CN111320750B - 一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体、胶束递药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体、胶束递药系统及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体、胶束递药系统及其制备方法与应用，所述两亲性两性离子载体结构通式如下：Dn‑CP‑TAm；其中所述的CP为亲水性阳离子聚合物骨架，D为两性离子甜菜碱单体；n为亲水性阳离子聚合物骨架上两性离子甜菜碱单体的接枝率，TA为含有叔胺结构的pH敏感单体分子，m为阳离子聚合物上含有叔胺结构的pH敏感单体分子的接枝率；弱酸可电离的两亲性两性离子载体中，两性离子甜菜碱单体具有抗生物体内蛋白吸附作用，可减弱阳离子聚合物对蛋白的吸附能力和溶血能力，延长载体血液循环时间，促进载体在疾病部位蓄积，从而提高生物大分子类药物递送效率。

Description

一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体、胶束递药系统及其 制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种离子载体及其制备方法与应用，尤其涉及一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体、胶束递药系统及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤微环境是指肿瘤细胞所处的内外环境，肿瘤微环境调控药物可通过调节肿瘤相关免疫细胞、抗肿瘤血管生成以及调控肿瘤细胞和微环境内肿瘤相关细胞之间的相互作用等发挥抑制肿瘤的作用。肿瘤微环境调节药物包括天然药物如藤黄酸、南蛇藤素、槲皮素、秦皮素、姜黄素等；化学药物如吉西他滨、培美曲塞、TGF-β抑制剂、替尼类等，这些药物大多为难溶性药物，不利于体内递送。聚合物胶束作为一种常用递药系统，具有以下各种优势：1、聚合物种类多样并可由多种方法合成；2、胶束具有特征性核/壳结构，内核可包载疏水药物，表面负载亲水生物大分子药物；3、可修饰多种功能化基团，从而改善载体性质或发挥不同生物学作用。
生物大分子药物，尤其是核酸、蛋白类药物的有效体内递送效率受限于体内酶降解、细胞膜屏障、溶酶体破坏等。阳离子聚合物介导的生物大分子递送具有诸多优势：1.基于阳离子聚合物的递送系统易与荷负电的细胞膜表面作用，通过静电吸附优先被细胞摄取；2.生物可降解型的阳离子聚合物种类多样并且可由多种方法合成；3.阳离子聚合物表面可修饰多种功能化基团，以改善载体性质或发挥不同生物学作用，如血清稳定性、靶向性、刺激响应性等。更重要的是，阳离子聚合物与生物大分子类药物复合操作简易，只需要简单混匀即可通过静电吸附作用与药物自组装成微粒制剂。
然而，具有高表面正电的阳离子聚合物具有较高的细胞毒性，且毒性随分子量增加而增大；但低分子量阳离子聚合物电荷密度较低，对生物大分子类药物的荷载能力较弱，质子缓冲能力低，递送效率较低。根据文献报导，低分子量的阳离子聚合物进行疏水性修饰可以增加细胞摄取，从而提高生物大分子的递送效率[Song et al.Enhanced AntitumorEfficacy of Arginine Modified Amphiphilic Nanoparticles Co-DeliveringDoxorubicin and SiSur-pDNA via the Multiple Synergistic Effect.Biomaterials2018,150,1-13.]。另外，阳离子聚合物全身循环时易吸附生物体内带负电的蛋白成分，稳定性差且易被RES系统识别并清除。
目前，大量研究致力于阳离子聚合物表面改性以期提高生物相容性，降低毒性，提高血液稳定性，延长循环时间。常见表面修饰如聚乙二醇(PEG)化，可降低表面电荷并增加空间位阻，减弱载体与蛋白间的相互作用，提高生物相容性，延长载体在体稳定性和循环时间。然而，PEG多次应用会引起明显的体液免疫反应，B细胞分泌的中和抗体结合PEG后，经PEG修饰的载体会被吞噬细胞识别和清除，其血液半衰期显著缩短，即PEG具有ABC(accelerated blood clearance)效应。两性离子甜菜碱(化学名称为三甲基甘氨酸)，具有超亲水特性，能有效抑制载体与蛋白或细胞膜发生过强的相互作用，使载体的蛋白吸附能力和溶血性均显著下降，从而避免RES的吞噬和肾脏的排泄，延长载体在体内的血液循环时间，且不具有PEG类似的多次给药后对体液免疫反应的激发。然而，两性离子的表面修饰会引起载体入胞能力下降，组织渗透性降低，从而降低载体递送效率。
许多疾病具有特殊的微环境特征，如肿瘤微环境中存在大量致炎因子、致血管新生的活性分子等，导致微环境低氧状态。细胞利用非氧气依赖的糖酵解过程获取能量，从而产生大量乳酸盐，以及过量的质子和二氧化碳，这些因素共同增强了胞外微环境的酸度，pH的范围通常为6.5-6.8。这种特异的弱酸环境为带有特定结构的中性或负电的药物载体发生电荷翻转、结构变化从而促进细胞摄取、提高药物递送效率提供了可能。
目前，基于高效抗蛋白吸附和病灶微酸环境响应性质子化双功能型两性离子载体的设计及其在肿瘤微环境调控药物或生物大分子递送领域的应用尚未见报道。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种在水溶液中自组装形成胶束，可用于肿瘤微环境调控药物和生物大分子药物的递送的弱酸可电离的两亲性两性离子载体；
本发明的第二目的是提供上述弱酸可电离的两亲性两性离子载体的制备方法；
本发明的第三目的是提供包含上述弱酸可电离的两亲性两性离子载体的胶束递药系统；
本发明的第四目的是提供上述弱酸可电离的两亲性两性离子载体的应用。
本发明提供一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体，该载体包括亲水性阳离子聚合物骨架、两性离子甜菜碱单体和含有叔胺结构的pH敏感单体分子；所述两性离子甜菜碱单体和含有叔胺结构的pH敏感单体分子接枝在所述亲水性阳离子聚合物骨架上；所述含有叔胺结构的pH敏感单体分子的pKa为6.0-7.2；所述两亲性两性离子载体结构通式如下：
Dn-CP-TAm
其中所述的CP为亲水性阳离子聚合物骨架，分子量600-500000Da，接枝率为共价连接到亲水性阳离子聚合物骨架上的分子与亲水性阳离子聚合物骨架总氨基的摩尔百分比；D为两性离子甜菜碱单体；n为亲水性阳离子聚合物骨架上两性离子甜菜碱单体的接枝率，所述的两性离子甜菜碱单体接枝率为5％-80％；TA为含有叔胺结构的pH敏感单体分子，m为阳离子聚合物上含有叔胺结构的pH敏感单体分子的接枝率，所述的接枝率为5-50％。
其中，两性离子甜菜碱单体可抗生物体内蛋白吸附，发挥血液长循环作用；含有叔胺结构的pKa为6.0-7.2的pH敏感单体分子在人体血液pH环境下为不带电疏水结构，在病灶弱酸性微环境下转变为质子化亲水结构。具体来说上述人体血液pH环境是指pH为7.35-7.45，病灶弱酸性微环境是指pH为6.0-7.2。
优选地，上述亲水性阳离子聚合物骨架包括非生物可降解性阳离子聚合物骨架和生物可降解型阳离子聚合物骨架，其中，非生物可降解型阳离子聚合物骨架为聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺、聚丙烯亚胺中的一种，生物可降解型阳离子聚合物骨架为壳聚糖、环糊精、聚氨基酯、聚-L-赖氨酸以及含有二硫键的阳离子高分子聚合物中的一种；上述亲水性阳离子聚合物骨架均为已知的对人体无基因毒性，无强烈致癌性且生物相容性较好的亲水性阳离子聚合物。
优选地，上述两性离子甜菜碱单体结构母核为羧酸基甜菜碱和磺基甜菜碱。
优选地，上述含有叔胺结构的pKa为6.0-7.2的pH敏感单体分子为2-氮杂环庚烷乙基甲基丙烯酸、异硫氰酸二乙基氨基丙酯和二乙基氨基丙胺中的一种或多种。
进一步地，上述弱酸可电离的两亲性两性离子载体中，亲水性阳离子聚合物骨架分子量为600-500,000Da；两性离子甜菜碱单体接枝率为5％-80％，含有叔胺结构的pKa为6.0-7.2的pH敏感单体分子的接枝率为5-50％。
本发明另一方面提供上述一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体的制备方法，包括以下步骤：
1)通过迈克尔加成反应或酰胺化反应将所述两性离子甜菜碱单体接枝到所述亲水性阳离子聚合物骨架上，得到两性离子甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体；
2)使所述含有叔胺结构的pH敏感单体分子与步骤1)所述的两性离子甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体的氨基发生亲核加成反应，得到所述弱酸可电离的两亲性两性离子载体。
优选地，步骤1)所述迈克尔加成反应或酰胺化反应，以及步骤2)中所述的亲核加成反应使用的溶剂均为水、丙酮、甲醇、二甲基亚砜、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、水与甲醇的混合溶剂、水与二甲基亚砜的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。
优选地，所述两性离子甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体，可以具体采用下列a和b方法中任意方法制备得到：
a.将亲水性阳离子聚合物骨架溶于反应溶剂中，加入两性离子甜菜碱单体，进行迈克尔加成反应，室温反应2-3天，透析，冻干，得到甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体；
b.或将亲水性阳离子聚合物骨架和两性离子甜菜碱单体溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)或N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化剂进行酰胺反应，透析，冻干制得两性离子甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体。
所述弱酸可电离的两亲性两性离子载体，具体采用下列方法制备得到：
将两性离子甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体和含有叔胺结构的pKa为6.0-7.2的pH敏感单体分子(DEAP)溶于反应溶剂中，以吡啶和三乙胺或二环己基碳二亚胺(DCC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)和三乙胺为活化剂进行亲核加成或酰胺化反应，得到弱酸可电离的两亲性两性离子载体。
本发明还提供一种包含上述的弱酸可电离的两亲性两性离子载体的胶束递药系统，所述递送系统由可电离的两亲性两性离子载体和包载在两亲性两性离子载体内核中的肿瘤微环境调控药物或负载在两亲性两性离子载体表面的生物大分子药物组成。
优选地，所述肿瘤微环境调控药物为肿瘤基质细胞靶向药物、肿瘤相关免疫细胞靶向药物、肿瘤新生血管靶向药物、调控肿瘤细胞和微环境内肿瘤相关细胞的相互作用的药物、逆转肿瘤基质酸性和乏氧的药物中的一种或多种；所述生物大分子药物为质粒、siRNA、miRNA、shRNA、Aptamer、肽核酸、反义RNA、反义DNA等核酸类药物以及具生物活性的蛋白类药物中的一种或多种。
上述一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体，在水介质中自组装形成两性离子胶束，可于内核包载肿瘤微环境调控药物，还可表面负载生物大分子药物，并采用下述方法A～D中的任意一种制备得到：
A、将所述弱酸可电离的两亲性两性离子载体溶解或分散在水中，经高压均质或探头超声处理形成两性离子胶束溶液，将所述肿瘤微环境调控药物用药学上可接受的有机溶剂溶解或分散后与所述两性离子胶束溶液混合，进行高压均质或探头超声处理后，除去有机溶剂和游离药物分子，经冷冻干燥制得所述胶束递药系统；
B、将所述弱酸可电离的两亲性两性离子载体和所述肿瘤微环境调控药物溶解或分散于药学上可接受的有机溶剂，进行高压均质或探头超声处理后，除去有机溶剂和游离药物分子，经冷冻干燥制得所述胶束递药系统；
C、将弱酸可电离的两亲性两性离子载体溶解或分散在水相溶液中，经搅拌、超声或高压均质处理形成两性离子胶束溶液，将所述得到的两性离子胶束溶液与含生物大分子药物的溶液通过吹打或涡旋10s-60s混合，37℃孵育20min-60min制得所述胶束递药系统；
D、将通过A方法下制备得到的包载了肿瘤微环境调控药物的胶束溶液与含生物大分子药物的溶液通过吹打或涡旋10s-60s混合，37℃孵育20min-60min制得所述胶束递药系统。
有益效果：
1、本发明的一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体中，两性离子甜菜碱单体具有抗生物体内蛋白吸附作用，可减弱阳离子聚合物对蛋白的吸附能力和溶血能力，延长载体血液循环时间，促进载体在疾病部位蓄积，从而提高生物大分子类药物递送效率。
2、本发明的一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体在正常生理条件下(pH7.35-7.45)可自组装为稳定的内部疏水、外部亲水的胶束；在疾病部位弱酸环境中，含有叔胺结构的pKa为6.0-7.2的pH敏感单体分子转变为质子化亲水结构，造成负载的肿瘤微环境调控药物于肿瘤基质内特异性释放，有效调控基质微环境，同时两性载体的表面正电荷密度增大从而促进靶细胞摄取，提高生物大分子药物递送效率。
附图说明
图1为实施例7制备的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束抗蛋白吸附能力结果图；
图2为实施例9制备的荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统核酸负载能力结果图；
图3为实施例9制备的载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统在4T1细胞模型的体外摄取结果图；
图4为实施例12制备的包载槲皮素的胶束递药系统在4T1细胞体外瘤球模型中的抑瘤效果结果图。
图5为实施例15制备的共载槲皮素和siVEGF胶束递药系统在4T1细胞模型的体外药效结果图；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下列实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1
磺基甜菜碱修饰聚乙烯亚胺衍生物(D-PEI)的制备
将0.4g PEI(MW 1800Da)溶于甲醇溶液，加入0.27g磺基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO＝1kD)48-72h，冻干得到磺基甜菜碱修饰聚乙烯亚胺衍生物(D-PEI)。
实施例2
羧基甜菜碱修饰羟乙基壳聚糖衍生物(D-HECS)的制备
将0.1g羟乙基壳聚糖溶于二甲亚砜和甲醇(v/v＝1:3)的混合溶液中，加入0.59g羧基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO＝14kD)48-72h，冻干得到羧基甜菜碱修饰羟乙基壳聚糖衍生物(D-HECS)。
实施例3
羧基甜菜碱修饰聚赖氨酸衍生物(D-PLL)的制备
将0.5g聚赖氨酸(MW 10000Da)溶于N,N-二甲基甲酰胺和甲醇(v/v＝1:1)的混合溶液中，加入0.34g羧基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO＝3.5kD)48-72h，冻干得到羧基甜菜碱修饰聚赖氨酸衍生物(D-PLL)。
实施例4
磺基甜菜碱-聚乙烯亚胺-异硫氰酸二乙基氨基丙酯(D-PEI-DEAP)的制备和表征
将0.1g实施例1制备的中间产物D-PEI、0.1g异硫氰酸二乙基氨基丙酯溶于水和甲醇的混合溶液(v/v＝1:1)，加入0.1mL三乙胺和0.05mL吡啶，常温反应24-48h，将反应液滴加至水中稀释，搅拌1-2h后超声(100w)30min，透析(MWCO＝14000)48-72h，冻干得磺基甜菜碱-聚乙烯亚胺-异硫氰酸二乙基氨基丙酯(D-PEI-DEAP)。在核磁共振氢谱中，合成产物在化学位移2.1ppm以及2.3ppm附近分别出现了DMAAPS分子结构中亚甲基的氢特征峰，在化学位移1.2ppm附近出现了DEAP分子结构中的甲基单峰，说明成功合成D-PEI-DEAP聚合物。
实施例5
羧基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-二乙基氨基丙胺(D-HECS-DEAP)的制备和表征
将0.1g实施例2制备的中间产物D-HECS、0.2g二乙基氨基丙胺溶于二甲基亚砜，加入0.1mL三乙胺和0.05mL吡啶，常温反应24-48h，将反应液滴加至水中稀释，搅拌1-2h后超声(100w)30min，透析(MWCO＝14000)48-72h，冻干得羧基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-二乙基氨基丙胺(D-HECS-DEAP)。在核磁共振氢谱中，合成产物在化学位移2.1ppm以及2.3ppm附近分别出现了DMAAPS分子结构中亚甲基的氢特征峰，在化学位移1.2ppm附近出现了DEAP分子结构中的甲基单峰，说明成功合成D-HECS-DEAP聚合物。
实施例6
羧基甜菜碱-聚赖氨酸-二乙基氨基丙胺(D-PLL-DEAP)的制备和表征
将0.1g实施例3制备的中间产物D-PLL、0.2g二乙基氨基丙胺溶于二甲基亚砜，加入0.1mL三乙胺和0.05mL吡啶，常温反应24-48h，将反应液滴加至水中稀释，搅拌1-2h后超声(100w)30min，透析(MWCO＝14000)48-72h，冻干得羧基甜菜碱-聚赖氨酸-二乙基氨基丙胺(D-PLL-DEAP)。在核磁共振氢谱中，合成产物在化学位移2.1ppm以及2.3ppm附近分别出现了DMAAPS分子结构中亚甲基的氢特征峰，在化学位移1.2ppm附近出现了DEAP分子结构中的甲基单峰，说明成功合成D-PLL-DEAP聚合物。
实施例7
弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束的制备和表征
将20mg实施例4～6制备的弱酸可电离的两亲性两性离子载体分别溶于4mL水，冰浴超声(100w，20min)或高压均质(1300bar，9次循环)后过0.8μm滤膜即得自组装纳米胶束溶液。
粒径：Zetasizer 3000HS instrument(Malvern Instruments,Malvern,UK)测定样品粒径。使用实施例4～6制备的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束的理化性质见表1。
结果见表1。
表1弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束的表征
Figure BDA0002408585940000081
实施例8
弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束抗蛋白吸附能力
将实施例7制备的胶束溶液(对应表1中使用实施例4制备的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束，简写为Dn-PEI-DEAP)与牛血清白蛋白(BSA)溶液(2mg/mL)等体积混合，置于气浴恒温振荡器中(温度37℃，转速100rpm)，孵育4h后，将其离心(12000rpm，15min)，吸取上清液，利用紫外-可见分光光度计测280nm处紫外吸光度值A。
通过已知的BSA标准曲线计算上述各上清液中的BSA浓度，根据下述公式计算出样品的牛血清白蛋白的吸附值A。
Figure BDA0002408585940000082
公式中C0为初始溶液中BSA的浓度(2mg/mL)、V0是初始BSA溶液的体积，Ci为吸附实验后上清液中BSA的浓度，Vi为吸附实验后的BSA溶液总体积，m为聚合物材料总质量。
结果如图1所示，D9％-PEI-DEAP、D16％-PEI-DEAP、D23％-PEI-DEAP载体胶束对BSA的平均吸附值A分别为0.70±0.050、0.56±0.055、0.33±0.040；其中蛋白吸附值A越小，表明样品越不易被蛋白吸附，即其抗蛋白吸附能力越强。结果表明载体中甜菜碱接枝率影响载体胶束的抗蛋白吸附能力，且具有越高甜菜碱接枝率的载体胶束抗蛋白吸附能力越强。
实施例9
荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的制备和表征
根据N/P＝6，将预先计算得出的适当体积的实施例7制得的自组装纳米胶束溶液(按照甜菜碱接枝率为23％)与miRNA的超纯水溶液混合，并涡旋30s，随后在常温下静置30min，得到载体与miRNA充分结合形成的基因复合物胶束递药系统。
粒径电位：Zetasizer 3000HS instrument(Malvern Instruments,Malvern,UK)分别测定pH 7.4和pH 6.8下的样品粒径和电位。使用实施例4～6制备的荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的理化性质见表2。
表2荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的表征
Figure BDA0002408585940000091
实施例10
荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统基因负载能力
选择一系列不同氮磷比(N/P＝0，3，6，9)，将实施例9制备的基因复合物胶束溶液(对应表2中使用实施例4制备的荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统，简写为D23％-PEI-DEAP/miRNA，N/P＝0，3，6，9)，与Loading Buffer混合，进行1％琼脂糖凝胶电泳阻滞实验。
结果如图2所示，载体胶束表现出压缩miRNA的能力，随着N/P增加，结合miRNA的能力不断加强，在N/P＝6时，载体胶束可完全阻滞miRNA条带泳动，意味着此时载体胶束完全络合miRNA。
实施例11
荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统在4T1细胞中的摄取
取处于对数生长期且生长状态良好的4T1细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基终止消化，将细胞悬液离心，弃去上清，用DMEM完全培养基重悬，稀释至1×105cell/mL，接种于24孔板中。待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入用不同pH的DMEM培养基稀释成相同FITC浓度的实施例9制备的基因(Cy3荧光标记miRNA)复合物胶束溶液(对应表2中使用实施例4制备的荷载miRNA的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统，简写为D23％-PEI-DEAP/Cy3-miRNA,N/P＝6)，孵育4h后弃去上层液体，用PBS洗涤3次，胰酶消化，培养基终止消化后用PBS重悬细胞，最后于流式定量分析。
结果如图3所示，pH 6.8条件下，包载miRNA的胶束在4T1细胞内的摄取量显著高于pH 7.4时胶束在4T1细胞内的摄取量，这是由于pH 6.8时，胶束的部分结构发生质子化，正电荷显著增加，促进其被肿瘤细胞摄取入胞，最终提高miRNA转染效率。
实施例12
包载槲皮素的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的制备和表征
槲皮素11.50mg溶于无水乙醇，滴加入实施例7制得的自组装纳米胶束溶液(按照甜菜碱接枝率为23％)中，冰浴超声(100w)30min，透析(MWCO＝14000)12h。离心5-10min(3000r/min)，0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥，得到包载槲皮素的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统。
粒径电位：Zetasizer 3000HS instrument(Malvern Instruments,Malvern,UK)分别测定pH 7.4和pH 6.8下的样品粒径和电位。使用实施例4-6制备的载有槲皮素的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的理化性质见表3。
表3载有槲皮素的弱酸可电离的载体胶束递药系统的表征
Figure BDA0002408585940000101
实施例13
包载藤黄酸的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的制备和表征
将20mg实施例4～6制备的弱酸可电离的两亲性两性离子载体和12.60mg藤黄酸溶于DMSO中，冰浴超声(150w)30min，透析(MWCO＝14000)24h，0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥，得到包载藤黄酸的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统。
粒径电位：Zetasizer 3000HS instrument(Malvern Instruments,Malvern,UK)分别测定pH 7.4和pH 6.8下的样品粒径和电位。使用实施例4～6制备的载有藤黄酸的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的理化性质见表4。
表4载有槲皮素的弱酸可电离的载体胶束递药系统的表征
Figure BDA0002408585940000111
实施例14
包载槲皮素的弱酸可电离的载体胶束递药系统在4T1细胞瘤球模型中的抑瘤效果
取处于对数生长期且状态良好的4T1贴壁细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基终止消化，将细胞悬液离心，弃去上清，用DMEM完全培养基重悬，稀释成6×105cell/mL的4T1细胞悬液。将4T1细胞悬液吹匀后，以0.1mL/孔加入96孔板，培养5d。待细胞聚集成球后，吸弃培养液，分别加入不同pH的DMEM培养基稀释成相同FITC浓度的实施例12制备得到的胶束溶液，对应表3中使用实施例4制备的包载槲皮素的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统，简写为D23％-PEI-DEAP/QUE。以无血清培养基组为对照组control，每隔3d进行换液，并在倒置显微镜下用明场观察瘤球形态。
结果如图4所示，对照组瘤球形态越来越紧凑；而pH 7.4的给药组在第6天瘤球形态发生变化，第9天开始停止生长；pH 6.8的给药组在第9天发生解体，失去3D结构。结果表明弱酸可电离的载体胶束递药系统可响应肿瘤微环境，渗透进入肿瘤内部，释放药物发挥肿瘤微环境调控作用，从而强效抗肿瘤。
实施例15
共载槲皮素和siVEGF的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的制备和表征
将实施例12制备的包载槲皮素的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统溶于适量150mM NaCl溶液中，使聚合物质量浓度为1.0mg/mL；然后根据N/P＝6，将预先计算得出的适当体积的聚合物NaCl溶液与siVEGF的超纯水溶液混合，并涡旋30s，随后在常温下静置30min，得到共载槲皮素与siVEGF的载体胶束递药系统。
粒径电位：Zetasizer 3000HS instrument(Malvern Instruments,Malvern,UK)分别测定pH 7.4和pH 6.8下的样品粒径和电位。使用实施例4～6制备的共载槲皮素和siVEGF的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的理化性质见表5。
表5共载槲皮素和siVEGF的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统的表征
Figure BDA0002408585940000121
实施例16
共载槲皮素和siVEGF的弱酸可电离的载体胶束递药系统在4T1细胞模型中的抑瘤作用
将4T1细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔细胞板中，将板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，吸出孔中培养液，用PBS洗涤3次。分别加入用不同pH的DMEM培养基稀释成相同FITC浓度的实施例15制备得到的胶束溶液，对应表4中使用实施例4制备的共载槲皮素和siVEGF的弱酸可电离的两亲性两性离子载体胶束递药系统，简写为D23％-PEIsiVEGF-DEAPQUE。置于培养箱中继续孵育48h。每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4h后，吸出孔内液体，每孔加入150μL的DMSO，置摇床上充分振摇以使结晶充分溶解。用酶联免疫检测仪在570nm处测定各孔的吸光值ODsample。无样品的对照组以相同操作测定其吸光值ODcontrol。按下列计算4T1细胞的存活率。
Figure BDA0002408585940000122
其中，ODsample是加入样品的供试孔吸光值，ODcontrol是仅加入培养基的对照孔吸光值。
结果如图5所示，与PBS组相比，给药各组均有一定抑制肿瘤生长作用。pH 6.8条件下，共载槲皮素和siVEGF的胶束递药系统产生的协同抗肿瘤效果显著高于单载任意一种药物的胶束递药系统。其中，共载槲皮素和siVEGF的胶束递药系统在pH 6.8条件下IC50值为0.0515μg/mL。共载槲皮素和siVEGF的胶束递药系统在pH 6.8条件下较pH 7.4条件下更高效释放药物，从而发挥更强协同抗肿瘤效果。

Claims (7)

1.一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体，其特征在于：该载体包括亲水性阳离子聚合物骨架、两性离子甜菜碱单体和含有叔胺结构的pH敏感单体分子；所述两性离子甜菜碱单体和含有叔胺结构的pH敏感单体分子接枝在所述亲水性阳离子聚合物骨架上；所述含有叔胺结构的pH敏感单体分子的pKa为6.0-7.2；所述两亲性两性离子载体结构通式如下：
Dn-CP-TAm
其中所述的CP为亲水性阳离子聚合物骨架，分子量600-500000 Da，接枝率为共价连接到亲水性阳离子聚合物骨架上的分子与亲水性阳离子聚合物骨架总氨基的摩尔百分比；D为两性离子甜菜碱单体；n为亲水性阳离子聚合物骨架上两性离子甜菜碱单体的接枝率，所述的两性离子甜菜碱单体接枝率为5%-80%；TA为含有叔胺结构的pH敏感单体分子，m为阳离子聚合物上含有叔胺结构的pH敏感单体分子的接枝率，所述的接枝率为5-50%；所述两性离子甜菜碱单体为羧酸基甜菜碱和磺基甜菜碱；所述含有叔胺结构的pH敏感单体分子为2-氮杂环庚烷乙基甲基丙烯酸、异硫氰酸二乙基氨基丙酯和二乙基氨基丙胺中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体，其特征在于：所述亲水性阳离子聚合物骨架包括非生物可降解性阳离子聚合物骨架和生物可降解型阳离子聚合物骨架，其中，非生物可降解型阳离子聚合物骨架为聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺、聚丙烯亚胺中的一种，生物可降解型阳离子聚合物骨架为壳聚糖、环糊精、聚氨基酯、聚-L-赖氨酸以及含有二硫键的阳离子高分子聚合物中的一种。
3.权利要求1~2中任意一项所述的一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1）通过迈克尔加成反应或酰胺化反应将所述两性离子甜菜碱单体接枝到所述亲水性阳离子聚合物骨架上，得到两性离子甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体；
2）使所述含有叔胺结构的pH敏感单体分子与步骤1）所述的两性离子甜菜碱单体修饰的两性离子聚合物中间体的氨基发生亲核加成反应，得到所述弱酸可电离的两亲性两性离子载体。
4.根据权利要求3所述的一种弱酸可电离的两亲性两性离子载体的制备方法，其特征在于：步骤1）所述迈克尔加成反应或酰胺化反应，以及步骤2）中所述的亲核加成反应使用的溶剂均为水、丙酮、甲醇、二甲基亚砜、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、水与甲醇的混合溶剂、水与二甲基亚砜的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。
5.一种包含权利要求1~2中任意一项所述的弱酸可电离的两亲性两性离子载体的胶束递药系统，其特征在于：所述递送系统由可电离的两亲性两性离子载体和包载在两亲性两性离子载体内核中的肿瘤微环境调控药物或负载在两亲性两性离子载体表面的生物大分子药物组成。
6.根据权利要求5所述的胶束递药系统，其特征在于：所述肿瘤微环境调控药物为肿瘤基质细胞靶向药物、肿瘤相关免疫细胞靶向药物、肿瘤新生血管靶向药物、调控肿瘤细胞和微环境内肿瘤相关细胞的相互作用的药物、逆转肿瘤基质酸性和乏氧的药物中的一种或多种；所述生物大分子药物为质粒、siRNA、miRNA、shRNA、Aptamer、肽核酸、反义RNA、反义DNA核酸类药物以及具生物活性的蛋白类药物中的一种或多种。
7.一种权利要求6所述的胶束递药系统的制备方法，其特征在于：所述制备方法为方法A~D中的任意一种：
A、将所述弱酸可电离的两亲性两性离子载体溶解或分散在水中，经高压均质或探头超声处理形成两性离子胶束溶液，将所述肿瘤微环境调控药物用药学上可接受的有机溶剂溶解或分散后与所述两性离子胶束溶液混合，进行高压均质或探头超声处理后，除去有机溶剂和游离药物分子，经冷冻干燥制得所述胶束递药系统；
B、将所述弱酸可电离的两亲性两性离子载体和所述肿瘤微环境调控药物溶解或分散于药学上可接受的有机溶剂，进行高压均质或探头超声处理后，除去有机溶剂和游离药物分子，经冷冻干燥制得所述胶束递药系统；
C、将弱酸可电离的两亲性两性离子载体溶解或分散在水相溶液中，经搅拌、超声或高压均质处理形成两性离子胶束溶液，将所述得到的两性离子胶束溶液与含生物大分子药物的溶液通过吹打或涡旋10 s-60 s混合，37 ℃孵育20 min-60 min制得所述胶束递药系统；
D、将通过A方法下制备得到的包载了肿瘤微环境调控药物的胶束溶液与含生物大分子药物的溶液通过吹打或涡旋10 s-60 s混合，37 ℃孵育20 min-60 min制得所述胶束递药系统。
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