BR102014032446B1 - Lipossomas ph-sensíveis com superfície modificada com bisfosfonatos contendo fármacos para tratamento de doenças ósseas e uso - Google Patents

Abstract

LIPOSSOMAS PH-SENSÍVEIS COM SUPERFÍCIE MODIFICADA COM BISFOSFONATOS CONTENDO FÁRMACOS PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS ÓSSEAS E USO. A presente invenção objetiva a preparação de lipossomas pH-sensíveis para o tratamento de doenças ósseas, como tumores ósseos, com superfície modificada por um bisfosfonato, preferencialmente o alendronato de sódio, e fármacos, preferencialmente a doxorrubicina, em seu interior.

Description

[001] A presente invenção objetiva a preparação de lipossomas pH-sensíveis para o tratamento de doenças ósseas, como tumores ósseos, com superfície, modificada por um bisfosfonato, preferencialmente o alendronato de sódio, e fármacos, preferencialmente a doxorrubicina, em seu interior.

[002] Dentre os agentes antineoplásicos, a Doxorrubicina (DXR), uma antraciclina, é um fármaco com grande utilização no tratamento de leucemias e tumores sólidos, seja isoladamente ou em combinação com outros fármacos (WEISS, R. B. The Anthracyclines: willweeverfind a better doxorubicin? Seminars in Oncology, v. 19, p. 670-686, 1992), pois possui atividade contra muitos tipos de tumores como leucemia, linfomas, mama, carcinoma esofágico, osteosarcomas, sarcoma de Kaposi, carcinomas do tecido mole, cancro testicular, gástrico, ovariano, fígado, biliar, pancreático, carcinoma endometrial e carcinoma de pulmão (SINGAL, P.K. ILISKOVIC, N. Doxorubicin-inducedcardiomyopathy. The New EnglandJournalof Medicine, v. 339, p. 900-905, 1998).

[003] A DXR é um fármaco hidrofílico administrado na forma de cloridrato por via endovenosa por possuir baixa absorção por via oral (WEISS, R. B. The Anthracyclines: willweeverfind a betterdoxorubicin? Seminars in Oncology, v. 19, p. 670-686, 1992). Possui pKa próximo de 7,4 indicando que em meio biológico possui cerca de 50 % de seu conteúdo na forma de base livre e 50 % na forma do sal cloridrato. O tempo de meia-vida de distribuição é de cerca de 5 minutos, o que indica que esse fármaco possui rápida captação pelos tecidos (DRUGBANK. Doxorubicin. Disponível em: <http://www.drugbank.ca/drugs/db00997> . Acesso em 03 ago. 2014). A DXR tem um índice terapêutico baixo, e seu uso é limitado devido à mielossupressão, calvície, náusea aguda e vômito, estomatite, e principalmente à cardiotoxicidade cumulativa irreversível que pode conduzir à insuficiência cardíaca congestiva potencialmente fatal (PAI VB, NAHATA MC. Cardiotoxicityofchemotherapeuticagents: incidence, treatmentandprevention. DrugSafety, v. 22, p. 263-302, 2000). A cardiotoxicidade acomete cerca de 11 % dos pacientes e os principais mecanismos que parecem estar envolvidos são o aumento dos níveis intracelulares de ferro por inibição de proteínas reguladoras de ferro (IRP’s), que levam ao aumento do stress oxidativo, e a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) por regeneração de radicais do seu metabólito semiquinona (SHI, Y.; MOON, M.; DAWOOD, S.; MCMANUS, B.; LIU, P.P. Mechanismand management ofdoxorubicincardiotoxicity. Herz. v. 36, n. 4, p. 3470-3473, 2011).

[004] Desta forma, diante do curto tempo de distribuição da DXR e alta taxa de toxicidade, o emprego de nanossistemas lipidicos com o objetivo de manter o fármaco na circulação apresenta-se como uma estratégia promissora para veicular essa substância. Além disso, a utilização de nanocarreadores, como os lipossomas, pode propiciar o direcionamento desse composto para seu local específico de ação, possibilitando uma maior eficácia terapêutica e menor toxicidade.

[005] Uma desvantagem relacionada ao emprego de lipossomas convencionais é a rápida captação dessas partículas, in vivo, pelas células do sistema fagocitário mononuclear (SFM) após administração sistêmica (HUWYLER, J.; DREWE, J.; KRAHENBUHL, S. Tumor targetingusingliposomalantineoplasticdrugs. InternationaIJournalofNanomedicine. v. 3, n. 1, p. 21-29, 2008. VEMURI, S.; RHODES, C.T.Preparationandcharacterizationofliposomes : a review. Current Science, v. 68, p. 715- 724, 1995).O SFM é parte integrante do sistema imunológico e consiste em células fagocíticas localizadas no baço, linfonodo e fígado (na forma de células de Kupffer) as quais podem remover carreadores lipídicos da circulação sanguínea em minutos (DEVINE, D.V.; WONG, K.; SERRANO, K. et al. Liposome-complementinteractions in ratserum: Implications for liposomesurvivalstudies. BiochimicaBiophysica Acta, v.1191, p.43-51, 1994).

[006] Alguns tipos especiais de lipossomas, denominados de circulação prolongada, são capazes de permanecer por maior tempo na circulação driblando o processo de opsonização pelo SFM, e possibilitando, desta forma, um aumento na biodisponibilidade das substâncias veiculadas nessas formulações (TORCHILIN VP. Multifunctional and timuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. EuropeanJournalofPharmacyandBiopharmacy, v. 71, n. 3, p. 431-444, 2009). O maior tempo de permanência desses lipossomas na corrente sanguínea se deve à presença, em sua superfície, de componentes hidrofílicos naturais como o monossialogangliosídeo GM1 e fosfatidilinositol, ou de polímeros hidrofílicos sintéticos, especificamente os polietilenoglicóis (PEG). Essa modificação química previne o processo de opsonização por meio da blindagem da carga superficial das partículas, aumento da hidrofilicidade da superfície, elevação das interações repulsivas entre os lipossomas “peguilados” e os componentes plasmáticos bem como a formação de uma barreira polimérica que é impermeável às opsoninas (TORCHILIN, V.P. Targeted pharmaceutical nanocarriers for câncer therapy and imaging.The AAPS Journal, v. 9, n. 2, p.E128-E147, 2007). Concentrações de 5-10 % de distearoilfosfatidiletanolamina acoplado a PEG (DSPE-PEG) de massa molecular 1000-2000 Da conferem excelente estabilidade às formulações (ULRICH, A. S. Biophysicalaspectsofusingliposomes as delivery vehicles. BioscienceReports, v. 22, p. 129-150, 2002).

[007] A aplicabilidade dessas formulações para o tratamento de câncer tem sido demonstrada por diversos estudos. O exemplo de maior sucesso foi o desenvolvimento do produto Doxil®, uma formulação lipossomal composta por fosfatidilcolina de soja completamente hidrogenada, DSPE-PEG2000 e colesterol, contendo DXR. Estudos clínicos demonstraram que o Doxil® apresentou um menor clearance plasmático (0,1 x 25 L/h para o Doxil® e DXR livre, respectivamente) e menor volume de distribuição (4 x 200 L para o Doxil® e DXR livre, respectivamente). A meia-vida plasmática do Doxil® foi cerca de 450 vezes maior que do fármaco livre (30 a 90 h x 12 minutos para o Doxil® e DXR livre, respectivamente) (GABIZON A, SHMEEDA H, BARENHOLZ Y. Pharmacokineticsofpegylatedliposomaldoxorubicin. ClinicalPharmacokinetic, v.42, n.5, p.419-436, 2003). O Doxil® é, atualmente, aprovado pelo FDA e EMA para o tratamento de sarcoma de Kaposi e câncer ovariano.

[008] Alguns dos principais obstáculos quanto ao uso de lipossomas convencionais ou de circulação prolongada, entretanto, têm sido sua lenta liberação e a ausência de atividade fusogênica após internalização no compartimento endossomal. A fim de superar essas dificuldades, lipossomas contendo compostos com propriedade fusogênica, denominados lipossomas pH-sensíveis (SpHL), têm sido desenvolvidos. Esses lipossomas são estáveis em pH fisiológico, mas após entrarem em contato com o meio ácido, como é o caso do pH extracelular de tecidos tumorais e o compartimento endossomal, se desestabilizam, permitindo a interação com as membranas biológicas e liberam o conteúdo encapsulado no citoplasma celular (SUDIMACK, J.J, GUO, W„ TJARKS, W„ LEE, R.J. A novel pH- sensitive liposome formulation containing oleylalcohol. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1564, p. 31-37, 2002).

[009] A dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) constitui o principal componente na maioria das formulações usadas para o preparo de SpHL. Esse fosfolípide apresenta urn grupamento polar pequeno, a etanolamina, que é muito pouco hidratado e ocupa um menor volume quando comparado à respectiva cadeia hidrocarbônica. Essas características conferem à DOPE um formato de cone que impede, portanto, a formação de uma fase lamelar. A intercalação de moléculas anfifílicas contendo um grupo ácido ionizável (negativamente carregado em pH fisiológico), como o hemisuccinato de colesterila (CHEMS), entre as moléculas de DOPE, favorece uma repulsão eletrostática entre os grupamentos fosfato da DOPE e os grupamentos carboxilatos do CHEMS, permitindo a formação de bicamadas, e portanto, conduzindo à formação de lipossomas em pH e temperatura fisiológica. A exposição dos lipossomas pH-sensíveis a um meio ácido leva à protonação do agente estabilizante anfifílico resultando na desestabilização lipossomal e liberação do material encapsulado (BERGSTRAND, N., ARFVIDSSON, M.C., KIM, JONG-MOK., THOMPSON, D.H., EDWARDS, K. Interactions between pH- sensitiveliposomesandmodelmembranes. BiophysicalChemistry, v. 104, p. 361-379, 2003.SIMÕES S, MOREIRA JN, FONSECA C, DÜZGÜNES N, DE LIMA MCP. On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times.Advanced Drug Delivery Reviews, v. 56, n. 7, p. 947-965, 2004).

[010] A associação do fosfolipide DSPE-PEG aos lipossomas pH-sensíveis contendo DOPE:CHEMS possibilita um aumento no tempo de circulação desses lipossomas mantendo-se as propriedades de pH-sensibilidade (DRUMMOND, D. C.; MEYER, O.; HONG, K.; KIRPOTIN, D. B.; PAPAHADJOPOULOS, D. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors. PharmacologyReviews. v. 54, n. 4, p. 691- 743, 1999.SIMÕES S, MOREIRA JN, FONSECA C, DÜZGÜNES N, DE LIMA MCP. On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 56, n. 7, p. 947-965, 2004).

[011] Todos os tipos de lipossomas descritos anteriormente, se acumulam de forma passiva nos tumores, devido ao aumento da permeabilidade vascular e fluxo sanguíneo nessa região. Uma estratégia para aumentar a seletividade dos lipossomas pela região tumoral é através da modificação da superfície dos lipossomas por adição de um ligante que possua alta afinidade pela região-alvo. Estes passam, então, a se acumular na região de interesse por um processo chamado de captação ativa (FORSSEN, E.; WILLIS, M. Ligand-targeted liposomes. AdvancedDrug Delivery Reviews v. 29, n. 3, p. 249-271, 1999.SURENDIRAN, A.; SANDHIYA, S.; PRADHAN, S. C.; ADITHAN, C. Novel applications of nanotechnology in medicine. Indian Journal of Medical Research, v. 130, p. 689-701,2008).

[012] Diversas doenças ósseas, dentre elas os tumores, apresentam um intenso processo de remodelação óssea, com deposição de hidroxiapatita na forma amorfa, substância para a qual os bifosfonatos possuem alta afinidade (Shea & Miller, 2005). A modificação superficial de nanossistemas por inserção de bifosfonatos, dentre eles o alendronato (AL) tem demonstrado aumento da captação dos lipossomas nas regiões ósseas acometidas por tumor e aumento da eficácia da terapia antitumoral (ANADA, T.; TAKEDA, Y.; HONDA, Y.; SAKURAI, K.; OSAMO, S. Synthesisofcalciumphosphate- bindingliposome for drug delivery. Bioorganicand Medicinal ChemistryLetters, v.19, p.4148-4150, 2009.SALERNO, M; CENNI, E.; FOTIA, C.; AVNET, S.; GRANCHI, D.; CASTELLI, F.; MICIELI, D.; PIGNATELLO, R.; CAPULLI, M.; RUCCI, N.; ANGELUCCI, A.; DEL FATTORE, A.; TETI, A.; ZINI, N.; GIUNTI, A.; BALDINI, N. Bone-targeted doxorubicin- loaded nanoparticles as a tool for thetreatment of skeletal metastases. CurrentCancerDrugTargets, v.10, p. 649-659, 2010).

[013] O documento WO 2010143193 A1, descreve a utilização de lipossomas contendo bisfosfonatos, inclusive alendronato, para o tratamento de diversas doenças, incluindo os tumores ósseos. Contudo, a tecnologia descrita no documento supracitado utiliza o folato como agente para direcionamento e o alendronato, encapsulado no interior dos lipossomas, como fármaco adjuvante para o tratamento de tumores, ou seja, o alendronato não teria função especificamente terapêutica. Nesse caso, a formulação teria afinidade específica para qualquer tumor que expresse de forma exacerbada o receptor para folato. Na invenção contemplada neste pedido de patente, entretanto, o bifosfonato é conjugado à superfície lipossomal, possibilitando que a formulação apresente uma grande afinidade por regiões de intenso turnover ósseo, incluindo, mas não limitando, a tumores ósseos. Na presente invenção, a doxorrubicina foi encapsulada como fármaco, entretanto, este fármaco poderia ser substituído por outros fármacos para o tratamento de doenças ósseas que levam ao aumento da atividade osteoclástica, como tumores, inflamações e infecções.

[014] O documento OsteotropicTherapy via Targeted Layer-by-Layer Nanoparticles, investiga uma abordagem para a geração de carreadores funcionais, mediante a deposição camada por camada, de drogas direcionadas especificamente para o tratamento de osteossarcoma primário. Os lipossomas são compostos basicamente por lípides e a incorporação de outras classes de substâncias pode alterar significativamente sua organização estrutural e, consequentemente, suas características físico-químicas e comportamento cinético. No caso da tecnologia acima citada, há associação do alendronato a moléculas de ácido poliacrílico (um polímero sintético). A incorporação deste polímero modificado à superfície lipossomal se dá por um processo de deposição camada por camada, pela intercalação com poli-L-lisina. É sabido, ainda, que esses polímeros não são bioerosíveis, o que implica na formação de uma formulação em que a estrutura lipossomal passa a ter função apenas de suporte para esse agente de direcionamento e reservatório do fármaco, sem participação direta na interação com componentes biológicos. Na presente invenção, por outro lado, o alendronato foi incorporado à superfície liposomal por associação a um lípide estrutural (DSPE-PEG34oo)- Isso permitiu a realização de importantes alterações na composição lipossomal a fim de melhorar a interação com o meio biológico, o que garante um maior tempo de circulação da formulação no organismo e maior possibilidade de entrega do fármaco diretamente na região tumoral, aumentando a eficácia e diminuindo a toxicidade. Portanto, apesar da semelhança entre a tecnologia citada e a presente invenção quanto à aplicação da formulação, há diferenças importantes tanto entre os ligantes, quanto às estruturas das nanopartículas, que levam à obtenção de produtos claramente diferentes.

[015] Desta forma, os lipossomas pH-sensíveis de circulação prolongada e superfície modificada por um bisfosfonato, preferencialmente o alendronato de sódio, contendo fármacos em seu interior, preferencialmente a doxorrubicina, propostos na presente tecnologia, apresentam-se vantajosos por sua diferenciada composição lipídica possibilitar a liberação seletiva de fármacos nas áreas alvo, especialmente DXR nas áreas de tumor ósseo, onde ocorrerá desestabilização dos lipossomas em decorrência do menor pH dessas regiões. Além disso, a modificação superficial dos lipossomas com alendronato de sódio confere uma maior afinidade da formulação pelos tecidos ósseos, favorecendo seu acúmulo no local e proporcionando maior eficácia no tratamento de tumores ósseos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] Figura 1- A Figura 1 mostra as estruturas químicas dos compostos DSPE- PEG3400-NHS e DSPE-PEG3400-AL

[017] Figura 2- A Figura 2 mostra os espectros na região do infravermelho do DSPE- PEG3400-AL (A) e DSPE-PEG3400-NHS (B). A seta indica o desaparecimento do sinal de estiramento de carbonila em 1712 cm-1, referente à eliminação do grupo N- hidroxisuccinimida.

[018] Figura 3- A Figura 3 mostra o espectro de 1H RMN do alendronato de sódio. Os destaques representam a estrutura química do alendronato de sódio em (A) e a ampliação da região do espectro entre os valores de δ igual a 1,7 e 3,3 ppm em (B).

[019] Figura 4- A Figura 4 refere-se ao espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)1H do DSPE-PEG3400-NHS. A estrutura química do DSPE-PEG3400-NHS é tô mostrada em (A), o aspecto geral do espectro pode ser visto em (B) e a ampliação da região com valores de δ entre 0 e 3,7 ppmem(C).

[020] Figura 5- A Figura 5 refere-se ao espectro de RMN1H do DSPE-PEG3400-AL. A estrutura química do DSPE-PEG3400-AL é mostrada em (A), o aspecto geral do espectro pode ser visto em (B) e a ampliação da região com valores de δ entre 0 e 3,9 ppm em (B).

[021] Figura 6- A Figura 6 refere-se aos cromatogramas padrão da DXR (A) e dos componentes da formulação (B)

[022] Figura 7- A Figura 7mostra a representação esquemática do processo de encapsulação da encapsulação da DXR nos SpHL-AL.

[023] Figura 8- A Figura 8 mostra as curvas de DSC dos componentes dos SpHL AL (linha azul) e SpHL-AL-DXR (linha vermelha)

[024] Figura 9- A Figura 9 refere-se ao difratograma dos SpHL-AL explicitando os diferentes padrões de difração para a formulação quando submetida aos pHs igual a 7,4 (linha preta); 5,0 (linha vermelha) e 4,0 (linha azul). Os índices em azul representam as razões de reflexão de Bragg das fases lamelares, enquanto os índices vermelhos representam a fase hexagonal.

[025] Figura 10- A Figura 10 refere-se aos difratogramas dos SpHL-AL-DXR , explicitando os diferentes padrões de difração para a formulação quando submetida aos pHs igual a 7,4 (linha preta); 5,0 (linha vermelha) e 4,0 (linha azul). Os índices em azul representam as razões de reflexão de Bragg das fases lamelares, enquanto os índices vermelhos representam a fase hexagonal.

[026] Figura 11- A Figura 11 representa as variações do diâmetro médio e IP dos SpHL- AL durante o armazenamento a 4°C. * indica diferença estatisticamente significativa (p<0,05) em comparação ao tempo zero.

[027] Figura 12- A Figura 12 representa as variações do potencial zeta dos SpHL-AL durante o armazenamento a 4°C.

[028] Figura 13- A Figura 13 representa as curvas de inibição das células MDA-MB-231 quando incubadas por 48 horas com DXR livre (A) ou SpHL-AL-DXR (B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[029] A presente invenção diz respeito a lipossomas pH-sensíveis com superfície modificada por um bisfosfonato, contendo fármaco em seu interior, objetivando a preparação de formulações para o tratamento de doenças ósseas.

[030] O bisfosfonato utilizado deve ser preferencialmente o alendronato de sódio, e o fármaco deve ser preferencialmente a doxorrubicina.

[031] A invenção pode ser melhor compreendida através dos exemplos abaixo, não limitantes.

EXEMPLO 1- SÍNTESE DO COMPOSTO DSPE-PEG3400-AL

[032] Em um balão de fundo redondo foram adicionados DSPE-PEG3400-NHS (Figura 1) , alendronato de sódio e hidróxido de sódio. Essas substâncias foram solubilizadas em quantidade suficiente de DMSO e mantidas sobre agitação mecânica. Posteriormente, a mistura foi transferida para um cadinho de porcelana e o DMSO evaporado sob fluxo de ar. O pó resultante foi redisperso em quantidade suficiente de solução de ácido clorídrico e transferido para um funil de separação ao qual adicionou-se diclorometano.

[033] Agitou-se a mistura, aguardou-se a separação das fases orgânica e aquosa, e recolheu-se a fase orgânica em um erlemeyer. O processo de adição do diclorometano e recolhimento da fase orgânica foi repetido por cinco vezes. A mistura obtida foi, então, submetida à filtração à vácuo e o filtrado foi submetido à evaporação até secura em evaporador rotativo acoplado a uma bomba de vácuo. O produto de reação obtido (DSPE- PEG3400-AL) está representado na Figura 1.

[034] Amostras de DSPE-PEG3400-NHS e do DSPE-PEG3400-AL sólidos foram submetidos à aquisição de espectros na região do infravermelho utilizando um espectrofotômetro com transformada de Fourier Perkin-Elmer, modelo Spectrum One (Santa Clara, EUA). Além disso, amostras de alendronato de sódio, DSPE-PEG3400-NHS e do DSPE-PEG3400-AL foram solubilizadas ou dispersas em água deuterada e submetidas à aquisição de espectros de RMN de 1H.

EXEMPLO 2- PREPARO DE LIPOSSOMAS pH-SENSÍVEIS DE CIRCULAÇÃO PROLONGADA E SUPERFÍCIE MODIFICADA COM ALENDRONATO CONTENDO DXR (SPHL-AL-DXR)

[035] Os lipossomas foram preparados pela técnica de hidratação do filme lipídico (BANGHAM, A. D.; STANDISH, M. M.; WATKINS, J. C. Diffusionofunivalentionsthelamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology, v. 13, p. 238-252, 1965), seguido de calibração de tamanho por extrusão. Alíquotas de soluções clorofórmicas de DOPE, CHEMS e DSPE-PEG3400-AL foram transferidas para um balão de fundo redondo. O solvente foi removido utilizando um evaporador rotativo. Ao filme lipídico obtido foi adicionada quantidade suficiente de solução de NaOH (0,1 mol.L-1) para promover a completa ionização do CHEMS, e este foi então hidratado com solução de sulfato de amónio (300 mmol.L-1 pH 7,4) à temperatura ambiente, com auxílio de um mini-shaker. A dispersão de vesículas multilamelares resultante foi calibrada mediante sua passagem em membranas de policarbonato da marca Millipore de 0,4 μm, 0,2 μm e 0,1 μm.

[036] Para a incorporação da DXR na formulação foi utilizado o método de encapsulação remota por gradiente de sulfato de amónio. A formulação lipossomal foi ultracentrifugada, a 150.000 g, 4°C, durante 90 minutos. Após o ciclo de ultracentrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi reconstituído com solução tampão HEPES-salina (HBS) pH 7,4, mantendo-se a concentração lipídica de 10 mmol.L-1 . Cada 1 mL da dispersão de lipossomas foi adicionada sobre 2 mg de cloridrato de DXR liofilizado e a mistura resultante foi mantida por 12 h sob refrigeração a 4 °C.

[037] Após a encapsulação da DXR, os SpHL-AL-DXR foram purificados por meio de ultracentrifugação, a 150.000 g, 4°C, durante 90 minutos. Após o ciclo de ultracentrifugação, foram obtidos o pellet (fração purificada) e o sobrenadante (fração contendo impurezas). O pellet foi reconstituído com solução tampão HBS pH 7,4, mantendo-se a concentração lipídica de 10 mmol.L-1. Os SpHL-AL foram preparados pela mesma técnica descrita acima sem, entretanto, adicionar-se o fármaco (DXR).

EXEMPLO 3- ANÁLISE POR INFRAVERMELHO DOS COMPOSTOS DSPE-PEG3400- NHS e DSPE-PEG3400-AL

[038] Os espectros na região do infravermelho do DSPE-PEG3400-NHS e do DSPE- PEG3400-AL estão representados na Figura 2. É possível observar uma banda de estiramento de ligação C=O de carbonila em 1712 cm-1 no espectro do DSPE-PEG3400- NHS. Esse sinal é correspondente às duas carbonilas do grupamento succinil do N- hidroxisuccinimida (NHS). No espectro do produto, é possível verificar o desaparecimento dessa banda, condizente com a eliminação do grupo NHS e sua substituição pelo alendronato.

EXEMPLO 4- ANALISE POR RMN DO ALENDRONATO DE SÓDIO, DO DSPE- PEG3400-NHS E DO DSPE-PEG3400-AL

[039] O espectro de RMN de 1H do alendronato de sódio (Figura 3) apresenta um multipleto com δ = 2,01 ppm, em relação ao tetrametilsilano (TMS), e integral 4, referente aos hidrogénios H2 e H3. Outro pico, com δ = 3,04 ppm, na forma de um tripleto, e integral igual a 2, é observado. Esse sinal é relativo aos hidrogénios H4, que estão mais desblindados devido à proximidade com o grupo amino. No espectro do DSPE-PEG3400- NHS (Figura 4) é possível observar um simpleto intenso com δ = 3,61 ppm. Esse pico representa os hidrogénios das repetições de óxido de etileno da cadeia PEG. Um multipleto centrado em 1,19 ppm representa os hidrogénios H3 a H17 de ambas cadeias carbônicas do fosfolípide. Os hidrogénios vizinhos às carbonilas das cadeias laterais podem ser visualizados em valor de δ igual a 1,50. O simpleto em δ = 0,79 ppm está relacionado aos hidrogénios terminais de ambas as cadeias carbônicas laterais do DSPE- PEG3400-NHS. Já o simpleto centrado cm δ= 2,69 ppm representa os quatro hidrogénios do grupo NHS. Ao analisar o espectro de RMN de 1H do DSPE-PEG3400-AL (Figuraõ), é possível verificar a diminuição do pico em δ = 2,61 ppm, condizente com a eliminação do grupo NHS da molécula de DSPE-PEG3400-NHS. Além disso, é possível perceber o aparecimento de picos em δ = 1,92 ppm e 2,95 ppm, que estão relacionados à inserção do alendronato à molécula de DSPE-PEG3400-AL.

EXEMPLO 5 - DETERMINAÇÃO DO DIÂMETRO E DO POTENCIAL ZETA DAS VESÍCULAS

[040] A análise do diâmetro médio das partículas foi realizada por espectroscopia de correlação de fótons à 25°C e ângulo de 90°. O potencial zeta foi avaliado por espalhamento dinâmico da luz associado à mobilidade eletroforética, a um ângulo de 90°. As amostras foram diluídas em tampão HBS pH 7,4 e as medidas foram efetuadas utilizando-se o equipamento Zetasizer 3000Hs.

[041] As características químicas e físico-químicas dos SpHL-AL e SpHL-AL-DXR estão apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 - Determinação do diâmtero médio, IP, distribuição de tamanho por número e potencial zeta (Ç) das formulações SpHL-AL e SpHL-AL-DXR

* Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Não houve diferença estatisticamente significativa (p< 0.05) para nenhum dos resultados quando analisados pelo teste-l Para a amostra SpHL-AL os parâmetros foram realizados com n = 3 e para a amostra SpHL-AL-DXR realizou-se as análises com n = 5.

[042] As partículas apresentaram diâmetro médio inferior a 200 nm e 100 % das partículas foram menores que 500 nm. Vesículas lipossomais de diâmetro médio dessa grandeza apresentam uma eficiência de encapsulação razoável; adequado tempo de circulação sanguínea; são mais estáveis; e são capazes de se extravasarem dos vasos sanguíneos em regiões tumorais (LITZINGER, D.C.; BUITING, A.M.; VAN ROOIJEN, N.; HUANG, L Effectofliposomesizeonthecirculation time andintraorgandistributionofamphipathicpoly(ethyleneglycol)-containingliposomes. Biochimica et Biophysica Acta, v.1190, n.1, p.99-107, 1994). O IP reflete a distribuição do tamanho das vesículas na dispersão coloidal e pode variar de 0,0 a 1,0 para sistemas mono e polidispersos, respoctivamente. As formulações apresentaram valores de IP menores que 0,1 que indicam boa homogeneidade dos sistemas. Essa formulação pode ser considerada monodispersa (NEW, R.R.C. Liposomes - a practical approach. Oxford: Oxford University Press, 1990).

[043] Em relação ao potencial zeta, ambas as formulações apresentam valores negativos, que pode estar relacionado com a presença dos grupos fosfonatos na superfície da formulação. Isso pôde ser comprovado pela avaliação do potencial zeta de uma formulação lipossomal contendo DXR, na qual o DSPE-PEG3400-AL foi substituído por DSPE-PEG2000, preparada pela mesma metodologia acima descrita. Essa formulação apresentou valores de potencial zeta significativamente menos negativos (-7,1 ± 0,7 mV). Os valores de potencial zeta encontrados para os SpHL-AL-DXR podem garantir uma maior estabilidade da formulação, uma vez que as cargas superficiais negativas podem gerar repulsão entre as partículas, dificultando a agregação (NEW, R.R.C. Liposomes-a practical approach. Oxford; Oxford University Press, 1990).

[044] Não houve alterações significativas no diâmetro médio, IP, distribuição de tamanho e potencial zeta das partículas após a incorporação da DXR, indicando que a interação do fármaco com o lipossoma não causa alterações estruturais importantes na formulação. Esse comportamento é típico de fármacos que são encapsulados no núcleo aquoso da formulação lipossomal, sem interação química com a bicamada lipídica.

EXEMPLO 6- ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) E DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ENCAPSULAÇÁO DE DXR NOS SPHL-AL- DXR

[045] Para a quantificação da DXR nos SpHL-AL-DXR, foram utilizadas seis amostras da formulação. A membrana lipídica dos lipossomas foi aberta com álcool isopropílico na proporção 1:2 (v/v) e, em seguida, a preparação foi diluída com o sistema eluente até atingir uma concentração teórica de DXR igual a 40 ng.mL' e injetada no cromatógrafo. A quantidade de DXR foi determinada nos lipossomas antes (lipossomas não purificados) e após a ultracentrifugação (lipossomas purificados). O teor de encapsulação (TE) da DXR foi calculado de acordo com a seguinte equação:

[046] O aparato cromatográfico consistiu de uma bomba modelo 515, um auto-injetor modelo 717 Plus e um detector de fluorescência modelo 2475 (Waters Instruments, Milford, EUA) monitorados por um computador utilizando o software Empower Pro® versão 6.00.00.00. Utilizou-se uma coluna ACE® CB 4,6 mm x 250 mm, 5 µm (Merck S.A. Indústrias Químicas, Darmstadt, Alemanha). A fase móvel foi constituída pela mistura metanol:tampão fosfato 0,01 mol.L-1 pH 3,0 na proporção volumétrica de 65:35, respectivamente. O volume de injeção das soluções foi de 20 µL, com tempo de corrida de 7,0 min, sendo mantida a velocidade de fluxo da fase móvel igual a 1,0 ml.min-1. O material eluído foi detectado em comprimento de onda de excitação igual a 470 nm e emissão igual a 555 nm.

[047] O desenvolvimento da metodologia analítica para doseamento de DXR por CLAE foi realizada através da determinação dos parâmetros de especificidade e linearidade. A especificidade do método de CLAE foi avaliada através da comparação do tempo de retenção do pico de DXR e os picos obtidos após a injeção de SpHL-AL. A linearidade do método de quantificação de AU foi avaliada pela construção da curva padrão em fase móvel, no intervalo de concentração de 1 O a 200 ng.ml-1.

[048] A DXR apresentou tempo de retenção de 4,83 minutos. O cromatograma obtido para os componentes dos lipossomas não apresentou nenhum pico interferente próximo ao tempo de retenção da DXR nos comprimentos de onda avaliados (A exc=477 nm e Aem =555 nm). Um cromatograma padrão da DXR assim como da formulação branca estão representados na Figura 6. A linearidade do método de quantificação de DXR foi confirmada no intervalo de concentração avaliado (10-200 ng/ml), com um coeficiente de correlação maior que 0,9998 e uma equação linear igual a y = 12203x + 10403.

[049] O teor de encapsulação médio para os SpHL-AL-DXR foi de 94,7 ± 7,7 %. Esse elevado teor de encapsulação pode ser explicado pelo método de encapsulação utilizado (Figura 7). Para a encapsulação, a DXR é solubilizada em tampão HBS pH 7,4 enquanto o interior do lipossoma contem solução de sulfato de amónio 300 mmol.L-1 pH 7,4. A DXR é capaz de atravessar a membrana lipossomal por difusão passiva e atingir o seu interior aquoso, onde interage com os íons sulfato formando sulfato de DXR, que é um sal insolúvel. Com isso, há geração de um gradiente que permite a encapsulação de praticamente toda a DXR (BARENHOLZ, Y. Liposomeapplication: problemsandprospects. Currentopinion in Colloid& Interface Science, v.6, p.66-77, 2001).

EXEMPLO 7- AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO TÉRMICO DA MISTURA DE LÍPIDES DOS SPHL-AL E SPHL-AL-DXR POR CALORIMETRIA EXPLORATÓRIA DIFERENCIAL (DSC)

[050] Alíquotas de DOPE, CHEMS, DSPE-PEG3400-AL, tampão HBS e DXR (mistura referente aos SpHL-AL-DXR) ou DOPE, CHEMS, DSPE-PEG3400-AL, tampão HBS (mistura referente aos SpHL-AL), previamente secas, contendo as massas equivalentes às encontradas em 1 mL da formulação lipossomal foram adicionadas em um cadinho de alumínio. Os cadinhos contendo as amostras foram mantidos em uma cuba de hidratação, com umidade relativa igual a 39%, até atingirem um teor de umidade entre 10 e 15 %. As análises calorimétricas foram realizadas em um aparelho de DSC, no intervalo de temperatura de -50 °C a 80 °C, com uma taxa de aquecimento de 5 °C/min. As amostras foram submetidas a duas corridas consecutivas a fim de permitir uma maior homogeneização do conteúdo colocado nos cadinhos. Os dados obtidos foram analisados pelo software de isotermas do próprio equipamento. As temperaturas de transição foram determinadas pela posição dos picos observados nas curvas de DSC. As curvas de DSC dos componentes dos SpHL-AL e SpHL-AL-DXR estão representados na Figura 8.

[051] Na curva da mistura dos componentes da formulação SpHL-AL é possível perceber um pico exotérmico na temperatura de -3 °C, o qual se refere à cristalização do CHEMS, e três picos endotérmicos centrados em 16 °C, 48 °C e 54 °C. O sinal centrado em 16 °C corresponde, provavelmente, à transição de fase Lα-HII da DOPE em presença de CHEMS. Os sinais centrados em 48 °C e 54 °C podem estar relacionados à fusão das moléculas de DSPE-PEG3400-AL que se encontram distribuídas de forma heterogênea na bicamada lipídica. Esses resultados estão de acordo com dados relatados previamente na literatura com derivados lipídicos semelhantes (DSPE-PEG-MAL-3400, MSDS, 2013).

[052] É possível perceber que o perfil da curva de DSC dos componentes dos SpHL-AL- DXR é semelhante ao descrito anteriormente. Esse resultado indica uma baixa interação da DXR com os componentes lipídicos da formulação, o que garante a manutenção da organização estrutural da bicamada lipídica.

EXEMPLO 8 - AVALIAÇÃO DA pH-SENSIBILIDADE DAS FORMULAÇÕES POR DIFRAÇÀO DE RAIOS X DE BAIXO ÂNGULO (SAXS)

[053] As medidas de SAXS foram realizadas nos pellets dos lipossomas obtidos após o processo de preparação descrito previamente. Inicialmente, as amostras dos SpHL-AL e SpHL-AL-DXR foram purificadas por ultracentrifugação a 150.000 x g por 90 min a 4 °C. Em seguida, os sobrenadantes foram descartados e os pellets ressuspensos em tampão HBS em pHs variáveis (7,4; 5,0 e 4,0). As amostras foram novamente submetidas à ultracentrifugação a 150.000 x g por 90 min a 4 °C e os pellets obtidos foram analisados por SAXS. Foi utilizado um comprimento de onda fixo (À = 1,488 nm). O detector Pilatus 100k foi posicionado a 1m da amostra. A região em espaço recíproco variou de qmin= 0,15 nm-1 até qmax= 4,0 nm-1. As amostras foram depositadas em anéis de metal que foram vedados por um filme de poliimida e acoplados a um sistema de aquecimento DSC- Linkam.

[054] Os difratogramas adquiridos à 30 °C para o SpHL-AL estão representados na Figura 9. Para os SpHL-AL em pH 7,4 é possível verificar duas fases lamelares com razões de reflexão de Bragg iguais a 1 e 2. A primeira fase lamelar apresenta valores de q iguais a 0,435 e 0,893 nm-1, o que corresponde à uma distância interplanar de 14,38 nm, coerente com a presença de uma fase lamelar rica em DSPE-PEG3400-AL (GARBUZENKO, O.; BARENHOLZ, Y, PRIEV, A Effect of grafted PEG on liposome size andon compressibility and packing f lipid bilayer. Chemistry and Physics of Lipids, v.135, p.117-129, 2005). Verifica-se ainda, a presença de dois picos em valores de q = 1,434 nm-1 (d = 4,38 nm) e 2,852 nm-1, referentes a uma fase lamelarisenta de DSPE-PEG (DE OLIVEIRA, M. FATTAL, E.; COUVREUR, P.; LESIEUR, P.; BOURGAUX, C.jOLLIVON, M.; DUBERNET, C. pH-sensitive liposomes as a carrier for oligonucleotides: a physicochemical study of the interaction between DOPE and a 15-meroligonucleotide in quasi- anhydrous samples. BiochimicaetBiophysicaActa. Biomembranes, v.1372, p.301-310, 1998).

[055] Com a diminuição do pH para 5, há o desaparecimento dos sinais referentes às regiões lamelares ricas em DSPE-PEG3400-AL e uma diminuição da intensidade da segunda fase lamelar do sistema. Além disso, é possível verificar o aparecimento de picos com valores de q = 0,978; 1,696; 1,974 e 2,712 nm-1, correspondendo às razões de reflexão de Bragg de 1, \/3, 2, >/7, que é compatível com o surgimento de uma fase hexagonal. Isso indica que os lipossomas sofrem desestabilização neste pH. Em pH mais baixo (pH = 4), é possível perceber uma diminuição da intensidade dos sinais relativos à fase lamelar, com manutenção dos picos relativos à fase hexagonal.

[056] Os difratogramas para os SpHL-AL-DXR estão representados na Figura 10. Em pH 7,4 a 30°C é possível perceber a presença de três fases lamelares, com valores de q = 0,403 e 0,868 nm-1, correspondendo à fase rica em DSPE-PEG3400-AL discutida anteriormente, q = 1,501 e 2,844 nm-1, correspondendo à fase lamelar com menor quantidade de DSPE-PEG3400-AL e q = 1,248; 2,523 e 3,790 nm-1 que corresponde à uma região de interação eletrostática da DXR com os grupos carboxilato do CHEMS e/ou fosfato das moléculas de DOPE e/ou DSPE-PEG3400-AL. Em pH 5, observa-se o desaparecimento dos sinais relativos à fase lamelar de interação DXR- CHEMS/DGPE/DSPE-PEG3400-AL. Além disso, surgem picos com valores de q = 0,961; 1,653; 1,899; 2,515; 2,979; 3,292 e 3,436 nm-1, correspondendo às razões de reflexão de Bragg igual a 1, >/3, 2,A/7, 3, >/l2,^13, condizentes com a formação de uma fase hexagonal.

[057] No pH igual a 4, é possível perceber o completo desaparecimento da fase lamelar rica em DSPE-PEG3400-AL, além de uma intensa diminuição dos picos referentes à terceira fase lamelar do sistema. Os sinais referentes à fase hexagonal aparecem mais intensos, indicando uma maior formação de fase hexagonal nesse pH.

[058] Durante o processo de endocitose, ocorre a acidificação dos endossomas até pH próximo a 5, seguido da fusão com o lisossoma e acidificação até pH próximo a 4. Por tanto, é importante que os lipossomassejam capazes de se desestabilizarem e liberar o conteúdo interno no citoplasma celular antes do processo de fusão, uma vez que os lisossomas são ricos em enzimas que podem levar à degradação do fármaco (SIMÕES S, MOREIRA JN, FONSECA C, DÜZGÜNES N, DE UMA MOP. On the formulation of pH- sensitive liposomes with long circulation times. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 56, n. 7, p. 947-965, 2004). Os resultados das análises por SAXS discutidos nesse exemplo indicam que os lipossomas sintetizados nessa invenção são capazes de liberar a DXR no citoplasma antes do processo de fusão com os lisossomas.

EXEMPLO 9- ESTUDO DE ESTABILIDADE DOS SPHL-AL

[059] Uma vez que a incubação da DXR com os SpHL-AL demonstrou ser capaz de garantir teor de encapsulação adequadoé possível preparar lipossomas brancos (SpHL- AL) para encapsulação do fármaco previamente à aplicação. Com isso, avaliou-se a estabilidade dos SpHL-AL nos períodos de 7, 14, 21,30, 60, 90 e 120 dias após o preparo das formulações, as quais foram mantidas em geladeira a 4 °C. Os parâmetros avaliados foram diâmetro médio e potencial zeta. Os valores médios obtidos foram comparados com aqueles obtidos logo após o preparo das formulações (tempo 0).

[060] Os resultados das análises de diâmetro médio das partículas realizados nos SpHL- AL armazenados a 4°C estão representados na Figura 11. Na primeira semana de armazenamento houve um pequeno aumento do diâmetro médio das partículas de 154 ± 4 nm para 163 ± 3 nm. Após a primeira semana de armazenamento, não houve nenhuma variação estatisticamente significativa no diâmetro médio dos SpHL-AL nos tempos analisados. Apesar do aumento de diâmetro médio no período analisado, a diferença entre o início do armazenamento e o final (4 meses) foi de cerca de 20 nm, indicando uma adequada estabilidade do sistema, sem a presença de agregação das partículas. Esse fato pode ser confirmado pela verificação de que não houve aumento do IP das amostras nos tempos analisados.

[061] Em relação aos valores de potencial zeta (Figura 12), não houve alterações estatisticamente significativa para os SpHL-AL durante o tempo avaliado, com os valores mantendo-se entre -9 e -12 mV. Esses resultados demonstram que não há desestabilização da formulação durante o armazenamento.

EXEMPLO 10- AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS SPHL-AL-DXR

[062] Para determinar a atividade citotóxica dos SpHL-AL-DXR, foi avaliado “in vitro" o efeito desses sobre a proliferação de células de câncer de mama de origem humana MDA-MB-231. As células foram mantidas em garrafas de cultura celular T-75 contendo meio de cultura DMEM suplementado com 10 % de SFB e com os antibióticos penicilina (100 Ul.mL-1) eestreptomicina (100 mg.mL-1). As culturas foram mantidas em estufa úmida, contendo 5 % de CO2, a 37 °C. A citotoxicidade foi avaliada por meio do ensaio de metabolização do MTT. As células foram coletadas nos frascos de cultura por meio do uso de tripsina, que foi, posteriormente, inativada com DMEM + 10 % SFB. A suspensão das células foi centrifugada e suspensa em 1 mL de meio de cultura. Após a contagem no hemocitômetro, 3x103 células/poço foram inoculadas em placas de 96 poços e mantidas em estufa úmida, contendo 5 % de CO2, a 37 °C por 24 horas.

[063] DXR livre (n = 13) e SpHL-AL-DXR (n = 8) foram adicionados em diferentes concentrações (1 - 500 nmol.L-1), após diluição em DMEM + 10 % SFB. Para os grupos controle foram adicionados somente meio de cultura (isento de tratamento) ou SpHL-AL (n = 3) diluídos em meio de cultura. As células foram novamente incubadas, em estufa úmida, contendo 5 % de CO2, a 37 °C, por 48 horas.

[064] Após esse tempo, o meio de cultura das placas foi removido e adicionou-se 100 μL de solução de MTT (0,5 mg.mL-1) e DMEM + 10 % SFB em cada poço. As amostras foram mantidas na estufa por duas horas para metabolização do MTT. Após esse período, foram adicionados 100 μL de dodecilsulfato de sódio 10 % (p/v) em HCI 0,1 mmol.L-1 por poço e as placas incubadas por 18 horas para solubilização dos cristais de formazan. A leitura dos valores de absorbância da solução resultante foi realizada a 595 nm em um leitor automático de microplacas. Os valores de densidade óptica do grupo controle (isento de tratamento) foram considerados como 100 % para cálculo da porcentagem de alteração da viabilidade celular induzida pelos tratamentos. Os resultados foram expressos em percentual de inibição (PI) em relação à cultura controle e esses foram utilizados para a determinação da concentração inibitória de 50 % (IC50).

[065] Após a incubação das células MDA-MB-231 com DXR livre e SpHL-AL-DXR por 48 horas, foi realizada a avaliação da viabilidade celular pelo ensaio de MTT. As curvas de % inibição em relação ao logaritmo decimal da concentração de DXR foram construídas (Figura 13) e o valor de IC50 foi calculado. Os valores de IC50 calculados para a DXR livre e SpHL-AL-DXR foram iguais a 120 ± 15 nM e 153 ± 20 nM. Os resultados são estatisticamente semelhantes (p > 0,05) e indicam que a encapsulação da DXR nos lipossomas não prejudica a sua citotoxicidade.

Claims (2)

1. Lipossomas pH-sensíveis compostos por dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), hemisuccinato de colesterol (CHEMS) e o lípide peguilado distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE-PEG), com concentração lipídica de 10 mmol.L-1, caracterizados pelo DSPE-PEG estar covalentemente ligado ao alendronato, formando uma molécula híbrida DSPE-PEG3400- AL, estando o alendronato exposto na superfície do lipossoma, o qual contém, em seu interior, a doxorrubicina (DXR), na concentração de 2 mg de cloridrato de DXR por mL da dispersão de lipossomas 10 mmol.L-1 em solução tampão pH 7,4.

2. Uso dos lipossomas pH-sensíveis definidos na reivindicação 1, caracterizado por ser para a produção de composições para o tratamento de doenças que geram alta atividade osteoclástica, como tumores ósseos, inflamações e infecções.

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