CN107184552B - 一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体的制备方法 - Google Patents

一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体的制备方法，其特征在于，将卵磷脂、胆固醇、十八胺混合后溶于乙醇中，旋转蒸发，得到脂质体膜，然后加入含有药物的溶液搅拌，得到载药醇质体；利用层层自组装技术，将载药醇质体滴加到半乳糖化聚乙烯亚胺溶液中，边搅拌边超声分散，再加入核酸类药物，得到半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体。本发明主要采用基于醇质体制备技术和层层自组装技术，通过静电吸附先后在载药醇质体外组装半乳糖化聚乙烯亚胺和核酸类药物，有效负载并递送多种药物(含基因药物)，并其提高药物靶向肝肿瘤细胞的治疗。

Description

一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体的制备方法，属于载 药醇质体的制备工艺技术领域。
背景技术
肝癌在各肿瘤致死原因中列第3位。全球范围内，超过35％的肝癌病例发生 于我国。所以，找到一个有效的治疗方法是迫切需要的。半乳糖配体可与肝癌细 胞特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体结合，主动靶向肝癌，同时增加肿瘤细胞的 摄取。
聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒基因载体之一。因具有良好的基因结合能力和 转染能力，已经广泛地应用于核酸类药物的细胞传递和转染。一直被认为是基因 转染试剂的黄金标志。但其较高的细胞毒性限制了其在基因治疗中的应用。研究 发现，半乳糖化的聚乙烯亚胺(Gal-PEI)比PEI对细胞的毒副作用小，还具有 主动靶向肝癌的作用。
醇质体是一种可包裹和传递大分子类药物的给药系统。其结构稳定、包封率 高、具有低毒性、低免疫性和良好的细胞相容性，在药物递送研究领域中受到广 泛关注。溶解在醇质体磷脂层中的低分子量醇增强膜的柔性和流动性，使其与细 胞膜更好地融合，将药物直接释放到细胞内发挥作用。
综上所述，基于醇质体制备技术和层层自组装技术，可通过静电吸附先后在 载药醇质体外组装半乳糖化聚乙烯亚胺和核酸类药物，有效负载并递送多种药物 (含基因药物)，并其提高药物靶向肝肿瘤细胞的治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇 质体的制备方法，所得到的载药醇质体不仅能有效负载并递送多种药物(含基因 药物)，而且能提高药物靶向肝肿瘤细胞的治疗。
为了解决上述问题，本发明提供了一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质 体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将卵磷脂、胆固醇、十八胺混合后溶于乙醇中，旋转蒸发，得到 脂质体膜，然后加入含有药物的溶液搅拌，得到载药醇质体；
步骤2)：利用层层自组装技术，将载药醇质体滴加到半乳糖化聚乙烯亚胺 溶液中，边搅拌边超声分散，再加入核酸类药物，得到半乳糖化聚乙烯亚胺修饰 的载药醇质体。
优选地，所述步骤1)中卵磷脂、胆固醇、十八胺的质量比为25∶2.5∶1。
优选地，所述步骤1)中药物为蛋白类、多肽类、激素类、抗生素类和生物 碱类药物中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述步骤2)中半乳糖化聚乙烯亚胺溶液的浓度为0.01g/mL。
优选地，所述步骤2)中载药醇质体和半乳糖化聚乙烯亚胺溶液的体积比为 9∶1。
优选地，所述步骤2)中核酸类药物中磷酸基团与半乳糖化聚乙烯亚胺修饰 载药醇质体中氨基的N/P比值为1∶5-1∶25。
优选地，所述步骤2)中总搅拌时间为2-4h。
优选地，所述步骤1)、2)中所使用的溶剂均为乙醇水溶液，其中乙醇与水 的体积比为3∶7。
优选地，所述步骤2)中半乳糖化聚乙烯亚胺的制备方法具体为：将乳糖酸 和聚乙烯亚胺在去离子水溶液里进行反应，然后透析、冷冻干燥，得到半乳糖化 的壳聚糖聚乙烯亚胺；其中，乳糖酸与聚乙烯亚胺的摩尔比为1∶1。
更优选地，所述半乳糖化的聚乙烯亚胺的制备过程中加入EDC/NHS引发反 应。
更优选地，所述反应的时间为14-72h；透析时间为2-3天。
本发明主要采用基于醇质体制备技术和层层自组装技术，通过静电吸附先后 在载药醇质体外组装半乳糖化聚乙烯亚胺和核酸类药物，有效负载并递送多种药 物(含基因药物)，并其提高药物靶向肝肿瘤细胞的治疗。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明操作方便，实验装置简易，制备时间短且条件温和，利于大批 量生产；
(2)本发明制备的半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体稳定性好，可长 时间保存；
(3)本发明制备的半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体可有效负载并递 送多种药物(含基因药物)，并其提高药物靶向肝肿瘤细胞的治疗。
附图说明
图1为实施例中所得不同修饰层数半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体材料形貌TEM图的比较图；其中，a是醇质体，b是半糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体；
图2为实施例所得不同修饰层数半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体的L929细胞毒性图；
图3为实施例所得不同修饰层数半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体负载罗丹明B靶向HepG2肝癌细胞吞噬图的比较图；其中，a是醇质体负载罗丹明B，b是半糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体负载罗丹明B，c是半糖化聚乙烯亚胺混合罗丹明B。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例
一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体的制备方法：
将卵磷脂、胆固醇和十八胺以质量比为25∶2.5∶1的比例混合溶于乙醇中，旋 转蒸发得到一层脂质体膜，将罗丹明B(模型药物)以0.5mg/ml加入30％(v/v) 乙醇水溶液，搅拌即得到负载罗丹明B的醇质体；
将2.0g乳糖酸(LA)溶解于50mL TEMED/HCl buffer(PH4.7)，再由NHS (0.14g)和EDC(0.6g)的混合物激活。最后将1.0g聚乙烯亚胺(PEI)以LA 的当量摩尔比加入到溶解液中。室温反应72h，将产物置于1.4kD的透析袋中透 析2-3天，冷冻干燥后得到半乳糖化的聚乙烯亚胺(Gal-PEI)。
将半乳糖化的聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，浓度为10mg/mL，利用层层 自组装技术将9mL负载罗丹明B的醇质体先缓慢滴加到1ml半乳糖化的聚乙烯 亚胺溶液中，剧烈搅拌2h，超声分散，再将该混合溶液缓慢滴加到pGFP质粒(模 型基因药物)溶液中静置1h，pGFP质粒的磷酸基团和半乳糖化聚乙烯亚胺修饰 的载罗丹明B醇质体的氨基的比值为1∶5-1∶25。既得半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的 载药醇质体。
图1为实施例中所得不同修饰层数半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体材料 形貌TEM图的比较图；其中，a是醇质体，b是半糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体； 外层材料的修饰增加了醇脂体的粒径，但是仍然小于100nm。
图2为实施例所得不同修饰层数半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体的L929 细胞毒性图；分别是醇质体；半糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体；半糖化聚乙烯亚 胺。从图中可以看出，随着浓度的增大，由于醇质体的存在，半糖化聚乙烯亚胺 修饰的醇质体对细胞的毒性比半乳糖化聚乙烯亚胺明显降低。
图3为实施例所得不同修饰层数半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体负载罗 丹明B靶向HepG2肝癌细胞吞噬图的比较图；依次是半糖化聚乙烯亚胺修饰的 醇质体负载罗丹明B，醇质体负载罗丹明B，半糖化聚乙烯亚胺混合罗丹明B。 从图中可以看出，半糖化聚乙烯亚胺修饰的醇质体负载罗丹明B靶向HepG2肝 癌细胞吞噬的荧光高于其他两组。

Claims (1)

1.一种半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将卵磷脂、胆固醇和十八胺以质量比为25:2.5:1的比例混合溶于乙醇中，旋转蒸发得到一层脂质体膜，将罗丹明B以0.5mg/mL加入体积百分比30%乙醇水溶液，搅拌即得到负载罗丹明B的醇质体；
将2.0g乳糖酸溶解于50mL TEMED/HCl buffer，pH为4.7，再由NHS0.14g和EDC0.6g的混合物激活，最后将1.0g聚乙烯亚胺以乳糖酸的当量摩尔比加入到溶解液中；室温反应72h，将产物置于1.4kD的透析袋中透析2-3天，冷冻干燥后得到半乳糖化的聚乙烯亚胺；
将半乳糖化的聚乙烯亚胺溶解于去离子水中，浓度为10mg/mL，利用层层自组装技术将9mL负载罗丹明B的醇质体先缓慢滴加到1ml半乳糖化的聚乙烯亚胺溶液中，剧烈搅拌2h，超声分散，再将该混合溶液缓慢滴加到pGFP质粒溶液中静置1h，pGFP质粒的磷酸基团和半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载罗丹明B醇质体的氨基的比值为1:5-1:25；即 得半乳糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体。
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