KR20180063255A - 캄프토테신 제약 조성물의 안정화 - Google Patents

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다릴 씨. 드루몬드
드미트리 비. 키르포틴
마크 이몬 헤이스
찰스 노블
케빈 케스퍼
안토인 엠. 어와드
더글라스 제이. 무어
앤드류 제이. 오'브라이언
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입센 바이오팜 리미티드
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Abstract

개선된 저장 안정성을 갖는 이리노테칸 인지질 리포솜이, 관련된 치료 및 제조 방법과 함께 제공된다. 이리노테칸 리포솜은 저장 동안 및 환자에게의 투여 전에 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)의 감소된 형성을 가질 수 있다.

Description

캄프토테신 제약 조성물의 안정화
우선권 주장
본 특허 출원은 미국 특허 가출원 일련 번호 62/242,835 (2015년 10월 16일 출원), 62/242,873 (2015년 10월 16일 출원), 62/244,061 (2015년 10월 20일 출원) 및 62/244,082 (2015년 10월 20일 출원)를 우선권 주장하며, 각각의 이들 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 캄프토테신 화합물을 포함하는 제약 조성물의 안정화, 예컨대 저장 동안에 리소-지질의 형성을 감소시키도록 안정화된 리포솜성 캄프토테신 제약 제형에 관한 것이다.
캄프토테신 화합물 (예컨대 이리노테칸 또는 토포테칸)은 인간 신체 내의 종양 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 형태의 암의 치료를 위한 주사가능한 리포솜 제약 제품은 캄프토테신 화합물을 캡슐화하는 리포솜의 분산액으로서 제조될 수 있다. 리포솜성 캄프토테신 조성물은 콜레스테롤 및 하나 이상의 인지질(들) ("PL")을 포함하는 리포솜 내에 다가음이온성 포획제와 함께 캄프토테신 화합물을 캡슐화할 수 있다. 그러나, 인지질의 가수분해 및 캄프토테신의 활성 락톤 구조의 가수분해가 하나 이상의 인지질을 갖는 캄프토테신 리포솜에서 발생할 수 있다. 리포솜성 인지질 예컨대 포스파티딜콜린 ("PC"+)의 가수분해성 분해는 리포솜으로부터의 캄프토테신 화합물, 예를 들어 이리노테칸의 방출을 변경시킬 수 있다. PL (예컨대 PC)의 가수분해에서의 제1 단계는 리소-PL (예컨대 글리세릴포스포콜린 지방산 모노에스테르인 리소포스파티딜콜린 ("리소-PC"))의 형성을 유도할 수 있다.
리포솜성 캄프토테신 조성물은 적어도 2가지 측면에서 pH의 영향을 받는다. 첫째로, 리포솜성 캄프토테신 (예를 들어, 리포솜성 이리노테칸) 인지질의 가수분해성 분해는 pH 의존성인 경향이 있으며, 6.0 또는 6.5의 pH가 포스파티딜콜린의 가수분해를 최소화하는 것으로 생각된다. pH가 6.5 초과인 조건은 (1) 캄프토테신 화합물, 예를 들어 이리노테칸의 보다 덜 활성인 카르복실레이트 형태로의 전환 및 (2) 리포솜 내의 리소-PC의 양을 증가시키는 경향이 있다. 둘째로, 캄프토테신 화합물은 보다 덜 활성인 카르복실레이트 형태 (중성 및 알칼리성 pH에서 우세함)와 산성 pH에서 우세한 보다 활성인 락톤 형태 사이에서 pH-의존성 전환을 겪는다. 예를 들어, 이리노테칸의 카르복실레이트 형태의 락톤 형태로의 전환은 주로 pH 6.0 (이리노테칸의 약 85%가 보다 활성인 락톤 형태임) 내지 pH 7.5 (이리노테칸의 단지 약 15%가 보다 활성인 락톤 형태임)에서 발생한다. pH 6.5에서는, 이리노테칸의 약 65%가 보다 활성인 락톤 형태이다.
6.5의 pH에서 제조된 인지질-함유 리포솜성 캄프토테신의 안정성은 예상외로 냉장 조건 (2-8℃) 하의 저장 동안에 리소-PC의 형성에 의해 불리한 영향을 받는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 샘플 12의 이리노테칸 리포솜 조성물 (pH 6.5에서 제조된, 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE를 포함하는 이리노테칸 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트)은 제조 후 냉장 저장 (2-8℃)의 처음 3개월 동안 (이리노테칸 리포솜 조성물 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 30 mol%를 초과하는 수준의 리소-PC를 후속적으로 생성하였다 (또한 처음 9개월 동안 35mol% 초과의 리소-PC가 생성되었음).
따라서, 안정화된 캄프토테신 제약 조성물에 대한 필요성이 계속해서 남아있다. 예를 들어, 제조 후 2-8℃에서의 냉장 저장 동안 리소-PC를 보다 적게 생성하는 이리노테칸의 보다 안정한, 개선된 리포솜성 제형에 대한 필요성이 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 다룬다.
본 발명은 개선된 안정성을 갖는 신규 캄프토테신 제약 조성물 (예를 들어, 리포솜성 이리노테칸), 예컨대 리소-인지질 ("리소-PL") (예를 들어, 리소-포스파티딜콜린, 또는 "리소-PC")의 감소된 형성 비율을 갖는 에스테르-함유 인지질을 포함하는 캄프토테신 리포솜성 조성물을 제공한다. 본 발명은, 부분적으로, 2-8℃에서의 연장된 저장 후에 감소된 양의 리소-인지질을 생성하는 캄프토테신 화합물 (예를 들어, 이리노테칸)의 리포솜성 조성물이 제조될 수 있다는 놀라운 인식에 기반한 것이다. 이러한 안정화된 리포솜성 조성물의 제조는 리포솜 제조 동안 특정한 파라미터 (포획제의 양 대비 약물-대-인지질의 비, 리포솜성 제제의 pH 및 리포솜성 제제 내의 포획제 반대-이온의 양)의 제어가 캄프토테신 리포솜성 제제의 저장 동안 리소-인지질의 형성을 상승작용적으로 감소시킨다는 예상외의 발견에 의해 가능해진다. 본 발명은 보다 강건한, 개선된 리포솜 조성물을 설계하고 확인함과 동시에, 이러한 조성물의 개발과 연관된 비용을 감소시키기 위한 극도로 가치있는 정보를 제공한다.
하나 이상의 인지질(들) (PEG-함유 인지질(들) 포함)을 포함하는 안정화된 캄프토테신 조성물은 바람직하게는 4℃에서의 처음 6개월의 저장 동안 저장 중에 20 mol% 이하의 리소-PL (총 리포솜 인지질 대비) 및/또는 4℃에서의 처음 9개월의 저장 동안 저장 중에 25 mol% 이하의 리소-PL을 형성한다. 안정화된 이리노테칸 리포솜은 바람직하게는 캄프토테신 조성물의 제조 이후, 4℃에서의 처음 9개월의 저장 동안 개월당 약 2 mol% 미만 (예를 들어, 0.5-1.5 mol%)의 리소-PL의 평균 비율로 리소-PL을 형성한다. 바람직한 안정화된 캄프토테신 조성물은 콜레스테롤 및 하나 이상의 인지질(들) (PEG-함유 인지질(들) 포함)을 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물에 이리노테칸 또는 그의 염 (예를 들어 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트)을 포함하며, 4℃에서 6개월 동안 저장 중에 20 mol% 이하의 리소-PC (총 리포솜 인지질 대비) 및/또는 4℃에서 9개월 동안 저장 중에 25 mol% 이하의 리소-PC를 형성한다 (예를 들어, 제조 후 처음 6 및/또는 9개월의 안정성 시험 동안). 안정화된 이리노테칸 리포솜은 4℃에서의 저장 동안 (예를 들어, 제조 후 처음 9개월의 안정성 시험 동안) 개월당 약 2 mol% 미만 (예를 들어, 0.5-1.5 mol%)의 리소-PC의 비율로 리소-PC를 형성할 수 있다. 안정화된 포스파티딜콜린-함유 이리노테칸 리포솜 조성물은 제조 후 처음 9개월의 2-8℃에서의 안정성 시험 동안 1 mg 미만의 리소-PC를 생성할 수 있다.
제1 실시양태에서, 안정화된 리포솜성 캄프토테신 조성물은 6.5 초과 (예를 들어, 7.0-7.5, 예컨대 7.25, 7.3 또는 7.5)의 pH를 가지며, 0.9 초과 (예를 들어, 0.9-1.1)의 이리노테칸/술페이트 화합물 그램-당량비 ("ER")를 갖는 이리노테칸 및 술페이트 다가음이온성 포획제 (예를 들어, 이리노테칸 수크로소페이트 또는 "SOS")를 캡슐화하는 리포솜을 포함한다. ER은 이리노테칸 SOS 리포솜 제제에 대해, 리포솜 조성물의 단위 (예를 들어, 1 mL)당 리포솜으로 공동-캡슐화된 이리노테칸 (I) 및 술페이트 화합물 (S)의 몰량을 결정하고, 식: ER = I/(SN)을 사용함으로써 계산될 수 있으며, 여기서 N은 술페이트 화합물 음이온의 원자가 (예를 들어, 수크로소페이트의 경우에는 N이 8이고, 유리 술페이트, 즉 SO4 2-의 경우에는 N이 2임)이다. 바람직하게는, 술페이트 화합물 (S)은 SOS의 mol당 8개의 술페이트 모이어티를 함유하는, 수크로스 옥타술페이트이다.
제2 실시양태에서, 안정화된 리포솜성 캄프토테신 조성물은, 바람직하게는 약 950 초과 (예를 들어, 950-1050)의 안정성 비 ("SR")를 갖는 특정한 비의 캄프토테신, 음이온성 포획제 및 리포솜-형성 인지질을 사용하여 수득되며, 예컨대 약 990 초과 (예를 들어, 990-1,100, 예컨대 992-1,087)의 SR을 갖는 이리노테칸 리포솜이 제조된다. 이러한 실시양태는 하기에 더욱 자세히 설명된 바와 같은, 안정성 비에 의해 반영된 리포솜 안정성을 예측하는 제조 기준을 제공한다. 본 발명의 이러한 실시양태는, 부분적으로, 인지질-기재 캄프토테신-함유 리포솜이 (1) 캄프토테신 화합물(들) (예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸 등)을 (2) 폴리술페이트화된 음이온성 포획제 (예를 들어, 수크로스 옥타술페이트)를 캡슐화하는 리포솜과 반응시킴으로써 제조되는 경우에, 생성된 약물-로딩된 리포솜의 안정성이 포획제-리포솜 내의 술페이트 기의 초기 농도 및 리포솜 내의 캡슐화된 캄프토테신 대 인지질의 비에 좌우된다는 발견에 기반한 것이다. 안정성 비는 하기와 같이 정의된다: SR = A/B, 여기서 A는 조성물 내의 인지질의 몰당, 이리노테칸 유리 무수 염기와 등가의 그램으로, 약물 로딩 과정 동안 포획제 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 모이어티의 양이고; B는 몰/L로 표현된, 포획제 리포솜을 제조하는데 사용된 수크로소페이트 (또는 다른 포획제) 용액 내의 술페이트 기의 농도 (술페이트 기의 농도 기준)이다. 안정성 비는 놀랍게도 심지어 pH 6.5에서도, 인지질-기재 캄프토테신-함유 리포솜 내의 리소-PC의 형성에 있어서 현저한 감소를 예측하고: 약 942의 안정성 비로 제조된 포스파티딜콜린-함유 이리노테칸 리포솜 (샘플 3)은 4℃에서의 9개월의 저장 후에, 약 990의 안정성 비로 제조된 이리노테칸 리포솜 (샘플 2)에서 생성된 약 24 mol%의 리소-PC와 비교하여, 약 36 mol%의 리소-PC를 생성하였다 (즉, 이들 조건 하에 약 5%의 안정성 비 증가는 리소-PC 생성에서의 34% 감소를 야기함). 이와 달리, 이리노테칸 리포솜의 안정성 비를 724 (샘플 12)에서 942 (샘플 3)로 약 30% 증가시키면 4℃에서의 9개월의 저장 후에 약 1% 더 많은 리소-PC를 생성하였다 (예를 들어, 샘플 3의 35.7 mol%의 리소-PC 및 샘플 12의 35.4 mol%의 리소-PC의 비교).
제3 실시양태에서, 2-8℃에서의 저장 동안 생성된 감소된 양의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 갖는 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 신규 안정화된 조성물은 화학식 (I)의 이리노테칸 조성물을 포함할 수 있으며, 여기서 x는 8이다:
Figure pct00001
리포솜성 이리노테칸은 리포솜에 캡슐화된 화학식 (I)의 조성물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (I)의 조성물은 콜레스테롤 및 하나 이상의 인지질(들) (예를 들어, PEG-함유 인지질(들) 포함)을 포함하는 리포솜 내에 형성 (예를 들어, 침전)된다. 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물은 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물을 형성하는 과정에서, (1) 캄프토테신 화합물(들) (예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸 등)을 (2) 폴리술페이트화된 음이온성 포획제 (예를 들어, 수크로스 옥타술페이트)를 캡슐화하는 리포솜과 반응시킴으로써 리포솜 내에 형성될 수 있다. 바람직하게는, 리포솜성 이리노테칸 조성물은 6.5 초과 (예를 들어, 7.0-7.5, 예컨대 7.25, 7.3 및 7.5)의 pH를 갖는다.
바람직한 안정화된 캄프토테신 조성물은 수성 등장성 완충제 중에 콜레스테롤 및 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (예를 들어, MPEG-2000-DSPE)을 포함하는 이리노테칸 리포솜 내에 캡슐화된 이리노테칸 또는 그의 염 (예를 들어 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트)을 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물을 포함하며, 상기 리포솜성 이리노테칸 조성물은 2-8℃에서의 처음 3개월의 저장 후에 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유 (또는 형성)하고/거나, 2-8℃에서의 처음 6개월 (또는 180일)의 저장 후에 20 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유 (또는 형성)하고/거나, 2-8℃에서의 처음 9개월의 저장 후에 (예를 들어, 제조 후 처음 9개월의 안정성 시험 동안) 25 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유 (또는 형성)한다.
이리노테칸 리포솜은 바람직하게는 3:2:0.015 몰비의 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (예를 들어, MPEG-2000-DSPE)을 포함하며, 총 리포솜 인지질의 mmol당 500 mg (±10%)의 이리노테칸을 캡슐화한다. 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물은 바람직하게는 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 총 약 4.3 mg의 이리노테칸 모이어티를 제공하는 이리노테칸 리포솜을 포함하며, 이리노테칸의 적어도 약 98%가 이리노테칸 리포솜에 캡슐화되어 있다 (예를 들어, 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트, 예컨대 상기 화학식 (I)의 화합물로서). 특정의 바람직한 리포솜성 조성물은 7.00-7.50 (예를 들어, 7.0, 7.25, 7.3, 7.5)의 pH를 가지고, 이리노테칸 유리 무수 염기의 g으로, 총 리포솜 인지질의 mmol당 500 mg (±10%)의 이리노테칸 및 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 4.3 mg의 이리노테칸과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도에서, 콜레스테롤 및 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 단층의 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화하는 이리노테칸 리포솜의 분산액을 포함하며, 4℃에서의 처음 6개월의 저장 동안 1 mg/mL 미만의 리소-PC를 형성하도록 안정화된, 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물이다. 예를 들어, 특정의 바람직한 제약 리포솜성 이리노테칸 조성물은 수성 등장성 완충제 중의 4.3 mg/mL의 이리노테칸 모이어티, 6.81 mg/mL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 2.22 mg/mL의 콜레스테롤 및 0.12 mg/mL의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)에서 이리노테칸에 캡슐화된 이리노테칸 또는 그의 염 (예를 들어, 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트)을 포함하며, 상기 리포솜 조성물은 2-8℃에서의 3개월의 저장 후에 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하고/거나, 2-8℃에서의 6개월 (또는 180일)의 저장 후에 20 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하고/거나, 2-8℃에서의 9개월의 저장 후에 25 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유한다.
일부 실시양태에서, 리포솜성 조성물은 이리노테칸 모이어티를 함유하는 용액을 0.4-0.5 M의 농도에서 (술페이트 기 농도 기준) TEA8SOS로서 트리에틸암모늄 (TEA) 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제를 캡슐화하는 포획제 리포솜 (바람직하게는 TEA8SOS 포획제 용액)과, PL을 함유하는 포획제 리포솜 내에 500 g (±10%)의 이리노테칸 모이어티 / mol 인지질을 로딩하고, 포획제 리포솜으로부터 TEA 양이온의 방출을 가능하게 하는데 효과적인 조건 하에 접촉시켜 이리노테칸 SOS 리포솜을 형성하고, (b) 7.25-7.50의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물을 수득하도록 이리노테칸 SOS 리포솜을 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)과 조합하여, 4℃에서의 3개월의 저장 동안 (이리노테칸 리포솜 조성물 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하도록 안정화된 이리노테칸 리포솜 조성물을 수득하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.
예를 들어, 본 발명은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진, 직경이 대략 110 nm인 단층의 지질 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 (SOS)를 캡슐화하는 안정화된 이리노테칸 리포솜을 포함하며, 여기서 안정화된 이리노테칸 리포솜은 (a) 이리노테칸을 0.4-0.5 M의 농도에서 (술페이트 기 농도 기준) TEA8SOS로서 트리에틸암모늄 (TEA) 양이온 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제를 캡슐화하는 포획제 리포솜과, 포획제 리포솜 내에 500 g (±10%)의 이리노테칸 모이어티 / mol 인지질을 로딩하고, 포획제 리포솜으로부터 TEA 양이온의 방출을 가능하게 하는데 효과적인 조건 하에 접촉시켜 이리노테칸 SOS 리포솜을 형성하는 단계, 및 (b) 7.25-7.50의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물을 수득하도록 이리노테칸 SOS 리포솜을 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)과 조합하여, 4℃에서의 3개월의 저장 동안 (이리노테칸 리포솜 조성물 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하도록 안정화된 이리노테칸 리포솜 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 이리노테칸 리포솜 조성물을 제공한다.
리포솜성 이리노테칸 조성물은 다양한 형태의 암이 진단된 환자의 치료에 유용하다. 예를 들어, 리포솜성 이리노테칸은 다른 항신생물제 없이 소세포 폐암 (SCLC)의 치료를 위해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포솜성 이리노테칸 조성물은 다른 항신생물제와 조합되어 투여된다. 예를 들어, 리포솜성 이리노테칸 조성물, 5-플루오로우라실 및 류코보린은 (다른 항신생물제 없이) 겜시타빈-기반 요법 이후에 질환 진행이 있는 췌장의 전이성 선암종이 진단된 환자의 치료를 위해 투여될 수 있다. 리포솜성 이리노테칸 조성물, 5-플루오로우라실, 류코보린 및 옥살리플라틴은 (다른 항신생물제 없이) 췌장암이 진단된, 이전에 치료받지 않은 환자의 치료를 위해 투여될 수 있다. 리포솜성 이리노테칸 조성물, 5-플루오로우라실, 류코보린 및 EGFR 억제제 (예를 들어, 올리고클로날 항체 EGFR 억제제 예컨대 MM-151)는 결장직장암이 진단된 환자의 치료를 위해 투여될 수 있다.
본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 리포솜성 조성물은 인지질의 mol당 471 g 또는 500 g (±10%)의 이리노테칸 유리 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 비로, 인지질의 몰에 대한 그램 양의 이리노테칸 (유리 염기 또는 염 형태)을 함유한다.
본원에 사용된 (또한 달리 명시되지 않는 한) "이리노테칸 모이어티"는 단지 이리노테칸 락톤; 즉 무수 이리노테칸 락톤 유리 염기를 지칭한다.
본원에 사용된 (또한 달리 명시되지 않는 한) 용어 "캄프토테신"은 캄프토테신 및 캄프토테신 유도체, 예컨대 이리노테칸, 토포테칸, 루르토테칸, 실라테칸, 에티리노테칸 페골, TAS 103, 9-아미노캄프토테신, 7-에틸캄프토테신, 10-히드록시캄프토테신, 9-니트로캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시캄프토테신, 9-아미노-10,11-메틸렌디옥시캄프토테신, 9-클로로-10,11-메틸렌디옥시캄프토테신, (7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신, 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-메틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신 및 7-(2-N-이소프로필아미노)에틸)-(20S)-캄프토테신, 및 그의 입체이성질체, 염 및 에스테르를 포함한다.
본원에 사용된 (또한 달리 명시되지 않는 한), "DLS"는 동적 광 산란을 지칭하고, "BDP"는 벌크 약물 제품을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜은 리포솜 내에 제약 약물을 포획하는 하나 이상의 작용제 (이하, 포획제라 지칭됨)를 캡슐화한다.
본 명세서에 사용된 "연장 방출 조성물"은 2주마다 1회씩 70 mg/m2의 이리노테칸 유리 염기에 상응하는 용량으로 인간에게 투여될 때 하기 약동학적 파라미터의 80 내지 125%를 제공하는 이리노테칸 조성물을 포함한다: Cmax 37.2 (8.8) μg 이리노테칸 (유리 염기 무수로서)/mL 및 AUC0-∞ 1364 (1048) h·μg 이리노테칸/mL (이리노테칸의 경우); 또는 (SN-38의 경우), Cmax 5.4 (3.4) μg SN-38 (유리 염기 무수로서)/mL; AUC0-∞ 620 (329) h·ng SN-38/mL.
달리 나타내지 않는 한, 리포솜성 제제는 적어도 1개의 지질 이중층을 갖는 (예를 들어, 구형 또는 실질적으로 구형인) 소포를 포함할 수 있으며, 다층 및/또는 단층의 소포로서, 제약 활성 화합물 (예를 들어, 캄프토테신) 및/또는 포획제(들)를 캡슐화하고/거나 캡슐화하지 않은 소포를 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, 달리 나타내지 않는 한, 캄프토테신 리포솜을 포함하는 제약 리포솜성 제제는 캄프토테신 화합물을 포함하지 않는 리포솜, 예컨대 캄프토테신 화합물(들) 및/또는 포획제(들)를 갖거나 또는 갖지 않는 단층 및 다층의 리포솜의 혼합물을 임의로 포함할 수 있다.
도 1a는 수크로스 옥타술페이트 염으로서 겔화 또는 침전된 상태의 이리노테칸을 함유하는 수성 공간을 캡슐화하는 이리노테칸 리포솜의 개략도를 제시한다.
도 1b는 도 1a의 이리노테칸 리포솜의 적도 방향 단면을 제시한다.
도 2a는 4℃에서의 9개월의 저장 후의 액체 이리노테칸 리포솜 조성물의 리소-PC의 상대량 (mol%)에 대한 안정성 비 값의 그래프이며, 이들 리포솜 조성물은 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 나타낸 pH 값을 갖는다.
도 2b는 4℃에서의 6개월의 저장 후의 액체 이리노테칸 리포솜 조성물의 리소-PC의 상대량 (mol%)에 대한 안정성 비 값의 그래프이며, 이들 리포솜 조성물은 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 나타낸 pH 값을 갖는다.
도 2c는 4℃에서의 6개월의 저장 후의 액체 이리노테칸 리포솜 조성물의 리소-PC의 상대량 (mol%)에 대한 안정성 비 값의 그래프이며, 이들 리포솜 조성물은 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 나타낸 pH 값을 갖는다.
도 3a는 1047의 안정성 비 및 6.5의 pH를 갖는 2종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 상대량 (mol%)의 그래프이다.
도 3b는 각각 992 및 942의 안정성 비 및 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 6.5의 pH를 갖는 2종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 상대량 (mol%)의 그래프이다.
도 3c는 785의 안정성 비 및 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 6.5의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 상대량 (mol%)의 그래프이다.
도 3d는 약 724의 안정성 비를 가지며, 0.65 M의 술페이트 기 농도에서 TEA8SOS를 사용하여 제조되며, 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 6.5의 pH를 갖는 2종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 상대량 (mol%)의 그래프이다.
도 4a는 약 1047의 안정성 비 및 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 7.25의 pH를 갖는 3종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 상대량 (mol%)의 그래프이다. 리포솜 샘플 5 (백색 정사각형)는 5 mg/mL의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도에서 제조되었고, 반면 리포솜 샘플 13 (흑색 삼각형)은 마찬가지로 20 mg/mL의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물에서 제조되었다. 샘플 13의 리포솜은 샘플 5와 동일한 방식으로 제조되나, 최종 리포솜 조성물의 밀리리터당 리포솜성 구성요소 (즉, 인지질, 콜레스테롤, 이리노테칸 및 수크로소페이트)가 샘플 5와 비교하여 4배 증가되었다.
도 4b는 약 1047의 안정성 비 및 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 7.25 및 7.5의 pH 값을 갖는 2종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 상대량 (mol%)의 그래프이다.
도 4c는 약 785의 안정성 비 및 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 7.25 및 7.5의 pH 값을 갖는 2종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 상대량 (mol%)의 그래프이다.
도 5는 1046-1064의 안정성 비 및 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 7.3의 pH를 갖는 3종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 농도 (mg/mL)의 그래프이다.
도 6은 1046-1064의 안정성 비 및 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 7.3의 pH를 갖는 3종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 개월수에 대한 리소-PC의 농도 (mg/mL)의 그래프이다.
도 7은 다양한 양의 치환된 암모늄 (양성자화된 TEA)을 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물의 4℃에서의 저장 동안의 추정된 리소-PC 형성 비율 (mg/mL/개월)의 그래프이다.
도 8은 수용액 중에서, 다양한 비율, 즉 1:9 내지 9:1의 그램-당량비에서 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물 및 트리에틸암모늄 수크로소페이트를 조합함으로써 형성된 침전물 내의 이리노테칸 및 수크로소페이트의 그램-당량의 그래프이다. x-축은 이리노테칸 유리 염기 무수의 그램-당량과 관련하여, 샘플 내의 트리에틸암모늄 수크로소페이트 (SOS)의 상대 그램-당량 전체 양을 제시한다.
도 9는 4℃에서 12-36개월의 기간에 걸쳐 저장된 12종의 상이한 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 리포솜 생성물 로트 번호의 평균 입자 크기를 플롯팅한 그래프를 제시하며, 각 샘플에 대해 얻어진 데이터에 대해 선형 회귀가 이루어졌다.
도 10은 도 9에 제시된 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 생성물 로트 번호의 입자 크기 다분산 지수 (PDI)의 그래프이며, 각 샘플에 대해 얻어진 데이터에 대해 선형 회귀가 이루어졌다.
도 11a는 4℃에서 12-36개월의 기간에 걸쳐 저장된 13종의 상이한 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 생성물 로트 번호의 pH의 그래프이며, 각 샘플에 대해 얻어진 데이터에 대해 선형 회귀가 이루어졌다.
도 11b는 4℃에서 12개월의 기간에 걸쳐 저장된 16종의 상이한 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 생성물 로트 번호의 pH의 그래프이며, 각 샘플에 대해 얻어진 데이터에 대해 선형 회귀가 이루어졌다.
도 12는 2종의 이리노테칸 리포솜 조성물의 36개월에 걸쳐서의 리소-PC의 농도 (mg/mL)의 그래프이며, 각 이리노테칸 리포솜 샘플로부터 얻어진 각각의 데이터 포인트에 대해 최적-피팅 선형 회귀가 이루어졌다.
도 13a는 방법 A의 대표적인 실규모 크로마토그램이다.
도 13b는 방법 A의 대표적인 확대 규모 크로마토그램이다.
안정화된 캄프토테신 조성물은 하나 이상의 캄프토테신 화합물(들)을 캡슐화하는 리포솜을 포함할 수 있다. 리포솜은 화학요법 약물을 포함한, 제약 약물의 투여를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 보다 소량의 리소-인지질, 예를 들어 리소-PC를 생성하는, 캄프토테신 화합물, 예를 들어 리포솜성 이리노테칸의 안정화된 인지질-함유 조성물을 제공한다.
캄프토테신 리포솜은 지질 조성물 (예를 들어, 인지질-함유 소포) 안쪽에 캄프토테신을 포획제와 함께 캡슐화할 수 있다. 예를 들어, 도 1a는 약 110 nm의 직경을 가지며 이리노테칸을 캡슐화하는 지질 막을 갖는 이리노테칸 리포솜을 도시하는 개략도를 제시한다. 이 개략도의 지질 막은 에스테르-함유 인지질 MPEG-2000-DSPE를 함유한다. MPEG-2000-DSPE 지질은 이중층 막의 내부 및 외부 지질 층에 위치하고, 그 결과 그의 PEG 모이어티는 리포솜 내에 또는 리포솜의 외부 표면에 각각 위치한다. 도 1b는 도 1a에 일반적으로 도시된 리포솜의 특정한 실시양태의 단면을 제시하며, 여기서 단층의 지질 이중층 막은 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE를 포함하며, 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화한다.
본 발명에 이르러, 심지어 2-8℃, 예컨대 4℃에서의 연장된 저장 후에도 낮은 수준의 리소-PC를 갖는, 에스테르-함유 인지질을 포함하는 신규 안정화된 이리노테칸 리포솜 조성물, 예컨대 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 (SOS)를 캡슐화하며 (이리노테칸-SOS 리포솜), 냉장 저장 동안 유의하게 감소된 리소-PC 형성을 갖는 리포솜이 제조될 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 본 발명은, 부분적으로, 다수의 예상외의 관찰에 기반한 것이다. 첫째로, 이리노테칸-SOS 리포솜 조성물은 놀랍게도 캡슐화되는 이리노테칸의 양이 공동-캡슐화되는 SOS 포획제의 양에 비해 증가될 때 냉장 저장 동안 실질적으로 보다 적은 리소-PC를 갖는다. 둘째로, 이리노테칸-SOS 리포솜 조성물은 놀랍게도 이리노테칸-SOS 리포솜을 함유하는 수성 매질의 pH가 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 6.5 초과일 때 냉장 저장 동안 보다 적은 리소-PC를 갖는다. 셋째로, 이리노테칸-SOS 리포솜 조성물은 놀랍게도 조성물 내의 검정된 잔류 리포솜성 포획제 암모늄/치환된 암모늄 양이온의 양이 100 ppm 미만일 때 보다 적은 리소-PC를 갖는다.
리포솜성 캄프토테신 조성물의 구성성분 지질
리포솜의 구성성분이 될 수 있는 다양한 지질, 특히 인지질, 예컨대 포스파티딜 에탄올아민 및 포스파티딜 세린은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 다른 이러한 인지질과 리포솜을 제조하는 것은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 구성된다. 본원에 개시된 리포솜 제제에 존재하는 지질에 관한 바람직한 실시양태가 하기에 기재된다.
리포솜성 구성요소는 활성 물질을 종양 부위에 전달될 때까지 캡슐화하며 보유하는 단층 및/또는 다층의 소포를 형성하는 리포솜성 이중층 막을 생성하도록 선택될 수 있다. 바람직하게는, 리포솜 소포는 단층이다. 리포솜성 구성요소는 조합될 때, 활성 물질을 능동적으로 로딩 및 보유하면서, 생체내에서 낮은 단백질 결합을 유지하여, 결과적으로 그의 순환 수명을 연장시킬 수 있는 리포솜을 생성하도록 그의 특성이 선택된다.
DSPC는 바람직하게는 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 이중층에서 주요 지질 구성요소이다 (예를 들어, 모든 지질 성분의 총 중량의 74.4%를 차지함). DSPC는 55℃의 상 전이 온도 (Tm)를 갖는다.
콜레스테롤은 바람직하게는 모든 지질 성분의 총 중량의 약 24.3%를 차지할 수 있다. 이는 리포솜성 인지질 막을 안정화시켜 이들이 혈장 단백질에 의해 파괴되지 않도록 하고, 순환으로부터의 리포솜의 신속한 클리어런스를 담당하는 혈장 옵소닌의 결합 정도를 감소시키며, 이중층 형성 인지질과 조합되어 용질/약물의 투과성을 감소시키는 유효량으로 혼입될 수 있다.
MPEG-2000-DSPE는 바람직하게는 모든 지질 이중층 구성성분의 총 중량의 약 1.3%를 차지할 수 있다. 이리노테칸 리포솜의 표면 상의 그의 양 및 존재는 리포솜 응집을 방지하는 최소한의 입체 장벽을 제공하도록 선택될 수 있다. 본 발명의 MPEG-2000-DSPE 코팅된 리포솜은 크기 및 약물-캡슐화와 관련하여 안정한 것으로 제시된다.
일부 실시양태에서, 리포솜 제제의 지질 막은 바람직하게는 하기 성분으로 구성된다: 대략 200개의 비-PEG-인지질 분자마다 1개의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-개질된 인지질 분자의 비의, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 리포솜은 3:2:0.015의 몰비로 조합된 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE의 혼합물로부터 제조된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 리포솜 제제는 약 6.81 mg/mL 농도의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 약 2.22 mg/mL 농도의 콜레스테롤 및 약 0.12 mg/mL 농도의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)을 포함한다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 리포솜 제제는 6.81 mg/mL 농도의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 2.22 mg/mL 농도의 콜레스테롤 및 0.12 mg/mL 농도의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)을 포함한다.
캄프토테신 조성물 포획제
일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜은 리포솜 내에 제약 약물을 포획하는 하나 이상의 작용제 (이하, 포획제라 지칭됨)를 캡슐화한다. 포획제는 바람직하게는 복수의 음으로 하전된 기를 갖는 다가음이온성 화합물을 포함하거나, 또는 2종 이상의 상이한 이러한 화합물의 조합을 포함한다. 비제한적 예에서, 다가음이온 포획제는 2가 음이온, 3가 음이온, 다가 음이온, 중합체 다가 음이온, 다가음이온화된 폴리올 또는 다가음이온화된 당이다. 본 발명의 문맥에서, 다가음이온성 포획제는 다가음이온화된 폴리올 또는 당, 예컨대 그의 히드록실 기가 음이온성 기로 완전히 또는 부분적으로 개질 또는 대체 (음이온화)된 폴리올 또는 당일 수 있다. 비제한적 예에서, 다가음이온화된 폴리올 또는 다가음이온화된 당은 그에 연결된 음이온성 기를 갖는 폴리올 모이어티 또는 당 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다가음이온화된 당 또는 다가음이온화된 폴리올 포획제의 적어도 1개의 음이온성 기는 수성 매질 중에 존재할 경우에 pH 3-12, 바람직하게는 pH 6.5-8의 pH 범위에서 50%를 초과하여 이온화되거나, 또는 대안적으로, 음이온성 기(들)는 3 이하, 바람직하게는 2 이하의 pKa를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 포획제는 1.0 이하의 pKa를 갖는 술페이트 모이어티를 함유한다. 비제한적 예에서, 다가음이온 포획제는 단위당, 예를 들어 탄소 쇄의 탄소 원자 또는 고리당 또는 당의 모노사카라이드 단위당 적어도 2, 3 또는 4개의 음으로 하전된 기의 전하 밀도를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 리포솜 조성물의 방출 속도는 포획제로서 다가음이온화된 당 또는 다가음이온화된 폴리올의 1개 이상의 다른 1가 또는 다가 음이온, 예를 들어 클로라이드, 술페이트, 포스페이트 등과의 혼합물을 사용함으로써 증가될 수 있다. 연장 방출 조성물의 방출 속도를 증가시키는 또 다른 비제한적 예에서, 다양한 다가음이온화도를 갖는 상이한 다가음이온화된 당 및/또는 다가음이온화된 폴리올의 혼합물이 포획제로서 사용되고 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜 안쪽에서의 다가음이온화도는, 예를 들어 리포솜-포획된 캄프토테신 또는 캄프토테신-유도체 화합물을 갖는 리포솜 안쪽의 총 음이온(들)의 90% 초과, 또는 99% 초과, 또는 0.1% 내지 99%, 10% 내지 90% 또는 20% 내지 80%이다.
일부 실시양태에서, 포획제는 술페이트화된 당 및/또는 폴리올이다. 본 발명의 예시적인 술페이트화된 당은 술페이트화된 수크로스, 예컨대, 비제한적으로, 수크로스 헥사술페이트, 수크로스 헵타술페이트 및 수크로스 옥타술페이트이다 (문헌 [Ochi. K., et al., 1980, Chem. Pharm. Bull., v. 28, p. 638-641] 참조). 유사하게, 염기 촉매의 존재 하에 옥시염화인 또는 디에틸클로로포스페이트와의 반응은 폴리포스포릴화된 폴리올 또는 당을 생성한다. 폴리포스포릴화된 폴리올은 또한 천연 공급원으로부터 단리된다. 예를 들어, 이노시톨 폴리포스페이트, 예컨대 이노시톨 헥사포스페이트 (피트산)는 옥수수로부터 단리될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 적합한 다양한 술페이트화, 술폰화, 및 포스포릴화된 당 및 폴리올은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,783,568에 개시되어 있으며, 이 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 폴리올 및/또는 당의 1개 초과의 붕산 분자와의 복합체화가 또한 다가음이온화 (폴리보레이트화)된 생성물을 생성한다. 알칼리의 존재 하에 폴리올 및/또는 당의 이황화탄소와의 반응은 다가음이온화 (폴리디티오카르보네이트화, 폴리크산토게네이트)된 유도체를 생성한다. 다가음이온화된 폴리올 또는 당 유도체는 유리 산 형태로 단리되고, 적합한 염기, 예를 들어 알칼리 금속 수산화물, 수산화암모늄으로, 또는 바람직하게는 치환된 아민, 예를 들어 본 발명의 치환된 암모늄에 상응하는 아민으로, 순수 형태로 또는 본 발명의 치환된 암모늄의 다가음이온성 염을 제공하는 치환된 수산화암모늄 형태로 중화될 수 있다. 대안적으로, 다가음이온화된 폴리올/당의 나트륨, 칼륨, 칼슘, 바륨 또는 마그네슘 염은 단리되어, 임의의 공지된 방법에 의해, 예를 들어 이온 교환에 의해 적합한 형태, 예를 들어 치환된 암모늄 염 형태로 전환될 수 있다. 술페이트화된 당 포획제의 비제한적 예는 술페이트화된 수크로스 화합물, 예컨대, 비제한적으로, 수크로스 헥사술페이트, 수크로스 헵타술페이트 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS)이다. 예시적인 폴리올 포획제는 이노시톨 폴리포스페이트, 예컨대 이노시톨 헥사포스페이트 (또한 피트산 또는 IHP라고도 공지되어 있음) 또는 다른 디사카라이드의 술페이트화된 형태를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 포획제는 술페이트화된 다가음이온이며, 그의 비제한적 예로는 수크로스 옥타술페이트 (SOS)가 있다. 수크로소페이트는 또한 수크로스 옥타술페이트 또는 수크로옥타술페이트 (SOS)라고도 지칭된다. 다양한 염, 예를 들어 암모늄, 나트륨 또는 칼륨 염 형태의 수크로소페이트를 제조하는 방법은 관련 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 4,990,610). 수크로스 옥타술페이트 (또한 수크로소페이트라고도 지칭됨)는 그의 완전히 양성자화된 형태일 때, 화학식 (II)의 구조를 갖는 수크로스의 완전히 치환된 술페이트 에스테르이다:
Figure pct00002
다양한 염, 예를 들어 암모늄, 나트륨 또는 칼륨 염 형태의 수크로소페이트를 제조하는 방법은 관련 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 4,990,610 참조). 다른 디사카라이드, 예를 들어 락토스 및 말토스의 술페이트화된 형태인 락토스 옥타술페이트 및 말토스 옥타술페이트를 제조하는 것도 마찬가지로 고려된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 리포솜 제형은 캄프토테신 화합물 예컨대 이리노테칸 또는 토포테칸, 및 음이온성 포획제 예컨대 SOS를 포함한다. 본 발명의 리포솜은 바람직하게는 음이온성 포획제와 화학량론적 비로 캄프토테신 화합물을 포함한다. 예를 들어, 이리노테칸 리포솜 제형은 약 8:1의 몰비로 이리노테칸 및 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화할 수 있다. 리포솜의 안정화된 조성물은 화학식 (I)의 이리노테칸 조성물을 캡슐화할 수 있으며, 여기서 x는 약 8이다:
Figure pct00003
리포솜성 이리노테칸은 리포솜에 캡슐화된 화학식 (I)의 조성물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (I)의 조성물은 콜레스테롤 및 하나 이상의 인지질(들) (예를 들어, PEG-함유 인지질(들) 포함)을 포함하는 리포솜 내에 형성 (예를 들어, 침전)된다. 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물은 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물을 형성하는 과정에서, (1) 캄프토테신 화합물(들) (예를 들어, 이리노테칸, 토포테칸 등)을 (2) 폴리술페이트화된 음이온성 포획제 (예를 들어, 수크로스 옥타술페이트)를 캡슐화하는 리포솜과 반응시킴으로써 리포솜 내에 형성될 수 있다. 바람직하게는, 리포솜성 이리노테칸 조성물은 6.5 초과 (예를 들어, 7.0-7.5, 예컨대 7.25, 7.3 및 7.5)의 pH를 갖는다.
바람직한 안정화된 캄프토테신 조성물은 리포솜성 이리노테칸을 포함한다.
안정화된 캄프토테신 조성물은 4.5 내지 5.5 mg/mL의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물 (즉, 3.9-4.8 mg/mL의 이리노테칸 유리 염기 무수)에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도에서 이리노테칸 또는 그의 염을 함유하는 고밀도 캄프토테신 화합물(들) 리포솜 제형을 포함하고, 6.13 내지 7.49 mg/mL (바람직하게는 약 6.81 mg/mL) 농도의 DSPC, 2-2.4 mg/mL (바람직하게는 약 2.22 mg/mL) 농도의 콜레스테롤 및 0.11-0.13 mg/mL (바람직하게는 약 0.12 mg/mL) 농도의 MPEG-2000-DSPE를 함유하며, 바람직하게는 보다 강력한 락톤 형태의 적합한 양의 캄프토테신 화합물(들)을 또한 제공함과 동시에, 냉장 저장 (2-8℃) 동안, 존재한다 하더라도, 소량의 리소-PC의 존재를 특징으로 한다. 본 발명은 제조 이후 적어도 처음 6개월, 바람직하게는 적어도 처음 9개월 동안 냉장 하에 (즉, 2-8℃에서) 20 mol% 초과 수준의 리소-PC의 형성 없이 저장될 수 있는 제약 캄프토테신 화합물(들) 리포솜 조성물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 4.7-5.3 mg/mL의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물 (즉, 4.1-4.6 mg의 이리노테칸 모이어티 유리 무수 염기) (이리노테칸은 리포솜 내에 캡슐화된 수크로스 옥타술페이트 염으로서 존재할 수 있음)에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티의 양을, 6.4-7.2 mg/mL의 (DSPC), 2.09-2.35 mg/mL의 콜레스테롤 및 약 0.113-0.127 mg/mL의 MPEG-2000-DSPE와 함께 함유하며, 2-8℃에서 저장될 때 6 또는 9개월 동안 20 mol% 이하의 리소-PC 또는 2-8℃에서 저장될 때 21개월 동안 2 mg/mL 이하의 리소-PC를 함유하는 조성물을 제공한다.
이리노테칸/술페이트 화합물 그램-당량비 (ER)의 계산
이리노테칸/술페이트 화합물 그램-당량비 (ER)는 각 이리노테칸 리포솜 제제에 대해, 리포솜 조성물의 단위 (예를 들어, 1 mL)당 리포솜으로 공동-캡슐화된 이리노테칸 (I) 및 술페이트 화합물 (S)의 몰량을 결정하고, 식: ER = I/(SN)을 사용함으로써 계산될 수 있으며, 여기서 N은 술페이트 화합물 음이온의 원자가 (예를 들어, 수크로소페이트의 경우에는 N이 8이고, 유리 술페이트, 즉 SO42-의 경우에는 N이 2임)이다. 예를 들어, 7.38 mM 이리노테칸 및 1.01 mM 수크로소페이트 (N=8)를 함유하는 리포솜성 이리노테칸 수크로소페이트 조성물은 7.38/(1.01x8)=0.913의 ER을 가질 것이다. 바람직하게는, 술페이트 화합물 (S)은 SOS의 mol당 8개의 술페이트 모이어티를 함유하는, 수크로스 옥타술페이트이다. 리포솜성 조성물은 7.1 내지 7.5의 pH를 가질 것이며, 하기 ER 범위 중 하나를 가질 것이다: 바람직하게는 0.85 내지 1.2, 0.85-1.1 또는 가장 바람직하게는 0.9 내지 1.05, 예컨대 약 1.02. 대안적으로 리포솜성 조성물은 인지질의 mol당 500 g (±10%)의 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 양을 가질 것이며, 하기 ER 범위 중 하나를 가질 것이다: 바람직하게는 0.85 내지 1.1, 가장 바람직하게는 0.9 내지 1.05, 예컨대 약 1.02.
안정화된 캄프토테신 조성물의 pH
리포솜성 조성물의 pH는, 예를 들어 약 6.5-8.0의 pH 또는 그 사이의 임의의 적합한 pH 값 (예컨대, 예를 들어, 7.0-8.0 및 7.25)에서 조성물을 제조함으로써, 목적하는 저장 안정성 특성을 제공하도록 (예를 들어, 180일에 걸쳐 4℃에서의 저장 동안 리포솜 내의 리소-PC의 형성을 감소시키도록) 조정되거나 또는 달리 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, pH는 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0이다. 특정한 pH 값, 이리노테칸 유리 무수 염기 농도 (mg/mL)에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 및 다양한 농도의 수크로스 옥타술페이트를 갖는 이리노테칸 리포솜은 본원에 기재된 바와 같이 보다 상세히 제공된 대로 제조되었다. 보다 바람직하게는, 제조 후 및 저장 전의 pH는 7.1 내지 7.5, 보다 더 바람직하게는 약 7.2 내지 7.3, 가장 바람직하게는 약 7.25이다. pH는 표준 수단에 의해, 예를 들어 적절하게 1N HCl 또는 1N NaOH를 사용함으로써 조정될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 제조 후이지만, 그러나 저장 전의 리포솜성 이리노테칸 제제의 pH는 6.5 초과, 바람직하게는 7.2 내지 7.3이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, pH는 7.2 내지 7.5이다.
안정화된 캄프토테신 조성물의 화합물 그램-당량비 ("ER")
안정화된 리포솜성 캄프토테신 조성물은 6.5 초과의 pH를 가지며, 0.9 초과 (예를 들어, 0.9-1.1)의 이리노테칸/술페이트 화합물 그램-당량비 ("ER")를 갖는 이리노테칸 및 술페이트 다가음이온성 포획제를 캡슐화하는 리포솜을 포함할 수 있다. ER은 이리노테칸 SOS 리포솜 제제에 대해, 리포솜 조성물의 단위 (예를 들어, 1 mL)당 리포솜으로 공동-캡슐화된 이리노테칸 (I) 및 술페이트 화합물 (S)의 몰량을 결정하고, 식: ER = I/(SN)을 사용함으로써 계산될 수 있으며, 여기서 N은 술페이트 화합물 음이온의 원자가 (예를 들어, 수크로소페이트의 경우에는 N이 8이고, 유리 술페이트, 즉 SO4 2-의 경우에는 N이 2임)이고, I는 리포솜 이리노테칸 조성물 내의 캡슐화된 이리노테칸의 농도이고, S는 리포솜성 이리노테칸 조성물 내의 캡슐화된 수크로스 옥타술페이트의 술페이트 기의 농도이다. 바람직하게는, 술페이트 화합물 (S)은 SOS의 mol당 8개의 술페이트 모이어티를 함유하는, 수크로스 옥타술페이트이다.
리포솜성 이리노테칸 조성물 내의 캡슐화된 수크로스 옥타술페이트의 술페이트 기 농도 (S·N)의 직접적인 결정이 바람직하지만, S·N은 리포솜 인지질 농도 (P, mol/L), 리포솜의 내부 공간 내의 SOS 술페이트 기 농도 (포획제 리포솜을 제조하는데 사용된 용액 내의 SOS 술페이트 기 농도; 파라미터 B, 본원의 안정성 비 정의 참조), 및 리포솜 내부 (포획된) 부피, 즉 리포솜 인지질의 단위당 리포솜 소포의 내부 공간 내에 격리된 부피 (Ve, L/mol 인지질)로부터 결정될 수 있다:
S·N = P·Ve·B
예로서, 100-nm 폴리카르보네이트 필터를 통한 압출에 의해 수득된 포스파티딜콜린-콜레스테롤 리포솜의 경우에, 포획된 부피는 거의 1.7 L/mol 인지질일 수 있다 (Mui, et al. 1993, Biophys.J., vol 65, p. 443-453). 이러한 경우에, SOS-캡슐화 리포솜 내의 471 g/mol 인지질의 이리노테칸 (분자량 586.7)의 정량적 로딩 및 0.45 M의 SOS 술페이트 기 농도는 하기의 ER을 야기할 것이다:
(471/586.7)/(1.7·0.45) = 1.049
반면, 0.65 M 술페이트 기의 SOS 농도에서는, ER이 하기와 같을 것이다:
(471/586.7)/(1.7·0.65) = 0.726
유사하게, SOS-캡슐화 리포솜 내의 500 g (±10%) /mol 인지질의 이리노테칸 (분자량 586.7)의 정량적 로딩 및 0.45 M의 SOS 술페이트 기 농도는 약 1.11의 ER을 야기할 것이며, 반면 0.65 M 술페이트 기의 SOS 농도에서는 ER이 약 0.77일 것이다.
안정화된 캄프토테신 조성물의 제조
안정화된 캄프토테신 조성물은 캄프토테신 리포솜을 포함할 수 있다. 리포솜은 화학요법 약물을 포함한, 제약 약물의 투여를 위해 사용된 바 있다. 약물-캡슐화 리포솜 및 그의 제조 방법에 관한 다양한 기술이 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 따라서 본원에서는 더 이상 상세히 기재하지 않았다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,147,867을 참조한다.
일부 실시양태에서, 소포 내에 하나 이상의 캄프토테신 화합물(들)을 캡슐화하는 리포솜은 적어도 하나의 인지질을 포함한다. 캄프토테신 화합물은, 예를 들어, (a) 인지질(들)을 포함하는 리포솜 소포 내에 음이온성 포획제 및 양이온을 캡슐화하는 포획제 리포솜을 형성하고, (b) 후속적으로 포획제 리포솜을 캄프토테신 화합물(들)과, 캄프토테신 화합물(들)을 포획제 리포솜 내에 로딩하고 캄프토테신 화합물을 포획제와 함께 리포솜 안쪽에 보유하도록 하는데 효과적인 조건 하에 접촉시켜 캄프토테신 리포솜을 형성하는 것을 포함하는 다단계 방법으로 리포솜 내에 로딩되거나 또는 달리 포획될 수 있다.
캄프토테신 화합물(들)은 캄프토테신 화합물(들)이 포획제 리포솜에 들어가도록 하는, 리포솜 막 전체에 걸쳐 있는 구배를 사용하여 포획제 리포솜 내에 로딩되어 캄프토테신 리포솜을 형성할 수 있다. 바람직하게는, 포획제 리포솜은 리포솜의 지질 구성요소의 상 전이 온도를 초과하여 가열될 때 포획제 리포솜 내의 암모늄/치환된 암모늄의 캄프토테신 화합물(들)로의 교환을 야기하는데 효과적인, 막-횡단 양이온, 예컨대 암모늄 또는 치환된 암모늄의 막횡단 농도 구배를 갖는다. 바람직하게는, 포획제는 그 주위의 매질에서보다 포획제 리포솜에서 보다 높은 농도를 갖는다. 추가로, 포획제 리포솜은 암모늄/치환된 암모늄 양이온에 의해 형성된 구배 이외의, 하나 이상의 막횡단 구배를 포함할 수 있다. 예를 들어, 포획제 리포솜 조성물에 함유된 리포솜은 추가적으로 또는 대안적으로 막횡단 pH 구배, 이온 구배, 전기화학 전위 구배 및/또는 용해도 구배를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 리포솜의 제조를 위해 사용되는 포획제 (예를 들어, SOS 및/또는 그의 허용되는 염을 포함한, 또 다른 술페이트화된 폴리올 포획제)는 0.3-08, 0.4-.05, 0.45-0.5, 0.45-.0475, 0.45-0.5, 0.3, 0.4, 0.45, 0.475, 0.5, 0.6, 0.7 또는 0.8 M 술페이트 기, 예를 들어 이들 구체적 값 ±10%의 농도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 리포솜의 제조를 위해 사용되는 포획제는 SOS이며, 약 0.45 또는 약 0.475 M 술페이트 기의 농도를 갖는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 리포솜의 제조를 위해 사용되는 포획제는 SOS이며, 0.45 M 또는 0.475 M 술페이트 기의 농도를 갖는다.
바람직하게는, 캄프토테신 화합물(들)은 로딩 동안 적합한 온도, 예를 들어 구성요소 인지질의 1차 상 전이 온도 초과의 온도의 수성 매질 중에서 캄프토테신 화합물(들)을 포획제 리포솜과 함께 인큐베이션함으로써 포획제 리포솜 내에 로딩되고, 반면 캄프토테신 화합물(들)의 로딩 후에는 구성요소 인지질의 1차 상 전이 온도 미만으로, 바람직하게는 약 실온으로 감소시킨다. 인큐베이션 시간은 통상적으로 구성요소 지질의 성질, 리포솜 내에 로딩될 캄프토테신 화합물(들) 및 인큐베이션 온도를 기준으로 한다. 전형적으로, 수분 (예를 들어 30-60분) 내지 수시간의 인큐베이션 시간이 충분하다.
85% 초과, 전형적으로는 90% 초과의 높은 포획 효율이 달성되기 때문에, 비포획된 물질을 제거할 필요가 없는 경우가 종종 있다. 그러나, 그럴 필요가 있는 경우이면, 비포획된 캄프토테신 화합물(들)은 다양한 수단, 예컨대, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 한외여과, 흡착 및 침전에 의해 조성물로부터 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 캄프토테신 리포솜은 이리노테칸 리포솜이다. 이리노테칸 리포솜은 (a) 수크로소페이트의 트리에틸암모늄 염 (TEA-SOS)으로서 트리에틸아민 (TEA)을 함유하는 리포솜을 제조하는 단계, 및 (b) 후속적으로 TEA-SOS 리포솜을 이리노테칸과, 이리노테칸이 리포솜에 들어가 상응하는 양의 TEA가 리포솜에서 빠져나오도록 하는데 (이에 의해 생성된 리포솜 전체에 걸쳐 있는 TEA의 농도 구배를 소진시키거나 또는 감소시킴) 효과적인 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
캄프토테신 리포솜의 약물 로딩 동안의 리포솜-외부 이온 강도
본 발명의 일부 실시양태에서, 리포솜의 캄프토테신 로딩은 50 mM NaCl과 등가의 이온 강도 미만, 또는 보다 바람직하게는 30 mM NaCl과 등가의 이온 강도 미만의 수용액 중에서 수행된다. 약물 로딩 후에, 보다 진한 염 용액, 예를 들어 NaCl 용액이 첨가되어 이온 강도를 50 mM NaCl과 등가의 이온 강도보다 높게, 또는 보다 바람직하게는 100 mM NaCl과 등가의, 바람직하게는 약 140-160 mM NaCl과 등가의 이온 강도보다 높게 상승시킬 수 있다.
포획제 양이온
본 발명의 양이온은 상기 기재된 바와 같이 지질 구성요소의 상 전이 온도를 초과하여 가열될 때, 캄프토테신 화합물(들)의 포획제 리포솜 내로의 로딩을 제공하는데 효과적인 양으로 포획제 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 양이온은 캄프토테신 화합물(들)의 리포솜 내로의 로딩 동안 이들이 포획제 리포솜에서 빠져나올 수 있도록 선택된다. 리포솜-외부 양이온은 캄프토테신 화합물(들)이 로딩된 리포솜의 제조 후에 제거될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 포획제와 함께 리포솜에 존재하는 양이온은 치환된 암모늄 화합물이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치환된 암모늄 화합물은 적어도 약 8.0의 pKa를 갖는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치환된 암모늄 화합물은 주위 온도의 수용액 중에서 결정 시, 적어도 약 8.0, 적어도 약 8.5, 적어도 약 9.0, 적어도 9.5, 적어도 10.0, 적어도 10.5, 또는 적어도 11.0의 pKa를 갖는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치환된 암모늄 화합물은 약 8.0-12.0, 약 8.5.-11.5, 또는 약 9.0-11의 pKa를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, pKa는 약 TEA의 pKa 또는 약 DEA의 pKa이다.
이러한 치환된 암모늄 화합물의 비제한적 예는 화학식: N(R1)(R2)(R3)(R4)+의 화합물이며, 여기서 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소 또는 총 18개 이하의 탄소 원자를 갖는 유기 기이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 적어도 하나는 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 기인 유기 기로서, 이들은 그의 탄화수소 모이어티 내에 에테르, 에스테르, 티오에테르, 아민 또는 아미드 결합을 형성하는 1개 이상의 S, O 또는 N 원자(들)를 임의로 포함하는, 알킬, 알킬리덴, 헤테로시클릭 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐 또는 시클로알케닐 기 또는 그의 히드록실-치환된 유도체일 수 있다. 치환된 암모늄은 입체 장애 암모늄 화합물 (예를 들어, 암모늄 질소 원자에 직접적으로 연결된 2급 또는 3급 탄소 원자를 갖는 유기 기 중 적어도 하나를 가짐)일 수 있다. 또한, R1, R2, R3 및 R4 중 적어도 하나는 수소이어야 한다. 바람직하게는, 치환된 암모늄 양이온은 트리에틸암모늄 (양성자화된 TEA) 또는 디에틸암모늄 (양성자화된 DEA)이다.
포획제 리포솜 내의 치환된 암모늄 양이온의 농도는, 캄프토테신 화합물이 캄프토테신 화합물 리포솜을 형성하는데 효과적인 조건 하에 음이온성 포획제를 캡슐화하는 리포솜 내에 로딩됨에 따라 감소될 수 있다. 본 발명의 리포솜은 음이온성 포획제 및 암모늄 또는 치환된 암모늄 양이온을 포함할 수 있으며, 이는 후속 약물 로딩 단계에서 리포솜 내에 로딩되는 캄프토테신 화합물에 의해 후속적으로 제거 및/또는 대체된다.
바람직한 실시양태에서, 캄프토테신 화합물 리포솜 내의 암모늄 또는 치환된 암모늄 양이온의 농도는 인지질을 함유하는 캄프토테신 리포솜 제제의 장기간 동안의 냉장 저장 후에 소량의 리소-PC를 제공할 정도로 충분히 낮다. 예를 들어, 도 7의 데이터를 포함하여, 실시예 3에서 논의된 바와 같이, 리소-PC 형성의 양에 있어서의 감소는 약 100 ppm 미만, 바람직하게는 20 내지 80 ppm, 바람직하게는 약 50 ppm 미만, 보다 더 바람직하게는 약 40 ppm 미만, 보다 더 바람직하게는 30 ppm 미만의 치환된 암모늄 양이온을 갖는 이리노테칸 SOS 리포솜 제제에서 관찰되었다.
일부 실시양태에서, 이리노테칸 SOS 리포솜 (예컨대 샘플 24-29; 실시예의 표 10)은 100 ppm 미만, 또는 약 15-100 ppm의 치환된 암모늄 SOS 포획제 반대 이온을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 SOS 리포솜 (예컨대 샘플 24-29; 실시예의 표 10)은 약 15-80 ppm의 치환된 암모늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 SOS 리포솜은 약 40-80 ppm의 치환된 암모늄을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 SOS 리포솜 (예컨대 샘플 24-29; 실시예의 표 10)은 약 80-100 ppm의 치환된 암모늄을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 임의의 상기 언급된 ppm 농도로 존재하는 치환된 암모늄은 TEA 또는 DEA로부터 유래된다.
안정화된 캄프토테신 조성물의 안정성 비
인지질-기재 캄프토테신-함유 리포솜이 (1) 캄프토테신 약물을 (2) 폴리술페이트화된 음이온성 포획제를 캡슐화하는 리포솜과 반응시킴으로써 제조되는 경우에, 생성된 약물-로딩된 리포솜의 안정성은 하기 정의된 바와 같은, 적어도 약 950의 안정성 비에 의해 한정되는 캄프토테신, 음이온성 포획제 및 리포솜-형성 인지질의 비에 좌우된다. 안정성 비는 포획제-리포솜 내의 술페이트 기의 초기 농도 및 리포솜 내의 캡슐화된 캄프토테신 대 인지질의 비에 좌우된다. 본원에 사용된 안정성 비 ("SR")는 하기와 같이 정의된다:
SR = A/B
여기서:
a. A는 조성물 내의 인지질의 몰당, 이리노테칸 유리 무수 염기와 등가의 그램으로, 약물 로딩 과정 동안 포획제 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 모이어티의 양이고;
b. B는 몰/L로 표현된, 포획제 리포솜을 제조하는데 사용된 수크로소페이트 (또는 다른 포획제) 용액 내의 술페이트 기의 농도 (술페이트 기의 농도 기준)이다.
안정성 비의 결정과 관련하여, 리포솜 제제 내의 인지질의 몰수는 실시예에 기재된 바와 같은 검정에 의해 결정된다. 리포솜 로딩을 수행하기 위한 이리노테칸 모이어티 양 (상기의 A)은 그에 따라 계산된다.
안정성 비의 결정과 관련하여, 몰/L로 표현된, 수크로소페이트 (또는 다른 포획제) 용액 내의 술페이트 기의 농도 B는 지질에 첨가된 용액 내의 수크로소페이트 (또는 본원에 개시된 다른 포획제)의 농도 (몰/L) (전형적으로 알콜에 용해된, 전형적으로 지질에 첨가된 포획제 용액 부피의 10% 이하인 부피)로서 계산된다. 따라서 수크로소페이트의 경우에, 술페이트 기의 농도 B는 수크로소페이트의 농도에 8 (즉, 하나의 수크로소페이트 분자 내의 술페이트 기의 개수)을 곱한 것이거나, 또는 사용된 특정한 포획제의 술페이트 기 개수에 따라 곱한 것이다 (실시예 1 참조).
본 발명의 일부 실시양태에서, 안정성 비 및 pH는 둘 다 6.5를 초과하여 증가된다. 따라서, 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태에서, 안정성 비는 942-1130이고, pH는 7.2 내지 7.5이며, 이리노테칸 및 SOS 포획제는 약 8:1의 몰비로 리포솜 조성물에 존재한다. 바람직하게는, 안정성 비는 942-1130이고, pH는 약 7.25이며, 이리노테칸 조성물 및 SOS 포획제는 8:1의 몰비로 리포솜에 존재한다. 다른 캄프토테신 화합물을 캡슐화하는 리포솜의 제형에서 리소-PL, 및 특히 리소-PC의 양은 유사한 방식으로 제어될 수 있다.
예를 들어, 신규 안정화된 이리노테칸 리포솜 제제는 다른 방법에 따라 제조된 이리노테칸 SOS 리포솜과 비교하여 80% 더 적은 리소-PC를 가질 수 있다 (예를 들어, 9개월의 냉장 저장 후에 비교 샘플 12에서 관찰되는 것보다 80% 더 적은 리소-PC). 샘플 12의 (비교) 리포솜성 이리노테칸은 3:2:0.015 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)을 갖는 지질 혼합물을, 0.65 M의 술페이트 기 농도에서 8:1 몰비 [(TEA)8SOS]의 트리에틸아민 (TEA) 및 수크로스 옥타술페이트 ("SOS" 또는 "수크로소페이트")의 존재 하에 가열하여 TEA-SOS 포획제 리포솜을 생성함으로써 약 724의 안정성 비로 제조되었다. TEA-SOS 포획제 리포솜에 캡슐화되지 않은 (TEA)8SOS의 제거 후에, 이리노테칸은 TEA의 제거 및 TEA-SOS 포획제 리포솜 제제 내의 인지질의 몰당 500 g (±10%)의 이리노테칸 무수 유리 염기에 의해 제공되는 이리노테칸 총량의 리포솜 내로의 로딩을 야기하는 조건 하에 이리노테칸의 용액을 사용하여 TEA-SOS 포획제 리포솜을 함유하는 생성된 제제 내에 로딩되었다. 이리노테칸 리포솜 조성물의 pH는 6.5이며 (본원의 실시예 섹션의 "pH 측정"이라는 서브섹션에 따라 측정됨), 이리노테칸 리포솜 조성물의 mL당 이리노테칸 리포솜 내에 4.3 mg의 이리노테칸 모이어티를 가졌다. 이들 포스파티딜콜린-함유 리포솜성 이리노테칸 조성물은 냉장 저장 (2-8℃)의 3개월 동안 (이리노테칸 리포솜 조성물 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 30 mol%를 초과하는 수준의 리소-PC를 생성하였다 (또한 9개월 동안 35mol% 초과의 리소-PC가 생성되었음).
예시적 실시양태에서의 안정성 비의 계산 및 리소-PC 양
일련의 상이한 이리노테칸 리포솜 제제가 본원에 기재된 방법에 따라 제조되었다 (각 샘플의 제조 및 특징화를 위한 추가의 실험 세부사항은 하기 실시예에 포함됨). 각각의 이리노테칸 리포솜 제제에서 측정된 리소-PC의 양이 표 1A (9개월의 냉장 저장 후에 수집된 리소-PC 측정치) 및 표 1B (표 1A에 열거된 샘플의 하위-세트에 대해, 6개월의 냉장 저장 후에 수집된 리소-PC 측정치)에 요약되어 있다. 각 이리노테칸 리포솜 제제는 수크로스 옥타술페이트 포획제와 함께 이리노테칸을 캡슐화하는, 직경이 약 110±20 nm, 바람직하게는 110±10 nm인 단층의 이중층 리포솜을 함유하였다. 리포솜은 3:2:0.015의 몰비를 갖는 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE의 혼합물로부터 형성되고, 이어서 인지질의 몰당 약 471 g의 이리노테칸 모이어티 (500 g (±10%)의 이리노테칸 HCl 무수와 등가의 이리노테칸 모이어티의 양을 제공하는 이리노테칸 또는 그의 염)의 농도에서 이리노테칸이 로딩되었다. 각 이리노테칸 리포솜 제제는 상이한 양의 SOS 포획제를 함유하였으며, 상이한 pH 값에서 제형화되었다. 각 이리노테칸 리포솜 제제에서 리소-PC의 양은 연속 냉장 저장 (4℃에서)의 9개월 후에 모든 샘플의 측정을 포함하여, 다양한 시점에서 측정되었다. 표 1A의 모든 샘플은 SOS에 대해 양성자화된 TEA 반대-이온을 사용하여 로딩되었다 (즉, 표 1A에 명시된 바와 같은, 다양한 농도의 TEA8SOS를 캡슐화하는 리포솜 내로의 이리노테칸의 로딩).
표 1A: 이리노테칸 리포솜 안정성 비 및 리소-PC (4℃에서의 9개월 후)a
Figure pct00004
a 본원에 기재된 바와 같은, 방법 B에 따라 측정됨.
도 2a는 4℃에서의 9개월의 저장 후에 표 1A의 각 샘플에서 측정된 리소-PC의 양을 도시하는 플롯을 제시한다. 샘플 12는 표 1A 및 도 2a에서 비교자로서 표시된다. 약 900 초과의 안정성 비 및 6.5 초과 (예를 들어, 7.25 및 7.5)의 pH를 둘 다 갖는 샘플은 4℃에서의 9개월의 냉장 저장 후에 20 mol% 미만의 리소-PC를 함유하였다. 도 2c는 4℃에서의 6개월의 저장 후의 액체 이리노테칸 리포솜 조성물의 리소-PC의 상대량 (mol%)에 대한 안정성 비 값의 그래프이다 (표 6의 데이터). 백색 원형으로 나타낸 데이터 포인트는 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 측정된 6.5 초과 (7.25 또는 7.5)의 pH를 갖는 이리노테칸 샘플에 상응한다. 다이아몬드로 나타낸 데이터 포인트는 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 측정된 6.5의 pH를 갖는 이리노테칸 샘플에 상응한다. 안정성 비는 각 샘플의 제조 동안, 본원에 정의된 바와 같이 계산되었다. mol% 리소-PC는 각 샘플을 제조한 이후 처음 6개월의 저장 후에 측정되었다.
표 1B: 이리노테칸 리포솜 안정성 비 및 리소-PC (4℃에서의 6개월 후)b
Figure pct00005
b 본원에 기재된 바와 같은, 방법 B에 따라 측정됨.
도 2b는 4℃에서의 6개월의 저장 후에 표 1B의 각 샘플에서 측정된 리소-PC의 양을 도시하는 플롯을 제시한다. 약 989 초과의 안정성 비 및 6.5 초과 (예를 들어, 7.25 및 7.5)의 pH를 둘 다 갖는 샘플은 4℃에서의 6개월의 냉장 저장 후에 20 mol% 미만의 리소-PC를 함유하였다.
도 3a-3d는 6.5의 pH를 갖는 표 1A 및 1B로부터 선택된 이리노테칸 리포솜 제제 내의 리소-PC의 mol%를 제시하는 플롯이다. 리소-PC는 각 샘플을 4℃에서 0, 1, 3, 6, 9 및/또는 12개월 동안 저장한 후에 결정되었다. 이들 플롯은 각 샘플의 시간 경과에 따른 리소-PC (mol%)의 증가율에 대한 추정치로서, 데이터에 대한 선형 회귀선을 포함한다. 각 도면에 대한 기울기, y-절편 및 R2 값의 요약이 하기 표 1C에 제시되어 있다.
표 1C: pH 6.5에서의 냉장 저장 시간 (개월수)에 대한 리소-PC의 mol%
Figure pct00006
일부 실시양태에서, 직경 약 100 nm (예를 들어, 100 ± 20 nm)의 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 SOS를 함유하는 이리노테칸 리포솜 제제의 안정성은 안정성 비가 942를 초과하는 이리노테칸 리포솜에서 유의하게 증가된다. 총 인지질에 대해 500 g (±10%)의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)의 일정한 약물 로딩 비를 유지하지만, SOS 포획제의 농도를 달리함으로써, 리포솜 제제 내의 리소-PC의 형성에 대한 안정성 비의 영향이 평가되었다. 표 2는 (비교) 샘플 12와 동일한 pH (6.5)에서, 그러나 SOS 포획제의 상이한 농도에서 (즉, 상이한 안정성 비에서) 제형화된 표 1의 이리노테칸 리포솜 제제에서 검출된 mol% 리소-PC의 양의 요약을 제공한다. 표 2는 SOS 포획제 및 이리노테칸을 함유하는 이리노테칸 리포솜에 관해 942 초과의 안정성 비를 갖는 것은 냉장 저장 동안의 리소-PC의 형성을 감소시킨다는 것을 설명한다. 비교자 이리노테칸 리포솜 제제에 비해 SOS 포획제의 양을 최대 30% 감소시키는 것 (즉, 안정성 비를 증가시키는 것)은 9개월의 냉장 저장 후에 리소-PC의 양의 약 1%의 약간의 증가를 야기하였다. 그러나, 942 초과의 안정성 비를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제에서 SOS 포획제의 양을 증가시키는 것은 4℃에서의 9개월의 냉장 저장 후에 존재하는 리소-PC의 양 (mol%)에서의 유의한 예상외의 감소를 야기한다. 예를 들어, 942 초과의 안정성 비의 그 다음의 5% 증분 증가 (즉, 샘플 2의 992의 안정성 비)는 샘플 3과 비교하여 존재하는 리소-PC의 양 (mol%)의 34%의 현저한 감소를 야기하였으며, 이는 샘플 12와 비교하여 리소-PC의 양 (mol%)의 33% 감소와 등가이다 (4℃에서의 9개월의 냉장 저장에서 측정 시). 종합하면, 4℃에서의 9개월의 냉장 저장 후에, 비교자 샘플 12와 비교하여 약 28-51%의 리소-PC (mol%)의 감소는 이리노테칸 리포솜의 안정성 비를 942를 초과하여 상승시킴으로써 달성되었다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 SOS 리포솜 조성물은 942 초과의 안정성 비를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 이리노테칸 SOS 리포솜 제제는 942-1130 또는 그 초과의 안정성 비 (예를 들어, 992-1047의 안정성 비)를 갖는다.
표 2: 이리노테칸 리포솜 안정성 비 및 리소-PC (4℃에서의 9개월 후, pH 6.5)
Figure pct00007
표 2는 냉장 저장 동안 리포솜-내부 리소-PC의 형성을 감소시키기 위해, SOS 포획제 및 이리노테칸을 함유하는 pH 6.5의 이리노테칸 리포솜을 안정화시키는데 있어서의 942 초과 (바람직하게는 950 초과, 가장 바람직하게는 992 초과)의 안정성 비를 갖는 것의 중요성을 설명한다. 종합하면, 4℃에서의 6개월 동안의 저장 중에 약 28-51%의 리포솜-내부 리소-PC의 감소는 950 초과 (예를 들어, 950-1050)의 안정성 비를 갖는 pH 6의 이리노테칸 리포솜 조성물을 제조함으로써 달성되었다. 포획제 리포솜의 제조에 사용되는 SOS 포획제의 농도를, 비교자 이리노테칸 리포솜 제제를 제조하는데 사용된 SOS 포획제의 상응하는 농도에 비해 최대 30% 감소시키는 것 (즉, 안정성 비를 증가시키는 것) (샘플 3 및 12의 비교)은 9개월의 냉장 저장 후에 리소-PC의 양의 약 1%의 약간의 증가를 야기하였다. 그러나, 992 이상의 안정성 비를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제를 형성하기 위해 이리노테칸 로딩 전에 포획제 리포솜을 형성하는데 사용되는 SOS 포획제의 양을 증가시키는 것은 제조 후 생성된 이리노테칸 리포솜의 처음 9개월의 냉장 저장 후에 리소-PC 형성에서의 유의한 예상외의 감소를 야기하였다. 예를 들어, 표 2의 데이터는, 942 초과의 안정성 비의 5% 증가가 4℃에서의 9개월의 저장 후에 리소PC의 34% 감소를 야기하였다는 것을 제시한다 (샘플 2 및 샘플 3의 비교). 992 (샘플 2)에서 1047로 안정성 비를 증가시키는 것 (SR의 6% 증가)은 4℃에서의 9개월의 저장 후에 생성된 리소-PC의 26% 감소를 야기하였으며 (샘플 6 및 샘플 2의 비교), 4℃에서의 9개월의 저장 후에 생성된 리소-PC의 8% 증가를 야기하였다 (샘플 1 및 샘플 2의 비교). 따라서, 바람직한 이리노테칸 SOS 리포솜 조성물은 1000-1200 또는 그 초과의 안정성 비 (예를 들어, 1053-111의 안정성 비)를 갖는 이리노테칸 SOS 리포솜 제제를 포함하여, 1000 초과의 안정성 비를 갖는다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 직경 약 100±20 nm, 바람직하게는 100±10 nm의 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 SOS를 함유하는 이리노테칸 리포솜 제제의 안정성은 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 제제의 pH를 pH 6.5를 초과하여 상승시킴으로써 유의하게 증가된다. 인지질의 mol당 471 g 또는 500 g의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)의 일정한 약물 로딩 비를 유지하지만, 이리노테칸 리포솜 조성물의 최종 pH의 pH를 달리함으로써, 리포솜 제제 내의 리소-PC의 형성에 대한 pH의 영향이 평가되었다. 표 3은 상이한 pH 값에서 제형화된 표 1의 이리노테칸 리포솜 제제 내의 리소-PC의 양의 요약을 제공한다. 표 3A는 인지질의 몰당 총 471 g의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)를 리포솜 (0.6 M의 술페이트 기 농도에서 TEA8SOS를 캡슐화한 것)에 로딩함으로써 형성된, 이리노테칸 리포솜 제제 (즉, 471/0.6 또는 785의 안정성 비)에 대한 표 1로부터의 데이터를 보고한다. 리소-PC 형성의 % 변화는 샘플 4 및 샘플 9 둘 다와 관련하여 계산되었다 (이들은 둘 다 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 pH 6.5를 가짐). 표 3B는 인지질의 몰당 총 471 g의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)를 리포솜 (0.45 M의 술페이트 기 농도에서 TEA8SOS를 캡슐화한 것)에 로딩함으로써 형성된, 이리노테칸 리포솜 제제 (예를 들어, 471/0.45 또는 1047의 안정성 비)에 대한 표 1로부터의 데이터를 보고한다. 리소-PC 형성의 % 변화는 샘플 1 및 샘플 6 둘 다와 관련하여 계산되었다 (이들은 둘 다 제조 후이지만, 그러나 저장 전에 6.5의 pH를 가짐).
표 3A: 이리노테칸 리포솜 제제 pH 및 리소-PC (4℃에서의 9개월 후, 471 g 이리노테칸 모이어티/mol 인지질, 0.6 M SOS 술페이트 기 농도)
Figure pct00008
표 3B: 이리노테칸 리포솜 제제 pH 및 리소-PC (4℃에서의 9개월 후, 471 g 이리노테칸 모이어티/mol 인지질, 0.45 M SOS 포획제 농도)
Figure pct00009
상기 표 3A 및 3B의 데이터에서, pH를 6.5에서 7.25 또는 7.5로 증가시키는 것은 리소-PC의 양을 785의 안정성 비를 갖는 이리노테칸 SOS 리포솜에 대해서는 약 15-20% 감소시켰고 (표 3A), 1047의 안정성 비를 갖는 이리노테칸 SOS 리포솜에서는 약 20-70% 감소시켰다 (표 3B). 이는 포스파티딜콜린 가수분해를 최소화하기 위한 최적으로서 6.5의 pH를 제시하는 기존의 보고를 고려하면 예상외였다 (Grit, M et al., "Hydrolysis of partially saturated egg phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions and the effect of cholesterol incorporation on hydrolysis kinetics," The Journal of pharmacy and pharmacology (1993) v 45, Is 6, pp 490-495).
도 4a-4c는 표 1A 및 1B로부터 선택된 7.25 또는 7.5의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제에서, 4℃에서의 각 샘플의 저장 후 0, 1, 3, 6 및/또는 9개월 후에 측정된 리소-PC의 mol%를 제시하는 플롯을 도시한다. 이들 플롯은 각 샘플의 시간 경과에 따른 리소-PC의 증가율에 대한 선형 회귀선을 포함한다. 각 도면에 대한 기울기, y-절편 및 R2 값의 요약이 하기 표 4에 제시되어 있다. 보다 소량의 리소-PC는 942 초과 (예를 들어, 1047)의 안정성 비 및 7.25 또는 7.5의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제 샘플에서 관찰되었다 (예를 들어, pH 7.25의 경우는 도 4a 및 4c의 샘플 5, 7 및 13과 샘플 10의 비교, 또는 pH 7.5의 경우는 도 4b의 샘플 8과 도 4c의 샘플 11의 비교). 또한, 942 미만의 안정성 비를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제에서는 9개월 후에 보다 많은 리소-PC가 측정되었다 (예를 들어, 샘플 10 및 11의 785, 이들은 둘 다 심지어 6.5 초과의 pH에서도, 6개월 후에 20 mol% 초과의 리소-PC를 가짐).
표 4: >6.5의 pH에서의 냉장 저장 시간 (개월수)에 대한 mol% 리소-PC
Figure pct00010
표 5: 6 및 9개월의 냉장 저장 후의 >942의 SR에서의 mol% 리소-PC
Figure pct00011
추가의 캄프토테신 조성물
캄프토테신 조성물은 캄프토테신 조성물의 제조 이후 (예를 들어, 캄프토테신 조성물이 제약 투여를 위해 멸균 용기에 밀봉될 때부터 시작하여), 냉장 저장, 즉 2-8℃에서의 기간 후에 감소된 양의 리소-인지질(들)을 생성하는, 하나 이상의 캄프토테신 화합물(들) 및 하나 이상의 인지질(들)을 포함하는 연장-방출 조성물일 수 있다.
안정화된 연장 방출 조성물은 캄프토테신 화합물 및 인지질 또는 가수분해되어 리소-인지질을 형성할 수 있는 다른 구성요소(들)를 포함하는 매트릭스 조성물을 포함할 수 있다. 매트릭스 조성물은 인지질(들) 및 다른 구성요소, 예컨대 콜레스테롤 및 PEG에 공유 연결된 지질을 포함하는 소포 내에 하나 이상의 캄프토테신 화합물(들)을 캡슐화하는 리포솜으로서 구성될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 매트릭스 조성물은, 예를 들어, 매트릭스 조성물 내의 리소-인지질 형성의 양을 감소시키는데 효과적인, 음이온성 포획제의 양 및 캄프토테신 화합물의 양, 뿐만 아니라 매트릭스 조성물을 함유하는 매질에서의 특정한 pH로 매트릭스 조성물을 제조함으로써 안정화된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 연장-방출 조성물은 지질 및/또는 생체적합성 중합체 (예를 들어, 시클로덱스트린, 생분해성 중합체 예컨대 PGA (폴리글리콜산) 및/또는 PLGA (폴리(락트산-코-글리콜산)))를 포함하는 조성물과 방출가능하게-회합된 트리에틸암모늄 수크로소페이트 (SOS) 및 이리노테칸을 포함하는 나노입자이다.
다른 예에서, 연장 방출 제형은 방출가능하게-회합된 화합물 예컨대 토포테칸, 에티리노테칸 및/또는 이리노테칸을 포함하는 매트릭스 조성물 (예를 들어, 캄프토테신 또는 캄프토테신 유도체 화합물을 방출가능하게 포획하거나 또는 보유하는 나노입자 또는 중합체)이다. 매트릭스 조성물은 생체적합성 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 기능적 등가 물질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)이다.
일부 실시양태에서, 연장 방출 제형은 생체적합성 중합체 예컨대 시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유사체 (예를 들어, 술페이트화된 시클로덱스트린)에 접합된 캄프토테신 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 연장 방출 제형은 캄프토테신 화합물 (예를 들어, 이리노테칸 및/또는 SN-38)에 화학적으로 결합된 시클로덱스트린-함유 중합체를 포함할 수 있다. 시클로덱스트린-캄프토테신 접합 화합물은 제약상 허용되는 용량으로 투여될 수 있다. 캄프토테신-시클로덱스트린 접합체의 예는 시클로덱스트린-함유 중합체 접합체 및 관련 중간체를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 지질 및/또는 생체적합성 중합체를 포함하는 연장-방출 조성물, 예컨대 저장 동안 캄프토테신 화합물(들)을 보유하고, 후속적으로 환자의 신체 내에서 화합물을 방출시키도록 제형화된 시클로덱스트린-함유 조성물은 지질 매트릭스 및/또는 착물화제(들)를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 매트릭스 조성물은 냉장 저장 동안에 리소-PC의 형성을 감소시키도록 안정화된 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 유도체를 포함한다.
바람직하게는, 연장 방출 조성물은 (a) 포획제를 포함하는 매트릭스 조성물을 형성하는 단계, 및 (b) 매트릭스를 캄프토테신 화합물과, 대상체에게 투여 시 대상체의 신체 내에서 캄프토테신 화합물의 목적하는 방출을 가능하게 하는 방식으로 매트릭스 조성물과 회합된 포획제 및 캄프토테신 화합물을 포함하는 생성된 연장-방출 조성물에 캄프토테신 화합물을 안정하게 보유하는데 효과적인 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하는 다단계 방법에 의해 제조된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 연장-방출 조성물은 mL당 4.3 mg/mL의 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도에서 이리노테칸 또는 그의 염을 함유함과 동시에, 또한 4℃에서의 6개월의 냉장 저장에서 약 1 mg/mL 미만 (또는 약 20 mol% 미만)의 리소-PC를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 연장-방출 조성물은 mL당 4.3 mg/mL의 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도에서 이리노테칸 또는 그의 염을 함유함과 동시에, 또한 2-8℃, 보다 더 바람직하게는 약 4℃에서의 12개월의 냉장 저장에서 약 2 mg/mL 미만 (또는 약 30 mol% 미만)의 리소-PC를 함유한다.
연장-방출 조성물은 리포솜을 포함할 수 있다. 리포솜은 전형적으로 수성 내부를 둘러싸고 있는 1개 이상의 지질 이중층을 함유하는 소포를 포함한다. 리포솜 조성물은 통상적으로 리포솜 외부의 매질, 예컨대 수성 유체에 리포솜을 포함한다. 리포솜 지질은, 수성 매질과 접촉 시, 자발적으로 이중층 막을 형성하는 친양쪽성 지질 구성요소, 예컨대 인지질, 예를 들어 포스파티딜콜린을 포함할 수 있다. 리포솜은 또한 막-강성화 구성요소, 예컨대 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 리포솜은 또한 리포솜의 응집 경향을 감소시킬 수 있으며 또한 다른 유익한 효과를 가질 수 있는, 친수성 중합체에 접합된 지질, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 지질 유도체를 포함한다. 하나의 이러한 PEG-지질은 PEG 모이어티가 약 2000의 분자량을 갖는 N-(메톡시-PEG)-옥시카르보닐-디스테아로일-포스파티딜에탄올아민, 또는 MPEG-2000-DSPE이다. 리포솜은 전형적으로 마이크로미터 또는 서브마이크로미터 범위의 크기를 가지고, 제약 물질, 예컨대 항암 약물, 예컨대 이리노테칸을 운반하며, 다양한 유익한 방식으로 그의 제약 특성을 변화시키는 그의 능력에 대해 널리 인식되어 있다. 제약 리포솜 조성물을 제조하고 특징화하는 방법은 관련 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Lasic D. Liposomes: From physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1993; G. Gregoriadis (ed.), Liposome Technology, 3rd edition, vol. 1-3, CRC Press, Boca Raton, 2006]; Hong et al., 미국 특허 8,147,867 참조).
일부 실시양태에서, 리포솜은 본원의 하나 이상의 실시예 또는 다른 실시양태에 기재된 바와 같이 제조되나, 최종 리포솜 조성물의 농도는 제형이 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 mg/mL의 농도의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도를 함유하도록 증가된다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 모이어티 농도는 5-10, 10-20, 20-30, 30-40 또는 40-50 mg/mL의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물과 등가이다. 일부 실시양태에서, 이 섹션 하에 언급된 리포솜 조성물은 미국 특허 번호 8,658,203에 기재된 바와 같이 포유동물에서 뇌 종양 또는 임의의 다른 병태를 치료하는데 사용되며, 이 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제형은 리포솜을 함유하는 주사가능한 제형 (환자에게의 투여 전에 제약상 허용되는 희석제로 후속적으로 희석될 수 있는 주사가능한 제형 포함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 일정 양의 이리노테칸 또는 그의 염이 하나 이상의 포획제를 함유하는 리포솜에 첨가되며, 여기서 이리노테칸은 이리노테칸 유리 무수 염기의 그램으로, 인지질의 mol당 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g 또는 700 g과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸은 약물 로딩 과정 동안, 이리노테칸 유리 무수 염기의 그램으로, 인지질의 mol당 200 내지 300 g, 400 내지 550 g, 450 내지 600 g, 또는 600 내지 700 g과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도로 존재한다. 바람직하게는, 리포솜 인지질의 mol당 약 500 g (±10%)의 모이어티가 이리노테칸 리포솜 내에 로딩되며, 예컨대 총 이리노테칸 리포솜 인지질의 mol당 471 g의 이리노테칸 모이어티가 로딩된다. 본원에서 구체적 예는 총 리포솜 인지질의 mol당 471 g의 이리노테칸 모이어티를 함유하는 안정화된 이리노테칸 리포솜, 뿐만 아니라 총 리포솜 인지질의 mol당 500 g의 이리노테칸 모이어티를 함유하는 이리노테칸 리포솜의 측정치를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리포솜 제제에서 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도는 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.3, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 또는 약 6.0 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 리포솜 제제에서 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도는 2.5-3.5, 3.5-4.5, 4.5-5.5, 또는 5.5-6.5 mg/mL이다. 4.5-5.5 mg/mL가 가장 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 리포솜 제제 내의 이리노테칸 모이어티의 농도는 mL당 약 4.3 mg/mL의 이리노테칸 유리 염기 무수이며, 보다 바람직한 실시양태에서 이러한 농도는 mL당 4.3 mg/mL의 이리노테칸 유리 염기 무수이다. 리포솜 제제는 약 10 mL의 부피를 갖는 리포솜 제제에 약 43 mg의 이리노테칸 유리 무수 염기를 함유하는 바이알일 수 있으며, 이는 환자에게의 정맥내 투여 전에 후속적으로 희석될 수 있다 (예를 들어, 500 mL의 제약상 허용되는 희석제로).
따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 단층의 지질 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 (SOS)를 캡슐화하는 안정화된 이리노테칸 리포솜을 포함하는 이리노테칸 리포솜 제제를 제조하는 방법이며, (a) 이리노테칸을 함유하는 용액을 0.4-0.5 M의 술페이트 농도 (TEA8SOS로부터 제공됨)에서 이리노테칸 없이 트리에틸암모늄 (TEA) 양이온 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제를 캡슐화하는 포획제 리포솜과, 인지질의 mol당 500 g (±10%)의 이리노테칸 모이어티를 포획제 리포솜 내에 로딩하는데 효과적인 조건 하에 접촉시켜 이리노테칸 SOS 리포솜을 형성하는 단계, 및 (b) 7.25-7.50의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하도록 이리노테칸 SOS 리포솜을 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)과 조합하여, 4℃에서의 3개월의 저장 동안 (이리노테칸 리포솜 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하도록 안정화된 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
저장 안정화된 이리노테칸 리포솜은 TEA 함유 리포솜의 형성, 이어서 TEA가 리포솜에서 빠져나옴에 따라 이리노테칸의 리포솜 내로의 로딩을 포함하는 다중 단계에서 제조될 수 있다. 제1 단계는 리포솜 지질을 TEA 수크로소페이트의 용액에 수화 및 분산시킴으로써 TEA-수크로소페이트 함유 리포솜을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 이는, 예를 들어, 지질, 예컨대 DSPC 및 콜레스테롤을 가열된 에탄올에 용해시키고, 용해 및 가열된 지질 용액을 리포솜 지질의 전이 온도 (Tm) 초과, 예를 들어 60℃ 이상의 온도에서 TEA-수크로소페이트 수용액에 분산시킴으로써 수행될 수 있다. 지질 분산액은 한정된 세공 크기, 예를 들어 100 nm를 갖는 트랙-에칭된 폴리카르보네이트 막을 통한 압출에 의해, 75-125 nm (예컨대 80-120 nm, 또는 일부 실시양태에서는 90-115 nm)의 평균 크기를 갖는 리포솜으로 형성될 수 있다. TEA-수크로소페이트는 수크로소페이트의 각 몰 당량에 대해 적어도 8 몰 당량의 TEA를 포함하여, 약 0.40-0.50 M의 술페이트 농도, 및 분산 및 압출 단계 동안 리포솜 인지질의 허용되지 않는 분해를 방지하도록 선택된 pH (예를 들어, 약 6.5) (예를 들어, 이들 단계 동안 리포솜 인지질의 분해를 최소화하도록 선택된 pH)를 가질 수 있는 용액을 수득할 수 있다. 이어서, 비-포획된 TEA-SOS는 이리노테칸 캡슐화 전에 리포솜 분산액으로부터, 예를 들어 투석, 겔 크로마토그래피, 이온 교환 또는 한외여과에 의해 제거될 수 있다. 이들 리포솜은 생성된 리포솜 조성물 내의 TEA의 양을, 4℃, 또는 보다 통상적으로는 5 ± 3℃에서의 180일 후에, 예를 들어 mg/mL/개월, 또는 단위 시간의 경과에 따른 리소-PC로의 % PC 전환, 예컨대 mol% 리소-PC/ 개월로 측정된 리소-PC 형성이 주어진 최대 수준보다 낮아지도록 하는 수준으로 감소시키는데 충분한 이리노테칸을 리포솜 내에 로딩함으로써 안정화될 수 있다. 그 후에, 로딩 과정 동안 리포솜으로부터 외부 매질로 교환된 TEA는, 임의의 비포획된 이리노테칸과 함께, 전형적으로 임의의 적합한 공지된 방법(들) (예를 들어, 겔 크로마토그래피, 투석, 투석여과, 이온 교환 또는 한외여과)에 의해 리포솜으로부터 제거된다. 리포솜 외부 매질은 목적하는 pH에서 완충된, 주사가능한 등장성 유체 (예를 들어 염화나트륨의 등장성 용액)로 교환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 약 3.9-4.7 mg/mL의 이리노테칸 및 4℃에서의 180일 후에 20% 미만의 리소-PC를 함유하는 이리노테칸 리포솜 조성물은 TEA의 양이 약 25 ppm 미만 또는 약 20 ppm 미만일 때 수득될 수 있다. 리포솜 바깥쪽에서 이리노테칸 리포솜 조성물의 pH를 상승시키는 것은 또한 25 ppm 초과의 TEA를 함유하는 이리노테칸 수크로소페이트 리포솜을 저장 안정화시켜, 4℃에서의 180일 후에 20% 미만의 추가의 리소-PC 형성을 갖는 이리노테칸 리포솜을 생성할 수 있다. 예를 들어, 약 4-5 mg 이리노테칸/mL 및 100 ppm의 TEA를 함유하며, 리포솜 바깥쪽에서 약 7-8의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물은 또한 4℃에서의 180일 후에 20% 미만의 리소-PC 형성을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 약 25 ppm 미만 (또는 바람직하게는 20 ppm 미만)의 잔류 TEA의 양을 가지면서, 약 3.9-4.7 mg/mL의 이리노테칸 및 7-8 범위의 리포솜 외부 매질의 pH를 함유하는 리포솜 조성물은, 4℃에서 180일에 걸쳐 리포솜 조성물에 누적된 리소-PC의 양이 10 mol.% 이하일 수 있다.
따라서, 본 발명은 적어도 990 (예를 들어, 990-1100, 또는 약 1111)의 리소-PC 안정성 비를 갖는 인지질 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트를 포함하는 이리노테칸 리포솜 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 3:2 몰비의 DSPC 및 콜레스테롤을 포함하는 소포에 캡슐화된 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 4.3 mg/mL (±10%)의 모이어티 및 0.4-0.5 M 농도의 술페이트, 및 소포에서의 400-600 g 이리노테칸 /mol 인지질의 비를 포함하는 이리노테칸 리포솜 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 총 약 4.3 mg 이리노테칸 모이어티/mL를 포함하며, 이리노테칸의 적어도 98%가 약 8:1의 이리노테칸:SOS 몰비로 수크로스 옥타술페이트 (SOS)와 함께 리포솜 조성물 내에 캡슐화되어 있고, 리포솜은 75-125 nm의 평균 크기를 갖는 것인 이리노테칸 리포솜 조성물을 제공한다. 안정화된 고밀도 이리노테칸 리포솜의 크기는 바람직하게는 약 110 nm (±20 nm), 보다 바람직하게는 110 nm (±10 nm)이다 (리포솜성 약물 로딩 후에 측정됨). 바람직하게는, 제약 조성물 내의 이리노테칸의 적어도 약 95%는 리포솜 내에 캡슐화된다. 리포솜은 바람직하게는 3:2 몰비의 DSPC 및 콜레스테롤을 포함한다.
본 발명은 또한 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 단층의 지질 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 (SOS)를 캡슐화하는 안정화된 이리노테칸 리포솜을 포함하는 제약을 제조하는 방법이며, (a) 이리노테칸을 0.4-0.5 M의 술페이트 농도에서 이리노테칸 없이 TEA8SOS로서 트리에틸암모늄 (TEA) 양이온 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제를 캡슐화하는 포획제 리포솜과, 포획제 리포솜 내에 이리노테칸 모이어티를 로딩하고, 포획제 리포솜으로부터 TEA 양이온의 방출을 가능하게 하는데 효과적인 조건 하에 접촉시켜 이리노테칸 SOS 리포솜을 형성하는 단계, (b) 7.25-7.50의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하도록 이리노테칸 SOS 리포솜을 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)과 조합하여, 4℃에서의 3개월의 저장 동안 (이리노테칸 리포솜 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하도록 안정화된 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하는 단계, 및 (c) 이리노테칸 SOS 리포솜 및 HEPES의 조합을 제약으로서 제형화하는 단계를 포함하는 방법을 제공할 수 있다.
이들 방법의 일부 실시양태에서, 이리노테칸 리포솜 제제 내의 이리노테칸 SOS 리포솜은 총 100 ppm 미만의 TEA를 함유한다. 일부 실시양태에서, 단층의 지질 이중층 소포는 6.81 mg/mL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 2.22 mg/mL의 콜레스테롤 및 0.12 mg/mL의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 리포솜 제제는 총 안정화된 이리노테칸 리포솜 인지질의 mol당 총 500 g (±10%)의 이리노테칸을 포함하고, 이리노테칸 리포솜 제제 내의 이리노테칸의 적어도 98%는 이리노테칸 리포솜 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 리포솜 제제는 4.05 mg/mL의 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 리포솜 제제는 8.42 mg/mL의 염화나트륨을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이리노테칸 리포솜 제제는 약 4.3 mg/mL의 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안정화된 이리노테칸 리포솜은 화학식 (I)의 화합물로 이리노테칸 및 SOS를 캡슐화하며, 여기서 x=8이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 3개월의 저장 후에 2 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 3개월의 저장 후에 5 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 리포솜성 조성물은 2-8℃에서의 6개월의 저장 후에 10 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 9개월의 저장 후에 10 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 6개월의 저장 후에 5 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 9개월의 저장 후에 5 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 6개월의 저장 후에 2 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 9개월의 저장 후에 2 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 12개월의 저장 후에 10 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 12개월의 저장 후에 5 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 12개월의 저장 후에 2 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 24개월의 저장 후에 10 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 24개월의 저장 후에 5 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 2-8℃에서의 24개월의 저장 후에 2 mol% 미만의 리소-PC를 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 100 ppm 미만의 치환된 암모늄을 함유한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 양성자화된 TEA 또는 DEA인, 20 내지 80 ppm의 치환된 암모늄 화합물을 함유한다.
다른 실시양태에서, 안정화된 캄프토테신 조성물은 캄프토테신 조성물의 제조를 위한 하나 이상의 구성요소 바이알을 포함하는 키트로서 제공된다. 예를 들어, 리포솜성 이리노테칸의 제조를 위한 키트는 하기를 포함할 수 있다 (별개의 용기 또는 동일한 용기의 별개의 부분에 저장됨):
Figure pct00012
이리노테칸 용액 (예를 들어, 주사용 이리노테칸 HCl);
Figure pct00013
포획제를 캡슐화하는 리포솜 (예를 들어, 수크로스 옥타술페이트 용액으로부터 형성된 포획제 리포솜); 및
Figure pct00014
이리노테칸 용액 및 포획제 리포솜을 조합하여, 리포솜성 이리노테칸 리포솜에 캡슐화된 치료 유효량의 이리노테칸을 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물 (예를 들어, 포획제 리포솜 내의 총 인지질의 mol당 500 g (±10%)의 이리노테칸 및 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 4.3 mg의 총 이리노테칸)을 형성하는 것에 대한 지침서.
캄프토테신 조성물의 치료 용도
캄프토테신 조성물 - 예컨대 본 발명의 이리노테칸 리포솜 및 본원에 개시된 다른 조성물 및 제제는 요법 및 치료 방법, 및 또는 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요법은 암의 치료를 위한 캄프토테신 조성물의 투여를 포함한다. 예를 들어, 암은 기저 세포암, 수모세포종 암, 간암, 횡문근육종, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계의 신생물, 원발성 중추 신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종, 또는 이들 암 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 췌장암, 임의로 췌장의 선암종, 예컨대, 예를 들어 겜시타빈-기반 요법 이후 질환 진행이 발생한 췌장의 전이성 선암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 난소암이다. 일부 실시양태에서, 암은 소세포 폐암이다. 일부 실시양태에서, 암은 담도암이다.
요법으로서 사용되는 경우에, 리포솜 조성물은 하나 이상의 다른 화합물 또는 조성물과 함께 치료 레지멘에 사용될 수 있다. 하나 이상의 다른 화합물 또는 조성물과 함께 리포솜 조성물을 투여하는 것은 동시적, 개별적 또는 순차적일 수 있다. 하나 이상의 다른 화합물 또는 조성물은 추가의 치료제, 예를 들어 추가의 항암제일 수 있거나, 또는 치료제의 부정적 부작용을 호전시키도록 설계된 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포솜 조성물은 류코보린과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 리포솜 조성물은 5-플루오로우라실 (5-FU)과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 리포솜 조성물은 류코보린 및 5-플루오로우라실 (5-FU)과 함께 투여된다. 이전 단락에 논의된 바와 같은, 췌장암을 치료하기 위해 이러한 3중 레지멘이 사용될 수 있다. 5-FU는 2400 mg/m2의 용량으로 투여될 수 있고, 류코보린은 200 mg/m2 (l 형태) 또는 400 mg/m2 (l + d 라세미 형태)의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 치료 레지멘에서 겜시타빈과 함께 투여된다.
리포솜 조성물이 난소암을 치료하는데 사용되는 일부 실시양태에서, 리포솜 조성물은 PARP (폴리 ADP 리보스 폴리머라제) 억제제와 함께 투여된다.
일부 실시양태에서, 연장 방출 매트릭스는 포획제를 보유하도록 구성된 나노입자 (예를 들어 실리카 또는 중합체) 또는 중합체 응집체 (예를 들어, PEG 중합체)일 수 있다. 약물 로딩 동안, 매트릭스는 캄프토테신 화합물 및 포획제를 둘 다 보유하는데 효과적인 조건 하에 캄프토테신 화합물과 접촉되어, 안정한 연장 방출 제형을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 안정화된 캄프토테신 조성물은 전도 촉진 전달 요법 동안에 환자에게의 실질내 투여를 위해 제형화된 이리노테칸 SOS 리포솜 제제이다. 최종 리포솜 제제 내의 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도는 약 17, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35 또는 약 40 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 최종 리포솜 제제 내의 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도는 17-20, 17-25, 17-30, 17-35, 또는 17-40 mg/mL이다. 가장 바람직하게는, 이리노테칸 리포솜 제제 내의 이리노테칸 유리 무수 염기 (예를 들어, 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트로서)에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티의 총 농도는 17 mg/mL 또는 35 mg/mL이다. 리포솜 제제는 환자에게의 국부 투여 (예를 들어, 신경교종이 진단된 환자의 뇌 내로, 전도 촉진 전달 요법의 일부로서 뇌내 위치에)를 위해 약 17 mg/mL 또는 약 35 mg/mL 또는 17-35 mg/ml의 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도에서 리포솜 제제 내의 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 리포솜이 멸균 용기에 봉입되어 있을 수 있다. 17-35 mg/mL 농도의 이리노테칸 리포솜은 이리노테칸 리포솜 제제의 mL당 20-40 mg의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물에 존재하는 이리노테칸 유리 무수 염기의 양과 등가로 표현될 수 있다. 예를 들어, 리포솜성 이리노테칸 제제는 17 mg, 26 mg, 52 mg 또는 70 mg의 총 이리노테칸 유리 무수 염기에 의해 제공되는 것과 등가의 총 이리노테칸 모이어티를 제공하는 용량으로 환자의 뇌에 (예를 들어, 종양내 위치에 외과적으로 배치된 하나 이상의 카테터를 통해) 투여될 수 있다. 환자의 뇌 내의 종양내 위치에 전달되는 이리노테칸 리포솜 제제의 이리노테칸 총 부피는 약 2-4시간 (예를 들어, 2-3시간, 3-4시간, 또는 2-4시간)의 기간에 걸쳐 약 1-2 mL (예를 들어, 1.0, 1.5, 또는 2.0 mL)일 수 있다.
이리노테칸 리포솜은 바람직하게는 3:2 몰비의 DSPC 및 콜레스테롤을 포함하는 지질로부터 형성된 소포 내에 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트를 함유한다. 소포는 또한 폴리에틸렌-글리콜 (PEG) 유도체화된 인지질, 예컨대 MPEG-2000-DSPE를 함유할 수 있다. MPEG-2000-DSPE의 양은 리포솜 지질의 1 mol% 미만 (예를 들어, 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE로 이루어진 소포에서 약 0.3 mol.%)일 수 있다. PEG는 이리노테칸을 둘러싸고 있는 리포솜 지질 소포의 안쪽 및 바깥쪽 둘 다에 분포될 수 있다. 캡슐화된 이리노테칸은 바람직하게는 수크로스의 술페이트 에스테르 (수크로소페이트)와의 염, 예컨대 이리노테칸 수크로소페이트 (CAS 등록 번호 1361317-83-0) 형태이다. 바람직하게는, 이리노테칸 리포솜 조성물 내의 이리노테칸의 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 약 98%는 리포솜 소포 내에 캡슐화되며, 이리노테칸 리포솜 조성물의 mL당 약 3.87-4.73 mg의 이리노테칸 (유리 무수 염기)의 총 이리노테칸 모이어티 농도를 갖는다. 이리노테칸 리포솜 조성물의 pH는 리포솜 바깥쪽에서 바람직하게는 약 6.5-8.0이거나, 또는 약 6.6-8.0, 6.7-8.0, 6.8-8.0, 6.9-8.0, 또는 7.0-8.0이고, 바람직하게는 약 7.2-7.6이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 7.2-7.5이다. 일부 실시양태에서, pH는 약 7.25이다. 다른 실시양태에서, pH는 약 7.25-7.5이다. 다른 실시양태에서, pH는 약 7.4-7.5이다.
조합 실시양태
본원의 넘버링된 실시양태로부터의 특색은 조성물과 관련된 실시양태 및 제제와 관련된 실시양태 둘 다를 포함한, 여기에 개시된 다른 실시양태로부터의 특색과 조합될 수 있다.
상기 기재된 방법은 조성물 및 제제의 제조에 관련된 것이므로, 이들은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 이들 조성물 및 제제의 실시양태와 공동의 특색을 공유한다. 조성물 및 제제와 관련하여 개시된 특색은 또한 상기 단락에 개시된 방법과 조합될 수 있다. 따라서, 상기 서브섹션, 및 본원의 다른 곳, 예컨대 하기 넘버링된 실시양태 섹션의 특색은 이 서브섹션의 단락에서 방법의 개시된 특색과 조합될 수 있다.
예를 들어, 하기는 본원에 개시 및/또는 예시된 실시양태의 다양한 조합의 예이다:
Figure pct00015
4℃에서의 180일 동안의 저장 후에, 약 3.9-4.7 mg/ml의 이리노테칸 모이어티 및 20% 미만의 리소-PC를 함유하는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00016
적어도 990 (예를 들어, 990-1100, 또는 약 1111)의 리소-PC 안정성 비를 갖는 인지질 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트를 포함하는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00017
3:2 몰비의 DSPC 및 콜레스테롤을 포함하는 소포에 캡슐화된 4.3 mg/mL (±10%)의 이리노테칸 모이어티 및 0.4-0.5 M 농도의 술페이트, 및 소포에서의 450-550 g 이리노테칸 /mol 총 인지질의 비를 포함하는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00018
총 약 4.3 mg 이리노테칸 모이어티/mL를 포함하며, 이리노테칸의 적어도 98%가 약 8:1의 이리노테칸:SOS 몰비로 수크로스 옥타술페이트 (SOS)와 함께 리포솜 조성물 내에 캡슐화되어 있고, 리포솜은 75-125 nm의 평균 크기를 갖는 것인 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00019
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜이 이리노테칸을 인지질 리포솜 내에 캡슐화된 트리에틸암모늄 (TEA) 수크로소페이트와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 조성물.
Figure pct00020
상기 실시양태에 있어서, TEA-SOS의 농도가 약 0.40-0.50 M인 조성물.
Figure pct00021
임의의 상기 실시양태에 있어서, 리포솜의 크기가 약 110 nm (±10%)인 조성물.
Figure pct00022
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 433 g 이리노테칸 모이어티/mol 인지질을 포함하는 조성물.
Figure pct00023
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜 조성물이 약 100 ppm 미만의 트리에틸아민을 함유하는 것인 조성물.
Figure pct00024
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜 조성물이 액체 중의 리포솜의 용액이며, 여기서 이리노테칸 리포솜 바깥쪽의 액체는 약 7.0-8.0, 예를 들어 7.25-7.5, 예컨대 7.25의 pH를 가지고, 임의로 여기서 이리노테칸 리포솜 바깥쪽의 액체는 제약상 허용되는 주사가능한 유체인 조성물.
Figure pct00025
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 모이어티를 4.5-5.5 mg/ml의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물에 의해 제공되는 것과 등가의 양으로 포함하는 조성물.
Figure pct00026
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜 조성물 내의 이리노테칸의 적어도 약 95%가 리포솜 내에 캡슐화되는 것인 조성물.
Figure pct00027
임의의 상기 실시양태에 있어서, 리포솜이 3:2 몰비의 DSPC 및 콜레스테롤을 포함하며, 예컨대 여기서 리포솜이 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG(2000)-DSPE를 포함하는 것인 조성물.
Figure pct00028
임의의 상기 실시양태에 있어서, 990-1200의 안정성 비를 갖는 조성물.
Figure pct00029
임의의 상기 실시양태에 있어서, 적어도 0.9, 적어도 0.95, 적어도 0.98, 적어도 0.99 또는 본질적으로 1.0의 리포솜으로 캡슐화된 이리노테칸/수크로소페이트 그램-당량비를 갖는 조성물.
Figure pct00030
임의의 상기 실시양태에 있어서, 리포솜 인지질이 약 4℃에서의 180일 동안의 저장 후에 20 mol% 이하의 리소-PC를 함유하는 것인 조성물.
Figure pct00031
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜 조성물이 이리노테칸 리포솜 바깥쪽에서 약 7.0-8.0의 pH를 갖는 제약상 허용되는 주사가능한 유체를 추가로 포함하고, 유리 염기로서 계산된 4.3 mg/mL의 이리노테칸을 포함하며, 임의로 이리노테칸을, 임의로 약 0.40-0.50N의 캡슐화된 TEA 수크로소페이트의 농도를 갖는, 인지질 리포솜 내에 캡슐화된 트리에틸암모늄 (TEA) 수크로소페이트와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 조성물.
Figure pct00032
임의의 상기 실시양태에 있어서, 인지질 리포솜 내에 캡슐화된 약 433 g 이리노테칸 모이어티/mol 인지질 및 약 100 ppm 이하의 트리에틸암모늄을 포함하는 조성물.
Figure pct00033
임의의 상기 실시양태에 있어서, 적어도 0.9의 캡슐화된 이리노테칸/수크로소페이트 그램-당량비를 갖는 조성물.
Figure pct00034
임의의 상기 실시양태에 있어서, 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트의 적어도 90%, 예컨대 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% (다시 말해서, 본질적으로 모두)가 하나의 수크로소페이트 분자당 8개의 이리노테칸 분자를 포함하는 화학량론적 염의 침전 또는 겔화된 형태인 조성물.
Figure pct00035
임의의 상기 실시양태에 있어서, 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트의 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%가 하나의 수크로소페이트 분자당 8개의 이리노테칸 분자를 포함하는 화학량론적 염의 침전 또는 겔화된 형태인 조성물.
Figure pct00036
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 100 ppm 이하의 트리에틸암모늄 (TEA)을 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00037
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 20 ppm 이하의 트리에틸암모늄 (TEA)을 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00038
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 10 mL의 총 부피를 갖는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00039
임의의 상기 실시양태에 있어서, 6.81 mg/mL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 2.22 mg/mL의 콜레스테롤 및 0.12 mg/mL의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)을 포함하는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00040
임의의 상기 실시양태에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜을 이리노테칸 리포솜의 안쪽 및 바깥쪽 둘 다에서 포함하는 이리노테칸 리포솜 조성물.
Figure pct00041
환자 체표면적의 m2당 70 mg의 이리노테칸을 전달하는데 충분한 이리노테칸의 용량을 포함하는, 환자에게의 투여를 위해 제형화된 안정화된 주사가능한 단위 용량 이리노테칸 리포솜 조성물이며, 여기서:
o 이리노테칸의 적어도 99%는 인지질 및 콜레스테롤을 포함하는 소포에 캡슐화되고, 여기서 인지질의 20 mol.% 이하가 리소-PC이며, 그 나머지는 DSPC이고, 여기서 소포는 7.0-8.0 범위의 pH를 갖는 주사가능한 유체 중에 존재하거나; 또는
o 주사가능한 단위 용량 리포솜 조성물은 상기 실시양태 중 어느 하나의 리포솜 조성물의 단위 용량인
조성물.
Figure pct00042
하기를 포함하는 주사가능한 이리노테칸 리포솜 단위 투여 형태:
o 인지질을 포함하며, 상기 인지질은 약 20 mol.% 이하의 리소-PC를 함유하는 것인 리포솜에 캡슐화된 단위 투여 형태 내의 이리노테칸의 적어도 약 98%; 및
o 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 리포솜 조성물.
Figure pct00043
상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 본질적으로 이루어진 지질 막에 의해 둘러싸인 소포에 캡슐화되는 것인 단위 투여 형태.
Figure pct00044
실시양태 29 또는 30에 있어서, 적어도 약 6.81 mg/mL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 약 2.22 mg/mL의 콜레스테롤 및 약 0.12 mg/mL의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE) L을 포함하는 단위 투여 형태.
Figure pct00045
실시양태 29-31 중 어느 하나에 있어서, 완충제로서의 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES) 및 등장성 시약으로서의 염화나트륨을 추가로 포함하는 단위 투여 형태.
Figure pct00046
실시양태 1-27 및 실시양태 29-32 중 어느 하나에 있어서, 요법에 사용하기 위한 리포솜 조성물 또는 단위 용량.
Figure pct00047
본원의 실시양태에 있어서, 암을 치료하는데 사용하기 위한 리포솜 조성물 또는 단위 용량.
Figure pct00048
본원의 실시양태에 있어서, 암이 기저 세포암, 수모세포종 암, 간암, 횡문근육종, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계의 신생물, 원발성 중추 신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종, 또는 이들 암 중 하나 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 리포솜 조성물 또는 단위 용량.
Figure pct00049
임의의 상기 실시양태에 있어서, 암이 췌장암, 임의로 췌장의 선암종, 예컨대, 예를 들어 겜시타빈-기반 요법 이후 질환 진행이 발생한 췌장의 전이성 선암종인 리포솜 조성물 또는 단위 용량.
Figure pct00050
임의의 상기 실시양태에 있어서, 암이 결장암인 리포솜 조성물 또는 단위 용량.
Figure pct00051
임의의 상기 실시양태에 있어서, 리포솜 조성물 또는 단위 용량이 류코보린 및/또는 5-플루오로우라실과 함께 사용하기 위한 것이며, 임의로 여기서 리포솜 조성물 또는 단위 용량, 류코보린 및/또는 5-플루오로우라실의 투여는 동시적, 개별적 또는 순차적인 리포솜 조성물 또는 단위 용량.
Figure pct00052
상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 리포솜이 80 mg/m2의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물과 등가의 이리노테칸의 양을 제공하는 용량으로 투여되는 것인 리포솜 조성물 또는 단위 용량.
Figure pct00053
겜시타빈-기반 요법 이후의 질환 진행 후에 치료를 필요로 하는 환자에서 췌장의 전이성 선암종을 치료하는 방법이며, 단위 투여 형태 내의 이리노테칸의 적어도 약 98%를 약 20% 미만의 리소-PC를 함유하는 인지질을 포함하는 리포솜에 캡슐화된 것으로 포함하는, 본원의 임의의 실시양태의 주사가능한 이리노테칸 리포솜 단위 투여 형태 또는 임의의 상기 실시양태에 따른 단위 용량을, 80 mg/m2의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물과 등가의 이리노테칸의 양을 제공하는 양으로 상기 환자에게 정맥내로 투여하는 것을 포함하는 방법.
Figure pct00054
7.00-7.50의 pH를 가지고, 이리노테칸 유리 무수 염기의 g으로, 총 리포솜 인지질의 mmol당 500 mg의 이리노테칸 및 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 4.3 mg의 이리노테칸과 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도에서, 콜레스테롤 및 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 단층의 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화하는 이리노테칸 리포솜의 분산액을 포함하며, 4℃에서의 6개월의 저장 동안 1 mg/mL 미만의 리소-PC를 형성하도록 안정화된, 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00055
상기 실시양태에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 리포솜성 이리노테칸 조성물:
(a) 0.4 내지 0.5 M의 술페이트 농도 및 5 내지 7의 pH를 갖는 DEA8SOS로부터 제조된 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 약 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE인 단계;
(b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
(c) DEA8SOS 및/또는 리포솜의 바깥쪽에 있는 DEA8SOS로부터 유래된 이온을 실질적으로 제거하는 단계;
(d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액과 접촉시키며, 이에 의해 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
(e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및/또는 DEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 실질적으로 제거하는 단계; 및
(f) 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5가 되도록 조정하는 단계.
Figure pct00056
임의의 상기 실시양태에 있어서, 지질 분산액이 적어도 2개의 적층된 0.1 μm 폴리카르보네이트 막을 통해 압출되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00057
임의의 상기 실시양태에 있어서, 리포솜이 동적 광 산란에 의해 결정 시 110 nm의 평균 크기를 가지며, 여기서 크기는 누율 방법에 의해 결정되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00058
임의의 상기 실시양태에 있어서, 4.3 mg/ml의 이리노테칸 유리 염기 무수와 등가의 총 이리노테칸 모이어티 함량을 갖는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00059
임의의 상기 실시양태에 있어서,
단계 (a)에서 리포솜이 0.43-0.47 M의 술페이트 농도를 갖는 DEA8SOS로부터 형성되고;
단계 (d)에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액이 DSPC의 몰당 500 g (±10%)의 이리노테칸 유리 염기 무수와 등가의 이리노테칸 모이어티 함량을 가지고;
단계 (f)에서 조성물의 pH가 7.2 내지 7.3이 되도록 조정되는 것인
리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00060
상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 4℃에서의 저장 전에 1 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하며, 약 4℃에서의 180일의 저장 후에 (총 리포솜 인지질에 대해) 20 mol% 이하의 리소-PC를 함유하는 리포솜성 조성물.
Figure pct00061
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 4℃에서의 6, 9 또는 12개월의 저장 후에 (총 리포솜 인지질에 대해) 20 mol% 이하의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하는 리포솜성 조성물.
Figure pct00062
임의의 상기 실시양태에 있어서, 총 6.1 내지 7.5 mg DSPC/ml, 2 내지 2.4 mg 콜레스테롤 /ml 및 0.11 내지 0.13 mg MPEG-2000-DSPE/ml를 모두 수성 등장성 완충제 중에 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00063
임의의 상기 실시양태에 있어서, 리포솜성 이리노테칸이 2 내지 20 mM의 농도에서 등장성 HEPES 수성 완충제 중에 이리노테칸 리포솜을 포함하는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00064
임의의 상기 실시양태에 있어서, 130-160 mM의 농도에서 염화나트륨을 추가로 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00065
임의의 상기 실시양태에 있어서, 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸이 수크로스 옥타술페이트 염으로서 겔화 또는 침전된 상태인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00066
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜이 준탄성 광 산란에 의해 측정 시, 95-115 nm의 직경을 갖는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00067
임의의 상기 실시양태에 있어서, 총 6.81 mg DSPC/ml, 2.22 mg 콜레스테롤 /ml 및 0.12 mg MPEG-2000-DSPE/ml, 4.05 mg/mL HEPES 수성 완충제 및 8.42 mg 염화나트륨/mL를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00068
임의의 상기 실시양태에 있어서, 7.25의 pH를 가지며, 여기서 이리노테칸 리포솜은 준탄성 광 산란에 의해 측정 시 110 nm의 직경을 갖는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00069
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 4℃에서의 6개월의 저장 후에 1 mg/mL 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00070
임의의 상기 실시양태에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 리포솜성 이리노테칸 조성물:
(a) 약 0.45 M의 술페이트 농도 및 약 6.5의 pH를 갖는 DEA8SOS의 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 3:2:0.015 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 것인 단계;
(b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
(c) 리포솜의 바깥쪽에 있는 DEA8SOS로부터 유래된 이온을 제거하는 단계;
(d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물을 사용하여 제조된 용액과 접촉시켜, 총 리포솜 인지질의 mol당 약 500 g (±10%)의 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
(e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 제거하는 단계; 및
(f) 조성물의 pH를 약 7.3이 되도록 조정하는 단계.
Figure pct00071
임의의 상기 실시양태에 있어서, 총 100 ppm 미만의 DEA를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00072
임의의 상기 실시양태에 있어서, 총 100 ppm 미만의 DEA를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00073
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 4℃에서의 6개월의 저장 후에 이리노테칸의 적어도 98%가 이리노테칸 리포솜에 캡슐화되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
Figure pct00074
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진, 직경이 대략 110 nm인 단층의 지질 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 (SOS)를 캡슐화하는 안정화된 이리노테칸 리포솜을 포함하며, 여기서 안정화된 이리노테칸 리포솜은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 이리노테칸 리포솜 제제:
(a) 이리노테칸을 0.4-0.5 M의 농도에서 (술페이트 기 농도 기준) TEA8SOS로서 이리노테칸 없이 디에틸암모늄 (DEA) 양이온 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제를 캡슐화하는 포획제 리포솜과, 포획제 리포솜 내에 총 리포솜 인지질의 mol당 500 g (±10%)의 이리노테칸 모이어티를 로딩하고, 포획제 리포솜으로부터 DEA 양이온의 방출을 가능하게 하는데 효과적인 조건 하에 접촉시켜 이리노테칸 SOS 리포솜을 형성하는 단계, 및
(b) 7.25-7.50의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하도록 이리노테칸 SOS 리포솜을 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)과 조합하여, 4℃에서의 3개월의 저장 동안 (이리노테칸 리포솜 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하도록 안정화된 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하는 단계.
Figure pct00075
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜 제제 내의 이리노테칸 SOS 리포솜이 총 100 ppm 미만의 TEA를 함유하는 것인 이리노테칸 리포솜 제제.
Figure pct00076
임의의 상기 실시양태에 있어서, 단층의 지질 이중층 소포가 6.81 mg/mL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 2.22 mg/mL의 콜레스테롤 및 0.12 mg/mL의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어지는 것인 이리노테칸 리포솜 제제.
Figure pct00077
임의의 상기 실시양태에 있어서, 총 안정화된 이리노테칸 리포솜 인지질의 mol당 총 500 mg의 이리노테칸을 포함하고, 이리노테칸 리포솜 제제 내의 이리노테칸의 적어도 98%가 이리노테칸 리포솜 내에 캡슐화되는 것인 이리노테칸 리포솜 제제.
Figure pct00078
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 7.25-7.50의 pH에서 약 4.05 mg/mL의 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)을 추가로 포함하는 이리노테칸 리포솜 제제.
Figure pct00079
임의의 상기 실시양태에 있어서, 약 8.42 mg/mL의 염화나트륨을 추가로 포함하는 이리노테칸 리포솜 제제.
Figure pct00080
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜 제제의 mL당 총 약 4.3 mg의 이리노테칸을 갖는 이리노테칸 리포솜 제제.
Figure pct00081
임의의 상기 실시양태에 있어서, 이리노테칸 리포솜이 이리노테칸을 인지질 리포솜 내에 캡슐화된 암모늄과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 조성물.
Figure pct00082
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진, 직경이 대략 110 nm인 단층의 지질 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 (SOS)를 캡슐화하는 안정화된 이리노테칸 리포솜을 포함하며, 여기서 안정화된 이리노테칸 리포솜은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 이리노테칸 리포솜 제제:
(a) 이리노테칸을 암모늄 양이온 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제를 캡슐화하는 포획제 리포솜과, 포획제 리포솜 내에 총 리포솜 인지질의 mol당 500 g (±10%)의 이리노테칸 모이어티를 로딩하고, 포획제 리포솜으로부터 암모늄 양이온의 방출을 가능하게 하는데 효과적인 조건 하에 접촉시켜 이리노테칸 SOS 리포솜을 형성하는 단계, 및
(b) 7.25-7.50의 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하도록 이리노테칸 SOS 리포솜을 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES)과 조합하여, 4℃에서의 3개월의 저장 동안 (이리노테칸 리포솜 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하도록 안정화된 이리노테칸 리포솜 제제를 수득하는 단계.
Figure pct00083
4℃에서의 3개월의 저장 동안 (리포솜 내의 포스파티딜콜린의 총량에 대해) 10 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하도록 안정화된, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)을 포함하는 리포솜에 이리노테칸 및/또는 SN-38을 포함하는 안정화된 리포솜을 포함하는 SN38 리포솜 제제.
Figure pct00084
임의의 상기 실시양태에 있어서, 안정화된 이리노테칸 리포솜이 30-100 ppm의 TEA 또는 DEA, 화학식 (I)의 화합물로의 이리노테칸 및 SOS를 캡슐화하며, 여기서 x는 8인 이리노테칸 리포솜 제제.
Figure pct00085
한 실시양태에서, 본원에 개시된 이리노테칸 리포솜 조성물은 적어도 990 (예를 들어, 990-1100, 또는 약 1111)의 리소-PC 안정성 비를 갖는 인지질 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트를 포함하는 안정화된 이리노테칸 리포솜 조성물이며, 여기서 리포솜 조성물은 하기 특색 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) 리포솜의 크기는 약 110 nm (±10%)이고,
(ii) 조성물은 약 433 g 또는 적어도 약 433 g 이리노테칸 모이어티/mol 인지질을 포함하고,
(iii) 조성물은 약 100 ppm 미만의 트리에틸아민을 함유하고,
(iv) 조성물은 이리노테칸 리포솜 바깥쪽에서 약 7.25의 pH를 갖는 제약상 허용되는 주사가능한 유체를 포함하고,
(v) 리포솜은 3:2 몰비의 DSPC 및 콜레스테롤을 포함하고,
(vi) 조성물은 적어도 0.9, 적어도 0.95, 적어도 0.98, 또는 본질적으로 1.0의 리포솜으로 캡슐화된 이리노테칸/수크로소페이트 그램-당량비를 가지고;
(vii) 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트의 적어도 90%, 예컨대 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% (다시 말해서, 본질적으로 모두)는 하나의 수크로소페이트 분자당 8개의 이리노테칸 분자를 포함하는 화학량론적 염의 침전 또는 겔화된 형태이다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 이리노테칸 리포솜 조성물은 적어도 990 (예를 들어, 990-1100, 또는 약 1111)의 리소-PC 안정성 비를 갖는 인지질 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트를 포함하는 안정화된 이리노테칸 리포솜 조성물이며, 여기서:
(i) 리포솜의 크기는 약 110 nm (±10%)이고,
(ii) 조성물은 약 433 g 또는 적어도 약 433 g 이리노테칸 모이어티/mol 인지질을 포함하고,
(iii) 조성물은 약 100 ppm 미만의 트리에틸아민을 함유하고,
(iv) 조성물은 이리노테칸 리포솜 바깥쪽에서 약 7.25의 pH를 갖는 제약상 허용되는 주사가능한 유체를 포함하고,
(v) 리포솜은 3:2 몰비의 DSPC 및 콜레스테롤을 포함하고,
(vi) 조성물은 적어도 0.9, 적어도 0.95, 적어도 0.98, 또는 본질적으로 1.0의 리포솜으로 캡슐화된 이리노테칸/수크로소페이트 그램-당량비를 가지고;
(vii) 캡슐화된 이리노테칸 수크로소페이트의 적어도 90%, 예컨대 적어도 92%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% (다시 말해서, 본질적으로 모두)는 하나의 수크로소페이트 분자당 8개의 이리노테칸 분자를 포함하는 화학량론적 염의 침전 또는 겔화된 형태이다.
실시양태 1: 7.00-7.50의 pH를 가지고, 이리노테칸 유리 무수 염기의 그램으로, 총 리포솜 인지질의 mmol당 500 mg (±10%)의 이리노테칸 모이어티 및 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 4.3 mg의 이리노테칸 모이어티와 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도에서, 콜레스테롤 및 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화하는 이리노테칸 리포솜의 분산액을 포함하며, 4℃에서의 처음 6개월의 저장 동안 20 mol% 미만의 리소-PC를 형성하도록 안정화된, 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 2: 7.00-7.50의 pH를 가지고, 이리노테칸 유리 무수 염기의 그램으로, 총 리포솜 인지질의 mmol당 500 mg (±10%)의 이리노테칸 모이어티 및 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 4.3 mg의 이리노테칸 모이어티와 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도에서, 콜레스테롤 및 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 단층의 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화하는 이리노테칸 리포솜의 분산액을 포함하며, 0.85-1.2의 이리노테칸/술페이트 화합물 그램-당량비를 갖는 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 3: 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 4℃에서의 처음 6개월의 저장 동안 20 mol% 미만의 리소-PC를 형성하도록 안정화된, 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물:
(a) 0.4 내지 0.5 M의 술페이트 농도 및 5 내지 7의 pH를 갖는 TEA8SOS 및/또는 DEA8SOS로부터 제조된 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 약 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE인 단계;
(b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
(c) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및/또는 DEA8SOS로부터 유래된 이온을 실질적으로 제거하는 단계;
(d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액과 접촉시키며, 이에 의해 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
(e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및/또는 DEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 실질적으로 제거하는 단계; 및
(f) 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5가 되도록 조정하는 단계.
실시양태 4: 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 리포솜성 이리노테칸 조성물:
(a) 0.4 내지 0.5 M의 술페이트 농도 및 5 내지 7의 pH를 갖는 TEA8SOS로부터 제조된 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 약 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE인 단계;
(b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
(c) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS로부터 유래된 이온을 실질적으로 제거하는 단계;
(d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액과 접촉시키며, 이에 의해 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
(e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 실질적으로 제거하는 단계; 및
(f) 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5가 되도록 조정하는 단계.
실시양태 5: 실시양태 4에 있어서, 지질 분산액이 적어도 2개의 적층된 0.1 μm 폴리카르보네이트 막을 통해 압출되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 6: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 리포솜이 동적 광 산란에 의해 결정 시 110 nm의 평균 크기를 가지며, 여기서 크기는 누율 방법에 의해 결정되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 7: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 4.3 mg/ml의 이리노테칸 유리 염기 무수와 등가의 총 이리노테칸 모이어티 함량을 갖는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 8: 실시양태 3-6 중 어느 하나에 있어서,
단계 (a)에서 리포솜이 0.43-0.47 M의 술페이트 농도를 갖는 TEA8SOS로부터 형성되고;
단계 (d)에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액이 DSPC의 몰당 500 g (±10%)의 이리노테칸 유리 염기 무수와 등가의 이리노테칸 모이어티 함량을 가지고;
단계 (f)에서 조성물의 pH가 7.2 내지 7.3이 되도록 조정되는 것인
리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 9: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 4℃에서의 저장 전에 1 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하며, 약 4℃에서의 180일의 저장 후에 (총 리포솜 인지질에 대해) 20 mol% 이하의 리소-PC를 함유하는 리포솜성 조성물.
실시양태 10: 실시양태 9에 있어서, 약 4℃에서의 6, 9 또는 12개월의 저장 후에 (총 리포솜 인지질에 대해) 20 mol% 이하의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하는 리포솜성 조성물.
실시양태 11: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 총 6.1 내지 7.5 mg DSPC/ml, 2 내지 2.4 mg 콜레스테롤 /ml 및 0.11 내지 0.13 mg MPEG-2000-DSPE/ml를 모두 수성 등장성 완충제 중에 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 12: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 리포솜성 이리노테칸이 2 내지 20 mM의 농도에서 등장성 HEPES 수성 완충제 중에 이리노테칸 리포솜을 포함하는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 13: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 130-160 mM의 농도에서 염화나트륨을 추가로 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 14: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸이 수크로스 옥타술페이트 염으로서 겔화 또는 침전된 상태인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 15: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 이리노테칸 리포솜이 준탄성 광 산란에 의해 측정 시, 95-115 nm의 직경을 갖는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 16: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 총 6.81 mg DSPC/ml, 2.22 mg 콜레스테롤 /ml 및 0.12 mg MPEG-2000-DSPE/ml, 4.05 mg/mL HEPES 수성 완충제 및 8.42 mg 염화나트륨/mL를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 17: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 7.25의 pH를 가지며, 여기서 이리노테칸 리포솜은 준탄성 광 산란에 의해 측정 시 110 nm의 직경을 갖는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 18: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 4℃에서의 6개월의 저장 후에 1 mg/mL 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 19: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 리포솜성 이리노테칸 조성물:
(a) 약 0.45 M의 술페이트 농도 및 약 6.5의 pH를 갖는 TEA8SOS의 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 3:2:0.015 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 것인 단계;
(b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
(c) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS로부터 유래된 이온을 제거하는 단계;
(d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물을 사용하여 제조된 용액과 접촉시켜, 총 리포솜 인지질의 mol당 약 500 g (±10%)의 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
(e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 제거하는 단계; 및
(f) 조성물의 pH를 약 7.3이 되도록 조정하는 단계.
실시양태 20: 임의의 상기 실시양태에 있어서, 총 100 ppm 미만의 TEA를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 21: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 총 30-100 ppm의 TEA 또는 DEA를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 22: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 4℃에서의 6개월의 저장 후에 이리노테칸의 적어도 98%가 이리노테칸 리포솜에 캡슐화되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
실시양태 23: 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 이리노테칸 리포솜 내에 화학식 (I)의 이리노테칸 조성물을 포함하며, 여기서 x는 8인 리포솜성 이리노테칸 조성물:
Figure pct00086
실시예
여러 이리노테칸 리포솜 제제의 합성 및 특징화가 하기 실시예에 기재되어 있다. 실시예에서 달리 나타내지 않는 한, 이들 이리노테칸 리포솜은 하기 다단계 방법에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 이 서브섹션 및 실시예에 기재된 제조 방법에 따른 이리노테칸 리포솜을 제조하는 방법, 및 그의 변경 및 조합을 제공한다.
먼저, 리포솜-형성 지질을 가열된 에탄올에 용해시켰다. 이들 지질은 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE를 포함하였다. 달리 나타내지 않는 한, DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE는 3:2:0.015의 몰비로 존재하였다. 생성된 에탄올-지질 조성물을 치환된 암모늄 및 다가음이온을 함유하는 수성 매질에, 치환된 암모늄 이온 및 다가음이온 포획제 (SOS)를 함유하며 적절하게 사이징된 (예를 들어 80-120 nm 또는 95-115 nm 등), 본질적으로 단층의 리포솜을 형성하는데 효과적인 조건 하에 분산시켰다. 리포솜 분산액은, 예를 들어, 에탄올성 지질 용액을 치환된 암모늄 이온 및 다가음이온을 함유하는 수용액과 지질 전이 온도 초과의 온도, 예를 들어 60-70℃에서 혼합하고, 생성된 지질 현탁액 (다층의 리포솜)을 한정된 세공 크기, 예를 들어 50 nm, 80 nm, 100 nm 또는 200 nm를 갖는 1개 이상의 트랙-에칭된, 예를 들어 폴리카르보네이트, 막 필터를 통해 압력 하에 압출시킴으로써 형성될 수 있었다. 바람직하게는, 치환된 암모늄은 양성자화된 트리에틸아민 (TEA) 또는 디에틸아민 (DEA)이고, 다가음이온은, 바람직하게는 화학량론적 비 (예를 들어, TEA8SOS)로 조합된 수크로스 옥타술페이트 (SOS)였다. TEA8SOS의 농도는 리포솜 내에 로딩되는 이리노테칸의 양에 기초하여 선택될 수 있었다 (예를 들어, 리포솜 전체에 걸쳐 있는 농도 로딩 구배를 실질적으로 또는 완전히 소진시키고/거나 약 1:8 몰비의 SOS 및 이리노테칸을 함유하는 리포솜을 제공하도록). 예를 들어, 471g 또는 500 g 이리노테칸 모이어티/mol 인지질을 갖는 이리노테칸 SOS 리포솜을 제조하기 위해, 바람직하게 사용되는 TEA8SOS는 약 0.4-0.5 M 술페이트 기의 농도를 가졌다 (예를 들어 0.45 M 또는 0.475 M의 술페이트 기, 또는 0.45 M 또는 0.475 M SOS). 모든 또는 실질적으로 모든 비-포획된 TEA 또는 SOS를 이어서 제거하였다 (예를 들어, 겔-여과, 투석 또는 한외여과/투석여과에 의해).
생성된 포획제 리포솜 (예를 들어, 치환된 암모늄 화합물 예컨대 TEA8SOS 또는 DEA8SOS를 캡슐화함)을 이어서 이리노테칸 용액과, 이리노테칸을 포획제 리포솜 내에 로딩하는데 효과적인 조건 (즉, 리포솜에서 빠져나오는 TEA를 대신하여, 이리노테칸이 리포솜에 들어가도록 하는 조건) 하에 접촉시켰다. 이리노테칸 로딩 용액 (예를 들어 상응하는 양의 이리노테칸-HCl 3수화물을 사용하여 제조될 수 있는, 15 mg/ml의 무수 이리노테칸-HCl)은 바람직하게는 삼투제 (예를 들어, 5% 덱스트로스)를 함유하며, pH가 6.5였다 (달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 pH 값은 실온에서 결정되었음). 약물 로딩은 조성물의 온도를 리포솜 지질의 전이 온도를 초과하여 (예를 들어, 60-70℃로) 증가시켜, 치환된 암모늄 화합물 (예를 들어, TEA) 및 이리노테칸의 막횡단 교환을 촉진함으로써 용이해졌다. 일부 실시양태에서, 리포솜 내의 이리노테칸 수크로소페이트는 겔화 또는 침전된 상태였다.
리포솜 전체에 걸쳐 있는 치환된 암모늄 화합물 (예를 들어, TEA 또는 DEA)과의 교환에 의한 이리노테칸의 로딩은 바람직하게는 모든 또는 실질적으로 모든 치환된 암모늄 화합물 (예를 들어, TEA)이 리포솜으로부터 제거되며, 이에 의해 리포솜 전체에 걸쳐 있는 모든 또는 실질적으로 모든 농도 구배가 소진될 때까지 계속되었다. 바람직하게는, 이리노테칸 리포솜 로딩 과정은 이리노테칸 대 SOS의 그램-당량비가 적어도 0.9, 적어도 0.95, 0.98, 0.99 또는 1.0 (또는 약 0.9-1.0, 0.95-1.0, 0.98-1.0, 또는 0.99-1.0의 범위)이 될 때까지 계속되었다. 바람직하게는, 이리노테칸 리포솜 로딩 과정은 TEA의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 그 초과가 리포솜 내부로부터 제거될 때까지 계속되었다. 본 발명의 일부 실시양태에서, TEA8SOS를 사용하여 이러한 방식으로 제조된 이리노테칸 SOS 리포솜 조성물은 100 ppm 미만의 TEA를 함유하였다. 본 발명의 일부 실시양태에서, TEA8SOS를 사용하여 이러한 방식으로 제조된 이리노테칸 SOS 리포솜 조성물은 20-100 ppm, 20-80 ppm, 40-80 ppm, 또는 40-100 ppm의 TEA를 함유하였다.
리포솜-외부 이리노테칸 및 치환된 암모늄 화합물 (예를 들어, TEA 또는 DEA)을 제거하여 최종 이리노테칸 리포솜 생성물을 수득할 수 있었다. 이러한 제거는 다양한 방법에 의해 용이해질 수 있는데, 그의 비제한적 예는 겔 (크기 배제) 크로마토그래피, 투석, 이온 교환 및 한외여과/투석여과 방법을 포함한다. 리포솜 외부 매질을 주사가능한, 약리학상 허용되는 유체, 예를 들어 완충된 (7.1 내지 7.5의 pH, 바람직하게는 7.2 내지 7.3의 pH) 등장성 염수로 대체하였다. 최종적으로, 리포솜 조성물을, 예를 들어, 0.2-마이크로미터 여과에 의해 멸균하고, 단일 용량 바이알에 분배하여, 표시한 다음, 사용할 때까지, 예를 들어 2-8℃에서의 냉장 하에 저장하였다. 리포솜 외부 매질은 잔류하는 리포솜-외부 이리노테칸 및 암모늄/치환된 암모늄 이온 (예를 들어, TEA)을 제거함과 동시에 약리학상 허용되는 유체로 대체할 수 있었다.
포획제의 정량화
본 발명의 목적상, 리포솜성 포획제 및 치환된 암모늄 화합물 반대-이온 (예를 들어, TEA8SOS)은 리포솜을 제조하는데 사용된 농도를 기준으로 하여 정량화되며, 포획제의 술페이트 기 개수를 기준으로 하여 계산된다. 예를 들어, 본원에서 0.1 M TEA8SOS는, SOS의 각 분자가 8개의 술페이트 기를 갖기 때문에, 0.8 M/L 술페이트로 표현될 것이다. 상이한 포획제가 사용되는 경우에, 이러한 계산은 포획제의 분자당 음이온성 기 (예를 들어, 술페이트 기)의 개수에 따라 조정될 것이다.
이리노테칸 리포솜 제제 내의 리소-PC의 정량화
도 11b 및 12의 데이터를 얻기 위해 시험된 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 리포솜 제제 내의 리소-PC의 양은 실시예 9에 기재되어 있는 HPLC 방법 ("방법 A")에 의해 얻어졌다.
본원에서 샘플 1-23으로부터 리소-PC 측정치를 얻기 위해서는 상이한 정제 (TLC) 방법 (본원에서, "방법 B")이 사용되는데, 리소-인지질은 직전에 논의된 HPLC 방법 (방법 A)보다는, 하기 TLC 방법 및 후속 포스페이트 분석에 의해 결정되었다. 하기 단계에 따라 방법 B에 의해 리소-PC를 측정하였다. 대략 500 nmol의 인지질 (PL)을 함유하는 리포솜 샘플의 분취물 (예를 들어 0.05mL의 10 mM PL 리포솜 용액)을 물로 평형화된 PD-10 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하여 탈염하였다. 샘플을 물을 이용하여 칼럼으로부터 용리하고, 각각 대략 150 nmol의 PL을 함유하는 3개의 분량으로 나눈 다음, 원심 농축기 (서번트 고속 진공 농축기, 모델#SVC100X)를 사용하여 진공 하에 건조시켰다. 건조된 지질을 30 μl의 클로로포름/메탄올 (5/1, 부피/부피)에 용해시키고, 유리 시린지를 사용하여 정상 실리카 겔 TLC 플레이트 (아날테크(Analtech)의 유니플레이트, cat # 44921)의 비-흡착 영역에 적용하였다. TLC를 클로로포름/메탄올/30% 수산화암모늄/물 (60/40/2.5/3.75, v/v/v/v)로 이루어진 이동상으로 전개시키고, 지질을 아이오딘 증기를 사용하여 가시화하였다. PL의 결정은 후속 포스페이트 분석을 위해 TLC 상의 인지질 및 리소-인지질에 상응하는 스팟을 별개의 12 x 75 mm 보로실리케이트 튜브 내로 스크레이핑함으로써 수행하였다.
리포솜으로 공동-캡슐화된 이리노테칸 및 술페이트 화합물의 몰량의 정량화는 실시예에 제공되어 있다.
물질
실시예 1의 샘플 1-5 및 13, 및 실시예 2의 샘플 12 및 14-18을 제조하기 위한, USP GMP 등급 이리노테칸 히드로클로라이드 ((+)-7-에틸-10-히드록시캄프토테신 10-[1,4'-비피페리딘]-1'-카르복실레이트, 모노히드로클로라이드, 3수화물, CAS 등록 번호 100286-90-6)를 시노팜 (SinoPharm; 대만 타이페이)으로부터 구입하고; 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW-2000)-디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)을 아반티 폴라 리피즈 (Avanti Polar Lipids; 미국 알라바마주 엘라베스터)로부터 구입하고; 초순수 콜레스테롤 (Chol)을 칼바이오켐 (Calbiochem; 미국 캘리포니아주 라호야)으로부터 입수하고; 수크로스 옥타술페이트를 유티칼스 (Euticals; 이탈리아 로디)로부터 입수하였다.
실시예 1의 샘플 6-11을 제조하기 위한, 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물을 파르마엔진 (PharmaEngine; 대만)으로부터 입수하고; 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW-2000)-디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)을 아반티 폴라 리피즈 (미국 알라바마주 엘라베스터)로부터 구입하고; 초순수 콜레스테롤 (Chol)을 칼바이오켐 (미국 캘리포니아주 라호야)으로부터 입수하고; 수크로스 옥타술페이트를 유티칼스 (이탈리아 로디)로부터 입수하였다.
실시예 8의 샘플 19-23을 제조하기 위한, 비노렐빈 (VNB)을 비노렐빈 타르테이트 10 mg/mL 용액 (글락소-스미스클라인(Glaxo-SmithKline))으로서 약국에서 입수하고, 토포테칸 (TPT) 분말을 타이완 리포솜 캄파니 (Taiwan Liposome Company; 대만 타이페이)로부터 기증품으로서 입수하였다.
분석용 또는 보다 우수한 순도의 모든 다른 화학물질은 통상적인 공급업체로부터 입수하였다.
방법: 하기에 달리 나타내지 않는 범위에서, 샘플 1-5 및 13 (실시예 1), 및 샘플 6-11 및 19-23 (실시예 2), 및 샘플 12 및 14-18 (실시예 3)을 제조하는데 하기 방법을 사용하였다.
트리에틸암모늄 수크로스 옥타술페이트 제조
트리에틸암모늄 수크로스 옥타술페이트 (TEA8SOS) 및 디에틸암모늄 수크로스 옥타술페이트 (DEA8SOS)는 수크로스 옥타술페이트의 나트륨 염으로부터 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 제조되었다. 간략하게 설명하면, 15 g의 수크로스 옥타술페이트 (나트륨 염)를 2.64 M의 술페이트 농도를 제공하도록 물에 용해시켰다. 다우엑스 50W-8X-200 양이온 교환 수지를 사용하여 수크로스 옥타술페이트의 산성 형태를 제조하였다. 한정된 수지를 2 vol의 1 N NaOH로 2회, 이어서 ddH2O (2중 증류수)로 중성 pH까지 세척하고, 2 vol의 1 N HCl로 2회 세척하고, 최종적으로 ddH2O로 중성이 되도록 세척한 다음, 반복하였다. 칼럼을 수지의 450 mL 부피까지 붓고, 3 vol의 3 N HCl로 세척한 다음, 전도도가 1 μS/cm보다 낮아질 때까지 ddH2O로 헹구었다. 수크로스 옥타술페이트 (나트륨 염) 용액 (칼럼 용량의 대략 10%)을 칼럼 상에 로딩하고, ddH2O로 용리하였다. 칼럼 용리액을 전도도 검출기를 사용하여 모니터링하여, 칼럼으로부터의 수크로스 옥타술페이트의 용리를 검출하였다. 이어서, 산성 수크로스 옥타술페이트를 6-7의 pH까지 트리에틸아민 또는 디에틸아민으로 적정하고, 술페이트 함량을 문헌 [B. Sorbo et al., Methods in Enzymology, 143: 3-6, 1984]으로부터 변형된 방법을 사용하여 결정하였다 (술페이트 결정 참조). 최종적으로 용액을 0.65 M 술페이트에 상응하는 술페이트 농도까지 희석하였다. pH는 전형적으로 6-7의 범위였다. 잔류 나트륨을 나트륨 전극을 사용하여 결정하고, 1 mol% 초과의 잔류 나트륨을 갖는 임의의 용액은 추가로 사용하지 않았다.
술페이트 기 결정
수크로스 옥타술페이트 용액 내의 술페이트 함량은 탁도측정-기반 검정으로 결정되었다. 용액은 하기와 같이 이루어졌다: (1) 100 mL의 물 중의 15 g의 PEG 6000 및 1.02 g의 아세트산바륨; (2) 1 mL의 물 중의 142 mg의 황산나트륨; (3) 바륨 작업 용액: 0.1 mL의 황산나트륨 용액을 100 mL의 바륨 용액에 교반하면서 적가한다. 이 용액은 사용 전에 1시간 동안 평형화되어야 하며, 최대 1주까지 저장될 수 있다; (4) 0.4 M 시트르산삼나트륨 용액; (118 mg 시트르산삼나트륨/mL 물); 및 (5) 1 N 황산으로부터 물로 희석된 10 mM의 술페이트 표준물. 보로실리케이트 시험 튜브를 사용하여 표준물 및 용액을 100 μl의 최종 부피로 만들었다. 표준물은 0.2-1 μmol 술페이트 (20-100 μl의 10 mM 표준물)의 범위에 있도록 만들었다. 0.6 M 술페이트 용액의 샘플을 위해, 1/100의 희석 및 100 μl의 부피 (0.6 μmol)를 사용하였다. 각각의 100 μl의 샘플/표준물을 100 μl의 70% 과염소산으로 처리하고, 12분 동안 110-120℃에서 가열하였다. 냉각 후에, 0.8 mL의 0.4 M 시트르산삼나트륨 용액을 첨가한 다음, 볼텍싱하였다. 교반되는 바륨 작업 용액으로부터의 0.25 mL 부피를 각 튜브로 옮기고, 즉시 볼텍싱하였다. 모든 샘플/표준물을 1시간 동안 평형화되도록 한 다음, 볼텍싱하고, 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. OD600에 대한 SO4 농도의 선형 표준 곡선을 사용하여 미지의 SO4 농도를 결정하였다.
HPLC에 의한 수크로스 옥타술페이트 결정
샘플의 수크로스 옥타술페이트 농도 (mg/mL)는 기지의 농도의 표준물로부터 생성된 수크로스 옥타술페이트 피크의 면적을 기준으로 하여 계산될 수 있다. 이어서, 수크로스 옥타술페이트의 계산된 농도를 사용하여 샘플의 술페이트 농도 (mM)를 계산하였다.
분석될 샘플을 페노메넥스(Phenomenex), 본드클론 10 μ NH2, 300 x 3.90 mm, PN 00H-3128-C0 또는 워터스(Waters) μ본다팩 NH2 10 μm 125 Å, (3.9 mm x 300 mm), 부품 번호 WAT084040을 사용하는 HPLC에 의해, pH 3.0의 0.60 M 황산암모늄 이동상을 사용하여 40℃의 칼럼 온도에서 1.00 mL/분으로 용리하여 크로마토그래피하였다. 샘플을 굴절률 검출기에 의해 검출하는데, 이 또한 40℃에서, 예를 들어, 굴절률 검출기를 갖춘 애질런트(Agilent) HPLC를 사용하였다. USP 포타슘 수크로스 옥타술페이트 7수화물을 참조 표준물로서 사용하였다; CAS 76578-81-9, CAT No. 1551150.
SOS 검정 표준물 및 검정 대조군 샘플을 기준선 대 기준선 적분을 사용하여 적분하였다. 이어서, TEA-SOS 샘플을 기준선 대 기준선 적분을 사용하여 적분하였다. 이는 수동으로 기준선을 허공 용적 밸리 앞에서부터 시작하여 SOS 테일 종점까지, 그 다음에 TEA 피크의 시작점 및 두 피크 사이의 저점에서 선을 드롭핑하여 수행될 수 있다. 주: 허공 용적 밸리 앞에서부터 시작하여 SOS 테일 종점까지의 단일 기준선이 TEA 및 SOS 피크 사이의 저점과 교차하면, 기준선 대 기준선 어프로치로 근사화할 2개의 별개의 선이 사용될 수 있다. TEA-SOS 샘플은 SOS 피크의 체류 시간에 대해 대략 0.45의 상대 체류 시간의 TEA 피크를 제시할 것이다.
약물 분석
이리노테칸의 HPLC 분석은 디오넥스(Dionex) 시스템 상에서 슈펠코(Supelco) C18 가드 칼럼 다음에 C18 역상 실리카 칼럼 (슈펠코 C18 칼럼, 250 mm x 4 mm 내부 직경, 5μm의 입자 크기)을 사용하여 수행하였다. 50 μl의 샘플 주입 부피를 사용하였고, 칼럼은 pH 5.5의 0.21 M 수성 트리에틸암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴 (73:27, v:v)로 이루어진 이동상을 이용하여 1.0 mL/분의 유량으로 등용매 용리하였다. 이리노테칸 및 SN-38은 전형적으로 각각 5.1분 및 7.7분에 용리되었다. 이리노테칸은 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 375 nm에서의 흡광도에 의해 검출하였고, SN-38은 형광 (370 nm 여기 및 535 nm 방출)에 의해 검출하였다.
포스페이트 결정
하기 포스페이트 결정 방법을 사용하여 샘플 1-23을 분석하였다. 변형된 바틀렛 포스페이트 검정을 사용하여 인지질 (PL)을 측정할 수 있었다. 포스페이트의 10-40 nmol 범위의 표준물을 12 x 75 mm 보로실리케이트 튜브에 넣고, 정확히 샘플과 같이 처리하였다. 황산 (100 μl의 6 M H2SO4)을 가열 블록에 배치된 각 튜브에 첨가하고, 45분 동안 180℃로 가열하였다. 과산화수소 (20 μl의 30% 용액)를 각 튜브에 첨가한 다음, 30분 동안 150℃에서 가열하였다. 후속적으로, 암모늄 몰리브데이트 (0.95 mL의 2.2 g/l 용액) 및 아스코르브산 (50 μl의 10% 수용액)을 각 튜브에 첨가하였다. 볼텍싱 후에, 튜브를 15분 동안 비등수 중에서 전개시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 박층 크로마토그래피 (TLC)를 사용하는 리소지질 분석을 위해, 실리카를 5분 동안 1000 rpm에서 원심분리에 의해 펠릿화하였고, 823 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 상청액에서의 청색을 측정하였다. 실리카를 함유하지 않는 샘플은 원심분리 단계를 제거할 수 있었다.
약물 보유 및 안정성
리포솜성 이리노테칸 안정성 (약물 보유의 관점에서)은 PD-10 (세파덱스 G-25) 크기 배제 칼럼을 사용하여 리포솜-외부 이리노테칸으로부터 리포솜성 이리노테칸을 분리함으로써 결정되었다. 약물 누출은 리포솜-외부 이리노테칸의 분리 전후의 이리노테칸 (HPLC) 대 PL (인지질 결정에 기재되어 있음) 비의 비교에 의해 결정되었다. 이리노테칸의 분해는 HPLC 분석 후의 크로마토그램에서 추가의 피크의 관찰에 의해 결정되었다. 이리노테칸-대-인지질 비 및 약물 캡슐화 효율은 각각 하기 식 1 및 2를 사용하여 계산되었다.
Figure pct00087
Figure pct00088
여기서 (이리노테칸-대-인지질 비)AC는 G-25 크기 배제 칼럼 상에서의 정제 후의 약물 대 인지질 비이고, (이리노테칸-대-인지질 비)BC는 칼럼 상에서의 정제 전의 약물-대-인지질 비이다.
리포솜성 조성물 내의 캡슐화된 이리노테칸 및 유리 이리노테칸의 결정
실시예 3 및 4의 이리노테칸 수크로소페이트 리포솜성 조성물 내의 리포솜으로 캡슐화된 이리노테칸 및 유리 (비-캡슐화된) 이리노테칸은 카트리지 흡착 방법을 사용하여 결정되었다. 오아시스 60 mg 3 cc HLB 카트리지 (워터스)를 2 mL의 메탄올, 1 mL의 HEPES-완충된 염수 (HBS; 5 mM HEPES, 140 mM NaCl, pH 6.5) 및 0.5 mL의 생리 염수 중의 10% 인간 혈청 알부민, 이어서 1 mL의 HBS의 순차적 통과에 의해 컨디셔닝하였다. 리포솜성 이리노테칸 수크로소페이트 조성물을 약 2.2 mg/mL의 이리노테칸까지 생리 염수를 이용하여 희석하고, 0.5 mL의 분취물을 카트리지 상에 적용하였다. 용리액을 수집하고, 카트리지를 2회 분량의 HBS (1.5 mL, 3 mL)로 헹구고, 헹군 액을 용리액과 조합하여 리포솜 분획을 제조하였다. 카트리지를 추가적으로 1.5 mL의 HBS로 헹구고, 2회의 3-mL 분량의 메탄올-HCl (90 부피%의 메탄올, 10 부피%의 18 mM HCl)로 용리하였다. 용리액을 조합하여 유리 약물 분획을 제조하였다. 리포솜성 약물 분획을 25-mL 부피 플라스크로 옮기고, 유리 약물 분획을 10-mL 부피 플라스크로 옮겨, 메탄올-HCl로 표시까지 오도록 하고, 잘 혼합하고, 리포솜 분획 플라스크를 60℃에서 10분 동안 가열하여 약물을 가용화시켰다. 냉각되면, 용액을 여과하고, 이들 분획 둘 다에서의 이리노테칸을 페노메넥스 루나 C18(2) 칼럼 상에서의 역상 HPLC를 사용하여, 20 mM 인산칼륨 pH 3.0 메탄올 혼합물 (부피 기준으로 60:40)로 등용매 용리하고, 254 nm에서 UV 검출하여 정량화하였다. 약물 피크를 적분하고, 샘플 내의 이리노테칸의 양을 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물 USP 참조 표준물을 사용하여 동일한 조건 하에 얻어진 선형 표준 곡선과의 비교에 의해 계산하였다. 약물 캡슐화 비는 샘플 내의 유리 약물 및 캡슐화된 약물 전체에 대한 캡슐화된 약물의 백분율로서 계산되었다.
pH 측정
pH는 항상 전위차 표준 유리 전극 방법을 사용하여 주위 온도 (즉, 20-25℃)에서 측정되었다. 따라서 리포솜 제형의 pH는 유리 전극을 리포솜 제형에 넣고 pH 판독치를 얻음으로써 측정하였다.
TEA/DEA ppm에 대한 샘플의 분석
샘플 분석은 모세관 GC 칼럼 상에서의 구배 온도 용리 (50 m x 0.32 mm x 5 μm 레스텍 Rtx-5 (5% 페닐-95% 디메틸폴리실록산))를 사용하는 헤드스페이스 기체 크로마토그래피 (GC) 분리 및 후속 화염 이온화 검출 (FID)에 의해 수행하였다. 샘플 제제 및 표준물 제제를 분석하고, 그에 따른 피크 면적 반응을 비교하였다. 잔류 아민 (예를 들어, TEA 또는 디에틸 아민 (DEA))의 양을 외부 표준물을 사용하여 정량화하였다. TEA의 경우에, 표준물은 ≥ 99%이었다. 다른 시약은 트리에틸렌 글리콜 (TEG), 수산화나트륨 및 탈이온 (DI) 수를 포함하였다.
GC 조건은 하기와 같았다: 운반 기체: 헬륨; 칼럼 유량: 20 cm/초 (1.24 mL/분); 분할 비: 10:1 (모든 시스템 적합성 기준이 충족되는 한은 조정가능함); 주입 모드: 분할 10:1; 라이너: 2 mm 직선형 슬롯 (권장되나, 필수는 아님);
주입 포트 온도: 140℃, 검출기 온도: 260℃ (FID); 초기 칼럼 오븐 온도: 40℃; 칼럼 오븐 온도 프로그램:
Figure pct00089
54분 실행시간
헤드스페이스 파라미터: 플래턴 온도: 90℃; 샘플 루프 온도: 100℃; 이송 라인 온도: 100℃; 평형화 시간: 60분; 주입 시간: 1분; 바이알 압력: 10 psi; 가압 시간: 0.2분; 진탕: 작동 (중간 정도); 주입 부피: 헤드스페이스의 1.0 mL; GC 사이클 시간: 60분 (권장되나, 필수는 아님).
TEA가 검출되지 않으면, "검출되지 않음"으로 기록하고; TEA 결과가 < 30 ppm이면, < QL (30 ppm)으로 기록하며; TEA 결과가 ≥ 30 ppm이면, 정수로 기록하였다.
리포솜 크기의 결정
리포솜 입자 크기는 23-25℃의 수성 완충제 (예를 들어, 10 mM NaCl, pH 6.7) 중에서 말번(Malvern) 제타사이저 나노 ZS™ 또는 유사 기기를 사용하여 동적 광 산란 (DLS)에 의해 누율 방법을 통해 측정하였다. z-평균 입자 크기 및 다분산 지수 (PDI)를 기록하였다. 기기 성능은 100 nm 중합체의 나노스피어 NIST 추적가능 표준물 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 3000 시리즈 나노스피어 크기 표준물 P/N 3100A, 또는 유체역학적 직경을 포함하는 분석 증명서와 등가물)을 사용하여 검증하였다. 본원에 사용된, "DLS"는 동적 광 산란을 지칭하고, "BDP"는 벌크 약물 제품을 지칭한다.
실시예 1: 리포솜성 이리노테칸 제제 저장 안정성에 대한 SOS 포획제 농도 및 pH의 영향
본 연구의 목적은 특정 시간 기간 동안 약 4℃에서 저장될 때, 특히, 이리노테칸 및 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제를 캡슐화하는 리포솜의 물리적 및 화학적 안정성에서의 임의의 변화를 결정하는 것이었다. 본 연구를 위해, 리포솜성 SOS 포획제의 농도를 감소시켰고, 반면 인지질의 총 mol당 471 g의 이리노테칸 모이어티의 비는 유지하였다.
일련의 이리노테칸 SOS 리포솜 제제를 상이한 농도의 SOS 포획제를 사용하여 다단계 방법으로 제조하고, 최종 리포솜성 제제의 pH를 상이한 pH 값으로 조정하였다. 각각의 이리노테칸 SOS 리포솜 제제는 5 mg/mL의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도를 함유하였다. 샘플 1-5 및 13의 이리노테칸 SOS 리포솜 제제를 실시예 1의 다단계 방법에 의해 제조하였다.
DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 PEG-DSPE를 각각 3:2:0.015의 몰비에 상응하는 양 (예를 들어, 1264 mg/412.5 mg/22.44 mg)으로 칭량하였다. 지질을 클로로포름/메탄올 (4/1, v/v)에 용해시키고, 완전히 혼합하고, 4개의 분취물 (A-D)로 나누었다. 각 샘플을 60℃에서 회전 증발기를 사용하여 증발 건조시켰다. 잔류 클로로포름은 12시간 동안 실온에서 진공 (180 마이크로토르) 하에 두어 지질로부터 제거하였다. 건조된 지질을 60℃에서 에탄올에 용해시키고, 적절한 농도의 미리-가온된 TEA8SOS를 최종 알콜 함량이 10% (v/v)가 되도록 첨가하였다. 지질 농도는 대략 75 mM이었다. 지질 분산액을 리펙스 써모배럴 압출기 (노던 리피즈(Northern Lipids), 캐나다)를 사용하여 2개의 적층된 0.1 μm 폴리카르보네이트 막 (뉴클리포어(Nuclepore)™)을 통해 약 65℃에서 10회 압출시켜, 95-115 nm의 전형적인 평균 직경 (준탄성 광 산란에 의해 결정됨; 서브섹션 "리포솜 크기의 결정" 참조)을 갖는 리포솜을 생성하였다. 압출된 리포솜의 pH는 필요에 따라 압출 동안의 pH 변화를 보정하도록 조정하였다. 리포솜을 이온-교환 크로마토그래피 및 크기-배제 크로마토그래피의 조합에 의해 정제하였다. 먼저, 다우엑스(Dowex)™ IRA 910 수지를 1 N NaOH로 처리한 다음, 탈이온수로 3회 세척하고, 이어서 3 N HCl로 3회 세척한 다음, 물로 다수회 세척하였다. 리포솜을 준비된 수지를 통해 통과시키고, 용리된 분획의 전도도를 유동-셀 전도도계 (파마시아(Pharmacia), 스웨덴 웁살라)를 사용하여 측정하였다. 분획은 전도도가 15 μS/cm 미만인 경우에 추가의 정제를 위해 허용되는 것으로 간주되었다. 이어서, 리포솜 용리액을 탈이온수로 평형화된 세파덱스 G-75 (파마시아) 칼럼에 적용하고, 수집된 리포솜 분획을 전도도에 대해 측정하였다 (전형적으로 1 μS/cm 미만). 교차-막 등장성은 40% 덱스트로스 용액을 5% (w/w)의 최종 농도까지 첨가함으로써 달성되었고, 완충제 (Hepes)를 원액 (0.5 M, pH 6.5)으로부터 10 mM의 최종 농도까지 첨가하였다.
각 배치의 분석 증명서로부터 입수된 물 함량 및 불순물 수준을 고려하여, 이리노테칸·HCl 3수화물 분말을 탈이온수에 15 mg/mL의 무수 이리노테칸-HCl까지 용해시킴으로써 이리노테칸의 원액을 제조하였다. 이리노테칸을 리포솜 인지질의 mol당 500g의 이리노테칸 HCl 무수 (471 g의 이리노테칸 유리 염기 무수에 상응함)의 양으로 첨가하고, 온수조에서 30분 동안 60 ± 0.1℃로 가열함으로써 약물 로딩을 개시하였다. 용액을 수조에서 꺼내어 빙냉수에 침지시킴으로써 급속 냉각시켰다. 리포솜-외부 약물은 Hepes 완충 염수 (10 mM Hepes, 145 mM NaCl, pH 6.5와)로 평형화되고 용리되는 세파덱스 G75 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 샘플을 HPLC에 의해 이리노테칸에 대해, 또한 바틀렛 방법 (서브섹션 "포스페이트 결정" 참조)에 의해 포스페이트에 대해 분석하였다. 저장을 위해, 샘플을 4 mL의 분취물로 나누고, 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 pH를 조정하고, 무균 조건 하에 멸균 여과하고, 멸균 투명 유리 바이알에 충전하고, 테플론® 라이닝 나사식 캡으로 아르곤 하에 밀봉하여, 4℃의 자동 온도 제어되는 냉장고에 넣었다. 한정된 시점에서, 분취물을 각 샘플로부터 꺼내어, 외관, 리포솜 크기, 약물/지질 비, 및 약물 및 지질의 화학적 안정성에 대해 시험하였다.
실시예 1과 관련하여, 리포솜 크기 분포를 희석된 샘플에서 쿨터(Coulter) 나노-사이저를 사용하여 동적 광 산란에 의해 90도 각도에서 결정하고, 누율 방법에 의해 얻어진 평균 ± 표준 편차 (nm)로서 제시하였다.
샘플 1-5 및 13의 이리노테칸 리포솜 제제를 추가로 하기와 같이 수득하였다. 새로 압출된 리포솜은, 각각 포획제로서 (A) 0.45 M 술페이트 기 (112.0±16 nm), (B) 0.475 M 술페이트 기 (105.0±16 nm), (C) 0.5 M 술페이트 기 (97±30 nm), 및 (D) 0.6 M 술페이트 기 (113±10nm)의 농도에서 TEA8SOS가 혼입된 2개의 그룹을 포함하였다. 샘플 1-5 및 13을 총 리포솜 인지질의 mol당 471 g의 이리노테칸 유리 염기 무수의 초기 비로 로딩하고, 상기 실시예 1의 설명에 기재된 바와 같이 정제하였다 (500 g의 이리노테칸 HCl 무수와 등가임). 샘플 1, 5 및 13은 압출된 샘플 (A)로부터 유래하고; 샘플 2는 압출된 샘플 (B)로부터 유래하며; 샘플 3 및 4는 각각 압출된 샘플 (C) 및 (D)로부터 유래하였다. 정제 후에, 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 pH 조정을 실시한 다음, 멸균하고 바이알에 충전하였다. 샘플 1-5의 데이터는 표 7 (실시예 1)에 제시되며, 샘플 13의 데이터는 표 8 (실시예 2)에 제시되어 있다.
샘플 6-11의 이리노테칸 리포솜 제제를 추가로 하기와 같이 수득하였다. 새로 압출된 리포솜은, 각각 포획제로서 (A) 0.45 M 술페이트 기 (116±10 nm) 및 (B) 0.6 M 술페이트 기 (115.0±9.0 nm)의 농도에서 TEA8SOS가 혼입된 2개의 그룹을 포함하였다. 샘플 6-8은 압출된 샘플 (A)로부터 유래하고, 샘플 9-11은 압출된 샘플 (B)로부터 유래하였다. 정제 후에, 필요에 따라 적절한 1 N HCl 또는 1 N NaOH의 첨가에 의해 pH 조정을 실시하였다. 샘플 12를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하여, 비교 목적으로 표 7에 포함시켰다.
특정 이리노테칸 리포솜 조성물의 이리노테칸 리포솜이 리포솜-외부 pH 값, 이리노테칸 유리 염기 농도 (mg/mL) 및 수크로스 옥타술페이트의 다양한 농도와 함께 하기 표 6 (4℃에서의 6개월의 저장) 및 표 7에 열거되어 있으며, 본원에 기재된 바와 같이 보다 상세히 제공된 대로 제조되었다.
도 4a-4c는 6.5 초과의 pH (즉, 각 도면에 나타낸 바와 같이 7.25 또는 7.5)를 갖는 표 7로부터 선택된 이리노테칸 리포솜 제제 내의 리소-PC의 mol%를 제시하는 플롯이다. 리소-PC는 각 샘플을 4℃에서 처음 1, 3, 6 및/또는 9개월 동안 저장한 후에, 본원에 개시된 방법 B (TLC)로 결정하였다. 이들 플롯은 각 샘플의 시간 경과에 따른 리소-PC (mol%)의 증가율에 대한 추정치로서, 각 샘플의 데이터에 대한 선형 회귀선을 포함한다. 놀랍게도, 이리노테칸 리포솜 제제의 pH를 6.5를 초과하여 (예를 들어, 7.25 및 7.5) 증가시키는 것은 유사한 안정성 비에서 형성된 이리노테칸 리포솜과 비교하여, 4℃에서의 냉장 저장 동안 측정된 리소-PC의 양을 감소시켰다. 이러한 추세는 리포솜성 이리노테칸의 다양한 농도에서 분명하였다. 예를 들어, 약 4.3 mg 이리노테칸 모이어티/mL의 강도에서 제조된 리포솜성 이리노테칸 조성물과 관련하여, 샘플 5 및 7에서 측정된 mol% 리소-PC 수준은 pH 6.5의 샘플 1에 대해 측정된 mol% 리소 PC 수준과 비교하여 모든 데이터 포인트 (제조 이후 4℃에서의 처음 1, 6 및 9개월의 저장 후)에서 유의하게 더 낮았다 (표 7의 데이터). 유사하게, 약 18.8 mg 이리노테칸 모이어티/mL의 강도에서 제조된 리포솜성 이리노테칸 조성물과 관련하여, 샘플 13에서 측정된 mol% 리소-PC 수준은 pH 6.5의 샘플 12 또는 샘플 14에 대해 측정된 mol% 리소 PC 수준과 비교하여 모든 데이터 포인트 (제조 이후 4℃에서의 처음 1 및 9개월의 저장 후)에서 유의하게 더 낮았다 (표 8의 데이터).
표 6: 6개월의 냉장 저장 후의 리소-PC 측정치
Figure pct00090
실시예 1의 비교 안정성 연구로부터의 추가의 결과가 하기 표 7에 제공되어 있다. 표 7에 나타낸 바와 같은, 리소-PC의 mol%는 1, 3, 6, 9 및/또는 12개월 동안 4℃에서 리포솜 제제를 저장한 후에 결정되었다. 각 샘플에 대해, 표 7은 술페이트 기의 몰 농도로서 표현된, 리포솜을 제조하는데 사용된 SOS의 농도를 제공한다 (하나의 SOS 분자는 8개의 술페이트 기를 포함함). 달리 나타내지 않는 한, 표 7의 모든 이리노테칸 리포솜은 각각 총 리포솜 인지질의 몰당 471 g의 이리노테칸 모이어티 (500 g의 무수 이리노테칸 HCl 염 내의 이리노테칸 모이어티의 양과 등가임)의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준) 대 총 인지질 비를 사용하여 제조하였다. 표 7은 또한 인지질의 mol당 471 g의 이리노테칸 모이어티 (유리 염기 무수 기준)를, 리포솜을 제조하는데 사용된 몰/L 단위의 술페이트 기 농도로 나눈 비로서 계산된, 각 샘플에 대한 안정성 비를 함유한다. 표 7에 기재된 샘플의 리포솜은 각각 약 89-112 nm의 크기 측정치 (부피 가중 평균) 및 적어도 87.6%의 이리노테칸 캡슐화 효율을 가졌다. 캡슐화 효율은 서브섹션 "약물 보유 및 안정성"에 따라 결정되었다.
표 7: 다양한 안정성 비 및 pH를 갖는 이리노테칸 리포솜 제제 (3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 PEG-DSPE로부터 형성된 리포솜 소포)c
Figure pct00091
Figure pct00092
c 본원에 기재된 바와 같은, 방법 B에 따라 측정됨.
이러한 저장 안정성 연구로부터의 결과는, 이리노테칸 유리 염기 무수 (g) 대 총 리포솜 인지질 (mol)의 비를 일정하게 유지하면서, 리포솜의 제조에 사용된 SOS 포획제의 농도 (술페이트의 몰 농도로서 측정됨)를 감소시키면, 4℃에서의 6 및 9개월의 냉장 저장 후에 이리노테칸 리포솜 제제에서 검출된 리소-PC의 양에 의해 측정되는 바와 같이, 이리노테칸 SOS 리포솜의 보다 큰 저장 안정성이 야기된다는 것을 입증하였다. 6.5의 pH (본원에 기재된 "pH 측정" 방법 참조)로 제조된 리포솜 제제에서, 리포솜 제조 동안 SOS 포획제의 농도를 감소시키면 4℃에서의 저장 후에 리포솜 제제에서 검출되는 리소-PC의 양의 감소가 유도된다.
이론에 얽매이지는 않지만, 제조 동안 리포솜-외부 포획제로부터 정제되면, 리포솜의 내부 공간은 산성화되는 것으로 생각된다. 이는 각 경우에 수소 이온이 리포솜-내부에 침착되면서, 리포솜-외부 TEA8SOS의 제거 이후 포획제 염의 아민 구성요소의 리포솜의 안쪽에서 바깥쪽으로의 재분포 때문일 수 있다. 양성자화가 가능한 첨가된 약물, 예컨대 이리노테칸은 또한 리포솜의 외부 및 내부 공간 사이에 분포된다. 리포솜의 내부에 분포된 약물의 양성자화 및 양성자화된 약물의 수크로소페이트에의 결합은 약물의 리포솜-내부 로딩을 유발하며, TEA 및 수소 이온 둘 다의 리포솜-내부 농도를 감소시켜, 리포솜-내부 산성화 정도를 감소시킨다. 이리노테칸 리포솜의 경우에, 0.6 M의 술페이트 농도에서 SOS를 이용하는 500 g 이리노테칸 히드로클로라이드 (즉, 471 mg 이리노테칸) /mol 리포솜 인지질의 약물 로딩에서는, 과량의 리포솜-내부 TEA가 불완전하게 소진되는 것으로 상정된다. 리포솜에 약물을 보유하기 위한 기반은 아니지만, 이는 샘플 7 및 13으로 제시된 바와 같이 리포솜의 약물 및 지질 구성요소의 분해에 기여할 수 있는, 산성 리포솜성 내부를 제공할 수 있다. 대조적으로, 샘플 8 및 5는 500 g 이리노테칸 히드로클로라이드 (즉, 471 mg 이리노테칸 모이어티) /mol의 동일한 약물 로딩을 갖지만, 각각 0.45 M 술페이트 및 0.475 M 술페이트의 보다 낮은 SOS 농도를 갖는다. 이들 특정한 경우에, 측정된 리소지질의 수준은 보다 낮다. 최종적으로, 가장 안정한 리포솜 제형은 보다 높은 약물/포획제 비를 보다 높은 외부 pH (즉, pH 7.25)와 조합한다는 것이 분명하다.
샘플 1-11의 이리노테칸 리포솜은 침전의 부재 및 상대적으로 좁고 재현가능한 입자 크기 분포에 의해 판단되는 바와 같이, 4℃에서 9개월까지 우수한 콜로이드성 안정성을 유지하였으며, 여기서 이리노테칸 모이어티 농도는 4.71 mg/mL의 이리노테칸 유리 염기 무수에 상응하였다. 이리노테칸은 연장된 저장 기간에 걸쳐 최소한의 누출 (<10%)로 효율적이고 안정적으로 포획되었다 (본원에 기재된 "약물 보유 및 안정성" 방법 참조).
샘플 1 및 2는 인지질의 몰당 약 471 g의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)의 동일한 초기 로딩을 갖지만, 각각 0.45 M 술페이트 기 및 0.475 M 술페이트 기의 보다 낮은 SOS 농도를 가졌다. 유사하게, 샘플 6, 7 및 8은 0.45 M 술페이트의 보다 낮은 SOS 농도를 갖지만, 471 g 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)/mol 인지질의 동일한 약물 로딩을 가지며, 상당히 더 낮은 리소-지질 함량 (9개월 후에 7-17%)을 야기하였다.
일부 샘플 (1, 2 및 3)의 경우에 인지질의 35 mol%까지 이르는, 리소-PC의 증가된 수준이 리포솜 제조 동안의 약물 로딩 또는 포획제 농도와 상관없이 pH 6.5의 샘플에서 측정되었다. pH를 7.25로 조정하면 리포솜이 리소-PC 형성에 덜 민감하게 되어, 수준이 총 PC의 9.72%에 이르렀다 (예를 들어, 샘플 1 및 13의 리소-PC 수준 비교). 9개월 후에 7-8 mol%의 리소-지질을 갖는 샘플 7 및 8에서 제시된 바와 같이, 보다 높은 약물 대 포획제 농도 비 및 보다 높은 pH를 갖는 샘플은 보다 적은 리소-지질을 형성하였다. 보다 높은 약물 포획제 비 및 보다 높은 pH의 조합 (예를 들어, 샘플 12와의 비교)은 리소-지질 형성을 감소시켰다. 가장 안정한 리포솜 제형은 보다 높은 약물/포획제 비 (즉, 이리노테칸 유리 염기의 양과 관련하여 한정된 942 초과의 안정성 비)와 6.5 초과의 보다 높은 외부 pH를 조합한다 (예를 들어, 샘플 1 및 13의 비교).
게다가, 이리노테칸 리포솜 제제 1-11에서 9개월에 걸쳐 측정된 % SN38은 약 0.05% 이하의 SN38이며 (즉, 이리노테칸 및 SN38과의 비교에 의한 SN38의 상대량), 반면 샘플 12 이리노테칸 리포솜 제제는 동일한 시간 기간에 걸쳐 측정된 0.20-0.50%의 SN38을 가졌다 (본원에 기재된 "약물 분석" 방법에 의해 결정됨). 각각의 샘플 1-5 및 13에서, 이리노테칸은 리포솜으로부터의 적은 누출 (13% 미만; 본원에 기재된 "약물 보유 및 안정성" 방법에 의해 결정됨) 및 활성 세포독성 SN-38로의 낮은 전환 (0.1% 미만, 및 보다 높은 pH (7.25)에서 저장된 샘플에서는 0.05% 미만)을 가지면서 안정적으로 포획되었다.
실시예 2: 액체 제제 내의 이리노테칸 리포솜의 농도 증가
본 저장 안정성 연구의 목적은 4℃에서 저장될 때, 리포솜성 이리노테칸 SOS의 물리적 및 화학적 안정성에서의 임의의 변화를 결정하는 것이었다. 본 연구 동안, (1) 이리노테칸 리포솜의 제조 동안 SOS 포획제의 초기 반대 이온 (TEA8SOS 또는 DEA8SOS를 사용함), (2) 이리노테칸 유리 염기 무수의 양 (그램) 대 인지질 (mol)의 비 (인지질의 몰당 약 471 g 또는 707 g의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)), (3) 액체 이리노테칸 제제 내의 이리노테칸 유리 염기 무수의 농도 (액체 이리노테칸 리포솜 제제 내의 4.7 mg/mL 또는 18.8 mg/mL의 캡슐화된 이리노테칸 (이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물로부터의 이리노테칸 모이어티의 등가 농도 기준)), (4) 이리노테칸 리포솜 제제가 조정되는 pH (pH 6.5 또는 7.25), 및 (5) 이리노테칸 리포솜 제제의 완충제 (HEPES 또는 히스티딘)를 달리하면서, 리포솜 제조를 위해 사용된 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제의 농도는 0.65 M의 술페이트 기 농도에서 유지하였다.
조사되는 제형 파라미터는 하기를 포함한다: 리포솜 크기, 이리노테칸 리포솜 내의 약물 대 인지질 비, 이리노테칸 약물 캡슐화 효율 및 전반적 외관, 이리노테칸 분해 산물의 존재, 및 리소-PC (mol%) 형성.
일련의 이리노테칸 SOS 리포솜 제제를 캡슐화된 이리노테칸 대비 상이한 농도의 SOS 포획제를 사용하여 다단계 방법으로 제조하고, 최종 리포솜성 제제의 pH를 상이한 pH 값으로 조정하였다. DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 PEG-DSPE를 각각 3:2:0.015의 몰비에 상응하는 양 (730.9 mg/238.5 mg/13.0 mg)으로 칭량하였다. 지질을 클로로포름/메탄올 (4/1, v/v)에 용해시키고, 완전히 혼합하고, 2개의 분취물로 나누었다. 각 샘플을 60℃에서 회전 증발기를 사용하여 증발 건조시켰다. 잔류 클로로포름은 12시간 동안 실온에서 진공 (180 마이크로토르) 하에 두어 지질로부터 제거하였다. 건조된 지질을 60℃에서 에탄올에 용해시키고, 미리-가온된 TEA8SOS 또는 DEA8SOS (0.65 M 술페이트 기의 농도에서)를 최종 알콜 함량이 10% (v/v)가 되도록 첨가하고, 샘플을 각각 A 및 B로 지정하였다. 지질 농도는 대략 75 mM이었다. 지질 분산액을 0.1 μm 폴리카르보네이트 막 (뉴클리포어™)을 통해 10회 압출시켜, 95-115 nm의 전형적인 평균 직경을 갖는 리포솜을 생성하였다. 압출된 리포솜의 pH를 필요에 따라 선택된 제제 pH로 조정하였다 (1 N NaOH 이용). 리포솜을 이온-교환 크로마토그래피 및 크기-배제 크로마토그래피의 조합에 의해 정제하였다. 먼저, 다우엑스™ IRA 910 수지를 1 N NaOH로 처리한 다음, 탈이온수로 3회 세척하고, 이어서 3 N HCl로 3회 세척한 다음, 물로 다수회 세척하였다. 용리된 분획의 전도도를 유동-셀 전도도계 (파마시아, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 측정하였다. 분획은 전도도가 15 μS/cm 미만인 경우에 추가의 정제를 위해 허용되는 것으로 간주되었다. 이어서, 리포솜 용리액을 탈이온수로 평형화된 세파덱스 G-75 (파마시아) 칼럼에 적용하고, 수집된 리포솜 분획을 전도도에 대해 측정하였다 (전형적으로 1 μS/cm 미만). 교차-막 등장성은 40% 덱스트로스 용액을 5% (w/w)의 최종 농도까지 첨가함으로써 달성되었고, 완충제 (Hepes)를 원액 (0.5 M, pH 6.5)으로부터 10 mM의 최종 농도까지 첨가하였다.
각 배치의 분석 증명서로부터 입수된 물 함량 및 불순물 수준을 고려하여, 326.8 mg의 이리노테칸·HCl 3수화물 분말을 20.0 mL의 탈이온수에 15 mg/mL의 무수 이리노테칸-HCl까지 용해시킴으로써 이리노테칸의 원액을 제조하였다. 500g/mol 또는 750g/mol 인지질의 이리노테칸 유리 염기 무수를 첨가하고, 온수조에서 30분 동안 60 ± 0.1℃로 가열함으로써 약물 로딩을 개시하였다. 용액을 수조에서 꺼내어 빙냉수에 침지시킴으로써 급속 냉각시켰다. 리포솜-외부 약물은 샘플 A의 경우에는 pH 6.5의 Hepes 완충 염수 (10 mM) (HBS)로, 또한 샘플 B의 경우에는 pH 7.25의 히스티딘 완충 염수로 평형화되고 용리되는 세파덱스 G75 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 샘플을 HPLC에 의해 이리노테칸에 대해, 또한 바틀렛 방법 (포스페이트 결정 참조)에 의해 포스페이트에 대해 분석하였다.
저장을 위해, 샘플을 4 mL의 분취물로 나누고, 필요에 따라 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 pH를 조정하고, 무균 조건 하에 멸균 여과하고, 멸균 투명 유리 바이알에 충전하고, 테플론® 라이닝 나사식 캡으로 아르곤 하에 밀봉하여, 4℃의 자동 온도 제어되는 냉장고에 넣었다. 한정된 시점에서, 분취물을 각 샘플로부터 꺼내어, 외관, 크기, 약물/지질 비, 및 약물 및 지질의 화학적 안정성에 대해 시험하였다.
리포솜 크기는 희석된 샘플에서 쿨터 나노-사이저를 사용하여 동적 광 산란에 의해 90도 각도에서 결정하고, 누율 방법에 의해 얻어진 평균 ± 표준 편차 (nm)로서 제시하였다.
비교 안정성 연구로부터의 결과가 표 8 (TEA8SOS 포획제 출발 물질을 사용하여 제조된 샘플) 및 표 9 (DEA8SOS 포획제 출발 물질을 사용하여 제조된 샘플)에 제공되어 있다.
표 8: Hepes 완충제 (10 mM) 중에 TEA8SOS 포획제를 이용하여 제조된 이리노테칸 리포솜d
Figure pct00093
d 본원에 기재된 바와 같은, 방법 B에 따라 측정됨.
샘플 13 (실시예 2, 표 8)을 샘플 1-5 (실시예 1)보다 4배 더 큰 농도 (20 mg 이리노테칸/mL)에서 저장하였고, 이는 관찰가능한 응집 또는 침전 없이, 여전히 우수한 콜로이드성 안정성을 유지하였다.
표 9: 0.65M의 술페이트 기 농도에서 DEA8SOS 포획제를 이용하여 제조된 이리노테칸 리포솜 (pH 7.25)e
Figure pct00094
e 본원에 기재된 바와 같은, 방법 B에 따라 측정됨.
새로 압출된 리포솜 크기에 (A) 0.65 M 술페이트의 TEA8SOS (113.0±23.8nm) 또는 (B) 0.65 M 술페이트 기의 DEA8SOS (103.2±21.1nm)를 캡슐화하였다 (0.45 M 술페이트 기를 갖는 샘플 13이 유일한 예외임). (A)로부터 샘플 12 및 14가 유래되고, 샘플 (B)로부터 샘플 15-18이 유래되었으며, 샘플 12, 14, 15 및 16에는 총 리포솜 인지질의 mol당 471 g의 이리노테칸 유리 염기 무수 (500 g의 이리노테칸 HCl 무수와 등가임)를 로딩하고, 샘플 16-18에는 인지질의 mol당 750 g의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)를 로딩하였다. 정제 후에, 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 적절하게 표 7 및 8에 기재된 바와 같이 pH 6.5 또는 7.25로 pH 조정을 실시하였다. 샘플 12는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 비교 목적으로 표 8에 포함시켰다.
데이터는, 침전의 부재 및 상대적으로 좁고 재현가능한 입자 크기 분포에 의해 판단되는 바와 같이, 리포솜이 4℃에서 1년까지 우수한 콜로이드성 안정성을 유지한다는 것을 제시하였다. 둘째로, 콜로이드성 안정성은 또한 높은 pH 및 상승된 약물 대 인지질 비에서 저장될 때 보다 진한 샘플의 경우에 우수하였다는 것이 분명하고, 이는 20 mg/mL 및 40 mg/mL의 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물과 등가의 이리노테칸 모이어티 농도에서, 리포솜이 안정하며 응집체의 형성에 저항한다는 것을 나타낸다.
모든 경우에, 이리노테칸은 적은 누출 및 활성 세포독성 SN-38로의 낮은 전환 (즉, 이리노테칸 및 SN38과의 비교에 의한 SN38의 상대량)으로 리포솜에 안정적으로 포획되었다; 모든 경우에 0.5 mol% 미만, 및 샘플 12를 제외하고는, 0.1 mol% 미만의 SN-38. 데이터는 본원에 기재된 "약물 보유 및 안정성" 방법 및 "약물 분석" 방법으로 얻었다.
샘플 12 및 14의 경우에 36-37 mol% (총 포스파티딜콜린에 대해)에 이르는, 리소-PC의 증가된 수준이 pH 6.5로 조정되고 인지질의 몰당 471 g의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 500 g의 이리노테칸 HCl 무수와 등가량을 사용함)의 비로 제조된 샘플에서 측정되었고, 반면 pH를 7.25로 조정하면 리포솜이 리소-지질 형성에 덜 민감하게 되어, 샘플 15의 경우에는 리소-PC 수준이 1년 후에 단지 11 mol% (총 포스파티딜콜린에 대해)에 근접하였다.
리포솜성 pH를 6.5에서 7.25로 변화시키는 것은 콜로이드성 안정성 또는 약물 누출에 대해 유해한 영향을 갖지 않았다.
실시예 3: 다양한 양의 TEA (SOS 포획제 반대-이온)를 갖는 안정화된 이리노테칸 리포솜의 저장 안정성
이리노테칸을 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 및 치환된 암모늄 반대 이온 (예를 들어, 양성자화된 TEA)을 캡슐화하는 리포솜 내에 로딩함으로써 이리노테칸 리포솜을 제조하였다. 약물 로딩된 이리노테칸 SOS 리포솜 내의 치환된 암모늄의 잔류 양이 변화된 영향을 다양한 양의 캡슐화된 잔류 치환된 암모늄 이온을 함유하는 다수의 이리노테칸 SOS 리포솜을 제조하고, 이들 이리노테칸 SOS 리포솜을 4℃에서의 냉장 하에 6개월 동안 저장한 다음, 이들 이리노테칸 SOS 리포솜 내의 리소-PC의 양 (mol%)을 측정함으로써 평가하였다.
데이터는, 이리노테칸 SOS 리포솜 내의 치환된 암모늄 이온의 양의 감소가 4℃에서의 6개월의 냉장 저장 후에 보다 낮은 수준의 리소-PC를 야기한다는 것을 입증하였다. 특히, 100 ppm 미만의 치환된 암모늄 (예를 들어, 20-100 ppm TEA)을 갖는 이리노테칸 SOS 리포솜은 4℃에서의 6개월의 냉장 저장 후에 보다 낮은 수준의 리소-PC 형성을 나타냈다.
본원에 기재된 프로토콜에 따라, 1046-1064의 안정성 비, 각각 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE의 지질 조성을 갖는 리포솜성 이리노테칸 수크로소페이트의 6개의 로트 (샘플 24-29)를 본 발명의 특정 실시양태에 따라 제조하였다.
표 10의 리소-PC의 양은 HPLC (본원의 방법 A)에 의해 결정하였다.
표 10: pH 7.3의 이리노테칸 리포솜 제제 (3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 PEG-DSPE로부터 형성된 소포에 캡슐화된 이리노테칸 SOS)
Figure pct00095
f 본원에 기재된 바와 같은, 방법 A에 따라 측정됨.
g 본원에 기재된 바와 같은, 방법 A에 따라 측정됨.
리포솜 (100-115 nm)을 TEA-SOS 용액 (0.4-0.5 M 술페이트)에 분산된 지질의 100-nm 폴리카르보네이트 막 (뉴클리포어)을 통한 압출에 의해 수득하고, 삼투 균형 덱스트로스 용액에 대한 접선 유동 투석여과 완충제 교환에 의해 리포솜-외부 TEA-SOS로부터 정제하고, 온도를 68℃로 상승시키고 30분 동안 교반함으로써 이리노테칸을 로딩하고, 급속 냉각시키고, 완충 생리 염화나트륨 용액에 대해 접선 유동 투석여과 완충제 교환에 의해 리포솜-외부 TEA 및 임의의 비-캡슐화된 약물로부터 정제하였다. 이리노테칸 수크로소페이트 리포솜 조성물을 0.2-μm 막 필터를 통해 통과시킴으로써 필터-멸균하고, 멸균 유리 바이알에 무균 분배하고, 냉장 조건 (5 ± 3℃) 하에 인큐베이션하였다. 대략 0, 3, 6, 9, 및 일부 경우에는 12개월의 냉장 저장 시간에서, 각 로트의 이중 바이알을 회수하여, 증기화 산란 검출기를 갖춘 HPLC 방법을 사용하여 누적된 리소-PC의 양에 대해 분석하였다. 리포솜 조성물은 또한 입자 크기, 이리노테칸 및 리포솜 인지질 농도, 리포솜 조성물의 pH, 이리노테칸/수크로소페이트 그램-당량비 (Iri/SOS 비) 및 잔류 트리에틸암모늄 (양성자화된 TEA) (트리에틸아민으로서)에 의해 특징화되었다. 평균 입자 크기 (D) 및 다분산 지수 (PDI)는 말번 제타사이저 나노ZS™를 사용하여 DLS 방법에 의해 결정하였다. 리포솜 조성물 내의 이리노테칸 농도는 HPLC에 의해 결정하였다. 총 인지질은 황산/과산화수소 혼합물에서의 리포솜의 소화 후에 청색 포스포몰리브데이트 방법에 의해 분광광도계로 결정하였다.
약물/지질 (DL) 비는 리포솜 제제 내의 g 단위의 약물 양 (유리 염기 무수로서)을 리포솜 인지질의 몰량으로 나누어 계산하였다. 리포솜으로 포획된 SOS는 생리 염수로 용리되는 세파덱스 G-25 겔-크로마토그래피 칼럼 (PD-10, 지이 헬스케어)을 통해 리포솜을 통과시킨 후에 정량화하였다. 이리노테칸/SOS 그램-당량비를 결정하기 위해, 용리된 리포솜 분획의 0.1-mL 분취물을, 삼중으로, 0.05 mL의 70% 과염소산과 혼합하고, 1시간 동안 95-100℃에서 가수분해하고, 0.8 mL의 1 M 아세트산나트륨으로 중화시키고, 여과하여 불용성 지질 생성물을 제거하고, 여과물 내의 수크로소페이트-유래 술페이트 기의 양을 본질적으로 방법 하에 기재된 바와 같은 바륨-PEG 시약을 사용하는 탁도측정법에 의해 정량화하였다. 동일한 리포솜 용리액의 삼중 분취물의 또 다른 세트를 70% 산성화 (0.1M HCl) 수성 이소프로판올로 용해시켰고, 365 nm에서의 분광광도측정법에 의해 이리노테칸에 대해 검정하였다. 이리노테칸/수크로소페이트 그램-당량비 (Iri/SOS 비)는 각각의 용리된 리포솜 분획에서 약물의 측정된 몰 농도를 술페이트 기의 측정된 몰 농도로 나누어 계산하였다. pH는 서브섹션 "pH 측정"에 기재된 바와 같이 측정하였다. TEA는 모세관 GC 칼럼 상에서의 구배 온도 용리를 사용하는 헤드스페이스 기체 크로마토그래피 (GC) 분리에 이어서, 화염 이온화 검출 (FID)에 의해 정량화하였다. 결과는 TEA의 ppm (백만분율)으로 표현된다. TEA의 수준을 표준물에 대한 외부 정량화에 의해 결정하였다.
5, 6, 7, 10, 11a, 11b 및 12의 데이터는, 0.4-0.5 M TEA8SOS 포획제 리포솜에 총 인지질의 mol당 약 400-600 mg (예를 들어, 약 500 g)의 이리노테칸 모이어티 (약 1000-1200 범위의 안정성 비)를 로딩함으로써 제조되고, 제조 후에 약 7.0-7.5 (예를 들어, 약 7.25)의 pH를 갖는 리포솜성 이리노테칸 샘플로부터 얻어졌다. 각각의 이들 리포솜성 이리노테칸 샘플 내의 리소-PC의 양을 실시예 9의 HPLC 방법을 사용하여 도 5-7에 나타낸 시점에서 측정하였다.
도 5 (샘플 24-26/로트 1-3) 또는 도 6 (샘플 27-29/로트 4-6)에 제시된 바와 같이, 리소-PC 누적 데이터 (mg 리소-PC/mL 리포솜 조성물)를 저장 시간에 대해 플롯팅하였다. 선형 상관 관계가 관찰되었으며, 여기서 리소-PC 누적은 약 0.008 mg/mL/개월에서 약 0.06 mg/mL/개월로 달라지고, 보다 높은 비율은 보다 많은 TEA 양을 갖는 조성물에 대한 특징이다. 저장의 제180일 (약 6개월)에 누적된 리소-PC의 양을 다중-포인트 데이터의 선형 근사법으로부터 결정하고 (도 5a 및 5b), 리소-PC의 분자량을 523.7 g/mol로 하여 PC의 mol%로 표현하였다. 모든 6개의 로트 (샘플 24-29; 표 10 참조)는 냉장 저장의 제180일에 20 mol% 미만의 리소-PC가 누적되었다. 20 ppm 미만의 TEA 및 0.98 초과의 Iri/SOS 그램 당량비를 갖는 로트는 최소 리소-PC 누적 (제180일에 약 0.015 mg/mL/개월 미만의 리소-PC - 3.0 mol% 미만)을 제시하였고; 80 ppm 미만의 TEA를 갖는 로트는 약 0.03 mg/mL/개월 이하의 비율로 리소-PC가 누적되었으며, 제180일에 7 mol% 미만의 리소-PC를 가졌고; 100 ppm의 잔류 TEA를 갖는 로트는 약 0.06 mg/mL/개월의 비율로 리소-PC가 누적되었으며, 제180일에 약 10 mol%의 리소-PC를 가졌다.
도 7은 안정화된 이리노테칸 수크로소페이트 리포솜 조성물 내의 TEA 함량 (ppm)에 대해 플롯팅된 5 ± 3℃에서 저장된 리소-PC 누적 비율 (mg/mL/개월)을, 데이터로부터 유도된 선형 회귀선과 함께 제시하는 그래프이다. 리포솜성 이리노테칸 수크로소페이트의 5개의 추가의 로트를 실시예 3과 유사하게 제조하였다. 제제를 mL당 약 4.3 mg/mL의 이리노테칸 유리 염기 무수의 이리노테칸 모이어티 (상기 설명된 바와 같이, 유리 염기 무수 기준)에서 저장하였고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 리소-PC 형성 및 TEA 함량에 대해 주기적으로 분석하였다. 리소-PC 누적 비율은 각 로트의 저장 시간 경과에 따른 리소-PC 데이터를 피팅함으로써 얻어진 선형 회귀선의 기울기로서 계산되었고, BDP/DP 페어링 로트의 평균 TEA 판독치로 TEA 함량에 대해 플롯팅되었다 (도 6). 그래프로부터 하기와 같이, 약 25 ppm 이하의 TEA를 갖는 제제는 0.02 mg/mL/개월 미만의 비율로 리소-PC가 누적되었고 (180일의 기간에 걸쳐 2.5 mol% 미만의 리소-PC 증가); 약 70 ppm 미만의 TEA를 갖는 제제는 0.033 mg/mL/개월 미만의 비율로 리소-PC가 누적되었고 (180일의 기간에 걸쳐 4.3 mol% 미만의 리소-PC 증가); 약 100 ppm 미만의 TEA를 갖는 모든 제제는 0.062 mg/mL/개월 미만의 비율로 리소-PC가 누적되었다 (180일의 기간에 걸쳐 8.0 mol% 미만의 리소-PC 증가).
샘플 24, 25 및 28은 각각 20 ppm 미만 (예를 들어, 약 10-20 ppm)의 치환된 암모늄 이온 (양성자화된 TEA)을 가지며, 4℃에서의 6개월의 냉장 저장 후에 관찰된 최소량의 리소-PC (2.2-3 mol% 리소-PC)를 가졌다. 샘플 26 및 27을 비교하면, 이리노테칸 SOS 리포솜 내의 잔류 치환된 아민 포획제 반대-이온 (예를 들어, 양성자화된 TEA)의 양의 약 39 ppm에서 79 ppm으로의 증가 (103% 증가)는 180일 후에 관찰된 리소-PC의 양의 예상외의 강하 (6.9 mol%에서 5.4 mol%로, 리소-PC의 22% 감소)를 동반하였다. 그러나, 이리노테칸 SOS 리포솜 내의 잔류 치환된 암모늄 이온 (예를 들어, 양성자화된 TEA)의 양의 79 ppm (샘플 27)에서 100 ppm (샘플 29)으로의 추가의 증가 (즉, 27% 증가)는 4℃에서의 6개월의 냉장 저장 후에 관찰된 리소-PC의 양의 추가의 87% 증가 (즉, 샘플 27의 5.4 mol%에서 샘플 29의 10.1 mol%로)를 동반하였다.
실시예 4: 이리노테칸의 수크로소페이트와의 상호작용
도 8은 실시예 4에 기재된 바와 같이 다양한 비율의 수크로소페이트 (SOS)에서 수용액 중에서 이리노테칸 히드로클로라이드 및 트리에틸암모늄 수크로소페이트를 조합함으로써 형성된 침전물에서의 이리노테칸 및 수크로소페이트의 그램-당량을 제시하는 그래프이다.
이리노테칸 히드로클로라이드의 용액이 트리에틸암모늄 수크로소페이트를 함유하는 리포솜과 조합될 때, 수소 이온은 스캐빈징될 수 있고 이리노테칸 수크로소페이트 염이 형성될 수 있다. 이리노테칸과 트리에틸암모늄 수크로소페이트 사이의 반응을 연구하기 위해, 본 발명자들은 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물 USP의 25 mM (16.93 mg/mL) 수용액 및 트리에틸암모늄 수크로소페이트 (TEA-SOS)의 250 meq/L (31.25 mM) 용액을 제조하였다 (본질적으로 "방법" 섹션에 기재된 바와 같음). 이리노테칸 히드로클로라이드 용액의 분취물을 물로 희석하고, 65℃로 가열하고, 이들 화합물 둘 다의 전체 그램-당량 농도가 함께 25 meq/L가 되도록 하여 9:1 내지 1:9의 일련의 이리노테칸-SOS 그램-당량비를 생성하도록 TEA-SOS 용액의 분취물과 조합하였다. 샘플을 볼텍싱에 의해 급속 혼합하고, 30분 동안 65℃에서 인큐베이션하고, 빙수로 냉각시키고, 4-6℃에서 밤새 평형화되도록 하였다. 모든 샘플에서, 침전이 관찰되었다. 다음 날에, 샘플을 5분 동안 10000xg에서, 또한 추가의 5분 동안 14000xg에서 원심분리하고, 투명한 상청액 유체 (풀린 다량의 백색 내지 연한 황갈색 침전물 위)를 단리하고, 침전물의 양 및 조성을 결정하기 위해 본질적으로 실시예에 기재된 바와 같이 비-침전된 이리노테칸 및 SOS의 양에 대해 분석하였다. 결과를 샘플의 SOS의 그램-당량 퍼센트에 대해 플롯팅하였다 (도 8). 20-80 당량% 범위의 SOS에서 이들 구성요소 둘 다에 대한 그래프는 50 당량%의 값에서 만나는 2개의 선형 브랜치로 이루어지며, 이는 이리노테칸 및 수크로소페이트가 수크로소페이트의 1개의 술페이트 에스테르 기당 하나의 이리노테칸 분자의 화학량론 (즉, 하나의 수크로소페이트 (SOS) 분자당 8개의 이리노테칸 (IRI) 분자)으로 불용성 염을 형성하였다는 것을 나타낸다:
8 IRI.HCl + TEA8SOS → (IRI.H)8SOS ↓ + TEACl
양성자화된 이리노테칸 분자 및 수크로소페이트 음이온의 분자 크기 및 형상의 명백한 차이에도 불구하고, 놀랍게도 이들의 염은 심지어 어느 한 구성요소의 큰 초과량 하에서도 화학량론 - 하나의 수크로소페이트 분자에 대해 8개의 양성자화된 이리노테칸 분자 -을 거의 유지하였다 (도 8). 따라서, 이리노테칸 수크로소페이트는 리포솜에서 난용성, 침전 또는 겔화된 형태로 존재할 수 있다. 침전 염이 그의 엄격한 화학량론을 유지한다는 사실은 수크로소페이트의 대부분의 모든 또는 본질적으로 모든 술페이트 기가 약물 분자에 결합되는 시점까지 과정이 진행되도록 한다. 실시예 6의 이리노테칸-수크로소페이트 그램-당량비 측정치와 일치하게, 본 발명의 안정한 리포솜을 수득하기 위한 이리노테칸 로딩 과정은, 일부 실시양태에서, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 98%, 및 일부 경우에는 본질적으로 모든 유리 리포솜성 수크로소페이트가 그의 이리노테칸 염의 침전 및/또는 겔화를 통해 리포솜성 수성 상으로부터 고갈될 때까지 화학량론적 약물 염의 리포솜성 침전을 포함할 수 있다.
실시예 5: 이리노테칸 수크로소페이트의 제조 및 용해도 결정.
이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물을 1.64 g의 양으로 0.008 mL의 1 N HCl로 산성화된 물 160 mL에 첨가하고, 65℃ 수조에서 약물이 용해될 때까지 교반하면서 가열하였다. 5 mL의 0.46 M (술페이트 농도 기준) 트리에틸암모늄 수크로소페이트를 강력 교반 하에 첨가하고, 5분 동안 더 교반하였다. 4-6℃에서의 밤새 저장 후에 황색빛 유성 침전물이 취성 물질로 고체화되었다. 이 물질을 유리 막대로 연화처리하여 솜털모양의 회백색 침전물을 제공하였고, 이를 25일 동안 냉장 하에 인큐베이션하였다. 침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 상청액은 폐기하였다. 펠릿을 5 부피의 탈이온수에 재현탁시키고, 원심분리에 의해 침전시키며; 이러한 세척 단계를 현탁액의 pH가 약 5.8이 될 때까지 2회 더 반복하였다. 최종적으로, 펠릿을 동등 부피의 탈이온수에 재현탁시켜 46.0 mg/mL의 이리노테칸 함량 (유리 염기) (이론치의 84% 수율)을 갖는, 약 26 mL의 생성물을 제공하였다. 생성물의 분취물을 1 N HCl로 가용화시키고, 이리노테칸에 대해 (70% 수성 이소프로판올-0.1 N HCl 중 365 nm에서의 분광광도측정법에 의해), 또한 술페이트에 대해서는 희석된 (1:4) 과염소산으로의 가수분해 후에 황산바륨 탁도측정 검정을 사용하여 분석하였다. 이리노테칸 대 SO4의 몰비는 1.020 ± 0.011인 것으로 밝혀졌다. 이리노테칸 수크로소페이트 현탁액의 분취물을 0.93, 1.85 및 3.71 mg/mL의 최종 약물 염 농도가 되도록 탈이온수에 첨가하였다. 샘플을 22시간 동안 4-6℃에서 교반 하에 인큐베이션하고, 고체 물질을 14000 g에서 10분 동안 원심분리함으로써 제거하고, 상청액 유체를 분광광도측정법에 의해 이리노테칸에 대해 분석하였다. 용액 내의 이리노테칸의 농도는 각각 58.9 ± 0.90 마이크로-g/mL, 63.2 ± 0.6 마이크로-g/mL 및 63.4 ± 1.3 마이크로-g/mL인 것으로 밝혀졌고, 이들은 평균적으로 1.32x10-5 M의 이리노테칸 수크로소페이트 몰 용해도에 상응한다.
실시예 6: 다양한 이리노테칸 리포솜
본 실시예를 위한 모든 실험은 초기 투석여과 단계를 위한 25mm 압출기, 중공 섬유 또는 접선 유동 여과 (TFF) 셋업, 마이크로 규모의 약물 로딩, 및 최종 투석여과 및 후속 EAV 여과를 위한 TFF 셋업을 사용하여 수행하였다. 약물 로딩된 물질의 제한된 부피 때문에, 희석 후의 최종 여과는 2개의 EBV 필터 대신에, 생물안전 캐비닛에서 20 cm2 EAV 필터를 사용하여 수행하였다.
표 11:
Figure pct00096
h 본원에 기재된 바와 같은, 방법 A에 따라 측정됨.
표 11을 참조하면, 상이한 양의 리소-PC를 갖는 일련의 상이한 이리노테칸 리포솜이 제조되었다. 달리 나타내지 않는 한, 이리노테칸 리포솜은 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG2000DSPE로 이루어진 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트가 캡슐화된 것이었다.
샘플 30 (로트 1)은 리포솜을 실시예 1에 기재된 바와 같이 (본 실시예에 나타낸 것은 제외) 제조한 다음, 리포솜 압출 후에 압출된 리포솜을 72℃에서 8시간 동안 유지하고, 8시간이 종료될 때 pH를 6.2-6.9로 조정하여, 약 45 mol%의 리소-PC (즉, 약 1.7 mg/mL)를 갖는 조성물을 생성함으로써 수득하였다. MLV 제조의 시간이 제0시간으로 간주되었다. 본 실험을 기준선 실험 1로부터의 분취물을 사용하여 수행하였다. 샘플 30 (로트 1)의 조성물을 보다 낮은 DSPC:콜레스테롤 mol 비 (다른 샘플에서의 3:1 대신에 약 2:1)를 갖는 리포솜으로 제조하였다. 생성된 이리노테칸 리포솜 조성물은 높은 수준의 리소-PC (즉, 1 mg/mL 초과 및 40 mol% 초과의 리소-PC)를 가졌다.
샘플 31a 및 31b (로트 2a 및 2b)는 생성된 이리노테칸 리포솜 조성물의 특징에 대한 이리노테칸 약물 로딩 전의 리포솜 내의 TEA-SOS 용액 농도를 증가시킨 것의 영향 및 이리노테칸 약물 로딩 비를 15% 감소시킨 것의 영향을 시험하기 위해 실시예 1의 방법을 변형시켜 사용하여 제조하였다. 샘플 31a (2a)의 물질은 다층의 소포 (MLV)를 형성하기 위해 0.5 M 술페이트 기 농도에서 TEA-SOS의 용액을 캡슐화하는 DSPC 및 콜레스테롤 (표 11에 제공된 비)을 포함하는 소포를 갖는 리포솜을 형성하고, 이들 리포솜을 이리노테칸 히드로클로라이드 용액과 510 g 이리노테칸 유리 염기 무수/PL의 mol의 양으로 접촉시켜 약물을 리포솜 내에 로딩함으로써 수득하였다. 샘플 31b (2b)의 물질은 샘플 31a (2a)의 리포솜 조성물을 40℃에서 1주 동안 유지하고, 이어서 샘플을 다시 분석함으로써 수득하였다. 샘플 31a 및 31 b (2a 및 2b)의 생성된 이리노테칸 리포솜 조성물은 둘 다 매우 낮은 수준의 리소-PC (즉, 샘플 31a (2a)의 약 0.06 mg/mL 미만 또는 4 mol% 및 샘플 31b (2b)의 약 0.175 mg/mL)를 함유하였다.
샘플 32a 및 32b (각각 로트 3a 및 3b)는 제형 완충제 pH 및 감소된 이리노테칸 약물 로딩 비의 조합된 영향을 연구하기 위해 선택된 변형으로, 실시예 1의 방법을 사용하여 제조하였다. 샘플 32a (3a)의 물질은 MLV를 형성하기 위해 TEA-SOS 용액을 캡슐화하는 DSPC 및 콜레스테롤 (표 10에 제공된 비)을 포함하는 소포를 갖는 리포솜을 형성하고, 이들 리포솜을 이리노테칸과 접촉시켜 약물을 리포솜 내에 로딩하여, 약 6.50의 pH (샘플 30 (1)의 약 7.25의 pH 대신에)를 제공하도록 선택된 완충제 중에서 표 11에 나타낸 이리노테칸 약물 로딩 비 (샘플 33 (4) 및 34 (5)보다 낮은 이리노테칸 약물 로딩 비)로 리포솜 내에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 형성함으로써 수득하였다. 샘플 32b (3b)의 물질은 샘플 3a의 조성물을 40℃에서 1주 동안 유지하고, 이어서 샘플을 다시 분석함으로써 수득하였다. 생성된 이리노테칸 리포솜 조성물 32a (3a) 및 32b (3b)는 둘 다 각각 0.076 mg/mL 및 0.573 mg/mL의 낮은 수준의 리소-PC를 함유하였다.
샘플 33 (4) 및 34 (5)는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 샘플 33 (4) 및 34 (5)의 물질은 MLV를 형성하기 위해 TEA-SOS 용액을 캡슐화하는 DSPC 및 콜레스테롤 (표 11에 제공된 비)을 포함하는 소포를 갖는 리포솜을 형성하고, 이들 리포솜을 이리토테칸과 접촉시켜 약물을 리포솜 내에 로딩하여, 약 7.25의 pH (샘플 3a 및 3b의 약 6.5의 pH 대신에)를 제공하도록 선택된 완충제 중에서 500 g 이리노테칸 모이어티 (유리 염기 무수 기준)/mol 인지질로 리포솜 내에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 형성함으로써 수득하였다. 생성된 이리노테칸 리포솜 조성물 3a 및 3b는 둘 다 각각 0.24 mg/mL 및 0.79 mg/mL의 낮은 수준의 리소-PC를 함유하였다.
도 12는 샘플 33 (4) (원형, 아래쪽 선) 및 샘플 34 (5) ("+" 데이터 포인트, 위쪽 선)에서 측정된 리소-PC의 양을 제시하는 그래프이다. 리소-PC 형성 비율은 샘플 33 (4)보다 샘플 34 (5)에서 더 높았다. 도 12의 데이터 포인트에 대한 선형 피팅은 하기와 같았다:
샘플 33 (4): 리소-PC, mg/mL = 0.0513596 + 0.0084714*누적된 시기
샘플 34 (5): 리소-PC, mg/mL = 0.1766736 + 0.0279783*누적된 시기
샘플 33 및 34의 이리노테칸 리포솜 제제의 제22개월의 총 리소-PC 농도는 각각 0.24 mg/mL 및 0.79 mg/mL였다.
실시예 7: 이리노테칸 리포솜 주사제 (오니바이드(ONIVYDE)®)
저장 안정성 이리노테칸 리포솜 제제의 하나의 바람직한 예는 오니바이드® (이리노테칸 리포솜 주사제) (메리맥 파마슈티컬즈, 인크.(Merrimack Pharmaceuticals, Inc.), 매사추세츠주 캠브리지)로서 시판되는 제품이다. 오니바이드® 제품은 정맥내 사용을 위해 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물을 리포솜성 분산액으로 제형화한 토포이소머라제 억제제이다. 오니바이드® 제품은 겜시타빈-기반 요법 이후의 질환 진행 후에 췌장의 전이성 선암종을 갖는 환자의 치료를 위해 플루오로우라실 및 류코보린과의 조합으로 권고된다.
오니바이드® 제품의 권장 용량은 2주마다 1회씩 90분에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여되는 70 mg/m2이다. 오니바이드® 제품은 특정 형태의 췌장암의 치료를 위해 류코보린 및 플루오로우라실과 조합되어 투여된다. UGT1A1*28 대립유전자에 대해 동형접합성인 것으로 공지된 이들 췌장암 환자의 오니바이드® 제품의 권장 출발 용량은 90분에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여되는 50 mg/m2이다. 후속 사이클에서 허용될 때는 오니바이드® 제품의 용량을 70 mg/m2로 증가시킨다. 정상 상한치 초과의 혈청 빌리루빈을 갖는 환자에게는 오니바이드® 제품의 권장 용량이 없다.
오니바이드® 제품은 환자에게 하기와 같이 투여된다. 먼저, 오니바이드® 제품의 계산된 부피를 바이알로부터 빼낸다. 이어서, 이러한 양의 오니바이드® 제품을 500 mL의 5% 덱스트로스 주사액, USP 또는 0.9% 염화나트륨 주사액, USP로 희석하고, 완만한 전도에 의해 혼합한다. 희석액은 광으로부터 보호되어야 한다. 이어서, 희석액을 실온에서 저장되었을 때는 제조의 4시간 이내에 또는 냉장 조건 [2℃ 내지 8℃ (36℉ 내지 46℉)] 하에 저장되었을 때는 제조의 24시간 이내에 투여한다. 희석 용액은 투여 전에 실온이 되도록 하며, 동결되지 않아야 한다. 이어서, 희석액을 인라인 필터의 사용 없이 90분에 걸쳐 주입하고, 미사용 분량은 폐기한다.
오니바이드® 제품은 토포이소머라제 억제제인 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물을 정맥내 사용을 위해 리포솜성 분산액으로 제형화한 것이다. 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물의 화학 명칭은 (S)-4,11-디에틸-3,4,12,14-테트라히드로-4-히드록시-3,14-디옥소1H-피라노[3',4':6,7]-인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-9-일-[1,4'비피페리딘]-1'-카르복실레이트, 모노히드로클로라이드, 3수화물이다. 실험식은 C33H38N4O6·HCl·3H2O이고, 분자량은 677.19 g/몰이다. 분자 구조는 하기와 같다:
Figure pct00097
오니바이드® 제품은 멸균된, 백색 내지 연한 황색의 불투명한 등장성 리포솜성 분산액으로서 제공된다. 10 mL 단일-용량 바이알은 각각 mL당 4.3 mg/mL의 이리노테칸 유리 염기 무수의 농도에서 43 mg의 이리노테칸 유리 염기의 등가량을 함유한다 (즉, 4.3 mg 이리노테칸 모이어티/mL). 리포솜은 직경이 대략 110 nm인 단층의 지질 이중층 소포로서, 이는 수크로스 옥타술페이트 염으로서 겔화 또는 침전된 상태의 이리노테칸을 함유하는 수성 공간을 캡슐화한다. 소포는 6.81 mg/mL의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 2.22 mg/mL의 콜레스테롤 및 0.12 mg/mL의 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 구성된다. 각각의 mL는 또한 완충제로서의 4.05 mg/mL의 2-[4-(2-히드록시에틸) 피페라진-1-일]에탄술폰산 (HEPES) 및 등장성 시약으로서의 8.42 mg/mL의 염화나트륨을 함유한다.
이리노테칸 리포솜 주사제는 지질 이중층 소포 또는 리포솜에 캡슐화된 토포이소머라제 1 억제제이다. 토포이소머라제 1은 단일-가닥 절단을 유도함으로써 DNA에서의 비틀림 변형을 경감시킨다. 이리노테칸 및 그의 활성 대사물 SN-38은 가역적으로 토포이소머라제 1-DNA 복합체에 결합하고, 단일-가닥 절단의 재라이게이션을 막아, 노출 시간-의존성 이중-가닥 DNA 손상 및 세포 사멸을 유도한다. 인간 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서, 이리노테칸 HCl보다 5배 더 낮은 이리노테칸 HCl-등가 용량에서 투여된 이리노테칸 리포솜은 SN-38의 유사한 종양내 노출을 달성하였다.
단일 작용제로서 또는 조합 화학요법의 일부로서, 오니바이드® 제품을 50 내지 155 mg/m2의 용량으로 수용한 암 환자에서, 353명의 암 환자를 대상으로 한 집단 약동학적 분석을 사용하여, 총 이리노테칸 및 총 SN-38의 혈장 약동학을 평가하였다.
단일 작용제로서 또는 조합 화학요법의 일부로서 70 mg/m2의 오니바이드® 제품의 투여 후의 총 이리노테칸 및 총 SN-38의 약동학적 파라미터가 하기에 제시되어 있다.
표 12: 평균 (±표준 편차) 총 이리노테칸 및 총 SN-38의 요약
Figure pct00098
Cmax: 최대 혈장 농도
AUC0-∞: 시간 무한대까지 외삽된 혈장 농도 곡선하 면적
t1/2: 말기 제거 반감기
CL: 클리어런스
Vd: 분포 부피
50 내지 155 mg/m2의 용량 범위에 걸쳐, 총 이리노테칸의 Cmax 및 AUC는 용량에 따라 증가하였다. 추가적으로, 총 SN-38의 Cmax는 용량에 비례하여 증가하지만; 총 SN-38의 AUC는 용량에 비례하여 증가하지 않았다.
이리노테칸 리포솜의 직접 측정은 이리노테칸의 95%가 계속 리포솜-캡슐화되어 있으며, 전체 형태와 캡슐화된 형태 사이의 비가 투여 후 제0시간부터 제169.5시간까지 시간에 따라 변화하지 않는다는 것을 제시하였다.
오니바이드® 제품은 2℃ 내지 8℃ (36℉ 내지 46℉)에서 저장되어야 하고, 광으로부터 보호되어야 하며, 동결되지 않아야 한다.
다수의 오니바이드® 제품 제제를 장기간 안정성에 대해, 2-8℃ (냉장 조건)에서의 12-36개월의 저장에 걸쳐 분석하였다. 결과는 하기 기재된 바와 같이, 도 9, 10, 11a 및 11b에 그래프로 플롯팅되어 있다. 한 연구에서, 12개의 오니바이드® 제품 제제에 대해 입자 크기 (도 9) 및 입자 크기 분포 (도 10)를 12-36개월에 걸쳐 측정하였다. PDI는 모든 샘플에서 0.1보다 훨씬 낮게, 또한 약 0.05보다 낮게 유지되었다. 또 다른 연구에서, 13개의 상이한 오니바이드® 제품 제제에 대해 pH (도 11a)를 12 -36개월에 걸쳐 측정하였다. pH는 모든 샘플에서 연구 동안 6.8을 초과하여 유지되었다. 또 다른 연구에서, 16개의 상이한 오니바이드® 제품 제제에 대해 리소-PC의 양 (도 11b)을 냉장 저장 동안 12개월에 걸쳐 측정하였다. 리소-PC의 양은 모든 샘플에서 1 mg/mL 미만으로 유지되었다.
저장의 상이한 시점에서 오니바이드® 제품 실시양태의 이리노테칸 유리 염기 농도를 결정하기 위해, 이리노테칸 유리 염기를 "실시예" 섹션에 제공된 바와 같이 정량화하였다. 저장의 상이한 시점에서 오니바이드® 제품 실시양태의 지질 조성을 결정하기 위해, 지질을 관련 기술분야에서의 표준법인 표준 HPLC 방법론을 사용하여 정량화하였다.
저장의 상이한 시점에서 오니바이드® 제품 실시양태의 리포솜의 평균 입자 크기 (D) 및 다분산 지수 (PDI)를 결정하기 위해, 말번 제타사이저 나노 ZS™와 함께 DLS 방법을 사용하였다.
저장의 상이한 시점에서 오니바이드® 제품 실시양태의 리소-PC의 존재를 결정하기 위해, 리소-PC를 "실시예" 섹션에 기재된 바와 같이 정량화하였다. 추가적으로, 본 발명의 문맥에서 리소-PC는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 정량화될 수 있는 것으로 고려된다.
실시예 8: 토포테칸 및 비노렐빈 리포솜
본 저장 안정성 연구의 목적은 4℃에서 저장될 때, 수크로스 옥타술페이트 포획제를 이용하여 제조된 토포테칸 (TPT) 리포솜 및 비노렐빈 (VNB) 리포솜의 물리적 및 화학적 안정성에서의 임의의 변화를 결정하는 것이었다. 구체적으로, 본 연구는, 리포솜 제조 동안, 인지질의 mol당 토포테칸 또는 비노렐빈 대 인지질 비를 하기 나타낸 바와 같이 유지하면서, 수크로스 옥타술페이트 (SOS) 포획제 농도를 0.6 M에서 0.45 M 술페이트 기로 감소시키는 것이 리포솜 샘플에 존재하는 리소-PC의 양에 영향을 미칠것인지 여부를 검사하였다. 유사하게, pH의 6.5에서 7.5로의 증가의 영향을, 이러한 pH 증가가 리포솜 조성물 내의 리소-PC의 존재를 감소시켰는지 여부를 결정하기 위해 검사하였다. TPT 및 VNB는 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 PEG-DSPE를 함유하는 리포솜에 SOS 포획제와 함께 캡슐화되었다. 조사되는 제형 파라미터는 하기를 포함한다: 용액 pH (6.5-7.5), 리포솜 제조 동안의 수크로스 옥타술페이트 포획제의 농도 (0.45-0.6 M 술페이트), 캡슐화된 약물 (TPT 또는 VNB), 및 약물 대 지질 비 (리포솜 로딩 동안 인지질의 mol당 500 g의 TPT HCl; VNB의 경우에는 리포솜 로딩 동안 인지질의 mol당 350 내지 450 g의 VNB 모이어티). 이러한 안정성 연구 동안 모니터링된 리포솜의 다양한 물리화학적 특성은 리포솜 크기, 약물 대 인지질 비, 약물 캡슐화 효율, 전반적 외관 및 리소-지질 형성이었다.
DSPC, 콜레스테롤 (Chol) 및 PEG-DSPE를 각각 3:2:0.015의 몰비에 상응하는 양 (790.15 mg/257.8 mg/14.0 mg)으로 칭량하였다. 지질을 클로로포름/메탄올 (4/1, v/v)에 용해시키고, 완전히 혼합하고, 2개의 분취물 (A 및 B)로 나누었다. 각 샘플을 60℃에서 회전 증발기를 사용하여 증발 건조시켰다. 잔류 클로로포름은 12시간 동안 실온에서 진공 (180 마이크로토르) 하에 두어 지질로부터 제거하였다. 건조된 지질을 60℃에서 에탄올에 용해시키고, 적절한 농도의 미리-가온된 TEA8SOS를 최종 알콜 함량이 10% (v/v)가 되도록 첨가하였다. 총 인지질 농도는 대략 75 mM이었다. 지질 용액을 0.1 μm 폴리카르보네이트 막 (뉴클리포어™)을 통해 10회 압출시켜, 95-115 nm의 전형적인 평균 직경을 갖는 리포솜을 생성하였다. 압출된 리포솜의 pH를 요구되는 경우에 필요에 따라 (1 N NaOH 이용) pH 6.5로 조정하였다. 리포솜을 이온-교환 크로마토그래피 및 크기-배제 크로마토그래피의 조합에 의해 정제하였다. 먼저, 다우엑스™ IRA 910 수지를 1 N NaOH로 처리한 다음, 탈이온수로 3회 세척하고, 이어서 3 N HCl로 3회 세척한 다음, 물로 다수회 세척하였다. 용리된 분획의 전도도를 유동-셀 전도도계 (파마시아, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 측정하였다. 분획은 전도도가 15 μS/cm 미만인 경우에 추가의 정제를 위해 허용되는 것으로 간주되었다. 이어서, 리포솜 용리액을 탈이온수로 평형화된 세파덱스 G-75 (파마시아) 칼럼에 적용하고, 수집된 리포솜 분획을 전도도에 대해 측정하였다 (전형적으로 1 μS/cm 미만). 40% 덱스트로스 용액을 5% (w/w)의 최종 농도를 달성하도록 첨가하고, 완충제 (Hepes)를 원액 (0.5 M, pH 6.5)으로부터 10 mM의 최종 농도까지 첨가하였다.
토포테칸 히드로클로라이드의 원액을 50 mg을 10 mL의 탈이온수에 용해시킴으로써 제조하였다. 약물을 결과 표 13에서 각 제형에 대해 나타낸 약물/지질 비로 리포솜 용액에 첨가하였다. TPT 로딩을 위해, pH를 로딩 전에 pH 6.0으로 조정하였다. 비노렐빈은 약국으로부터의 상업용 USP 주사 용액으로부터 직접적으로 첨가하고, 생성된 혼합물의 pH를 가열 전에 1 N NaOH를 이용하여 6.5로 조정하였다. 리포솜/약물 혼합물을 30분 동안 60℃로 가열함으로써 약물 로딩을 개시하였다. 용액을 수조에서 꺼내어 빙냉수에 침지시킴으로써 급속 냉각시켰다. 리포솜-외부 약물은 pH 6.5의 Hepes (10 mL) 완충 염수 (HBS)로 평형화되고 용리되는 세파덱스 G75 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 샘플을 HPLC에 의해 이리노테칸에 대해, 또한 바틀렛 방법 (포스페이트 결정 참조)에 의해 포스페이트에 대해 분석하였다.
저장을 위해, 샘플을 4 mL의 분취물로 나누고, 필요에 따라 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 pH를 조정하고, 무균 조건 하에 멸균 여과하고, 멸균 투명 유리 바이알에 충전하고, 테플론® 라이닝 나사식 캡으로 아르곤 하에 밀봉하여, 4℃의 자동 온도 제어되는 냉장고에 넣었다. 한정된 시점에서, 분취물을 각 샘플로부터 꺼내어, 외관, 크기, 약물/지질 비, 및 약물 및 지질의 화학적 안정성에 대해 시험하였다. 리포솜 크기는 희석된 샘플에서 쿨터 나노-사이저를 사용하여 동적 광 산란에 의해 90도 각도에서 결정하고, 누율 방법에 의해 얻어진 평균 ± 표준 편차 (nm)로서 제시하였다.
비교 안정성 연구로부터의 결과가 표 13에 제공되어 있다.
표 13: TEA8SOS 포획제를 이용하여 제조된 토포테칸 및 비노렐빈 리포솜 (0.6N SOS 술페이트 기, 2 mg/mL의 약물 농도에서 저장됨)
Figure pct00099
i 본원에 기재된 바와 같은, 방법 B에 따라 측정됨.
j 총 인지질의 mol당 500 g의 토포테칸 HCl
토포테칸 로딩된 리포솜에서의 리소-지질의 생성에 대한 저장 매질 pH의 영향은 샘플 19 및 20에서 관찰되지 않았다. 샘플 19는 pH 6.5에서 저장되었고, 샘플 20은 pH 7.25에서 저장되었음에도 불구하고, 샘플 19 및 20의 제형은 둘 다 9개월 후에 30 mol%에 가까운 리소-지질을 나타냈다.
두 리포솜성 캄프토테신과 달리, 리포솜성 비노렐빈은 9개월 후에 9.5 mol%의 리소-지질을 갖는 샘플 21에서 최고량의 리소-지질이 측정되었다는 점에서, 지질 가수분해에 보다 큰 저항성을 가졌다. 명백하진 않지만, 본 발명자들은 또한 안정성 비 및 저장 매질 pH에 대한 의존성을 발견할 수 있었다. 보다 높은 안정성 비는 감소된 지질 가수분해를 야기하였다 (샘플 21 및 23의 비교). 7.25의 pH는 또한 관찰되는 지질 가수분해의 양을 감소시켰다 (샘플 21 및 22의 비교).
실시예 9: 리소-PC를 측정하는 HPLC 방법 ("방법 A")
도 11b 및 12의 데이터를 얻기 위해 시험된 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트 리포솜 제제 내의 리소-PC의 양은 증기화 광 산란에 의한 검출과 함께 HPLC를 사용하여 얻었다. 적합한 HPLC 방법 (본원에서 "방법 A"라 지칭됨)은 약물 제품에서의 스테아르산, 리소-PC, 콜레스테롤 및 DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린)의 양을 측정하는데 사용되는 정량적 방법이다. 리포솜을 메탄올-테트라히드로푸란 용액을 사용하여 그의 개별 지질 구성요소로 해리시켰다. 지질 구성요소를 증기화 광 산란 검출기가 장착된 역상 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 정량화하였다.
샘플 및 표준물 제조
표준물 제조:
리소PC
적절한 양의 리소PC를 85:15의 메탄올-테트라히드로푸란으로 4, 8, 20, 32 및 40 μg/mL의 표적 최종 농도로 희석함으로써 5 포인트 표준 곡선을 준비하였다.
스테아르산
적절한 양의 스테아르산을 85:15의 메탄올-테트라히드로푸란으로 2, 4, 10, 16 및 20.4 μg/mL의 표적 최종 농도로 희석함으로써 5 포인트 표준 곡선을 준비하였다.
콜레스테롤
적절한 양의 콜레스테롤을 85:15의 메탄올-테트라히드로푸란으로 90, 144, 183.7, 224.9 및 266.6 μg/mL의 표적 최종 농도로 희석함으로써 5 포인트 표준 곡선을 준비하였다.
DSPC
적절한 양의 DSPC를 85:15의 메탄올-테트라히드로푸란으로 220, 352, 449, 549.8 및 651.7 μg/mL의 표적 최종 농도로 희석함으로써 5 포인트 표준 곡선을 준비하였다.
검정 대조군
스테아르산을 희석제 (85:15의 메탄올-테트라히드로푸란)로 9.0 μg/mL 및 18.0 μg/mL의 표적 최종 농도로 희석함으로써 검정 대조군을 제조하였다.
샘플 제조:
각 샘플을 85:15의 메탄올-테트라히드로푸란 용액으로 475 μg/mL의 표적 최종 DSPC 농도로 희석함으로써 샘플을 제조하였다.
용액 안정성
시험 샘플 표준물 및 검정 대조군은 주위 온도에서 저장될 때 최대 48시간 동안 용액에서 허용되는 안정성을 입증한 바 있다.
기기 및 기기 파라미터
적절한 피크 검출을 보장하기 위해, 필요에 따라 실행 동안 게인 및 필터 설정을 변화시킬 수 있는 증기화 광 산란 검출기가 장착된 적합한 고압 크로마토그래피 시스템. 기기 작동 파라미터는 표 14에 열거되어 있다.
표 14: 크로마토그래피 조건
Figure pct00100
표 15: 시스템 적합성
Figure pct00101
각각의 지질 농도는 표준 곡선에 대해 샘플 피크 면적을 분석함으로써 결정되었다. 2차 다항식 (2차 곡선) 추세선을 사용하여 리소-PC 및 스테아르산의 지질 농도를 계산하였다. 선형 추세선을 사용하여 DSPC 및 콜레스테롤의 지질 농도를 계산하였다.
대표적인 크로마토그램이 도 13a 및 도 13b에 제시되어 있다.
본원에 인용되는 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (23)

  1. 7.00-7.50의 pH를 가지고, 이리노테칸 유리 무수 염기의 그램으로, 총 리포솜 인지질의 mmol당 500 mg (±10%)의 이리노테칸 모이어티 및 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 4.3 mg의 이리노테칸 모이어티와 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도에서, 콜레스테롤 및 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화하는 이리노테칸 리포솜의 분산액을 포함하며, 4℃에서의 처음 6개월의 저장 동안 20 mol% 미만의 리소-PC를 형성하도록 안정화된, 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  2. 7.00-7.50의 pH를 가지고, 이리노테칸 유리 무수 염기의 그램으로, 총 리포솜 인지질의 mmol당 500 mg (±10%)의 이리노테칸 모이어티 및 리포솜성 이리노테칸 조성물의 mL당 4.3 mg의 이리노테칸 모이어티와 등가의 이리노테칸 모이어티의 농도에서, 콜레스테롤 및 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 단층의 이중층 소포에 이리노테칸 수크로스 옥타술페이트를 캡슐화하는 이리노테칸 리포솜의 분산액을 포함하며, 0.85-1.2의 이리노테칸/술페이트 화합물 그램-당량비를 갖는 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  3. 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 4℃에서의 처음 6개월의 저장 동안 20 mol% 미만의 리소-PC를 형성하도록 안정화된, 저장 안정화된 리포솜성 이리노테칸 조성물:
    (a) 0.4 내지 0.5 M의 술페이트 농도 및 5 내지 7의 pH를 갖는 TEA8SOS 및/또는 DEA8SOS로부터 제조된 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 약 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE인 단계;
    (b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
    (c) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및/또는 DEA8SOS로부터 유래된 이온을 실질적으로 제거하는 단계;
    (d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액과 접촉시키며, 이에 의해 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
    (e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및/또는 DEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 실질적으로 제거하는 단계; 및
    (f) 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5가 되도록 조정하는 단계.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 리포솜성 이리노테칸 조성물:
    (a) 0.4 내지 0.5 M의 술페이트 농도 및 5 내지 7의 pH를 갖는 TEA8SOS로부터 제조된 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 약 3:2:0.015 몰비의 DSPC, 콜레스테롤 및 MPEG-2000-DSPE인 단계;
    (b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
    (c) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS로부터 유래된 이온을 실질적으로 제거하는 단계;
    (d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액과 접촉시키며, 이에 의해 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
    (e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 실질적으로 제거하는 단계; 및
    (f) 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5가 되도록 조정하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 지질 분산액이 적어도 2개의 적층된 0.1 μm 폴리카르보네이트 막을 통해 압출되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜이 동적 광 산란에 의해 결정 시 110 nm의 평균 크기를 가지며, 여기서 크기는 누율 방법에 의해 결정되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 4.3 mg/ml의 이리노테칸 유리 염기 무수와 등가의 총 이리노테칸 모이어티 함량을 갖는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  8. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (a)에서 리포솜이 0.43-0.47 M의 술페이트 농도를 갖는 TEA8SOS로부터 형성되고;
    단계 (d)에서 이리노테칸 유리 염기 또는 이리노테칸 염을 사용하여 제조된 용액이 DSPC의 몰당 500 g (±10%)의 이리노테칸 유리 염기 무수와 등가의 이리노테칸 모이어티 함량을 가지고;
    단계 (f)에서 조성물의 pH가 7.2 내지 7.3이 되도록 조정되는 것인
    리포솜성 이리노테칸 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4℃에서의 저장 전에 1 mol% 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하며, 약 4℃에서의 180일의 저장 후에 (총 리포솜 인지질에 대해) 20 mol% 이하의 리소-PC를 함유하는 리포솜성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 약 4℃에서의 6, 9 또는 12개월의 저장 후에 (총 리포솜 인지질에 대해) 20 mol% 이하의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 함유하는 리포솜성 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 총 6.1 내지 7.5 mg DSPC/ml, 2 내지 2.4 mg 콜레스테롤 /ml 및 0.11 내지 0.13 mg MPEG-2000-DSPE/ml를 모두 수성 등장성 완충제 중에 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜성 이리노테칸이 2 내지 20 mM의 농도에서 등장성 HEPES 수성 완충제 중에 이리노테칸 리포솜을 포함하는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 130-160 mM의 농도에서 염화나트륨을 추가로 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜에 캡슐화된 이리노테칸이 수크로스 옥타술페이트 염으로서 겔화 또는 침전된 상태인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 이리노테칸 리포솜이 준탄성 광 산란에 의해 측정 시, 95-115 nm의 직경을 갖는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 총 6.81 mg DSPC/ml, 2.22 mg 콜레스테롤 /ml 및 0.12 mg MPEG-2000-DSPE/ml, 4.05 mg/mL HEPES 수성 완충제 및 8.42 mg 염화나트륨/mL를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 7.25의 pH를 가지며, 여기서 이리노테칸 리포솜은 준탄성 광 산란에 의해 측정 시 110 nm의 직경을 갖는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4℃에서의 6개월의 저장 후에 1 mg/mL 미만의 리소-포스파티딜콜린 (리소-PC)을 형성하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 리포솜성 이리노테칸 조성물:
    (a) 약 0.45 M의 술페이트 농도 및 약 6.5의 pH를 갖는 TEA8SOS의 용액 중의 지질 분산액을 형성하며, 상기 분산액 내의 지질은 각각 3:2:0.015 몰비의 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 및 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 (MW 2000)-디스테아로일포스파티딜 에탄올아민 (MPEG-2000-DSPE)으로 이루어진 것인 단계;
    (b) 지질 분산액을 60-70℃에서 적어도 1개의 0.1 μm 막을 통해 압출시켜 리포솜을 형성하는 단계;
    (c) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS로부터 유래된 이온을 제거하는 단계;
    (d) 리포솜을 60-70℃의 온도에서 이리노테칸 히드로클로라이드 3수화물을 사용하여 제조된 용액과 접촉시켜, 총 리포솜 인지질의 mol당 약 500 g (±10%)의 이리노테칸을 캡슐화하는 리포솜의 제제를 형성하는 단계;
    (e) 리포솜의 바깥쪽에 있는 TEA8SOS 및 이리노테칸 성분으로부터 유래된 물질을 제거하는 단계; 및
    (f) 조성물의 pH를 약 7.3이 되도록 조정하는 단계.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 총 100 ppm 미만의 TEA를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 총 30-100 ppm의 TEA 또는 DEA를 포함하는 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4℃에서의 6개월의 저장 후에 이리노테칸의 적어도 98%가 이리노테칸 리포솜에 캡슐화되는 것인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 이리노테칸 리포솜 내에 화학식 (I)의 이리노테칸 조성물을 포함하며, 여기서 x는 8인 리포솜성 이리노테칸 조성물.
    Figure pct00102
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