CN113825497A - 生产脂质体的方法 - Google Patents

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阿图尔·曼努埃拉·卡瓦科-保罗
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Abstract

本公开涉及一种生产脂质体的方法，从而在减少的生产步骤个数的情况下获得包封药剂的高包封效率，即避免传统脂质体生产工艺的挤出步骤。本发明的脂质体旨在携带治疗剂，如抗癌剂、抗氧化剂、抗炎剂、解热剂、抗生素、抗病毒剂、抗风湿剂、镇痛剂、生长因子或它们的混合物。

Description

生产脂质体的方法
技术领域
本公开涉及一种生产脂质体的方法，从而以减少的生产步骤数来获得包封药剂的高包封效率。
背景技术
脂质体被定义为由一个或多个同心磷脂层(薄层)包围的水核组成的人工微囊泡[1]。因为脂质体由天然存在的物质组成，由于无毒且可生物降解，因此作为各种治疗剂的载体受到广泛关注[2]。脂质体显示出广泛的潜在应用，因为它们能够结合亲水性(在水性隔室中)、疏水性(在脂质膜内)和两亲性物质(脂质水性界面)[3]。此外，包封在脂质体中的生物活性材料被保护而不会被立即稀释或降解。由于所有这些原因，脂质体是自发现以来最流行的纳米载体系统。
脂质体出于多种目的的广泛使用已经产生了对开发高效且可重复的尽可能简单的制备方法的需求。有多种不同的脂质体制备方法，并有多种变型。由于其简单性，大多数实验室使用最早描述于1965年的脂质薄膜水化法[4]。然而，薄膜法往往不适合大规模生产。此外，人们担心使用氯化溶剂。
乙醇注射法是GMP放大脂质体生产的一项有趣技术。它提供了多个优点，例如简单、GMP友好型溶剂、快速实施和重现性，以及它不会导致脂质降解或氧化改变的事实。乙醇注射法于1973年由Batzri和Korn[5]首次报道，作为无需超声处理制备小单层囊泡(SUV)的首批替代方法之一。通过在水相中立即稀释乙醇，脂质分子沉淀并形成双层平面碎片。通过体系中的能量耗散(通过搅拌和/或超声波处理)，这些脂质双层的片段倾向于减少其分子的疏水部分暴露于水环境中，产生了呈现准球形结构的这些片段的曲率。在接下来的几年中，多项研究已经调查了乙醇注射技术的制备参数(脂质浓度和组成、注射速度、两相的温度、搅拌速度等)对所得脂质体特性(尺寸分布、zeta电位、药物包封效率等)的影响[6]。
在传统的乙醇注射方法中，与水相相比，乙醇相的比例很小，通常为5-10％。乙醇蒸发后，脂质体分散体被挤出以减小囊泡尺寸。简而言之，传统的乙醇注射方法包含3个关键步骤：
1.在水相中注射脂质(乙醇)；
2.挤出以减小脂质体尺寸；
3.去除未包封的药剂。
通常，脂质体治疗剂或成像剂的加载是通过被动或主动方法实现的：
被动加载涉及将干燥的脂质膜溶解在含有目标药剂的水溶液中。这种方式只能用于水溶性药剂，并且加载效率往往较低(小于5％)。该方法可用于范围广泛的化合物，与其化学结构无关。
主动加载涉及由脂质体跨膜pH梯度驱动的药剂的内化[7]。这个过程可以非常高效(高于95％)，导致高脂质体内浓度并最大限度地减少宝贵的化疗药物的浪费。
然而，这种方法(主动加载)要求分子在脂质体内部和外部使用的缓冲液的极端pH下具有不同的质子化状态。以这种方式，当脂质体内部和外部设置两种不同的pH时，给定分子将扩散脂质双层。因此，pH梯度是转移和保留两亲性弱碱和酸的驱动力[8]。
文献中还报道了使用跨膜硫酸铵梯度的弱碱性胺治疗剂或成像剂的主动加载方法。在这种情况下，氨梯度驱动pH梯度，导致药剂主动转运到脂质体中。然后，硫酸盐充当电离剂的抗衡离子，使其在脂质体内沉淀。在阿霉素脂质体(Doxil)的情况下，该策略已应用于脂质体阿霉素的生产。Myocet是远程加载的脂质体阿霉素的另一个例子，尽管pH梯度是用柠檬酸建立的[9]。
在主动加载过程中，在用传统乙醇注射法制备脂质体后，取出脂质体外相，然后将药剂加入到脂质体外相中并且温育脂质体以允许远程加载进程继续进行。简而言之，主动加载过程包括5个关键步骤：
1.在水相中注射脂质(乙醇)；
2.挤出以减小脂质体尺寸；
3.取出脂质体外相；
4.脂质体与药剂的温育；
5.去除未包封的药剂。
文献WO/2013/084208(Paulo A.et al.,2013，脂质体及其生产方法)描述了一种脂质体生产方法，其为脂质膜水化法。
文献US4752425A(Martin F.et al.,1988，高包封脂质体加工方法)描述了一种使用氯仿生产脂质体的方法。产生的脂质体尺寸为1.5微米或更大，需要挤出以减小尺寸(此时原始包封的药剂丢失)。
文献US5549910A(Szoka F.et al.,1994，脂质体和脂质复合物组合物的制备)描述了一种获得含有在水、醇和卤代烃溶剂中溶解性较差的化合物的脂质体的方法。在这种方法中，脂质溶解在非质子溶剂溶液中，如果需要溶解它们，可以附加地含有低级烷醇。该方法需要挤出以获得具有确定尺寸的脂质体。
文献US20120171280A1(Zhang Y,2011,制备脂质体的方法、由该方法制备的脂质体组合物及其使用方法)描述了一种获得脂质体的方法，其中水溶液包含乙二胺四乙酸(EDTA)以包封抗坏血酸或其盐。所述脂质体组合物具有约200-500nm的选定平均粒径。
文献US 5316771A(Barenholz,Y.et al.,1994，通过铵离子梯度在脂质体中加载两性药物的方法)描述了使用跨膜梯度将弱两性药物主动加载到脂质体中。
文献US 5939096A(Clerc,S.Y.和Barenholz,1999，以高浓度将弱酸性药物稳定地包封在脂质体中)描述了用高浓度弱酸药物包封的脂质体。该方法采用了涉及弱酸的盐的质子穿梭机制，以产生较高的内部/较低的外部pH梯度。
文献WO201364911涉及用于生产脂质包封的带负电荷的治疗性聚合物(例如核酸、蛋白质和肽)的方法和组合物，所述聚合物被封装在脂质层内。
文献WO0105374涉及在混合预形成的脂质囊泡、带电的治疗剂(具有与脂质相反的电荷)和去稳定剂之后，生产脂质包封的带电荷治疗剂颗粒的方法和组合物。
发明内容
本描述的方法具有如下优点：在靶向脂质体中实现小分子包封效率等于或优于先前方法，无需额外的加工步骤来生产纳米颗粒。多电荷分子，即在中性pH(5-8)下在结构中带有负电荷，如甲氨蝶呤和多柔比星，使用这种方法可以更好地封装。甲氨蝶呤包封速度高，而多柔比星减少步骤数。(表2和3)
在提议的替代方法中，使用类似体积比的乙醇:水相的预浓缩方法实现了治疗剂或成像剂的更高包封效率，并且脂质体可以在最后被稀释。新提出的方法减少了工业过程中所需的步骤数量(仅2个)。这些特征首次在同一方法上聚集，将其与文献中报道的区别开来。
脂质体在多种用途中的广泛使用产生了开发制备方法的需要，这些方法应该是有效的、可重复的并且尽可能简单。现有方法对于工业放大和/或实现目标药剂的低包封效率仍然费力。以这种方式，必须开发一种步骤数量减少并实现包封药剂的高包封效率的方法。
用于生产脂质体的脂质可以被改变或被修饰以定制脂质体表面和膜层的特性。基于它们的电荷，有不同类别的脂质：中性、阳离子和阴离子。将有机分子添加到磷酸盐头基，会产生多种磷脂物种，例如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰胆碱(PC)。所有这些脂质均可用于脂质体生产。
未经修饰的脂质体在循环中无法存活很长时间，因为它们会被巨噬细胞移除。克服这些问题的最初尝试之一集中在操纵脂质膜组分，以改变双层流动性，例如通过包含类固醇。以这种方式，我们的脂质体配方可以优先含有胆固醇(CH)，其摩尔比可以为35-55％，优选35-40％。已经表明，将胆固醇掺入脂质体中，通过促使脂质双层中磷脂的堆积增加，可减少与血液蛋白质的相互作用。
此外，在优先执行中，将合成聚合物、聚乙二醇(PEG)包括到脂质体中。含PEG的脂质体显示出与血液蛋白的结合较少，RES摄取减少，从而延长了脂质体在循环体系中的持续时间。这将传统脂质体的血液循环扩展到了药物递送，缀合的磷脂DSPE-MPEG被掺入这些新配方的脂质膜中，摩尔比可以为4-12％，优选5-10％。
还已经证明，与未修饰的脂质体相比，具有神经节苷脂的表面修饰脂质体在血流中具有延长的循环时间。这些特性对于神经节苷脂在免疫疗法中的应用具有潜在的作用。在静脉注射后脂质体的RES摄取研究中测试了多种糖脂：糖脂GM1(一种脑组织源性的单唾液酸神经节苷脂)在结合到脂质体表面时显著降低了RES摄取，并且该配方在血液循环中保持数小时。
主动靶向利用用靶向配体对脂质体表面的特定修饰，这可导致它们在靶位点积累或细胞内递送至靶细胞。在脂质体中包含某些配体允许通过受体介导的内吞作用在细胞内释放其内容物。靶向剂在膜表面的整合可以通过与磷脂或脂肪酰基链缀合或掺入脂质膜中来实现。
有多种制备脂质体的方法，有许多变体。在乙醇注射法(5％乙醇)中，一部分具有水溶性物质的水溶液被被动地包封在囊泡内。这种方法的优点是简单，但只有很小百分比的水溶性治疗剂或成像剂可以用这种方式包封。
在远程加载中，通常在初始盐或低pH缓冲液中制备空脂质体。然后使用透析或尺寸排阻色谱法或通过将pH滴定至微碱性条件以取出脂质体外相。最后，将药剂添加到所述脂质体外相中，并温育脂质体以允许远程加载进程继续进行[6]。涉及的步骤数量使生产工艺难以扩大规模，构成了阻碍该标准方法进一步发展的障碍。
因此，我们将精力专注于优化脂质体内的药剂包封，减少生产步骤。实际上，只有少量使用的药剂被包封(例如甲氨蝶呤药物的3-5％)，浪费了大量药剂，这可能是放大工艺中的一个问题。为了增加被包封的药剂，在生产方法的多个步骤中测试了许多条件。即：水相在含有磷脂的有机相中(而不是相反)，不除去乙醇，在室温下而不是在70℃下进行注射，测试不同的注射速度和多种浓度的有机相(5％至95％)。
本发明在于一种生产脂质体的新方法，其中将脂质体的疏水组分溶解在乙醇中，并在剧烈的搅拌下以约2-4ml/min的速度注入水相中。乙醇:水相的初始体积比为1/1。乙醇蒸发或正切流动过滤后，脂质体分散液应稀释1至10倍，以达到所需的最终浓度。
在一个实施方式中，预浓缩方法包括2个关键步骤：
·在水相中注射脂质(乙醇)(1:1v/v)，然后进行稀释；
·去除未包封的药剂。
在一个实施方式中，这一方面可以以减少的步骤数(仅2)实现多电荷药剂如甲氨蝶呤的高包封效率(例如约40％)。初始预浓缩(使用较低的水体积)增加了磷脂浓度，并且因此允许更高的包封效率。此外，使用初始1:1的乙醇:水相体积比，允许具有不同极性的两相之间的平衡，增加药剂的包封。
在一个实施方式中，本公开涉及一种将活性成分包封在脂质体中的方法，包含以下顺序步骤：
-通过将磷脂的疏水分子和类固醇与乙醇混合制备乙醇相；优选胆固醇；
-在缓冲溶液中制备具有活性成分和靶向剂的水相；
-通过在约50℃至约80℃的温度下将所述乙醇相注入所述水相中以获得脂质体，其中所述乙醇/水相体积比为1:1至3:2；
-通过蒸发或正切流动过滤，去除乙醇；
-以适合的方式，即通过正切流动过滤，去除剩余的游离活性成分；
其中所述靶向剂是与脂质体组分缀合或掺入在脂质膜中的肽。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中其进一步包含步骤：在进一步稀释的水相中将所述脂质体分散体稀释1至10倍。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述乙醇相以约2-4ml/分钟的速度注入。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述注射步骤在搅拌下进行。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述活性成分是药物，特别是抗癌药、抗风湿药,抗神经退行性疾病药物、抗氧化药物、抗炎药物、解热药、抗生素药、抗病毒药、镇痛药或它们的组合。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述靶向剂是选自具有以下序列的至少90％的同一性程度的以下列表的肽：SEQ-ID.NO 1、SEQ-ID.NO 2、SEQ-ID.NO 3或它们的混合物；包含与SEQ-ID.NO 1、SEQ-ID.NO 2、SEQ-ID.NO 3或它们的混合物具有至少95％，优选或至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％同一性的序列。
用于比较的序列比对的方法是本领域公知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch((1970)J Mol Biol 48:443-453)的算法以找到两个序列的全局(在整个序列上)比对，使匹配数最大化并最小化间隙数。BLAST算法(Altschul et al.(1990)J Mol Biol 215:403-10)计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计分析。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得。也可以使用MatGAT软件包(Campanella et al.,BMCBioinformatics.2003Jul 10；4:29.MatGAT:使用蛋白质或DNA序列生成相似性/同一性矩阵的应用程序)中可用的方法之一确定相似性和同一性的全局百分比。可以进行少量手动编辑以优化保守基序之间的比对，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在本主题中以百分比表示的序列同一性值是使用BLAST以默认参数在整个氨基酸序列上确定的。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中相对于初始水体积，乙醇浓度在40％与60％之间，优选50％。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中温度为60℃或70℃。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述活性成分是在约4到约7的pH下含有至少一个负电荷的多电荷分子，特别是甲氨蝶呤或多柔比星。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述水相是磷酸盐缓冲盐水，PBS。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述乙醇相包含阴离子磷脂、中性磷脂或阳离子磷脂。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述乙醇相包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和/或它们的衍生物或它们的混合物，特别是1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述乙醇相包含类固醇、隐形剂、靶向剂或它们的混合物。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述类固醇是胆固醇和/或其衍生物，特别是胆固醇半琥珀酸酯。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述隐形剂是聚乙二醇PEG或神经节苷脂。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中聚乙二醇PEG与磷脂结合，特别是与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺结合。
在另一实施方式中，本公开涉及一种方法，其中将所述靶向剂并入脂质膜中。
在另一实施方式中，公开涉及一种方法，其中所述活性成分是成像剂或治疗剂。
在进一步的实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述成像剂或治疗剂是疏水的或亲水的。
在另一进一步实施方式中，本公开涉及一种方法，其中所述成像剂是染料。
具体实施方式
本公开涉及一种生产脂质体的方法，以减少的生产步骤数，即避免传统脂质体生产工艺的挤出步骤，获得被包封的药剂的高包封效率。本发明的脂质体旨在携带治疗剂，如抗癌剂、抗氧化剂、抗炎剂、解热剂、抗生素、抗病毒剂、抗风湿剂、镇痛剂、生长因子或它们的混合物。
本描述的方法具有在靶向脂质体中实现小分子包封效率等于或优于先前方法的优点，而无需额外的加工步骤来生产纳米颗粒。
为了以减少的生产步骤增加被包封的药剂，在生产方法的数个步骤中测试了许多条件。结果表明乙醇的初始百分比显著影响包封效率。已经注意到，随着乙醇体积高于传统的5％(相对于初始水相为50％)，并且还使用了较低体积的药剂水溶液(样品随后被稀释五倍以在乙醇蒸发或正切流动过滤后得到通常的药剂浓度)，包封效率的急剧增加。达到这一比例后，囊泡的尺寸受到乙醇体积的积极影响。实际上，与先前生产的脂质体批次相比，具有更高乙醇体积(>50％)的批次显示出更大的囊泡(<150nm)。这些结果可能归因于乙醇涉及在水相中体积增加的较慢扩散，导致由于磷脂的缓慢自组装，引起形成更大尺寸的脂质体。因此，囊泡的尺寸越小，含水核的体积越小，获得的包封效率越低，因为亲水剂主要被包封在脂质体的含水核中[10、11]。然而，使用50％的初始乙醇体积获得了包封效率和尺寸之间的折衷。用这种乙醇百分比获得的脂质体具有小尺寸(<150nm)和PDI值(<0.1)。此外，使用这些条件，通常需要减少挤出过程，并且可以完全消耗均匀的囊泡大小。
脂质体的生产
在一个实施方式中，使用乙醇注射法制备了由DOPE/胆固醇/DSPE-MPEG(54:36:10，摩尔比)组成的脂质体。简而言之，在60℃下，将脂质(DOPE、胆固醇和DSPE-MPEG)溶解在乙醇中(在传统乙醇注射方法中为5％；在新提出的预浓缩方法中为50％，相对于最初的20％水相)。
在搅拌下将所述溶液注入水溶液(磷酸盐缓冲盐水，PBS)。该过程在70℃下进行，并保持必要的时间以蒸发所有乙醇体积。
在传统的乙醇注射方法中，脂质体被挤出以减小其尺寸。在预浓缩法中，乙醇蒸发或正切流动过滤后，将脂质体分散体在PBS中稀释5倍(加入剩余80％的体积)。在穿过具有5kDa截留值的凝胶过滤色谱柱(含有8.3mL Sephadex G-25介质的PD-10脱盐柱)(GEHealthcare)后，从样品中去除未掺入脂质体的游离治疗剂或成像剂。在传统的乙醇注射方法和新提出的预浓缩方法中，在这一水相中存在亲水性治疗剂或成像剂(例如甲氨蝶呤和多柔比星)。在远程/主动加载中，在硫酸铵(120mM,pH＝8.5)中生产后，将缓冲液改为
Figure BDA0003335994730000081
蔗糖(10％,w/v,缓冲在pH 9.0下)，并且将空脂质体与治疗剂或成像剂一起温育。
包封甲氨蝶呤的脂质体的表征：多种生产方法之间的比较研究。
Figure BDA0003335994730000091
表II-包封装多柔比星的脂质体的表征：多种生产方法之间的比较研究。
Figure BDA0003335994730000092
表III-包括联合治疗的抗癌药物的A到Z列表
Figure BDA0003335994730000093
Figure BDA0003335994730000101
Figure BDA0003335994730000111
Figure BDA0003335994730000121
Figure BDA0003335994730000131
Figure BDA0003335994730000141
Figure BDA0003335994730000151
Figure BDA0003335994730000161
表IV-用于类风湿性关节炎治疗的药物的A到Z列表
Figure BDA0003335994730000162
Figure BDA0003335994730000171
Figure BDA0003335994730000181
Figure BDA0003335994730000191
Figure BDA0003335994730000201
表IV染料的A到Z列表
Figure BDA0003335994730000202
Figure BDA0003335994730000211
Figure BDA0003335994730000221
Figure BDA0003335994730000231
Figure BDA0003335994730000241
Figure BDA0003335994730000251
Figure BDA0003335994730000261
Figure BDA0003335994730000271
Figure BDA0003335994730000281
Figure BDA0003335994730000291
Figure BDA0003335994730000301
Figure BDA0003335994730000311
Figure BDA0003335994730000321
Figure BDA0003335994730000331
在给出范围的情况下，包括端点。另外，应当理解，除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显看出，表示为范围的值可以采取本发明不同实施方式中所述范围内的任何特定值，至该范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。还应理解的是，除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解中明显看出，表示为范围的值可以采取给定范围内的任何子范围，其中该子范围的端点以与所述范围下限单位的十分之一相同的精度表示。
本文件中任何时候使用的术语“包含”旨在表示存在所述特征、整数、步骤、组件，但不排除存在或添加一个或多个其它特征、整数、步骤、组件或它们的组。
本公开当然不以任何方式限于所描述的实施方式，并且本领域的普通技术人员可以预见对其修改的许多可能性而不背离如所附权利要求中限定的本公开的基本构思。
上述实施方式显然是可以组合的。
以下从属权利要求阐述了本公开的特定实施方式。
序列表
SEQ-ID.NO.1:叶酸-DRDDQAAWFSQY
SEQ-ID.NO 2:KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK-DRDDQAAWFSQY
SEQ-ID.NO 3:YQSFWAAQDDRD-KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK
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<160> 3
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有 SEQ ID 1 的叶酸
<400> 1
Asp Arg Asp Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ser Gln Tyr
1 5 10
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列2
<400> 2
Lys Asp Glu Pro Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Asp
20 25 30
Arg Asp Asp Gln Ala Ala Trp Phe Ser Gln Tyr
35 40
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列3
<400> 3
Tyr Gln Ser Phe Trp Ala Ala Gln Asp Asp Arg Asp Lys Asp Glu Pro
1 5 10 15
Gln Arg Arg Ser Ala Arg Leu Ser Ala Lys Pro Ala Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Pro Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys
35 40

Claims (23)

1.一种将活性成分包封在脂质体中的方法，包括以下顺序步骤：
通过将磷脂的疏水性分子和类固醇与乙醇混合来制备乙醇相，
在缓冲溶液中制备具有活性成分和靶向剂的水相；
在约50℃至约80℃的温度下，将所述乙醇相注入到所述水相中，获得所述脂质体，其中所述乙醇相/水相的体积比在1:1与3:2之间；
去除所述乙醇；
以适合的方式，即通过正切流动过滤，去除剩余的游离活性成分；
其中所述靶向剂是与脂质体组分缀合或掺入脂质膜的肽。
2.根据前述权利要求所述的方法，其中通过蒸发或正切流动过滤去除所述乙醇。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述类固醇是胆固醇。
4.根据前述权利要求所述的方法，其中所述胆固醇是胆固醇半琥珀酸酯。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中其进一步包括在进一步稀释的水相中将所述脂质体分散体稀释1至10倍的步骤。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以约2-4ml/分钟的速度注入所述乙醇相。
7.根据前述权利要求所述的方法，其中相对于所述初始水体积，所述乙醇浓度在40％与60％之间，优选50％。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述温度为60℃或70℃。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活性成分为在约4至约7的pH下含有至少一个负电荷的多电荷分子。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活性成分为药物，特别是抗癌药、抗风湿药、抗神经退行性疾病药物、抗氧化药物、抗炎药物、解热药、抗生素药、抗病毒药、镇痛药或它们的组合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中注入步骤在搅拌下进行。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向剂为选自与以下序列具有至少90％同一性程度的下列列表中的至少一种肽：SEQ-ID.NO 1、SEQ-ID.NO 2、SEQ-ID.NO3或它们的混合物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水相为磷酸盐缓冲盐水，PBS。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乙醇相包含阴离子磷脂、中性磷脂或阳离子磷脂。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中乙醇相磷脂选自由以下组成的列表：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和/或它们的衍生物或它们的混合物，特别是1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乙醇相进一步包含隐形剂、靶向剂或它们的混合物。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述隐形剂为聚乙二醇PEG或神经节苷脂。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚乙二醇PEG结合磷脂，特别是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶向剂并入到所述脂质膜中。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活性成分是成像剂或治疗剂。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成像剂或治疗剂是疏水的或亲水的。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述成像剂为染料。
23.根据前述权利要求所述的方法，其中所述活性成分为甲氨蝶呤、多柔比星或它们的混合物。
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