WO2005087196A1

WO2005087196A1 - 免疫応答システムを利用したドラッグデリバリーシステム

Info

Publication number: WO2005087196A1
Application number: PCT/JP2005/005446
Authority: WO
Inventors: Naoya Kojima; Yoshitaka Shimizu; Yuzuru Ikehara; Hayao Nakanishi
Original assignee: Tokai University Educational System; Aichi Prefecture
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2005-09-22
Also published as: CN100577210C; KR20070057701A; US20080020029A1; HK1105861A1; CA2559800A1; JPWO2005087196A1; CN1953736A

Abstract

　本発明の目的は、抗癌剤などの投与物質を標的部位に効率良く集積させることができるドラッグデリバリー組成物を提供することである。本発明によれば、オリゴ糖被覆リポソームと投与物質とを含む、投与物質を標的部位に送達するためのドラッグデリバリーリポソーム組成物が提供される。

Description

明細書

免疫応答システムを利用したドラッグデリバリーシステム技術分野

本発明は、オリゴ糖被覆リボソームを用いたドラッグデリバリーリボソーム組成物に関する。より詳細には、本発明は、腹腔内に投与した際に腹腔内のマクロファージによって取り込まれて標的部位に送達されることを特徴とする、オリゴ糖被覆リボソームを用いたドラッグデリバリーリポソーム組成物に関する。背景技術

癌の術後の再発は癌患者の生存率の向上を阻む最大の障壁となっており、この再発を抑制することは癌の臨床上最も重要な課題の一つである。根治手術後の再発の主たる原因は手術時に既に撒布されている遊離癌細胞あるいは目に見えない微小転移によると考えられており、この微小転移を検出して治療することは、癌患者の予後に直結する重要な課題である。胃癌では、根治手術後の再発形式として腹膜再発が 5 0 %以上を占め、患者の予後を決める最も重要な因子である。現在の Golden standard, 腹腔洗浄細胞診による細胞診陽性の診断は予後不良を意味する。

しかしながら、細胞診陰性の症例からの腹腔再発が少なからず見られるなど、上記の方法は検出感度が低く、腹膜微小転移の検出は事実上不可能である。これまでの所、癌胎児抗原（C E A) を指標とする R T— P C R法を用いた腹腔内遊離癌細胞の高感度の検出法が確立されている。また、 1995年から臨床検体を用いた解析を 8年に渡つて行つた結果、腹膜再発のリスクの高さが生命予後に直結していることが明らかになつている。現在、高度先進医療として、腹腔内再発のリスク評価を行うとともに、胃癌患者の予後改善のための治療法の開発が検討されている。

一方、抗癌剤の投与に際して、リボソームは、より選択的に癌局所へ抗癌剤を到達させ、治療効果を高めると同時に正常組織への集積を抑えることで副作用の軽減を図る目的で用いられている。血管内に投与されたリボソームは、血管透過性の亢進した腫瘍血管では癌組織中に漏れ出し、局所に滞留する性格を有している。従って、薬剤送達システムとしては、 passive targeting と呼ばれるものである。一方、抗体などの特異的結合能を利用した薬剤送達システムは active targeting と呼ばれている。従来の方法はリボソームを直接、癌細胞へ到達させることを目的としている。この場合、リボソームは、血中のマクロファージには取り込まれないようにしつつ血行性に癌部に送達することを目的として、開発されてきた。発明の開示

上記の通り、腹膜微小転移の有無の検出は可能になりつつあるが、腹膜微小転移の局所を特定する方法は存在しない。胃癌の職腹腔内転移は、乳斑と呼ばれる大綱や散在する腸間膜の節外性小リンパ節を足がかりとして生じることが臨床的に知られている。本発明者らはこれまでに、 G F P遺伝子を導入した転移性細胞と、簡便な G F P検出システムを組み合わせることにより、乳斑に生じてくる微小転移を非侵襲的に可視化できる微小転移マウスモデルを確立し、微小転移が大網や腸管膜リンパ節に生じてくることを見出し、さらにマウスを用いた実験で初期腹腔内転移の早期に抗癌剤を投与すると有効であることを見出している。しかし、腹腔という広い空間に薬剤を投与すると薬剤の有効濃度に至らない、あるいは有効濃度に維持しようとすれば非常に高濃度の薬剤を投与することとなり、薬剤の血中移行など副次的な問題が生じるため、現時的ではなく、有効な投与方法がないのが現状である。従って、腹膜微小転移相という局所にドラッグデリバリ一システムで薬剤を集中させることができれば、有効な投与方法となりうる。即ち、本発明は、抗癌剤などの投与物質を標的部位に効率良く集積させることができるドラッグデリパリ一組成物を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、オリゴマンノースで被覆したリボソームを腹腔内に投与すると、非常に特異的かつ迅速に腹腔内常在性マクロファージによって取り込まれることを見出した（図 1 )。また、このォリゴマンノース被覆リボソームを特異的に取り込んだマクロファージが 1 2時間から 2 4時間という短時間で初期腹腔内転移の生じる局所である乳斑と呼ばれる大網ゃ腸管膜リンパ節に散在する節外性リンパ節に集積することを見出した（図 2 )。また、実際に腹腔内におけるオリゴマンノース被覆リボソームを取り込んだマクロファージの集積場所と癌細胞の微小転移の生じる場所が同じであることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、オリゴ糖被覆リボソームと投与物質とを含む、投与物質を標的部位に送達するためのドラッグデリバリーリポソーム組成物が提供される。

好ましくは、オリゴ糖はオリゴマンノースであり、さらに好ましくは、オリゴ糖はマンノペンタオース又はマンノトリオースである。

好ましくは、投与物質は、薬物、マーカーまたは造影剤である。

好ましくは、薬物は抗癌剤である。

好ましくは、本発明のドラッグデリバリーリボソーム組成物は、腹腔内に投与され、腹腔内のマクロファージによって取り込まれて標的部位に送達される。好ましくは、標的部位は、腹腔内の節外性小リンパ組織又は腸管膜リンパ組織である。

好ましくは、本発明のドラッグデリパリ一リボソーム組成物は、磁性化合物を封入したオリゴ糖被覆リボソームと一緒に組み合わせて投与される。

本発明の別の側面によれば、オリゴ糖被覆リボソームと投与物質とを含むドラッグデリパリ一リボソーム組成物をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、投与物質を標的部位に送達する方法が提供される。

好ましくは、本発明のドラッグデリバリーリボソーム組成物は、磁性化合物を封入したオリゴ糖被覆リボソームと一緒に組み合わせてヒトを含む哺乳動物に投与し、その後、外部から磁場を照射することができる。図面の簡単な説明

図 1は、 M3- DPPE被覆リボソームと M3- DPPEで被覆していないリボソームをマウスに投与して、 1時間後に細胞を回収し腹腔内細胞（F 4 8 0陽性細胞）への取込みを観察した結果を示す。

図 2は、大網への M3-DPPE被覆リボソームの集積を経時的に観察した結果を示す。

図 3は、大網内への抗癌剤封入糖鎖被覆リポソームと磁性微粒子封入糖鎖被覆リポソ一ムの至適取り込み条件を調べた結果を示す。

図 4は、抗癌剤（5FU) を投与したマウスと投与しないマウスを開腹しがんの増殖を GFPの蛍光を指標に観察した結果を示す。

図 5は、抗癌剤（5FU) を投与したマウスと投与しないマウスを開腹しがんの増殖を GFPの蛍光を指標に観察した結果を示す。

図 6は、抗癌剤（5FU) を投与したマウスと投与しないマウスを開腹しがんの増殖を GFPの蛍光を指標に観察した結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。

本発明のドラッグデリパリ一リボソーム組成物は、オリゴ糖被覆リボソームと投与物質とを含むことを特徴とするものであり、投与物質を標的部位に送達するために使用される。さらに具体的には、本発明のドラッグデリバリーリボソーム組成物は、腹腔内に投与された場合に、腹腔内のマクロファージによって取り込まれて標的部位に送達される。本発明における標的部位は、好ましくは、癌の初期腹腔内転移病巣である大綱や腸管膜の節外性小リンパ組織である。

本発明で用いるオリゴ糖被覆リボソームとしては、例えば、特許第 2 8 2 8 3 9 1号公報に記載のリボソームを用いることができる。オリゴ糖を構成する糖成分の種類は特に限定されないが、例えば、 D—マンノース（D— M a n ) 、 L— フコース（L一 Fu c) 、 D—ァセチルダルコサミン（D— G 1 c NA c) 、 D 一グルコース（D— G l c) 、 D—ガラクトース（D— Ga l) 、 D—ァセチルガラクトサミン (D-G a 1 NAc) 、 D—ラムノース (D-Rh a) などが挙げられる。

オリゴ糖中で、各構成糖は、 α 1→2結合、《 1→3結合、 _α 1→4結合、 α

1→6結合又は β 1一 4結合等あるいはこれらの組合せにより結合している。例えば、マンノースは上記の結合により単鎖を構成してもよく、又は《 1→3結合と α 1→6結合との組合せにより分枝構造をとつてもよい。オリゴ糖中の単糖の数は、好ましくは 2〜1 1個である。具体的なオリゴ糖として、例えばマンノビオース (Ma η 2) 、マンノトリオース (M a η 3 ) 、マンノテトラオース (Μ a η 4) 、マンノペンクオース（Ma n 5) 、マンノへキサオース（Ma n 6) 、マンノヘプタオース（Ma n 7) 、種々の混合オリゴ糖、例えば下記に示す M5

(式 1) 及び RN (式 2) 等を挙げることができる。

式 1

5

Man α K

Manな 1 \

3 6

Manaレ Man

3

Manetレ

式 2

RN

Manal-*2 Mana 1

Manな 1

an l→2 Manal^ 6

Man β l→4GlcNAc l→4GlcNAc

3

Man α卜 2 Manal 2 anal

(式中、 α 1→ 2結合している Manは、それぞれ独立に、存在してもよく

存在しなくてもよい。）さらに、グルコースを含有するオリゴ糖として式 3に示す構造を有するものを挙げることができ、 N—ァセチルダルコサミンを含むオリゴ糖として式 4に示すものを挙げることができ、そしてフコースを含むオリゴ糖として式 5に示すものを挙げることができる。式 3

H + 6G 1 cな l → 6 G 1 c a 1- 6 G 1 c a l -→ H

G 1 c

6

H

Cm + m^/ +nは 1〜10)

GlcNACiSl- >4GlcNAcS lhr^ 4G 1 cNAc

(nは 0〜4)

( Ac β1)_Ρ

(GlcNAc/3i→)_n Man α K ふ

^6 4

Man ^l→4GlcNAc 4GlcNAc

CGlcNAc/Si→)_n anal^

(pは 0又は 1であり、 nはそれぞれ独立に 0〜3である。式中右側の 4G1CNAC/01—4G1CNAC で示した 2つの GlcNAc残基は、それぞれ独立にあってもなくてもよい。また、（GlcNAc^l ) _π で示した GlcNAcはどれも右瞵の Man の空いている水酸基のどこにダリコシド結合してもよい。）

Fucal

(GlcNAc 51→)„ Manal-

'6 4 6

Man β l→4GlcNAc β l→4GlcNAc

(GlcNAc 31→)_B Man a V

(pは 0又は 1であり、 nはそれぞれ独立に 0〜 3である。また、 (GlcNAc/81→) _n で示した GlcNAcはどれも右隣の Man の空いている水酸基のどこにグリコシド結合してもよい。）

GlcNAc/31

6

R^l→3CalNAc

Rは H， GlcNAc、又は（GlcNAcjSl→6)_P (GlcNAc 3 l-*3)_sGal (pは 0又は 1である。） 5 FucaDp (Pucな 1)_P

Ψ

→ Gal/31 -→GlcNACiSl (Gal/31→Glc)〕

ノ

(kは 1~5であり、 pはそれぞれ独立に 0又は 1である。矢印の先に行先の番号のないものは、空いている水酸基のどこにグリコシド結合してもよい。）

GlcNAc 1)_P

H Manな 1

6 4

Man jSMGtcNAc jSMGlc c 3

►(Gal/Sl→)_P GlcNAc/Sl- Man 1

个

(Fucal)p (Fucd!l),

(pはそれぞれ独立に 0又は 1であり、 nはそれぞれ独立に 0〜 3である _c 矢印の先に行先の番号のないものは、空いている水酸基のどこにグリコシド結合してもよい。また、式中右側の 4GkMcj81→4GlcNAcで示した 2つの GlcNAc残基はそれぞれ独立にあつてもなくてもよい。）

(Cal Sl→)p GlcNAc/3H anal

个今

FucaDp (Fucai),

( pはそれぞれ独立に 0又は 1であり、 nはそれぞれ独立に 0〜 3である。

矢印の先に行先の番号のないものは、空いている水酸基のどこにグリコシド結合してもよい。また、式中右側の 4GkMc/Sl→4GlcNAcで示した 2つの GlcNAc残基はそれぞれ独立にあってもなくてもよい。：）本発明で用いるオリゴ糖は好ましくは、オリゴマンノースであり、特に好ましくはマンノペンタオース又はマンノトリオースである。

上記のオリゴ糖は、いずれも 1個の還元末端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基を、オリゴ糖をリボソーム表面に導入するための手段として使用することができる。すなわち、このアルデヒドと、アミノ基を有する脂質との間に反応によりシッフ塩基を形成し、次にこのシッフ塩基を、常法に従って、還元、好ましくは化学還元、例えば N a BH₃CNにより還元することにより、ォリゴ糖と、脂質とを結合することができる（水落次男、糖質工学、 224— 23 2頁、産業調査会バイオテクノロジー情報センター、 1992) 。

上記のァミノ基を有する脂質は、好ましくはァミノ基を有するリン脂質であり、例えばホスファチジルァミン、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE) 、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（DSP E) 等を使用することができる。上記のようにして得られた、オリゴ糖と脂質との結合物を、本発明においては人工糖脂質と称する場合がある。

リポソームを構成する脂質としては、リポソームを構成するために知られている任意の常用の脂質を単独で又は複数組み合わせて使用することができる。例えば、天然物、例えば卵黄、大豆、又はその他の動植物から得られる脂質、これらの脂質を修飾したもの、例えば水素添加によって不飽和度を低下したもの、あるいは化学合成したものを使用することができる。具体的には、例えば、ステロール類、例えばコレステロール（C h o 1) ；ホスファチジルエタノールアミン類、例えばジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE) 、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（D S PE) ；ホスファチジルコリン類、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（DP PC) 、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC) ；ホスファチジルセリン類、例えばジパルミトイルホスファチジルセリン（DP P S)、ジステアロイルホスファチジルセリン（D SPS) ；ホスファチジン酸類、例えばジパルミトイルホスファチジン酸（DP PA) 、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA) 、等が挙げられる。リポソームの作製は公知の方法 [D. W. Deeamer, P. S. Uster, "Liposome" ed. by M. J. Ostro, Marcel Dekker Inc. , N. Y. Basel, 1983， p27] を用いて行うことができる。ポルテックス法および超音波法が一般的であるが、そのほかにエタノール注入法、エーテル法および逆相蒸発法などが適用でき、これらを組合せて使用することもできる。

例えば、ポルテックス法おょぴ超音波法においては、所定の脂質を有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、クロ口ホルム又はこれらの混合物、例えばメタノールとクロ口ホルムとの混合物に溶解した後、該有機溶剤を蒸発除去することにより脂質の薄層を得る。次に、この脂質の薄層に水性媒体を加えてポルテックス処理又は超音波処理することによりリボソームが形成される。この際に、上記水性媒体に、薬物、マーカーまたは造影剤などの投与物質を混入、例えば溶解又は懸濁させておくことにより、該投与物質をリボソームに封入することができる。オリゴ糖をリボソームの表面に導入するためには、例えば、次の 2つの方法のいずれかを用いればよい。前記の人工糖脂質が水溶性で有機溶剤に十分溶解しない場合、例えば、前記の M 5と D P P Eとの結合物（M 5— D P P E) 、 R Nと D P P Eとの結合物（R N— D P P E ) を用いる場合には、これらの水性溶液を調製し、これを形成されたリボソームと混合して、例えば 4 °Cないし室温において 2 4〜 1 2 0時間、例えば約 7 2時間ィンキュベーションすればよい。

他方、人工糠脂質が有機溶剤に溶解する場合には、該人工糖脂質を、リポソ一ム構成用脂質と共に、リポソーム製造過程において前記のごとき有機溶剤に溶解し、以後、常法に従ってリボソームを形成すればよい。リボソームの量に対するオリゴ糖の量はオリゴ糖の種類、封入しょうとする抗原の種類、リボソームの組合せ構造等により異なるが、一般に、リボソームを構成する脂質 l mgに対して 5 jtt g〜り O O jU gで ¾)る。

本発明で用いるリボソームは、多重層タイプ（multilamella vesicle) であつてもよく、また単層タイプ（unilamella vesicle) であってもよい。これらは既知の常法に従って調製することができ、また常法に従って一方のタイプを他方のタイプに、例えば多重層タイプのリボソームを単層タイプのリボソームに転換することもできる。本発明で用いるリボソームの粒径は特に限定されないが、必要により常法に従って、例えば所望の孔サイズのフィルタ一により濾過することにより、粒径を整えることができる。

本発明で用いる投与物質は、好ましくは、薬物、マーカー、または造影剤である。薬物としては、抗癌剤、癌ワクチン、抗原ペプチド、免疫活性化剤（ピシパユールなど）、サイト力イン、血管新生阻害剤などが挙げられる。

本発明で用いることができる抗癌剤の種類は特に限定されず、ァルキル化薬（例えば、シクロホスフアミド、塩酸二ムスチン、ィホスフアミド、ラニムスチン、チォテパ、メルファラン、ブスルファン、ダカルパジン、力ルポコン、塩酸プロカルパジンなど）、代す拮抗薬（例えば、シタラビン、テガフール、シタラビンォクホスフアート、エノシタビン、リン酸フルダラビン、レポホリ ·^ "一トカルシゥム、塩酸ゲムシタビン、メトトレキサート、メルカプトプリン、カルモフール、 6 -メルカプトプリンリポシド、ヒドロキシカルバミド、フルォロウラシル、ホリナートカルシウム、ドキシフルリジンなど）、分子標的治療薬（チロシンキナーゼ阻害薬）又はアル力ロイド（硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチンなど）が挙げられる。

マーカーとしては、 G F Ρなどの蛍光タンパク質、フルォロ 'デォキシ 'グルコースなどが挙げられる。また、造影剤としては、非イオン性水溶性ョード造影剤、水溶性ョード造影剤、低浸透圧水溶性ョード造影剤などが挙げられる。

リポソームの量に対する投与物質の量は、投与したリボソーム組成物が腹腔内のマクロファージによって取り込まれて標的部位に送達されるという本発明の効果が得られる限り特に限定されず、投与物質の種類やリボソームの組成や構造等により適宜設定することができる。一般的には、投与物質の量は、リボソームを構成する脂質 l mg当たり 1 μ g〜l 0 Ο μ gである。

本発明のリボソーム組成物は、所望により薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。担体としては，滅菌水、緩衝液又は食塩水を用いることができる。また、本発明のリボソーム組成物は、所望により塩類、糖類、蛋白質、澱粉、ゼラチン、植物油おょぴポリエチレンダリコール等を含んでいてもよレ、。

本発明のリボソーム組成物の投与経路は特に限定されないが、好ましくは腹腔内に投与することができる。本発明のリボソーム組成物の投与量は、投与物質の種類、投与経路、症状の重篤度、患者の年齢おょぴ状態、副作用の程度等により変動するが、一般に、 0 . 1〜1 0 O m g Z k g Z日の範囲である。

本発明のリボソーム組成物を投与する場合、磁性化合物を封入したオリゴ糖被覆リボソームと一緒に組み合わせて投与することもできる。本発明で用いる磁性化合物としては、磁界下で発熱または振動をするような磁性微粒子を用いることが好ましい。この場合、オリゴ糖被覆リボソームと抗癌剤とを含むリボソーム組成物と、オリゴ糖被覆リボソームと磁性化合物とを含むリポソーム組成物とを混合して得られる混合物を生体に投与することができる。この場合、大網に取り込まれた当該リポソ一ム組成物を貪食したマクロファージから、外部磁場をかけることにより抗癌剤を放出させることができ、これにより、この部位に転移している腫瘍組織を効率的に抑制することが可能になる。

次に本発明のドラッグデリバリーリポソーム組成物の利用方法について説明する。

( 1 ) 腹腔内マクロファージを運ぴ屋とした、腹腔内節外性リンパ組織への抗癌剤のドラッグデリパリ一システム

M 3リボソーム（F I T C— B S Aを封入）を腹腔内に投与すると、時間経過にともない大網及び腸管膜リンパ組織（乳斑）へ集積してくる。腹腔内の免疫系を破綻させたマウスでは、リボソームが脾臓へ一部送達されるが、そうでない場合には、脾臓に存在するマクロファージへの取り込みはほとんど見られない。ゆえに、このリボソームに抗癌剤を封入すると、腹腔内リンパ節に生じた転移初期病変に抗癌剤を集積して働かせることが可能となる。有効な抗癌剤は、強い副作用を持つことが多く、この点を改善するために種々のドラッグデリバリーシステムが考案されている。抗腫瘍効果は一般に腫瘍内の薬剤濃度に依存しているので、 M 3リボソームを用いることで腫瘍局所に集積できる技術は、抗癌剤デリバリーシステムとして広く利用できる。本発明のシステムは、以下の 3つの免疫学的機序に基づくステップに基づいている。

( i ) 表面にマンノースを抱合した M 3リボソームは、会合したマクロファージによって特異的、迅速に貪食されリソソームへ蓄積される。

( i i ) マンノース受容体を介した細胞内取り込みは、マクロファージを活性化する。この活性化によって、マクロファージは抗原提示するために領域リンパ節辺縁洞に集積する。

( i i i ) リンパ節に到達したマクロファージは、リソソームで消化しきれないものを接着面細胞外へ排出する。

この方法を用いることで、効率よく高濃度の抗癌剤を腫瘍局所に集積でき、集積後は長時間にわたり緩やかに抗癌剤がマク口ファージから排出されることで、腫瘍局所のみを長時間抗癌剤に曝露させることが可能である。さらに集積したマクロファージに熱等のコントロールされたストレスを体外から与えることで、積極的かつ能動的に排出させることができる。

( 2 ) 腹腔内マクロファージを運ぴ屋とした、腹腔内節外性リンパ組織へのがんワクチンデリバリーシステム

オリゴマンノース被覆リボソームの使用は、癌ワクチンにも応用できる技術である。癌ワクチンの効果は、いかに効率よく癌抗原を抗原提示細胞に抗原情報をインプットし、より効果的に癌細胞を攻撃させる免疫活性を誘導できるかという点が重要であると考えられている。この点において、オリゴマンノース被覆リポソームに癌抗原と免疫賦活剤を封入し、腹腔内に散布すると、これらの薬剤はマクロファージによって送達され、癌の転移巣となる領域リンパ組織に到達し、局所での免疫活性を亢進させることができる。これまでの癌免疫療法で問題となつていた、免疫反応の活性化が不十分であったことによるヮクチンの効果の弱さは、癌病巣局所での抗腫瘍免疫活性化によつて改善することができる。 ( 3 ) 蛍光物質などを封入したオリゴマンノース被覆リボソームによる初期腹腔. 内転移危険部位の検出

R T— P C R法を用いた高感度の検出法によって腹腔內遊離癌細胞の存在が確かめられ、腹膜微小転移の可能性が高いと判断された場合でも生存率は 5 0 %程度である。このことは、腹膜微小転移局所の特定ができずにいることと無関係ではない。オリゴマンノース被覆リボソームを取り込んだマクロファージの集積場所と癌細胞の微小転移の生じる場所が同じであるという事実から、蛍光タンパク質などを術中でも認識容易な物質を封入したリボソームを術前 2 4時間前に投与することにより腹膜微小転移の高発部位を検出することが可能であり、予防的に最小限の侵襲で切除することが可能となる。

( 4 ) 他の応用

(A) 癌リンパ節転移に対する治療への応用

近年増加している乳癌では、リンパ節転移が患者予後に大きく影響する一方、広範なリンパ節廓清でも予後が改善されないことが理由となり、主たる治療法は縮小手術と化学療法の組み合わせに移行しつつある。乳癌では、腋下、鎖骨上窩、傍胸骨リンパ節を領域リンパ節としているので、これらからの再発が間々みられる。抗癌剤を入れた M 3リボソーム、もしくは癌免疫療法として癌抗原と免疫賦活剤を入れた M 3リボソームを、手術後病巣近傍へ注入することで、マクロファージにより領域リンパ節への効果的な薬剤送達が期待され、薬物療法のさらなる効果が期待される。この他にも同様の機序に基づいて、リンパ節好転移癌であるメラノーマ、甲状腺癌、肺癌の治療にも適応できる。

(B ) 血液系腫瘍への適応

血液系腫瘍では、単核球、マクロファージ系の分化を示す腫瘍が治療適応対象となる。本発明の M 3リボソームに入れた抗癌剤を分子標的性の高いものとすれば、腫瘍以外のマクロファージに取り込まれた場合でも、副作用を軽減することができ、腫瘍細胞に限った薬効を期待できる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によつて限定されるものではない。実施例

実施例 1：オリゴ糖被覆リボソームの製造方法およぴ薬物、マーカー又はまたは、造影剤の封入方法

以下の方法により、マンノペンタオース（M5) (化 1に示した化合物）又はマンノトリオース（M3) (M a n a 1→ 6 (M a n a 1→ 3 ) Ma nという構造を有するマンノトリオース（Ma n 3) ) と、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DPPE)とを還元アミノ化反応で化学的に結合させ M5 - DPPE および M3-DPPEを合成した。

先ず、マンノペンタオース（M5)又はマンノトリオース（M3) 2. 5111§に6 00 μΐ の蒸留水を加えて攪拌溶解してオリゴ糖溶液を調製した。次に、クロ口ホルム /メタノール（1 : 1、体積比）混合液に DP P Eを 5 m g/m lの濃度で溶解して D P P E溶液を調製した。また、メタノールに、 NaBH₃CNを 1 0mg /m 1の濃度に溶解して NaBH₃CN溶液を調製した。前記オリゴ糖の各溶液 6 0 0 μ 1に前記 D P P E溶液 9. 4m 1および前記 NaBH₃CN溶液 lmlを加えて攪拌混合した。この反応混合液を 6 0°Cにて 1 6時間インキュベートし、人工糖脂質を生成せしめた。合成した人工糖脂質は HPLCを用い高純度に精製した。

TRITCで標識されたタンパク質（実施例 2) 又は FITCあるいはローダミンで標識されたタンパク質（実施例 3) を封入したリポ^一ムは、以下のようにして作製した。

先ず、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC)、コレステロールおよぴ人ェ糖脂質（M5-DPPEまたは M3-DPPE)を 1： 1： 0.1で混合したクロ口ホルムノメタノール溶液もしくはエタノール溶液をなし型フラスコにいれ、ロータリーエバポレ一ターで減圧乾固し脂質フィルムを作製した。次いで、 TRITC で標識されたタンパク質（実施例 2)又は FITCあるいはローダミンで標識されたタンパク質（実施例 3) を含む PBS溶液（5 mg/ml) 0.3 m 1を脂質フィルムに加え、ボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌し、 M5- DPPE被覆リボソームまたは M3- DPPE被覆リボソームを作製した。 TRITCで標識されたタンパク質又は FITCあるいはローダミンで標識されたタンパク質としては、 FITC-BSAまたは TRITC - BSAを使用した。その後、リボソームを PBSで数回洗浄し、リボソームに封入されていない可溶性の物質を遠心により取り除いた。さらにこのリボソームの粒径を Ι μ ηιのフィルターを用いて整えた。封入タンパク質量はタンパク質定量により、またリポソ一ムの脂質組成比およぴ薬物は HPLCによって定量した。実施例 2 ：マクロファージへの取り込みの評価方法と簡単な結果の説明

TRITCで標識された BSAを封入した M5- DPPE被覆リボソームまたは M3 - DPPE被覆リボソーム（コレステロールとして 100マイクログラム）をマウス腹腔内に投与し、 3 0分、 6 0分、 1 2 0分、 1 8 0分後に腹腔内細胞を常法により回収した。回収した細胞を FITCで標識された抗 CD 1 l c抗体あるいは F4/80で染色し、その後 FACS を用いて細胞に取り込まれたローダミンおょぴ細胞表面抗原（FITC) の蛍光強度を解析した。

図 1は M3- DPPE被覆リボソームと M3- DPPEで被覆していないリボソームを投与し 1時間後に細胞を回収し腹腔内細胞への取込みを観察したものである。 M3- DPPE 被覆リボソームを投与した場合マクロファージのマーカーである F4/80で染色される細胞の 78%が TRITC の強い蛍光を持っていることから、マクロファージに TRITCで標識されたタンパク質を封入した M3- DPPE被覆リボソームが取り込まれたことが分かる。一方 M3- DPPEで被覆していないリボソームを投与した場合はほとんど取込みが見られない。図 1下段で示したように M3-DPPE被覆リボソームはマクロファージに顆粒状に取り込まれている。

実施例 3 ：マクロプアージまたはリボゾームの標的部位への集積の評価方法と簡単な説明

FITCあるいはローダミンで標識されたタンパク質を封入した M3- DPPE被覆リポゾーム 100マイクログラム（コレステロール換算）を生理食塩水で希釈し、総量 0. 5 ミリリツトルをヌードマウス腹腔内に接種した。その後、経時的（3 時間、 6 時間、 12時間、 24時間後）にマウスを屠殺し、観察した。マウスを開腹後、青色光（150Wハロゲン光源， LGPS- 2に 420-480の band pass filterを装着したもの）をマウス腹腔内の大網を含む上腹部に照射し、黄色の filter (500nm以上の波長域の可視光を通す long pass filter) を装着した実体顕微鏡（オリンパス GFP専用チェッカー， SZ40- GFP) 下に暗視野で大綱への M3 リボゾームの集積を緑色

(FITC)としてデジタルカメラを介してパソコンに取り込み評価した。

ローダミンの場合、 150Wハロゲン光源に、バンドパスフィルター 545- 580を用い、吸収フィルタ一としてロングパスフィルター（5 9 O nm以上）を用いて観察した。図 2は大網への M³-DPPE被覆リボソームの集積を経時的にみたものである。 3 時間後にはすでに集積が認められ、 1 2時間後に最大集積を示し、その後 2 4時間まで集積が認められた。節外性リンパ組織が低形成である γ δ Τ細胞欠失マウスではほとんど集積が認められないことから、 Μ3 - DPPE被覆リボソームが節外性リンパ組織に集積していることが分かる。一方 M3-DPPEで被覆していないリポソームでは集積はほとんど見られなかつた。実施例 4 ：抗癌剤封入リボソームと磁性微粒子封入リボソームによる胃がん腹膜転移の制癌効果確認実験

( 1 ) 抗癌剤封入糖鎖被覆リボソームと磁性微粒子封入糖鎖被覆リボソームの混合投与による大綱へのリボソーム集積

抗癌剤封入糖鎖被覆リボソーム（120 g/ml of 5FU, 2 mg/ml of cholesterol) および磁性微粒子封入糖鎖被覆リボソーム（1. 5 mg/ ml of magnetite, 2 mg/ml of cholesterol) をそれぞれ調整し、以下に示す比率で混合し、マウス腹腔内に投与した。 2 4時間後、マウスより大網を摘出し、そこに含まれる 5FUおよぴ鉄ィォンを測定した（図 3 )。

A： 240 gのコレステロールを含む M3/5- FU 20 μ gのコレステ口一ノレを含む M3/ML

B ： 320 ^ gのコレステロールを含む M3/5 - FU

40 gのコレステロールを含む M ML

C： 480 ^ のコレステロールを含む M3/5-FU

20 gのコレステロールを含む M3/ML

D： 480 ^^のコレステロールを含む M3/5- FU

40 gのコレステロールを含む M3/ML

5— F U濃度： 120 μ g/ml； M3/ML濃度： 1. 5mg/ml；コレステロール： 2mg/ml その結果、抗癌剤封入糖鎖被覆リボソームを cholesterol 磁性微粒子封入糖鎖被覆リボソームを 20 _§ cholesterolで混合して投与した場合がもっとも集積効率がよいことが判明した。

( 2 ) 上記条件検討ののち、制癌効果の検討を行った。

まず、 GFPを導入した胃がん細胞株 MKN 2 8を 3 X 10⁶ ヌードマウスの腹腔に投与した。 2 4時間後 GFPの蛍光を指標として癌細胞の生着を確認し、生着が確認されたマウスの腹腔に抗癌剤封入糖鎖被覆リボソームを 240 g cholesterol, 磁性微粒子封入糖鎖被覆リボソームを 20 μ _§ cholesterolで混合して投与した。リボソームを投与 2 4時間後、交盤磁界照射装置（第一高周波製)、高周波誘導加熱装置（富士電波ェ機株式会社製。型式 F1H- 153HH、出力： 15Kw、 400KHz) で 3 0分間交盤磁界照射を行った。その後 1週間経過した後、マウスを開腹しがんの增殖を GFPの蛍光を指標に観察すると共に、 J®瘍の重量を測定した。上記の方法及ぴ結果を図 4〜図 6に示す。腫瘍重量は、対照マウスでは 3 6 . 6 m gであつたのに対し、抗癌剤 (5FU) で処置したマウスでは 5 . 2 m gであり、本発明のリポソーム組成物の投与により腫瘍重量は顕著に抑制された。また、 GFP の蛍光観察からも抗癌剤（5FU) で処置したマウスではがんの増殖は抑制されていた。産業上の利用可能性

本発明により、抗癌剤などの投与物質を標的部位に効率良く集積させ、放出させることができるドラッグデリノリーリポソーム組成物を提供することが可能になった。

Claims

請求の範囲

1 . オリゴ糖被覆リボソームと投与物質とを含む、投与物質を標的部位に送達するためのドラッグデリバリーリボソーム組成物。

2 . オリゴ糖がオリゴマンノスである、請求項 1に記載のドラッグデリパリーリボソーム組成物。

3 . オリゴ糖がマンノペンタオース又はマンノトリオースである、請求項 1 又は 2に記載のドラッグデリパリーリポソーム組成物。

4 . 投与物質が、薬物、マーカーまたは造影剤である、請求項 1から 3の何れかに記載のドラッグデリバリーリボソーム組成物。 '

5 . 薬物が抗癌剤である、請求項 4に記載のドラッグデリバリーリボソーム組成物。

6 . 腹腔内に投与され、腹腔内のマクロファージによって取り込まれて標的部位に送達される、請求項 1から 5の何れかに記載のドラッグデリバリーリポソーム組成物。

7 . 標的部位が、腹腔内の癌の初期腹腔内転移病巣である大網又は腸管膜の節外性小リンパ節である、請求項 1から 6の何れかに記載のドラッグデリノリーリポソーム組成物。

8 . 磁性化合物を封入したオリゴ糖被覆リボソームと一緒に組み合わせて投与される、請求項 1カゝら 7の何れかに記載のドラッグデリバリーリポソーム組成物。