BR102015009427A2 - Composições de lipossomas multifuncionalizados com agentes antineoplásicos, processo de preparação e uso - Google Patents

Abstract

composições de lipossomas multifuncionalizados com agentes antineoplásicos, processo de preparação e uso a presente invenção descreve composições farmacêuticas de lipossomas multifuncionalizados contendo paclitaxel ou outros fármacos com atividade antitumoral, processo de obtenção e uso. o processo proposto permite a produção de formas farmacêuticas de lipossomas ph-sensíveis com alta afinidade pelos receptores de folato, expressos em grande quantidade nas células do tecido tumoral. assim sendo, propõe-se o uso dessas composições como antitumorais.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES DE LIPOSSOMAS MULTIFUNCIONALIZADOS COM AGENTES ANTINEOPLÁSICOS, PROCESSO DE PREPARAÇÃO E USO (51) Int. Cl.: A61K 9/127; A61K 47/44; A61K 31/337; A61P 35/00 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS, UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI, FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE MINAS GERAIS - FAPEMIG (72) Inventor(es): ELAINE AMARAL LEITE; MARCOS VINÍCIUS BARBOSA; LIZIANE OLIVEIRA FONSECA MONTEIRO; ALVARO DUTRA DE CARVALHO JÚNIOR; MÔNICA CRISTINA DE OLIVEIRA; GUILHERME CARNEIRO (57) Resumo: COMPOSIÇÕES DE LIPOSSOMAS MULTIFUNCIONALIZADOS COM AGENTES ANTINEOPLÁSICOS, PROCESSO DE PREPARAÇÃO E USO A presente invenção descreve composições farmacêuticas de lipossomas multifuncionalizados contendo Paclitaxel ou outros fármacos com atividade antitumoral, processo de obtenção e uso. O processo proposto permite a produção de formas farmacêuticas de lipossomas pH-sensíveis com alta afinidade pelos receptores de folato, expressos em grande quantidade nas células do tecido tumoral. Assim sendo, propõe-se o uso dessas composições como antitumorais.

o pH

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COMPOSIÇÕES DE LIPOSSOMAS MULTIFUNCIONALIZADOS COM AGENTES ANTINEOPLÁSICOS, PROCESSO DE PREPARAÇÃO E USO [01] A presente invenção descreve composições farmacêuticas de lipossomas multifuncionalizados contendo Paclitaxel ou outros fármacos com atividade antitumoral, processo de obtenção e uso. O processo proposto permite a produção de formas farmacêuticas de lipossomas pHsensíveis com alta afinidade pelos receptores de folato, expressos em grande quantidade nas células do tecido tumoral. Assim sendo, propõese o uso dessas composições como antitumorais.

Estado da Técnica [02] Os tumores malignos sólidos são estruturas semelhantes a órgãos, porém heterogêneos, com arquitetura complexa e algumas peculiaridades em relação ao tecido normal. Com a alta taxa metabólica e de proliferação, as células neoplásicas necessitam de nutrientes para a manutenção de sua atividade. Assim, para garantir o suprimento sanguíneo adequado, induzem o desenvolvimento de uma nova rede vascular a partir de vasos sanguíneos pré-existentes e/ou de células tronco endoteliais circulantes, em um processo chamado angiogênese, que contribui para o crescimento tumoral e metástase. Caso contrário, a massa tumoral não poderia crescer mais do que 1 a 2 mm de diâmetro (CHUA. T. C.; YAO, P.; AKTHER, J.; MORRIS, D. L. Impact of tumor angiogenesis in peritoneal mesothelioma after radical cytoreduction and hyperthermic intraperitoneal chemotherapy. Pathology and Oncology Research, v. 16, p. 217-222, 2010; JUN, H. Y.; YIN, H-H.; KIM, S-H.; PARK, S. H.; YOON, K-Y. Visualization of tumor angiogenesis using MR imaging contrast agent Gd-DTPA-anti-VEGF receptor 2 antibody

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2/29 conjugate in a mouse tumor model. Korean Journal of Radiology, v.11, p. 449-456, 2010). Esses novos vasos são dilatados, tortuosos, com ramificações e não possuem organização em arteríolas, capilares e vênulas, porém compartilham características de todas essas estruturas. Suas paredes podem ter fenestrações e membranas basais descontínuas ou ausentes, além de apresentarem deficiência de um sistema de vasos linfáticos.

[03] Outra característica marcante dos tecidos tumorais reside no fato do pH extracelular (pHe) ser mais ácido que o pH do tecidos normais. O pH intracelular (pHi) de ambos os tecidos é relativamente similar pois há a necessidade de se manter um ambiente adequado às várias atividades citoplasmáticas. Essa diferença entre o tecido normal e o tumoral pode ser explicada pela má organização das estruturas vasculares das células tumorais que resulta em um fluxo sanguíneo heterogêneo e uma entrega de nutrientes não uniformes. Dessa forma, a alta produção de energia decorrente do aumento da taxa de glicólise anaeróbia leva a um aumento da produção de ácido lático nas regiões mal perfundidas, e uma vez que o fluxo sanguíneo é reduzido e insuficiente para remover o excesso de ácido lático produzido, uma redução do pHe é detectada (M. T.; FERREIRA, L. A. M.; BRAGA, F. C.; OLIVEIRA, M. C. Preparation, physicochemical characterization, and cell viability evaluation of longcirculating and pH-senstive liposomes containing ursolic acid. BioMed Research International, v. ?, p. 1-7, 2013).

[04] Nos últimos 50 anos, a pesquisa de novos fármacos antineoplásicos introduziu no cenário terapêutico cerca de 70 medicamentos (BRANDÃO, H. N.; DAVID, J. P.; COUTO, R. D.; NASCIMENTO, J. A. P.; DAVID, J. M. Química e farmacologia de quimioterápicos antineoplásicos derivados de plantas. Quimica Nova, v. 33, p. 1359-1369, 2010). Porém, os estudos nesse campo ainda são

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3/29 vastos devido à necessidade de desenvolver medicamentos que apresentem elevada eficácia antitumoral e baixa toxicidade garantindo um tratamento seguro ao paciente e um índice terapêutico favorável. Dentre os quimioterápicos obtidos de produtos naturais e, atualmente, mais usados na terapêutica destacam-se os taxanos, como o Paclitaxel (PTX).

[05] O PTX é um pseudoalcalóide diterpeno com fórmula molecular C47H51NO14 e quimicamente conhecido como (2α,5β,7β,10β,13α)-4,10Diaceoxi-13-{[2R,3S)-3-(benzoil-amino)-2-hidroxi-3-fenilpropanoil]oxi}1,7-di-hidroxi-9-oxo-5,20-epoxi-tax-11-em-2-ilo. É altamente lipofílico e devido à indisponibilidade de grupos funcionais ionizáveis é praticamente insolúvel em água (0,3 a 1,0 pg/mL), fato que contribui para sua baixa biodisponibilidade e dificuldade de manipulação em diferentes valores de pH (PANCHAGNULA, R. PHARMACEUTICAL ASPECTS OF PACLITAXEL. INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, V. 172, P. 1-15, 1998 ; IQBAL, J.; SARTI, F.; PERERA, G.; BERNKOPSCHNÜRCH, A. DEVELOPMENT AND IN VIVO EVALUATION OF AN ORAL DRUG DELIVERY SYSTEM FOR PACLITAXEL. BIOMATERIALS, V. 31, P. 170-175, 2011. et al., 2011; LIU, Y.; ZHANG, B.; YAN, B. Enabling anticancer therapeutics by nanoparticle carries: the delivery of paclitaxel. International Journal of Molecular Science, v. 12, p. 43954413, 2011).

[06] Sua atividade antineoplásica foi comprovada contra vários tipos de tumores sólidos incluindo câncer de próstata, de cabeça e pescoço, das células não-pequenas do pulmão, carcinoma do ovário e câncer de mama, sendo os dois últimos, responsáveis por 22,9% dos tipos de câncer mais incidentes em mulheres no território brasileiro (GUCHELAAR, H. J.; TEN NAPEL, C. H. H.; DE VRIES, E. G. E.; MULDER, N. H. Clinical, toxicological and pharmaceutical aspects of the

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4/29 antineoplastic drug taxol: a review. Clinicai Oncology, v. 6, p. 40-48, 1994 ; ROWINSKYY, E. K.; DONEHOWER, R. C. PACLITAXEL (TAXOL). THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, V. 13, P. 1004-1014, 1995. 158 ; INCA - INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA - MINISTÉRIO DA SAÚDE. ESTIMATIVA DO CÂNCER 2014: INCIDÊNCIA DO CÂNCER NO BRASIL). Devido à sua eficácia, o PTX foi desenvolvido e comercializado pela companhia norteamericana Bristol-MeyerSquibb com o nome de Taxol®, durante a década de 90, e atualmente está disponível como medicamento em mais de 60 países (SOUZA, 2004).

[07] A forma farmacêutica comercialmente disponível, Taxol®, consiste em uma dispersão micelar do PTX em uma mistura de partes iguais de etanol desidratado e do diluente Cremophor EL® (CrEL), um derivado polietoxilado do óleo de castor (GUCHELAAR et al., 1994; SCRIPTURE et al., 2005; HUREAUX et al., 2010), sendo administrado por via intravenosa. Sua administração, geralmente, segue um esquema terapêutico de doses entre 135 a 145 mg/m2, em infusão de 3 ou 24 horas, a cada três semanas (PANCHAGNULA, 1998). Entretanto, sua aplicação na terapêutica tem gerado vários problemas de toxicidade e efeitos adversos, principalmente devido a quantidade de CrEL requerida em sua formulação comercial.

[08] A infusão do CrEL, em quantidade relativamente alta, induz a produção de histamina e ativação de proteínas do complemento causando reação de hipersensibilidade aguda, caraterizada por dispneia, erupções cutâneas, taquicardia, angioedema e anafilaxia sistêmica que pode levar a quadros clínicos potencialmente graves como parada cardiorrespiratória e colapso cardíaco (PANCHAGNULA, 1998; SZEBENI et al., 1998; GELDERBLOM et al., 2001; MIELE et al., 2009).

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5/29 [09] Estudos clínicos têm demonstrado que até 41% dos pacientes experimentaram reações de hipersensibilidade aguda (IRIZARRY et al.,

2009). Em virtude disso, medidas profiláticas são adotadas durante o tratamento, com o uso combinado de anti-histamínicos e corticosteroides, anteriormente e ao longo da infusão, porém não garantem total ausência dessas reações (GELDERBLOM et al., 2001; KLOOVER et al., 2004). [010] Além disso, o CrEL tem a capacidade de lixiviar agentes plastificantes como o di(2-etilhexil)ftalato (DEHP) das embalagens e de cateteres padrões constituídos de cloreto de polivinila (PVC). A quantidade de DEHP lixiviado depende da concentração de CrEL administrado e pode causar quadros de hepatotoxicidade grave (GELDERBLOM et al., 2001; DONAY; SEWELL, 2006).

[011] A neuropatia periférica sensorial é a manifestação neurotóxica mais evidente em decorrência do uso do Taxol®, com risco maior em pacientes diabéticos. Esse efeito tóxico pode ser causado por dois mecanismos. O primeiro está relacionado com a ação do PTX sobre o cone neuronal dos neurônios periféricos, inibindo seu crescimento e movimentação por meio da estabilização dos microtúbulos, resultando assim em gangliopatia e anaxopatia. O segundo é dependente do CrEL, que atua através dos ácidos graxos insaturados residuais e derivados etoxilados produzidos como resultado de sua peroxidação. Esses produtos podem afetar diretamente os neurônios e, principalmente, as células de Schwann, levando à desmielinização e degradação progressiva das células nervosas, causando neuropatia motora com a paralização e dormência dos membros, hipotensão ortostática e perda sensorial periférica (GELDERBLOM et al., 2001; MIELKE et al., 2006). [012] Outras reações adversas proeminentes associadas ao uso do PTX incluem mielossupressão, sob a forma de neutropenia grave, sendo recomendável ajuste de doses. Toxicidade cardíaca, com maior

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6/29 frequência bradicardia e casos mais raros como bloqueio da condução atrioventricular e isquemia cardíaca (GUCHELAAR et al., 1994), bem como efeitos colaterais comuns incluindo alopecia, mucosites e náuseas também são relatados.

[013] Além dos efeitos adversos graves, o Taxol® apresenta sérios problemas em relação a sua estabilidade química e física. Garantir a estabilidade em longo prazo dessa formulação é um fator limitante para assegurar a eficácia e segurança do tratamento ao paciente. Antes da sua administração intravenosa, o Taxol® é previamente diluído em solução salina (NaCl 0,9% p/v) ou solução de dextrose 5% p/v para uma concentração final de 0,3 a 1,2 mg/mL, o que ocasiona a precipitação do fármaco, particularmente quando a concentração de PTX é superior a 0,6 mg/mL nessas preparações. Dessa forma, terapias com esquemas de infusões mais lentas ou mesmo padronização de doses necessitando diluições prévias são dificultadas devido à baixa estabilidade dessa formulação (GELDERBLOM et al., 2001; BURM, 2005).

[014] Outra alteração notória exercida pelo CrEL foi observada no comportamento farmacocinético do PTX. Esse veículo apresenta um volume de distribuição muito pequeno e, em concentrações acima da concentração micelar crítica, o PTX tende a permanecer mais associado às micelas que associado às proteínas transportadoras ou mesmo na forma livre. Dessa forma, o PTX passa a assumir uma farmacocinética distinta com valores de depuração diminuído, substancialmente, com o aumento da dose do medicamento, em um fenômeno conhecido como farmacocinética não-linear, particularmente evidente com regimes de infusão de pelo menos 3 horas. Como resultado disso, a percentagem total de PTX associado às micelas é muito maior que o fármaco não ligado, tornando-o menos disponível para o metabolismo hepático e

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7/29 distribuição pelo organismo, principalmente nas regiões tumorais (SCRIPTURE et al., 2005).

[015] Na tentativa de contornar esses inconvenientes, estudos vêm sendo conduzidos na busca de análogos mais hidrossolúveis através de modificações químicas em sua molécula e síntese de pró-fármacos (FENG et al., 2002; RYU et al., 2008; HUANG et al., 2013). Além disso, novas abordagens farmacotécnicas utilizando sistemas de liberação de fármacos têm sido adotadas, destacando-se as ciclodextrinas (SHARMA et al., 1995; YU et al., 2013; JING et al., 2013), micelas poliméricas (ZHANG et al., 2011), nanopartículas (XU et al., 2005; ZHAO et al., 2012) e lipossomas (CROSASSO et al., 2000; YANG et al., 2007a; KOUDELKA et al., 2010).

[016] O Abraxane® (ABI-007) é um exemplo de nanossistema que, atualmente, encontra-se disponível no mercado farmacêutico dos Estados Unidos. Consiste em um sistema coloidal composto de nanopartículas de albumina carreadoras do PTX. Foi aprovado em 2005 pelo Food and Drug Adminstration (FDA), sendo direcionado e eficiente para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático e de células não-pequenas do pulmão. Estudos pré-clínicos e clínicos mostraram que o ABI-007 foi significativamente menos tóxico que o Taxol®, sendo a dose máxima tolerada 1,5 a 2 vezes maior que o tratamento convencional e o volume de distribuição foi maximizado em uma extensão de 5 vezes (MIELE et al., 2009; SCRIPTURE et al., 2005). [017] Sistemas nanoestruturados oferecem vantagens quando comparados a outras formas farmacêuticas convencionais, destacando: maior eficácia terapêutica, com liberação progressiva e controlada da substância; diminuição significativa da toxicidade associada ao fármaco ou mesmo dos adjuvantes da formulação convencional; menor volume de circulação e consequentemente redução das dosagens empregadas,

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8/29 capacidade de superar a resistência oferecida por algumas barreiras biológicas e oferecer proteção ao fármaco contra inativação química ou enzimática; além de promover direcionamento a determinados alvos (MOHANRAJ; CHEN, 2006).

[018] Dentre os principais sistemas nanoestruturados estudados, os lipossomas ocupam lugar de destaque como sistema transportador, por serem biocompatíveis, não imunogênicos e versáteis estruturalmente em termos de tamanho, composição, carga superficial e fluidez de membrana, além de possibilitar a associação de substâncias hidrofílicas, lipofílicas e anfifílicas (FRÉZARD et al., 2005; BATISTA et al., 2007; AKABARZADEH et al., 2013).

[019] Alguns estudos incorporaram glicolípides à superfície da membrana lipídica visando o “escape” dos lipossomas ao reconhecimento e captação pelas células do SFM, possibilitando assim, uma permanência maior dos mesmos na circulação sanguínea. E assim, foram introduzidos os chamados lipossomas de circulação prolongada. A primeira estratégia estudada foi mediante a preparação de lipossomas mimetizando a membrana dos eritrócitos. Nesse caso, a superfície lipossomal foi modificada com componentes hidrofílicos naturais como o monossialogangliosideo GM1 (GABIZON; PAPAHADOJOPOULOS, 1988; ALLEN; CHONN, 1987).

[020] Klibanov e seus colaboradores (1990) mostraram que, a incorporação de um polímero hidrofílico, o polietilenoglicol (PEG), à membrana lipossomal aumentava, com sucesso, o tempo de circulação sanguínea desse sistema. A presença de grupos volumosos hidrofílicos criados pelo PEG na superfície lipossomal resulta em um efeito estérico à ligação das opsoninas, as quais são responsáveis por sinalizar os lipossomas como corpo estranho, e impedindo assim, seu reconhecimento e captação pelas células do SFM.

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9/29 [021] A modificação da superfície dos lipossomas com PEG pode ser conseguida de várias maneiras: adsorção física sobre as vesículas; ligação covalente de grupos reativos à superfície de lipossomas previamente formulados, mas o método mais amplamente utilizado é o acoplamento desse polímero mediante uma ligação cruzada com um lípide presente na composição das vesículas. Além do aumento do tempo de meia vida de circulação sanguínea dos lipossomas, o PEG mostrou evitar agregação das vesículas melhorando a estabilidade das formulações (IMMORDINO et al., 2006).

[022] Um exemplo de medicamento comercialmente disponível que utiliza a tecnologia dos lipossomas de circulação prolongada é o DOXIL®/CaelyxTM, formulação contendo a doxorrubicina, aprovada nos Estados Unidos e Europa para o tratamento do câncer no ovário e sarcoma de Kaposi (CHARROIS; ALLEN, 2003; CHARROIS; ALLEN, 2004; KO et al., 2013). Além de exibir um perfil de toxicidade melhorado em comparação com seu homólogo não lipossomal, esse medicamento mostrou uma progressão mediana na sobrevida de pacientes com câncer de ovário recorrente, quando comparado com tratamentos convencionais à base de carboplatina e PTX (PUJADE-LAURAINE et al., 2010).

[023] Cada vez mais o foco das pesquisas em sistemas lipossomais tem sido no desenvolvimento de estratégias que proporcionem, da melhor forma possível, o aumento da capacidade de mediar a entrega de fármacos em alvos específicos, incluindo também, a liberação dessas substâncias ao nível intracelular (BALAMURALIDHARA et al., 2011). Esses estudos têm resultado em ferramentas importantes e eficientes na terapia com fármacos e biomoléculas que exercem seus efeitos intracelularmente (FERREIRA et al., 2013). Nesse contexto, surgiram os lipossomas polimórficos que apresentam capacidade de se tornarem reativos e alterar sua estrutura frente alguma alteração, como, por

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10/29 exemplo, a mudança de pH (BATISTA et al., 2007). Os lipossomas pHsensíveis, são um dos exemplos desses carreadores.

[024] Os derivados da fosfatidiletanolamina (PE), como por exemplo, a dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), ao contrário da maioria dos fosfolípides, possuem uma região polar pequena e pouco hidratada, que ocupa um volume menor quando comparado com sua respectiva cadeia de hidrocarbonetos, exibindo, portanto, uma organização supramolecular do tipo cônica. Essa organização favorece a formação de interações intermoleculares entre grupos amina e fosfato da região polar, o que explica a tendência dessas moléculas em adquirir a fase hexagonal invertida (HII) não promovendo a formação das vesículas lipídicas. A formação de lipossomas com esses fosfolípides requer a adição de agentes estabilizantes, como o hemisuccinato de colesterila (CHEMS), os quais se encontram sob a forma ionizada em pH fisiológico. Esses estabilizantes se distribuem homogeneamente entre as moléculas de PE e o aparecimento de repulsões eletrostáticas entre os grupamentos carboxílicos presentes no CHEMS e os grupos fosfatos presentes nos fosfolípides favorece a organização lamelar e a formação das vesículas (SIMÕES et al., 2004).

[025] Em pH fisiológico esses lipossomas são estáveis, e sua exposição em meios ácidos favorece a protonação dos agentes estabilizantes, e como consequência ocorre a desestabilização das vesículas possibilitando a liberação do material carreado (OLIVEIRA et al., 2000; SIMÕES et al., 2004).

[026] É descrito que, em média, o pH extracelular da região tumoral, situa-se entre 6,0 e 7,0, ao passo que, em tecidos normais e no sangue, esse valor é de aproximadamente 7,4. Porém, os locais de maior acidez nos tumores são frequentemente os mais distantes da microvasculatura tumoral, onde o acesso pelos lipossomas é mais dificultado

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11/29 (BALAMURALIDHARA et al., 2011). Além disso, o pH do interstício tumoral raramente cai abaixo de 6,5 dificultando a desestabilização dos lipossomas para liberação de seu conteúdo (FERREIRA et al., 2013). [027] Entretanto, ao ser internalizados na célula por endocitose, os lipossomas pH-sensíveis são mantidos nos endossomas de estágios iniciais, onde o pH encontra-se a um valor próximo de 6,5. O potencial desse sistema reside na sua capacidade de sofrer desestabilização na fase endossomal tardia, com duração de aproximadamente 10 a 15 minutos, onde o pH situa-se entre 5,0 e 6,0. Nesse ponto, ocorre a liberação do seu conteúdo no interior do citoplasma, além de evitar sua degradação no lisossoma (KARANTH; MURTHY, 2007; FERREIRA et al., 2013).

[028] A liberação do conteúdo dos lipossomas ao citoplasma tem sido proposta por três mecanismos hipotéticos: em primeiro lugar a desestabilização das vesículas sensíveis ao pH tem a capacidade de desestabilizar a membrana endosômica, presumivelmente, através da formação de poro; em segunda hipótese, após a desestabilização dos lipossomas, as moléculas carreadas se difundem para o citoplasma, e por último, é proposto uma fusão entre os lipossomas e a membrana dos endossomas, proporcionando a liberação do conteúdo lipossomal (KARANTH; MURTHY, 2007).

[029] A combinação das propriedades dos lipossomas de circulação prolongada e pH-sensibilidade, vêm mostrando ganhos de eficácia antitumoral e redução da toxicidade associada a diversos antineoplásicos (TORCHILIN, 2005; ISHIDA et al., 2006; RANE; PRABHAKAR, 2009). Leite e colaboradores (2009, 2012b), em estudos com lipossomas pHsensíveis de circulação prolongada contendo o antineoplásico cisplatina observaram, em modelos animais, que esse sistema apresentou uma significativa redução da toxicidade, exibindo aumento na dose letal

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12/29 (DL50) e na dose máxima tolerada de aproximadamente duas e três vezes, respectivamente, quando comparado ao tratamento com cisplatina livre. O estudo de atividade antitumoral demonstrou uma redução significativa do crescimento e volume tumoral para o tratamento com os lipossomas em confronto com a cisplatina livre (LEITE et al., 2012a).

[030] Os lipossomas podem se localizar em órgãos ou tecidos específicos de forma passiva ou ativa. A captação passiva está relacionada com elementos estruturais, fisiológicos e processos anatômicos. Na terapia do câncer, características da região tumoral, como a presença de poros no endotélio vascular, elevado fluxo sanguíneo e ausência de um sistema linfático eficiente, bem como o tamanho reduzido dos lipossomas, possibilitam o extravasamento e retenção dos mesmos na região tumoral devido ao efeito de permeabilidade e retenção aumentado (BERTRAND et al., 2014).

[031] Por outro lado, a captação ativa é alcançada pela utilização dos lipossomas sítio-específicos ou de superfície modificada, mediante inserção de ligantes (MEDINA et al., 2004; SURENDIRAN et al., 2008). [032] Esses sistemas caracterizam-se por possuir em suas superfícies ligantes que atuam reconhecendo de forma específica moléculas de superfícies ou receptores expressos em determinados locais ou células (BATISTA et al., 2007; SAWANT; TORCHILIN, 2012). Os ligantes largamente utilizados incluem peptídeos, oligossacarídeos, anticorpos, ácidos nucleicos e moléculas pequenas tais como vitaminas (BERTRAND et al., 2014).

[033] A descoberta sobre a expressão do receptor para folato em algumas linhagens de cânceres humanos, como câncer de ovário e mama (CONEY et al., 1991), foi um marco importante e possibilitou o direcionamento de várias pesquisas. Parker e colaboradores (2005)

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13/29 demonstraram uma expressão aumentada de receptores de folato em células tumorais do rim, bexiga, colo do útero, pâncreas, tumores cerebrais, mama e ovário. Por outro lado, em tecidos normais, essa expressão foi imensurável ou expressa em valores muito baixos. Cânceres como alguns linfomas, câncer de próstata, pâncreas, testículo e fígado não mostraram níveis elevados de receptores de folato (ZWICKE et al., 2012). Essas evidências possibilitaram o uso dos receptores para folato como sítio para o direcionamento de fármacos às células tumorais.

[034] Diante desses resultados duas estratégias foram desenvolvidas para entrega de fármacos mediada via receptor de folato. A primeira é por meio do acoplamento de anticorpos monoclonais contra esses receptores e a segunda está relacionada ao acoplamento do ácido fólico ou seus derivados folatados diretamente como ligante alvo (SUDIMACK; LEE, 2000). Para a segunda estratégia, a ligação do folato ao lipossoma, geralmente, é realizada mediante acoplamento às extremidades do PEG, que por sua vez está ligado a um lípide formador da bicamada lipídica. Desse modo, esse polímero irá atuar como um longo espaçador permitindo superar o impedimento estérico da superfície celular. Após o reconhecimento do folato, mediante ligação específica pelo receptor na célula tumoral, o lipossoma é internalizado e direcionado ao endossoma, podendo liberar o fármaco no meio intracelular, com posterior regeneração dos receptores (JARACZ et al., 2005).

[035] Em 2004, um estudo realizado no Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coréia mostrou a eficiência de um nanossistema carreador de doxorrubicina utilizando o direcionamento através de receptor para folato. A equipe produziu micelas poliméricas de circulação prolongada funcionalizadas com folato, com diâmetro médio em torno de 200 nm. As células da linhagem KB, carcinoma bucal, positivas para o

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14/29 receptor de folato, mostraram maior acúmulo de doxorrubicina que as células A549, carcinoma de pulmão, negativas para esse tipo de receptor. Por outro lado, a presença de folato livre juntamente com o nanossistema, inibiu o acúmulo de doxorrubicina, mostrando haver competitividade pela ligação aos receptores entre o folato livre e as micelas poliméricas funcionalizadas (YOO; PARK, 2004).

[036] A forma farmacêutica comercialmente disponível, Taxol®, consiste em uma dispersão micelar do PTX em uma mistura de partes iguais de etanol desidratado e do diluente CrEL, um derivado polietoxilado do óleo de castor (GUCHELAAR et al., 1994; SCRIPTURE et al., 2005; HUREAUX et al., 2010), sendo administrado por via intravenosa. Sua administração, geralmente, segue um esquema terapêutico de doses entre 135 a 145 mg/m2, em infusão de 3 ou 24 horas, a cada três semanas (PANCHAGNULA, 1998). Entretanto, sua aplicação na terapêutica tem gerado vários problemas de toxicidade e efeitos adversos, principalmente devido a quantidade de CrEL requerida em sua formulação comercial.

[037] A infusão do CrEL, em quantidade relativamente alta, induz a produção de histamina e ativação de proteínas do complemento causando reação de hipersensibilidade aguda, caraterizada por dispneia, erupções cutâneas, taquicardia, angioedema e anafilaxia sistêmica que pode levar a quadros clínicos potencialmente graves como parada cardiorrespiratória e colapso cardíaco (PANCHAGNULA, 1998; SZEBENI et al., 1998; GELDERBLOM et al., 2001; MIELE et al., 2009). Além dos efeitos adversos graves, o Taxol® apresenta sérios problemas em relação a sua estabilidade química e física. Garantir a estabilidade em longo prazo dessa formulação é um fator limitante para assegurar a eficácia e segurança do tratamento ao paciente. Antes da sua administração intravenosa, o Taxol® é previamente diluído em solução

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15/29 salina (NaCI 0,9% p/v) ou solução de dextrose 5% p/v para uma concentração final de 0,3 a 1,2 mg/mL, o que ocasiona a precipitação do fármaco, particularmente quando a concentração de PTX é superior a 0,6 mg/mL nessas preparações.

[038] No cenário farmacêutico mundial, a única formulação lipossomal contendo PTX e comercialmente disponível é a Lipusu®, compostas por lipossomas convencionais, aprovado na China, a qual trouxe como benefício uma menor toxicidade em comparação ao Taxol®; no entanto, a eficácia antitumoral mostrou resposta similar ao tratamento convencional (KOUDELA; TURÁNEK, 2012).

[039] O documento BR1120130246634 proporciona uma composição de lipossoma, a qual é obtida por mistura de uma solução orgânica miscível em água no qual um fosfolípidio e colesterol estão contidos numa concentração total de 100 a 200 w / v% de um solvente orgânico miscível com a água com uma primeira fase aquosa solução numa quantidade de 3/1 até 12/1, em termos de razão em volume à solução orgânica miscivel com água, obtendo-se assim uma emulsão em que a concentração total de colesterol e o fosfolípidio na fase de mistura resultante é de 15 a 50 w / v%, seguido por sujeição da emulsão a troca da solução externa com uma segunda solução de fase aquosa, em que um gradiente iônico é formado entre uma fase aquosa, de uma região interna de uma membrana de lipossomas, compreendendo a primeira solução de fase aquosa e uma fase aquosa numa região externa da membrana do lipossoma, compreendendo a segunda fase de solução aquosa, e um fármaco pode ser introduzido em uma quantidade alta de encapsulação. A invenção também fornece uma preparação de lipossomas que tem propriedades de liberação prolongada e controlada, mantendo uma concentração clinicamente eficaz e suficiente adequado para a administração subcutânea.

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16/29 [040] A invenção proposta pelo documento PI 0705519-6 A2 apresenta um método de preparo de formulações de lipossomas de cisplatina e outros agentes antineoplásicos sob a forma de dispersão coloidal e liofilizada. O método proposto permite a produção dessas formas farmacêuticas de lipossomas pH-sensíveis de cisplatina em larga escala assim como o preparo de produtos com maior estabilidade de prateleira. [041] O documento PP 1100699-4 B1 descreve um método para encapsulação de agentes antineoplásicos ionizáveis em lipossomas usando-se os potenciais transmembrana são proporcionados. As eficiências de retenção aproximam-se de 100% e a introdução rápida é prontamente obtida. Os protocolos de desidratação que permitem aos lipossomas serem usados convenientemente na administração de agentes antineoplásicos em aplicação clínica são também proporcionados. De acordo com outros aspectos da invenção, os potenciais transmembrana são usados para reduzir a taxa de liberação das drogas ioniozáveis a partir dos lipossomas.

[042] O documento US2015056270 apresenta um método de encapsular fármacos com ação antitumoral (Paclitaxel e Docetaxel) em lipossomas com a finalidade de reduzir os efeitos colaterais dos derivados de paclitaxel mas mantendo os excelentes efeitos anti-cancerígenos. Foi feita uma tentativa para produzir um lipossoma encapsulando derivados de paclitaxel, tais como paclitaxel monoglicosídeos e docetaxelmonoglicosídeos, no entanto, a eficiência de introdução de derivados de paclitaxel em um lipossoma era pobre, e esta técnicanão tinha sido desenvolvida em um nívelprático. A presente invenção proporciona um método para a produção de um lipossoma encapsulando um paclitaxel monoglycosídeo e/ou um docetaxel monoglicosideo, e tendo um anticorpo que reconhece especificamente uma célula cancerígena, compreendendo o método um passo de fazer um lipossoma

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17/29 encapsulando um derivado de éster de polioxietileno, um álcool inferior, e um tampão ou água em contato com uma solução na qual um paclitaxel monoglicosídeo e/ou um docetaxelmonoglicosídeo é dissolvido num tampão ou água contendo alquilenoglicol.

[043] O documento Multifunctional, Stimuli-Sensitive Nanoparticulate Systems For Drug Delivery (NatureReviewsDrug Discovery 13, 813-827, 2014) discute o uso de sistemas de distribuição de drogas em nanopartículas farmacêuticas (NDDSs) para aumentar a sua eficácia in vivo. O desenvolvimento de estímulos multifuncionais e sensíveis aos sistemas NDDSs é uma área ativa de pesquisa atual. Tais NDDSs podem ter tempos de circulação prolongada, o alvo do local da doença e melhorar a entrega intracelular de um fármaco. Estes tipos de NDDS também podem responder aos estímulos locais que são característicos do local patológico, por exemplo, liberar um fármaco encapsulado ou romper um revestimento protetor, facilitando assim a interação entre nanocarreadores carregados com fármaco e as células ou tecidos alvo. Além disso, podem ser ligados porções de contraste de imagem a estes transportadores para rastrear a sua biodistribuição em tempo real e a acumulação em células ou tecidos alvo.

[044] O documento US 6461637 B1 descreve um método de administração de taxanos encapsulados em lipossomas ou um derivado do mesmo antineoplásico ou uma mistura que é fornecida e utilizada para desenvolver um método melhorado de tratar terapeuticamente o câncer. O paclitaxel encapsulado em lipossomas permite a administração ao paciente em menos de uma hora.

[045] Diante da atividade do PTX contra vários tipos de tumores e seus inconvenientes, principalmente, em relação à formulação convencional, a presente invenção propõe uma formulação lipossomal multifuncionalizada contendo paclitaxel na qual o lipossoma é sensível à

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18/29 diferença de pH da região tumoral, possui tempo de circulação prolongado e se utilizará dos receptores folato da célula tumoral para garantir uma ação direcionada do fármaco nas células tumorais. Com essas funções garante-se o aumento da eficácia do tratamento e da segurança, com consequente diminuição das reações adversas decorrentes do uso desta classe de fármacos.

[046] Nesse contexto, a encapsulação do PTX ou outro agente antineoplásico em um nanocarreador lipídico multifuncionalizado combinando as três estratégias: circulação prolongada, pH-sensibilidade e o direcionamento ativo via receptor de ácido fólico, é uma alternativa que aumenta a estabilidade, a eficácia terapêutica do PTX ou outros agentes antineoplásicos bem como reduz a toxicidade e os efeitos adversos associados ao uso desses fármacos.

[047] A funcionalização dos lipossomas com folato é uma forma de aumentar o direcionamento para as células neoplásicas, uma vez que as células tumorais humanas são capazes de expressar receptores de folato em quantidade bem superiores que os tecidos normais (CONEY et al., 1991). Em células do câncer de ovário e de mama, essa expressão chega a quase 90% e 43% dos casos humanos, respectivamente (PARKER et al., 2005). Por outro lado a pH-sensibilidade é uma propriedade que torna os lipossomas reativos frente a mudanças no pH do ambiente em que se encontram. Em pH fisiológico esses lipossomas são estáveis e a exposição a um ambiente ácido são capazes de sofrer desestabilização das vesículas e, consequentemente, há liberação do material encapsulado (SIMÕES et al., 2004; FERREIRA et al., 2013). [048] Dessa forma, considerando a função da composição lipídica da presente invenção garante-se uma maior estabilidade do sistema e, em termos terapêuticos, uma redução significativa da dose administrada com menor incidência de e.

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Breve descrição das figuras [049] Figura 1 - Perfil de retenção do PTX (%) em diferentes valores de pH. (*) Representa diferença significativa entre as composições considerando o mesmo pH analisado. DOPE: Dioleilfosfatidiletanolamina; CHEMS: Hemisuccinato de colesterila; DSPE-PEG:

diestearoilfosfatidiletanolamina associada ao polietilenoglicol 2000; SPC: Fosfatidilcolina de soja.

[050] Figura 2 - Perfil diâmetro médio (a) e porcentagem de retenção do fármaco PTX no interior dos lipossomas (b) ao longo do tempo.

[051] Figura 3 - Perfil de retenção do PTX (%) em diferentes valores de pH. (*) Representa diferença significativa entre as composições considerando o mesmo pH analisado. DOPE: Dioleilfosfatidiletanolamina; CHEMS: Hemisuccinato de colesterila; DSPE-PEG:

diestearoilfosfatidiletanolamina associada ao polietilenoglicol 2000; SPC: Fosfatidilcolina de soja.

[052] Figura 4- Viabilidade celular mediada pelo ensaio do MTT para PTX livre, LpHS-PTX, LpHS, LpHSF-PTX, LpHSF e LpHSF-PTX + AF em células da linhagem L929 após 48 horas de tratamento. (*) Representa diferença significativa em relação ao LpHS-PTX, LpHSF-PTX e LpHSFPTX + AF (p<0,001). (°) Representam diferença significativa em relação ao LpHSF-PTX e LpHSF-PTX + AF (p<0,001). Dados expressos com média ± desvio padrão de três experimentos independentes. As composições brancas foram diluídas na mesma proporção que as contendo PTX.

[053] Figura 5 - Viabilidade celular mediada pelo ensaio do MTT para PTX Livre, LpHS-PTX, LpHS, LpHSF-PTX, LpHSF e LpHSF-PTX + AF em células das linhagens tumorais MFC-7 (a) e MDA-MB-231 (b) após 48 horas de tratamento. (*) Representa diferença significativa em relação ao PTX livre (p<0,01) e (°) Representam diferença significativa em relação

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20/29 ao PTX livre (p<0,01), LpHS-PTX e LpHSF-PTX + AF (p<0,05). Dados expressos com média ± desvio padrão de três experimentos independentes. As composições brancas foram diluídas na mesma proporção que as contendo PTX.

Descrição detalhada da tecnologia [054] A presente invenção descreve composições farmacêuticas de lipossomas multifuncionalizados contendo Paclitaxel ou outros fármacos com atividade antitumoral, o processo de obtenção e seu uso. O processo proposto permite a produção de formas farmacêuticas de lipossomas pH-sensíveis com alta afinidade pelos receptores de folato, expressos em grande quantidade nas células do tecido tumoral.

[055] O produto apresentado neste documento é caracterizado pela solução de lipossomas compostos por DOPE:CHEMS:DSPEPEG2000:DSPE-folato-PEG2000 carreando o fármaco paclitaxel ou outros fármacos antineoplásicos, sendo:

a) DOPE: Dioleilfosfatidiletanolamina;

b) CHEMS: Hemisuccinato de colesterila;

c) DSPE-PEG2000: diestearoilfosfatidiletanolamina associada ao polietilenoglicol 2000;

d) DSPE-folato:PEG2000: diestearoilfosfatidiletanolamina associada ao folato e ao polietilenoglicol 2000.

[056] A composição supracitada é caracterizada por formar um sistema lipossomal pH-sensível de circulação prolongada funcionalizado com folato capaz de carrear PTX (LpHSF-PTX) ou outros agentes antineoplásicos, preferencialmente PTX.

[057] Para o processo de obtenção das composições foi desenvolvido a partir de adaptações do método de hidratação do filme lipídico, também conhecido como método de Bangham.

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21/29 [058] O processo de preparação das composições compreende as seguintes etapas:

a) dissolução dos lípides DOPE, CHEMS, DSPE-PEG2000 e DSPE-folato-PEG2000 em clorofórmio na concentração lipídica de 10 mM a 40mM, mantendo a razão molar entre os lípides igual a 5,7:3,8:0,45: 0,05, respectivamente) e transferidas para um balão de fundo redondo;

b) evaporação do solvente com auxílio de um rotavapor acoplado a uma bomba de vácuo sob pressão reduzida, até a formação do filme lipídico nas paredes do balão;

c) adição de uma solução de NaOH 150 a 450 mM ao filme em quantidade equimolar suficiente para ionização do CHEMS, hidratação do filme lipídico com solução de NaCl 0,9% (p/v) e agitação vigorosa, em vórtex, até que a obtenção de uma dispersão homogênea de lipossomas multilamelares (MLV);

d) transferência dos lipossomas para recipiente em banho de gelo e calibração do tamanho dos lipossomas mediante sonicação, com sonda de titânio, por um período de 1 a 15 minutos a uma potência de 100 W;

e) separação da fração do fármaco não encapsulada nos lipossomas, insolúvel no meio, juntamente com possíveis partículas de titânio liberados pela sonda, foram separados mediante centrifugação a 1000 a 3000 rpm por 10 a 30 minutos e a 4°C (SANTOS; CASTANHO, 2002; YANG et al., 2007a);

f) O sobrenadante contendo o fármaco encapsulado nos lipossomas é separado e em seguida armazenado em geladeira a 5 ± 3°C.

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22/29 [059] Na etapa “a” do processo deve adicionar uma solução de PTX ou outro antineoplásico lipofílico em clorofórmio variando de 0,05% a 0,2% (p/v) para o preparo de LpHSF-PTX.

[060] Nas etapas “e” e “f” o fármaco deve ser preferencialmente PTX. [061] A presente invenção também propõe o uso dessa composição no tratamento de câncer.

[062] A tecnologia pode ser melhor compreendida, mas de forma não limitante, através dos exemplos abaixo.

Exemplo 1 - Processo de obtenção dos lipossomas [063] Para o preparo dos lipossomas pH-sensíveis de circulação prolongada (LpHS), alíquotas dos lípides DOPE, CHEMS, DSPEPEG2000 e DSPE-folato-PEG2000 foram dissolvidos em clorofórmio na concentração lipídica de 10 a 40 mM mantendo a razão molar entre os lípides igual a 5,7:3,8:0,45:0,05, respectivamente, e transferidas para um balão de fundo redondo. Para o preparo de LpHSF-PTX, uma solução de PTX em clorofórmio correspondente a 0,05% a 0,2% (p/v) foi adicionada nessa etapa.

Exemplo 2 - Determinação do teor de encapsulação do PTX em LpHSFT-PTX [064] A determinação da porcentagem de PTX encapsulado em LpHSFPTX foi realizada por espectrofotometria derivada no ultravioleta (EDUV). Inicialmente, a membrana lipídica dos lipossomas foi aberta com álcool isopropílico na proporção 1:9 podendo variar até 1:15, respectivamente, e em seguida, a preparação foi diluída com o sistema eluente (acetonitrila:água 55:45 v/v) e injetada no cromatógrafo. O teor de PTX foi determinado nos lipossomas antes (PTX total) e após a centrifugação (PTX encapsulado) e calculado pela seguinte fórmula:

TE = ([PTX]Lps.Purificado/[PTX]Lps.Total) x 100

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23/29 [065] As medidas foram realizadas em triplicata e os resultados apresentados como média ± desvio padrão.

[066] Os dados de teor de encapsulação do PTX nos LpHS estão apresentados na Tabela 1. A composição apresentou um teor de encapsulação próximo de 95%. Estudos prévios mostraram taxas igualmente elevadas para lipossomas com composição lipídica diversa contendo PTX (ZHANG et al, 2005; KOUDELKA et al, 2009; MENG et al,

2010).

TABELA 1- Determinação do teor de encapsulação do PTX em LpHS
Composição	LpHS-PTX
	95,5
TE(%)	97,3 92,9
Média ± DP	95,2 ± 2,20

Exemplo 3 - Avaliação das propriedades físico-químicas [067] A composição LPHSF-PTX apresentou diâmetro médio variando de 173 a 200 nm e índice de polidispersão de 0,30 a 0,34, demonstrando ser uma composição com distribuição homogênea e tamanho adequado para a administração intravenosa. O potencial zeta foi próxima da neutralidade devido as moléculas de PEG presentes no sistema, como se observa pelos dados da Tabela 2.

TABELA 2 - Caracterização do potencial zeta das vesículas dos LpHS e LpHS-PTX

Formulação LpHS LpHS-PTX

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	2,1	-1,8
ζ (mV)	5,1	2,3
	5,6	3,7
Média ± DP	+4,3 ± 1,9	1,4 ± 2,9

Exemplo 4 - Avaliação da pH-sensibilidade [068] A liberação do PTX a partir dos lipossomas compostos por DOPE:CHEMS:DSPE-PEG e SPC:DOPE:CHEMS:DSPE-PEG foi avaliada em diferentes valores de pH a fim de confirmar a propriedade de sensibilidade frente à variações do pH. Inicialmente a preparação inicial de lipossomas foi diluída em água Mili-Q, e alíquotas de 1 a 10 mL de cada composição foram adicionadas em oito diferentes tubos Falcon. Em seguida, utilizando um pHmetro e volume conhecido de HCl 1 a 10 mM ou NaOH 1 a 10 mM (ambos em solução de NaCl 0,9% (p/v)), o pH das composições foi ajustado para os seguintes valores: 7,4; 7,2; 7,0; 6,8; 6,5; 6,0; 5,5 e 5,0 e incubados em banho-maria a 37 ± 1°C por 30 minutos. Posteriormente, os tubos foram submetidos à centrifugação a 1000 a 3000 rpm durante 10 a 30 minutos a 4°C. O sobrenadante contendo o PTX encapsulado nos lipossomas foi, cuidadosamente, separado do precipitado (fração de PTX liberada e insolúvel no meio). Finalmente, o sobrenadante foi diluído e submetido à quantificação por ED-UV. As análises foram realizadas em triplicatas e os valores expressos como a média ± DP da porcentagem de retenção do PTX em relação à composição inicial, ou seja, sem alteração do pH.

[069] Os resultados do estudo de pH-sensibilidade estão mostrados na figura 1.

[070] À medida que o pH é gradativamente diminuído, o PTX é liberado das vesículas lipossomais em ambas composições analisadas. Entretanto, é possível perceber que, a partir do pH 6,8 a composição

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25/29 contendo DOPE:CHEMS:DSPE-PEG tem uma liberação maior de PTX (p<0,05), chegando a liberar quase 30% a mais do fármaco em pH equivalente a 5,0 (p<0,05), em comparação com a composição contendo SPC em sua composição. Além disso, considerando o pH inicial igual a 7,4, a liberação do fármaco foi significativamente diferente a partir do pH 6,8 para a composição sem SPC (p<0,05) e, a partir do pH 6,0 para a composição contendo SPC (p<0,05).

[071] A um pH igual a 5,0, foi possível perceber que, apenas cerca de 30% do PTX ficou retido nas vesículas da composição lipossomal, indicando boa liberação do fármaco à medida que o pH decai. Essa taxa de liberação pode ser favorável à entrega de droga que atua no interior das células, como é o caso do PTX, pois, uma vez internalizados, os lipossomas podem ser direcionados aos endossomas, os quais criam, na fase tardia, um ambiente onde o pH pode chegar a valores entre 6,0 e 5,0 (KARANTH; MURTHY, 2007).

[072] A avaliação da pH-sensibilidade das composições também foi conduzida empregando a técnica de espalhamento de raio-X a baixo ângulo. Os resultados mostraram que a presença do PTX na bicamada lipídica da composição DOPE:CHEMS:DSPE-PEG mantém a propriedade de pH-sensibilidade do sistema, visto que uma desorganização da bicamada em função da variação do pH foi observada. Por outro lado, uma alteração da pH-sensibilidade em função da redução da razão molar da DOPE após incorporação de SPC foi observada. Ishida e colaboradores (2006), durante o desenvolvimento de lipossomas pH-sensíveis contendo doxorrubicina, investigaram o efeito da fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) e Chol sobre a pHsensibilidade das vesículas. Para esse estudo foi realizado uma série de testes, variando o pH do meio estudado em uma faixa de 7,5 a 4,5, sendo considerados como controles positivo e negativo as composições

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26/29 compostas por DOPE:CHEMS (6:4) e HSPC:Chol (2:1), respectivamente. A composição composta por DOPE:HSPC:CHEMS:Chol na proporção de (3:3:2:2) não mostrou pH-sensibilidade em função da acidificação do meio, pequena sensibilidade foi detectada quando a proporção dos lípides foi mudada para (4:2:2:2) e um extensiva sensibilidade ao pH foi observada quando essa proporção era de (6:0:2:2), dessa forma, mostraram que a sensibilidade da composição ao pH ácido é aumentada com o acréscimo da porcentagem molar de DOPE e diminuição de HSPC.

[073] Essa possível diminuição da pH-sensibilidade pode ser atribuída ao fato da fosfatidilcolina (PC) apresentar áreas moleculares aproximadamente equivalentes para o grupo polar e sua cadeia de hidrocarboneto, que assumem uma estrutura molecular cilíndrica e leva a formação da fase lamelar, caracterizando bicamadas (FATTAL et al., 2004). Dessa forma, possivelmente, pode haver uma estabilização da fase lamelar, pela presença da SPC juntamente com os outros lípides, mantendo a formação, em certa proporção, das vesículas mesmo com a diminuição do pH.

Exemplo 5 - Avaliação preliminar estabilidade de armazenamento [074] O estudo de estabilidade de LpHSF-PTX armazenado a 5 ± 3^oC foi conduzido ao longo de 150-dias por acompanhamento do diâmetro das vesículas, índice de polidispersão e PTX retido na bicamada. Em primeiro lugar, é interessante mencionar que a composição proposta na presente invenção apresentou boa estabilidade em termos de tamanho e retenção do PTX durante 100 dias. Nenhuma variação nesses parâmetros foi obtida (Figura 2). A porcentagem de PTX retida foi cerca de 90% e 85% após 100 e 150 dias de armazenamento, respectivamente. Os resultados apresentados na figura 2 demonstram, portanto, um ganho significativo em relação à estabilidade, visto que

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27/29 dados da literatura demonstram composições lipossomais contendo PTX que se mantiveram estáveis por cerca de dois meses e outras que mantiveram suas características físico-químicas por menos de 24 horas de armazenamento (SHARMA et al., 1994; CROSASSO et al., 2000; IMMORDINO et al., 2003; YANG et al., 2007a; YANG et al., 2007b; KOUDELKA; TURÁNEK, 2012).

Exemplo 6 - Avaliação da Atividade antitumoral in vivo [075] A avaliação da atividade antitumoral foi conduzida em camundongos Balb/c acometidos com tumor de mama MDA-MB-231. Os diferentes grupos experimentais receberam solução salina (controle), paclitaxel (PTX) livre, lipossomas pH-sensíveis contendo PTX (LpHSPTX) e lipossomas pH-sensíveis funcionalizados com folato contendo PTX (LpHSF-PTX). As preparações foram administradas por via intravenosa na dose de 7,5 mg/kg/dia com intervalo de quatro dias entre as administrações, perfazendo um total de seis doses. A administração de PTX livre reduziu significativamente o crescimento tumoral em comparação com o grupo controle. Entretanto, o tratamento com LpHSF-PTX resultou em uma atividade antitumoral significativamente maior em relação ao tratamento com PTX livre e LpHS-PTX. Pode-se observar pelos dados compilados na Figura 3 que a administração de LpHS-FPTX inibiu de maneira significativa o crescimento tumoral, resultando praticamente na ausência de alteração do volume tumoral no final do período experimental.

Exemplo 7 - Estudos de citotoxicidade in vitro [076] Para avaliar se a citotoxicidade do PTX seria afetada pela sua encapsulação em composições lipossomais pH-sensíveis de circulação prolongada recobertas ou não por folato, foi utilizado o ensaio de metabolização do MTT para avaliar a viabilidade celular. A viabilidade de células normais (L929) e neoplásicas (MCF-7 e MDA-MB-231) foi

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28/29 investigada após incubação, por 48 horas, com solução de PTX livre (PTX livre), com PTX encapsulado em lipossomas pH-sensíveis de circulação prolongada recobertos com folato (LpHSF-PTX) e lipossomas sem a presença desse ligante (LpHS-PTX). Para verificar a citotoxicidade da matriz da composição, as células foram tratadas com as composições brancas (LpHSF e LpHS).

[077] Os dados obtidos para as linhagens normal (L929) e tumoral (MCF-7 e MDA-MB-231), expressos como porcentagem da viabilidade celular, são mostrados nas figuras 4 e 5, respectivamente. Os valores de IC50 para todas as linhagens são apresentados na Tabela 3.

[078] Em primeiro lugar, é importante mencionar que nenhuma atividade citotóxica significativa foi observada para LpHS ou LpHS-FT em todas as linhas celulares testadas. Assim, estas composições mostram citotoxicidade insignificante quando comparado com composições contendo PTX.

[079] Na linhagem de célula normal (L929), a viabilidade celular foi diminuída em livre PTX nas concentrações mais elevadas (100 e 500 nM) a 92,5 e 80%, respectivamente. Esta citotoxicidade foi significativamente maior do que a observada para LpHS-PTX (86% a 500 nM) ou LpHS-FT-PTX (93% a 500 nM).

[080] LpHSF-PTX promoveu uma atividade citotóxica maior do que aquela observada para os demais grupos testados. Os valores de IC50 mais baixos da ordem de 2,2 e 11,5 vezes para células MCF-7 e MDAMB-231, respectivamente comparado ao LpHS-PTX foram obtidos. A fim de demonstrar se a presença de folato nas preparações tem um papel importante na captação das vesículas por células tumorais, as células foram submetidas a um pré-tratamento por meio da adição de acido folato por um período de 1 a 2 horas antes do tratamento com LpHS-FTPTX. Foi observado um aumentou na viabilidade celular de ambas as

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29/29 linhagens tumorais avaliadas para todas as concentrações, sugerindo que o ácido fólico foi capaz de saturar os receptores da superfície das células, reduzindo a captação de lipossomas e, consequentemente, a atividade citotóxica do PTX incorporado nesta composição LpHSF-PTX. Baseado nesses resultados pode-se inferir que a presença do folato é indispensável para garantir maior eficácia terapêutica nas linhagens estudadas. A atividade citotóxica foi menor a linhagem tumoral MCF-7 uma vez que essa expressa menor quantidade de receptores para folato que a linhagem MDA-MB-231. Além disso, ganhos significativos em termos de seletividade foram observados para a composição LpHSF-PTX (Tabela 3).

Tabela 3 - Valores de IC50 calculados para as linhagens de células tumorais e normais*.

Linhagem Celular	IC50 (μΜ) PTX livre	IC50 (μΜ) LpHS-PTX	IC50 (μΜ) LpHSF-PTX	IC50 (nM) LpHSF-PTX + AF (1mM)
MCF-7	660,7 ± 42,5	214,1 ± 16,7	97,6 ± 9,5	357,8 ± 59,0
MDA-MB- 231	689,3 ± 32,8	183,1 ± 36,6	15,7 ± 1,4	449,9 ± 11,2
L929	2573,3 ± 576,6	1257,5 ± 81,0	4177 ± 1038,2	-

*Valores expressos com média ± desvio padrão (n = 3).

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Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composições de lipossomas multifuncionalizados com agentes antineoplásicos caracterizadas por compreender dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), hemisuccinato de colesterila (CHEMS), diestearoilfosfatidiletanolamina associada ao polietilenoglicol 2000 (DSPEPEG2000), diestearoilfosfatidiletanolamina associada ao folato e ao polietilenoglicol 2000 (DSPE-folato:PEG2000).
2. 2. Composições de lipossomas multifuncionalizados com agentes antineoplásicos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por carrear PTX (LpHSF-PTX) ou outros agentes antineoplásicos, preferencialmente PTX.
3. 3. Processo de preparação das composições definidas nas reivindicações 1 e 2 caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   a) dissolução dos lípides DOPE, CHEMS, DSPE-PEG2000 e DSPEfolato-PEG2000 em clorofórmio na concentração lipídica de 10 mM a 40mM, mantendo a razão molar entre os lípides igual a 5,7:3,8:0,45: 0,05, respectivamente) e transferidas para um balão de fundo redondo;

   b) evaporação do solvente com auxílio de um rotavapor acoplado a uma bomba de vácuo sob pressão reduzida, até a formação do filme lipídico nas paredes do balão;

   c) adição de uma solução de NaOH 150 a 450 mM ao filme em quantidade equimolar suficiente para ionização do CHEMS, hidratação do filme lipídico com solução de NaCl 0,9% (p/v) e agitação vigorosa, em vórtex, até que a obtenção de uma dispersão homogênea de lipossomas multilamelares (MLV);

   d) transferência dos lipossomas para recipiente em banho de gelo e calibração do tamanho dos lipossomas mediante sonicação, com

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   2/2 sonda de titânio, por um período de 1 a 15 minutos a uma potência de 100 W;

   e) separação da fração do fármaco não encapsulada nos lipossomas, insolúvel no meio, juntamente com possíveis partículas de titânio liberados pela sonda, foram separados mediante centrifugação a 1000 a 3000 rpm por 10 a 30 minutos e a 4°C;

   f) O sobrenadante contendo o fármaco encapsulado nos lipossomas é separado e em seguida armazenado em geladeira a 5 ± 3°C.
4. 4. Processo de preparação das composições, de acordo com a reivindicação 3, etapa “a”, caracterizado por adicionar uma solução de PTX ou outro antineoplásico lipofílico em clorofórmio variando de 0,05% a 0,2% (p/v) para o preparo de LpHSF-PTX.
5. 5. Processo de preparação das composições, de acordo com a reivindicação 3, etapa “e” e “f”, caracterizado pelo fármaco ser preferencialmente PTX.

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   FIGURAS