BR122021024957B1 - Processos de produção de uma composição de irinotecano lipossômico estabilizado em armazenamento - Google Patents

Processos de produção de uma composição de irinotecano lipossômico estabilizado em armazenamento Download PDF

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lyso
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Daryl C. Drummond
Dmitri B. Kirpotin
Mark Eamon Hayes
Charles Noble
Kevin Kesper
Antoine M. Awad
Douglas J. Moore
Andrew J. O'brien
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Ipsen Biopharm Ltd
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Abstract

A invenção refere-se aos lipossomas de fosfolipídio de irinotecano com estabilidade de armazenamento aprimorada que são fornecidos, com os métodos relacionados de tratamento e fabricação. Os lipossomas com irinotecano podem ter formação reduzida de lisofosfatidilcolina (liso-PC) durante o armazenamento, e antes da administração a um paciente.

Description

Dividido do BR112018006922-1, depositado em 15.10.2016. REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício dos Pedidos de Patente Provisórios Norte-Americanos Nos. de Série 62/242.835 (depositado em 16 de outubro de 2015), 62/242.873 (depositado em 16 de outubro de 2015), 62/244.061 (depositado em 20 de outubro de 2015) e 62/244.082 (depositado em 20 de outubro de 2015), cada qual sendo incorporado na presente invenção por referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[002] Esta divulgação refere-se à estabilização de composições farmacêuticas compreendendo compostos de camptotecina, incluindo formulações farmacêuticas lipossomais de camptotecina estabilizadas para reduzir a formação de lisolipídios durante o armazenamento.
ANTECEDENTES
[003] Compostos de camptotecina (como irinotecano ou topote- cano) podem ser usados para tratar um tumor e/ou câncer no corpo humano. Por exemplo, produtos farmacêuticos em lipossomas injetáveis para o tratamento de certas formas de câncer podem ser preparados como dispersões de lipossomas encapsulando compostos de camptotecina. As composições lipossomais de camptotecina podem encapsular o composto camptotecina juntamente com um agente de retenção polianiônico dentro de um lipossoma compreendendo coles-terol e um ou mais fosfolipídio(s) ("PL"). No entanto, a hidrólise dos fosfolipídios e a hidrólise da estrutura lactona ativa na camptotecina podem ocorrer em lipossomas de camptotecina com um ou mais de fosfolipídios. A decomposição hidrolítica de um fosfolipídio lipossomal, como uma fosfatidilcolina ("PC"+) pode alterar a liberação do composto camptotecina, por exemplo, irinotecano, dos lipossomas. A primeira etapa na hidrólise da PL (como PC) pode levar à formação de liso-PL (como lisofosfatidilcolina ("liso-PC"), que é um monoéster de ácido graxo da glicerilfosfocolina).
[004] As composições de camptotecina lipossomais são afetadas pelo pH em pelo menos dois aspectos. Primeiro, a decomposição hi- drolítica dos fosfolipídios de captotecina lipossomais (por exemplo, iri- notecano lipossomal) tende a ser dependente de pH, e acredita-se que um pH de 6,0 ou 6,5 minimize a hidrólise da fosfatidilcolina. Condições onde o pH está acima de 6,5 tendem a aumentar (1) a conversão dos compostos camptotecina, por exemplo, irinotecano, para a forma de carboxilato menos ativa e (2) a quantidade de liso-PC nos lipossomas. Em segundo lugar, compostos de camptotecina passam por uma con-versão dependente de pH entre uma forma de carboxilato menos ativa (predominância em pH neutro e alcalino) e uma forma de lactona mais ativa, predominante em pH ácido. Por exemplo, a conversão da forma carboxilato de irinotecano na forma de lactona ocorre principalmente entre pH 6,0 (cerca de 85% do irinotecano está sob a forma de lactona mais ativa) e pH 7,5 (apenas cerca de 15% do irinotecano está sob a forma de lactona mais ativa). Em pH 6,5, cerca de 65% do irinotecano está sob a forma de lactona mais ativa.
[005] Verificou-se inesperadamente que a estabilidade das camp-totecinas lipossomais contendo fosfolipídio preparadas a um pH de 6,5 foi negativamente afetada pela formação de liso-PC durante o armazenamento sob condições refrigeradas (2 a 8 °C). Por exemplo, uma composição de lipossomas de irinotecano da Amostra 12 (octassulfato de irinotecano sacarose encapsulado em lipossomas de irinotecano compreendendo DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE em uma razão molar de 3:2:0,015, preparada em pH 6,5) gerou posteriormente níveis de liso-PC superiores a 30% em mol (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nas composições de lipossomas de irinotecano) durante os primeiros 3 meses após a fabricação (e mais de 35% em mol de liso-PC gerado durante os primeiros 9 meses) de armazenamento sob refrigeração (2 a 8 °C) .
[006] Portanto, ainda há uma necessidade de composições farmacêuticas estabilizadas de camptotecina. Por exemplo, há uma necessidade de formulações lipossomais aprimoradas e mais estáveis de irinotecano gerando menos liso-PC durante o armazenamento sob refrigeração a 2 a 8 °C após a fabricação. A presente invenção aborda essa necessidade.
SUMÁRIO
[007] A presente invenção fornece novas composições farmacêu ticas de camptotecina (por exemplo, irinotecano lipossomal) com estabilidade aprimorada, incluindo composições lipossomais de camptote- cina, compreendendo fosfolipídios contendo éster com taxas reduzidas de formação de lisofosfolipídios ("liso-PL") (por exemplo, lisofosfatidil- colina ou "liso-PC"). A presente invenção baseia-se, em parte, no reconhecimento surpreendente de que composições lipossomais dos compostos camptotecina (por exemplo, irinotecano) podem ser fabricadas que geram quantidades reduzidas de lisofosfolipídios após armazenamento prolongado a 2 a 8 °C. A fabricação de tais composições lipossomas estabilizadas é possibilitada pela constatação inesperada de que o controle específico dos parâmetros durante a fabricação do lipossoma (a razão de fármaco-para-fosfolipídio em relação à quantidade de agente de retenção, o pH da preparação lipossomal e a quantidade de agente de retenção de contra-íons na preparação lipos- somal) reduz sinergisticamente a formação de lisofosfolipídios durante o armazenamento da preparação lipossomal de camptotecina. A invenção fornece informações extremamente valiosas para projetar e identificar composições lipossomais aprimoradas, que são mais robustas, reduzindo os custos associados ao desenvolvimento de tais composições.
[008] Composições de camptotecina estabilizadas compreenden do um ou mais fosfolipídio(s) (incluindo fosfolipídio(s) contendo PEG), de preferência de não mais do que 20% em mol de liso-PL (em relação ao total de fosfolipídios lipossomais) durante o armazenamento nos primeiros 6 meses de armazenamento a 4 °C e/ou não mais de 25% em mol de liso-PL durante o armazenamento nos primeiros 9 meses de armazenamento a 4 °C. Os lipossomas de irinotecano estabilizados formam de preferência liso-PL a uma taxa média de menos de cerca de 2% em mol (por exemplo, de 0,5 a 1,5% em mol) de liso-PL por mês durante os primeiros 9 meses de armazenamento a 4 °C após a fabricação das composições de camptotecina. As composições preferenciais de camptotecina estabilizadas incluem irinotecano ou um sal do mesmo (por exemplo, octassulfato de irinotecano sacarose) em composições de irinotecano lipossomais compreendendo colesterol e um ou mais fosfolipídio(s) (incluindo fosfolipídio(s) contendo PEG, que formam não mais do que 20% em mol de liso-PC (em relação ao total de fosfolipídios lipossomais) durante o armazenamento por 6 meses a 4 °C e/ou não mais de 25% em mol de liso-PC durante o armazenamento durante 9 meses a 4 °C (por exemplo, durante os primeiros 6 ou 9 meses de teste de estabilidade após a fabricação). Os lipossomas de irinotecano estabilizados podem formar liso-PC a uma taxa de menos de cerca de 2% em mol (por exemplo, de 0,5 a 1,5% em mol) de liso-PC por mês durante o armazenamento a 4 °C (por exemplo, durante os primeiros 9 meses de testes de estabilidade após a fabrica-ção). Composições estabilizadas de lipossomas de irinotecano contendo fosfatidilcolina podem gerar menos de 1 mg de liso-PC durante os 9 primeiros meses de testes de estabilidade a 2 a 8 °C após a fabri-cação.
[009] Em uma primeira modalidade, as composições estabiliza das lipossomais de camptotecina têm um pH maior do que 6,5 (por exemplo, de 7,0 a 7,5, incluindo 7,25, 7,3 ou 7,5) e compreendem os lipossomas encapsulando irinotecano e um agente de retenção de sulfato polianiônico (por exemplo, sucrossulfato de irinotecano, ou "SOS") tendo uma razão equivalente-grama ("ER") de composto irinoteca- no/sulfato que é maior do que 0,9 (por exemplo, de 0,9 a 1,1). A ER pode ser calculada para uma preparação de lipossoma de SOS irino- tecano determinando as quantidades molares de irinotecano liposso- malmente encapsulado (I) e de composto sulfato (S) por unidade (por exemplo, 1 mL) da composição de lipossoma, e usando a fórmula: ER = I/(SN), onde N é a valência do ânion do composto sulfato (por exemplo, para o sucrossofato, N é 8, e para o sulfato livre, SO42-, N é 2). Preferencialmente, o composto sulfato (S) é octassulfato de sacarose, contendo 8 porções de sulfato por mol de SOS.
[0010] Em uma segunda modalidade, as composições estabilizadas lipossomais de camptotecina são obtidas usando razões particulares de camptotecina, um agente de retenção aniônico e fosfolipídios de formação de lipossoma tendo uma razão de estabilidade ("SR") que é, de preferência, maior que cerca de 950 (por exemplo, 950 a 1050), incluindo lipossomas de irinotecano preparados com uma SR maior do que cerca de 990 (por exemplo, de 990 a 1.100, incluindo de 992 a 1.087). Essa modalidade proporciona critérios de fabricação que são preditivos da estabilidade dos lipossomas, tal como é refletido por uma razão de estabilidade, conforme é explicado mais detalhadamente abaixo. Essa modalidade da invenção baseia-se em parte na descoberta de que os lipossomas contendo camptotecina à base de fosfoli- pídio são feitos pela reação de (1) compostos camptotecina (por exemplo, irinotecano, topotecano e similares) com (2) lipossomas en- capsulando um agente de retenção aniônico polissulfatado (por exemplo, octassulfato de sacarose), a estabilidade dos lipossomas com fármaco resultantes depende da concentração inicial de grupos sulfato nos lipossomas de agente de retenção e na razão da camptotecina encapsulada para o fosfolipídio nos lipossomas. A razão de estabilidade é definida como: SR = A B, onde: A é a quantidade de porção irino- tecano encapsulado nos lipossomas de agente de retenção durante o processo de carregamento de fármaco, em equivalentes-grama em relação à base anidra livre de irinotecano por mol de fosfolipídios na composição; e B é a concentração de grupos sulfato no sucrossofato (ou outro agente de retenção) usado para fazer os lipossomas de agente de retenção, expressa em mol/L (com base na concentração dos grupos sulfato). A razão de estabilidade previu surpreendentemente que grandes reduções na formação de liso-PC nos lipossomas contendo camptotecina à base de fosfolipídio, mesmo em pH 6,5:lipossomas de irinotecano contendo fosfatidilcolina preparados contendo uma razão de estabilidade de cerca de 942 (amostra 3) gerou 36% em mol de liso-PC, em comparação com cerca de 24% em mol de liso-PC gerado nos lipossomas de irinotecano preparados com uma razão de estabilidade de cerca de 990 (amostra 2), depois de 9 meses de armazenamento a 4 °C (ou seja, aumentando a razão de estabilidade em cerca de 5%, resultou em uma redução na geração de liso-PC de 34% sob essas condições). Ao contrário, o aumento da razão de estabilidade dos lipossomas de irinotecano por cerca de 30% de 724 (amostra 12) para 942 (amostra 3) resultou em cerca de 1% de mais liso-PC gerado após 9 meses de armazenamento a 4 °C (por exemplo, em comparação com 35,7% em mol de liso-PC na amostra 3 mol para 35,4% de liso-PC na amostra 12).
[0011] Em uma terceira modalidade, as novas composições estabilizadas de lipossomas encapsulando irinotecano com quantidades reduzidas de lisofosfatidilcolina (liso-PC) geradas durante o armazenamento a 2 a 8 °C podem compreender a composição de irinotecano de fórmula (I), onde x é 8.
[0012] O irinotecano lipossomal pode compreender a composição da fórmula (I) encapsulada nos lipossomas. Preferencialmente, a composição de fórmula (I) é formada (por exemplo, precipitada) dentro dos lipossomas compreendendo colesterol e um ou mais fosfolipídio(s) (por exemplo, incluindo fosfolipídio(s) contendo PEG. Por exemplo, o composto de fórmula (I) pode ser formado dentro dos lipossomas reagindo (1) (um) composto(s) de camptotecina (por exemplo, irinotecano, topotecano e similares) com (2) lipossomas encapsulando um agente de retenção aniônico polissulfatado (por exemplo, octassulfato de sacarose), em um processo que forma uma composição de irinotecano lipossomal estabilizada. De preferência, a composição de irinotecano lipossomal tem um pH maior do que 6,5 (por exemplo, de 7,0 a 7,5, incluindo 7,25, 7,3 e 7,5).
[0013] As composições de camptotecina estabilizadas preferenci ais incluem composições de irinotecano lipossomais compreendendo irinotecano ou um sal da mesma (por exemplo, octassulfato de irinote- cano sacarose) encapsulado nos lipossomas de irinotecano compreendendo colesterol e os fosfolipídios 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC) e polietilenoglicol-diestearoilfosfatidiletanolamina terminado em metóxi (por exemplo, MPEG-2000-DSPE) em um tampão isotônico aquoso, a dita composição de irinotecano lipossomal contendo (ou formando) menos de 10% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) após os primeiros 3 meses de armazenamento a 2 a 8 °C, contendo (ou formando) menos de 20% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) após os primeiros 6 meses (ou 180 dias) de armazenamento a 2 a 8 °C, e/ou contendo (ou formando) menos de 25% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) após os primeiros 9 meses de armazenamento a 2 a 8 °C (por exemplo, durante os primeiros 9 meses de teste de estabilidade após a fabricação).
[0014] Os lipossomas de irinotecano preferencialmente compreen dem colesterol, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e polie- tilenoglicol-diestearoilfosfatidiletanolamina terminado em metóxi (por exemplo, MPEG-2000-DSPE) em uma razão em mol de 3:2:0,015, encapsulando 500 mg (± 10%) de irinotecano por mmol total de fosfolipí- dio de lipossoma. As composições de irinotecano lipossomal estabilizadas de preferência compreendem lipossomas de irinotecano fornecendo um total de cerca de 4,3 mg de porção de irinotecano por mL da composição de irinotecano lipossomal, com pelo menos cerca de 98% de irinotecano encapsulado nos lipossomas de irinotecano (por exemplo, como octassulfato de irinotecano sacarose, tal como um composto de fórmula (I) acima). Certas composições lipossomais preferenciais são composições de irinotecano lipossomais estabilizadas tendo um pH de 7,00 a 7,50 (por exemplo, 7,0, 7,25, 7,3, 7,5) e compreendem uma dispersão de lipossomas de irinotecano encapsulando octassulfa- to de irinotecano sacarose em vesículas de bicamada unilamelar con-sistindo em colesterol e nos fosfolipídios 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC) e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), em uma concentração de porção irinotecano equivalente a, em g de base anidra de irinotecano livre, 500 mg (± 10%) de irinotecano por mmol de fosfolipí- dio de lipossoma total e 4,3 mg/mL de irinotecano por mL de composição de irinotecano lipossomal, a composição de irinotecano lipossomal estabilizada ao armazenamento estabilizada para formar menos de 1 mg/mL de liso-PC durante os primeiros 6 meses de armazenamento a 4 °C. Por exemplo, certas composições de irinotecano lipossomais farmacêuticas preferenciais compreendem irinotecano ou um sal do mesmo (por exemplo, octassulfato de irinotecano sacarose) encapsu-lado em irinotecano a 4,3 mg/mL de porção de irinotecano, 6,81 mg/mL de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 2,22 mg/mL de colesterol e 0,12 mg/L de polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE) em um tampão isotônico aquoso, a dita composição de lipossoma contendo menos de 10% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) após 3 meses de armazenamento a 2 a 8 °C contendo menos de 20% em mol de li- sofosfatidilcolina (liso-PC) após 6 meses (ou 180 dias) de armazenamento a 2 a 8 °C, e/ou contendo menos de 25% em mol de lisofosfati- dilcolina (liso-PC) após 9 meses de armazenamento a 2 a 8 °C.
[0015] Em algumas modalidades, a composição lipossomal é feita por um método que compreende colocar em contato uma solução contendo a porção irinotecano com um lipossoma de agente de retenção encapsulando um trietilamônio (TEA) e o agente de retenção octassul- fato de sacarose (SOS) a um concentração de 0,4 a 0,5 M (com base na concentração do grupo sulfato), como TEA8SOS (de preferência a solução de agente de retenção TEA8SOS) sob condições eficazes para carregar 500 g (± 10%) da porção de irinotecano/mol de fosfolipídio no lipossoma do agente de retenção contendo PL e permitir a liberação do cátion TEA do lipossoma do agente de retenção para formar os lipossomas de irinotecano SOS, e (b) combinando os lipossomas de irinotecano SOS com ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1- il]etanossulfônico (HEPES) para obter uma composição de lipossoma com irinotecano tendo um pH de 7,25 a 7,50, para obter uma composição de lipossoma com irinotecano estabilizada para formar menos de 10% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) ( em relação à quantidade total de fosfatidilcolina na composição de lipossoma com irinotecano) durante 3 meses de armazenamento a 4 °C.
[0016] Por exemplo, a invenção fornece uma composição de lipos- soma de irinotecano compreendendo lipossomas de irinotecano estabilizados encapsulando octassulfato de irinotecano sacarose (SOS) em uma vesícula de bicamada lipídica unilamelar de aproximadamente 110 nm de diâmetro, consistindo em 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), em que os lipossomas de irinotecano estabilizados são obtidos por um processo compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato o irino- tecano com um lipossoma de agente de retenção encapsulando um cátion trietilamônio (TEA) e o agente de retenção octassulfato de sacarose (SOS) a uma concentração de 0,4 a 0,5 M (baseada na concentração do grupo sulfato), como TEA8SOS sob condições eficazes para carregar 500 g (± 10%) da porção de irinotecano/mol de fosfolipídio no lipossoma do agente de retenção e permitir a liberação do cátion TEA do lipossoma do agente de retenção para formar os lipossomas com irinotecano SOS, e (b) combinar os lipossomas com irinotecano SOS com ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) para obter uma composição de lipossoma com irinotecano tendo um pH de 7,25 a 7,50, para obter uma composição de lipossoma com iri- notecano estabilizada para formar menos de 10% em mol de lisofosfa- tidilcolina (liso-PC) (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nas composições de lipossoma com irinotecano) durante 3 meses de armazenamento a 4 °C.
[0017] As composições de irinotecano lipossomais são úteis no tratamento de pacientes diagnosticados com várias formas de câncer. Por exemplo, o irinotecano lipossomal pode ser administrado para o tratamento de câncer de pulmão de pequenas células (SCLC) sem outros agentes antineoplásicos. Em algumas modalidades, as composições de irinotecano lipossomais são administradas em combinação com outros agentes antineoplásicos. Por exemplo, uma composição de irinotecano lipossomal, 5-fluoruracila, e leucovorina (sem outros agentes antineoplásicos) pode ser administrada para o tratamento de pacientes com adenocarcinoma metastático do pâncreas com progressão de doença após a terapia à base de gencitabina. Uma composição de irinotecano lipossomal, 5-fluoruracila, leucovorina e oxali- platina (sem outros agentes antineoplásicos) pode ser administrada para o tratamento de pacientes diagnosticados com câncer de pâncreas previamente não tratado. Uma composição de irinotecano lipos- somal, 5-fluorouracila, leucovorina e um inibidor do EGFR (por exemplo, um inibidor do EGFR de anticorpo oligoclonal, como MM-151) pode ser administrada para o tratamento de pacientes diagnosticados com câncer colorretal.
[0018] A menos que seja indicado de outra forma neste relatório descritivo, as composições lipossomas contêm uma quantidade de iri- notecano em gramas (em forma de sal ou base livre) em relação aos mols de fosfolipídio em uma razão equivalente àquela fornecida por 471 g ou 500 g (± 10%) de base livre de irinotecano por mol de fosfoli- pídio.
[0019] Conforme utilizado na presente invenção (e a menos que seja especificado de outra forma), “porção de irinotecano” refere-se unicamente à lactona de irinotecano; ou seja, a base livre anidra da lactona de irinotecano.
[0020] Conforme utilizado na presente invenção (e a menos que seja especificado de outra forma), o termo “camptotecina” inclui camp- totecina e derivados de camptotecina incluindo irinotecano, topoteca- no, lurtotecano, silatecano, etirinotecano pegol, TAS 103, 9-aminocamptotecina, 7-etilcamptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9- nitrocamptotecina, 10,11-metilenodioxicamptotecina, 9-amino-10,11- metilenodioxicamptotecina, 9-cloro-10,11-metilenodioxicamptotecina, (7-(4-metilpiperazinometileno)-10,11-etilenodióxi-20(S)-camptotecina, 7-(4-metilpiperazinometileno)-10,11-metilenodióxi-20(S)-camptotecina e 7-(2-N-isopropilamino)etil)-(20S)-camptotecina e estereoisômeros, sais e ésteres dos mesmos.
[0021] Conforme utilizado na presente invenção (e a menos que seja especificado de outra forma), “DLS” refere-se ao espalhamento de luz dinâmico e "BDP" refere-se ao produto de fármaco a granel.
[0022] Em algumas modalidades, os lipossomas da presente in venção encapsulam um ou mais agentes que retêm o fármaco farmacêutico dentro dos lipossomas (doravante referido como agentes de retenção).
[0023] Como usado neste relatório descritivo, "composições de liberação prolongada" incluem composições de irinotecano que proporcionam de 80 a 125% dos seguintes parâmetros farmacocinéticos quando são administradas aos seres humanos na dose correspondente a 70 mg/m2 de base livre de irinotecano, uma vez a cada duas semanas: Cmax 37,2 (8,8) μg de irinotecano (como base livre anidra)/mL e AUCO-~ 1364 (1048) h^μg de irinotecano/mL (para irinotecano); ou (para SN-38), Cmax 5,4 (3,4) μg de SN-38 (como base livre ani- dra)/mL; AUCo- 620 (329) h-ng SN-38/mL.
[0024] A menos que seja indicado de outra forma, as preparações lipossomais podem compreender vesículas (por exemplo, esféricas ou substancialmente esféricas) com pelo menos uma bicamada lipídica e podem, opcionalmente, incluir vesículas multilamelares e/ou unilamela- res, e vesículas que encapsulam e/ou não encapsulam compostos farmaceuticamente ativos (por exemplo, camptotecinas) e/ou agentes de retenção. Por exemplo, a menos que seja indicado de outra forma, uma preparação lipossomal farmacêutica compreendendo lipossomas de camptotecina pode opcionalmente incluir lipossomas que não compreendem um composto camptotecina, incluindo uma mistura de lipos- somas unilamelares e multilamelares com ou sem composto(s) de camptotecina e/ou agente(s) de retenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0025] Figura 1A mostra uma representação esquemática de um lipossoma com irinotecano que encapsula um espaço aquoso contendo irinotecano em um estado gelificado ou precipitado como o sal de octassulfato de sacarose.
[0026] Figura 1B mostra uma seção transversal equatorial do li- possoma com irinotecano na figura 1A.
[0027] Figura 2A é um gráfico dos valores de taxa de estabilidade em comparação com as quantidades relativas de liso-PC (% em mol) das composições de lipossomas de irinotecano líquidas após 9 meses de armazenamento a 4 °C, tendo as composições de lipossomas os valores de pH designados após a fabricação, porém antes do armazenamento.
[0028] Figura 2B é um gráfico dos valores de taxa de estabilidade em comparação com as quantidades relativas de liso-PC (% em mol) das composições de lipossomas de irinotecano líquidas após 6 meses de armazenamento a 4 °C, tendo as composições de lipossomas os valores de pH designados após a fabricação, porém antes do armazenamento.
[0029] Figura 2C é um gráfico dos valores de taxa de estabilidade em comparação com as quantidades relativas de liso-PC (% em mol) das composições de lipossomas de irinotecano líquidas após 6 meses de armazenamento a 4 °C, tendo as composições de lipossomas os valores de pH designados após a fabricação, porém antes do armazenamento.
[0030] Figura 3A é um gráfico das quantidades relativas de liso-PC (% em mol) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de duas composições de lipossomas de irinotecano com uma razão de estabilidade de 1047 e um pH de 6,5.
[0031] Figura 3B é um gráfico das quantidades relativas de liso-PC (% em mol) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de duas composições de lipossomas de irinotecano com razões de estabilidade de 992 e 942, respetivamente, e um pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 6,5.
[0032] Figura 3C é um gráfico das quantidades relativas de liso-PC (% em mol) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de uma composição de lipossoma com irinotecano com uma razão de estabilidade de 785 e um pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 6,5.
[0033] Figura 3D é um gráfico das quantidades relativas de liso-PC (% em mol) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de duas composições de lipossomas de irinotecano tendo uma razão de estabilidade de cerca 724, preparada usando TEA8SOS em uma concentração de grupo sulfato de 0,65 M e tendo um pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 6,5.
[0034] Figura 4A é um gráfico das quantidades relativas de liso-PC (% em mol) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de três composições de lipossomas com irinotecano com uma razão de estabilidade de cerca de 1047 e um pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 7,25. A amostra de lipossoma 5 (quadrado aberto) foi preparada em uma concentração de porção de irino- tecano equivalente àquela fornecida por 5 mg/mL de cloridrato de iri- notecano tri-hidratado, enquanto a amostra de lipossoma 13 (triângulo fechado) foi, da mesma forma, preparada a 20 mg/mL de cloridrato de irinotecano tri-hidratado. Os lipossomas nas amostras 13 foram preparados da mesma forma como no exemplo 5, mas os componentes li- possomais (ou seja, fosfolipídios, colesterol, irinotecano e sucrossofa- to) por mililitro na composição de lipossoma final aumentou quatro vezes em comparação com a amostra 5.
[0035] Figura 4B é um gráfico das quantidades relativas de liso-PC (% em mol) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de duas composições de lipossomas de irinotecano com razões de estabilidade de cerca de 1047 e valores de pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 7,25 e 7,5.
[0036] Figura 4C é um gráfico das quantidades relativas de liso-PC (% em mol) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de duas composições de lipossomas de irinotecano com razões de estabilidade de cerca de 785 e valores de pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 7,25 e 7,5.
[0037] Figura 5 é um gráfico da concentração de liso-PC (mg/mL) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C de três composições de lipossomas com irinotecano com uma razão de estabilidade de 1046 a 1064 e um pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 7,3.
[0038] Figura 6 é um gráfico da concentração de liso-PC (mg/mL) em comparação com os meses de armazenamento a 4 °C em três composições de lipossomas com irinotecano com uma razão de estabilidade de 1046 a 1064 e um pH após a fabricação, porém antes do armazenamento, de 7,3.
[0039] Figura 7 é um gráfico da taxa estimada de formação de liso- PC (mg/mL/mês) durante o armazenamento a 4 °C, em composições de lipossomas com irinotecano com várias quantidades de amônio substituído (TEA protonado).
[0040] Figura 8 é um gráfico das quantidades em gramas equiva lentes de irinotecano e sucrossofato no precipitado formado pela combinação, em solução aquosa, de cloridrato de irinotecano tri-hidratado e sucrossofato de trietilamônio em várias proporções, ou seja, em razões em gramas equivalentes de 1:9 a 9:1. O eixo x mostra a quantidade total de gramas equivalentes relativa de sucrossofato de trietila- mônio (SOS) nas amostras, em referência às gramas equivalentes de base livre anidra de irinotecano.
[0041] Figura 9 mostra um gráfico representando graficamente o tamanho de partícula médio de 12 diferentes números de lote de produtos de lipossoma de octassulfato de irinotecano sacarose armazenados durante um período de 12 a 36 meses, a 4 °C, com regressões lineares para os dados obtidos para cada amostra.
[0042] Figura 10 é um gráfico do índice de polidispersividade do tamanho de partícula (PDI) dos números de lote do produto octassulfa- to de irinotecano sacarose mostrados na figura 9, com regressões lineares para os dados obtidos para cada amostra.
[0043] A figura 11A é um gráfico do pH de 13 diferentes numerous de lote do produto de octassulfato de irinotecano sacarose armazenado durante um período de 12 a 36 meses, a 4 °C, com regressões lineares para os dados obtidos para cada amostra.
[0044] Figura 11B é um gráfico do pH de 16 diferentes números de lote do produto de octassulfato de irinotecano sacarose armazenados durante um período de 12 meses a 4 °C, com regressões lineares para os dados obtidos para cada amostra.
[0045] Figura 12 é um gráfico da concentração de liso-PC (mg/mL) em 36 meses em duas composições de lipossomas com irinotecano, e as regressões lineares de melhor ajuste aos pontos de dados respectivos obtidos de cada amostra de lipossoma com irinotecano.
[0046] Figura 13A é um cromatograma representativo para o mé todo A em escala completa.
[0047] Figura 13B é um cromatograma representativo para o mé todo A em escala ampliada.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0048] Composições de camptotecina estabilizadas podem incluir lipossomas encapsulando um ou mais composto(s) de camptotecina. Os lipossomas podem ser usados para a administração de medicamentos, incluindo quimioterápicos. A presente invenção fornece composições contendo fosfolipídio estabilizadas dos compostos de camp- totecina, por exemplo, irinotecano lipossomal, que geram quantidades menores de lisofosfolipídios, por exemplo, liso-PC.
[0049] Os lipossomas de camptotecina podem encapsular uma camptotecina com um agente de retenção dentro de uma composição lipídica (por exemplo, uma vesícula contendo fosfolipídio). Por exemplo, a figura 1A mostra uma representação esquemática representando um lipossoma com irinotecano com diâmetro de cerca de 110 nm e tendo uma membrana lipídica encapsulando irinotecano. A membrana lipídica nesta representação esquemática contém o fosfolipídio contendo éster MPEG-DSPE-2000. Os lipídios MPEG-DSPE-2000 estão localizados na camada lipídica interna e externa da membrana de bi- camada, como resultado do que, as suas porções de PEG estão localizadas dentro do lipossoma ou na superfície externa dos lipossomas, respectivamente. Figura 1B mostra uma seção transversal de uma modalidade particular do lipossoma genericamente representado na figura 1A, em que a membrana da bicamada lipídica unilamelar inclui DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE e encapsula octassulfato de irinotecano sacarose.
[0050] Verificou-se agora que novas composições de lipossomas com irinotecano estabilizadas compreendendo fosfolipídios contendo éster podem ser feitas, que têm baixos níveis de liso-PC mesmo após o armazenamento prolongado a 2 a 8 °C, como a 4 °C, incluindo os lipossomas que encapsulam octassulfato de irinotecano sacarose (SOS) (lipossomas com irinotecano-SOS) e têm formação de liso-PC significativamente reduzida durante o armazenamento sob refrigeração. A presente invenção é baseada, em parte, em várias observações inesperadas. Primeiro, as composições de lipossomas com irinoteca- no-SOS têm, surpreendentemente, menos liso-PC durante o armazenamento refrigerado quando a quantidade de irinotecano encapsulado é aumentada em relação à quantidade de agente de retenção SOS coencapsulado. Em segundo lugar, as composições de lipossomas com irinotecano-SOS têm, surpreendentemente, menos liso-PC durante o armazenamento sob refrigeração quando o pH do meio aquoso contendo os lipossomas com irinotecano-SOS, após a fabricação, porém antes do armazenamento, é acima de 6,5. Em terceiro lugar, as composições de lipossomas com irinotecano-SOS têm, surpreendentemente, menos liso-PC quando a quantidade de agente de retenção lipossomal residual de amônio/cátion amônio substituído analisado na composição é inferior a 100 ppm.
Lipídios constituintes das composições lipossomais de campto- tecina
[0051] Uma variedade de lipídios, e especialmente de fosfolipídios, são conhecidos na técnica que podem ser constituintes dos liposso- mas, como a fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina, e fazer lipossomas com outros tais fosfolipídios está compreendido na habilidade de uma pessoa versada na técnica. Em algumas modalidades, os lipossomas das presentes invenções são compostos de 1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol terminado em metó- xi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE). Abaixo são descritas as modalidades preferenciais dos lipídios presen-tes nas preparações de lipossoma divulgadas na presente invenção.
[0052] Os componentes lipossomais podem ser selecionados para produzir a membrana da bicamada lipossomal, que forma vesículas unilamelares e/ou multilamelares encapsulando e retendo a substância ativa até que ela seja liberada ao local do tumor. De preferência, as vesículas de lipossomas são unilamelares. Os componentes liposso- mais são selecionados por suas propriedades quando combinados para produzir lipossomas capazes de carregar e reter ativamente a substância ativa, mantendo ao mesmo tempo a baixa ligação proteica in vivo e o consequentemente prolongamento de seu tempo de vida cir-culante.
[0053] DSPC é, preferencialmente, o principal componente lipídico na bicamada do lipossoma encapsulando irinotecano (por exemplo, compreendendo 74,4% do peso total de todos os ingredientes lipídi- cos). DSPC tem uma temperatura de transição de fase (Tm) de 55 °C.
[0054] O colesterol pode, preferencialmente, compreender cerca de 24,3% do peso total de todos os ingredientes lipídicos. Ele pode ser incorporado em uma quantidade eficaz para estabilizar as membranas fosfolipídicas lipossomais, de modo que elas não sejam rompidas por proteínas plasmáticas, para diminuir o grau de ligação das opsoninas plasmáticas responsáveis pela liberação rápida dos lipossomas da circulação, e para diminuir a permeabilidade dos solutos/fármacos em combinação com os fosfolipídios formadores da bicamada.
[0055] MPEG-2000-DSPE pode, preferencialmente, compreender cerca de 1,3% do peso total de todos os constituintes da bicamada li- pídica. Sua quantidade e presença na superfície do lipossoma com irinotecano podem ser selecionados para fornecer uma barreira estéri- ca mínima impedindo a agregação dos lipossomas. Os lipossomas revestidos com MPEG-2000-DSPErevestido da presente invenção são mostrados como sendo estáveis em relação ao tamanho e ao encap-sulamento do fármaco.
[0056] Em algumas modalidades, a membrana lipídica da preparação de lipossoma é, preferencialmente, composta pelos seguintes ingredientes: 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), na razão de cerca de uma molécula de fosfolipídio modificada com polietilenoglicol (PEG) para cada 200 moléculas de fosfolipídio sem PEG.
[0057] Em modalidades preferenciais, os lipossomas da presente invenção são feitos a partir de uma mistura de DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE combinados em uma razão molar de 3:2:0,015. Em modalidades preferenciais, as preparações de lipossoma da presente invenção incluem 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) a uma concentração de cerca de 6,81 mg/mL, colesterol a uma concentração de cerca de 2,22 mg/mL e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE) a uma concentração de cerca de 0,12 mg/mL.
[0058] Em mais modalidades preferenciais, as preparações de li-possoma da presente invenção incluem 1,2-diestearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC) a uma concentração de 6,81 mg/mL, colesterol a uma concentração de 2,22 mg/mL e polietilenoglicol terminado em me- tóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE) a uma concentração de 0,12 mg/mL.
Agentes de Retenção da Composição de Camptotecina
[0059] Em algumas modalidades, os lipossomas da presente in venção encapsulam um ou mais agentes que retêm o fármaco farmacêutico dentro dos lipossomas (doravante referido como agentes de retenção). O agente de retenção de preferência compreende um composto polianiônico com uma pluralidade de grupos carregados negativamente, ou compreende uma combinação de dois ou mais diferentes tais compostos. Em exemplos não limitantes, o agente de retenção polianiônico é um ânion bivalente, um ânion trivalente, um ânion polivalente polimérico, um poliol polianionizado ou um açúcar polianioni- zado. No contexto da presente invenção, o agente de retenção polia- niônico pode ser um poliol polianionizado ou açúcar, como um poliol ou um açúcar tendo seus grupos hidroxila completamente ou parcialmente modificados ou substituídos com grupos aniônicos (anioniza- dos). Em um exemplo não limitante, o poliol polianionizado ou o açúcar polianionizado pode incluir uma porção poliol ou uma porção de açúcar juntamente com grupos aniônicos ligados aos mesmos. Preferencialmente, pelo menos um grupo aniônico de um agente de retenção de açúcar polianionizado ou poliol polianionizado é mais do que 50% ionizado em uma faixa de pH de 3 a 12, de preferência, de 6,5 a 8, quando em meio aquoso, ou, alternativamente, o(s) grupo(s) aniônico(s) tem/têm um pKa de 3 ou menos, de preferência de 2 ou menos. Em uma modalidade preferencial, o agente de retenção contém porções de sulfato com um pKa de 1,0 ou menos. Em um exemplo não limitan- te, um agente de retenção polianiônico pode ter uma densidade de carga pelo menos dois, três ou quatro grupos carregados negativa-mente por unidade, por exemplo, por átomo de carbono ou anel em uma cadeia carbônica ou por unidade de monossacarídeo em um açúcar.
[0060] Em algumas modalidades da presente invenção, a taxa de liberação da composição de lipossoma pode ser aumentada usando como um agente de retenção uma mistura de açúcar polianionizado ou de poliol polianionizado com um ou mais outros ânions monovalentes ou polivalentes, por exemplo, cloreto, sulfato, fosfato, etc. Em outro exemplo não limitante do aumento da taxa de liberação da composição de liberação prolongada, as misturas de diferentes açúcares polianio- nizados com vários graus de polianionização estão sendo usadas co-mo agente de retenção.
[0061] Em algumas modalidades, o grau de polianionização no interior dos lipossomas da presente invenção é superior a 90%, ou superior a 99%, ou entre 0,1% a 99%, 10% a 90% ou 20% a 80% do total do ânion(s) no interior dos lipossomas, por exemplo, com uma campto- tecina retida no lipossoma ou um composto derivado da camptotecina.
[0062] Em algumas modalidades, o agente de retenção é um açúcar sulfatado e/ou um poliol. Um açúcar sulfatado exemplar da presente invenção é a sacarose sulfatada incluindo, sem limitação, hexassul- fato de sacarose, heptassulfato de sacarose e octassulfato de sacarose (Consulte Ochi. K., et al., 1980, Chem. Pharm. Bull., v. 28, páginas 638 a 641). De forma semelhante, a reação com oxicloreto de fósforo ou clorofosfato de dietila na presença de catalisador básico resulta em polióis ou açúcares polifosforilados. Os polióis polifosforilados também são isolados de fontes naturais. Por exemplo, polifosfatos de inositol, como o hexafosfato de inositol (ácido fítico) podem ser isolados do mi-lho. Uma variedade de açúcares e polióis sulfatados, sulfonados e fos- forilados adequados para a prática da presente invenção são divulgados, por exemplo, na Patente Norte-Americana No. 5.783.568, que é incorporada na presente invenção por referência em sua totalidade. A complexação de polióis e/ou de açúcares com mais de uma molécula de ácido bórico também resulta em um produto polianionizado (polibo- rado). A reação de polióis e/ou de açúcares com dissulfeto de carbono na presença de base alcalina resulta em derivados polianionizados (poliditocarbonatado, polixantogenato). Um derivado de poliol ou de açúcar polianionizado pode ser isolado sob a forma de um ácido livre e neutralizado com uma base adequada, por exemplo, com um hidróxido de metal alcalino, hidróxido de amônio ou, preferivelmente, com uma amina substituída, por exemplo, com uma amina correspondente a um amônio substituído da presente invenção, em uma forma pura ou na forma de um hidróxido de amônio substituído que forma um sal polia- niônico de um amônio substituído da presente invenção. Alternativamente, um sal de sódio, potássio, cálcio, bário ou magnésio de um po- liol/açúcar polianionizado pode ser isolado e convertido em uma forma adequada, por exemplo, em uma forma de sal de amônio substituído, por qualquer método conhecido, por exemplo, por troca iônica. Exemplos não limitantes de agentes de retenção de açúcar sulfatados são compostos de sacarose sulfatada incluindo, sem limitação, hexassulfa- to de sacarose, heptassulfato de sacarose e octassulfato de sacarose (SOS). Agentes de retenção de poliol exemplares incluem polifosfatos de inositol, tais como hexafosfato de inositol (também conhecido como ácido fítico ou IHP) ou formas sulfatadas de outros dissacarídeos.
[0063] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o agente de retenção é um poliânion sulfatado, sendo um exemplo não limitativo do mesmo o octassulfato de sacarose (SOS). O sucrossofato é também referido como octassulfato de sacarose ou sucro- octassulfato (SOS). Métodos de preparação do sucrossofato sob a forma de vários sais, por exemplo, sais de amônio, sódio ou potássio, são bem conhecidos no campo (por exemplo, na Patente Norte- Americana 4.990.610, incorporada na presente invenção em sua totalidade). O octassulfato de sacarose (também referido como sucrosso- fato), é um éster de sulfato totalmente substituído de sacarose tendo, na sua forma totalmente protonada, a estrutura da fórmula (II):
[0064] Métodos de preparação do sucrossofato sob a forma de vários sais, por exemplo, sais de amônio, sódio ou potássio, são bem conhecidos no domínio (por exemplo, na Patente Norte-Americana No. 4.990.610 (que é incorporada na presente invenção por referência, em sua totalidade). Da mesma forma, formas sulfatadas de outros dissa- carídeos, por exemplo, de lactose e maltose, para produzir octassulfa- to de lactose e octassulfato de maltose, são previstas.
[0065] Em algumas modalidades, as formulações de lipossomas da presente invenção compreendem um composto de camptotecina, tal como irinotecano ou topotecano, e um agente de retenção aniônico, como SOS. Os lipossomas da presente invenção preferencialmente incluem o composto de camptotecina em uma razão estequiométrica com o agente de retenção aniônico. Por exemplo, uma formulação de lipossoma com irinotecano pode encapsular o irinotecano e um octas- sulfato de sacarose em uma razão molar de cerca de 8:1. As composições estabilizadas de lipossomas podem encapsular a composição de irinotecano de fórmula (I), em que x é cerca de 8:
[0066] O irinotecano lipossomal pode compreender a composição da fórmula (I) encapsulada nos lipossomas. Preferencialmente, a composição de fórmula (I) é formada (por exemplo, precipitada) dentro dos lipossomas compreendendo colesterol e um ou mais fosfolipídio(s) (por exemplo, incluindo fosfolipídio(s) contendo PEG. Por exemplo, o composto de fórmula (I) pode ser formado dentro dos lipossomas reagindo (1) (um) composto(s) de camptotecina (por exemplo, irinotecano, topotecano e similares) com (2) lipossomas encapsulando um agente de retenção aniônico polissulfatado (por exemplo, octassulfato de sacarose), em um processo que forma uma composição de irinotecano lipossomal estabilizada. De preferência, a composição de irinotecano lipossomal tem um pH maior do que 6,5 (por exemplo, de 7,0 a 7,5, incluindo 7,25, 7,3 e 7,5).
[0067] Composições de camptotecina estabilizadas preferenciais incluem o irinotecano lipossomal.
[0068] As composições de camptotecina estabilizadas incluem formulações lipossomais do(s) composto(s) de camptotecina de alta densidade contendo irinotecano ou um sal do mesmo em uma concentração de porção de irinotecano equivalente àquela fornecida por de 4,5 a 5,5 mg/mL de cloridrato de irinotecano tri-hidratado (ou seja, de 3,9 a 4,8 mg/mL de base livre anidra de irinotecano), e contém DSPC em uma concentração de 6,13 a 7,49 mg/mL (preferivelmente de cerca de 6,81 mg/mL), colesterol em uma concentração de 2 a 2,4 mg/mL (preferencialmente de cerca de 2,22 mg/mL) e MPEG-2000-DSPE em uma concentração de 0,11 a 0,13 mg/mL (preferivelmente de cerca de 0,12 mg/mL), e também fornece quantidades adequadas do(s) com- posto(s) de camptotecina, de preferência, em uma forma de lactona mais potente. A presente invenção inclui composições de lipossoma de composto(s) de camptotecina farmacêuticas que podem ser armazenadas sob refrigeração (ou seja, a 2 a 8 °C) durante pelo menos os primeiros 6 meses, de preferência pelo menos nos primeiros 9 meses após a fabricação e sem a formação dos níveis de liso-PC acima de 20% em mol. Mais preferencialmente, a presente invenção fornece composições contendo uma quantidade de porção de irinotecano equivalente à fornecida entre 4,7 e 5,3 mg/mL de cloridrato de irinote- cano tri-hidratado (isto é, de 4,1 a 4,6 mg de base anidra livre da porção de irinotecano) (o irinotecano pode estar presente como um sal de octassulfato de sacarose encapsulado nos lipossomas), juntamente com (DSPC) a 6,4 a 7,2 mg/mL, colesterol a 2,09 a 2,35 mg/mL e MPEG-2000-DSPE a cerca de 0,113 a 0,127 mg/mL que contém no máximo 20% em mol de liso-PC em 6 ou 9 meses quando armazenado a 2 a 8 °C, ou no máximo 2 mg/mL de liso-PC em 21 meses, quando armazenado em 2 a 8 °C.
Cálculo da Razão de Grama-Equivalente do Composto Irinoteca- no/Sulfato (ER)
[0069] Uma razão grama-equivalente (ER) do composto de irinote- cano/sulfato pode ser calculada para cada preparação de lipossoma com irinotecano determinando as quantidades molares de irinotecano lipossomalmente coencapsulado (I) e de composto sulfato (S) por unidade (por exemplo, 1 mL) da composição de lipossoma, e usando a fórmula: ER = I/(SN), onde N é a valência do ânion do composto sulfato (por exemplo, para o sucrossofato, N é 8, e para o sulfato livre, SO42-, N é 2). Por exemplo, a composição de sucrossofato de irinote- cano lipossomal que contém 7,38 mM de irinotecano e 1,01 mM de sucrossofato (N = 8) teria uma ER de 7,38/(1,01 x 8) = 0,913. Prefe-rencialmente, o composto sulfato (S) é octassulfato de sacarose, contendo 8 porções de sulfato por mol de SOS. A composição lipossomal terá um pH de 7,1 a 7,5 e tem uma das seguintes faixas de ER: preferencialmente, de 0,85 a 1,2, de 0,85 a 1,1 ou, mais preferencialmente, de 0,9 a 1,05, tal como cerca de 1,02. Alternativamente, a composição lipossomal terá uma quantidade da porção de irinotecano equivalente àquela fornecida por 500 g (± 10%) de base anidra de irinotecano livre por mol de fosfolipídio e nd tem uma das seguintes faixas de ER: de preferência de 0,85 a 1,1, e mais preferivelmente de 0,9 a 1,05, como cerca de 1,02.
pH da Composição Estabilizada de Camptotecina
[0070] O pH da composição lipossomal pode ser ajustado ou, de outro modo, selecionado para fornecer uma propriedade de estabilidade de armazenamento desejada (por exemplo, para reduzir a formação de liso-PC no lipossoma durante o armazenamento a 4 °C durante 180 dias), por exemplo, preparando a composição em um pH de cerca de 6,5 a 8,0 ou em qualquer valor de pH adequado entre esses valores (incluindo, por exemplo, de 7,0 a 8,0 e 7,25). Em algumas modalidades, o pH é cerca de 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ou 8,0. As lipossomas de irinotecano com valores de pH particulares, a porção de irinotecano equivalente àquela fornecida pela concentração de base anidra livre de irinotecano (mg/mL) e várias concentrações de octassulfato de sacarose foram preparadas como descrito em mais detalhes, conforme é descrito na presente invenção. Mais preferencialmente, o pH após a fabricação e antes do armazenamento está entre 7,1 e 7,5 e, ainda mais preferencialmente, entre cerca de 7,2 e 7,3, e mais preferivelmente, é cerca de 7,25. O pH pode ser ajustado por meios padrões, por exemplo, usando HCl 1N ou Na- OH 1N, conforme apropriado.
[0071] Em algumas modalidades da presente invenção, o pH da preparação de irinotecano lipossomal após a fabricação, porém antes do armazenamento, é acima de 6,5, e de modo preferencial, entre 7,2 e 7,3. Em algumas modalidades da presente invenção, o pH é de 7,2 a 7,5.
Razão grama-equivalente (“ER”) do composto das Composições Estabilizadas de Camptotecina
[0072] As composições estabilizadas lipossomais de camptotecina podem ter um pH maior do que 6,5 e compreendem lipossomas que encapsulam irinotecano e um agente de retenção de sulfato polianiôni- co com uma razão grama-equivalente de irinotecano/composto sulfato ("ER") superior a 0,9 (por exemplo, de 0,9 a 1,1). A ER pode ser calculada para uma preparação de lipossoma de SOS irinotecano determi- nando as quantidades molares de irinotecano lipossomalmente encapsulado (I) e de composto sulfato (S) por unidade (por exemplo, 1 mL) da composição de lipossoma, e usando a fórmula: ER = I/(SN), onde N é a valência do ânion do composto sulfato (por exemplo, para o su- crossofato, N é 8, e para o sulfato livre, SO42-, N é 2), I é a concentração de irinotecano encapsulado na composição de irinotecano lipos- somal e S é a concentração dos grupos sulfato do octassulfato de sacarose encapsulado na composição de irinotecano liposso- mal. Preferencialmente, o composto sulfato (S) é octassulfato de sacarose, contendo 8 porções de sulfato por mol de SOS. ,
[0073] Embora a determinação direta da concentração dos grupos sulfato de octassulfato de sacarose encapsulado na composição de irinotecano lipossomal (S.N) seja preferencial, S^N pode ser determinado a partir da concentração de fosfolipídio de lipossoma (P, mol/L), concentração de grupos sulfato SOS no espaço interno do lipossoma (a concentração dos grupos sulfato SOS na solução usada para preparar um lipossoma do agente de retenção; parâmetro B, consulte a definição da razão de estabilidade na presente invenção), e o volume interno de lipossoma (retido), isto é, o volume sequestrado dentro do espaço interno das vesículas dos lipossomas por unidade de fosfolipí- dio de lipossoma (Ve, L/mol de fosfolipídio): S•N = P•Ve•B
[0074] A título de exemplo, para um lipossoma de fosfatidilcolina- colesterol obtido por extrusão através de filtros de policarbonato de 100 nm, o volume retido pode estar perto de 1,7 L/mol de fosfolipídio (Mui, et al. 1993, Biophys.J., vol 65, p. 443-453). Nesse caso, a carga quantitativa de irinotecano (peso molecular 586,7) nos lipossomas en- capsulantes de SOS a 471 g/mol de fosfolipídio e a concentração dos grupos SOS sulfato de 0,45 M, resultarão em uma ER de(471/586,7)/(1,7-0,45) = 1,049
[0075] Enquanto que na concentração de SOS de grupos de sulfa to 0,65 M, a ER será: (471/586,7)/(1,7-0,65) = 0,726
[0076] Similarmente, a carga quantitativa de irinotecano (peso mo lecular 586,7) nos lipossomas encapsulantes de SOS a 500 g (± 10%)/mol de fosfolipídio e a concentração de grupos SOS sulfato de 0,45 M resultará em uma ER de cerca de 1,11, enquanto na concentração de SOS de grupos sulfato 0,65 M, a ER será igual a cerca de 0,77.
Preparação das Composições Estabilizadas de Camptotecina
[0077] As composições estabilizadas de camptotecina podem compreender lipossomas de camptotecina. Os lipossomas foram usados para a administração de medicamentos, incluindo quimioterápicos. Várias tecnologias relacionadas com lipossomas encapsuladores de fármacos e métodos para fazer os mesmos são geralmente conhecidos na técnica e, portanto, são adicionalmente descritos na presente invenção pormenorizadamente. Consulte, por exemplo, a Patente Norte-Americana No. 8.147.867, que é incorporada na presente invenção por referência em sua totalidade.
[0078] Em algumas modalidades, os lipossomas encapsulando um ou mais compostos de camptotecina dentro de uma vesícula compreendem pelo menos um fosfolipídio. O composto de camptotecina pode, por exemplo, ser carregado ou, de outro modo, retido dentro do lipos- soma num processo de várias etapas compreendendo (a) formar um lipossoma do agente de retenção encapsulando o agente de retenção aniônico e um cátion dentro de uma vesícula lipossomal compreendendo fosfolípido(s) e (b) subsequentemente colocar em contato o li- possoma do agente de retenção com o(s) composto(s) de camptoteci- na sob condições eficazes para carregar o(s) composto(s) de campto- tecina no(s) lipossoma(s) com o agente de retenção para formar os lipossomas com camptotecina.
[0079] O(s) composto(s) de camptotecina pode(m) ser carrega- do(s) nos lipossomas do agente de retenção utilizando um gradiente através da membrana lipossômica, fazendo com que o(s) composto(s) de camptotecina entre nos lipossomas de agente de retenção para formar os lipossomas de camptotecina. Preferencialmente, os lipos- somas do agente de retenção têm um gradiente de concentração transmembranar de um cátions que atravessa a membrana, tal como uma amônia ou amônia substituída, eficaz para resultar na troca da amônia/amônia substituída nos lipossomas de agente de retenção para o(s) composto(s) de camptotecina, quando aquecido acima da temperatura de transição de fase dos componentes lipídicos dos liposso- mas. Preferencialmente, o agente de retenção tem uma concentração mais alta no lipossoma do agente de retenção do que no meio adjacente. Além disso, os lipossomas do agente de retenção podem incluir um ou mais gradientes transmembranares, além do gradiente criado pelo cátion amônia/amônia substituída. Por exemplo, os lipossomas contidos na composição de lipossoma do agente de retenção podem, além disso ou alternativamente, incluir um gradiente de pH transmem- branar, gradiente de íon, gradiente de potencial eletroquímico e/ou gradiente de solubilidade.
[0080] Em algumas modalidades, o agente de retenção utilizado para a preparação de lipossomas (por exemplo, SOS e/ou outro agente de retenção de poliol sulfatado, incluindo seus sais aceitáveis) tem uma concentração de 0,3 a 0,8, 0,4 a 0,5, 0,45 a 0,5, 0,45 a 0,0475, 0,45 a 0,5, 0,3, 0,4, 0,45, 0,475, 0,5, 0,6, 0,7 ou 0,8 M de grupos sulfato, por exemplo, estes valores específicos ± 10%. Em uma modalidade preferencial, o agente de retenção utilizado para a preparação de li- possomas é SOS e tem uma concentração de cerca de 0,45 ou de cerca de 0,475 M grupos sulfato. Em uma modalidade mais preferen- cial, o agente de retenção utilizado para a preparação de lipossomas é SOS e tem uma concentração de cerca de 0,45 M ou de 0,475 M grupos sulfato.
[0081] De preferência, o(s) composto(s) de camptotecina é(são) carregado(s) no lipossoma do agente de retenção incubando ao(s) composto(s) de camptotecina com os lipossomas de agente de retenção em um meio aquoso a uma temperatura adequada, por exemplo, a uma temperatura acima da temperatura de transição de fase primária dos fosfolipídios componentes durante o carregamento, enquanto são reduzidos abaixo da temperatura de transição de fase primária dos fosfolipídios componentes após o carregamento do(s) composto(s) de camptotecina, de preferência a cerca da temperatura ambiente. O tempo de incubação é geralmente baseado na natureza dos lipídeos componentes, do(s) compostos camptotecina a serem carregados nos lipossomas e da temperatura de incubação. Normalmente, os tempos de incubação de vários minutos (por exemplo, de 30 a 60 minutos) até várias horas são suficientes.
[0082] Devido à obtenção da eficiência de alta compressão maior do que 85%, normalmente maior do que 90%, há muitas vezes há necessidade de remover a entidade não retida. Se houver essa necessidade, no entanto, o(s) composto(s) de camptotecina não retido(s) po- de(m) ser removido(s) da composição por diversos meios, tais como, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho, diálise, ultrafil- tração, adsorção e precipitação.
[0083] Em algumas modalidades, os lipossomas de camptotecina são os lipossomas de irinotecano. Os lipossomas de irinotecano podem ser preparados por um processo que inclui as etapas de (a) preparar um lipossoma contendo trietilamina (TEA) como um sal de trieti- lamônio de sucrossofato (TEA-SOS) e (b) em seguida, colocando em contato o lipossoma TEA-SOS com irinotecano sob condições eficazes para o irinotecano entrar no lipossoma e permitir que uma quantidade correspondente de TEA saia do lipossoma (desse modo exaurindo ou reduzindo o gradiente de concentração de TEA através do lipossoma resultante).
Força lônica Extralipossomal Durante o Carregamento de Fárma- co de Lipossomas de Camptotecina
[0084] Em algumas modalidades da presente invenção, a carga de camptotecina dos lipossomas é feita em uma solução aquosa com a força iônica menor do que a equivalente a NaCl 50 mM, ou mais preferencialmente, menor do que a equivalente a NaCl 30 mM. Após a carga de fármaco, uma solução salina mais concentrada, por exemplo, solução de NaCl, pode ser adicionada para aumentar a força iônica até mais do que aquela equivalente a NaCl 50 mM, ou mais preferencialmente, mais do que a equivalente a NaCl 100 mM, de preferência equivalente a entre cerca de 140 a 160 mM de NaCl.
Cátions do Agente de Retenção
[0085] O cátion da presente invenção pode ser encapsulado nos lipossomas do agente de retenção em uma quantidade eficaz para proporcionar o carregamento do(s) composto(s) de camptotecina nos lipossomas de agente de retenção, quando aquecidos acima da temperatura de transição de fase dos componentes lipídicos, como descrito acima. Os cátions são selecionados para que eles possam sair dos lipossomas de agente de retenção durante o carregamento do(s) composto(s) nos lipossomas. Cátions extralipossomais podem ser removidos após a preparação dos lipossomas carregados com compos- to(s) de camptotecina.
[0086] Em algumas modalidades da presente invenção, o cátion no lipossoma, juntamente com o agente de retenção, é um composto de amônio substituído. Em algumas modalidades da invenção, o composto de amônio substituído tem um pKa de pelo menos cerca de 8,0. Em algumas modalidades da invenção, o composto amônio substituído tem um pKa de pelo menos cerca de 8,0, pelo menos cerca de 8,5, pelo menos cerca de 9,0, pelo menos 9,5, pelo menos 10,0, pelo menos 10,5 ou pelo menos 11,0, conforme é determinado em solução aquosa, a temperatura ambiente. Em algumas modalidades da invenção, o composto de amônio substituído tem um pKa de cerca de 8,0 a 12,0, de cerca de 8,5 a 11,5 ou de cerca de 9,0 a 11. Em uma modalidade preferencial, o pKa é aproximadamente o pKa de TEA, ou apro-ximadamente o pKa de DEA.
[0087] Exemplos não limitantes de tais compostos de amônio substituídos são os compostos da fórmula: N(R1)(R2)(R3)(R4)+, onde cada um de R1, R2, R3 e R4 são independentemente um hidrogênio ou um grupo orgânico tendo até um total de 18 átomos de carbono, e onde pelo menos um de R1, R2, R3 e R4 é um grupo orgânico que é um grupo hidrocarboneto tendo até 8 átomos de carbono, que podem ser uma alquila, alquilideno, alquila heterocíclica, cicloalquila, arila, alque- nila ou cicloalquenila, ou um derivado substituído com hidroxila do mesmo, opcionalmente incluindo dentro de sua porção hidrocarboneto S, O ou N átomo(s) formando uma ligação éter, éster, tioéter, amina ou amida. A amônia substituída pode ser um composto de amônia esteri- camente impedida (por exemplo, ter pelo menos um dos grupos orgânicos com um átomo de carbono secundário ou terciário, diretamente ligado ao átomo de nitrogênio da amônia). Além disso, pelo menos um de R1, R2, R3 e R4 deve ser hidrogênio. De preferência, o cátion de amônio substituído é trietilamônio (TEA protonado) ou dietilamônio (DEA protonado).
[0088] A concentração do cátion de amônio substituído dentro o lipossoma do agente de retenção pode ser reduzida conforme o composto camptotecina é carregado nos lipossomas encapsulando o agente de retenção aniônico sob condições eficazes para formar os lipossomas do composto camptotecina. Os lipossomas da presente invenção podem incluir um agente de retenção aniônico e um cátion de amônio ou de amônio substituído que é posteriormente removido e/ou substituído pelo composto camptotecina, carregado no lipossoma em uma etapa de carga de fármaco posterior.
[0089] Em uma modalidade preferencial, a concentração do cátion amônio substituído dentro dos lipossomas de composto camptotecina ou de amônio é baixa o suficiente para fornecer quantidades baixas de liso-PC após o armazenamento refrigerado por períodos prolongados de preparações de lipossoma de camptotecina que contêm fosfolipí- dios. Por exemplo, conforme discutido no exemplo 3, incluindo os dados na figura 7, redução na quantidade de formação de liso-PC foi observada nas preparações de lipossoma de irinotecano SOS com menos de cerca de 100 ppm de cátion amônio substituído, preferencial-mente entre 20 e 80 ppm, de preferência menos de cerca de 50 ppm, e ainda mais preferencialmente menos de cerca de 40 ppm, e ainda mais preferencialmente, menos de 30 ppm.
[0090] Em algumas modalidades, os lipossomas com irinotecano SOS (como as amostras 24-29; Tabela 10 dos exemplos) compreendem menos do que 100 ppm, ou de cerca de 15 a 100 ppm de contra- íon do agente de retenção de SOS com amônio substituído. Em algumas modalidades, os lipossomas de irinotecano SOS (tais como as amostras 24 a 29; Tabela 10 dos exemplos) compreendem de cerca de 15 a 80 ppm de amônia substituída. Em algumas modalidades, as lipossomas com irinotecano-SOS compreendem cerca de 40-80 ppm de amônia substituída. Em algumas modalidades, os lipossomas com irinotecano SOS (tais como as amostras 24 a 29; Tabela 10 dos exemplos) compreendem de cerca de 80 a 100 ppm de amônia substituída. Em uma modalidade preferencial, a amônia substituída presente em qualquer uma das concentrações acima mencionadas em ppm é derivada de TEA ou DEA.
Relação de estabilidade das Composições Estabilizadas de Camp- totecina
[0091] Quando os lipossomas contendo camptotecina à base de fosfolipídio são feitos reagindo (1) um fármaco camptotecina com (2) os lipossomas encapsulando um agente de retenção aniônico polissul- fatado, a estabilidade dos lipossomas com fármaco resultante depende da razão de camptotecina, de um agente de retenção aniônico e dos fosfolipídios de formação de lipossoma, conforme é definido por uma razão de estabilidade de pelo menos cerca de 950, conforme definido abaixo. A razão de estabilidade depende da concentração inicial de grupos sulfato nos lipossomas de agente de retenção e da razão de camptotecina encapsulada para fosfolipídio nos lipossomas. Conforme utilizado na presente invenção, a relação de estabilidade ("SR") é definida como a seguir:SR = A/B,
[0092] Onde: a. A é a quantidade de porção irinotecano encapsulado nos lipossomas de agente de retenção durante o processo de carregamento de fármaco, em equivalentes-grama em relação à base anidra livre de irinotecano por mol de fosfolipídios na composição; e b. B é a concentração de grupos sulfato no sucrossofato (ou outro agente de retenção) usado para fazer os lipossomas de agente de retenção, expressa em mol/L (com base na concentração dos grupos sulfato).
[0093] No que diz respeito à determinação da razão de estabilida de, o número de mols de fosfolipídio na preparação do lipossoma é determinado por ensaio, tal como é descrito nos exemplos. A quantidade da porção de irinotecano (A acima) é calculada de acordo para realizar a carga do lipossoma.
[0094] No que diz respeito à determinação da razão de estabilida de, a concentração B dos grupos sulfato no sucrossofato (ou outro agente de captura), expressada em mol/L, é calculada como a concentração de sucrossofato (ou outro agente de retenção divulgado na presente invenção) (em mol/L) na solução que é adicionada a lipídios (que normalmente são dissolvidos em álcool, normalmente em um volume que é 10% ou menor do que o volume da solução de agente de retenção adicionado aos lipídios). Assim, para o sucrossofato, a con-centração B de grupos sulfato é a concentração de sucrossofato, multiplicado por 8 (ou seja, o número de grupos sulfato em uma molécula de sucrossofato), ou multiplicado de acordo com o número de grupos sulfato do agente de retenção particular usado. (Consulte o Exemplo 1).
[0095] Em algumas modalidades da presente invenção, a razão de estabilidade e o pH são ambos aumentados até mais de 6,5. Assim, em certas modalidades preferenciais da presente invenção, a razão de estabilidade é 942-1130, o pH é de 7,2 a 7,5, e o irinotecano e o agente de retenção SOS estão presentes na composição do lipossoma em uma razão molar de cerca de 8:1. De preferência, a razão de estabilidade é 942-1130, o pH é cerca de 7,25 e a composição de irinotecano e agente de retenção SOS estão presentes no lipossoma em uma razão molar de 8:1. A quantidade de liso-PL e, em especial, de liso-PC nas formulações de lipossomas encapsulando outros compostos de camptotecina pode ser controlada de forma semelhante.
[0096] Por exemplo, as novas preparações de lipossoma com iri- notecano estabilizadas podem ter 80% menos liso-PC em comparação com os lipossomas com irinotecano-SOS preparados de acordo com outros processos (por exemplo, 80% menos liso-POC do que o que foi observado na amostra comparativa 12 após 9 meses de armazenamento sob refrigeração). Um irinotecano lipossomal (comparativo) da amostra 12 foi preparado com uma razão de estabilidade de cerca de 724 por aquecimento de uma mistura de lipídios, tendo uma razão molar de 3:2:0,015 de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), na presença de trietilamina (TEA) e octassulfato de sacarose ("SOS" ou "sucrossofa- to") em uma razão molar de 8:1 [(TEA)8SOS] em uma concentração de grupo sulfato de 0,65 M para gerar os lipossomas de agente de retenção TEA-SOS. Após a remoção do (TEA)8SOS não encapsulado nos lipossomas de agente de retenção, o irinotecano foi carregado na preparação resultante contendo os lipossomas de agente de retenção TEA-SOS usando uma solução de irinotecano sob condições resultando na remoção de TEA e no carregamento nos lipossomas de uma quantidade total de irinotecano fornecido por 500 g (± 10%) de base livre de irinotecano anidro por mol de fosfolipídios na preparação de lipossoma do agente de retenção TEA-SOS. O pH da composição de lipossoma com irinotecano foi 6,5 (medido de acordo com a subseção "medições de pH" na seção Exemplos neste documento), com 4,3 mg de porção irinotecano nos lipossomas de irinotecano/mL da composição de lipossoma com irinotecano. Estas composições de irinotecano lipossomal contendo fosfatidilcolina geraram níveis de liso-PC superiores a 30% em mol (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nas composições de lipossomas com irinotecano) durante 3 meses (e mais de 35% em mol de liso-PC gerado durante 9 meses) de armazenamento sob refrigeração (2 a 8 °C).
Cálculo das razões de estabilidade e das quantidades de liso-PC nas modalidades exemplares
[0097] Uma série de preparações de lipossoma com irinotecano diferentes foram feitas de acordo com os métodos descritos neste documento (os detalhes experimentais adicionais de preparação e carac- terização de cada amostra estão incluídos abaixo nos exemplos). A quantidade de liso-PC medida em cada uma das preparações nos li- possoma com irinotecano está resumida na tabela 1A (medições de liso-PC após 9 meses de armazenamento sob refrigeração) e na tabela 1B (medições de liso-PC feitas após 6 meses de armazenamento sob refrigeração para um subconjunto das amostras enumeradas na tabela 1A). Cada preparação de lipossoma com irinotecano continha lipossomas de bicamada unilamelar de cerca de 110 ± 20 nm, de pre-ferência de 110 ± 10 nm de diâmetro, encapsulando irinotecano com um agente de retenção de octassulfato de sacarose. Os lipossomas foram formados a partir de uma mistura de DSPC, colesterol e MPEG- 2000-DSPE tendo uma razão molar de 3:2:0,015 e, em seguida, foram carregados com irinotecano em uma concentração de cerca de 471 g de porção de irinotecano (irinotecano ou um sal do mesmo fornecendo uma quantidade de porção de irinotecano equivalente a 500 g (± 10%) de HCl anidro de irinotecano) por mol de fosfolipídio. Cada preparação de lipossoma com irinotecano continha quantidades diferentes do agente de retenção de SOS e foi formulada em valores de pH diferentes. A quantidade de liso-PC foi medida em cada preparação de lipos- soma com irinotecano em vários momentos, incluindo uma medição de todas as amostras após 9 meses de armazenamento sob refrigeração contínuo (a 4 °C). Todas as amostras na tabela 1A foram carregadas usando um contra-íon de TEA protonado para SOS (ou seja, carregando irinotecano nos lipossomas encapsulando as diferentes concen-trações de TEA8SOS, conforme especificado na tabela 1A). TABELA 1A: Razão de estabilidade de lipossoma com irinotecano e liso-PC (depois de 9 meses a 4 °C)aa Medição de acordo com o método B, conforme descrito na presente invenção
[0098] Figura 2A mostra um enredo mostrando a quantidade de liso-PC medido em cada amostra na tabela 1A após 9 meses de armazenamento a 4 °C. A amostra 12 é marcada como um comparador na tabela 1A e na figura 2A. Amostras tendo tanto uma relação de estabilidade superior a cerca de 900 e pH superior a 6,5 (por exemplo, 7.25 e 7,5) continham menos de 20% em mol de liso-PC após 9 meses de armazenamento refrigerado a 4 °C. Figura 2C é um gráfico dos valores de razão de estabilidade em comparação com as quantidades relativas de liso-PC (% em mol) de composições de lipossomas com irinotecano líquido após 6 meses de armazenamento a 4 °C (dados na tabela 6). Os pontos de dados indicados com círculos abertos corres- pondem às amostras de irinotecano tendo um pH superior a 6,5 (7,25 ou 7.5) medido após a fabricação, mas antes do armazenamento. Os pontos de dados indicados com diamantes correspondem às amostras de irinotecano tendo um pH de 6,5 medido após a fabricação, mas antes do armazenamento. A razão de estabilidade foi calculada conforme definido neste documento, durante a fabricação de cada amostra. A % em mol de liso-PC foi medida após os primeiros 6 meses de armazenamento após a fabricação de cada amostra.TABELA 1B: Razão de estabilidade de lipossoma com irinotecano e liso-PC (depois de 6 meses a 4 °C)bb Medição de acordo com o método B, conforme descrito na presente invenção
[0099] Figura 2B mostra um enredo mostrando a quantidade de liso-PC medido em cada amostra na tabela 1B após 6 meses de armazenamento a 4 °C. Amostras tendo tanto uma relação de estabilidade superior a cerca de 989 e pH superior a 6,5 (por exemplo, 7.25 e 7,5) continham menos de 20% em mol de liso-PC após 6 meses de armazenamento refrigerado a 4 °C.
[00100] As figuras 3A a 3D são gráficos mostrando a % em mol de liso-PC nas preparações de lipossoma com irinotecano selecionadas da tabela 1A e 1B tendo um pH igual a 6,5. Liso-PC foi determinado após o armazenamento de cada amostra a 4 °C durante 0, 1, 3, 6, 9 e/ou 12 meses. Esses gráficos incluem uma linha de regressão linear para os dados como uma estimativa para a taxa de aumento de liso- PC (% em mol) ao longo do tempo em cada amostra. Um resumo da inclinação, intercepto no eixo y e valores de R2 para cada figura é mostrado na tabela 1C abaixo.TABELA 1C: % em mol de liso-PC vs. tempo de armazenamento sob refrigeração (meses) em pH 6,5
[00101] Em algumas modalidades, a estabilidade de uma preparação de lipossoma com irinotecano contendo irinotecano SOS encapsulada em lipossomas de cerca de 100 nm (por exemplo, 100 ± 20 nm) de diâmetro é significativamente maior em lipossomas de irinotecano, onde a razão de estabilidade é maior do que 942. Por manter a proporção de carga de fármaco constante de porção de irinotecano de 500 g (± 10%) (como explicado acima, com base na livre base anidra) para total fosfolipídio, mas variando a concentração do agente de retenção de SOS, o efeito da relação de estabilidade sobre a formação de Super-PC na preparação em lipossomas foi avaliada. A Tabela 2 fornece um resumo da quantidade de % molar de liso-PC detectada nas preparações de lipossomas de irinotecano na Tabela 1 formuladas no mesmo pH da Amostra (comparativa) 12 (6,5), mas em diferentes concentrações de agente de retenção SOS (ou seja, em diferentes razões de estabilidade). A tabela 2 ilustra que ter uma razão de estabilidade superior a 942 em relação aos lipossomas de irinotecano contendo um agente de retenção de SOS e irinotecano reduz a formação de liso-PC durante o armazenamento sob refrigeração. Reduzir a quantidade de agente de retenção SOS (ou seja, aumentar a razão de estabilidade) em até 30% em relação à preparação de lipossoma com irinotecano resultou num ligeiro aumento na quantidade de liso-PC de cerca de 1% após 9 meses de armazenamento sob refrigeração. Contudo, o aumento da quantidade de agente de retenção SOS numa preparação de lipossomas de irinotecano com uma razão de estabilidade acima de 942 resulta num declínio significativo e inesperado da quantidade de liso-PC (mol%) presente após 9 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C. Por exemplo, um aumento incremental subsequente de 5% no índice de estabilidade acima de 942 (isto é, uma razão de Estabilidade de 992 na amostra 2) resultou em uma diminuição significativa da quantidade de liso-PC (% em mol) presente em 34%, em comparação com a amostra 3, equivalente a um decréscimo de 33% na quantidade de liso-PC (% em mol) em comparação com a amostra 12 (medida em 9 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C). No geral, após 9 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C, as reduções de liso-PC (% em mol) de cerca de 28 a 51% foram alcançadas aumentando a razão de Estabilidade do lipossoma com irinotecano acima de 942, em comparação com a amostra comparado- ra 12. Em algumas modalidades, as composições de lipossomas com irinotecano-SOS têm uma razão de estabilidade acima de 942. Em modalidades preferidas, as preparações de lipossomas com irinoteca- no-SOS têm uma razão de estabilidade de 942-1130 ou maior (por exemplo, razões de estabilidade de 992-1047).TABELA 2: Razão de estabilidade de lipossoma com irinotecano e liso-PC (depois de 9 meses a 4 °C, pH 6,5)
[00102] A tabela 2 ilustra a criticidade de ter uma razão de estabilidade superior a 942 (de preferência superior a 950 e mais preferencialmente superior a 992) na estabilização de lipossomas com irinoteca- no a pH 6,5 contendo um agente de retenção de SOS e irinotecano, para reduzir a formação intralipossomal de liso-PC durante o armazenamento sob refrigeração. Em geral, as reduções de liso-PC intrali- possomal de cerca de 28-51% durante o armazenamento durante 6 meses a 4° C foram conseguidas preparando composições de lipos- somas com irinotecano em pH 6 tendo uma razão de estabilidade acima de 950 (por exemplo, 950-1050). Reduzir a concentração do agente de retenção SOS usado na preparação dos lipossomas do agente de retenção (isto é, aumentando a razão de estabilidade) em até 30% em relação à concentração correspondente do agente de retenção SOS usado para preparar a preparação do lipossoma irinotecano comparador (compare as amostras 3 e 12 ) resultou num leve aumento na quantidade de liso-PC de cerca de 1% após 9 meses de armazenamento sob refrigeração. No entanto, o aumento da quantidade de agente de retenção de SOS utilizado para formar os lipossomas de agente de retenção antes do carregamento de irinotecano para formar uma preparação de lipossomas com irinotecano possuindo uma razão de estabilidade de 992 ou superior resultou num declínio significativo e inesperado na formação de liso-PC após os primeiros 9 meses de armazenamento sob refrigeração do lipossoma com irinotecano resultante após a fabricação. Por exemplo, os dados na tabela 2 mostram que um aumento de 5% no índice de estabilidade acima de 942 resultou em uma diminuição de 34% de LisoPC após 9 meses de armazenamento a 4 graus C (amostra 2 em comparação com a amostra 3). O aumento da razão de estabilidade de 992 (amostra 2) para 1047 (um aumento de 6% de SR) resultou em uma redução de 26% de liso-PC gerado após 9 meses de armazenamento a 4 °C (amostra 6 em comparação com a amostra 2), e em um aumento de 8% de Liso-PC gerado após 9 meses de armazenamento a 4 °C (amostra 1 comparada com a amostra 2). Consequentemente, as composições de lipossoma com irinotecano-SOS preferidas têm uma razão de estabilidade acima de 1000, incluindo as preparações de lipossomas com irinotecano- SOS com uma razão de estabilidade de 1000-1200 ou superior (por exemplo, razões de estabilidade de 1053-111).
[00103] Em algumas modalidades da presente invenção, a estabilidade de uma preparação de lipossoma com irinotecano contendo irino- tecano SOS encapsulado em lipossomas de cerca de 100 ± 20 nm, de preferência 100 ± 10 nm de diâmetro é significativamente aumentada aumentando o pH da preparação após a fabricação, porém antes do armazenamento acima de pH 6,5. Mantendo a taxa de carga de fár- maco constante de 471 g ou 500 g de porção de irinotecano (como explicado acima, baseado na base livre anidra) por mol de fosfolipídio, mas variando o pH do pH final da composição de lipossoma com irino- tecano, o efeito do pH sobre a formação de liso-PC na preparação de lipossomas foi avaliado. A tabela 3 fornece um resumo das quantidades de liso-PC nas preparações de lipossomas de irinotecano na tabe- la 1 formuladas em diferentes valores de pH. A tabela 3A relata dados da tabela 1 para preparações de lipossomas de irinotecano, formadas pelo carregamento de lipossomas (encapsulando TEA8SOS a uma concentração de grupo sulfato de 0,6 M) com um total de 471 g de porção de irinotecano (como explicado acima, com base na base livre anidra) por mol de fosfolipídio (isto é, uma razão de estabilidade de 471/0,6 ou 785). A % de alteração na formação de liso-PC foi calculada em relação à amostra 4 e à amostra 9 (ambas com pH 6,5 após a fabricação, porém antes do armazenamento). A tabela 3B relata dados da tabela 1 para preparações de lipossomas de irinotecano, formadas pelo carregamento de lipossomas (encapsulando TEA8SOS a uma concentração de grupo sulfato de 0,6 M) com um total de 471 g de porção de irinotecano (como explicado acima, com base na base livre anidra) por mol de fosfolipídio (por exemplo, uma razão de estabilidade de 471/0,6 ou 1047). A % de alteração na formação de liso-PC foi calculada em relação à amostra 1 e à amostra 6 (ambas com pH 6,5 após a fabricação, porém antes do armazenamento).TABELA 3A: PH da preparação de lipossomas com irinotecano e Liso-PC (após 9 meses a 4 °C, 471 g de porção irinotecano/mol de fosfolipídio, 0,6 M de concentração de grupo sulfato SOS)TABELA 3B: PH da preparação de lipossomas com irinotecano e Liso-PC (após 9 meses a 4 °C, 471 g de porção irinotecano/mol de fosfolipídio, 0,45 M de concentração do agente de retenção SOS)
[00104] Nos dados nas Tabelas 3A e 3B acima, o aumento do pH de 6,5 para 7,25 ou 7,5 reduziu a quantidade de liso-PC em cerca de 15-20% para os lipossomas com irinotecano-SOS tendo uma razão de estabilidade de 785 (tabela 3A) e por cerca de 20 a 70% de liposso- mas com irinotecano-SOS com uma razão de estabilidade de 1047 (tabela 3B). Isso foi inesperado em vista de relatos anteriores mostrando que um pH de 6,5 é ideal para minimizar a hidrólise da fosfati- dilcolina (Grit, M et al, “Hydrolysis of partially saturated egg phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions and the effect of cholesterol incorporation on hydrolysis kinetics,” The Journal of pharmacy and pharmacology (1993) v 45, Is 6, pp 490-495).
[00105] As figuras 4A a 4C representam gráficos mostrando a % molar de liso-PC medida após armazenamento de cada amostra a 4 °C após 0, 1, 3, 6 e/ou 9 meses em preparações de lipossomas de iri- notecano tendo um pH de 7,25 ou 7,5, selecionadas da tabela 1A e 1B. Esses gráficos incluem uma linha de regressão linear para a taxa de aumento de liso-PC ao longo do tempo em cada amostra. Um resumo da inclinação, intercepto no eixo y e valores de R2 para cada figura é mostrado na tabela 4 abaixo. Quantidades mais baixas de liso- PC foram observadas em amostras de preparação de lipossomas com irinotecano com uma razão de estabilidade acima de 942 (por exem- plo, 1047) e pH de 7,25 ou 7,5 (por exemplo, comparando as amostras 5, 7 e 13 com a amostra 10 nas figuras 4A e 4C em pH 7,25, ou comparando a amostra 8 na figura 4B com a amostra 11 na figura 4C em pH 7,5). Além disso, mediu-se mais liso-PC após 9 meses nas preparações de lipossomas com irinotecano com uma razão de estabilidade abaixo de 942 (por exemplo, 785 nas amostras 10 e 11, ambas com mais de 20% em mol de liso-PC após 6 meses, mesmo a um pH acima de 6,5).TABELA 4: % em mol de liso-PC vs. tempo de armazenamento sob refrigeração (meses) em pH > 6,5.TABELA 5:% em mol de liso-PC em SR > 942 após 6 e 9 meses de armazenamento sob refrigeração
Composições adicionais de camptotecina
[00106] As composições de camptotecina podem ser composições de libertação prolongada compreendendo um ou mais composto(s) de camptotecina e um ou mais fosfolípido(s) que geram quantidades reduzidas de lisofosfolipídios(s) após períodos de armazenamento sob refrigeração, isto é, 2 a 8 °C, após a fabricação da composição de camptotecina (por exemplo, começando quando a composição de camptotecina é selada num recipiente estéril para administração farmacêutica.
[00107] As composições de liberação prolongada estabilizadas podem incluir uma composição de matriz compreendendo um composto de camptotecina e fosfolipídio ou outro(s) componente(s) que podem hidrolisar para formar lisofosfolipídios. A composição da matriz pode ser configurada como um lipossoma encapsulando o(s) composto(s) de camptotecina dentro de uma vesícula compreendendo o(s) fosfoli- pídio(s) e outros componentes, tais como colesterol e um lipídio ligado covalentemente ao PEG.
[00108] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição da matriz é estabilizada, por exemplo, preparando a composição da matriz com uma quantidade de um agente de retenção aniônico e uma quantidade de um composto de camptotecina, bem como um pH específico no meio contendo a composição da matriz, eficaz para reduzir a quantidade de formação de lisofosfolipídios no composto da matriz.
[00109] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição de liberação prolongada é uma nanopartícula compreendendo sucrossofato de trietilamônio (SOS) e irinotecano associado a uma composição compreendendo um polímero lipídico e/ou biocompatível (por exemplo, um polímero biodegradável de ciclodextrina, tal como PGA (ácido poliglicólico) e / ou PLGA (poli (ácido lático-co-glicólico))).
[00110] Em outros exemplos, a formulação de liberação prolongada é uma composição de matriz compreendendo um composto associado de modo liberável, como topotecano, etirinotecano e/ou irinotecano (por exemplo, nanopartículas ou polímeros que prendem ou retêm de modo liberável a camptotecina ou o composto derivado da camptoteci- na). A composição da matriz pode incluir um polímero biocompatível, tal como polietilenoglicol (PEG) ou materiais funcionalmente equivalentes. Em uma modalidade preferida, o polímero biocompatível é polieti- lenoglicol (PM 2000). Em uma modalidade mais preferencial, o polímero biocompatível é polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000).
[00111] Em algumas modalidades, a formulação de liberação prolongada pode compreender um composto de camptotecina conjugado com um polímero biocompatível, tal como um análogo da ciclodextrina ou ciclodextrina (por exemplo, ciclodextrinas sulfatadas). Por exemplo, a formulação de liberação prolongada pode compreender um polímero contendo ciclodextrina quimicamente ligada a um composto de camp- totecina (por exemplo, irinotecano e/ou SN-38). Um composto conjugado com ciclodextrina-camptotecina pode ser administrado a uma dose farmaceuticamente aceitável. Exemplos de conjugado de camp- totecina-ciclodextrina incluem um conjugado de polímero contendo ci- clodextrina e intermediários relacionados.
[00112] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição de liberação controlada compreendendo um lipídio e/ou polímero biocompatível compreende uma matriz lipídica e/ou agente(s) comple- xante(s), tais como composições contendo ciclodextrina formuladas para reter o(s) composto(s) de camptotecina durante o armazenamento e, em seguida, liberar o composto dentro do corpo do paciente.
[00113] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição de matriz compreende um fosfolipídio, tal como um derivado de fosfatidilcolina, que é estabilizado para reduzir a formação de liso-PC durante o armazenamento sob refrigeração.
[00114] De preferência, a composição de liberação prolongada é preparada por um processo de múltiplas etapas compreendendo as etapas de: (a) formar uma composição de matriz compreendendo um agente de captura e (b) colocar em contato a matriz com o composto camptotecina sob condições eficazes para reter de forma estável o composto camptotecina em uma composição de liberação prolongada resultante [0] compreendendo o agente de retenção e o composto de camptotecina associado com a composição de matriz de uma maneira que permite a liberação desejada do composto camptotecina no corpo de um indivíduo mediante a administração ao indivíduo.
[00115] Em uma modalidade preferencial, a composição de liberação prolongada da presente invenção contém irinotecano ou um sal do mesmo em uma concentração da porção de irinotecano equivalente àquela fornecida por 4,3 mg/mL de base anidra de irinotecano livre por mL, enquanto também contém menos do que cerca de 1 mg/mL (ou menos de cerca de 20% em mol) de liso-PC a 6 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C. Em uma modalidade preferencial, a composição de liberação prolongada da presente invenção contém irinotecano ou um sal do mesmo em uma concentração da porção de irinotecano equivalente àquela fornecida por 4,3 mg/mL de base anidra de irinotecano livre por mL, enquanto também contém menos do que cerca de 2 mg/mL (ou menos de cerca de 30% em mol) de liso-PC a 12 meses de armazenamento a 2 a 8 °C, e ainda mais preferencialmente a cerca de 4 °C.
[00116] A composição de liberação prolongada pode compreender lipossomas. Os lipossomas tipicamente compreendem vesículas contendo uma ou mais bicamadas lipídicas envolvendo um interior aquoso. As composições de lipossomas incluem geralmente lipossomas num meio, tal como um fluido aquoso exterior ao lipossoma. Os lipídios de lipossomas podem incluir componentes lipídicos anfifílicos que, em contato com o meio aquoso, formam espontaneamente membranas de duas camadas, tais como fosfolipídios, como por exemplo, fos- fatidilcolinas. Os lipossomas também podem incluir componentes de rigidez de membrana, tais como esteróis, por exemplo, colesterol. Em alguns casos, os lipossomas também incluem lipídios conjugados com polímeros hidrofílicos, tais como derivados lipídicos de polietilenoglicol (PEG) que podem reduzir a tendência dos lipossomas para se agregarem e que também têm outros efeitos benéficos. Um tal PEG-lipídio é N-(metóxi-PEG)-oxicarbonil-diestearoil-fosfatidiletanolamina, em que a porção PEG tem um peso molecular de cerca de 2000, ou MPEG- 2000-DSPE. Os lipossomas têm tipicamente o tamanho numa faixa de mícron ou submícron e são bem reconhecidos pela sua capacidade para transportar substâncias farmacêuticas, incluindo fármacos anti- cancerígenos, tais como o irinotecano, e para alterar as suas propriedades farmacêuticas de várias formas benéficas. Métodos de preparação e caracterização de composições farmacêuticas de lipossomas são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Lasic D. Liposo-mes: From physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1993; G. Gre- goriadis (ed.), Liposome Technology, 3a edição, vol. 1-3, CRC Press, Boca Raton, 2006; Hong et al., Patente Norte-Americana 8.147.867, aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os efeitos).
[00117] Em algumas modalidades, os lipossomas são preparados como descrito em um ou mais exemplos ou outras modalidades na presente invenção, de modo que a concentração da composição final de lipossoma é aumentada de modo que a formulação contenha uma concentração da porção de irinotecano equivalente ao cloridrato de irinotecano tri-hidratado a uma concentração de cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração da porção de irinotecano é equivalente ao cloridrato de irinote- cano tri-hidratado entre 5-10, 10-20, 20-30, 30-40 ou 40-50 mg/mL. Em algumas modalidades, as composições lipossômicas mencionadas sob esta seção são utilizadas para tratar tumores cerebrais ou qualquer outra condição em um mamífero, tal como é descrito na Patente Norte- Americana No. 8.658.203, que é incorporada na presente invenção por referência em sua totalidade.
[00118] A formulação de lipossomas encapsulando irinotecano pode ser uma formulação injetável contendo lipossomas (incluindo formulações injetáveis que podem ser subsequentemente diluídas com um diluente farmaceuticamente aceitável antes da administração a um paciente). Em algumas modalidades, a quantidade de irinotecano ou de um sal do mesmo é adicionada aos lipossomas contendo um ou mais agentes de retenção, onde o irinotecano está presente em uma concentração de porção de irinotecano equivalente a, em gramas de base anidra de irinotecano, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g ou 700 g por mol de fosfolipídio. Em algumas modalidades, o irinotecano está presente durante o processo de carga de fármaco em uma concentração da porção de irinotecano equivalente a, em gramas da base anidra livre de irinotecano, de 200 a 300 g, de 400 a 550 g, de 450 a 600 g, ou de 600 a 700 g por mol de fosfolipídio. Preferencialmente, cerca de 500 g (± 10%) da fração são carregados em lipossomas de irinotecano por mol de fosfolipídio de lipossoma, incluindo 471 g da fração de irino- tecano por mol total de fosfolipídio de lipossoma de irinotecano. Exemplos específicos na presente invenção incluem medições de li- possomas de irinotecano estabilizados contendo 471 g de porção de irinotecano por mol de fosfolipídio de lipossoma total, assim como li- possomas de irinotecano contendo 500 g de porção de irinotecano por mol total de fosfolipídio de lipossoma.
[00119] Em algumas modalidades, a concentração da fração de iri- notecano equivalente àquela proporcionada pela base anidra livre de irinotecano na preparação lipossômica é de cerca de 2,5, cerca de 3,0, cerca de 3,5, cerca de 4,0, cerca de 4,3, cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5 ou cerca de 6,0 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração da porção de irinotecano equivalente àquela proporcionada pela base anidra livre de irinotecano na preparação de lipossomas é 2,5-3,5, 3,5-4,5, 4,5-5,5 ou 5,5-6,5 mg/mL. Mais preferencialmente, ela é 4,5-5,5 mg/mL. Em modalidades preferenciais, a concentração da porção de irinotecano na preparação do lipossoma é de cerca de 4,3 mg/mL de base livre de irinotecano anidro por mL, e em uma modalidade mais preferencial, ela é 4,3 mL/mL de base livre anidra de irino- tecano por mL. A preparação de lipossoma pode ser um frasco contendo cerca de 43 mg de base anidra de irinotecano livre na preparação de lipossomas tendo um volume de cerca de 10 mL, que pode ser subsequentemente diluído (por exemplo, em 500 mL de um diluente farmaceuticamente aceitável) antes da administração intravenosa a um paciente.
[00120] Assim, algumas modalidades da invenção fornecem um método para produzir uma preparação de lipossoma de irinotecano compreendendo lipossomas de irinotecano estabilizados encapsulando octassulfato de irinotecano sacarose (SOS) em uma vesícula de bicamada lipídica unilamelar consistindo em 1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol terminado em metó- xi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato uma solução contendo irinotecano com um lisossoma do agente de retenção encapsulando um cátion trietilamônio (TEA) e agente de retenção de oc- tassulfato de sacarose (SOS) em uma concentração de sulfato de 0,40,5 M (fornecida a partir de TEA8SOS) sem irinotecano sob condições eficazes para carregar 500 g (± 10%) da porção de irinotecano por mol de fosfolipídio no lipossoma do agente de retenção para formar os li- possomas com irinotecano-SOS, e (b) combinar os lipossomas com irinotecano-SOS com ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1- il]etanossulfônico (HEPES) para obter uma preparação de lipossoma de lipossoma com irinotecano com um pH de 7,25-7,50, para obter uma preparação de lipossoma com irinotecano estabilizada para formar menos de 10% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nos lipossomas de irinotecano) durante 3 meses de armazenamento a 4 °C.
[00121] Os lipossomas de irinotecano estáveis ao armazenamento podem ser preparados em várias etapas compreendendo a formação de um lipossoma contendo TEA, seguido do carregamento de irinote- cano no lipossoma conforme o TEA sai do lipossoma. A primeira etapa pode incluir a formação do lipossoma contendo TEA-sucrossofato por hidratação e dispersão dos lipídios lipossômicos na solução de TEA- sucrossofato. Isso pode ser realizado, por exemplo, dissolvendo os lipídios, incluindo DSPC e colesterol, em etanol aquecido, e dispersando a solução lipídica dissolvida e aquecida na solução aquosa de TEA-sucrossofato à temperatura acima da temperatura de transição (Tm) do lipídio lipossômico, por exemplo, 60 °C ou mais. A dispersão lipídica pode ser formada em lipossomas tendo o tamanho médio de 75-125 nm (tal como 80-120 nm, ou em algumas modalidades, 90-115 nm), por extrusão através de membranas de membranas de policarbonato gravadas com sinais com o tamanho de poro definido, por exemplo, 100 nm. O TEA-sucrossofato pode incluir pelo menos 8 equivalentes molares de TEA para cada equivalente molar de sucrossofato para obter uma solução que pode ter uma concentração de sulfato de cerca de 0,40-0,50 M e um pH (por exemplo, cerca de 6,5) selecionado para evitar a degradação inaceitável do fosfolipídio de lipossoma durante as etapas de dispersão e extrusão (por exemplo, um pH selecionado para minimizar a degradação do fosfolipídio de lipossoma durante essas etapas). Em seguida, o TEA-SOS não retido pode ser removido da dispersão lipossômica, por exemplo, por diálise, cromatografia em gel, de troca iônica ou ultrafiltração antes do encapsulamento do irinoteca- no. Esses lipossomas podem ser estabilizados colocando irinotecano suficiente dentro dos lipossomas para reduzir a quantidade de TEA na composição de lipossomas resultante até um nível que resulta em menos do que um dado nível máximo de formação de liso-PC após 180 dias a 4 °C, ou, mais comumente, a 5 ± 3 °C, medido, por exemplo, em mg/mL/mês, ou % de conversão de PC em liso-PC ao longo de uma unidade de tempo, como % em mol de liso-PC/mês. Em seguida, o TEA trocado dos lipossomas para o meio externo durante o processo de carregamento, juntamente com qualquer irinotecano não retido, é tipicamente removido dos lipossomas por qualquer/quaisquer proces- so(s) conhecido(s) (por exemplo, cromatografia em gel, diálise, diafil- tração, troca iônica ou ultrafiltração). O meio externo do lipossoma pode ser trocado por um fluido isotônico injetável (por exemplo, solução isotônica de cloreto de sódio), tamponado a um pH desejado.
[00122] Em algumas modalidades, as composições de lipossomas com irinotecano contendo cerca de 3,9 a 4,7 mg/mL de irinotecano e menos de 20% de liso-PC após 180 dias a 4 °C podem ser obtidas quando a quantidade de TEA é inferior a 25 ppm, ou menor do que 20 ppm. Elevar o pH da composição de lipossoma com irinotecano fora do lipossoma também pode estabilizar o armazenamento dos liposso- mas de sucrossulfato de irinotecano contendo mais de 25 ppm de TEA, resultando em lipossomas de irinotecano com menos de 20% de formação adicional de liso-PC após 180 dias a 4 °C. Por exemplo, as composições de lipossomas com irinotecano contendo cerca de 4-5 mg de irinotecano/mL e 100 ppm de TEA e tendo um pH de cerca de 7-8 fora do lipossoma também podem ter menos de 20% de formação de liso-PC após 180 dias a 4 °C. Em outro exemplo, em composições lipossômicas contendo cerca de 3,9-4,7 mg/mL de irinotecano e um pH do meio exterior ao lipossoma na faixa de 7-8, com quantidade de TEA residual inferior a cerca de 25 ppm (ou preferivelmente, inferior a 20 ppm), a quantidade de liso-PC acumulada na composição lipossômica durante 180 dias a 4 °C pode ser igual a 10% em mol ou menos.
[00123] A invenção, dessa forma, fornece uma composição de li- possoma com irinotecano compreendendo sucrossulfato de irinoteca- no encapsulado em um lipossoma de fosfolipídio com uma razão de estabilidade de liso-PC de pelo menos 990 (por exemplo, 990-1100, ou cerca de 1111).
[00124] A invenção também fornece uma composição de lipossoma com irinotecano, a composição compreendendo uma porção de 4,3 mg/mL (± 10%) equivalente à proporcionada pela base anidra de irino- tecano livre e concentração de 0,4-0,5 M de sulfato encapsulado em uma vesícula compreendendo DSPC e colesterol em uma razão molar 3:2, e uma razão de 400-600 g de irinotecano/fosfolipídio em mol na vesícula.
[00125] A invenção também fornece uma composição de lipossoma com irinotecano compreendendo um total de cerca de 4,3 mg de porção de irinotecano/mL, com pelo menos 98% do irinotecano sendo encapsulado com octassulfato de sacarose (SOS) em uma razão molar de irinotecano:SOS de cerca de 8:1 em uma composição de liposso- ma, os lipossomas tendo um tamanho médio de 75-125 nm. O tamanho dos lipossomas de irinotecano de alta densidade estabilizados é, de preferência, de cerca de 110 nm (± 20 nm), e mais preferencialmente 110 nm (± 10 nm) (medido após a carga de fármaco lipossômica). De preferência, pelo menos cerca de 95% do irinotecano na composição farmacêutica é encapsulado no lipossoma. O lipossoma compreende preferencialmente DSPC e colesterol em uma razão molar de 3:2.
[00126] A invenção também pode fornecer um método de produção de um medicamento compreendendo lipossomas de irinotecano esta- bilizados que encapsulam octassulfato de irinotecano sacarose (SOS) numa vesícula de bicamada lipídica unilamelar consistindo em 1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenogli- col terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato o irinotecano com um lipossoma do agente de retenção encapsulando um cátion de trietilamônio (TEA), e o agente de retenção de octassulfato de sacarose (SOS) a uma concentração de sulfato de 0,4-0,5 M, como TEA8SOS sem irinotecano sob condições eficazes para carregar a porção irinotecano no lipossoma do agente de retenção e permitir a liberação do cátion TEA do lipossoma do agente de retenção para formar os lipossomas com irinotecano-SOS, (b) combinar os lipossomas com irinotecano-SOS com ácido 2-[4-(2- hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) para obter uma pre-paração de lipossoma com irinotecano com pH de 7,25 a 7,50, para obter uma preparação de lipossoma com irinotecano estabilizada para formar menos de 10% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nos lipossomas com irinote- cano) durante 3 meses de armazenamento a 4° C e (c) formular a combinação de lipossomas com irinotecano-SOS e HEPES como um medicamento.
[00127] Em algumas modalidades desses métodos, os lipossomas com irinotecano-SOS na preparação de lipossoma com irinotecano contêm um total de menos de 100 ppm de TEA. Em algumas modalidades, a vesícula de bicamada lipídica unilamelar consiste em 6,81 mg/mL de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 2,22 mg/mL de colesterol e 0,12 mg/mL de polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE). Em algumas modalidades, a preparação de lipossoma com irinotecano compreende um total de 500 g (± 10%) de irinotecano por mol de fos- folipídio de lipossoma com irinotecano estabilizado, e pelo menos 98% do irinotecano na preparação de lipossoma com irinotecano é encapsulado nos lipossomas com irinotecano. Em algumas modalidades, a preparação de lipossoma com irinotecano compreende ainda 4,05 mg/mL de ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES). Em algumas modalidades, a preparação de lipossomas com irinotecano compreende ainda 8,42 mg/mL de cloreto de sódio. Em algumas modalidades, a preparação de lipossoma com irinotecano tem uma concentração de porção de irinotecano equivalente à forneci-da por cerca de 4,3 mg/mL de base anidra de irinotecano livre. Em algumas modalidades, os lipossomas com irinotecano estabilizados encapsulam irinotecano e SOS em um composto de fórmula (I), em que x = 8.
[00128] Em algumas modalidades, a composição contém menos de 2% em mol de liso-PC após 3 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 5% em mol de liso-PC após 3 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição lipossomal contém menos de 10% em mol de liso-PC após 6 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 10% em mol de liso-PC após 9 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 5% em mol de liso-PC após 6 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 5% em mol de liso-PC após 9 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 2% em mol de liso-PC após 6 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 2% em mol de liso-PC após 9 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 10% em mol de liso-PC após 12 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas mo- dalidades, a composição contém menos de 5% em mol de liso-PC após 12 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 2% em mol de liso-PC após 12 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 10% em mol de liso-PC após 24 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 5% em mol de liso-PC após 24 meses de armaze-namento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 2% em mol de liso-PC após 24 meses de armazenamento a 2-8 °C. Em algumas modalidades, a composição contém menos de 100 ppm de uma amônia substituída. Em algumas modalidades, a composição contém entre 20 e 80 ppm de um composto amônio substituído, que é TEA ou DEA protonado.
[00129] Em outras modalidades, a composição de camptotecina estabilizada é fornecida como um kit compreendendo um ou mais frascos de componente para a preparação da composição de camptoteci- na. Por exemplo, um kit para a preparação de irinotecano lipossomal pode incluir o seguinte (armazenado em recipientes separados ou em porções separadas do mesmo recipiente: • uma solução de irinotecano (por exemplo, cloridrato de iri- notecano para injeção); • um lipossoma que encapsula um agente de retenção (por exemplo, lipossomas de agente de retenção formados a partir de uma solução de octassulfato de sacarose); e • instruções para combinar a solução de irinotecano e os li- possomas do agente de retenção para formar uma composição de iri- notecano lipossomal compreendendo uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de irinotecano encapsulado nos lipossomas com irinotecano lipossomal (por exemplo, 500 g (± 10%) de irinotecano por mol fosfoli- pídio total nos lipossomas de agente de retenção e 4,3 mg de irinote- cano total por mL de composição de irinotecano lipossomal).
Uso Terapêutico das Composições de Camptotecina
[00130] As composições de camptotecina - incluindo lipossomas com irinotecano e outras composições e preparações aqui divulgadas da invenção, podem ser utilizadas na terapia e em métodos de tratamento, e/ou na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças, tais como o câncer. Em algumas modalidades, uma terapia compreende a administração de uma composição de camptotecina para o tratamento de câncer. Por exemplo, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer basocelular, câncer de meduloblasto- ma, câncer de fígado, rabdomiossarcoma, câncer de pulmão, câncer dos ossos, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de útero, carcinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer de glândula suprarrenal, sarcoma de tecido mole, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, linfomas linfocíticos, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, neoplasias do sistema nervoso central, linfoma primário do sistema nervoso central, tumores do eixo vertebral, glioma do tronco encefálico e adenoma hipofisário ou uma combinação de um ou mais desses cânceres. Em algumas modalidades, o câncer é pancreático, opcionalmente adenocarcinoma do pâncreas, como o adenocarcinoma metastático do pâncreas, por exemplo, onde ocorreu a progressão de doença após a terapia com base em gencitabina. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de pequenas células. Em algumas modalidades, o câncer é câncer do trato biliar.
[00131] Quando utilizado como terapia, a composição lipossomal pode ser utilizada em um regime de tratamento com um ou mais outros compostos ou composições. A administração da composição de lipossoma com um ou mais outros compostos ou composições pode ser simultânea, separada ou sequencial. O um ou mais outros compostos ou composições podem adicionalmente ser terapêuticos, por exemplo, outros agentes anticâncer, ou podem ser compostos que são concebidos para melhorar os efeitos colaterais negativos dos agentes terapêuticos. Em algumas modalidades, a composição lipossomal é administrada com leucovorina. Em algumas modalidades, a composição lipossomal é administrada com 5-fluoruracila (5-FU). Em algumas modalidades, a composição lipossomal é administrada com leucovori- na e 5-fluoruracila (5-FU). Este regime de três vias pode ser usado para tratar o câncer de pâncreas, como discutido no parágrafo anterior. A 5-FU pode ser administrada na dose de 2400 mg/m2, e a leucovorina pode ser administrada na dose de 200 mg/m2 (forma l) ou 400 mg/m2 (forma racêmica l + d). Em algumas modalidades, a composição é também administrada em um regime de tratamento com gencitabina.
[00132] Em algumas modalidades em que a composição lipossomal é usada para tratar o câncer de ovário, a composição lipossomal é administrada com um inibidor de PARP (poli ADP ribose polimerase).
[00133] Em algumas modalidades, a matriz de liberação prolongada pode ser uma nanopartícula (por exemplo, sílica ou polímero) ou um agregado de polímero (por exemplo, polímero PEG) configurado para reter o agente de retenção. Durante o carregamento do fármaco, a matriz pode ser colocada em contato com o composto de camptotecina sob condições eficazes para reter o composto de camptotecina e o agente de retenção, formando a formulação de liberação prolongada estável.
[00134] Em algumas modalidades, a composição de camptotecina estabilizada é uma preparação de lipossoma de SOS irinotecano formulada para administração intraparenquimatosa a um paciente durante uma terapia de administração aprimorada por convecção. A concentração da porção de irinotecano, equivalente à proporcionada pela base anidra livre de irinotecano na preparação final do lipossoma, é de cerca de 17, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35 ou cerca de 40 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração da porção de irinotecano equivalente àquela proporcionada pela base anidra de irinotecano livre na preparação de lipossomas é 17-20, 1725, 17-30, 17-35 ou 17-40 mg/mL. Mais preferencialmente, a concentração total da porção de irinotecano, equivalente à proporcionada pela base anidra de irinotecano livre (por exemplo, como octassulfato de irinotecano sacarose) na preparação de lipossomas com irinotecano é 17 mg/mL ou 35 mg/mL. A preparação de lipossoma pode estar em um recipiente estéril que inclui lipossomas de octassulfato de irinote- cano sacarose na preparação de lipossoma em uma concentração da porção de irinotecano equivalente à fornecida por cerca de 17mg/mL ou cerca de 35 mg/mL ou de 17 a 35 mg/mL de base anidra de irinote- cano livre para administração local a um paciente (por exemplo, no cérebro de um paciente diagnosticado com um glioma, para um local dentro do cérebro como parte de uma terapia de administração aprimorada por convecção). A concentração de 17-35 mg/mL de liposso- mas com irinotecano pode ser equivalentemente expressa como a quantidade de base anidra de irinotecano livre presente em 20-40 mg de cloridrato de irinotecano tri-hidratado por mL da preparação de li- possoma com irinotecano. Por exemplo, a preparação de irinotecano lipossomal pode ser administrada no cérebro de um paciente (por exemplo, através de um ou mais cateteres cirurgicamente colocados em uma localização intratumoral) em doses que proporciona, um total de porção de irinotecano equivalente à fornecida por 17 mg, 26 mg, 52 mg ou 70 mg de base anidra de irinotecano livre. O volume total de irinotecano da preparação de lipossoma com irinotecano administrada na localização intratumoral no cérebro do paciente pode ser de cerca de 1 a 2 mL (por exemplo, 1,0, 1,5 ou 2,0 mL) durante um período de cerca de 2-4 horas (por exemplo, 2-3 horas, 3-4 horas ou 2-4 horas).
[00135] Os lipossomas com irinotecano contêm preferencialmente sucrossulfato de irinotecano encapsulado dentro de uma vesícula formada por lipídios compreendendo DSPC e colesterol em uma razão molar de 3:2. A vesícula também pode conter um fosfolipídio derivado de polietilenoglicol (PEG), tal como MPEG-2000-DSPE. A quantidade de MPEG-2000-DSPE pode menor do que 1% em mol do lipídio lipos- sômico (por exemplo, cerca de 0,3% mol em uma vesícula consistindo em DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE em uma razão molar de 3:2:0,015). O PEG pode ser distribuído tanto no interior como no exterior da vesícula lipídica lipossomal que envolve o irinotecano. O irino- tecano encapsulado está preferencialmente na forma de um sal com éster sulfato de sacarose (sucrossofato), tal como o sucrossofato de irinotecano (número de registo CAS 1361317-83-0). De preferência, pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% do irinotecano na composição de lipossoma com irinotecano é encapsulado em uma vesícula lipossomal, com uma concentração de porção de irinotecano total de cerca de 3,87-4,73 mg de irinotecano (base anidra livre) por mL da composição de lipossoma com irinotecano. O pH da composição de lipossoma com irinotecano é preferencialmente de cerca de 6,5-8,0 fora do lipossoma, ou cerca de 6,6-8,0, 6,7-8,0, 6,8-8,0, 6,9-8,0 ou 7,0-8,0 e, de um modo preferido, cerca de 7,2-7,6. Em algumas modalidades, o pH é cerca de 7,2-7,5. Em algumas mo- dalidades, o pH é cerca de 7,25. Em outras modalidades, o pH é de cerca de 7,25-7,5. Em outras modalidades, o pH é de cerca de 7,4-7,5. Modalidades de combinação
[00136] As características das modalidades numeradas na presente invenção podem ser combinadas com as características de outras modalidades aqui divulgadas, incluindo tanto as modalidades referidas como composições como as modalidades referidas como preparações.
[00137] Os métodos descritos acima partilham características em comum com as modalidades das composições e preparações apresentadas em outra parte do relatório descritivo porque se relacionam com a produção destas composições e preparações. As características divulgadas em relação às composições e preparações também podem ser combinadas com os métodos divulgados no parágrafo anterior. Consequentemente, as características das subseções precedentes, e em qualquer outra parte do presente documento, tal como na seção de modalidades numeradas abaixo, podem ser combinadas com as características divulgadas nos métodos nos parágrafos desta subseção.
[00138] Por exemplo, os seguintes são exemplos de várias combinações das modalidades divulgadas e/ou exemplificadas na presente invenção: • Uma composição de lipossoma com irinotecano que, após o armazenamento durante 180 dias a 4 graus C, contém cerca de 3,94,7 mg/mL de porção de irinotecano e menos de 20% de liso-PC. • Uma composição de lipossoma com irinotecano compreendendo sucrossulfato de irinotecano encapsulado em um lipossoma de fosfolipídio com uma razão de estabilidade de liso-PC de pelo menos 990 (por exemplo, 990-1100, ou cerca de 1111). • Uma composição de lipossoma com irinotecano, a composição compreendendo 4,3 mg/mL (± 10%) de porção de irinotecano e concentração de 0,4-0,5 M de sulfato encapsulado em uma vesícula compreendendo DSPC e colesterol em uma razão molar de 3:2, e uma razão de 450-550 g de irinotecano/mol total de fosfolipídio na vesícula. • Uma composição de lipossoma com irinotecano compreendendo um total de cerca de 4,3 mg de porção de irinotecano/mL, com pelo menos 98% do irinotecano sendo encapsulado com octassul- fato de sacarose (SOS) em uma razão molar de irinotecano:SOS de cerca de 8:1 em uma composição de lipossoma, os lipossomas tendo um tamanho médio de 75-125 nm. • A composição de acordo com qualquer modalidade anterior, em que o lipossoma com irinotecano é obtido por um processo compreendendo a etapa de colocar em contato o irinotecano com su- crossofato de trietilamônio (TEA) encapsulado dentro do lipossoma de fosfolipídio. • A composição de acordo com a modalidade anterior, em que a concentração de TEA-SOS é de cerca de 0,40-0,50 M. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tamanho do lipossoma é cerca de 110 nm (± 10%). • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, compreendendo cerca de 433 g de porção de irino- tecano/mol de fosfolipídio. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de lipossoma com irinotecano contém menos do que cerca de 100 ppm de trietilamina. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de lipossoma com irinotecano é uma solução de lipossomas em um líquido, em que o líquido fora dos lipossomas com irinotecano tem um pH de cerca de 7,0-8,0, por exemplo 7,25-7,5, tal como 7,25, opcionalmente, em que o líquido fora dos lipossomas com irinotecano é um fluido injetável farmaceutica- mente aceitável. • A composição de acordo com quaisquer modalidades anteriores, compreendendo a porção de irinotecano na quantidade equivalente à proporcionada por 4,5-5,5 mg/mL de cloridrato de irinotecano tri-hidratado. • A composição de acordo com quaisquer modalidades anteriores, em que pelo menos cerca de 95% de irinotecano na composição de lipossoma com irinotecano é encapsulado no interior do lipos- soma. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o lipossoma compreende DSPC e colesterol em uma razão molar de 3:2, tal como em que o lipossoma compreende DSPC, colesterol e MPEG(2000)-SPE na razão molar de 3:2:0,015. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, tendo uma razão de estabilidade de 990-1200. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, com irinotecano/sucrossulfato de irinotecano encapsulado em lipossomas de pelo menos 0,9, pelo menos 0,95, pelo menos 0,98, pelo menos 0,99 ou essencialmente 1,0. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o fosfolipídio de lipossoma contém mais de 20% em mol de liso-PC após o armazenamento durante 180 dias a cerca de 4 graus C. • A composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição de lipossoma com irinotecano compreende ainda um fluido injetável farmaceuticamente aceitável com um pH de cerca de 7,0-8,0 fora do lipossoma com irinotecano, compreende 4,3 mg/mL de irinotecano calculado como uma base livre e opcionalmente obtido por um processo que compreende a etapa de colocar em contato o irinotecano com sucrossofato de trietilamônio (TEA) no lipossoma de fosfolipídico, possuindo opcionalmente uma concentração de TEA-sucrossofato e cerca de 0,40-0,50N. • A composição de acordo com qualquer modalidade anterior, em que a composição compreende cerca de 433 g de porção de irinotecano/mol de fosfolipídio e não mais de cerca de 100 ppm de trie- tilamônio encapsulado dentro do lipossoma de fosfolipídio. • A composição de acordo com quaisquer modalidades anteriores, que tem uma razão grama-equivalente de irinoteca- no/sucrossulfato encapsulado de pelo menos 0,9. • A composição de acordo com quaisquer modalidades anteriores, em que pelo menos 90%, tal como pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% (em outras palavras, essencialmente todo) o sucros- sulfato de irinotecano está na forma precipitada ou gelificada de um sal estequiométrico compreendendo oito moléculas de irinotecano por uma molécula de sucrossofato. • A composição de acordo com quaisquer modalidades anteriores, em que pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% do su- crossulfato de irinotecano encapsulado está forma precipitada ou geli- ficada de um sal estequiométrico compreendendo oito moléculas de irinotecano por uma molécula de sucrossofato. • A composição de lipossoma com irinotecano de acordo com qualquer modalidade anterior, que não tem mais do que cerca de 100 ppm de trietilamônio (TEA). • A composição de lipossoma com irinotecano de acordo com qualquer modalidade anterior, que não tem mais do que cerca de 20 ppm de trietilamônio (TEA). • A composição de lipossoma com irinotecano, de acordo com qualquer modalidade anterior, tendo um volume total de cerca de 10 mL. • A composição de lipossoma com irinotecano, de acordo com qualquer modalidade anterior, compreendendo 6,81 mg/mL de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 2,22 mg/mL de colesterol e 0,12 mg/mL de polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE). • A composição de lipossoma com irinotecano, de acordo com qualquer modalidade anterior, que compreende polietilenoglicol tanto dentro como fora do lipossoma com irinotecano. • Uma composição de lipossoma com irinotecano em dose unitária injetável estabilizada formulada para administração a um paciente, a composição compreendendo uma dose de irinotecano suficiente para administrar 70 mg de irinotecano por m2 da área superficial do corpo do paciente, em que: o pelo menos 99% do irinotecano é encapsulado em uma vesícula compreendendo fosfolipídio e colesterol, e em que até 20% em mol do fosfolipídio é liso-PC, sendo o restante DSPC, em que a vesícula está em um fluido injetável com o pH na faixa de 7,0-8,0; ou o a composição lipossomal em dose unitária injetável é uma dose unitária das composições lipossômicas de acordo com qualquer uma das modalidades acima. • Uma forma de dosagem unitária de lipossoma com irino- tecano injetável, compreendendo: o pelo menos cerca de 98% de irinotecano sob a forma de dosagem unitária encapsulada em um lipossoma compreendendo fos- folipídio, o dito fosfolipídio não contendo mais de cerca de 20% em mol de liso-PC; e o uma composição lipossomal de acordo com qualquer uma das modalidades acima. • A forma de dosagem unitária divulgada em uma modali- dade anterior, em que o irinotecano é encapsulado em uma vesícula circundada por uma membrana lipídica consistindo essencialmente em 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietile- noglicol terminado em metóxi (MW 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE). • A forma de dosagem unitária da modalidade 29 ou 30, em que a forma de dosagem unitária compreende pelo menos cerca de 6,81 mg/mL de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), cerca de 2,22 mg/mL de colesterol e cerca de 0,12 mg/mL de polietilenoglicol terminado em metóxi (MW 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE) L. • A forma de dosagem unitária de acordo com qualquer uma das modalidades 29-31, em que a forma de dosagem unitária compreende ainda ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1- il]etanossulfônico (HEPES) como um tampão e cloreto de sódio como um reagente de isotonicidade. • A composição lipossomal de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 27, ou a dose unitária de acordo com qualquer uma das modalidades 29 a 32, para uso em terapia. • A composição lipossomal ou dose unitária divulgada em uma modalidade na presente invenção para uso no tratamento de câncer. • A composição lipossomal ou dose unitária para uso divulgada em uma modalidade na presente invenção, em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer basocelular, câncer de meduloblastoma, câncer de fígado, rabdomiossarcoma, câncer de pulmão, câncer dos ossos, câncer de pâncreas, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de útero, car cinoma das trompas de falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer de esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula pa- ratireoide, câncer de glândula suprarrenal, sarcoma de tecido mole, câncer de uretra, câncer de pênis, câncer de próstata, leucemia crônica ou aguda, linfomas linfocíticos, câncer de bexiga, câncer de rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, neoplasias do sistema nervoso central, linfoma primário do sistema nervoso central, tumores do eixo vertebral, glioma do tronco encefálico e adenoma hipofisário ou uma combinação de um ou mais desses cânceres. • A composição lipossomal ou dose unitária de acordo com qualquer modalidade acima, em que o câncer é pancreático, opcionalmente adenocarcinoma do pâncreas, como o adenocarcinoma me- tastático do pâncreas, por exemplo, onde ocorreu a progressão de doença após a terapia com base em gencitabina. • A composição lipossomal ou dose unitária de acordo com qualquer modalidade acima, em que o câncer é câncer de cólon. • A composição lipossomal ou dose unitária de acordo com qualquer modalidade acima, em que a composição lipossomal ou dose unitária é para ser usada com leucovorina e/ou 5-fluoruracila, opcionalmente em que a administração da composição lipossomal ou dose unitária, leucovorina e/ou 5-fluoruracila é simultânea, separada ou sequencial. • A composição lipossomal ou dose unitária, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o lipossoma é administrado em uma dose para fornecer uma quantidade de irinotecano equivalente a 80 mg/m2 de cloridrato de irinotecano tri-hidratado. • Um método de tratamento de adenocarcinoma metastático do pâncreas após a progressão de doença após a terapia à base de gencitabina em um paciente que necessita disso, compreendendo administrar intravenosamente ao paciente uma forma de dosagem unitária de lipossoma com irinotecano injetável de qualquer uma das modalidades da presente invenção ou a dose unitária de acordo com quaisquer modalidades acima, compreendendo pelo menos cerca de 98% do irinotecano na forma de dosagem unitária encapsulada em um li- possoma compreendendo fosfolipídio contendo menos de cerca de 20% de liso-PC em uma quantidade que proporciona uma quantidade de irinotecano equivalente a 80 mg/m2 de cloridrato de irinotecano tri- hidratado. • Uma composição de irinotecano lipossomal estável ao armazenamento com um pH de 7,00 a 7,50 e compreendendo uma dispersão de lipossomas de irinotecano encapsulando octassulfato de irinotecano sacarose em vesículas de bicamada unilamelar consistindo em colesterol e nos fosfolipídios 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), em uma concentração de porção irinotecano equivalente a, em g de base anidra de irinotecano livre, 500 mg de irinotecano por mmol de fosfolipídio de lipossoma total e 4,3 mg/mL de irinotecano por mL de composição de irinotecano lipossomal, a composição de irinotecano lipossomal estabilizada ao armazenamento estabilizada para formar menos de 1 mg/mL de liso-PC durante os primeiros 6 meses de armazenamento a 4 °C. • A composição de irinotecano lipossomal de uma modalidade acima, feita por um processo que compreende as etapas de: (a) formar uma dispersão lipídica em uma solução feita a partir de DEA8SOS tendo uma concentração de sulfato de 0,4 a 0,5 M e um pH entre 5 a 7, sendo os lipídios na dita dispersão DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE em uma razão molar de cerca de 3: 2:0,015, respectivamente. (b) extrusar a dispersão lipídica entre 60-70 °C através de pelo menos uma membrana de 0,1 μm para formar lipossomas; (c) remover substancialmente os íons derivados de DEA8SOS e/ou DEA8SOS que estão fora dos lipossomas; (d) colocar em contato os lipossomas a uma temperatura entre 60-70 °C com uma solução feita usando base livre de irinotecano ou sal de irinotecano, formando assim uma preparação de lipossomas encapsulando irinotecano; (e) remover substancialmente substâncias derivadas dos ingredientes TEA8SOS e/ou DEA8SOS e ingredientes de irinotecano que estão fora dos lipossomas; e (f) ajustar o pH da composição para ser de 7,0 a 7,5. • A composição de irinotecano lipossomal de acordo com qualquer modalidade acima, em que a dispersão lipídica é extrusada por meio de pelo menos duas membranas de policarbonato de 0,1 μm empilhadas. • A composição de irinotecano lipossomal, conforme definida em qualquer modalidade acima, onde os lipossomas têm um tamanho médio de 110 nm, conforme é determinado por espalhamento de luz dinâmico e em que o tamanho é determinado pelo método dos cumulativos. • Composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, com um teor de porção de irinotecano total equivalente a 4,3 mg/mL de base livre anidra de irinotecano. • A composição de irinotecano lipossomal de acordo com qualquer modalidade acima, em que: na etapa (a), os lipossomas são formados a partir de DEA8SOS tendo uma concentração de sulfato entre 0,43-0,47 M; e na etapa (d), a solução preparada utilizando base livre de irinotecano ou um sal de irinotecano tem um teor de unidade de irino- tecano equivalente a 500 g (+10%) de base livre de irinotecano anidro por mol de DSPC; e na etapa (f), ajustar o pH da composição para ser de 7,2 a 7,3. • A composição lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, contendo menos de 1% em mol de lisofosfati- dilcolina (liso-PC) antes do armazenamento a cerca de 4 °C e 20% em mol ou menos (em relação ao total de fosfolipídio de lipossoma) de liso-PC após 180 dias de armazenamento a cerca de 4 °C. • A composição lipossomal de acordo com qualquer modalidade acima, contendo 20% em mol ou menos (em relação ao total de fosfolipídio de lipossoma) de lisofosfatidilcolina (liso-PC) após 6, 9 ou 12 meses de armazenamento a cerca de 4 °C. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, compreendendo um total de 6,1 a 7,5 mg de DSPC/mL, de 2 a 2,4 mg de colesterol/mL e de 0,11 a 0,13 mg de MPEG-2000-DSPE/mL, todos em um tampão isotônico aquoso. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, em que o irinotecano lipossomal compreende os lipossomas com irinotecano em um tampão aquoso de HEPES isotônico a uma concentração entre 2 e 20 mM. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, compreendendo ainda cloreto de sódio a uma concentração de 130-160 mM. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, em que o irinotecano encapsulado nos lipossomas está em um estado gelificado ou precipitado como um sal de octassulfato de sacarose. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, em que os lipossomas com irinotecano têm um diâmetro de 95-115 nm, conforme medido pelo espalhamento da luz quasi elástico. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, compreendendo um total de 6,81 mg de DSPC/mL, 2,22 mg de colesterol/mL e 0,12 mg de MPEG-2000- DSPE/mL, 4,05 mg/mL de tampão aquoso HEPES e 8,42 mg de cloreto de sódio/mL. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, possuindo um pH igual a 7,25, em que os lipossomas com irinotecano têm um diâmetro de 110 nm, conforme medido por espalhamento da luz quasi elástico. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, formando menos de 1 mg/mL de lisofosfa- tidilcolina (liso-PC) após 6 meses de armazenamento a cerca de 4 °C. • A composição de irinotecano lipossomal de acordo com qualquer modalidade acima, feita por um processo que compreende as etapas de: (a) formar uma dispersão lipídica em uma solução de DEA8SOS com uma concentração de sulfato de cerca de 0,45 M e um pH de cerca de 6,5, os lipídios na dita dispersão consistindo em 1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenogli- col terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE) em uma razão molar de 3:2:0,015, respectivamente; (b) extrusar a dispersão lipídica entre 60-70 °C através de pelo menos uma membrana de 0,1 μm para formar lipossomas; (c) remover os íons derivados de DEA8SOS que estão fora dos lipossomas; (d) colocar em contato os lipossomas a uma temperatura entre 60 e 70 °C com uma solução preparada usando cloridrato de iri- notecano tri-hidratado para formar uma preparação de lipossomas encapsulando cerca de 500 g (± 10%) de irinotecano por mol total de fos- folipídio de lipossoma; (e) remover substâncias derivadas dos ingredientes TEA8SOS e irinotecano que estão fora dos lipossomas; e (f) ajustar o pH da composição para ser cerca de 7,3. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, compreendendo um total inferior a 100 ppm de DEA. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, compreendendo um total inferior a 100 ppm de DEA. • A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, em que pelo menos 98% do irinotecano é encapsulado nos lipossomas de irinotecano após 6 meses de armazenamento a cerca de 4 °C. • Uma preparação de lipossoma com irinotecano compreendendo lipossomas com irinotecano estabilizados encapsulando oc- tassulfato de irinotecano sacarose (SOS) em uma vesícula de bicama- da lipídica unilamelar com aproximadamente 110 nm de diâmetro consistindo em 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol terminado em metóxi (MW 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), em que os lipos- somas com irinotecano estabilizados são obtidos por um processo compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato o irinotecano com um lipossoma do agente de retenção encapsulando um cátion de dietilamônio (DEA) e o agente de retenção octassulfato de sacarose (SOS) a uma concentração de 0,4-0,5 M (com base na concentração do grupo sulfato) como TEA8SOS sem irinotecano sob condições efetivas para carregar 500 g (± 10%) da porção de irinotecano por mol de fosfolipídio de lipossoma total no lipossoma do agente de retenção e permitir a liberação do cá- tion DEA do lipossoma do agente de retenção para formar os liposso- mas com irinotecano-SOS, e (b) combinar os lipossomas com irinotecano-SOS com ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) para obter uma preparação de lipossoma de lipossoma com irinotecano com um pH de 7,25-7,50, para obter uma preparação de lipossoma com irino- tecano estabilizada para formar menos de 10% em mol de lisofosfati- dilcolina (liso-PC) (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nos lipossomas de irinotecano) durante 3 meses de armazenamento a 4 °C. • A preparação de lipossoma com irinotecano de acordo com qualquer modalidade acima, em que os lipossomas com irinote- cano-SOS na preparação de lipossoma com irinotecano contêm um total inferior a 100 ppm de TEA. • A preparação de lipossoma com irinotecano de acordo com qualquer modalidade acima, em que a vesícula de bicamada lipí- dica unilamelar consiste em 6,81 mg/mL de 1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (DSPC), 2,22 mg/mL de colesterol e 0,12 mg/mL de poli- etilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE). • A preparação de lipossoma com irinotecano de acordo com qualquer modalidade acima, compreendendo um total de 500 mg de irinotecano por mol de fosfolipídio de lipossoma com irinotecano estabilizado, e pelo menos 98% do irinotecano na preparação de li- possoma com irinotecano é encapsulado nos lipossomas com irinote- cano. • A preparação de lipossoma com irinotecano, de acordo com qualquer modalidade acima, em que a preparação de lipossoma com irinotecano compreende ainda cerca de 4,05 mg/mL de ácido 2- [4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) a um pH de cerca de 7,25-7,50. • A preparação de lipossoma com irinotecano, de acordo com qualquer modalidade acima, em que a preparação de lipossoma com irinotecano compreende ainda cerca de 8,42 mg/mL de cloreto de sódio. • A preparação de lipossoma com irinotecano, de acordo com qualquer modalidade acima, possuindo um total de cerca de 4,3 mg de irinotecano por mL da preparação de lipossoma com irinoteca- no. • A composição de acordo com qualquer modalidade anterior, em que o lipossoma com irinotecano é obtido por um processo compreendendo a etapa de colocar em contato o irinotecano com amônia encapsulada dentro do lipossoma de fosfolipídio. • Uma preparação de lipossoma com irinotecano compreendendo lipossomas com irinotecano estabilizados encapsulando oc- tassulfato de irinotecano sacarose (SOS) em uma vesícula de bicama- da lipídica unilamelar com aproximadamente 110 nm de diâmetro consistindo em 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol terminado em metóxi (MW 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), em que os lipos- somas com irinotecano estabilizados são obtidos por um processo compreendendo as etapas de: (a) colocar em contato o irinotecano com um lipossoma do agente de retenção encapsulando um cátion de dietilamônio e o agente de retenção octassulfato de sacarose (SOS) sob condições efetivas para carregar 500 g (± 10%) da porção de irinotecano por mol de fosfo- lipídio de lipossoma total no lipossoma do agente de retenção e permitir a liberação do cátion amônio do lipossoma do agente de retenção para formar os lipossomas com irinotecano-SOS, e (b) combinar os lipossomas com irinotecano-SOS com ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanossulfônico (HEPES) para obter uma preparação de lipossoma de lipossoma com irinotecano com um pH de 7,25-7,50, para obter uma preparação de lipossoma com irino- tecano estabilizada para formar menos de 10% em mol de lisofosfati- dilcolina (liso-PC) (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nos lipossomas de irinotecano) durante 3 meses de armazenamento a 4 °C. • Uma preparação de lipossoma SN38 compreendendo li- possomas estabilizados compreendendo irinotecano e/ou SN-38 em um lipossoma compreendendo 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol (MW 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), estabilizada para formar menos de 10% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) (em relação à quantidade total de fosfatidilcolina nos lipossomas) durante 3 meses de armazenamento a 4 °C. • A preparação de lipossoma com irinotecano de acordo com qualquer modalidade acima, em que os lipossomas de irinotecano estabilizados encapsulam 30-100 ppm de TEA ou DEA, irinotecano e SOS em um composto de fórmula (I), em que x é 8.
[00139] Em uma modalidade, a composição de lipossoma com iri- notecano divulgada na presente invenção é uma composição de lipos- soma com irinotecano estabilizada compreendendo sucrossulfato de irinotecano encapsulado em um lipossoma de fosfolipídio com uma razão de estabilidade liso-PC de pelo menos 990 (por exemplo, 9901100, ou cerca de 1111), em que a composição lipossomal compreende pelo menos uma das seguintes características: (i) o tamanho do lipossoma é de cerca de 110 nm (± 10%), (ii) a composição compreende cerca de 433 g ou pelo menos cerca de 433 g de porção de irinotecano/mol de fosfolipídio (iii) a composição contém menos de cerca de 100 ppm de trietilamina, (iv) a composição compreende um fluido injetável farma- ceuticamente aceitável com um pH de cerca de 7,25 fora do lipossoma com irinotecano, (v) os lipossomas compreendem DSPC e colesterol em uma razão molar de 3:2 (vi) a composição tem uma razão grama-equivalente de irinotecano/sucrossulfato encapsulado em lipossomas de pelo menos 0,9, pelo menos 0,95, pelo menos 0,98 ou essencialmente 1,0; e (vii) pelo menos 90%, tal como pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% (em outras palavras, essencialmente todo) o sucrossulfato de irinotecano está na forma precipitada ou gelificada de um sal este- quiométrico compreendendo oito moléculas de irinotecano por uma molécula de sucrossofato.
[00140] Em uma modalidade, a composição de lipossoma com iri- notecano divulgada na presente invenção é uma composição de lipos- soma com irinotecano estabilizada compreendendo sucrossulfato de irinotecano encapsulado em um lipossoma de fosfolipídio com uma razão de estabilidade liso-PC de pelo menos 990 (por exemplo, 990- 1100, ou cerca de 1111), em que: (i) o tamanho do lipossoma é de cerca de 110 nm (± 10%), (ii) a composição compreende cerca de 433 g ou pelo menos cerca de 433 g de porção de irinotecano/mol de fosfolipídio (iii) a composição contém menos de cerca de 100 ppm de trietilamina, (iv) a composição compreende um fluido injetável farma- ceuticamente aceitável com um pH de cerca de 7,25 fora do lipossoma com irinotecano, (v) os lipossomas compreendem DSPC e colesterol em uma razão molar de 3:2 (vi) a composição tem uma razão grama-equivalente de irinotecano/sucrossulfato encapsulado em lipossomas de pelo menos 0,9, pelo menos 0,95, pelo menos 0,98 ou essencialmente 1,0; e (vii) pelo menos 90%, tal como pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% (em outras palavras, essencialmente todo) o sucrossulfato de irinotecano está na forma precipitada ou gelificada de um sal este- quiométrico compreendendo oito moléculas de irinotecano por uma molécula de sucrossofato.
[00141] Modalidade 1: Uma composição de irinotecano lipossomal estabilizada para o armazenamento com um pH de 7,00-7,50 e compreendendo uma dispersão de lipossomas com irinotecano encapsulando octassulfato de irinotecano sacarose em vesículas consistindo em colesterol e os fosfolipídios 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)- diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE), a uma concentração de porção de irinotecano equivalente, em gramas de base anidra de irinotecano livre, de 500 mg (10%) de porção de irinotecano por mmol de fosfolipídio de lipossoma total e 4,3 mg de porção de irinote- cano por mL da composição de irinotecano lipossomal, a composição de irinotecano lipossomal estabilizada para armazenamento estabilizada para formar menos de 20% em mol de liso-PC durante os primeiros 6 meses de armazenamento a 4 °C.
[00142] Modalidade 2: Uma composição de irinotecano lipossomal estabilizada para armazenamento com um pH de 7,00-7,50 e compreendendo uma dispersão de lipossomas com irinotecano encapsulando octassulfato de irinotecano sacarose em vesículas de camada dupla unilamelares consistindo em colesterol e nos fosfolipídios 1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e polietilenoglicol terminado em metóxi (MW 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000- DSPE), a uma concentração de porção de irinotecano equivalente, em gramas de base anidra de irinotecano livre, a 500 mg (± 10%) de porção de irinotecano por mmol de fosfolipídio de lipossoma total e 4,3 mg de porção de irinotecano por mL da composição de irinotecano lipos- somal, a composição de irinotecano lipossomal estabilizada para armazenamento tendo uma razão grama-equivalente de irinoteca- no/composto sulfato de 0,85-1,2.
[00143] Modalidade 3: Uma composição de irinotecano lipossomal estabilizada para armazenamento estabilizada para formar menos de 20% em mol de liso-PC durante os primeiros 6 meses de armazenamento a 4 °C, a composição de irinotecano lipossomal sendo feita por um processo compreendendo as etapas de: (a) formar uma dispersão lipídica em uma solução feita a partir de TEA8SOS e/ou DEA8SOS tendo uma concentração de sulfato de 0,4 a 0,5 M e um pH entre 5 a 7, sendo os lipídios na dita dispersão DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE em uma razão molar de cerca de 3: 2:0,015, respectivamente. (b) extrusar a dispersão lipídica entre 60-70 °C através de pelo menos uma membrana de 0,1 μm para formar lipossomas; (c) remover substancialmente os íons derivados de TEA8SOS e/ou DEA8SOS que estão fora dos lipossomas; (d) colocar em contato os lipossomas a uma temperatura entre 60-70 °C com uma solução feita usando base livre de irinotecano ou sal de irinotecano, formando assim uma preparação de lipossomas encapsulando irinotecano; (e) remover substancialmente substâncias derivadas dos ingredientes TEA8SOS e/ou DEA8SOS e ingredientes de irinotecano que estão fora dos lipossomas; e (f) ajustar o pH da composição para ser de 7,0 a 7,5.
[00144] Modalidade 4: A composição de irinotecano lipossomal de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, feita por um processo que compreende as etapas de: (a) formar uma dispersão lipídica em uma solução feita a partir de TEA8SOS tendo uma concentração de sulfato de 0,4 a 0,5 M e um pH entre 5 a 7, sendo os lipídios na dita dispersão DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE em uma razão molar de cerca de 3: 2:0,015, respectivamente. (b) extrusar a dispersão lipídica entre 60-70 °C através de pelo menos uma membrana de 0,1 μm para formar lipossomas; (c) remover substancialmente os íons derivados de TEA8SOS que estão fora dos lipossomas; (d) colocar em contato os lipossomas a uma temperatura entre 60-70 °C com uma solução feita usando base livre de irinotecano ou sal de irinotecano, formando assim uma preparação de lipossomas encapsulando irinotecano; (e) remover substancialmente substâncias derivadas dos ingredientes TEA8SOS e irinotecano que estão fora dos lipossomas; e (f) ajustar o pH da composição para ser de 7,0 a 7,5.
[00145] Modalidade 5: A composição de irinotecano lipossomal de acordo com a modalidade 4, em que a dispersão lipídica é extrusada por meio de pelo menos duas membranas de policarbonato de 0,1 μm empilhadas.
[00146] Modalidade 6: A composição de irinotecano lipossomal, conforme definida em qualquer modalidade acima, onde os lipossomas têm um tamanho médio de 110 nm, conforme é determinado por espalhamento de luz dinâmico e em que o tamanho é determinado pelo método dos cumulativos.
[00147] Modalidade 7: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, com um teor de porção de irinotecano total equivalente a 4,3 mg/mL de base livre anidra de irinotecano.
[00148] Modalidade 8: A composição de irinotecano lipossomal de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 6, em que:
[00149] na etapa (a), os lipossomas são formados a partir de TEA8SOS tendo uma concentração de sulfato entre 0,43-0,47 M; e
[00150] na etapa (d), a solução preparada utilizando base livre de irinotecano ou um sal de irinotecano tem um teor de unidade de irino- tecano equivalente a 500 g (+10%) de base livre de irinotecano anidro por mol de DSPC; e
[00151] na etapa (f), ajustar o pH da composição para ser de 7,2 a 7,3.
[00152] Modalidade 9: A composição lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, contendo menos de 1% em mol de lisofosfatidilcolina (liso-PC) antes do armazenamento a cerca de 4 °C e 20% em mol ou menos (em relação ao total de fosfolipídio de li- possoma) de liso-PC após 180 dias de armazenamento a cerca de 4 °C.
[00153] Modalidade 10: A composição lipossomal de acordo com a modalidade 9, contendo 20% em mol ou menos (em relação ao total de fosfolipídio de lipossoma) de lisofosfatidilcolina (liso-PC) após 6, 9 ou 12 meses de armazenamento a cerca de 4 °C.
[00154] Modalidade 11: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, compreendendo um total de 6,1 a 7,5 mg de DSPC/mL, de 2 a 2,4 mg de colesterol/mL e de 0,11 a 0,13 mg de MPEG-2000-DSPE/mL, todos em um tampão isotônico aquoso.
[00155] Modalidade 12: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, em que o irinote- cano lipossomal compreende os lipossomas com irinotecano em um tampão aquoso de HEPES isotônico a uma concentração entre 2 e 20 mM.
[00156] Modalidade 13: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, compreendendo ainda cloreto de sódio a uma concentração de 130 a 160 mM.
[00157] Modalidade 14: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, em que o irinote- cano encapsulado nos lipossomas está em um estado gelificado ou precipitado como um sal de octassulfato de sacarose.
[00158] Modalidade 15: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, em que os lipos- somas com irinotecano têm um diâmetro de 95 a 115 nm, conforme medido pelo espalhamento da luz quasi elástico.
[00159] Modalidade 16: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer modalidade acima, compreendendo um total de 6,81 mg de DSPC/mL, 2,22 mg de colesterol/mL e 0,12 mg de MPEG- 2000-DSPE/mL, 4,05 mg/mL de tampão aquoso HEPES e 8,42 mg de cloreto de sódio/mL.
[00160] Modalidade 17: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, possuindo um pH igual a 7,25, em que os lipossomas com irinotecano têm um diâmetro de 110 nm, conforme medido por espalhamento da luz quasi elástico.
[00161] Modalidade 18: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, formando menos de 1 mg/mL de lisofosfatidilcolina (liso-PC) após 6 meses de armazenamento a cerca de 4 °C.
[00162] Modalidade 19: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, feita por um processo compreendendo as etapas de: (a) formar uma dispersão lipídica em uma solução de TEA8SOS com uma concentração de sulfato de cerca de 0,45 M e um pH de cerca de 6,5, os lipídios na dita dispersão consistindo em 1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polietilenogli- col terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE) em uma razão molar de 3:2:0,015, respectivamente; (b) extrusar a dispersão lipídica entre 60-70 °C através de pelo menos uma membrana de 0,1 μm para formar lipossomas; (c) remover os íons derivados de TEA8SOS que estão fora dos lipossomas; (d) colocar em contato os lipossomas a uma temperatura entre 60 e 70 °C com uma solução preparada usando cloridrato de iri- notecano tri-hidratado para formar uma preparação de lipossomas encapsulando cerca de 500 g (± 10%) de irinotecano por mol total de fos- folipídio de lipossoma; (e) remover as substâncias derivadas dos ingredientes TEA8SOS e irinotecano que estão fora dos lipossomas; e (f) ajustar o pH da composição para ser cerca de 7,3.
[00163] Modalidade 20: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, compreendendo um total inferior a 100 ppm de TEA.
[00164] Modalidade 21: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, compreendendo um total de 30-100 ppm de TEA ou DEA.
[00165] Modalidade 22: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades acima, em que pelo menos 98% do irinotecano é encapsulado nos lipossomas de irinotecano após 6 meses de armazenamento a cerca de 4 °C.
[00166] Modalidade 23: A composição de irinotecano lipossomal, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, compreendendo a composição de irinotecano de fórmula (I) nos lipossomas de irino- tecano, em que x é 8:
EXEMPLOS
[00167] A síntese e a caracterização de várias preparações de li-possomas de irinotecano é descrita nos Exemplos a seguir. A menos que seja indicado de outra forma nos exemplos, estes lipossomas de irinotecano podem ser obtidos pelo seguinte processo de várias etapas. Por conseguinte, a invenção também fornece métodos de produção de lipossomas de irinotecano, de acordo com os métodos preparativos apresentados nesta subsecção e nos exemplos, e variações e combinações dos mesmos.
[00168] Primeiro, os lipídios formadores de lipossoma são dissolvidos em etanol aquecido. Estes lipídios incluíam DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE. Amenos que seja indicado de outra forma, o DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE estão presentes em uma razão molar de 3:2:0,015. A composição etanol-lipídio resultante é dispersa num meio aquoso contendo amônio e poliânion substituído sob condições eficazes para formar lipossomas essencialmente de tamanho adequado (por exemplo, 80-120 nm ou 95-115 nm, etc.) contendo o íon amônio substituído e o agente de retenção polianiônico (SOS). A dispersão lipossômica pode ser formada, por exemplo, misturando a solução lipídica etanólica com a solução aquosa contendo um íon amônio substituído e um poliânion na temperatura acima da temperatura de transição lipídica, por exemplo, de 60 a 70 °C, e extrusando a suspensão lipídica resultante (lipossomas multilamelares) sob pressão através de um ou mais filtros de membrana de policarbonato gravados com sinais com tamanho de poro definido, por exemplo, 50 nm, 80 nm, 100 nm ou 200 nm. Preferivelmente, o amônio substituído é uma trieti- lamina (TEA) ou dietilamina (DEA) protonada, e o poliânion é octassul- fato de sacarose (SOS), de preferência combinado em uma razão es- tequiométrica (por exemplo, TEA8SOS). A concentração de TEA8SOS pode ser selecionada com base na quantidade de irinotecano contido nos lipossomas (por exemplo, para esgotar substancialmente ou completamente o gradiente de carga de concentração através do liposso- ma e/ou fornecer um lipossoma contendo SOS e irinotecano com uma razão molar de cerca de 1:8). Por exemplo, para preparar lipossomas com irinotecano SOS com 471 g ou 500 g de porção irinotecano/mol de fosfolipídio, o TEA8SOS utilizado preferencialmente tem uma concentração de cerca de 0,4-0,5 M de grupos sulfato (por exemplo, 0,45 M ou 0,475 M de grupos sulfato, ou 0,45 M ou 0,475 M de SOS). Todo ou substancialmente todo o TEA ou SOS não retido é, então, removido (por exemplo, por filtração em gel, diálise ou ultrafiltração/diafiltração).
[00169] Os lipossomas de agente de retenção resultantes (por exemplo, encapsulando o composto amônio substituído, como TEA8SOS ou DEA8SOS) são então colocados em contato com uma solução de irinotecano sob condições eficazes para colocar o irinote- cano nos lipossomas do agente de retenção (isto é, condições que permitem que o irinotecano entre no lipossoma em troca com TEA, deixando o lipossoma). A solução de carregamento de irinotecano (por exemplo, a 15 mg/mL de cloridrato de irinotecano anidro, que pode ser preparada usando quantidades correspondentes de cloridrato de irino- tecano tri-hidratado) contém preferivelmente um agente osmótico (por exemplo, dextrose a 5%) e um pH de 6,5 (a menos que indicado de outra forma, os valores de pH mencionados neste relatório descritivo foram determinados à temperatura ambiente). A carga de fármaco é facilitada pelo aumento da temperatura da composição acima da temperatura de transição dos lipídios lipossômicos (por exemplo, até 60 a 70 °C) para acelerar a troca transmembranar do composto amônio substituído (por exemplo, TEA) e irinotecano. Em algumas modalidades, o sucrossulfato de irinotecano dentro do lipossoma está em um estado gelificado ou precipitado.
[00170] O carregamento de irinotecano por troca com o composto amônio substituído (por exemplo, TEA ou DEA) através do lipossoma é preferencialmente continuado até que todo ou substancialmente todo o composto amônio substituído (por exemplo, TEA) seja removido do lipossoma, esgotando assim todo ou substancialmente todo o gradiente de concentração no lipossoma. Preferencialmente, o processo de carregamento do lipossoma com irinotecano continua até que a razão grama-equivalente de irinotecano para SOS seja igual a pelo menos 0,9, pelo menos 0,95, 0,98, 0,99 ou 1,0 (ou varie de cerca de 0,9-1,0, 0,95-1,0, 0,98-1,0 ou 0,99-1,0). Preferencialmente, o processo de car- regamento do lipossoma com irinotecano continua até pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou mais do TEA ser removido do interior do lipossoma. Em algumas modalidades da presente invenção, a composição de lipossoma com irinoteca- no-SOS preparada dessa maneira utilizando TEA8SOS contém menos de 100 ppm de TEA. Em algumas modalidades da presente invenção, a composição de lipossoma com irinotecano-SOS preparada dessa maneira utilizando TEA8SOS contém 20-100 ppm, 20-80 ppm, 40-80 ppm ou 40-100 ppm de TEA.
[00171] O irinotecano extralipossomal e o composto amônio substituído (por exemplo, TEA ou DEA) podem ser removidos para obter o produto final de lipossoma com irinotecano. Essa remoção pode ser facilitada por uma variedade de métodos, sendo exemplos não limitativos cromatografia em gel (exclusão por tamanho), diálise, troca iônica e métodos de ultrafiltração/diafiltração. O meio externo ao lipossoma é substituído por fluido injetável farmacologicamente aceitável, por exemplo, solução salina isotônica tamponada (pH entre 7,1 a 7,5, preferivelmente pH entre 7,2 e 7,3). Por fim, a composição lipossomal é esterilizada, por exemplo, por filtração a 0,2 mícron, dispensada em frascos de dose única, rotulada e armazenada, por exemplo, após refrigeração a 2 a 8 °C, até ser usada. O meio externo ao lipossoma pode ser substituído por fluido farmacologicamente aceitável ao mesmo tempo que o irinotecano extralipossomal remanescente e o íon amô- nio/amônio substituído (por exemplo, TEA) são removidos.
Quantificação do Agente de Retenção
[00172] Para fins da presente invenção, o agente de retenção lipos- somal e o contra-íon do composto amônio substituído (por exemplo, TEA8SOS) são quantificados com base nas concentrações utilizadas para preparar os lipossomas e são calculados com base no número de grupos sulfato do agente de retenção. Por exemplo, TEA8SOS 0,1 M seria expresso na presente invenção como 0,8 M/L de sulfato porque cada molécula de SOS tem oito grupos sulfato. Nos casos em que um agente de retenção diferente é usado, esse cálculo seria ajustado, dependendo do número de grupos aniônicos (por exemplo, grupos sulfato) por molécula de agente de retenção.
Quantificação de preparações de liso-PC em lipossoma com irinotecano
[00173] A quantidade de liso-PC nas preparações de lipossoma com octassulfato de irinotecano sacarose testadas para obter os dados nas figuras 11B e 12 foi obtida pelo método de HPLC (“Método A”), que é descrito no exemplo 9.
[00174] Um método preparativo diferente (CCF) (aqui, "Método B") foi usado para obter as medições de liso-PC das amostras 1 a 23, o lisofosfolípido foi determinado pelo método de CCF a seguir, seguido por análise de fosfato, ao invés de pelo método de HPLC (Método A) discutido imediatamente acima. As etapas a seguir foram feitas para medir liso-PC pelo Método B. Uma alíquota de amostra de lipossoma contendo aproximadamente 500 nmol de fosfolipídio (PL) (por exemplo, 0,05 mL de uma solução de lipossoma PL 10 mM) foi dessaliniza- da utilizando uma coluna PD-10 (GE Healthcare) equilibrada com água. A amostra é eluída da coluna com água e dividida em três porções contendo cada uma aproximadamente 150 nmol de PL, depois seca sob vácuo utilizando um concentrador centrífugo (Savant Speed Vac Concentrator, Modelo n° SVC100X). Os lipídios secos foram dissolvidos em 30 uL de clorofórmio/metanol (5/1, vol/vol) e aplicados na região não adsorvente de uma placa de CCF de sílica gel em fase normal (Uniplate da Analtech, n° cat 44921) utilizando uma seringa de vidro. O CCF foi realizado com uma fase móvel consistindo em cloro- fórmio/metanol/30% de hidróxido de amônio/água (60/40/2,5/3,75, v/v/v/v) e o lipídio foi visualizado utilizando vapor de iodo. A determina- ção do PL foi realizada raspando as manchas correspondentes ao fos- folipídio e lisofosfolípido na CCF para tubos separados de borossilicato de 12 x 75 mm para posterior análise de fosfato.
[00175] A quantificação das quantidades molares de composto de irinotecano e sulfato coencapsulado nos lipossomas é fornecida nos Exemplos.
Materiais
[00176] Para preparar as amostras 1-5 e 13 no Exemplo 1 e as amostras 12 e 14-18 no Exemplo 2, cloridrato de irinotecano de grau USP GMP monocloridrato, ((+)-7-etil-10-hidroxicamptotecina 10-[1,4'- bipiperidina]-1'-carboxilato, tri-hidratado, No. CAS Reg. 100286-90-6) foi adquirido da SinoPharm (Taipei, Taiwan); 1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfocolina (DSPC) e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM- 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina ((MPEG-2000-DSPE) foram ad-quiridos junto à Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA) o colesterol ultrapuro (Chol) foi obtido da Calbiochem (La Jolla, CA, EUA) e o oc- tassulfato de sacarose foi obtido da Euticals (Lodi, Itália).
[00177] Para preparar as amostras 6-11 no exemplo 1, cloridrato de irinotecano tri-hidratado foi obtido junto à PharmaEngine (Taiwan); 1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM-2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina ((MPEG-2000- DSPE) foram adquiridos junto à Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA) o colesterol ultrapuro (Chol) foi obtido da Calbiochem (La Jolla, CA, EUA) e o octassulfato de sacarose foi obtido da Euticals (Lodi, Itália).
[00178] Para preparar as amostras 19-23 no exemplo 8, vinorrelbi- na (VNB) foi obtida da farmácia como uma solução de tartarato de vi- norrelbina 10 mg/mL (Glaxo-SmithKline), e pó de topotecano (TPT) foi obtido como um presente junto à Taiwan Liposome Company (Taipei, Taiwan).
[00179] Todos os outros produtos químicos, de pureza analítica ou melhor, foram obtidos de fornecedores comuns.
[00180] Métodos: Os métodos a segui foram utilizados na preparação das amostras 1-5 e 13 (Exemplo 1) e das amostras 6-11 e 19-23 (exemplo 2) e as amostras 12 e 14-18 (exemplo 3), na extensão não indicada de outra forma abaixo.
Preparação de Octassulfato de Sacarose e Trimetilamônio
[00181] O octassulfato de sacarose e trietilamônio (TEA8SOS) e o octassulfato de sacarose e dietilamônio (DEA8SOS) foram preparados a partir do sal sódico de octassulfato de sacarose utilizando cromato- grafia de troca iônica. Em suma, 15 g de octassulfato de sacarose (sal de sódio) foram dissolvidos em água para proporcionar uma concentração de sulfato de 2,64 M. Utilizou-se uma resina trocadora catiônica Dowex 50W-8X-200 para preparar a forma ácida do octassulfato de sacarose. A resina definida foi lavada duas vezes com 2 vol de NaOH 1 N, depois com ddH2O (água duplamente destilada) até pH neutro, lavada duas vezes com 2 vol de HCl 1 N e finalmente lavada com ddH2O até a neutralidade e, depois, esse processo foi repetido. Uma coluna foi vertida para um volume de 450 mL de resina e lavada com 3 vol de HCl 3 N e depois enxaguada com ddH2O até a condutividade atingir menos de 1 μS/cm. A solução de octassulfato de sacarose (sal de sódio) (aproximadamente 10% da capacidade da coluna) foi carregada na coluna e eluída com ddH2O. O eluente da coluna foi monitorado utilizando um detector de condutividade para detectar a eluição do octassulfato de sacarose da coluna. O octassulfato de sacarose ácido foi então titulado com trietilamina ou dietilamina até um pH entre 6-7, e o teor de sulfato foi determinado usando um método modificado de B. Sorbo et al., Methods in Enzymology, 143: 3-6, 1984 (consulte a determinação de sulfato). A solução foi finalmente diluída para uma concentração de sulfato correspondente a 0,65 M de sulfato. O pH es- tava tipicamente na faixa de 6-7. O sódio residual foi determinado usando um eletrodo de sódio, e qualquer solução com sódio residual acima de 1% em mol não foi adicionalmente utilizada.
Determinação do Grupo Sulfato
[00182] O teor de sulfato nas soluções de octassulfato de sacarose foi determinado com um ensaio baseado em turbidimetria. As soluções consistem em: (1) 15 g de PEG 6000 e 1,02 g de acetato de bário em 100 mL de água; (2) 142 mg de sulfato de sódio em 1 mL de água; (3) solução de trabalho com bário: adicionar, gota a gota, 0,1 mL da solução de sulfato de sódio a 100 mL de solução de bário, com agitação. Esta solução deve ser equilibrada por 1 hora antes do uso e pode ser armazenada por não mais que uma semana; (4) solução de citrato trissódico a 0,4 M; (118 mg de citrato trissódico/mL de água); e (5) padrão de sulfato a 10 mM diluído em água a partir de ácido sulfúrico 1N. Usando tubos de ensaio de borossilicato, os padrões e soluções foram feitos até formar um volume final de 100 uL. Os padrões foram feitos na faixa de 0,2-1 μmol de sulfato (20-100 μl do padrão de 10 mM). Para amostras de solução de sulfato de 0,6 M, foi utilizada uma diluição de 1/100 e volume de 100 μl (0,6 μmol). Cada 100 μl de amos- tra/padrão foram tratados com 100 μl de ácido perclórico a 70% e aquecidos a 110-120 °C durante 12 minutos. Após o arrefecimento, adicionou-se 0,8 mL da solução de citrato trissódico 0,4 M seguido por agitação sob vórtice. Um volume de 0,25 mL de uma solução de trabalho de bário em agitação foi transferido para cada tubo e agitado em vórtice imediatamente. Todas as amostras/padrões foram deixados equilibrar durante 1 hora, seguido por agitação sob vórtice e medição da absorvância a 600 nm. Uma curva padrão linear de concentrações de SO4 versus OD600 foi usada para determinar as concentrações desconhecidas de SO4.
Determinação de Octassulfato de Sacarose por HPLC
[00183] A concentração de octassulfato de sacarose (mg/mL) em uma amostra pode ser calculada com base na área do pico de octas- sulfato de sacarose produzido a partir de um padrão de concentração conhecida. A concentração calculada do octassulfato de sacarose é, em seguida, usada para calcular a concentração de sulfato (mM) em uma amostra.
[00184] A amostra a ser analisada é cromatografada por HPLC usando uma coluna Phenomenex, Bondclone 10 μM NH2, 300 x 3,90 mm, PN 00H-3128-C0, ou Waters μBondapak NH2 10 μm 125 μ, (3,9 mm x 300 mm), N.° da peça WAT084040 utilizando uma fase móvel de sulfato de amônio 0,60 M, pH 3,0, eluindo a 1,00 mL/min a uma temperatura de coluna de 40 °C. As amostras são detectadas por um detector de índice de refração que também está a 40 °C, por exemplo, usando um HPLC Agilent com detector de índice de refração. O octas- sulfato de sacarose de potássio heptahidratado é utilizado como padrão de referência; No. CAS 76578-81-9, No. CAT 1551150.
[00185] As amostras de padrão do ensaio SOS e de controle de ensaio são integradas usando uma linha de base até a integração da linha de base. As amostras de TEA-SOS são em seguida integradas usando uma linha de base para a integração da linha de base. Isso pode ser feito manualmente, começando na linha de base antes do vale do volume vazio até o final da cauda do SOS, depois soltando uma linha no início do pico do TEA e o ponto baixo entre os dois picos. Nota: Se uma única linha de base começando antes do vale de volume vazio até o final da cauda do SOS cruzar o ponto mais baixo entre os picos de TEA e SOS, duas linhas separadas podem ser usadas que irão aproximar a linha de base ao método da linha de base. As amostras de TEA-SOS mostrarão um pico de TEA em um tempo de retenção relativo de aproximadamente 0,45 do tempo de retenção do pico de SOS.
Análise do Fármaco
[00186] A análise por HPLC do irinotecano foi realizada em um sistema Dionex utilizando uma coluna de sílica de fase reversa C18 (coluna Supelco C18, 250 mm x 4 mm de diâmetro interno, tamanho de partícula 5 μm) precedida por uma pré-coluna Supelco C18. Utilizou-se um volume de injeção de amostra de 50 μL e a coluna foi eluída iso- craticamente a uma vazão de 1,0 mL/min com uma fase móvel consistindo em 0,21 M de acetato de trietilamônio aquoso em pH 5,5 e ace- tonitrila (73:27, v: v). Irinotecano e SN-38 tipicamente eluíram em 5,1 min e 7,7 min, respectivamente. O irinotecano foi detectado por absor- vância a 375 nm utilizando um detector de arranjo de diodos e o SN-38 foi detectado por fluorescência (excitação a 370 nm e emissão a 535 nm).
Determinação de fosfato
[00187] O método de determinação de fosfato a seguir foi usado para analisar as amostras 1-23. Um ensaio de fosfato de Bartlett modificado pode ser usado para medir o fosfolipídio (PL). Padrões variando de 10-40 nmol de fosfato foram colocados em tubos de borossilicato 12 x 75 mm e tratados exatamente como as amostras. Ácido sulfúrico (100 mL de H2SO4 6 M) foi adicionado a cada tubo colocado em um bloco de aquecimento e aquecido a 180 °C durante 45 minutos. Peró- xido de hidrogênio (20 mL de uma solução a 30%) foi adicionado a cada tubo e depois aquecido a 150 °C durante 30 minutos. Molibdato de amônio (0,95 mL de uma solução 2,2 g/L) e ácido ascórbico (50 mL de uma solução aquosa a 10%) foram posteriormente adicionados a cada tubo. Após o vórtice, os tubos foram colocados em água fervente durante 15 minutos e depois foram arrefecidos até a temperatura ambiente. Para a análise de lisolipídios utilizando cromatografia em camada fina (CCF), a sílica foi sedimentada por centrifugação a 1000 rpm du-rante 5 minutos, e a cor azul foi medida no sobrenadante através da leitura da absorvância a 823 nm. As amostras que não contêm sílica não foram submetidas à centrifugação.
Retenção e Estabilidade do Fármaco
[00188] A estabilidade do irinotecano lipossomal (em termos de retenção do fármaco) foi determinada separando o irinotecano liposso- mal do irinotecano extralipossomal utilizando colunas de exclusão por tamanho PD-10 (Sephadex G-25). O escapamento de fármaco foi determinado por comparação da razão de irinotecano (HPLC) e PL (descrito na determinação dos fosfolipídios) antes e depois da separação do irinotecano extralipossomal. A degradação do irinotecano foi determinada pela observação de picos adicionais no cromatograma após análise por HPLC. As razões de irinotecano para fosfolipídioe as eficiências de encapsulamento de fármaco são calculadas utilizando as fórmulas 1 e 2 abaixo, respectivamente.
[00189] onde a (razão de Irinotecano para Fosfolipídio)AC é a razão de fármaco para fosfolipídio após a purificação na coluna de exclusão por tamanho G-25 e (razão de Irinotecano para Fosfolipídio) BC é a razão de fármaco para fosfolipídio antes da purificação na coluna.
Determinação de irinotecano encapsulado e livre nas composições lipossomais
[00190] O irinotecano encapsulado em lipossomas e livre (não encapsulado) nas composições lipossomais de sucrossulfato de irinote- cano dos exemplos 3 e 4 foram determinados utilizando um método de adsorção em cartucho. Os cartuchos Oasis 60 mg de 3 cc HLB (Waters) foram condicionados por passagem sequencial de 2 mL de metanol, 1 mL de solução salina tamponada com HEPES (HBS; HEPES 5 mM, NaCl 140 mM, pH 6,5) e 0,5 mL de albumina de soro humano 10% em soro fisiológico, seguido de 1 mL de HBS. As composições de sucrossulfato de irinotecano lipossomal foram diluídas com solução salina normal até cerca de 2,2 mg/mL de irinotecano e foram aplicadas alíquotas de 0,5 mL nos cartuchos. O eluato foi recolhido, os cartuchos foram lavados com duas porções de HBS (1,5 mL, 3 mL) e as lavagens foram combinadas com o eluato para produzir uma fração de li- possomas. Os cartuchos foram adicionalmente enxaguados com 1,5 mL de HBS e eluídos com duas porções de 3 mL de metanol-HCl (90% em volume de metanol, 10% em volume de HCl 18 mM). Os eluatos foram combinados para tornar a fração isenta de fármaco. As frações de fármaco lipossomal foram transferidas para balões volumétricos de 25 ml e as frações de fármaco livre foram transferidas para frascos volumétricos de 10 ml, avolumadas com metanol-HCl, bem misturadas e os frascos das frações lipossomais foram aquecidos durante 10 minutos a 60 °C para solubilizar o fármaco. Após arrefecimento, as soluções foram filtradas e o irinotecano foi quantificado em am-bas as fracções utilizando HPLC de fase reversa numa coluna Phe- nomenex Luna C18 (2), eluído isocraticamente com mistura de metanol a 20 mM fosfato de potássio pH 3,0 (60:40 em volume) com detecção UV a 254 nm. Os picos de fármaco foram integrados e a quantidade de irinotecano nas amostras foi calculada por comparação com a curva padrão linear obtida nas mesmas condições utilizando o padrão de referência USP de cloridrato de irinotecano tri-hidratado. A razão de encapsulamento de fármaco foi calculada como uma percentagem do fármaco encapsulado em relação ao total de fármaco encapsulado e livre na amostra.
Medições de pH
[00191] O pH foi sempre medido à temperatura ambiente (isto é, 20-25 °C) usando um método de eletrodo de vidro padrão potenciomé- trico. O pH das formulações de lipossomas foi por conseguinte medido colocando o eléctrodo de vidro na formulação de lipossomas e obtendo uma leitura de pH.
Análise de amostras para TEA/DEA em ppm
[00192] A análise das amostras foi realizada por cromatografia a gás em espaço livre (GC) utilizando eluição por gradiente de temperatura em uma coluna GC capilar Restek Rtx-5 (50 m x 0,32 mm x 5 μm (5% de fenil-95% de dimetilpolissiloxano)) seguido por detecção por ionização de chama (FID). Uma preparação de amostra e uma preparação padrão foram analisadas e as respostas de área de pico resultantes foram comparadas. A quantidade de amina residual (por exemplo, TEA ou dietilamina (DEA)) foi quantificada utilizando padrões ex-ternos. No caso da TEA, o padrão foi > 99%. Outros reagentes incluem trietilenoglicol (TEG), hidróxido de sódio e água deionizada (DI).
[00193] As condições de GC foram: gás carreador: hélio; fluxo da coluna: 20 cm/seg (1,24 mL/min); razão de divisão: 10:1 (que pode ser ajustada desde que todos os critérios de adequação do sistema sejam atendidos); modo de injeção: divisão 10:1; revestimento: ranhura reta de 2 mm (recomendado, mas não necessário); temperatura da porta de injeção: 140 °C, temperatura do detector: 260 °C (FID); temperatura inicial do forno da coluna: 40 °C; programa da temperatura do forno da coluna:
[00194] Parâmetros do espaço livre: temperatura da placa: 90 °C; Temperatura do loop de amostra: 100 °C; temperatura da linha de transferência: 100 °C; tempo de equilíbrio: 60 minutos; tempo de injeção: 1 minuto; pressão do frasco: 10 psi; tempo de pressurização: 0,2 minuto; agitação: ligado (médio); volume de injeção: 1,0 mL de espaço livre; tempo de ciclo de GC: 60 minutos (recomendado, mas não obrigatório).
[00195] Se nenhum TEA for detectado, relate como “não detectado;” se os resultados do TEA forem <30 ppm, relate como <QL (30 ppm); dos resultados em que TEA for > 30 ppm, indique um número inteiro.
Determinação do tamanho do lipossoma
[00196] O tamanho de partícula do lipossoma foi medido utilizando espalhamento de luz dinâmico (DLS) usando um Malvern ZetaSizer Nano ZS™ ou instrumento similar em tampão aquoso (por exemplo, NaCl 10 mM, pH 6,7) a 23-25 °C usando o método dos cumulativos. O tamanho médio das partículas z e o índice de polidiversidade (PDI) foram registrados. O desempenho do instrumento foi verificado usando o padrão rastreável NOS da Nanosphere NIST de polímero de 100 nm (Padrão de tamanho de nanoesfera P / N 3100A da Thermo Scientific 3000 Series ou equivalente com um certificado de análise que inclui o diâmetro hidrodinâmico). Conforme utilizado na presente invenção, “DLS” refere-se ao espalhamento de luz dinâmico e "BDP" refere-se ao produto de fármaco a granel.
Exemplo 1: Efeitos da Concentração do Agente de Retenção SOS e do pH na Estabilidade de Armazenamento de Preparação de Iri- notecano Lipossomal
[00197] O objetivo desse estudo foi determinar, entre outras coisas, quaisquer alterações na estabilidade física e química dos lipossomas encapsulando irinotecano e do agente de retenção de octassulfato de sacarose (SOS) quando armazenado a cerca de 4 °C durante determinados períodos de tempo. Para este estudo, a concentração liposso- mal do agente de retenção SOS foi reduzida, enquanto a proporção de 471 g de porção de irinotecano por mols totais de fosfolipídio foi mantida.
[00198] Preparou-se uma série de preparações de lipossomas com irinotecano-SOS em um processo de múltiplas etapas utilizando diferentes concentrações de agente de retenção de SOS e ajustando o pH da preparação lipossômica final para diferentes valores de pH. Cada uma das preparações de lipossomas com irinotecano-SOS continha uma concentração da porção de irinotecano equivalente a 5 mg/mL de cloridrato de cloridrato de irinotecano tri-hidratado. As preparações de lipossomas com irinotecano-SOS das amostras 1-5 e 13 foram preparadas por um processo de várias etapas do exemplo 1.
[00199] DSPC, colesterol (Chol) e PEG-DSPE foram pesados em quantidades que correspondiam a uma razão molar de 3:2:0,015, respectivamente (por exemplo, 1264 mg/412,5 mg/22,44 mg). Os lipídios foram dissolvidos em clorofórmio/metanol (4/1, v/v), bem misturados e divididos em 4 alíquotas (AD). Cada amostra foi evaporada até à secura utilizando um rotaevaporador a 60 °C. O clorofórmio residual foi removido dos lipídios por meio de vácuo (180 μtorr) em temperatura ambiente durante 12 horas. Os lipídios secos foram dissolvidos em etanol a 60 °C e TEA8SOS preaquecido de concentração apropriada foi adicionado de modo que o teor final do álcool era de 10% (v/v). A concentração lipídica foi de aproximadamente 75 mM. A dispersão lipídica foi extrusada a cerca de 65 °C através de 2 membranas de policarbonato 0,1 μm empilhadas (Nuclepore ™) 10 vezes utilizando a extrusora Li- pex thermobarrel (Northern Lipids, Canadá), para produzir lipossomas com um diâmetro médio típico de 95-115 nm (determinado por espalhamento de luz quase elástica, consulte a subseção "Determinação do tamanho do lipossoma"). O pH dos lipossomas extrusados foi ajustado conforme necessário para corrigir as alterações no pH durante a extrusão. Os lipossomas foram purificados por meio de uma combinação de cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão por tamanho. Primeiro, a resina Dowex™ IRA 910 foi tratada com NaOH 1 N, seguido por 3 lavagens com água deionizada e, em seguida, seguido por 3 lavagens de HC1 3 N e depois por múltiplas lavagens com água. Os lipossomas passaram através da resina preparada e a con- dutividade das frações eluídas foi medida utilizando um medidor de condutividade de células de fluxo (Pharmacia, Uppsala, Suécia). As frações foram consideradas aceitáveis para purificação adicional se a condutividade foi inferior a 15 μS/cm. O eluato de lipossoma foi em seguida aplicado a uma coluna Sephadex G-75 (Pharmacia) equilibrada com água deionizada, e a condutividade da fração de lipossoma recolhida foi medida (tipicamente inferior a 1 μS/cm). A isotonicidade da membrana cruzada foi alcançada pela adição de solução de dextrose a 40% até uma concentração final de 5% (p/p) e o tampão (Hepes) foi adicionado de uma solução estoque (0,5 M, pH 6,5) até uma concentração final de 10 mM. .
[00200] Preparou-se uma solução estoque de irinotecano dissolvendo cloridrato de irinotecano tri-hidratado em pó em água deioniza- da a 15 mg/mL de cloridrato de irinotecano anidro, levando em conta o teor de água e os níveis de impurezas obtidos no certificado de análise de cada lote. A carga de fármaco foi iniciada adicionando irinotecano em uma quantidade de 500 g de cloridrato de irinotecano anidro (correspondendo a 471 g de base livre de irinotecano anidro) por mol de fosfolipídio de lipossoma e aquecendo a 60 ± 0,1 °C durante 30 minutos em um banho de água quente. As soluções foram rapidamente arrefecidas após a remoção do banho-maria por imersão em água gelada. O fármaco extralipossomal foi removido por cromatografia de exclusão por tamanho usando as colunas Sephadex G75 equilibradas e eluídas com solução salina tamponada com Hepes (Hepes 10 mM, NaCl 145 mM, pH 6,5). As amostras foram analisadas para o irinote- cano por HPLC e fosfato pelo método de Bartlett (consulte a subseção "Determinação de fosfato"). Para armazenamento, as amostras foram divididas em alíquotas de 4 mL e o pH foi ajustado usando HCl 1 N ou NaOH 1 N, esterilizadas sob condições assépticas e preenchidas em frascos de vidro transparente estéreis que foram selados sob argônio com uma tampa roscada revestida com Teflon® e colocadas em um refrigerador controlado termostaticamente a 4 °C. Em pontos de tempo definidos, uma alíquota foi removida de cada amostra e testada quanto ao aspecto, tamanho do lipossoma, razão de fármaco/lipídio e estabilidade química do fármaco e do lipídio.
[00201] Em relação ao Exemplo 1, a distribuição do tamanho dos lipossomas foi determinada nas amostras diluídas por espalhamento de luz dinâmico utilizando o Coulter Nano-Sizer a um ângulo de 90 graus e foi apresentada como média ± desvio padrão (nm) obtido pelo método dos cumulativos.
[00202] As preparações de lipossoma com irinotecano das amostras 1-5 e 13 foram adicionalmente obtidas como a seguir. Os liposso- mas recém-extrusados compreenderam dois grupos, cada um incorporando TEA8SOS como o agente de captura nas concentrações de (A) grupo sulfato 0,45 M (112,0 ± 16 nm), (B) grupo sulfato 0,475 M (105,0 ± 16 nm), (C) grupo sulfato 0,5 M (97 ± 30 nm) e (D) grupo sulfato 0,6 M (113 ± 10 nm). As amostras 1-5 e 13 foram carregadas em uma razão inicial de 471 g de base livre de irinotecano anidro por mol de fos- folipídios lipossomais totais e foram purificadas como descrito acima na descrição do exemplo 1 (equivalente a 500 g de cloridrato de irino- tecano anidro). As amostras 1, 5 e 13 foram derivadas da amostra ex- trusada (A); a amostra 2 foi derivada da amostra extrusada (B); as amostras 3 e 4 foram derivadas das amostras extrusadas (C) e (D), respectivamente. Após a purificação, o ajuste do pH foi feito usando HCl 1 N ou NaOH 1 N antes da esterilização e do enchimento dos frascos. Os dados das amostras 1-5 são mostrados na Tabela 7 (Exemplo 1), e os dados da amostra 13 são mostrados na Tabela 8 (Exemplo 2).
[00203] As preparações de lipossoma com irinotecano das amostras 6-11 foram adicionalmente obtidas como a seguir. Os lipossomas recém-extrusados compreenderam dois grupos, cada um incorporando TEA8SOS como o agente de captura nas concentrações do grupo sulfato (A) 0,45 M (116 ± 10 nm) e grupo sulfato (B) 0,6 M (115,0 ± 9,0 nm). As amostras 6-8 foram derivadas da amostra extrusada (A) e as amostras 9-11 foram derivadas da amostra extrusada (B). Após a purificação, o ajuste do pH foi feito, se necessário, por adição de HCl 1 N ou NaOH 1 N, conforme apropriado. A amostra 12 foi preparada como descrito no Exemplo 2 e está incluída na Tabela 7 para fins de comparação.
[00204] Os lipossomas de irinotecano com os valores de pH extrali- possomal, concentração de base livre de irinotecano (mg/mL) e várias concentrações de octassulfato de sacarose para certas composições lipossômicas de irinotecano estão listados na Tabela 6 (6 meses de armazenamento a 4 graus C) e na Tabela 7 abaixo, e foram preparados como descrito em mais detalhes conforme descrito na presente invenção.
[00205] As figuras 4A a 4C são gráficos mostrando a % molar de liso-PC nas preparações de lipossoma com irinotecano selecionadas da tabela 7 tendo um pH superior a 6,5 (ou seja, 7,25 ou 7,5 como indicado em cada figura).. O liso-PC foi determinado com o método B (CCF) aqui divulgado, após o armazenamento de cada amostra a 4 °C durante os primeiros 1, 3, 6 e/ou 9 meses. Esses gráficos incluem uma linha de regressão linear para os dados para cada amostra, como uma estimativa para a taxa de aumento de liso-PC (% em mol) ao longo do tempo em cada amostra. Surpreendentemente, o aumento do pH das preparações de lipossoma com irinotecano acima de 6,5 (por exemplo, 7,25 e 7,5) diminuiu a quantidade de liso-PC medida durante o arma- zenamento sob refrigeração a 4 °C em comparação com os liposso- mas com irinotecano formados nas razões de estabilidade comparáveis. Esta tendência foi evidente em várias concentrações de irinote- cano lipossomal. Por exemplo, no que diz respeito às composições de irinotecano lipossomal preparadas com uma força de cerca de 4,3 mg de porção de irinotecano/mL, os níveis de % em mol de liso-PC medidos nas Amostras 5 e 7 foram significativamente inferiores em todos os pontos de dados (após o primeiro 1, 6 e 9 meses de armazenamento a 4 °C após a fabricação) em comparação com os níveis molares em % de liso-PC medidos para a Amostra 1 em pH 6,5 (dados na Tabela 7). Por exemplo, no que diz respeito às composições de irino- tecano lipossomal preparadas com uma força de cerca de 18,8 mg de porção de irinotecano/mL, os níveis de % em mol de liso-PC medidos na Amostra 13 foram significativamente inferiores em todos os pontos de dados (após o primeiro 1, 6 e 9 meses de armazenamento a 4 °C após a fabricação) em comparação com os níveis molares em % de liso-PC medidos para a Amostra 12 ou para a Amostra 14 em pH 6,5 (dados na Tabela 8).TABELA 6: Medições de liso-PC após 6 meses de armazenamento sob refrigeração
[00206] Resultados adicionais dos estudos comparativos de estabilidade no Exemplo 1 são fornecidos na Tabela 7 abaixo. A % em mol de liso-PC foi determinada após o armazenamento das preparações de lipossoma a 4 °C durante 1, 3, 6, 9 e/ou 12 meses, como indicado na Tabela 7. Para cada amostra, a Tabela 7 fornece a concentração de SOS utilizada para preparar o lipossoma, expressa como concentração molar de grupos sulfato (uma molécula de SOS inclui 8 grupos sulfato). A menos que seja indicado de outra forma, todos os liposso- mas com irinotecano na Tabela 7 foram preparados utilizando uma porção de irinotecano (como explicado acima, baseado na base livre anidra) em relação à razão total de fosfolipídio de 471 g de porção de irinotecano (equivalente à quantidade de unidade de irinotecano em 500 g de sal de cloridrato de irinotecano anidro) por mol de fosfolipídio de lipossoma total, respectivamente. A tabela 7 também contém a razão de estabilidade para cada amostra, calculada como a razão de 471 g de porção de irinotecano (com base na base livre anidra) por mol de fosfolipídio, dividido pela concentração de grupos sulfato em mols/L utilizada para preparar os lipossomas. Cada um dos liposso- mas das amostras descritas na Tabela 7 tinham um tamanho medido (média ponderada em volume) de entre cerca de 89-112 nm e uma eficiência de encapsulação de irinotecano de pelo menos 87,6%. A eficiência de encapsulação foi determinada de acordo com a subseção "Retenção e estabilidade de fármaco".TABELA 7: Preparações de lipossoma com irinotecano com vá- rias razões de estabilidade e pH (vesículas de lipossomas forma-das a partir de DSPC, colesterol (Chol) e PEG-DSPE em uma razão molar de 3:2:0,015)c c Medição de acordo com o método B, conforme descrito na presente invenção
[00207] Os resultados deste estudo de estabilidade de armazenamento demonstraram que uma redução da concentração do agente de retenção SOS (medido como a concentração molar de sulfato) usado na preparação dos lipossomas, enquanto a proporção de base livre de irinotecano anidro (em g) para lipossoma total do fosfolipídio (em mol) foi mantida constante, resultou numa maior estabilidade de armazenamento dos lipossomas de irinotecano SOS, conforme medido pela quantidade de liso-PC detectada na preparação de lipossomas de iri- notecano após 6 e 9 meses de armazenamento refrigerado a 4 °C. Nas preparações de lipossomas fabricadas a um pH de 6,5 (ver o método “Medições de pH”, aqui descrito), a redução da concentração do agente de retenção SOS durante a fabricação de lipossomas leva a uma redução das quantidades de liso-PC detectadas nas preparações de lipossomas após armazenamento a 4 °C.
[00208] Sem se limitar à teoria, acredita-se que uma vez purificado do agente de retenção extralipossomal durante a preparação, o espaço interior do lipossoma é acidificado. Isto pode ser devido à redistri- buição do componente amina do sal do agente de retenção de dentro para fora do lipossoma após a remoção do TEA8SOS extralipossomal, com uma deposição de um íon de hidrogênio intralipossomicamente em cada ocorrência. O fármaco adicionada, como o irinotecano, capaz de protonar, também se distribui entre o espaço exterior e o interior do lipossoma. A protonação do fármaco distribuído no interior do liposso- ma e a ligação do fármaco protonado ao sucrossofato causa a carga intralipossômica do fármaco e resulta em redução da concentração intralipossômica de TEA e de íons hidrogênio, diminuindo o grau de acidificação intralipossômica. No caso do lipossoma com irinotecano, postula-se que a uma carga de fármaco de 500 g de cloridrato de irino- tecano (ou seja, 471 mg de irinotecano)/mol de fosfolipídio de liposso- ma com SOS em uma concentração de sulfato de 0,6 M, há exaustão incompleta do excesso de TEA intralipossômico. Embora não seja a base para reter o fármaco no lipossoma, isto pode causar uma acidifi- cação do interior lipossomal, que pode contribuir para a degradação do fármaco e dos componentes lipídicos do lipossoma, tal como observado nas amostras 7 e 13. Ao contrário, as amostras 8 e 5 têm cargas de fármaco idênticas de 500 g de cloridrato de irinotecano (ou seja, 471 mg de porção de irinotecano)/mol, porém concentrações mais baixas de SOS de 0,45 M de sulfato e 0,475 M de sulfato, respectivamente. Nestes casos particulares, os níveis de lisolipídio medidos são menores. Por fim, é evidente que a formulação de lipossoma mais estável combina as razões de fármaco/agente de retenção mais altas com o pH externo mais elevado (isto é, pH 7,25).
[00209] Os lipossomas de irinotecano das amostras 1-11 mantiveram uma boa estabilidade coloidal até 9 meses a 4 °C, como julgado pela ausência de precipitação e as distribuições de tamanho de partícula relativamente limitadas e reprodutíveis, onde a concentração de irinotecano correspondeu a 4,71 mg/mL de base livre anidra de irinote- cano. O irinotecano foi eficientemente e estavelmente retido com es-capamento mínimo (<10%) durante longos períodos de armazenamento (consulte o método “Retenção e Estabilidade de Fármaco” descrito na presente invenção).
[00210] As amostras 1 e 2 tinham cargas iniciais idênticas de cerca de 471 g de porção de irinotecano (como explicado acima, baseado na base livre anidra) por mol de fosfolipídio, porém com concentrações de SOS mais baixas dos grupos sulfato 0,45 M e grupos sulfato 0,475 M, respectivamente. Similarmente, as amostras 6, 7 e 8 apresentaram uma concentração menor de SOS de sulfato 0,45 M, mas a mesma carga de fármaco de 471 g de porção de irinotecano (como explicado acima, com base na base livre anidra)/mol de fosfolipídio, resultou em um nível consideravelmente menor de conteúdo lisolipídico (7 a 17% após 9 meses).
[00211] Níveis aumentados de liso-PC foram medidos em amostras em pH 6,5, independentemente da carga de fármaco ou das concentrações do agente de retenção durante a fabricação dos lipossomas, atingindo até 35% em mol de fosfolipídio, para algumas amostras (1, 2 e 3). O ajuste do pH até 7,25 tornou os lipossomas menos susceptíveis à formação de liso-PC, com níveis atingindo 9,72% do PC total (por exemplo, comparar os níveis de liso-PC nas amostras 1 e 13). As amostras com maiores razões de concentração do fármaco para o agente de retenção e pH mais elevado formaram menos lisolipídio, tal como observado nas amostras 7 e 8 tendo 7-8% em mol de lisolipídios após 9 meses. A combinação de uma maior razão de agente de retenção de fármaco e maior pH (por exemplo, em comparação com a amostra 12) reduziu a formação de lisolipídios. A formulação de lipos- soma mais estável combina as razões mais elevadas de fárma- co/agente de retenção (ou seja, razões de estabilidade acima de 942 definidas em relação à quantidade de base livre de irinotecano com o pH externo mais alto acima de 6,5 (por exemplo, comparando as amostras 1 e 13).
[00212] Além disso, a % de SN38 medida nas preparações 1-11 de lipossoma com irinotecano em 9 meses não foi maior que cerca de 0,05% de SN38 (ou seja, a quantidade relativa de SN38 em comparação irinotecano e SN38), enquanto a preparação de lipossoma com irinotecano da amostra 12 tinha 0,20-0,50% de SN38 medido ao longo do mesmo período de tempo (determinado pelo método "Análise de Fármaco" descrito na presente invenção). Em cada uma das amostras 1-5 e 13, o irinotecano foi estavelmente encapsulado com baixo esca- pamento dos lipossomas (menos de 13%; determinado pelo método de “Retenção e Estabilidade de Fármaco” descrito na presente invenção) e baixa conversão no SN-38 citotóxico ativo, menor que 0,1%, e em amostras armazenadas em pH mais alto (7,25), menor que 0,05%.
Exemplo 2: Aumento da Concentração de Lipossomas com Irino- tecano em uma Preparação Líquida
[00213] O objetivo deste estudo de estabilidade de armazenamento foi determinar quaisquer alterações na estabilidade física e química de irinotecano SOS lipossomal quando armazenado a 4 °C. Durante esse estudo, a concentração do agente de retenção de octassulfato de sacarose (SOS) usado para a preparação de lipossomas foi mantida a uma concentração de grupo sulfato de 0,65 M, variando: (1) o contra- íon inicial do agente de retenção SOS durante a preparação dos lipos- somas com irinotecano (utilizando TEA8SOS ou DEA8SOS), (2) a razão da quantidade de base livre anidra de irinotecano (em gramas) para fosfolipídio (em mol) (cerca de 471 g ou 707 g de porção de irino- tecano (como explicado acima, baseado na base anidra) por mol de fosfolipídio), (3) a concentração de base livre anidra de irinotecano na preparação de irinotecano líquida (4,7 mg/mL ou 18,8 mg/mL de irino- tecano encapsulado (com base na concentração equivalente da porção irinotecano do cloridrato de irinotecano tri-hidratado) na prepara- ção de lipossoma com irinotecano líquido), (4) o pH ao qual a preparação de lipossoma com irinotecano foi ajustada (pH 6,5 ou 7,25) e (5) o tampão da preparação de lipossoma com irinotecano (HEPES ou histi- dina).
[00214] Os parâmetros de formulação investigados incluem: tamanho dos lipossomas, razão fármaco/fosfolipídio nos lipossomas de iri- notecano, a eficiência de encapsulação do fármaco irinotecano e aparência geral, presença de produtos de degradação de irinotecano e formação de liso-PC (em % em mol).
[00215] Preparou-se uma série de preparações de lipossomas com irinotecano-SOS em um processo de múltiplas etapas utilizando diferentes concentrações de agente de retenção de SOS e ajustando o pH da preparação lipossômica final para diferentes valores de pH. DSPC, colesterol (Chol) e PEG-DSPE foram pesados em quantidades que correspondiam a uma razão molar de 3:2:0,015, respectivamente (730,9 mg/238,5 mg/13,0 mg). Os lipídios foram dissolvidos em cloro- fórmio/metanol (4/1, v/v), bem misturados e divididos em 2 alíquotas. Cada amostra foi evaporada até à secura utilizando um rotaevapora- dor a 60 °C. O clorofórmio residual foi removido dos lipídios por meio de vácuo (180 μtorr) em temperatura ambiente durante 12 horas. Os lidos secos foram dissolvidos em etanol a 60 °C e foram adicionados TEA8SOS ou DEA8SOS preaquecidos (a uma concentração de 0,65 M de grupo sulfato), de modo que o teor de álcool final foi de 10% (v/v) e as amostras foram designadas como A e B, respectivamente. A concentração lipídica foi de aproximadamente 75 mM. A dispersão lipídica foi extrusada através de membranas de policarbonato de 0,1 μm (Nu- clepore ™) 10 vezes, para produzir lipossomas com um diâmetro médio típico de 95-115 nm. O pH dos lipossomas extrusados foi ajustado conforme necessário (com NaOH 1 N) até o pH da preparação selecionado. Os lipossomas foram purificados por meio de uma combinação de cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão por tamanho. Primeiro, a resina Dowex™ IRA 910 foi tratada com NaOH 1 N, seguido por 3 lavagens com água deionizada e, em seguida, seguido por 3 lavagens de HC1 3 N e depois por múltiplas lavagens com água. A condutividade das frações eluídas foi medida utilizando um medidor de condutividade de células de fluxo (Pharmacia, Uppsala, Suécia). As frações foram consideradas aceitáveis para purificação adicional se a condutividade foi inferior a 15 μS/cm. O eluato de lipos- soma foi em seguida aplicado a uma coluna Sephadex G-75 (Pharma- cia) equilibrada com água deionizada, e a condutividade da fração de lipossoma recolhida foi medida (tipicamente inferior a 1 μS/cm). A iso- tonicidade da membrana cruzada foi alcançada pela adição de solução de dextrose a 40% até uma concentração final de 5% (p/p) e o tampão (Hepes) foi adicionado de uma solução estoque (0,5 M, pH 6,5) até uma concentração final de 10 mM. .
[00216] Preparou-se uma solução estoque de irinotecano dissolvendo 326,8 mg de cloridrato de irinotecano tri-hidratado em pó em 20,0 mL de água deionizada a 15 mg/mL de cloridrato de irinotecano anidro, levando em conta o teor de água e os níveis de impurezas obtidos no certificado de análise de cada lote. A carga de fármaco foi iniciada adicionando base livre de irinotecano anidro a 500 g/mol ou 750 g/mol de fosfolipídio e aquecendo a 60 ± 0,1 °C durante 30 min em um banho de água quente. As soluções foram rapidamente arrefecidas após a remoção do banho-maria por imersão em água gelada. O fár- maco extralipossomal foi removido por cromatografia de exclusão por tamanho usando as colunas Sephadex G75 equilibradas e eluídas com solução salina tamponada com Hepes (10 mM) (HBS), pH 6,5 para a amostra A e solução salina tamponada com histidina em pH 7,2 5 para a amostra B. As amostras foram analisadas para o irinotecano por HPLC e fosfato pelo método de Bartlett (consulte "Determinação de fosfato").
[00217] Para armazenamento, as amostras foram divididas em alíquotas de 4 mL e o pH foi ajustado, se necessário, usando HCl 1 N ou NaOH 1 N, esterilizadas sob condições assépticas e preenchidas em frascos de vidro transparente estéreis que foram selados sob argônio com uma tampa roscada revestida com Teflon® e colocadas em um refrigerador controlado termostaticamente a 4 °C. Em pontos de tempo definidos, uma alíquota foi removida de cada amostra e testada quanto ao aspecto, tamanho, razão de fármaco/lipídio e estabilidade química do fármaco e do lipídio.
[00218] O tamanho do lipossoma foi determinado nas amostras diluídas por espalhamento de luz dinâmico utilizando o Coulter NanoSizer a um ângulo de 90 graus e foi apresentado como a média ± desvio padrão (nm) obtido pelo método dos cumulativos.
[00219] Os resultados dos estudos de estabilidade comparativa são fornecidos na tabela 8 (para amostras preparadas utilizando material de partida do agente de retenção TEA8SOS) e na Tabela 9 (para amostras preparadas utilizando o material de partida do agente de retenção DEA8SOS). TABELA 8: lipossomas com irinotecano preparados com o agente de retenção TEA8SOS em Tampão Hepes (10 mM) dd Medição de acordo com o método B, conforme descrito na presente invenção
[00220] A amostra 13 (exemplo 2, tabela 8) foi armazenada em uma concentração 4 vezes maior (20 mg de irinotecano/mL) do que as amostras 1-5 (Exemplo 1) e ainda reteve uma boa estabilidade coloi- dal, sem agregação ou precipitação observáveis. TABELA 9: Lipossomas de Irinotecano preparados com Agente de Retenção DEA8SOS em uma concentração de grupo sulfato de 0,65 M, pH 7,25 ee Medição de acordo com o método B, conforme descrito na presente invenção
[00221] Os tamanhos de lipossoma recém-extrusados encapsularam (A) TEA8SOS em sulfato 0,65 M (113,0 ± 23,8 nm) ou (B) DEA8SOS em grupos sulfato 0,65 M (103,2 ± 21,1 nm) (sendo a única exceção a amostra 13, que tinha 0,45 M de grupos sulfato). A partir de (A), as amostras 12 e 14 e a partir da amostra (B), as amostras 15-18 foram derivadas, com as amostras 12, 14, 15 e 16 sendo carregadas a 471 g de base livre anidra de irinotecano (equivalente a 500 g de clori- drato de irinotecano anidro) por mol total de fosfolipídios lipossomais e as amostras 16-18 foram carregadas a 750 g de porção de irinotecano (como explicado acima, com base na base livre anidra) por mol de fos- folipídio. Após a purificação, o ajuste de pH foi feito utilizando HCl 1 N ou NaOH 1 N, conforme apropriado e como descrito nas Tabelas 7 e 8 para pH 6,5 ou 7,25. A amostra 12 foi preparada como descrito no Exemplo 1 e está incluída na Tabela 8 para fins de comparação.
[00222] Os dados mostraram que os lipossomas mantêm uma boa estabilidade coloidal até um ano a 4 °C, conforme julgado pela ausência de precipitação e as distribuições de tamanho de partícula relativamente limitada e reproduzíveis. Em segundo lugar, é evidente que a estabilidade coloidal também foi boa para amostras mais concentradas quando armazenadas em pH elevado e na proporção elevada de fár- maco em fosfolipídio, indicando que em concentrações de irinotecano equivalentes a 20 mg/mL e 40 mg/mL de cloridrato de irinotecano tri- hidratado, os lipossomas são estáveis e resistem à formação de agregados.
[00223] Em todos os casos, o irinotecano foi retido nos lipossomas com baixo escapamento e baixa conversão ao SN-38 citotóxico ativo (isto é, a quantidade relativa de SN38 em comparação ao irinotecano e SN38); menos de 0,5% em mol em todos os casos e, com exceção da amostra 12, menos de 0,1% em mol de SN-38. Os dados foram obtidos pelo método de "Retenção e Estabilidade de Fármaco" e pelo mé- todo "Análise de Fármaco" descritos na presente invenção.
[00224] Níveis aumentados de liso-PC foram medidos em amostras que foram ajustadas para pH 6,5 e preparadas em uma proporção de 471 g de porção de irinotecano (como explicado acima, usando uma quantidade equivalente de 500 g de cloridrato de irinotecano anidro) por mol de fosfolipídio, atingindo 36 a 37% em mol (de fosfatidilcolina total) para as amostras 12 e 14, enquanto o ajuste do pH para 7,25 tornou os lipossomas menos susceptíveis à formação de lisolipídios, com os níveis de liso-PC se aproximando apenas de 11% em mol (da fosfatidilcolina total) após um ano para a amostra 15.
[00225] A alteração do pH lipossomal de 6,5 para 7,25 não teve efeito prejudicial sobre a estabilidade coloidal ou escapamento do fár- maco.
Exemplo 3: Estabilidade de armazenamento dos lipossomas com irinotecano estabilizados com quantidades variáveis de TEA (con- tra-íon do agente de retenção SOS)
[00226] Os lipossomas com irinotecano foram preparados carregando irinotecano nos lipossomas encapsulando octassulfato de sacarose (SOS) e um contra-íon de amônia substituída (por exemplo, TEA protonado). O efeito da alteração da quantidade residual do amônio substituído no lipossoma com irinotecano-SOS carregado com fárma- co foi avaliado fazendo vários lipossomas com irinotecano-SOS contendo quantidades variáveis do íon amônio substituído residual encapsulado, armazenando estes lipossomas com irinotecano-SOS sob refrigeração a 4 °C durante 6 meses e depois medindo a quantidade de liso-PC (em % em mol) nestes lipossomas com irinotecano-SOS.
[00227] Os dados demonstraram que a redução da quantidade de íon amônio substituído nos lipossomas com irinotecano-SOS resulta em níveis mais baixos de liso-PC após 6 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C. Em particular, os lipossomas com irinotecano- SOS com menos de 100 ppm (por exemplo, 20-100 ppm de TEA) de amônio substituído exibiram níveis mais baixos de formação de liso- PC após 6 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C.
[00228] Foram preparados seis lotes (amostras 24-29) de sucros- sulfato de irinotecano lipossomal de acordo com certas modalidades da invenção, seguindo os protocolos aqui descritos, possuindo as razões de estabilidade de 1046-1064, composição lipídica de DSPC, colesterol e MPEG-2000-DSPE na razão molar de 3:2:0,015, respectivamente.
[00229] A quantidade de liso-PC na Tabela 10 foi determinada por HPLC (Método A na presente invenção). TABELA 10: Preparações de lipossoma com irinotecano em pH 7,3 (irinotecano-SOS encapsulado nas vesícu-las formadas a partir de DSPC, colesterol (Chol) e PEG-DSPE em uma razão molar de 3:2:0,015)f Medição de acordo com o método A, conforme descrito na presente invenção. g Medição de acordo com o método A, conforme descrito na presente invenção.
[00230] Os lipossomas (100-115 nm) foram obtidos por extrusão do lipídio disperso em uma solução de TEA-SOS (sulfato 0,4-0,5 M) através de membranas de policarbonato de 100 nm (Nuclepore), purificados de TEA-SOS extralipossomal por troca de tampão por diafiltração de fluxo tangencial contra solução de dextrose osmoticamente balanceada carregada com irinotecano elevando a temperatura até 68 °C e agitando durante 30 minutos, ela foi rapidamente resfriada e purificada a partir de TEA extralipossomal, e qualquer fármaco não encapsulado por troca de tampão por diafiltração de fluxo tangencial contra solução fisiológica tamponada de cloreto de sódio. A composição lipossomal de sucrossulfato de irinotecano foi esterilizada por filtração por passagem através de filtros de membrana de 0,2 μm, foi dispensada assep- ticamente em frascos de vidro estéreis e incubada sob condições de refrigeração (5 ± 3 °C). Nos tempos de armazenamento sob refrigeração de aproximadamente 0, 3, 6, 9 e, em alguns casos, 12 meses, frascos duplicados de cada lote foram retirados e analisados quanto à quantidade de liso-PC acumulado usando o método de HPLC com detector de espalhamento evaporativo. As composições lipossômicas também foram caracterizadas pelo tamanho de partícula, irinotecano e lipossoma, concentração de fosfolipídio, pH da composição liposso- mal, razão grama-equivalente de irinotecano/sucrossulfato (razão Iri/SOS) e trietilamônio residual (TEA protonado) (como trietilamina). O tamanho de partícula médio (D) e o índice de polidispersividade (PDI) foram determinados pelo método DLS usando Malvern ZetaSizer Na- noZS™. A concentração de irinotecano nas composições lipossômicas foi determinada por HPLC. O fosfolipídio total foi determinado espec- trofotometricamente pelo modo de fosfomolibdato azul após a digestão dos lipossomas em uma mistura de ácido sulfúrico/peróxido de hidrogênio.
[00231] A razão fármaco/lipídio (DL) foi calculada dividindo a quan- tidade de fármaco (como base livre anidra) em g pela quantidade molar de fosfolipídio de lipossoma na preparação de lipossoma. O SOS lipossomicamente retido foi quantificado após a passagem dos lipos- somas através de uma coluna de cromatografia em gel Sephadex G- 25 (PD-10, GE Healthcare) eluída com solução salina normal. Para determinar a razão grama-equivalente de irinotecano/SOS, alíquotas de 0,1 mL das frações de lipossoma eluídas, em triplicata, foram misturadas com 0,05 mL de ácido perclórico a 70%, hidrolisadas a 95-100 °C durante 1 hora, neutralizadas com 0,8 mL de acetato de sódio 1 M, filtradas para remover produtos lipídicos insolúveis e a quantidade de grupos sulfato derivados de sucrossofato nos filtrados foi quantificada por turbidimetria utilizando reagente de bário-PEG essencialmente como descrito em Métodos. Outro conjunto de alíquotas em triplicata dos mesmos eluatos de lipossomas foi lisado em isopropanol aquoso 70% acidificado (HCl 0,1 M) e ensaiado para o irinotecano por espec- trofotometria a 365 nm. A razão grama-equivalente de irinoteca- no/sucrossofato (razão Iri/SOS) foi calculada em cada fracção de li- possoma eluída dividindo a concentração molar medida do fármaco pela concentração molar medida dos grupos sulfato. O pH foi medido conforme descrito na subseção "Medições de pH". O TEA foi quantificado por meio de separação por cromatografia gasosa no espaço livre (GC) utilizando a eluição por gradiente de temperatura em uma coluna de GC capilar seguido pela detecção por ionização de chama (FID). Os resultados são expressos como ppm (partes por milhão) de TEA. Os níveis de TEA são determinados por quantificação externa em relação a um padrão.
[00232] Os dados em 5, 6, 7, 10, 11A, 11B e 12 foram obtidos a partir de amostras de irinotecano lipossomal preparadas pelo carregamento de lipossomas de agente de retenção TEA8SOS a 0,4-0,5 M com cerca de 400-600 mg (por exemplo, cerca de 500 g) de porção de irinotecano por total de fosfolipídio em mol (razões de estabilidade variando entre cerca de 1000-1200) e um pH após a fabricação de cerca de 7,0 a 7,5 (por exemplo, cerca de 7,25). A quantidade de liso-PC em cada uma destas amostras de irinotecano lipossomal foi medida nos pontos de tempo indicados nas figuras 5-7 utilizando o método de HPLC do Exemplo 9.
[00233] Os dados de acumulação de liso-PC (em mg de liso-PC/mL de composição de lipossoma) foram representados em função do tempo de armazenamento, como mostrado na figura 5 (Amostras 24- 26/Lotes 1-3) ou figura 6 (amostras 27-29/lotes 4-6). Observou-se uma correlação linear, onde o acúmulo de liso-PC variou de cerca de 0,008 mg/mL/mês a cerca de 0,06 mg/mL/mês, sendo as maiores taxas características para as composições com maiores valores de TEA. As quantidades de liso-PC acumuladas no dia 180 (cerca de 6 meses) de armazenamento foram determinadas a partir da aproximação linear dos dados multipontos (figuras 5A e 5B) e expressas em % molar de PC assumindo o peso molecular de liso-PC igual a 523,7 g/mol. Todos os seis lotes (amostras 24-29; consulte a tabela 10) acumularam me-nos de 20% em mol de liso-PC no dia 180 do armazenamento sob re-frigeração. Os lotes com menos de 20 ppm de TEA e razão grama- equivalente de Iri/SOS de mais de 0,98 mostraram o menor acúmulo de liso-PC (menor que cerca de 0,015 mg/mL/mês, liso-PC no dia 180 - 3,0% em mol ou menos); os lotes com menos de 80 ppm de TEA acumularam liso-PC a uma taxa de cerca de 0,03 mg/mL/mês ou menos, e tinham menos de 7% em mol de liso-PC no dia 180; o lote com 100 ppm de TEA residual acumulou liso-PC a uma taxa de cerca de 0,06 mg/mL/mês e tinha cerca de 10% em mol de liso-PC no dia 180.
[00234] A Figura 7 é um gráfico que mostra as taxas de acúmulo de liso-PC (em mg/mL/mês) armazenado a 5 ± 3 °C representadas contra o teor de TEA (em ppm) nas composições lipossômicas de sucrossul- fato de irinotecano estabilizadas, juntamente com a linha de regressão linear derivada dos dados. Cinco lotes adicionais de sucrossulfato de irinotecano lipossomal foram preparados de forma semelhante ao exemplo 3. As preparações foram armazenadas na porção de irinote- cano (como explicado acima, com base na base livre anidra) de cerca de 4,3 mg/mL de base livre anidra de irinotecano por mL e foram analisadas periodicamente quanto à formação de liso-PC e o teor de TEA, como descrito no exemplo 3. As taxas de acúmulo de liso-PC foram calculadas como as inclinações das linhas de regressão linear obtidas por ajuste aos dados de liso-PC ao longo do tempo de armazenamento para cada lote e foram representadas graficamente em relação ao teor de TEA com leituras médias de TEA dos lotes pareados de BDP/DP (figura 6). Como a seguir no gráfico, as preparações que tinham cerca de 25 ppm ou menos de TEA acumularam liso-PC em taxas inferiores a 0,02 mg/mL/mês (menos de 2,5% em mol de aumento de liso-PC durante o período de 180 dias); preparações que tinham menos de cerca de 70 ppm de TEA acumularam liso-PC a uma taxa inferior a 0,033 mg/mL/mês (menos do que 4,3% em mol de aumento de liso-PC ao longo do período de 180 dias) e todas as preparações tinham menos de cerca de 100 ppm de TEA e liso-PC acumulado a uma taxa inferior a 0,062 mg/mL/mês (aumento inferior a 8,0% em mol de liso-PC ao longo de um período de 180 dias).
[00235] Cada uma das amostras 24, 25 e 28 têm menos de 20 ppm (por exemplo, cerca de 10-20 ppm) de íon amônio substituído (TEA protonado) e tem as menores quantidades de liso-PC observadas após 6 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C ( 2,2-3% em mol de liso-PC). Comparando as amostras 26 e 27, o aumento da quantidade de agente de contra-íon de agente de retenção de amina substituída residual (por exemplo, TEA protonado) nos lipossomas com irinotecano-SOS de cerca de 39 ppm para 79 ppm (um aumento de 103%) foi acompanhado por uma queda inesperada na quantidade de liso-PC observada após 180 dias (de 6,9% em mol para 5,4% em mol, uma redução de 22% de liso-PC). Contudo, o aumento adicional da quantidade de íon amônio substituído residual (por exemplo, TEA protonada) nos lipossomas com irinotecano-SOS de 79 ppm (amostra 27) para 100 ppm (amostra 29) (ou seja, um aumento de 27%) foi acompanhado por um aumento adicional de 87% (isto é, de 5,4% em mol na amostra 27 para 10,1% em mol na amostra 29) na quantidade de liso-PC observada após 6 meses de armazenamento sob refrigeração a 4 °C.
Exemplo 4: Interação de irinotecano com sucrossofato
[00236] A Figura 8 é um gráfico que mostra quantidades em gramas equivalentes de irinotecano e sucrossofato no precipitado formado pela combinação de cloridrato de irinotecano e sucrossofato de trimetila- mônio em solução aquosa em várias razões de sucrossofato (SOS), como descrito no exemplo 4.
[00237] Quando uma solução de cloridrato de irinotecano é combi nada com lipossomas contendo sucrossofato de trietilamônio, um íon de hidrogênio pode ser removido e um sal de sucrossulfato de irinote- cano pode ser formado. Para estudar a reação entre o sucrossofato de irinotecano e trietilamônio, nós preparamos uma solução aquosa a 25 mM (16,93 mg/mL) de cloridrato de irinotecano tri-hidratado USP e 250 meq/L (31,25 mM) de solução de sucrossofato de trietilamônio (TEA- SOS) (essencialmente como descrito na seção “Métodos”). Alíquotas de solução de cloridrato de irinotecano foram diluídas com água, aquecidas a 65 °C e combinadas com alíquotas de solução de TEA- SOS para produzir uma série de razões em gramas equivalentes de irinotecano-SOS entre 9:1 e 1:9, na concentração de grama- equivalente total de ambos os compostos juntos igual a 25 meq/L. As amostras foram rapidamente misturadas sob vórtice, incubadas a 65 °C durante 30 minutos, resfriadas em água gelada e deixadas em equilíbrio de um dia para o outro a 4-6 °C. Em todas as amostras, observou-se precipitação. No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas a 10000 x g durante 5 minutos e a 14000 x g durante mais 5 minutos, e o líquido sobrenadante claro (sobre um precipitado branco ou ligeiramente amarelado abundante) foi isolado e analisado quanto às quantidades de irinotecano não precipitado e SOS essencialmente como descrito nos Exemplos para determinar a quantidade e a composição do precipitado. Os resultados foram representados graficamente em relação à porcentagem em grama-equivalente de SOS na amostra (figura 8). Na faixa de 20-80% equivalente de SOS, os gráficos para ambos os componentes consistiram em dois ramos lineares que se encontraram no valor de 50% equivalente, indicando que o iri- notecano e o sucrossofato formaram um sal insolúvel com a estequio- metria de uma molécula de irinotecano por um grupo éster sulfato de sucrossofato (isto é, oito moléculas de irinotecano (IRI) por uma molécula de sucrossofato (SOS)):
[00238] Apesar das acentuadas diferenças no tamanho molecular e na forma de uma molécula de irinotecano protonado e de um ânion de sucrossofato, seu sal manteve surpreendentemente uma estequiome- tria próxima - oito moléculas de irinotecano protonado para uma molécula de sucrossofato - mesmo sob o grande excesso de um ou outro componente (figura 8). Assim, o sucrossulfato de irinotecano pode existir no lipossoma e uma forma pouco solúvel, precipitada ou gelifi- cada. O facto de que o sal precipitante mantém a sua estequiometria rigorosa permite que o processo avance até ao ponto em que quase todos ou essencialmente todos os grupos sulfato de sucrossofato estão ligados às moléculas do fármaco. Consistente com as medições da razão grama-equivalente de sucrossulfato de irinotecano do exemplo 6, o processo de carregamento de irinotecano para obter um liposso- ma estável da presente invenção, em algumas modalidades, pode compreender a precipitação lipossomal do sal de fármaco estequiomé- trica até pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 98% e, em alguns casos, praticamente todo o sucrossofato lipossomal livre é esgotado da fase aquosa lipossomal por meio da precipitação e/ou gelificação do seu sal de irinotecano.
Exemplo 5: Preparação e determinação da solubilidade do su- crossulfato de irinotecano
[00239] Adicionou-se uma quantidade de 1,64 g de cloridrato de irinotecano tri-hidratado a 160 mL de água acidificada com 0,008 mL de HCL IN, e foi aquecido em um banho-maria a 65 °C com agitação até o fármaco se dissolver. Adicionou-se 5 mL de sucrossofato de trie- tilamônio a 0,46 M (com base na concentração de sulfato) com agitação intensiva, e isso foi agitado durante mais cinco minutos. Um precipitado oleoso amarelado se solidificou em uma massa quebradiça após o armazenamento de um dia para o outro a 4-6 °C. A massa foi triturada com um bastão de vidro para produzir um precipitado macio e esbranquiçado e incubado sob refrigeração durante 25 dias. O precipitado foi separado por centrifugação e a solução sobrenadante foi descartada. O pélete foi ressuspenso em cinco volumes de água deioni- zada e foi precipitado por centrifugação; essa etapa de lavagem foi repetida mais duas vezes até o pH da suspensão ser igual a cerca de 5,8. Por fim, o pélete foi ressuspenso em um volume igual de água deionizada para produzir cerca de 26 mL ou o produto, tendo um teor de irinotecano de 46,0 mg/mL (base livre) (rendimento teórico de 84%). Uma alíquota do produto foi solubilizada em HCl 1 N e analisada quanto ao irinotecano (por espectrofotometria a 365 nm em isopropanol aquoso a 70% - HCl 0,1 N) e ao sulfato após hidrólise em ácido perclórico diluído (1:4) usando um ensaio turbidimétrico com sulfato de bário. Verificou-se que a razão molar de irinotecano para SO4 foi de 1,020 ± 0,011. Alíquotas da suspensão de sucrossulfato de irinotecano foram adicionadas à água deionizada até a concentração final de sal de fármaco de 0,93, 1,85 e 3,71 mg/mL. As amostras foram incubadas com agitação a 4-6 °C durante 22 horas, o material foi removido por centrifugação durante 10 min a 14000 g e o fluido sobrenadante foi analisado quanto ao irinotecano por espectrofotometria. Verificou-se que a concentração de irinotecano em solução era de 58,9 ± 0,90 mi- crog/mL, 63,2 ± 0,6 microg/mL e 63,4 ± 1,3 microg/mL, respectivamente, que, em média, corresponde a uma solubilidade molar de sucros- sulfato de irinotecano de 1,32 x 10-5 M.
Exemplo 6: Vários lipossomas com irinotecano
[00240] Todos os experimentos para esse exemplo foram realizados utilizando uma extrusora de 25 mm, fibras ocas ou filtração de fluxo tangencial (TFF) configurada para a etapa de diafiltração inicial, com carga de fármaco em microescala e uma configuração de TFF para a diafiltração final seguida por filtração por EAV. Devido ao volume limitado do material carregado com o fármaco, a filtração final após a diluição foi feita utilizando um filtro EAV de 20 cm2 em uma cabine de biossegurança ao invés de dois filtros EBV.TABELA 11: h Medição de acordo com o método A, conforme descrito na presente invenção.
[00241] Com referência à tabela 11, uma série de diferentes lipos- somas de irinotecano foram preparados com diferentes quantidades de liso-PC. A menos que seja indicado de outra forma, os lipossomas com irinotecano encapsularam octassulfato de irinotecano sacarose em uma vesícula consistindo em DSPC, colesterol e MPEG2000DSPE em uma razão molar de 3:2:0,015.
[00242] A amostra 30 (lote 1) foi obtida preparando os lipossomas como descrito no exemplo 1 (exceto como indicado neste exemplo) e, em seguida, mantendo os lipossomas extrusados durante 8 horas a 72 °C após a extrusão dos lipossomas, com pH ajustado para 6,2-6,9 no final das 8 horas, resultando em uma composição com cerca de 45% em mol de liso-PC (ou seja, cerca de 1,7 mg/mL). O tempo de preparação do MLV foi considerado como tempo 0. Esse experimento foi realizado usando uma alíquota do experimento da linha de base 1. A composição da amostra 30 (lote 1) foi preparada com lipossomas tendo uma menor razão molar de DSPC:colesterol (cerca de 2:1 em vez de 3:1 em outras amostras). A composição de lipossoma com irinote- cano resultante tinha um nível elevado de liso-PC (ou seja, superior a 1 mg/mL e superior a 40% em mol de liso-PC).
[00243] As amostras 31a e 31b (lotes 2a e 2b) foram preparadas utilizando o processo do Exemplo 1 com modificações para testar o efeito de aumentar a concentração da solução de TEA-SOS nos lipos- somas antes da carga do fármaco irinotecano e o efeito de diminuir a razão de carga de fármaco irinotecano por 15% nas características das composições de lipossomas com irinotecano resultantes. O material da amostra 31a (2a) foi obtido por formação de lipossomas contendo vesículas compreendendo DSPC e colesterol (na proporção informada na tabela 11) encapsulando uma solução de TEA-SOS a uma concentração de grupo sulfato de 0,5 M para formar vesículas multila- melares (MLVs) e colocar em contato esses lipossomas com solução de cloridrato de irinotecano na quantidade de 510 g de base livre anidra de irinotecano/mol de PL para carregar o fármaco nos lipossomas. O material da amostra 31b (2b) foi obtido mantendo a composição li- possomal da amostra 31a (2a) durante 1 semana a 40 °C, e em seguida analisando novamente a amostra. Ambas as composições de lipos- somas com irinotecano resultantes das amostras 31a e 31b (2a e 2b) continham níveis muito baixos de liso-PC (ou seja, menos de cerca de 0,06 mg/mL ou 4% em mol na amostra 31a (2a) e cerca de 0,175 mg/mL na amostra 31b (2b)).
[00244] As amostras 32a e 32b (lotes 3a e 3b, respectivamente) foram preparadas utilizando o processo do Exemplo 1, com modificações selecionadas para estudar o efeito combinado do pH do tampão da formulação e reduzida razão de carga de fármaco de irinotecano. O material da amostra 32a (3a) foi obtido por formação de lipossomas tendo vesículas compreendendo DSPC e colesterol (na razão informada na tabela 10) encapsulando uma solução de TEA-SOS para formar MLVs e colocando em contato esses lipossomas com irinotecano para carregar o fármaco nos lipossomas, formando octassulfato de irinote- cano sacarose no lipossoma na razão de carga de fármaco de irinote- cano indicada na tabela 11 (menor razão de carga de fármaco de irino- tecano do que as amostras 33 (4) e 34 (5)) em um tampão selecionado para proporcionar um pH de cerca de 6,50 em vez de um pH de cerca de 7,25 na amostra 30 (1)). O material da amostra 32b (3b) foi obtido mantendo a composição da amostra 3a durante 1 semana a 40 °C, e em seguida analisando novamente a amostra. As composições de li- possomas com irinotecano resultantes 32a (3a) e 32b (3b) continham níveis baixos de 0,076 mg/mL e 0,573 mg/mL de liso-PC, respectivamente.
[00245] As amostras 33 (4) e 34 (5) foram preparadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. O material da amostra 33 (4) e 34 (5) foi obtido por formação de lipossomas tendo vesículas compreendendo DSPC e colesterol (na razão informada na tabela 11) encapsulando uma solução de TEA-SOS para formar MLVs e colocando em contato esses lipossomas com irinotecano para carregar o fármaco nos lipossomas, formando octassulfato de irinotecano sacarose no li- possoma em 500 g da porção de irinotecano (com base na base livre anidra)/mol de fosfolipídio em um tampão selecionado para proporcionar um pH de cerca de 7,25 (ao invés de um pH de cerca de 6,5 nas amostras 3a e 3b). Ambas as composições de lipossomas com irinote- cano resultantes 3a e 3b continham níveis baixos de 0,24 mg/mL e 0,79 mg/mL de liso-PC, respectivamente.
[00246] A figura 12 é um gráfico que mostra a quantidade de liso- PC medida na amostra 33 (4) (círculos, linha inferior) e amostra 34 (5) (pontos de dados “+”, linha superior). A taxa de formação de liso-PC foi maior na amostra 34 (5) do que na amostra 33 (4). O ajuste linear aos pontos de dados na figura 12 foi como a seguir:
[00247] Amostra 33 (4): liso-PC, mg/mL = 0,0513596 + 0,0084714* Idade acumulada
[00248] Amostra 34 (5): liso-PC, mg/mL = 0,1766736 + 0,0279783* Idade acumulada
[00249] As concentrações totais de liso-PC das preparações de li- possoma com irinotecano nas amostras 33 e 34 foram de 0,24 mg/mL e 0,79 mg/mL aos 22 meses, respectivamente.
Exemplo 7: Injeção de Lipossoma com Irinotecano (ONIVYDE®)
[00250] Um exemplo preferencial de uma preparação de lipossoma com irinotecano estável ao armazenamento é o produto comercializado como ONIVYDE® (injeção de lipossoma com irinotecano) (Merrimack Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA). O produto ONIVYDE® é um inibidor da topoisomerase, formulado com cloridrato de irinotecano tri-hidratado em uma dispersão lipossomal para uso intravenoso. O produto ONIVYDE® é indicado, em combinação com fluorouracila e leucovorina, para o tratamento de pacientes com adenocarcinoma me- tastático do pâncreas após a progressão da doença após terapia à base de gencitabina.
[00251] A dose recomendada do produto ONIVYDE® é de 70 mg/m2 administrada por perfusão intravenosa durante 90 minutos, uma vez a cada 2 semanas. O produto ONIVYDE® é administrado juntamente com leucovorina e fluorouracila para o tratamento de certas formas de câncer de pâncreas. A dose inicial recomendada do produto ONIVYDE® nesses pacientes com câncer de pâncreas conhecido por ser homozigota para o alelo UGT1A1*28 é 50 mg/m2 administrada por infusão intravenosa durante 90 minutos. A dose do produto ONI- VYDE® aumentou para 70 mg/m2, conforme tolerado nos ciclos subsequentes. Não existe dose recomendada do produto ONIVYDE® para pacientes com bilirrubina sérica acima do limite superior da normalidade.
[00252] O produto ONIVYDE® é administrado aos pacientes da seguinte forma. Primeiro, o volume calculado do produto ONIVYDE® é retirado do frasco. Esta quantidade do produto ONIVYDE® é, em seguida, diluída em 500 mL de 5% injeção de dextrose a 5%, USP ou injeção de cloreto de sódio a 0,9%, USP, e misturada por inversão su ave. A diluição deve ficar ao abrigo da luz. A diluição é, em seguida, administrada durante 4 horas da preparação quando é armazenada em temperatura ambiente ou dentro de 24 horas após a preparação quando é armazenada sob condições refrigeradas [2 °C a 8 °C (36 °F a 46 °F)]. A solução diluída chega então à temperatura ambiente antes da administração, e não deve ser congelada. A diluição é então infundida durante 90 minutos sem o uso de filtros em linha, e a porção não usada é descartada.
[00253] O produto ONIVYDE® é um inibidor da topoisomerase, formulado com cloridrato de irinotecano tri-hidratado em uma dispersão lipossomal para uso intravenoso. O nome químico do cloridrato de irinotecano tri-hidratado é monocloridrato de (S)-4,11-dietil-3,4,12,14- tetra-hidro-4-hidróxi-3,14-dioxo-1H-pirano[3’,4’:6,7]-indolizino[1,2- b]quinolin-9-il-[1,4’bipiperidino]-1’-carboxilato tri-hidratado. A fórmula empírica é C33H3sN4O6^HCl^3H2O e o peso molecular é 677,19 g/mol. A estrutura molecular é:
[00254] O produto ONIVYDE® é fornecido como uma dispersão li- sossomal isotônica estéril, branca a ligeiramente amarelada e opaca. Cada frasco de 10 mL para dose única contém o equivalente a 43 mg de base livre de irinotecano em uma concentração de 4,3 mg/mL de base livre anidra de irinotecano por mL (isto é, 4,3 mg de porção de irinotecano/mL). O lipossoma é uma vesícula de bicamada lipídica uni- lamelar com aproximadamente 110 nm de diâmetro, que encapsula um espaço aquoso contendo irinotecano em um estado gelificado ou precipitado, como o sal octassulfato de sacarose. A vesícula é com- posta de 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) a 6,81 mg/mL, colesterol a 2,22 mg/mL e polietilenoglicol terminado em metóxi (PM 2000)-diestearoilfosfatidiletanolamina (MPEG-2000-DSPE) a 0,12 mg/mL. Cada mL também contém ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1- il]etanossulfônico (HEPES) como tampão a 4,05 mg/mL e cloreto de sódio como reagente de isotonicidade a 8,42 mg/mL.
[00255] A injeção de lipossoma com irinotecano é um inibidor da topoisomerase 1 encapsulado em uma vesícula ou lipossoma de bi- camada lipídica. A topoisomerase 1 alivia a tensão torcional no DNA, induzindo quebras de fita simples. O irinotecano e seu metabólito ativo SN-38 se ligam reversivelmente ao complexo da topoisomerase 1- DNA e evitam a religação das quebras da fita simples, levando a danos ao DNA na fita dupla dependentes do tempo de exposição e à morte celular. Em camundongos com xenoenxertos de tumores humanos, o lipossoma com irinotecano administrado em doses equivalentes de HCl de irinotecano 5 vezes mais baixas do que o cloridrato de irino- tecano atingiu uma exposição intratumoral semelhante de SN-38.
[00256] A farmacocinética plasmática do total de irinotecano e do total de SN-38 foi avaliada em pacientes com câncer que receberam o produto ONIVYDE®, como agente único ou como parte da quimioterapia combinada, em doses entre 50 e 155 mg/m2, e 353 pacientes com câncer usando análise farmacocinética da população.
[00257] Os parâmetros farmacocinéticos do irinotecano total e do SN-38 total após a administração do produto ONIVYDE® a 70 mg/m2 como agente único ou parte da quimioterapia combinada são apresentados abaixo. TABELA 12: Resumo da Média (± Desvio Padrão) de total de Irino- tecano e total de SN-38
[00258] No intervalo posológico de 50 a 155 mg/m2, a Cmax e a AUC do irinotecano total aumentam com a dose. Além disso, a Cmax do SN-38 total aumenta proporcionalmente com a dose; no entanto, a AUC do SN-38 total aumenta menos que proporcionalmente com a dose.
[00259] A medição direta do lipossoma com irinotecano mostrou que 95% do irinotecano permanece encapsulado nos lipossomas, e as razões entre as formas total e encapsulada não se alteraram com o tempo de 0 a 169,5 horas após a dose.
[00260] O produto ONIVYDE® deve ser armazenado entre 2 °C e 8 °C (36 °F a 46 °F), deve ser protegido da luz e não deve ser congelado.
[00261] Múltiplas preparações do produto ONIVYDE® foram colocadas em estabilidade a longo prazo e analisadas durante 12-36 meses de armazenamento a 2-8 °C (condições refrigeradas). Os resultados estão representados graficamente nos gráficos nas figuras 9, 10, 11A e 11B, como descrito abaixo. Em um estudo, o tamanho de partícula (figura 9) e a distribuição de tamanho de partícula (figura 10) foram medidos para 12 preparações de produtos ONIVYDE® durante 12 a 36 meses. O PDI permaneceu bem abaixo de 0,1 e abaixo de cerca de 0,05, para todas as amostras. Em outro estudo, o pH (figura 11A) foi medido para 13 preparações diferentes de produtos ONIVYDE® ao longo de 12-36 meses. O pH permaneceu acima de 6,8 durante o es- tudo para todas as amostras. Em outro estudo, a quantidade de liso- PC (figura 11B) foi medida durante 12 meses durante 16 preparações diferentes de produtos ONIVYDE®, durante o armazenamento sob refrigeração. A quantidade de liso-PC permaneceu abaixo de 1 mg/mL para todas as amostras.
[00262] Com a finalidade de determinar a concentração de base livre de irinotecano na modalidade do produto ONIVYDE® em diferentes momentos de armazenamento, a base livre de irinotecano foi quantificada como previsto na seção “Exemplo”. Com a finalidade de determinar a composição lipídica da modalidade do produto ONIVYDE® em diferentes momentos de armazenamento, os lipídios são quantificados utilizando metodologias de HPLC padrão que são padrão na técnica.
[00263] Com a finalidade de determinar o tamanho de partícula médio (D) e o índice de polidispersão (PDI) dos lipossomas da modalidade do produto ONIVYDE® em diferentes momentos de armazenamento, utilizou-se o método DLS em conjunto com um Malvern ZetaSizer Nano ZS™.
[00264] Com a finalidade de determinar a presença de liso-PC na modalidade do produto ONIVYDE® em diferentes momentos de arma-zenamento, o liso-PC foi quantificado como descrito na seção “Exemplos”. Adicionalmente, está também contemplado no contexto da presente invenção que o liso-PC pode ser quantificado por HPLC como descrito no relatório descritivo.
Exemplo 8: Lipossomas de Topotecano e Vinorrelbina
[00265] O objetivo desse estudo de estabilidade de armazenamento foi determinar quaisquer alterações na estabilidade física e química dos lipossomas encapsulando topotecano (TPT) e dos lipossomas encapsulando vinorrelbina (VNB) preparados com um agente de retenção de octassulfato de sacarose, quando armazenados a cerca de 4 °C. Especificamente, o estudo examinou se, durante a fabricação dos lipossomas, a redução da concentração do agente de retenção de oc- tassulfato de sacarose (SOS) de 0,6 M para 0,45 M grupos sulfato, mantendo a razão de topotecano ou vinorrelbina para fosfolipídio, como indicado abaixo por mol de fosfolipídio, teria um efeito sobre a quantidade de liso-PC presente nas amostras de lipossomas. Similarmente, o efeito de aumento no pH de 6,5 para 7,5 foi examinado, para determinar se este aumento de pH reduziu a presença de liso-PC nas composições lipossômicas. TPT e VNB foram encapsulados com um agente de retenção SOS nos lipossomas contendo DSPC, colesterol (Chol) e PEG-DSPE em uma razão molar de 3:2:0,015. Os parâmetros de formulação investigados incluem: pH da solução (6,5-7,5), concentração do agente de retenção de octassulfato de sacarose durante a preparação de lipossomas (0,45-0,6 M de sulfato), o fármaco encapsulado (TPT ou VNB) e a razão de fármaco para lipídio (500 g de clori- drato de TPT por mol de fosfolipídio durante o carregamento de lipos- somas; para VNB, de 350 a 450 g de porção VNB por mol de fosfolipí- dio durante o carregamento de lipossomas). As várias propriedades físico-químicas dos lipossomas que foram monitorados durante este estudo de estabilidade foram: tamanho dos lipossomas, razão fárma- co/fosfolipídio, eficiência de encapsulação do fármaco, aparência geral e formação de lisolipídios.
[00266] DSPC, colesterol (Chol) e PEG-DSPE foram pesados em quantidades que correspondiam a uma razão molar de 3:2:0,015, res-pectivamente (790,15 mg/257,8 mg/14,0 mg). Os lipídios foram dissolvidos em clorofórmio/metanol (4/1, v/v), bem misturados e divididos em 2 alíquotas (A e B). Cada amostra foi evaporada até à secura utilizando um rotaevaporador a 60 °C. O clorofórmio residual foi removido dos lipídios por meio de vácuo (180 μtorr) em temperatura ambiente durante 12 horas. Os lipídios secos foram dissolvidos em etanol a 60 °C e TEA8SOS preaquecido de concentração apropriada foi adicionado de modo que o teor final do álcool era de 10% (v/v). A concentração de fosfolipídio total foi de aproximadamente 75 mM. A solução lipídica foi extrusada através de membranas de policarbonato de 0,1 μm (Nucle- pore ™) 10 vezes, para produzir lipossomas com um diâmetro médio típico de 95-115 nm. O pH dos lipossomas extrusados foi ajustado conforme necessário (com NaOH 1 N) até o pH 6,5, se necessário. Os lipossomas foram purificados por meio de uma combinação de croma- tografia de troca iônica e cromatografia de exclusão por tamanho. Primeiro, a resina Dowex™ IRA 910 foi tratada com NaOH 1 N, seguido por 3 lavagens com água deionizada e, em seguida, seguido por 3 lavagens de HC1 3 N e depois por múltiplas lavagens com água. A con- dutividade das frações eluídas foi medida utilizando um medidor de condutividade de células de fluxo (Pharmacia, Uppsala, Suécia). As frações foram consideradas aceitáveis para purificação adicional se a condutividade foi inferior a 15 μS/cm. O eluato de lipossoma foi em seguida aplicado a uma coluna Sephadex G-75 (Pharmacia) equilibrada com água deionizada, e a condutividade da fração de lipossoma recolhida foi medida (tipicamente inferior a 1 μS/cm). Solução de dextrose a 40% foi adicionada até alcançar uma concentração final de 5% (p/p) e o tampão (Hepes) foi adicionado de uma solução estoque (0,5 M, pH 6,5) até uma concentração final de 10 mM. Preparou-se uma solução estoque de cloridrato de topotecano dissolvendo 50 mg em 10 mL de água deionizada. Os fármacos foram adicionados a soluções lipossô- micas na razão de fármaco/lipídio indicada para cada formulação nos resultados da tabela 13. Para o carregamento de TPT, o pH foi ajustado até pH 6,0 antes do carregamento. A vinorrelbina foi adicionada diretamente da solução de injeção USP comercial da farmácia, e o pH da mistura resultante foi ajustado para 6,5 com NaOH 1 N antes do aquecimento. O carregamento de fármaco foi iniciado aquecendo as misturas de lipossomas/fármaco a 60 °C durante 30 minutos. As soluções foram rapidamente arrefecidas após a remoção do banho-maria por imersão em água gelada. O fármaco extralipossomal foi removido por cromatografia de exclusão por tamanho usando as colunas Sephadex G75 equilibradas e eluídas com solução salina tamponada com solução salina tamponada com Hepes (10 mM) (HBS), pH 6,5. As amostras foram analisadas para o irinotecano por HPLC e fosfato pelo método de Bartlett (consulte "Determinação de fosfato").
[00267] Para armazenamento, as amostras foram divididas em alíquotas de 4 mL e o pH foi ajustado, se necessário, usando HCl 1 N ou NaOH 1 N, esterilizadas por filtração sob condições assépticas e preenchidas em frascos de vidro transparente estéreis que foram selados sob argônio com uma tampa roscada revestida com Teflon® e colocadas em um refrigerador controlado termostaticamente a 4 °C. Em pontos de tempo definidos, uma alíquota foi removida de cada amostra e testada quanto ao aspecto, tamanho, razão de fármaco/lipídio e estabilidade química do fármaco e do lipídio. O tamanho do lipossoma foi determinado nas amostras diluídas por espalhamento de luz dinâmico utilizando o Coulter Nano-Sizer a um ângulo de 90 graus e foi apresentado como a média ± desvio padrão (nm) obtido pelo método dos cumulativos.
[00268] Os resultados dos estudos comparativos de estabilidade estão fornecidos na tabela 13.TABELA 13: Lipossomas de Topotecano e Vinorrelbina preparados com agente de retenção TEA8SOS (grupos SOS sulfato 0,6 N, armazenados a 2 mg/mL de concentração de fármaco) i Medição de acordo com o método B, conforme descrito na presente invenção.j 500 g de HCl de topotecano por mol de fosfolipídios totais
[00269] O efeito do pH do meio de armazenamento na produção de lisolipídios nos lipossomas carregados com topotecano não foi observado nas amostras 19 e 20. Ambas as formulações nas amostras 19 e 20 exibiram perto de 30% em mol de lisolipídios após 9 meses, embora a amostra 19 tenha sido armazenada em pH 6,5 e a amostra 20 foi armazenada em pH 7,25.
[00270] Em contraste com ambas as camptotecinas lipossomais, a vinorrelbina lipossomal foi mais resistente à hidrólise lipídica, pelo fato de que a maior quantidade de lisolipídio medida foi na amostra 21, possuindo 9,5% em mol de lisolipídios após 9 meses. Embora menos acentuada, também podemos detectar uma dependência da Razão de Estabilidade e do pH do meio de armazenamento. A maior Razão de Estabilidade resultou na hidrólise lipídica reduzida (compare as amostras 21 a 23). Um pH de 7,25 também reduziu a quantidade de hidrólise lipídica observada (compare as amostras 21 e 22).
Exemplo 9: Método de HPLC para medir o liso-PC (“Método A”)
[00271] A quantidade de liso-PC nas preparações de lipossoma com octassulfato de irinotecano sacarose testadas para obter os dados nas figuras 11B e 12 foi obtida utilizando HPLC com detecção por espalhamento de luz evaporativa. Um método de HPLC adequado (aqui referido ao “Método A”) é um método quantitativo utilizado para medir a quantidade de ácido esteárico, liso-PC, colesterol e DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) no produto de fármaco. Os lipossomas são dissociados nos seus componentes lipídicos individuais utilizando uma solução de metanol-tetraidrofurano. Os componentes lipídicos são quantificados utilizando cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa equipada com um detector evaporativo com espalhamento de luz.
Amostra e Preparação Padrão PREPARAÇÃO PADRÃO: LisoPC
[00272] Uma curva padrão de cinco pontos foi preparada diluindo quantidades apropriadas de lisoPC com metanol-tetraidrofurano 85:15 para atingir as concentrações finais de 4, 8, 20, 32 e 40 μg/mL.
Ácido esteárico
[00273] Uma curva padrão de cinco pontos foi preparada diluindo quantidades apropriadas de ácido esteárico com metanol- tetraidrofurano 85:15 para atingir as concentrações finais de 2, 4, 10, 16 e 20,4 μg/mL.
Colesterol
[00274] Uma curva padrão de cinco pontos foi preparada diluindo quantidades apropriadas de colesterol com metanol-tetraidrofurano 85:15 para atingir as concentrações finais de 90, 144, 183,7, 224,9 e 266,6 μg/mL.
DSPC
[00275] Uma curva padrão de cinco pontos foi preparada diluindo quantidades apropriadas de DSPC com metanol-tetraidrofurano 85:15 para atingir as concentrações finais de 220, 352, 449, 549,8 e 651,7 μg/mL.
Controle de Ensaio
[00276] Um controle de ensaio é preparado diluindo o ácido esteárico em diluente (85:15 de metanol-tetraidrofurano) até uma concentração final alvo de 9,0 μg/mL e 18,0 μg/mL.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA:
[00277] As amostras são preparadas diluindo cada amostra em solução de metanol-tetraidrofurano 85:15 até uma concentração alvo final de DSPC de 475 μg/mL.
Estabilidade da Solução
[00278] Os padrões das amostras de teste e os controles do ensaio demonstraram estabilidade aceitável em solução por até 48 horas quando armazenados à temperatura ambiente.
Parâmetros do instrumento e instrumento
[00279] Sistema cromatográfico de alta pressão adequado equipado com um detector evaporativo com espalhamento de luz capaz de alterar as configurações de ganho e filtro ao longo de uma análise, se necessário, para garantir a detecção do pico adequada. Os parâmetros operacionais do instrumento estão listados na tabela 14.TABELA 14: Condições Cromatográficas TABELA 15: Adequabilidade do sistema
[00280] Cada concentração lipídica é determinada analisando a área do pico da amostra para a curva padrão. Uma segunda linha de tendência de equação polinomial de segunda ordem (curva quadrática) é usada para calcular as concentrações lipídicas de liso-PC e de ácido esteárico. Uma linha de tendência linear é usada para calcular as con- centrações lipídicas de DSPC e colesterol.
[00281] Um cromatograma representativo é mostrado na figura 13A e na figura 13B.
[00282] Todas as referências citadas nesse documento são incorporadas na presente invenção por referência nas suas totalidades.

Claims (16)

1. Processo de produção de uma composição de irinoteca- no lipossômico estabilizado em armazenamento, caracterizada pelo fato de que compreende octasulfato de sacarose irinotecano (SOS) encapsulado em lipossomas compostos de colesterol e um ou mais fosfolipídios com uma proporção correspondente a um total de 500 gramas ± 10% em peso da porção irinotecana por fosfolipídios totais em mol , a composição lipossômica do irinotecano estabilizou-se para formar menos de 20 mol% de liso-fosfatidilcolina (liso-PC) durante os primeiros 6 meses de armazenamento da composição lipossômica do irinotecano a uma temperatura de 2 a 8°C, sendo que o processo compreende as etapas de: (a) formar lipossomas compreendendo 1,2-distearoil-sn- glicero-3-fosfocololina (DSPC), colesterol e polietilenoglicol- distearoilfosfatidil etanolamina terminada em metoxi, encapsulando um sal de amônio substituído de SOS com uma concentração de sulfato de 0,4 a 0,5 M; (b) entrar em contato com os lipossomos com uma solução compreendendo irinotecano, a uma temperatura de 55°C ou mais, formando assim uma preparação de lipossomos que encapsulam oc- tasulfato de sacarose e irinotecano sacarose dentro dos lipossomos; e (c) obter a composição de irinotecano lipossômico estabilizado em armazenamento por pelo menos uma etapa adicional compreendendo ajustar o pH da preparação de lipossomas da etapa (b) a um pH de 7,25 a 7,50.
2. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura da etapa (b) é de 60°C ou superior, preferencialmente, a temperatura da etapa (b) é de 70°C ou superior, mais preferencialmente, a temperatura da etapa (b) b) é de 55°C a 70°C, ainda mais preferencialmente, a temperatura da etapa (b) é de 60°C a 70°C.
3. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela concentração de sulfato na etapa (a) variar de 0,45 a 0,475 M.
4. Processo de produção de uma composição de irinoteca- no lipossômico estabilizado em armazenamento, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) formar uma dispersão lipídica em uma solução de um sal de amônio substituído de octasulfato de sacarose (SOS) com uma concentração de sulfato de 0,45 M, os lipídios na referida dispersão compreendendo 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), colesterol e polie- tilenoglicol-distearoilfosfatidil etanolamina terminado em metoxi (MW 2000) numa proporção molar de 3: 2: 0,015, respectivamente; (b) extrusão da dispersão lipídica a uma temperatura variando de 60 a 70 ° C através de pelo menos um filtro de membrana de 0,1 μm para formar lipossomas; (c) remoção substancial de íons derivados do sal de amônio substituído de octasulfato de sacarose que estão fora dos lipossomas; (d) entrar em contato com os lipossomos, a uma temperatura variando de 60 a 70 ° C, com uma solução usando sal cloridrato de irinotecano, para formar uma preparação de lipossomos que encapsulam 500 g ± 10% em peso da porção irinotecana por mol de fosfolípido total; (e) remover substancialmente o irinotecano não retido; e (f) ajustar o pH da composição para 7,3.
5. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a membrana da etapa (b) é um filtro de membrana de policarbonato de 0,1 μm.
6. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dispersão lipídica é extrusada através de pelo menos dois filtros de membrana de 0,1 μm empilhados para formar lipossomas.
7. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição de irinotecano lipossômico estabilizada para armazenamento possui um teor total de fração irinotecano equivalente a 4,3 mg/mL de base livre de irinotecano.
8. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição de irinotecano lipossômico estabilizada para armazenamento compreende um tampão aquoso HEPES isotônico, em que o tampão aquoso HEPES está presente em uma concentração de 2 a 20 mM.
9. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição de irinotecano lipossômico estabilizada para armazenamento compreende ainda cloreto de sódio presente em uma concentração de 130 a 160 mM.
10. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o irinotecano encapsulado dentro dos lipossomas está em um estado gelificado ou precipitado como um sal octassulfato de sacarose e/ou o polietilenogli- col-distearoilfosfatidil etanolamina terminado em metoxi é MPEG- 2000-DSPE.
11. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a composição de irinotecano lipossômico estabilizada para armazenamento compreende 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) em uma concentração de 6,1 a 7,5 mg/mL, colesterol em uma concentração de 2 a 2,4 mg/mL e 0,11 a 0,13 mg/mL de MPEG-2000-DSPE
12. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição de irinotecano lipossômico estabilizada para armazenamento compreende um total de 6,81 mg de DSPC/mL, 2,22 mg de coleste- rol/mL e 0,12 mg de MPEG-2000-DSPE/mL, 4,05 mg/mL de tampão aquoso HEPES e 8,42 mg de cloreto de sódio/mL.
13. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o sal de amônio substituído do SOS é o SOS de trietilamônio ou SOS de dieti- lamônio.
14. Processo de produção, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a composição de irinotecano lipos- sômico estabilizada para armazenamento compreende trietilamônio ou dietilamônio em uma quantidade total inferior a 100 ppm, preferencialmente em uma quantidade total de 30 a 100 ppm.
15. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que os liposso- mas apresentam um tamanho médio ponderado em volume de 110 nm ± 20% conforme determinado por dispersão dinâmica de luz e em que o tamanho é determinado pelo método dos cumulativos.
16. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a quantidade de liso-PC é relativa ao total de fosfolipídios do lipossoma.
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