JP2001081044A - リポソームおよびそれからなるワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質を抗原提示細胞中で多量に発現す
ることができる遺伝子ワクチンを提供する。 【解決手段】 ２〜１１個の糖残基から成り、抗原提示
細胞由来のレクチンに結合するオリゴ糖を表面に有し、
かつ核酸を有するリポソームを遺伝子ワクチンの有効成
分として用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａなどの核酸を主成分とするいわゆる遺伝子ワクチン
（以下、ＤＮＡワクチンということがある）に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、ワクチンや免疫療法剤では、
病原体の抗原タンパク質を用いたワクチンやこれにさら
に免疫原性を高めるための補助剤としてアジュバントを
混合した製剤（以下、コンポーネントワクチンとい
う）、あるいは病原体を弱毒化させた生ワクチンなどが
実用化されている。近年、抗原タンパク質をコードする
ある種の核酸を動物に接種すると、その個体中で抗原タ
ンパク質が発現し、その個体が抗原タンパク質に対する
免疫応答を起こすことが明らかになっている。こうした
ことから、核酸そのものを有効成分とする、新たなワク
チンの可能性が期待されている。しかしながら、核酸を
そのまま動物に接種しても、核酸が発現する抗原タンパ
ク質量は微量でありワクチン効果が得られることはほと
んどない。ワクチン効果を得るためには、数１００μｇ
の多量のＤＮＡを頻回個体に接種する必要があるが、こ
うした多量のＤＮＡ接種は実用化に望ましい方向ではな
い。そこで、接種ＤＮＡ量を減らす検討が進められ、Ｄ
ＮＡを金やタングステン粒子のコロイドと混合して強力
な圧縮ガスを用いて接種する方法（ジーンガン法）や電
気的に細胞に穴を空けてＤＮＡを細胞内に導入する方法
（エレクトロポレーション法）が開発されているが、こ
れらの方法はいずれも特別な設備を必要とする。その
上、これらの方法で遺伝子が導入される細胞は、免疫担
当細胞にかぎらないため効率が悪いので、こうした機械
的手法は現実的ではない。そこで、より実用性を高める
ため、種々のサイトカイン遺伝子と抗原タンパク質をコ
ードするＤＮＡとを同時に接種して、サイトカインと抗
原タンパク質と共発現させ、これにより免疫原性を高め
る検討も行われている。一方、抗原タンパク質は一般に
抗原提示細胞に取り込まれ、その中でタンパク質のプロ
セシングを受けたのち、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）
分子とともにその細胞表面に表現されて、Ｔ細胞に認識
される必要があることが知られている。上述した方法で
は、抗原提示細胞に選択的にＤＮＡが取り込まれないと
推測され、実際、Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏ ＶＦらは
抗原提示細胞であるデンドリティック細胞にＤＮＡが効
率よく取り込まれないことを報告している（Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，５，７００−７０７（１９９９））。
ＤＮＡが大量に体内に入ると、抗ＤＮＡ抗体が産生さ
れ、新たな病気を引き起こす懸念もあるため、ＤＮＡワ
クチンの接種ＤＮＡ量はできる限り減らすことが求めら
れている。

【０００３】ところで、コンポーネントワクチン用のア
ジュバントとしては、例えば、結核菌の死菌菌体と鉱物
油を混合してなるフロインド・コンプリート・アジュバ
ントや鉱物油からなるフロインド・インコンプリート・
アジュバントなどの鉱物油を用いるアジュバント、燐酸
化アルミニウムアジュバントあるいは水酸化アルミニウ
ムを主成分とするアラムアジュバントのような無機アジ
ュバントなどが知られている。アジュバントは接種する
動物に対してより毒性の低いものであることが望まれ、
新たに毒性のないコンポーネントワクチン用のアジュバ
ントとしてある種のリポソームが開発された（特許第２
８２８３９１号公報）。リポソームをＤＮＡワクチン用
のアジュバントとして使用する例は、Ｖａｃｃｉｎｅ
１４、７４７（１９９６）などにおいて検討されている
が、リポソームのＤＮＡ含有量が少なく、必然的に細胞
へ移入できるＤＮＡ量も限られてしまい、未だ実用化レ
ベルには到達していなかった。また、免疫増強作用を高
めることができるかどうかまでは確認されていなかっ
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＤＮＡワクチンとし
て、効率よく細胞へＤＮＡを導入するために、金コロイ
ド粒子を担体として用いることが提案されている（特開
平１１−９２４０６号公報）。しかしながら、本発明者
らの検討の結果、十分な再現性が得られず、ワクチンと
しての実用性にかけていることが判った。

【０００５】かかる従来技術のもと、タンパク質を抗原
提示細胞中で多量に発現することができる遺伝子ワクチ
ンを得るべく鋭意検討した結果、コンポーネントワクチ
ン用のアジュバントとして知られているリポソームを遺
伝子ワクチンに適用すると、効率的に免疫誘導が得られ
ることがわかり、本発明を完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、２〜１１個の糖残基から成り抗原提示細胞由来のレ
クチンに結合するオリゴ糖を表面に有し、かつ核酸を有
するリポソームが提供され、また当該リポソームを含有
する遺伝子ワクチンが提供される。

【０００７】

【発明の実施の態様】本発明のリポソーム（以下、核酸
含有リポソームということがある）は、特許第２８２８
３９１号公報記載のリポソームにＤＮＡまたはＲＮＡな
どの核酸を含むものである。以下に当該公報記載のリポ
ソームを簡単に説明する。当該リポソームはその表面
に、抗原提示細胞由来のレクチンを結合することがで
き、且つ２〜１１個の糖残基から成るオリゴ糖を有して
いる。ここで、抗原提示細胞は、マクロファージ、デン
ドリティック細胞等を意味する。また、抗原提示細胞由
来のレクチンとは、上記のごとき抗原提示細胞の表面に
存在するマンノース・レセプター等を意味する。オリゴ
糖は、Ｄ−マンノース（Ｄ−Ｍａｎ）、Ｌ−フコース
（Ｌ−Ｆｕｃ）、Ｄ−アセチルグルコサミン（Ｄ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、Ｄ−ガラ
クトース（Ｄ−Ｇａｌ）、Ｄ−アセチルガラクトサミン
（Ｄ−ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−ラムノース（Ｄ−Ｒｈａ）
などの単糖がα１→２結合、α１→３結合、α１→４結
合、α１→６結合またはβ１→４結合等あるいはこれら
の組合せにより２〜１１個結合したものである。特に好
ましいオリゴ糖として、マンノビオース（Ｍａｎ２）、
マンノトリオース（Ｍａｎ３）、マンノテトラオース
（Ｍａｎ４）、マンノペンタオース（Ｍａｎ５）、マン
ノヘキサオース（Ｍａｎ６）、マンノヘプタオース（Ｍ
ａｎ７）、種々の混合オリゴ糖や、下式のＭ５およびＲ
Ｎなど特許第２８２８３９１号公報記載のものが挙げら
れる。

【０００８】

【化１】

【０００９】

【化２】

【００１０】(式中、α１→２結合しているＭａｎは、
それぞれ独立に存在していてもよく、存在していなくて
もよい。)

【００１１】上記のオリゴ糖は、いずれも１個の還元末
端アルデヒド基を有する。そこで、このアルデヒド基
を、オリゴ糖をリポソーム表面に導入するため、アミノ
基を有するリン脂質と反応させてシッフ塩基を形成し、
次にこのシッフ塩基を、常法に従って、還元、好ましく
は化学還元、例えばＮaＢＨ₃ＣＮにより還元することに
より、オリゴ糖と、脂質とを結合することができる（水
落次男、糖質工学、２２４−２３２頁、産業調査会バイ
オテクノロジー情報センター、１９９２）。このように
して得られた、オリゴ糖と脂質との結合物を、本発明に
おいては人工糖脂質と称する場合がある。

【００１２】リポソームを構成する脂質は、リポソーム
を構成するために知られている通常の脂質を単独でまた
は複数組合わせて使用することができる。そのような脂
質としては、例えば、卵黄、大豆、またはその他の動植
物などの天然物由来の脂質やこれらを水素添加によって
不飽和度を低下したもの、あるいは化学合成したものが
挙げられる。より具体的には、コレステロール（Ｃｈｏ
ｌ）、３β−[Ｎ−(ジメチルアミノエタン)カルバモイ
ル]コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（トリメ
チルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール
（ＴＣ−Ｃｈｏｌ）などのステロール類；ジパルミトイ
ルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジス
テアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰ
Ｅ）などのホスファチジルエタノールアミン類；ジパル
ミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステア
ロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などのホスフ
ァチジルコリン類；ジパルミトイルホスファチジルセリ
ン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン
（ＤＳＰＳ）；ホスファチジン酸類、例えばジパルミト
イルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホ
スファチジン酸（ＤＳＰＡ）などのホスファチジルセリ
ン類等が挙げられる。これらの中でも、３β−[Ｎ−(ジ
メチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール（Ｄ
Ｃ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（トリメチルアンモニオエチル）
カルバモイルコレステロール（ＴＣ−Ｃｈｏｌ）のよう
な陽性荷電を有するステロール類は、ＤＮＡやＲＮＡな
どの核酸との親和性が高いため特に好ましい。

【００１３】陽性荷電を有するコレステロール類と荷電
のないコレステロールとを併用するのが好ましく、陽性
荷電を有するコレステロール類が、全コレステロール量
の５〜５０％、好ましくは１０〜３０％である場合、リ
ポソームが効率よくＤＮＡを有することができ、陽性荷
電を有するコレステロールの割合が多すぎるとリポソー
ムに毒性が出る場合がある。尚、ここで例示した化合物
名の後ろの（ ）内のアルファベットは、各化合物の略
号であり、以下これらの略号を使用する。

【００１４】リポソームは、公知の方法、例えばＤ．
Ｗ．Ｄｅｅａｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．Ｕｓｔｅｒ，“Ｌｉｐｏ
ｓｏｍｅ”ｅｄ．ｂｙ Ｍ．Ｊ．Ｏｓｔｒｏ，Ｍａｒｃ
ｅｌＤｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．Ｂａｓｅｌ，１
９８３，ｐ２７〜記載の方法（ボルテックス法および超
音波法）、エタノール注入法、エーテル法、逆相蒸発法
などが適用でき、これらを組合せることにより作製され
る。

【００１５】オリゴ糖をリポソームの表面に導入するた
めには、例えば、次の２つの方法のいずれかを用いれば
よい。前記の人工糖脂質が水溶性で有機溶剤に十分溶解
しない場合、例えば、前記のＲＮとＤＰＰＥとの結合物
（ＲＮ−ＤＰＰＥ）を用いる場合には、これらの水性溶
液を調製し、これを形成されたリポソームと混合して、
例えば４℃ないし室温において０．５〜１２０時間、例
えば約２４時間インキュベーションすればよい。

【００１６】他方、人工糖脂質が有機溶剤に溶解する場
合には、当該人工糖脂質を、リポソーム構成用脂質と共
に、リポソーム製造過程において前記のごとき有機溶剤
に溶解し、以後、常法に従ってリポソームを形成すれば
よい。リポソームの量に対するオリゴ糖の量はオリゴ糖
の種類、封入しようとする核酸の種類、リポソームの組
合せ構造等により異るが、一般に、リポソームを構成す
る脂質１ｍｇに対して０．５μｇ〜５００μｇである。
尚、オリゴ糖がリポソーム表面に結合していることは、
糖に該当するレクチンを添加してリポソームの凝集反応
で調べることができる。

【００１７】本発明のリポソームは、多重層タイプ（ｍ
ｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）であっても
よく、また単層タイプ（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓ
ｉｃｌｅ）であってもよい。これらは既知の常法に従っ
て作製することができ、また常法に従って一方のタイプ
を他方のタイプに、例えば多重層タイプのリポソームを
単層タイプのリポソームに転換することもできる。本発
明のリポソームの粒径は特に限定されないが、必要によ
り常法に従って、例えば所望の孔サイズのフィルターに
より濾過することにより、粒径を整えることができる。

【００１８】本発明のＤＮＡ含有リポソームを得るため
には、上述してきたリポソームに、発現させたいタンパ
ク質をコードする任意の核酸、すなわちＤＮＡまたはＲ
ＮＡなどの遺伝子を封入あるいは表面結合させる必要が
ある。ＤＮＡやＲＮＡは断片でもよいし、プラスミドＤ
ＮＡのような環状構造であってもよい。例えばＤＮＡを
用いる場合は、プロモーター配列・遺伝子配列・終了配
列（転写終了、ポリＡ付加シグナルを含む）が存在する
ことが望ましい。ＲＮＡの場合は細胞内で安定に存在す
るためのキャップ構造、ポリＡ配列、翻訳開始コドンよ
り始まり、タンパク質部分をコードするＲＮＡを含んだ
ＲＮＡ分子であることが望ましい。このような遺伝子と
して、例えば病原体の抗原遺伝子、例えばヒト免疫不全
症ウイルス（ＨＩＶ）のｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝
子、インフルエンザウイルスのＨＡ、Ｍ遺伝子、ニュー
カッスル病ウイルスのＨＮ、Ｆ遺伝子、マラリア原虫・
結核菌などの外被タンパク質遺伝子等の全部あるいはそ
の一部の遺伝子を含む核酸が挙げられる。また、宿主由
来の遺伝子、例えばサイトカインの遺伝子のような機能
性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。

【００１９】これらのＤＮＡやＲＮＡの調製方法として
は、従来からの方法、例えば、ウイルス感染細胞からウ
イルスＤＮＡやＲＮＡを調製する方法などが挙げられ
る。宿主由来の遺伝子であれば、宿主動物の染色体ＤＮ
Ａから直接にあるいは目的とする遺伝子の相補的ＤＮＡ
から調製することができる。プラスミドＤＮＡの場合
は、形質転換された大腸菌等の細菌より大量に調製する
ことができる。

【００２０】リポソームの量に対する核酸の量は、非常
に重要であり、核酸の種類、リポソームの組成や構造等
により異るが、一般にリポソームを構成する脂質１ｍｇ
当り０．１μｇ〜５００μｇである。リポソームが核酸
を有していることは核酸の紫外部吸収あるいは核酸と特
異的に結合する試薬、例えばエチジウムブロマイド、あ
るいは標識された核酸、例えばメチルグリーン標識のＤ
ＮＡを用いて調べることができる。

【００２１】本発明の遺伝子ワクチンは、上述した、核
酸が結合したリポソームでさらに人工糖脂質を含有する
ものであり、培養細胞に遺伝子を導入したり、ヒト・動
物に注射・飲水などにより投与することにより個体の細
胞内で遺伝子を発現させることができる。培養細胞に遺
伝子を導入するためには、本発明の遺伝子ワクチンを細
胞培養用の培地など適当な液体にけん濁した形で培養細
胞に混合すればよい。また、動物への投与は生理食塩水
などのバッファーにけん濁し、それを皮下、皮内、筋肉
などに注射する、あるいは飲水・食物に混合して経口投
与する方法をとればよい。そのような方法で個体に取り
込まれた遺伝子は抗原提示細胞に効率よく取り込まれ、
それらの細胞内で遺伝子が発現し、その結果、液性・細
胞性免疫を誘導することができ、ワクチンとして利用さ
れることとなる。

【００２２】

【実施例】以下に実施例および実験例を挙げて本発明を
説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００２３】（参考例１）人工糖脂質の調製 α１→３結合したマンノビオース（Ｍａｎ２）、Ｍａｎ
α１→６（Ｍａｎα１→３）Ｍａｎという構造を有する
マンノトリオース（Ｍａｎ３）、Ｍ５（化１に示した化
合物）、およびＲＮ（化２に示した化合物）２．５ｍｇ
に６００μlの蒸留水を加えて攪拌溶解してオリゴ糖溶
液を調製した。

【００２４】次に、クロロホルム／メタノール（１：
１、体積比）混合液にＤＰＰＥを５ｍｇ／ｍｌの濃度で
溶解してＤＰＰＥ溶液を調製した。また、メタノール
に、ＮaＢＨ3ＣＮを１０ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解してＮ
aＢＨ_３ＣＮ溶液を調製した。前記オリゴ糖の各溶液６
００μｌに前記ＤＰＰＥ溶液９．４ｍｌおよび前記Ｎa
ＢＨ_３ＣＮ溶液１mlを加えて攪拌混合した。この反応混
合液を６０℃にて１６時間インキュベートし、人工糖脂
質を生成せしめた。この反応混合液をシリカゲルカラム
およびＣ１８逆相カラムにより精製することにより人工
糖脂質（Ｍａｎ２−ＤＰＰＥ、Ｍａｎ３−ＤＰＰＥ、Ｍ
５−ＤＰＰＥおよびＲＮ−ＤＰＰＥ）を得た。

【００２５】（参考例２）人工糖脂質含有リポソームの
作製 ２μｍｏｌのＤＰＰＣを含むクロロホルム・メタノール
（２：１、体積比、以下Ｃ／Ｍという）溶液と、１μｍ
ｏｌのＣｈｏｌ、ＤＣ−ＣｈｏｌまたはＴＣ−Ｃｈｏｌ
のＣ／Ｍ溶液とを、それぞれ２：１の割合で混合し合計
３ｍｌとした。これらを、それぞれ２５ｍｌの梨型フラ
スコに取り、エバポレーターに梨型フラスコを接続さ
せ、４０℃で減圧下、Ｃ／Ｍを蒸発除去し、混合脂質膜
Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣおよび
ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣを作製した。同様に、１μｍ
ｏｌのＣｈｏｌまたはＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ
溶液およびＤＰＰＣ ２μｍｏｌとＭ５−ＤＰＰＥ
０．２μｍｏｌを用いて混合脂質膜Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ
／Ｍ５−ＤＰＰＥ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５−
ＤＰＰＥおよびＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５−ＤＰ
ＰＥを作製した。

【００２６】フラスコの底に薄い脂質膜ができるが、こ
れにクロロホルムを加えて膜を一旦溶かした後に、再度
溶媒を蒸発除去した。この操作をさらに２〜３回繰り返
すと、きれいな脂質の薄膜ができた。デシケーターにフ
ラスコを１時間以上入れて完全に溶媒を除き、リン酸塩
バッファー（ｐＨ６．５、以下ＰＢＳという）１ｍｌを
加え、ボルテックス法でリポソームを作製後、超音波を
かけて粒径を小さくした。

【００２７】（実施例１）ＤＮＡ含有リポソームの調製
と確認 （１）ＤＮＡ含有リポソームの調製 結合用ＤＮＡとしてメチルグリーン標識ＤＮＡ(シグマ
社製)を用いた。参考例で得たリポソームのＰＢＳ溶液
１ｍｌのうち、５０μｌに対して、メチルグリーン標識
ＤＮＡ ５０μｌを加えて３０分間室温で放置後、２０
℃ ９，０００×ｇで３０分間遠心すると、ＤＣ−Ｃｈ
ｏｌおよびＴＣ−Ｃｈｏｌを用いた場合は、メチルグリ
ーンの色素が沈殿したリポソームに付着していたため
に、ＤＮＡ−リポソーム複合体（ＤＮＡ含有リポソー
ム）の形成が確認された。

【００２８】（２）ＤＮＡ含有リポソームの構成成分の
確認 上述の沈殿と、リポソーム ５０μｌをそれぞれＣ／Ｍ
２００μｌに溶解した後、遠心してＤＮＡを沈殿除去
後、真空乾燥した。次いで、それぞれをクロロホルム／
メタノール／水（１０／１０／３；体積比）溶液４０μ
ｌに溶解させそのうちの２０μｌをＴＬＣプレートにス
ポットし、クロロホルム／メタノール／水（４５／４５
／１０；体積比）で展開した後オルシノール硫酸法でＭ
５−ＤＰＰＥがＤＮＡ含有リポソーム形成後も存在して
いるかを調べた。ＴＬＣによる展開法では、人工糖脂質
や各脂質はそれぞれ違うＲＴ値を持っているため、リボ
ソームをＴＬＣ展開することで、各リボソームごとに目
的の人工糖脂質や脂質が含まれていることが確認でき
る。ここでのＴＬＣ展開の結果、いずれのリボソーム
も、目的の人工糖脂質や脂質が、ＤＮＡ複合体を形成し
た後も存在していることが確認された。

【００２９】（３）ＤＮＡ含有リポソーム表面に人工糖
脂質が含まれていることの証明 実施例３で作製したＤＮＡ含有リポソーム溶液の一部を
採り、そのまま、あるいはＭ５と反応するコンカナバリ
ンＡ溶液を加えてから９６穴の凝集用プレートに入れ、
室温放置後、凝集反応の有無を調べた。その結果、Ｍ５
−ＤＰＰＥを加えて作製したＤＮＡ−リポソームでのみ
コンカナバリンＡとの凝集反応が観察され、リポソーム
表面に人工糖脂質であるＭ５−ＤＰＰＥの糖鎖が露出し
ていることが確認された。

【００３０】（実施例２）ＤＮＡ含有量の確認 ＤＣ−ＣｈｏｌとＣｈｏｌの組成物のＤＣ−Ｃｈｏｌの
ＤＣ−ＣｈｏｌとＣｈｏｌとの合計量（１μｍｏｌ）に
対する比率が表１記載の値となるように、ＤＣ−Ｃｈｏ
ｌとＣｈｏｌの比を変えて、それぞれ調製した。これと
は別にＤＰＰＣ２μｍｏｌとＭ５−ＤＰＰＥ ０．２μ
ｍｏｌの比にて混合した組成物を調製した。両組成物を
混合し、脂質フィルムを作り、リポソームを作製した。
各組成のリポソームを全量１．２ｍｌとしその１００μ
ｌと１ｍｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−βＧａｌプラスミド（フ
ァルマシア社製）１００μｌを混合して１０，０００ｒ
ｐｍ、４℃、３０分間遠心し、上清（２００μｌ）と沈
殿に分けた。沈殿中にＤＮＡ含有リポソームが形成され
ている。この沈殿のＤＮＡ量を測定するため、沈殿を１
％ＳＤＳを含むＰＢＳ４００μｌに溶解し、３分間煮沸
後、９，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心し上清４００
μｌを回収した。ＤＮＡ量の定量は２６０ｎｍの吸光度
を測定して計算した。

【００３１】

【表１】

【００３２】この結果よりリポソームがＤＮＡを含んで
いることが判り、特にＤＣ−Ｃｈｏｌ含量が１２．５％
以上ではリポソーム中に極めて効率よくＤＮＡが取り込
まれていることがわかる。

【００３３】（実施例３）ＤＮＡ含有リポソームの抗原
提示細胞内へのＤＮＡ移入・発現効果の測定 参考例２で作製したリポソームＣｈｏｌ／ＤＰＰＣ、Ｄ
Ｃ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ、
ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５−ＤＰＰＥ、およびＴ
Ｃ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５−ＤＰＰＥからそれぞれ
１０μｌ採り、ｐＣＭＶ−βＧａｌプラスミド ４μg
を混合して複合体を作った。同様にリポソーム５μｌに
前記プラスミド２μｇ、あるいはリポソーム３μｌに前
記プラスミド１μｇを混合して複合体を作製した。

【００３４】Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウスの腹腔細胞約４Ｘ１
０^５をシャーレにまき、１時間後シャーレ中の浮遊細胞
を捨ててシャーレに接着した細胞をマクロファージとし
て使用した。このマクロファージ細胞と上記のｐＣＭＶ
−βＧａｌプラスミド結合リポソームを混合し、３７
℃、５％ＣＯ_２存在下５時間培養した後培地を交換しさ
らに４８時間培養した。ついで、２％パラホルムアルデ
ヒド５００μｌを加えて１０分間室温で放置して固定し
た後、２ｍｇ／ｍｌのＸｇａｌを加えて遮光して反応さ
せ、染色細胞をカウントしＤＮＡ移入・発現細胞とし
た。

【００３５】

【表２】

【００３６】注）Ａ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５
-ＤＰＰＥ使用時の陽性細胞数 Ｂ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ使用時の陽性細胞数

【００３７】なお、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５-
ＤＰＰＥとＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣを使用した実験の
場合も、上記と同様、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５
−ＤＰＰＥではβ−Ｇａｌ発現マクロファージ細胞数の
増加結果が得られたが、ＴＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣを使
用した場合には、β−Ｇａｌ発現マクロファージ細胞数
の増加が認められなかった。また、Ｍ５−ＤＰＰＥのか
わりに、参考例１で得られた人工糖脂質Ｍａｎ２−ＤＰ
ＰＥ、Ｍａｎ３−ＤＰＰＥあるいはＲＮ−ＤＰＰＥを用
いても上記と同様の結果が得られた。

【００３８】同時にマウス３Ｔ３細胞（上皮系細胞）を
使用し、同じ実験を行った。その結果、リポソームとし
てＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣ／Ｍ５−ＤＰＰＥとＤＣ−
Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＣを使用した場合の陽性細胞数に顕著
な差は認められず、陽性細胞数は１００個程度と上表の
Ｂカラムと同程度の細胞数であった。したがって、本発
明によるリポソームは抗原提示細胞において通常の上皮
系細胞以上に効率よくＤＮＡを細胞内に移入・発現でき
ることが明らかとなった。抗原提示細胞以外の細胞にＤ
ＮＡが移入されても、目的とする免疫誘導は得られな
い。抗原提示細胞内で抗原タンパク質が発現すると免疫
誘導は起こる。従って、本発明のリポソームをＤＮＡワ
クチンとして用いると、選択的に抗原提示細胞にＤＮＡ
が移入されるため、ＤＮＡワクチンの接種量を少量に抑
えても十分な効果の得られることが判る。

【００３９】（実施例４）ＤＮＡ−リポソームのマウス
免疫試験 （１）ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＦ遺伝子
を持ったプラスミドｐＣＭＶ−ＮＤＶ−Ｆの作製 ＮＤＶのＦ抗原のｃＤＮＡがクローニングされたプラス
ミドｐＮＺ９８（特開平３−２７２８４）から制限酵素
ＢａｍＨＩの部分消化後、ＥｃｏＲＩで完全消化した
後、ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端としてア
ガロース電気泳動により、約１．７ｋｂｐのＮＤＶ−Ｆ
遺伝子断片を得た。一方、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔプラ
スミド（ストラタジーン社製）を制限酵素ＳａｃＩで消
化した後、ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して平滑末端と
し、上記ＮＤＶ−Ｆ遺伝子断片と結合してｐＣＭＶ−Ｎ
ＤＶ−Ｆを得た。

【００４０】ＤＣ−Ｃｈｏｌ ０．２５μｍｏｌとＣｈ
ｏｌ ０．７５μｍｏｌをとり、ＤＰＰＣ ２μｍｏ
ｌ、Ｍ５−ＤＰＰＥ ０．２μｍｏｌの比にて脂質フィ
ルムを作りＰＢＳを封入したリポソームを作製した。同
様にＤＰＰＣ ２μｍｏlとＤＣ−Ｃｈｏｌ ０．２５
μｍｏｌとＣｈｏｌ ０．７５μｍｏｌの比でリポソー
ムを作製した。これら２つのリポソームをそれぞれ全量
１．２ｍｌとしその１００μｌと１ｍｇ／ｍｌのｐＣＭ
Ｖ−ＮＤＶ−Ｆプラスミド１００μｌを混合して９，０
００×ｇ、４℃、３０分間遠心し、上清（２００μｌ）
と沈殿に分けた。沈殿中のＤＮＡ量を測定するため、沈
殿を１％ＳＤＳを含むＰＢＳ４００μｌに溶解し、３分
間煮沸後、９，０００×ｇ、４℃、３０分間遠心し上清
４００μｌを回収した。２６０ｎｍの吸光度を測定して
ＤＮＡ量を計算し、終濃度１μｇＤＮＡ／１０μｌリポ
ソームとした。以後、Ｍ５−ＤＰＰＥ含有リポソームで
ｐＣＭＶ−ＮＤＶ−Ｆプラスミドを含有するリポソーム
をＤＣ／Ｍ５-ＤＰＰＥ／Ｆ−ＤＮＡ、Ｍ５−ＤＰＰＥ
を持たないリポソームでｐＣＭＶ−ＮＤＶ−Ｆプラスミ
ドを含有するリポソームをＤＣ／Ｆ−ＤＮＡとし、Ｍ５
−ＤＰＰＥ含有リポソームでプラスミドを含有しないリ
ポソームをＤＣ／Ｍ５−ＤＰＰＥとした。

【００４１】（２）マウス免疫実験 ４週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌マウスを一群５匹で３群に分
け、１匹あたり５０μｌのＤＣ／Ｍ５-ＤＰＰＥ／Ｆ−
ＤＮＡリポソーム（１μｇＤＮＡ／１０μｌリポソー
ム）、ＤＣ／Ｆ−ＤＮＡリポソーム（１μｇＤＮＡ／１
０μｌリポソーム）、ＤＣ／Ｍ５−ＤＰＰＥリポソーム
を背部に１回皮下接種した。３週間後、各マウスから採
血し血清をプールして各血清の抗ＮＤＶ中和抗体価を測
定した。ＮＤＶに対する中和抗体価測定は、Ｍｏｒｇａ
ｎ等の方法（Ｍｏｒｇａｎ．Ｒ．Ｗ．，ｅｔ．ａｌ．Ａ
ｖｉａｎ Ｄｉｓ．，３６，８５８−８７０，１９９
２）に従った。

【００４２】

【表３】

【００４３】注 １００ＴＣＩＤ_５０のＮＤＶ Ｓａｔ
ｏ株を５０ＴＣＩＤ_５０に中和する血清希釈度。1群５
匹のプール血清での評価

【００４４】本発明によるＭ５−ＤＰＰＥを含むＤＮＡ
含有リポソームはマウスにおいて中和抗体の誘導を著し
く増強させることが明らかとなった。

【００４５】（実施例５）ＤＮＡ−リポソームの鶏免疫
試験 鶏免疫実験 １群１０羽の試験用のＳＰＦ鶏（Ｌｉｎｅ Ｍ、日本生
物科学研究所）が孵化したときに、実施例４で作製され
たＤＣ／Ｍ５-ＤＰＰＥ／Ｆ−ＤＮＡリポソーム（１μ
ｇＤＮＡ／１０μｌリポソーム）、ＤＣ／Ｆ−ＤＮＡリ
ポソーム（１μｇＤＮＡ／１０μｌリポソーム）、ＤＣ
／Ｍ５−ＤＰＰＥリポソームをそれぞれ一羽あたり５０
μｌ背部皮下に１回接種した。コントロールに使用した
市販ＮＤＶ生ワクチン（北里研究所）は４日齢の雛に用
法通り点眼接種した。接種４週後に強毒ＮＤＶウイルス
（Ｓａｔｏ株）を１０^４ＰＦＵとなるように右大腿部筋
肉内に攻撃した。攻撃後約２週間鶏の生死および発症の
有無を観察し、生存率で効果を確かめた。ＮＤＶウイル
スを攻撃する際に各鶏を採血し、取得した血清中のNDV
に対する中和抗体の検出を行った。中和抗体価測定は、
Ｍｏｒｇａｎ等の方法（Ｍｏｒｇａｎ．Ｒ．Ｗ．，ｅ
ｔ．ａｌ．Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．，３６，８５８−８７
０，１９９２）に従った。また、各群のＮＤＶ攻撃試験
結果は表４に、ＮＤＶに対する中和抗体価測定結果は表
５に示した。

【００４６】

【表４】

【００４７】

【表５】

【００４８】本発明によるＤＮＡ含有リポソームは接種
した鶏に対しＮＤＶの攻撃に対する感染防御を付与し、
さらに、Ｍ５−ＤＰＰＥを含むリポソームとすること
で、そのワクチン効果が著しく増強されることが明らか
となった。ＤＣ／Ｍ５−ＤＰＰＥ／Ｆ−ＤＮＡリポソー
ムを接種した鶏の血清の中和抗体価は１２８倍（１０羽
の血清をプールして測定）と、陰性コントロールに比べ
有意に高かった。これらの結果から本発明によるＭ５−
ＤＰＰＥを含むＤＮＡ−リポソムワクチンはＮＤＶに対
する感染防御能を接種鶏に付与していることが明らかと
なった。

【００４９】

【発明の効果】本発明のリポソームは免疫誘導のための
アジュバント活性を有し、且つ毒性およびそれ自体の抗
原性が低いので、ヒトあるいは動物に対して、ＤＮＡワ
クチンのアジュバントとして使用すれば、実用的なＤＮ
Ａワクチンが得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安田 斡司 神奈川県川崎市川崎区夜光一丁目２番１号 日本ゼオン株式会社総合開発センター内 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 CC06 DD63 DD68 DD70 FF34 4C085 AA03 AA38 BA01 BB21 CC31 CC33 FF14 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 NA14 ZB05

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２〜１１個の糖残基から成り、抗原提示
   細胞由来のレクチンに結合するオリゴ糖を表面に有し、
   かつ核酸を有するリポソーム。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のリポソームを含有する
   遺伝子ワクチン。