CN111494637A - 一种抗肿瘤联合制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤联合制剂及其应用，所述制剂包括：经皮免疫膜和免疫检查点阻断剂。本发明主要采用基于醇质体制备技术和静电喷雾技术制备一种经皮肿瘤免疫膜，并结合免疫检查点阻断剂用于拮抗T细胞中的免疫抑制途径并增强CD8+ T细胞介导的肿瘤破坏，提供长期保护，防止肿瘤侵袭，转移或复发。

Description

一种抗肿瘤联合制剂及其应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域，特别涉及一种抗肿瘤联合制剂及其应用。
背景技术
恶性肿瘤的发病率和死亡率呈不断上升趋势，极大地威胁人类健康，是全世界卫生组织急需攻克的疑难病症之一。恶性肿瘤并不是单独的疾病，它通常是全身性病变的局部表现，转移和扩散的可能性随时存在，它的发展是一个多步骤，多因素的经历过程。因此，对于其治疗需要多学科之间的结合，并发挥各治疗手段的优点，合理科学的安排和实施，才能取得最佳的治疗效果。其中，免疫疗法利用患者自身的免疫系统而不是细胞毒性剂化疗药物来杀灭肿瘤细胞，具有高特异性、低毒性、低成本等优越性。目前的肿瘤免疫疗法主要包括：免疫检查点阻断疗法、过继细胞疗法和肿瘤疫苗等，在对多种恶性肿瘤的治疗中显示出令人鼓舞的临床效果。
人类免疫系统中的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)可以攻击和消除肿瘤细胞，肿瘤的生长和扩散源于肿瘤细胞的免疫逃逸。免疫逃逸的机制与“免疫检查点”有关，这些“检查点”在正常情况下能抑制T细胞的功能，而在肿瘤组织中则可能被肿瘤利用形成免疫逃逸。许多研究证明，使用免疫检查点抑制剂可在肿瘤微环境中消除免疫抑制、重启有效的CTL效应。目前，已获批准用于临床的免疫检查点阻断剂是靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)途径的单克隆抗体。PD-1/PD-L1(programmeddeath-ligand 1，PD-L1)被认为是肿瘤免疫疗法最有希望的靶标，抗PD-1/疗法已经在晚期黑色素瘤、肺癌、膀胱尿路上皮癌、胃癌等多种肿瘤的治疗中取得显著临床疗效。
新材料特别是纳米材料的迅速发展并广泛应用已成为推动当代科学技术进步的重要因素。其中静电纺丝是在强电场作用下将聚合物溶液形成喷射流以进行纺丝加工的过程，纤维直径可以精细到几十纳米至几微米。许多研究致力于开发电纺纳米纤维膜伤口敷料，因为它们与天然细胞外基质结构相似，具有高比表面积，利于细胞粘附和增殖。
缓释、控释和靶向制剂等一系列新剂型在医药领域显示了诱人的应用效果。静电喷雾是近年来用于制备微球的较有前景的技术之一，广泛用于制备微/纳米微球。静电喷雾的原理与静电纺丝的原理基本相同，在电喷雾中，将电场施加到注射器内包含的聚合物溶液中，施加的高压电势迫使聚合物以喷射的形式从注射器中出来，最终能够形成微/纳米微球。采用精密电喷雾技术，可提供重复加载的纳米颗粒和微球，产生窄尺寸分布，颗粒聚集和高产率，证明了其用于各种植入物均匀涂层的潜力，提高了它们的生物相容性和功效，从而避免了与天然体的各种非特异性反应。
CN 110420197 A公开了一种利用静电喷雾法制备可靶向树突状细胞的载药醇质体微球的方法，对肿瘤的治疗有一定的限制，癌症免疫疗法必须设法激活细胞介导的免疫，特别是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，活化的CD8+T细胞能够直接杀死恶性细胞并且可以获得持久的记忆表型，从而预防癌症复发，单一给药治疗效果差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤联合制剂及其应用，克服现有技术对癌症免疫疗法的技术缺陷，本发明中基于醇质体制备技术、静电纺丝和静电喷雾喷雾技术制备经皮肿瘤免疫膜，可有效负载并递送多种药物，提高抗原靶向DCs的能力，可促进机体针对肿瘤抗原的免疫应答，联合免疫检查点阻断剂可拮抗T细胞中的抑制途径并增强CD8+T细胞介导的肿瘤破坏效应，有望取得更为理想的肿瘤治疗效果。
本发明的一种抗肿瘤联合制剂，所述制剂包括：经皮免疫膜和免疫检查点阻断剂。
所述经皮免疫膜为负载载药醇质体的SF/PVA纳米纤维膜。
所述经皮免疫膜由下列方法制备，包括：
(1)将负载药物的醇质体滴加到甘露糖化聚乙烯亚胺溶液中，边搅拌边超声分散，再加入免疫佐剂，得到甘露糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体；
(2)将丝素SF，聚乙烯醇PVA溶液充分搅拌混合，转移至注射器中进行静电纺丝，得到SF/PVA纳米纤维膜；
(3)将步骤(1)中甘露糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体与聚乙烯吡咯烷酮乙醇水溶液混合，以步骤(2)的SF/PVA纳米纤维膜作为接收器进行静电喷雾，得到经皮免疫膜。
上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中醇质体由蛋黄卵磷脂、胆固醇、十八胺通过薄膜分散法获得。
所述卵磷脂、胆固醇、十八胺的质量比为25:2.5:1。
所述步骤(1)中药物为多肽、蛋白或基因表达载体；佐剂为卡介苗或未甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸CpG-ODN。
进一步，所述药物为肿瘤特异性抗原为TRP2肽。
所述步骤(1)、(3)中所使用的溶剂均为乙醇水溶液，其中乙醇与水的体积比为3:7；所述步骤(2)中，所使用的溶剂为去离子水。
所述步骤(2)中SF的体积百分比浓度为6％，PVA的体积百分比浓度为8％(混合前)；SF与PVA的混合体积比为2:5；混合搅拌时间为3h。
所述步骤(2)中SF/PVA纳米纤维纺丝于无纺布上并作干燥处理。
所述步骤(1)中甘露糖化聚乙烯亚胺的制备方法具体为：将4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷和聚乙烯亚胺进行反应，然后旋转蒸发，以水溶解冷冻干燥，得到甘露糖化聚乙烯亚胺；其中4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷和聚乙烯亚胺的质量比为1:2。
所述步骤(3)中聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为10wt％。
所述步骤(3)中免疫醇质体溶液(甘露糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体)的体积与聚乙烯吡咯烷酮溶液的体积比为4:6。
所述步骤(2)、(3)中静电纺丝和静电喷雾工艺参数均为：电压为15～20kV，推进速度为0.1～0.8ml/h，接收距离为10～15cm，温度为20～40℃，湿度为5％～8％。
所述免疫检查点阻断剂为aPD-1。
本发明提供一种所述抗肿瘤联合制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明提供一种所述抗肿瘤联合制剂在制备治疗黑素瘤药物中的应用。
一种抗肿瘤联合制剂的给药方法具体为：将经抗肿瘤免疫膜贴于患者腹部皮肤，同时注射免疫检查点阻断剂。
所述经皮给药膜以压敏胶带粘于皮肤；免疫检查点阻断剂的注射方式为皮下注射，免疫次数为2次。
本发明的一种经皮靶向DCs的给药系统，将抗原和佐剂局部应用于完整皮肤表面，则有望促进抗原提呈诱导机体产生免疫应答。本发明主要采用基于醇质体制备技术和静电喷雾技术制备一种经皮肿瘤免疫膜，并结合免疫检查点阻断剂用于拮抗T细胞中的免疫抑制途径并增强CD8+T细胞介导的肿瘤破坏，提供长期保护，防止肿瘤侵袭，转移或复发。
本发明中DCs在免疫检查点阻断疗法和经皮免疫中均发挥关键作用，通过经皮靶向DCs诱导肿瘤免疫配合免疫检查点阻断治疗产生协同抗肿瘤效应从而提升疗效。本发明涉及联合利用基于醇质体-纳米纤维膜的经皮肿瘤免疫与免疫检查点阻断剂【例如，抗PD-1单克隆抗体(aPD-1)】进行抗肿瘤治疗。以黑色素瘤为模型【以酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP2)为抗原、未甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)为佐剂】。
本发明联合采用经皮免疫膜和免疫检查点阻断剂，采用的aPD-1通过肿瘤浸润性DCs促进IL-12和TNF-α的产生，使免疫系统能够对肿瘤产生反应。肿瘤特异性抗原、TLR配体以及免疫检查点阻断剂的联合使用具有协同的肿瘤治疗效果。
有益效果
(1)本发明制备过程简便、原料来源广泛、实验装置简易、制备时间短且条件温和，利于大批量生产。
(2)本发明制备的经皮免疫膜稳定性好，可长时间保存。与当前的传统注射接种途径相比，经皮免疫有着极大优势：1)不使用针头与注射器，降低了接种过程中出现感染和传播某些疾病的风险，安全指数高；2)接种时的疼痛以及接种后的不适感被降低，提高了被接种者的依从性。
(3)本发明利用静电纺丝与静电喷雾技术制备的经皮免疫膜可有效负载并递送多种药物，提高药物靶向能力从而引发一系列免疫反应；经皮免疫与aPD-1等免疫检查点阻断剂联合应用可产生协同抗肿瘤效应。
(4)经皮免疫一种无针型疫苗接种新方法，将抗原和佐剂局部应用于完整皮肤表面诱导机体产生免疫应答。抗原透过角质层进入皮肤活性表皮层或真皮层后首先被树突状细胞(DCs)捕获并随之迁移至引流淋巴结，DCs在这个过程中发育成熟并将抗原处理成肽段，与主要组织相容性复合体(MHC)分子协同表达于细胞表面，将信号呈递给T细胞，激活CD4+和CD8+T细胞，产生强烈的免疫应答。与传统的皮下或肌肉注射接种方式相比，经皮免疫具有安全性好、顺应性佳、效率高、成本低等优势。将肿瘤特异性抗原和相应的佐剂纳入经皮免疫体系可实现经皮肿瘤免疫，达到抗肿瘤的功效。
附图说明
图1所示为实施例所得一种利用经皮肿瘤免疫与免疫检查点阻断剂aPD-1联合应用治疗肿瘤的实验流程图；
图2中实施例所得一种利用经皮肿瘤免疫与免疫检查点阻断剂aPD-1联合应用抗黑色素瘤效果；其中，A是荷瘤小鼠肿瘤体积变化，B是荷瘤小鼠体重变化，C是肿瘤实体照片，D是肿瘤平均质量，E是荷瘤小鼠照片(红色圆圈指示肿瘤部位)；
图3为不同治疗组的肿瘤组织切片的H&E染色照片，其中(a)control；(b)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA治疗组；(c)aPD-1治疗组；(d)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA+aPD-1联合治疗组；
图4为肿瘤组织的TUNEL染色图；其中(a)control；(b)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA治疗组；(c)aPD-1治疗组；(d)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA+aPD-1联合治疗组；
图5为小鼠肿瘤组织的抗CD4和CD8抗体免疫组化染色图；其中(a)control；(b)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA治疗组；(c)aPD-1治疗组；(d)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA+aPD-1联合治疗组；
图6为实施例中利用经皮肿瘤免疫与免疫检查点阻断剂aPD-1联合应用对小鼠的重要脏器切片的H&E染色图；其中，(a)control；(b)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA治疗组；(c)aPD-1治疗组；(d)PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA+aPD-1联合治疗组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
胆固醇 美国Sigma-Aldrich公司
蛋黄卵磷脂 艾维特医药有限公司
十八胺 生工生物工程股份有限公司
TRP2肽(SYVDFFVWL)南京金斯瑞生物科技有限公司
聚乙烯醇(PVA)上海阿拉丁生化科技股份有限公司
聚乙烯吡咯烷酮K30-32(PVP)上海阿拉丁生化科技股份有限公司
4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷(MPITC)摩贝生物科技有限公司
Anti-PD-1(aPD-1)达科为生物技术有限公司
实施例1
(1)将卵磷脂、胆固醇、十八胺以质量比25:2.5:1的比例混合于30％(v/v)乙醇水溶液中，旋转蒸发得到一层脂质体膜；将TRP2肽以0.5mg/ml加入30％(v/v)乙醇水溶液，得到TRP2肽溶液；将脂质体膜加入到TRP2肽溶液中，搅拌得到负载TRP2肽的醇质体；将负载TRP2肽的醇质体滴加到甘露糖化聚乙烯亚胺溶液中，边搅拌边超声分散，再加入免疫佐剂类(CPG-ODN)药物，得到甘露糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体；
甘露糖化聚乙烯亚胺的制备方法具体为：将4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷和聚乙烯亚胺混合，加入甲醇引发反应3h，然后旋转蒸发，冷冻干燥3d，得到甘露糖化聚乙烯亚胺；其中4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷和聚乙烯亚胺的质量比为1:2；
(2)配置10％聚乙烯吡咯烷酮的电喷液，并按照体积比为40％的比例加入(1)中所述甘露糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体；
(3)配置体积百分比浓度为6％的SF溶液，体积百分比浓度8％的PVA溶液，充分混合，制备SF/PVA纺丝液，将纺丝液装入5mL注射器针筒中，装上专用的金属针头，将注射器安装于推进泵中，使用包有铝箔的纸板作为接受装置，并在纸板上包裹无纺布，连接地线。设置电压13-18Kv，推进速度0.8-1mL/h，接受距离15-20cm。所制备的SF/PVA纳米纤维膜置于真空干燥箱中备用。
(4)将步骤(2)中的共混溶液转移至注射器中，SF/PVA纳米纤维膜作为接收板，利用高压发生装置进行电喷，设置电喷参数：电压为16kV，推进速度为0.5mL/h，接收距离为12cm，温度为25℃，湿度为5％，得到经皮肿瘤免疫膜(PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA)。
实施例2
(1)将4-5周的雄性C57BL/6小鼠分为4组：不给药的空白对照组、PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA治疗组、aPD-1治疗组、PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA+aPD-1联合治疗组。
(2)腹腔注射100uL的1％的戊巴比妥溶液将小鼠麻醉，剔除其腹部毛发，少量PBS润湿皮肤，免疫治疗组将经皮免疫膜(PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA)贴于润湿区并用医用胶带固定进行第一次免疫。第14天进行第二次免疫。aPD-1治疗采用皮下注射，20μg/小鼠。
(3)第二次免疫结束一周后(每次免疫三天)，每只小鼠皮下注射100uL密度为1x106的B16细胞于小鼠的右后腿处。小鼠在适宜的环境中饲养，每3天观察一次小鼠肿瘤的生长情况，待其生长至合适尺寸后，利用游标卡尺测量小鼠的肿瘤体积，并记录小鼠的体重，每3天测量一次。
(4)18天后，处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾等主要器官，多聚甲醛固定，通过石蜡包埋，切片，HE染色后在显微镜下观察并拍照。同时取出黑色素瘤，拍照记录，称重并计算其体积(按以下公式计算)，然后用多聚甲醛固定，肿瘤组织切片，HE和TUNEL染色，镜检CD8+和CD4+细胞并拍照记录。
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如图2所示可以看出，各组小鼠的肿瘤体积随着时间的延长而逐渐增长，其中未治疗的对照组肿瘤生长最快，而单纯经皮免疫或aPD-1治疗组肿瘤生长速度则显著放缓，肿瘤生长最慢的是经皮免疫联合aPD-1治疗组，其生长曲线十分平缓(图2A)。为了更客观的评价小鼠肿瘤生长情况，对各组小鼠在实验过程中的体重变化进行了测量和记录，结果如图2B所示：未治疗组体重增长较为明显，可能与其肿瘤生长较快有关；单纯经皮免疫或aPD-1治疗组小鼠体重稍有上升，与肿瘤的生长趋势相似；联合治疗组的小鼠体重则没有明显的变化，也与其肿瘤生长趋势吻合。实验结束后从小鼠中分离肿瘤并实测其质量，结果如图2C、D所示：未治疗的对照组小鼠体内的肿瘤体积明显大于治疗组，平均质量高达3.45g±0.1g；经皮免疫或aPD-1治疗组肿瘤的平均质量为1.82±0.1g；联合治疗组肿瘤平均质量仅为0.84±0.1g；显然，肿瘤的质量变化与肿瘤体积的变化趋势一致。从图2E荷瘤小鼠照片也可直观地看出不同的治疗结果。上述结果表明，PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA经皮肿瘤免疫膜可显著抑制黑色素瘤的生长，其抗肿瘤效果与aPD-1治疗相仿。特别值得关注的是，该经皮肿瘤免疫膜与aPD-1联合应用可进一步显著提升抗肿瘤疗效，肿瘤的生长几乎被完全遏制，提示这两种治疗方法之间通过某种机制产生了协同抗肿瘤作用。
如图3所示可以看出，不同治疗组的肿瘤组织切片的H&E染色照片中可以看到未治疗组肿瘤组织特点与治疗组区别明显。未治疗的肿瘤组织中肿瘤细胞排列紧密、血管丰富，显示了肿瘤的典型病理特征，而治疗组的肿瘤组织中则有大量坏死和无细胞区域。在各治疗组中，经皮免疫和aPD-1联合治疗组的肿瘤组织中肿瘤细胞密度显著降低，且细胞形态发生改变、细胞核消融明显。
如图4所示可以看出，肿瘤组织的TUNEL染色结果也显示联合治疗组的绿色荧光强度显著高于其他组，其次是aPD-1或经皮免疫单独治疗组。TUNEL染色将凋亡细胞染成绿色，绿色荧光越强则表明凋亡细胞的数量越多。上述肿瘤组织H&E和TUNEL染色结果清晰地表明，经皮免疫或/和aPD-1治疗通过诱导肿瘤细胞凋亡而显著抑制肿瘤的生长。经皮肿瘤免疫与aPD-1通过某种协同机制可显著提升其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
如图5所示可以看出，抗肿瘤细胞毒性T细胞，是通常携带CD4+和CD8+的T细胞，其表面分子标记对免疫识别并杀灭肿瘤细胞至关重要。CD4+和CD8+的T细胞在肿瘤中的浸润比例是免疫治疗效果的重要指标，占比越高表明疗效越好，预后也越佳。因此，通过测量肿瘤微环境中的CD4+和CD8+T细胞浸润率有助于进一步揭示上述治疗方案中的抗肿瘤机制。对小鼠肿瘤组织的抗CD4和CD8抗体免疫组化染色结果显示，治疗组比对照组有更多的CD8+T细胞的浸润，联合治疗组中出现大量的CD4+和CD8+T细胞浸润(图5中红色荧光所示为CD4+或CD8+T细胞)。这些结果表明，经皮免疫或/和aPD-1治疗诱导了小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。推测在联合治疗组中，经皮免疫可能通过递送TRP2而引发了针对表达TRP2的黑素瘤的有效抗肿瘤免疫应答，这一过程与aPD-1通过某种机制产生协同作用，最终导致强烈的CTL反应，CD4+和CD8+T细胞大量浸润，肿瘤细胞大批凋亡。
如图6所示可以看出，对接受治疗小鼠的重要脏器进行组织学观察可以对治疗方案的安全性作出评价。取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要器官进行切片，H&E染色后显微镜下观察并检查组织病理学。各治疗组与对照组之间没有明显差异，表明PVP{TRP2@Eth-CpG@PEIman}-SF/PVA经皮肿瘤免疫膜与aPD-1联合治疗不会对小鼠正常组织器官产生明显的生物毒性。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤联合制剂，其特征在于，所述制剂包括：经皮免疫膜和免疫检查点阻断剂。
2.根据权利要求1所述制剂，其特征在于，所述经皮免疫膜为负载载药醇质体的SF/PVA纳米纤维膜。
3.根据权利要求2所述制剂，其特征在于，所述经皮免疫膜由下列方法制备，包括：
(1)将负载药物的醇质体滴加到甘露糖化聚乙烯亚胺溶液中，边搅拌边超声分散，再加入免疫佐剂，得到甘露糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体；
(2)将丝素SF，聚乙烯醇PVA溶液充分搅拌混合，转移至注射器中进行静电纺丝，得到SF/PVA纳米纤维膜；
(3)将步骤(1)中甘露糖化聚乙烯亚胺修饰的载药醇质体与聚乙烯吡咯烷酮乙醇水溶液混合，以步骤(2)的SF/PVA纳米纤维膜作为接收器进行静电喷雾，得到经皮免疫膜。
4.根据权利要求3所述制剂，其特征在于，所述步骤(1)中药物为多肽、蛋白或基因表达载体；佐剂为卡介苗或未甲基化CpG基序的寡脱氧核苷酸CpG-ODN。
5.根据权利要求3所述制剂，其特征在于，所述步骤(2)中SF的浓度为6％，PVA的浓度为8％；SF与PVA的混合体积比为2:5。
6.根据权利要求3所述制剂，其特征在于，所述步骤(2)中SF/PVA纳米纤维纺丝于无纺布上并作干燥处理。
7.根据权利要求3所述制剂，其特征在于，所述步骤(2)、(3)中静电纺丝和静电喷雾工艺参数均为：电压为15～20kV，推进速度为0.1～0.8ml/h，接收距离为10～15cm，温度为20～40℃，湿度为5％～8％。
8.根据权利要求2所述制剂，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂为aPD-1。
9.一种权利要求1所述抗肿瘤联合制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。
10.一种权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物为抗肿瘤免疫膜贴于患者腹部皮肤和免疫检查点阻断剂皮下注射联合给药的药物。
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