JP4838255B2 - 階段状カニューレ - Google Patents
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Description
Quereshi等 (2000) Neurosurgery 46(3): 663-69.
アッセンブリー及び組み合わせ手順
A.例示的なカニューレ#1
例示的な階段状のカニューレ(図3A及び図3Bに示されるような)は、以下のように生産される。
Oakiteアルミニウム10分間洗浄され、7分間、脱イオン化された水でスプレーすすぎされ、アルコール中で超音波ですすがれ、及び空気で乾かされた。
図3B−1に示すように、針カバー32は、上述したようにINSA35から除去され、熔融シリカ管40の全長は、INSA35の芯23G管15に、近位端にて始まり、INSA35の遠位端を超えて約2インチ延在するまで通される。Loctite(登録商標)接着剤(Loctite(登録商標) Prism(登録商標) 4011接着剤、低粘度)は、露出した熔融シリカ管40に塗布された。次に、熔融シリカ管は、接着剤を均一に配置するようにINSAを回しながら、INSAの遠位端を超えて約1インチ残るまで引っ込められた。接着剤の接合強度は、少なくとも5ポンドである。露出した熔融シリカ管は、INSAの遠位端から延在して0.390インチ(10mm)残るように、仕上げられ、針カバー32が交換された。
他のカニューレは、例1Aに記述されたものに類似して作製される。図6に示されるように、カニューレ80は、30ゲージ管に終わり、階段デザインで、レーザ溶接により互いに熔融された4層の304手術用鋼を備える。鋼カニューレ(針先端を含み端から端まで約24.6cm)は、鋼を超えて1cm延在することにより配送装置の先端も形成する100μmの内径の熔融シリカ82で裏張りされている。テフロン(登録商標)管84で覆われていた約1.2m(122cm)のさらなる熔融シリカ82は、Luerハブ86に接続される。熔融シリカ及びテフロン(登録商標)管の間の1インチの30ゲージ鋼スペーサー88は、密閉され、医療級シアノアクリレート接着剤でLuerハブに取り付けられる。
AADCを符号化した組み換え型のウイルスベクターの霊長類の脳への配送
ヒトAADC(AAV-hAADC-2)を符号化した組み換え型AAVベクターが準備され、以下のようにアカゲザルの被殻に配送される。
組み換え型AAV2は、3倍のトランスフェクション・プロトコル(Matsushita等(1998)Gene Ther. 5(7): 938-45)によって生成された。簡単に言えば、10%のウシの胎仔血清及び2mMのグルタミンを含んでいるDMEM中の一連の使い捨て培養品によって細胞・バンクを動かすHEK293から細胞の拡大後、細胞は、3つのプラスミド(pAAV-hAADC-2、pHLP 19、及びpladeno5)で同時形質移入(co-transfected)された。rAAV−hAADC−2ベクター・クローンは、上述のもの(Sanftner等 (2004) Mol. Ther. 9(3): 403-9)と同じである。プラスミドpHLP 19及びpladeno5は、米国特許5,139,941;5,622,856;6,001,650;及び6,004,797 にてより完全に記載されており、それらの開示内容は、それらの全体が参考文献として本願に組み込まれている。
AAV-hAADC-2は、凝縮され、5%のソルビトールを含む無菌のバッファーされた食塩水(PBS)でダイアフィルタ(diafiltered)される。Poloxamer 188(TM)(0.001%)が加えられ、物質は、無菌濾過(0.22μm)され、−70℃で冷凍保存される。ベクター清浄は、SDS-PAGEによって評価される。この研究で用いられる、浄化されたrAAV2ベクターは、SDS-PAGEゲルの銀染色法により、VPl、VP2、及びVP3のみを示される。滴定濃度は、ベクター・ゲノムのリアルタイムQ-PCR分析により決定される。
定位の座標(被殻の解剖学的構造に基づく)を同定するために、核磁気共鳴映像法(MRI)が手術に先立って各猿に行なわれた。一つが頭側の被殻に集められた部位で、2つ目が尾部の被殻内の部位にて、各大脳半球に2つの部位が目標とされた。成体のアカゲザル(n=4)は、手術のため、ケタミン(Ketaset(登録商標)、10mg/kg、筋肉注射)及びValium(登録商標)(0.5mg/kg、静脈注射)の混合物で動けなくされ、挿管され準備された。等張性の液体は、2mL/kg/hrで静脈注射にて配送された。麻酔は、5%v/vで、全身麻酔薬(Aerane(登録商標)、Omeda PPD社、Liberty, New Jersey)にて引き起こされ、手術の間、l%−3% v/vで維持された。動物の頭は、MRI互換の定位フレームに置かれた。心電図、心拍数、酸素飽和度、及び体温が手続きの間、連続的にモニターされながら、中心温度は循環水ブランケットにて維持された。目標部位の真上の硬膜領域を露出するように、歯科用ドリルにて頭蓋骨に穴が形成された。AAV−hAADC−2は、CED(Lieberman等 (1995) J. Neurosurg. 82(6): 1021-9; Bankiewicz等 (2000) Exp. Neurol. 164(1): 2-14)によって注入された。それぞれの猿は、4つの部位(一つの半球当たり2つの部位を有し、部位当たり50μL)にわたり200μLで拡がり、計3×1011vgを受け入れた。注入カニューレは、各大脳半球における被殻に手動で案内された。また、動物は、左脳半球用に0.2μL/分(10分)、0.5μL/分(10分)、0.8μL/分(10分)、及び1μL/分(35分)の注入速度で、右脳半球用に1μL/分(50分)の一定の注入速度にて、AAV−hAADC−2(1.5×1012vg/mL)の左右相称の注入(つまり両大脳半球内の頭側及び尾部の部位へ連続して注入)を受けた。各動物の実際の定位座標は、:MR15101M 頭側被殻 AP:18、ML:±10.5、DV:20、尾部被殻AP:15,ML:±13,DV:20、R211101M 頭側被殻 AP:24、ML:±12.5、DV:20、尾部被殻 AP:21、ML:±13.5、DV:20、MR15109M 頭側被殻 AP:12、ML:±13、DV:20、尾部被殻 AP:15、ML:±12、DV:20、R23700M 頭側被殻 AP:21、ML:±13.5、DV:21、尾部被殻 AP:24、ML:±12.5、DV:20である。注入の約10分後に、カニューレは除去され、巻かれた部位は閉じられた。また、猿は麻酔からの回復のためにモニターされ、次に、継続して観察するためにケージに戻された。
組織学の研究のため、動物は、10%中性緩衝ホルマリン(NBF)に従い心臓内の塩水注入を介して潅流する。その後、脳は、除去され、脳型枠にて頭頂ブロック(8〜10mm)にスライスされる。収穫された脳ブロックは、10%NBF定着薬への浸漬により固定される。組織ブロックは、定着後2〜3日で、濃度上昇PBS/スクロース溶液(10,20,30%)に3〜5日間にわたり移送される。脳は、イソペンタン槽にて冷凍され、ドライアイス上で冷やされ、低温保持装置で40μm厚の頭頂部分に連続的にカットされる。10番目の部分毎に、組織病理学の分析のためにヘマトキシロン及びエオシン(H&E)溶液(Richard Allen、Scientific、Kalamazoo、MI)で着色される。免疫組織化学は、AADC(Chemicon、Temecula、CA、1:1,500)特定用の第一の抗体を有する浮かない部分で実行された。部分は、細胞膜内で成長するペルオキシダーゼを消すために、30分間、3%の過酸化水素内で保温された。10%の正常なヤギ血清で非特定結合のためにブロックした後、部分は、室温で、一級抗体に一晩保温され、その後、ビオチン化された抗ウサギIgG抗体(Vector Laboratories、Burlingame、CA、1:300)、スプレプトアビジン抱合体化されたホースラディシュ・ペルオキシダーゼ(Vector Laboratories、1:300)にて、室温で、両方1時間、保温された。複合体は、3−3'−ジアミノベンジジン(DAB(Vector Laboratories))及び過酸化水素で視覚化された。部分は、Superfrost Plus(登録商標)スライド(Brain Research Laboratories, Newton, MA)に取り付けられ、乾かされ、上昇エタノール系内で脱水され、キシレン内で清掃され、Cytoseal−XYL(Richard―Allen、Scientific、Kalamazoo、MI)でマウントされる。hAADC免疫染色の前後分配は、式(n×10×40μm)により決定される。ここで、nはhAADC陽性細胞での部分数、40μmは部分の厚さ、10番目の部分毎に検査された。分配量は、連続の部分(10番目毎)にて推定され、ビデオカメラ及びStereoinvestigator(TM)の立体解析学ソフトウェア(Microbrightfield、Williston、VT)を装備したZeiss顕微鏡で63倍の拡大の下、立体解析学法に基づき設計されたOptical Fractionator-Optical Dissector でAADCに関して着色された。CEEは、各グループに関し5%未満である。結果は、平均±標準偏差として報告される。学生のt - テストは、統計的有意性を測定するために用いられた。
この研究にて用いられるベクターAAV−hAADC−2は、ヒトのAADC目標cDNAを含んでいる。リアルタイムQ−PCRプライマー及びプローブは、AADC遺伝子の2,3のエクソンにアニールし、ベクター・シーケンスの中にないイントロンをまたがる。それにより、ゲノムのDNAの増幅を最小化する。リアルタイムQ−PCRは、ベクター・インサートを含む線形化されたプラスミドDNAで標準化され、ベクター・ゲノムは、上述したように(Sommer等 (2003) Mol. Ther. 7(1): 122-8)、量を計られた。
血清又は血漿の中和抗体(NAb)滴定濃度は、細胞に基づいた分析にて生体外で決定された。β−ガラクトシダーゼ・リポーター遺伝子(AAV2-LacZ)を符号化した、規定数のAAV2ベクター粒子は、96−ウエルプレートにおける集合の近くのHEK−293細胞への混合物の追加の前に、37℃にて1時間、テスト血清で保温された。制御(100%)AAV2形質導入は、純粋なマウス血清(NMS)がある状態でAAV2−LacZによる形質導入の後、24時間の培養にて測定されたβ−ガラクトシダーゼ活性の量として規定された。NMS中のテスト血清のハーフログ(half-log)連続希釈は、β−ガラクトシダーゼ発現の50%以上の抑制に帰着するテスト血清の最も高い稀釈を決定するようになされた。各希釈列は、3つにてテストされた。滴定濃度を中和する十分に定義されたAAV2を備えた基準血漿は、各分析評価にて使用され、また、負の制御(NMSだけ)は、バックグラウンドの分析評価を決定するために用いられた。NAbの滴定濃度は、50%抑制レベル、例えば、1:100、1:316を一まとめにする2つの稀釈液として規定された。
滴定濃度板(96ウエル)は、AAV2粒子でコーティングされ、次に、試験サンプル(血清または血漿)とともに保温された。板は、ビオチン化されたAAV2粒子で保温され、次に、それらはHRP結合−スプレプトアビジンにて検出された。ビオチン化されたAAV2粒子は、2つのAAV2粒子間にブリッジを形成する多価抗体によってのみ捕らえることができる。この分析評価における非常に低い非特異性のバックグラウンド信号は、希釈されていない、又は低希釈の試験品の試験を可能にし、また、分析評価は、試験サンプルにおける第一の抗体が酵素を結合した第2の抗体によって検出される古典的ELISAよりも高い感度を有する。架橋分析評価は、抗体の異なる種とクラスとの間の直接の滴定濃度比較を可能にする。分析は、AAV2(Grimm等、1998)を認識する、浄化されたマウス単クローン抗体「A20」の既知量で標準化された。この分析の量化限界は、約15ng/mLの反AAV2抗体だった。1:100のNAb滴定濃度を有するヒトのサンプルは、A20と同等な抗体の1〜10μg/mLの間に含まれていた。この分析によって反復試験を受けた65の人間サンプルに関する平均の測定間(inter-assay)の可変性は、23%だった。
組み換え型AAV2ベクターは、頭脳組織を効率的に形質導入するが、しかし、形質導入レベルは、高い中和抗体(NAb)滴定濃度(>1:1200)(Sanftner等 (2004) Mol. Ther. 9(3): 403-9) が存在する状態で著しく下がる。したがって、NAb滴定濃度≦1:100を有する4匹のオスのアカゲザルがAAV2注入(表1)のために選ばれた。ベクター投与のための定位座標を決定するために、MRI走査がAAV2配送に先立って行なわれた。
動物に、各大脳半球(3.0×1011vg/脳)に、2つの50μL注入(7.5×1010vg/部位)にて、1.5×1011vg/脳のAAV−hAADC−2がそれぞれに注がれた。0.2μL/分(10分)、0.5μL/分(10分)、0.8μL/分(10分)、及び1μL/分(35分)の上昇の注入速度(増加)が、左大脳半球用に用いられ、一方、50分間(非増加)、1μL/分の一定速度が右大脳半球用に用いられた。動物は、5.5週間モニターされた。このモニタ時間は、hAADC発現が比較的安定になるのに満足な期間である。第一の終了点は、免疫組織化学により決定されるようなAADC発現、並びに臨床観察及び組織病理学によって決定されるような安全評価を含んでいた。さらに、基線及び研究の終わりにて集められた血清サンプルは、中和すること及びAAVに対する全抗体の両方の存在に関してテストされた。
ヒトの使用(「Clinical Device A」つまりCDA)のための試作型注入装置は、標準のLeksell(登録商標)の定位フレームにはまり合うように作製された、25cmのステンレス鋼カニューレを備えていた。CDAカニューレは、剛性、及び内部ホールドアップ体積の最小化を提供するため、医療等級のステンレス鋼管の4つの階段状層を備えていた。鋼CDAカニューレは、1.2mのテフロン(登録商標)管を介して注射器に接続された。1μL/分までの流速におけるベクター回収研究は、製品調剤にて表面活性剤として0.01%のPoloxamer 188が含まれるにもかかわらず、90%のベクター製品が装置に吸着していたことを示している(表2)。ベクターで装置を1時間フラッシュすることは、後の回収を改善するが、しかし、ベクターの損失は、まだおよそ40%あった。さらに、ベクター回収用のテストは、1μL/分以下の流速にて製品が異種の管材料に接する階段状のステンレス鋼カニューレの試験を含んでいた(例1A、1B)。優れたベクター回収は、AAVベクターと接する、熔融シリカTygon(登録商標)及びシリコーン管を備えるカニューレに関して観察された。鋼、テフロン(登録商標)(PTFE及びFEP)、及びポリイミドのような他の物質は、かなりの量のベクターを捕獲する。
hAADC発現の免疫組織化学分析は、ベクター分配が上昇注入と非上昇注入との後で異なるのか否かを臨床装置Bで決定するため、AAV−hAADC−2注入後、5.5週にて各大脳半球にて実行された。全ての猿は、被殻内でhAADC発現を示した。連続した部分は、hAADC−陽性細胞用の明視野顕微鏡にて検査された。分配の体積、及びhAADC遺伝子組み換えの陽性細胞の前、後(A−P)拡張が全ての動物に関し決定された。
H&Eで染色された連続部分の組織病理学的分析は、上昇又は非上昇配送のいずれかにて、カニューレ配置及びAAV−hAADC−2注入の効果を決定するために、全ての動物にて行われた。図9は、5倍の拡大で、代表的な動物、R21110IMからの被殻内のH&E染色部分を示す。動物R21110IMは、右大脳半球(パネルA)にて非上昇注入手順により、及び左大脳半球(パネルB)にて上昇注入手順により、AAV−hAADC−2の左右相称のCEDを受け入れた。画像は、中間の尾部の被殻レベルでのカニューレ路に隣接する領域を示す。全てのH&E染色スライドは、処理状態を認識していない、神経病理学者(Pathology Associates 社)によって調査された。いくつかの単核細胞浸潤は、穏やかな血管周囲性細胞浸潤とともに被殻で見られた。両方の被殻は、少数の浸透した血管、及び穏やかな実質組織浸潤を含んでいた。右、左大脳半球の組織病理学の様相は、注入部位での少しの炎症性の組織反応と共に、類似した。
AAVキャップシッドへの中和抗体(NAb)及び合計抗体滴定濃度は、ベクターの注入に先立って、及び検死のときに集められた血清サンプルに関して決定された。反AAV抗体値のわずかな上昇は、AAV−hAADC−2(表1)の左右相称の注入後に、すべての動物におけるELISA架橋により検出された。2つのNAb分析に関する結果は、表1に示されている。ELISA架橋は、反AAV2マウス単クローン抗体で標準化される。2つの結果の平均は、後処理サンプルに関し示される。また、単一の結果は、前処理サンプルに関し示される。処理前の最も高い血清中和抗体滴定濃度(1:10〜1:100)を有する動物(R23700M)は、Day 42で1:31〜1:316に増加した後処理抗体を有している。他の動物と比較したとき、この動物は、類似のhAADC遺伝子組み換え分配を有していた。このように、高滴定濃度に関連してベクター拡張の明らかな抑制はなかった。
猿は、臨床的症状、食料消費、及び体重に関して毎日、評価された。手術後の日々の臨床観察は、動物がCED手順に対し耐性があり、行動変化を示さなかったことを示した。臨床的症状に関するAAV−hAADC−2処置又は体重変化はなかった。後処理期間になされた観察は、同様の外科的処置を受ける研究所に収容されたアカゲザルに一般に観察されるものに類似していた。
本発明のカニューレの実施形態は、霊長類の脳へ有効にrAAVベクターを配送する能力を評価するためにテストされた。それは、ヒトの被験者のパーキンソン病の治療のための治療のrAAVベクターの配送のためのモデルとして役立つ。ベクター配送をテストするために設計された模擬の注入は、テフロン(登録商標)又は鋼の表面にベクターの接触を好ましくは回避して、ここに記載されるようなカニューレにて、本質的に、意図した服用量の100%を配送可能であることを確証した。
Claims (14)
- 一若しくは複数の物質を脳へ配送する階段状のカニューレであって、
ここで上記カニューレは、下記i及びiiを備える、
i 同軸上に配置された2以上のセグメントで、各セグメントは、カニューレの外径を形成する外径を有し、ここで各セグメントの外径は異なり、
ii カニューレの内腔を通り延在する一若しくは複数の管状部品で、ここで少なくとも一つの管状部品は、カニューレを通り脳へ配送される物質の損失を低減する管を備え、さらに上記内腔の遠位端を越えて1〜10mmまで延在する、
カニューレ。 - 物質の損失を低減する管は、熔融シリカ管である、請求項1記載のカニューレ。
- カニューレは、2、3、4、5、又は6つの同軸上に配置されたセグメントを備える、請求項1記載のカニューレ。
- セグメントの外径は、カニューレの近位端から遠位端へ減少する、請求項1記載のカニューレ。
- カニューレは、一定の内径を有する、請求項1記載のカニューレ。
- カニューレは、熔融シリカ管の周りに配置されるFEP管をさらに備えた、請求項2記載のカニューレ。
- 2以上の同軸上に配置されたセグメントは、ステンレス鋼を備える、請求項1記載のカニューレ。
- 一若しくは複数のステンレス鋼セグメントの内腔は、一若しくは複数のポリマーでコーティングされている、請求項7記載のカニューレ。
- カニューレは、5つのステンレス鋼セグメントを備える、請求項1記載のカニューレ。
- カニューレの内腔は、カニューレを通して配送される一若しくは複数の物質を備える貯留部に接続可能である、請求項1記載のカニューレ。
- 貯留部は、注射器を備える、請求項10記載のカニューレ。
- 注射器は、ポンプに連結可能である、請求項11記載のカニューレ。
- ポンプは、プログラム可能である、請求項12記載のカニューレ。
- 貯留部は、カニューレの内腔を通り延在する一若しくは複数の管状部品に連結可能である、請求項10記載のカニューレ。
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