EA012618B1

EA012618B1 - Липосомная композиция для индукции иммунитета

Info

Publication number: EA012618B1
Application number: EA200702092A
Authority: EA
Inventors: Наоя Кодзима; Юзуру Икехара; Кунио Цудзимура
Original assignee: Токай Юниверсити Эдьюкейшнл Систем; Айти Префекче
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2006-03-29
Publication date: 2009-10-30
Also published as: KR20080027461A; US20090238863A1; EA200702092A1; CA2634038A1; WO2006104199A1; AU2006229381B2; AU2006229381A1; JPWO2006104199A1; EP1870091A1; EP1870091A4; CN101208075A

Abstract

Целью настоящего изобретения является создание липосомной композиции, которая дает возможность молекулам МНС класса I и класса II антигенпредставляющих клеток эффективно представлять антигенную субстанцию. Настоящее изобретение относится к липосомной композиции, которая включает в себя липосому, покрытую олигосахаридом, и антигенную субстанцию и которую используют для стимулирования молекул МНС класса I и класса II антигенпредставляющей клетки представлять антигенный пептид.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к липосомной композиции для индукции иммунитета, в которой используют покрытую олигосахаридами липосому. Более конкретно, настоящее изобретение относится к липосомной композиции, в которой используют покрытую олигосахаридами липосому, которая отличается тем, что она заключена в макрофаг, существующий в брюшной полости, после того, как его вводят в брюшную полость, и она представляется на молекулах МНС класса I и II.

Уровень техники

Количество смертей, вызванных раком желудка, в общем количестве смертей от всех видов рака, занимает второе место после рака легких. Главным фактором является диссеминированное метастазирование в органы брюшной полости. Поэтому для выздоровления от рака желудка является очень важным развитие иммунотерапии, которая способна контролировать метастазирование в брюшной полости и его распространение.

Цитотоксические Т-лимфоциты (СТЬ) являются главными эффекторными клетками иммунной системы, которые устраняют рак. Хелперные Т-клетки (ТБ) играют важную роль в проявлении функций указанных клеток. Таким образом, для создания эффективной иммунной реакции считают важным, чтобы эти две группы клеток были активированы совместно. Изучена иммунотерапия рака, в которой используют в качестве антигенов как эпитоп хелперов (ТБ), так и эпитоп цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ).

Как указано ранее, для получения эффективной иммунной реакции необходимо одновременно активировать хелперные Т-клетки (ТБ) и цитотоксические Т-лимфоциты (СТЬ). Для такой одновременной активации идеальна иммунизация антигеном, включающим в себя как ТБ эпитоп (МНС класс II), так и СТЬ эпитоп (МНС класс I). При этом известно, что сложно эффективно активировать СТЬ иммунизацией интактным белком. В общем, известно, что эндогенный антиген представлен на МНС класса I, в то время как экзогенный антиген представлен на МНС класса II. Тем не менее указывается, что экзогенный антиген, поглощенный антигенпредставляющей клеткой, такой как макрофаг, представляется на МНС класса II намного легче, чем на МНС класса I. Это происходит, когда в качестве вакцины используют антиген и отдельно вводят его пациенту для иммунизации, при этом СТЬ, которые зависят от представления антигена молекулами МНС класса I, не активируются эффективно.

Поскольку СТЬ являются главными эффекторными клетками иммунной системы, которые устраняют рак, было предпринято несколько попыток сделать возможным представление экзогенного антигена молекулами класса I. Такие попытки, предпринятые в виде иммунотерапии, охватывают: (1) способ, который включает забор антигенпредставляющих клеток пациента, их культивирование, добавление пептида антигена в культуру и возвращение результирующей культуры обратно в организм пациента, и (2) способ, который включает в себя представление гена антигена антигенпредставляющим клеткам. Два указанных метода являются проблематичными в техническом, этическом и экономическом аспектах. Кроме того, необходимо установить раковый антиген, который подходит для иммунизации. Далее, для одновременной активации нескольких рядов ТБ/СТЬ вышеупомянутым способом (1) также необходимо установить ТБ и СТЬ эпитопы.

При этом, что касается полисахарид-конъюгированной липосомы, было показано, что пуллулан и маннан инкорпорируются макрофагами и так, что они представлены на молекулах МНС класса I. В иммунотерапии был испытан способ конъюгирования антигена с такими полисахаридами и введение его пациенту. Однако поскольку указанная полисахаридная структура заключает в себе антигенность или токсичность, нельзя заведомо сказать, что применение данного способа является безопасным для человека. Далее еще не доказано, что молекулы МНС класса II способны представлять такой антиген.

Сущность изобретения

Задача, решаемая изобретением.

Целью настоящего изобретения является решение вышеупомянутых проблем предшествующего уровня техники. Другими словами, целью настоящего изобретения является создание липосомной композиции, которая способна позволить молекулам МНС класса I и II антигенпредставляющих клеток эффективно представлять антигенную субстанцию.

Способ решения задачи

В результате интенсивных исследований, направленных на достижение вышеупомянутой цели, авторы изобретения обнаружили, что антиген может быть доставлен к макрофагу путем инкапсулирования указанного антигена в липосому, покрытую олигоманнозой (МСЬ), и введения ее пациенту. Это происходит благодаря реакции, которая опосредована рецептором к маннозе, который экспрессируется макрофагом. Такой макрофаг специфически и активно поглощает липосому, которая была введена в брюшную полость, и становится активированным. В последующей иммунной реакции макрофаг представляет инкапсулированный антиген на своих молекулах МНС класса I и II и он мигрирует к экстанодальным лимфатическим тканям большого сальника или брыжейке тонкой кишки так, чтобы активировать клеточный иммунитет. В то же время макрофаг способен представлять пептид, полученный из инкапсулированного антигена, на молекулах МНС класса I и II, и он также мигрирует к региональному лимфатическому узлу. В эксперименте на мышах макрофаг инкорпорирует МЬС, которую ввели в брюшную полость, становится активированным и достигает большого сальника, работающего как региональный лимфатический

- 1 012618 узел. В то же время макрофаг представляет пептид, полученный из инкапсулированного антигена, на молекулах МНС класса I и II, и он активирует две клеточные группы ТЬ и СТЬ, что позволяет им производить γ-интерферон (ΙΕΝ-γ). Настоящее изобретение дополнено на основании указанных результатов.

Таким образом, настоящее изобретение относится к липосомной композиции, которая включает в себя покрытую олигосахаридами липосому и субстанцию антигена и которая используется для того, чтобы побудить молекулы МНС класса I и II антигенпредставляющей клетки представить антигенный пептид.

Олигосахарид предпочтительно является олигоманнозой.

Олигосахарид предпочтительно является маннопентозой или маннотриозой.

Субстанция антигена предпочтительно является раковым антигеном.

Предпочтительно липосомную композицию согласно настоящему изобретению вводят в брюшную полость подкожно или через слизистую оболочку носа, и она поглощается антигенпредставляющей клеткой, такой как макрофаг, и в результате антигенный пептид представляется на молекулах МНС класса I и II.

Липосомную композицию согласно настоящему изобретению предпочтительно используют для стимулирования цитотоксических Т лимфоцитов (СТЬ).

Наилучший способ осуществления изобретения

Варианты осуществления настоящего изобретения конкретно описаны ниже.

Авторы изобретения установили, что при использовании яичного альбумина (ОУА) в качестве модели антигена, когда такой экзогенный антигенный белок инкапсулируют в покрытую олигоманнозой липосому (МСЬ) и затем вводят пациенту, антиген может быть представлен не только на МНС класса I, но и на МНС класса II. После того как яичный альбумин (ОУА) или пептид ОУА был инкапсулирован в покрытую олигоманнозой липосому и такая липосома затем была введена в брюшную полость, она быстро инкорпорируется в макрофаг. Затем макрофаг извлекали из брюшной полости и культивировали 24 ч. Далее полученную культуру помещали в смешанную культуру вместе с селезеночными СЭ8 позитивными Т-лимфоцитами от трансгенных (Тд) мышей ТО-1, в которые введен ген Т-клеточного рецептора, специфичного к ОУА пептиду, представленному на молекулах класса I. В результате, когда растворенный в РВ8 ОУА ввели в брюшную полость мыши и затем извлекли макрофаги, то ΓΝΕ-γ практически не вырабатывался. При этом в случае, если ОУА был помещен в покрытую олигоманнозой липосому, то ΕΝΕ-γ вырабатывался. Полученный результат ясно показывает, что после того, как МСЬ с инкапсулированным ОУА инкорпорировалась в макрофаги, ОУА пептид представлялся на молекулах МНС класса I. С другой стороны, даже в случае прямого введения ОУА, такой ОУА также был инкорпорирован в макрофаги. Однако ЮТ-у не вырабатывался. Таким образом, считали, что ОУА пептид не был представлен на молекулах МНС класса I. Следовательно, было показано, что он может быть эффективно представлен на молекулах МНС класса I антигенпредставляющих клеток путем инкапсулирования белка антигена или пептида антигена в МСЬ и последующего введения МСЬ пациенту.

С другой стороны, если вышеупомянутую культуру смешивали с селезеночными СЭ8 позитивными Т-лимфоцитами от трансгенных (Тд) мышей ТО-1, в которые введен ген Т-клеточного рецептора, специфичного к ОУА пептиду, представленному на молекулах класса II, то стимулировалось образование ЮТ-у, специфичного к ОУА пептиду, представленному на молекулах МНС класса II. Таким образом, было показано, что антиген был эффективно представлен на вышеупомянутых молекулах в обоих случаях, когда антиген был инкапсулирован в липосому, покрытую олигоманнозой, и когда антиген был привит непосредственно.

Кроме того, когда растворимый белок лимфомы мышей ЕЬ4, который инкапсулировали в МСЬ, вводили подкожно сингенной мыши, то наблюдалась высокая активность СТЬ к ЕЬ4, которая была едва заметной при непосредственном введении растворимого продукта. Этот результат показывает, что даже если антиген вводили подкожно, то он инкорпорировался антигенпредставляющими клетками, и что антигенный пептид эффективно представлен на молекулах МНС класса I. Этот результат также показывает, что даже если антигенный белок неизвестен или не очищен, пептид, способный индуцировать СТЬ, может быть представлен на молекулах МНС класса I путем инкапсулирования экстракта раковых клеток в липосому, покрытую маннозой, и последующего введения этой липосомы. Таким образом, было показано, что применение такой липосомы эффективно в качестве средства для получения вакцины против рака.

Липосомная композиция согласно настоящему изобретению также может быть использована как система доставки лекарственных средств. Термин система доставки лекарственных средств используют в настоящем документе для обозначения системы для доставления лекарственных средств. В общем случае, когда вводят лекарственное средство, оно распространяется по всему телу. Система доставки лекарственного средства представляет собой технику, которая предотвращает данное распространение лекарственного средства и доставляет его к тканям-мишеням или клеткам-мишеням. Эта система доставки лекарственных средств имеет эффект снижения побочных эффектов или улучшения лекарственного эффекта.

- 2 012618

Термин липосома используют в настоящем документе для обозначения искусственной частицы, сделанной из двойной мембраны, образованной фосфолипидами. Гидрофильная часть ориентирована вовнутрь мембраны и гидрофобная часть - вовне. Гидрофильное соединение может быть инкапсулировано в полость. Липосомная композиция согласно настоящему изобретению может быть использована в системе доставки лекарственных средств для противораковых агентов и тому подобного.

Липосомная композиция согласно настоящему изобретению отличается тем, что включает в себя липосому, покрытую олигосахаридами, и антигенную субстанцию. Липосомную композицию используют, чтобы заставить молекулы МНС класса I и класса II антигенпредставляющих клеток представлять антигенный пептид из антигенной субстанции. Более подробно, когда липосомная композиция согласно настоящему изобретению вводится в брюшную полость, она инкорпорируется в антигенпредставляющую клетку, такую как макрофаг, и антигенный пептид представляется на молекулах МНС класса I и класса II указанной клетки.

Макрофаг представляет собой фагоцитирующую клетку. Эта клетка распознает чужеродные субстанции, которые не представлены в организме, умирающие (апоптозные) клетки, которые больше не формируют живой организм, раковые клетки и т.д. После этого макрофаг детально представляет пептидный фрагмент переваренного белка, который будет являться целью атаки иммунной системы, на клеточной поверхности и работает как контрольно-диспетчерский пункт для информирования иммунной сети о цели атаки.

В качестве покрытой олигосахаридами липосомы, использованной в настоящем изобретении, может быть использована липосома, описанная в японском патенте № 2828391. Тип сахарного компонента, формирующего такой олигосахарид, не является лимитированным. Примеры сахарного компонента включают в себя Ό-маннозу (Ό-тап), Ь-фукозу (Ь-Рие), Ό-ацетилглюкозамин (Ό-ΟΙοΝΆο), Ό-глюкозу (Ό61с), Ό-галактозу (И-6а1), Ό-ацетилгалактозамин (Э-баШЛе). Ό-рамнозу (Э-ЯБа).

В олигосахариде индивидуальные составляющие сахара связаны друг с другом через α1—2 связь, α1—3 связь, </.1—4 связь, α1—6 связь, β 1 —>4 связь или их комбинацию. Например, манноза может составлять единичную нить через указанную связь или может принимать ветвистую структуру посредством комбинации связей α1—3 и α1—6. Количество моносахаридов, содержащихся в олигосахариде, составляет предпочтительно от 2 до 11. Индивидуальные примеры этих олигосахаридов включают маннобиозу (Мап2), маннотриозу (Мап3), маннотетраозу (Мап4), маннопентозу (Мап5), манногексозу (Мап6), манногептозу (Мап7) и различные типы смешанных олигосахаридов, таких как М5 (формула 1) и ΡΝ (формула 2), как показано ниже.

Формула 1

М5

МааоК %

Нша К ,3 ^6

Мао

Ηοοαΐ^

Формула 2 ΚΝ

11ап«1-*2 Иап α 1 •-□.β

Мала! .

Л \

Ышв 1-*2 Иааа1-^ ¹¹ 6

Μ»η.^<91-4Ε1οΝΑ_[.βΙ-*4β1ί,ΝΑ«

ЛЭ

Мал а Г·*· 2 Маав1-*2 Мвпв1х где каждая Мап, которая связана с другой / 1 — 2 связью, может быть представлена или не представлена независимо.

Олигосахарид, имеющий структуру, представленную формулой 3, является примером олигосахарида, содержащего глюкозу. Олигосахарид, имеющий структуру, представленную формулой 4, является примером олигосахарида, содержащего Ν-ацетилглюкозамин. Олигосахарид, имеющий структуру, представленную формулой 3, является примером олигосахарида, содержащего фукозу.

- 3 012618

Формула 3

Η —(* 6 С 1 с я 6 <3 1 с α 1) -, > Н

а 1 С 1 с где т+т'+η составляет от 1 до 10.

Формула 4

С1сМАе£1 (>4(ΠεΝΑβ)8В. > 4С1сКАс где η составляет от 0 до 4, (С1с11Лс

(СОЛАсД1—)« Мел а!/ где р равно 0 или 1; каждый η независимо равен от 0 до 3; каждый из двух ΟΙοΝΛο остатков, представленных с правой стороны формулы 401οΝΛοβ1. может присутствовать или отсутствовать независимо от другого; и все ΟΙοΝΛο. представленные (01οΝΛοβ1>)_Μ. могут связываться с любым количеством свободной гидроксильной группы Мап, расположенной на их правой стороне через гликозидную связь.

ίδΕΝΑε й I —>1 Маг«1>. 4 4 в

Мап Й Н4С1сКАс (31 -4«1οΝΑγ

где р равно 0 или 1; каждый п независимо равен от 0 до 3 и все ΟΙοΝΑο. представленные (ΟΙοΝΑοβ 1>)_п. могут связываться с любым количеством свободной гидроксильной группы Мап, расположенной на их правой стороне через гликозидную связь,

С1СШЛ1

I в

К (91 -»ЗСа1КАс

КВН, 61пМА<ц ХВСМеНЛсβ 1-65» {(ИсШуЭI-ЗЬСаI где р равно 0 или 1.

'ТГисаР,

Формула 5 (Рисй1), '

Ψ

СкИАс^З]

ССа! β 1-МПе), где к равно от 1 до 5; каждое р равно 0 или 1 и компонент, не имеющий заданного номера на конце стрелки, может связаться с любым количеством свободной гидроксильной группы через гликозидную связь.

(&1сКАс£1),

Пап 51-Ч61сМАс £1-*4С1сШ

Б1С1ЧАСД1

(Руса1), (Руса О _г где каждое р независимо равно 0 или 1; каждое п равно от 0 до 3; компонент, не имеющий заданного номера на конце стрелки, может связаться с любым количеством свободной гидроксильной группы через гликозидную связь; два ΟΙιιΝΑο остатка, представленные 4Ο1οΝΑο>4Ο1οΝΑο на правой стороне в формуле могут присутствовать или отсутствовать независимо друг от друга.

- 4 012618 ('(ΓιΐββΐΉ

к.

(С!сНАс/3 ),

-3 Папа! <

Ч1П β 1-4С )сМАс β 1 ~*4С I сИАс (СИД1-*>, СШсД!-»)

где каждое р независимо равно 0 или 1; каждое η независимо равно от 0 до 3; компонент, не имеющий заданного номера на конце стрелки, может связаться с любым количеством свободной гидроксильной группы через гликозидную связь; два С1иМЛс остатка, представленные 401οΝΑο>401οΝΑο на правой стороне в формуле, могут присутствовать или отсутствовать независимо друг от друга.

Олигосахарид, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой олигоманнозу и особенно предпочтительно маннопентозу или маннотриозу.

Все указанные сахариды имеют восстановленную концевую альдегидную группу. Таким образом, указанная альдегидная группа может быть использована в качестве способа представления олигосахарида на поверхности липосомы. А именно указанный альдегид может реагировать с липидом, имеющим аминогруппу, с образованием Шиффова основания. Следовательно, согласно общему способу, такое Шиффово основание восстанавливают и предпочтительно восстанавливают химически, например ΝαΒΗΤ’Ν. так чтобы связать олигосахарид с липидом (Тзидио Μίζιιοοίιί. Тозййзи-кобаки (СагЬойубга1е Епдшеегшд), стр. 224-232, Биотехнологический информационный центр, Индустриальный исследовательский центр Японии, 1992).

Указанный липид, имеющий аминогруппу, предпочтительно является фосфолипидом, имеющим аминогруппу. Например, может быть использован фосфатидиламин, такой как дипальмитоилфосфа тидилэтаноламин (ΌΡΡΕ) или дистеароилфосфатидилэтаноламин (Ό8ΡΕ). Полученная, таким образом, связанная субстанция также может быть отнесена к искусственным гликолипидам в настоящем изобретении.

В качестве липидов, которые формируют липосому, обычно используют любые указанные липиды, которые известны как компоненты липосомы и могут быть использованы отдельно или в виде смеси нескольких липидов. Например, могут быть использованы натуральные липиды, такие как липиды желтка яйца, соевых бобов, или липиды, полученные из других растений и животных, модифицированные липиды, полученные модификацией вышеуказанных липидов, такие как липиды, чья степень ненасыщенности увеличена гидрированием, или химически синтезированные липиды. Характерные примеры этих липидов включают в себя стеролы, такие как холестерин (С1ю1); фосфатидилэтаноламины, такие как дипалмитоилфосфатидилэтаноламин (ΌΡΡΕ) или дистеароилфосфатидилэтаноламин (Ό8ΡΕ); фосфотидилхолины, такие как дипалмитоилфосфатидилхолин (^ΡΡС) или дистеароилфосфатидилхолин (Ό8Ρί.'); фосфатидилсерины, такие как дипалмитоилфосфатидилсерин (ΌΡΡ8) или дистеароилфосфатидилсерин (Ό8Ρ8), и фосфатидные кислоты, такие как дипалмитоилфосфатидная кислота (ΌΡΡΑ) или дистеароилфосфатидная кислота (Ό8ΡΑ).

Липосома может быть изготовлена по известному способу |Ό.\ν. Оееашег, Ρ.8. из1ег, Ырозоше еб. Ьу М.1. Оз1го, Магсе1 Оеккег 1пс., Ν.Υ. Вазе1, 1983, р.27]. Общепринятыми являются вихревой способ и ультразвуковой способ. Также могут быть применены другие, кроме вышеупомянутых, способы: способ этаноловой инъекции, эфирный способ, способ напыления обратной фазы. Такие способы также могут быть использованы в комбинации.

Например, в случае вихревого способа и ультразвукового способа определенный липид растворяют в органическом растворителе, таком как метанол, этанол, хлороформ или их смесь, включая смесь метанола и хлороформа. После этого органический растворитель удаляют выпариванием, так чтобы получить тонкий слой липида. Затем к тонкому слою липида добавляют водный переносчик с последующей вихревой обработкой или обработкой ультразвуком для формирования липосом. Во время этой операции субстанцию для введения, такую как лекарственное средство, маркер или контрастное вещество, вводят в указанный водный переносчик. Например, такую субстанцию растворяют или ресуспендируют в указанном водном переносчике, так чтобы субстанция для введения была инкапсулирована в липосому.

Для того чтобы ввести олигосахарид в поверхность липосомы, можно, например, использовать один из следующих двух способов. В случае, если указанный искусственный гликолипид является водорастворимым и совершенно не растворимым в органическом растворителе, например когда используют связанную субстанцию вышеупомянутых М5 и ΌΡΡΕ (Μ5-ΌΡΡΕ) или связанную субстанцию ΚΝ ΌΡΡΕ (ΚΝ-ΌΡΡΕ), то готовят водный раствор, который содержит такую связанную субстанцию, и затем водный раствор смешивают с формируемой липосомой. После этого полученная смесь может быть инкубирована при температуре от +4°С до комнатной температуры от 24 до 120 ч, например примерно 72 ч.

С другой стороны, в случае если вышеупомянутый искусственный гликолипид растворим в органи

- 5 012618 ческом растворителе, то искусственный гликолипид вместе с липидом, который используют для формирования липосомы, растворяют в указанном органическом растворителе в процессе производства липосомы. После этого липосома может быть создана по общепринятому способу. Количество олигосахарида, используемого для производства липосомы, отличается в зависимости от типа олигосахарида, типа антигена для инкапсулирования, комбинационной структуры липосомы и т.д. В общем, используют от 5 до 500 мкг олигосахарида с учетом 1 мг липида, который составляет липосому.

Липосома, используемая в настоящем изобретении, может быть либо многослойного типа (многослойный переносчик), либо однослойного типа (однослойный переносчик). Такая липосома может быть изготовлена общеизвестным способом. Кроме того, также возможно преобразовать один тип в другой общепринятым способом. Например, липосома многослойного типа может быть преобразована в липосому однослойного типа.

Размер частицы липосомы, используемой в настоящем изобретении, не является особенно лимитированным. При необходимости размер частицы липосомы может быть изменен согласно общепринятому способу, например фильтрацией через фильтр, имеющий желаемый размер пор.

В настоящем изобретении предпочтительно используют липосому, покрытую олигоманнозой. Такую липосому, покрытую олигоманнозой, получают присоединением липидов к нескольким цепям сахара маннозы (олигоманнозы), которые формируют структуру сахарной цепи, которая является высококонсервативной в организмах, от дрожжей до человека, ее очисткой и затем конъюгированием с липосомой. Такая покрытая олигоманнозой липосома не является токсичной, потому что используют структуру, исходно представленную в человеческом организме. Когда рецептор, который имеется на макрофаге, специфически узнает олигоманнозу, липосома, покрытая олигоманнозой, немедленно инкорпорируется в клетку в результате фагоцитоза.

Тип антигенной субстанции, используемой в настоящем изобретении, не является особенно лимитированным. Примеры данной антигенной субстанции включают в себя сурвивин, ливин, рикаварин, др110, ΜΑΒΤ-1, ΝΥ-ΕδΟ-1, δδΧ, РВЕ, ΗΕΒ2 δΥΤ-δδΧ, СЕА и МиС-1. Указанная антигенная субстанция предпочтительно является раковым антигеном.

Количество антигенной субстанции, содержащейся в липосоме, не является особенно лимитированным, при условии, что может быть получен эффект настоящего изобретения, такой, что введенная липосомная композиция инкорпорируется в макрофаг, находящийся в брюшной полости, и затем антигенный пептид представляется на молекулах МНС класса I и класса II антигенпредставляющей клетки. Количество такой антигенной субстанции может быть определено приблизительно, в зависимости от типа субстанции для введения, композиции липосомы, ее структуры и т. д. В общем, вводят от 1 до 100 мкг антигенной субстанции с учетом 1 мг липида, который составляет липосому.

Композиция липосомы согласно настоящему изобретению может включать в себя фармацевтически приемлемый носитель по желанию. Примеры используемого носителя включают в себя стерильную воду, буферный раствор и физиологический раствор. Кроме того, композиция липосомы согласно настоящему изобретению может также включать в себя соли, сахара, белки, крахмал, желатин, растительное масло, полиэтиленгликоль и т.д.

Путь введения липосомальной композиции согласно настоящему изобретению не является особенно лимитированным. Указанная липосомная композиция предпочтительно может быть введена в брюшную полость, подкожно или через слизистую носа. Доза липосомальной композиции согласно настоящему изобретению изменяется в зависимости от типа субстанции для введения, пути введения, тяжести симптомов, возраста и состояния пациента, степени побочных эффектов и т.д. В общем, указаную липосомальную композицию вводят в дозе от 1 до 100 мг/кг в день.

Настоящее изобретение может быть описано более детально в следующих примерах. Однако эти примеры не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Примеры.

Пример 1. Способ производства липосомы, покрытой олигосахаридами, и способ инкапсулирования в нее антигена.

Согласно следующему способу маннотриозу (М3) (маннотриоза (Мап3), имеющую структуру МапаЛ^-б (МапоЛ^-3) Мап), химически связывают с дипальмитоилфосфатидилэтаноламином в реакции восстановительного аминирования так, чтобы синтезировать М3-ЭРРЕ.

Во-первых, добавляют 600 мкл дистиллированной воды к 2,5 мг маннотриозы (М3) и перемешивают реакционный раствор так, чтобы указанная субстанция растворилась в дистиллированной воде, и таким образом получают раствор олигосахарида. Затем растворяют ΌΡΡΕ в концентрации 5 мг/мл в смешанном растворе хлороформ/этанол (1:1; объемное отношение) и таким образом получают ΌΡΡΕ раствор. Кроме того, растворяют NаВΗзСN в концентрации 10 мг/мл в метаноле и таким образом получают NаВΗзСN раствор. 9,4 мл вышеупомянутого раствора ΌΡΡΕ и 1 мл вышеупомянутого раствора NаВΗзСN добавляют к 600 мкл каждого из вышеупомянутых олигосахаридных растворов, и три типа растворов перемешивают взбалтыванием, реакционную смесь инкубируют при 60°С 16 ч для получения искусственного гликолипида. Синтезированный искусственный гликолипид очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией, ВЭЖХ, так чтобы получить высоко очищенный гликолипид.

- 6 012618

Липосома, в которую помещен белок-антиген (яичный альбумин (ОУА) или антиген ЕЬ4), получена следующим образом.

Во-первых, раствор хлороформ/метанол или раствор этанола, который содержит дипальмитоилфосфатидилхолин (БРРС), холестерин и искусственный гликолипод (МЗ-БРРЕ) в соотношении 1:1:0,1, помещают в грушевидную колбу. Смесь высушивают, используя роторный испаритель, при пониженном давлении так, чтобы получить липидную пленку. Затем 0,3 мл основного фосфатного буфера (РВБ), который содержит белок-антиген (5 мг/мл), добавляют к липидной пленке и полученную смесь затем перемешивают, используя вортекс миксер, так, чтобы получить М3-БРРЕ-покрытую липосому (ОМЬ).

Затем липосому несколько раз отмывают РВБ и водорастворимые субстанции, которые не были инкапсулированы в липосому, удаляют центрифугированием. Кроме того, размер частиц липосом устанавливают, используя 1 мкм фильтр. Количество инкапсулированного белка устанавливают, измеряя количество белка. Кроме того, композиционное соотношение липида в липосоме и количества лекарственного средства определяют количественно ВЭЖХ.

Пример 2. Подтверждение представления антигена молекулами МНС класса I и класса II.

Яичный белок (ОУА) или ОУА пептид инкапсулируют в липосому, покрытую маннозой, и затем вводят липосому непосредственно в брюшную полость мыши С57ВБ/6 или мыши ВАЬВ/е. Липосома быстро инкорпорируется в СБ11Ь-положительную клетку, которая экспрессирует оба МНС класса I и МНС класса I и класса II. Известно, что данная СБ11Ь-положительная клетка функционирует как антиген-представляющая клетка. Таким образом, чтобы продемонстрировать, что ОУА может быть представлен на обеих молекулах МНС класса I и класса II, после того, как покрытая олигоманнозой (М3) липосома с инкапсулированным ОУА была инкорпорирована в СБ11Ь-положительную клетку, проводят следующий эксперимент.

(1) Экспериментальные группы.

В группе А 50 мкг ОУА, растворенного в РВБ, инкапсулируют в М3 покрытые липосомы (ОМЬ). Добавляют РВБ к липосоме до конечного объема 200 мкл. Полученный раствор вводят в брюшную полость каждой мыши.

В группе В ОУА растворяют в РВБ в концентрации 5 мг/мл. К 10 мкл раствора ОУА добавляют РВБ до конечного объема 200 мкл. Полученный раствор вводят в брюшную полость каждой мыши. В группе В мышам также вводят по 50 мкг ОУА, как и в случае группы А.

В группе С РВБ добавляют к 38 мкл липосом, покрытых М3 и содержащих только РВБ, до конечно го объема 200 мкл. Полученный раствор вводят в брюшную полость каждой мыши.

В группе Б 200 мкл РВБ вводят в брюшную полость каждой мыши.

(2) Предварительная обработка СБ11Ь-положительных клеток, полученных из брюшной полости.

Используют восьминедельных мышей линии С57ВБ/6 или ВАЬВ/е. Брюшную часть каждой мыши дезинфицируют гигроскопической ватой, смоченной в 70% этаноле. После этого каждый из вышеуказанных растворов вводят каждой группе мышей, используя шприц для туберкулинизации. Через час после введения мышей подвергали эвтаназии введением нембутала в качестве анестезирующего агента. После этого брюшную полость мыши быстро промывают 5 мл сбалансированного раствора Хенкса и собирают указанный раствор для выделения свободных клеток, имеющихся в брюшной полости.

Клетки, полученные с помощью сбалансированного раствора Хенкса от 3 мышей каждой группы, собирают отдельно для каждой группы и центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин. Осажденные клетки ресуспендируют в 10 мл раствора ИРМ! (раствор ИРМЬА), который содержит 10% фетальной телячьей сыворотки, и затем их вновь центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин. Данную процедуру повторяют дважды и полученные клетки ресуспендируют в растворе ΚРМI (раствор ИРМЬВ), который содержит 1 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10% фетальной телячьей сыворотки. Суспензию наносят по 100 мкл в 96луночный планшет. Клетки культивируют в СО₂ инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ в течение 2 ч для адгезии СБ11Ь-положительных клеток. Неадгезированные клетки смывают, и оставшиеся клетки культивируют в 100 мкл раствора ИРМЬВ в течение 24 ч.

(3) Определение антигена, представленного на молекулах МНС класса I и класса II.

Наличие или отсутствие ОУА пептида, представляемого на молекулах МНС класса I и класса II мышей С57ВБ/6, определяют, используя мышей линии С57ВБ/6, а именно мышей ОТ-1 (которые различают ОУА_257-264, представленных на Н-2К^Ь в качестве молекулы МНС класса I) и мышей ОТ-2 (которые различают ОУА323-339, представленных на Н-2А^Ь в качестве молекулы МНС класса II) соответственно. Из каждой из указанных мышей выделяют селезенку, погружают в 5 мл сбалансированного раствора Хенкса и растирают между двух предметных стекол. Размельченную таким образом селезенку переносят в центрифужную пробирку объемом 15 мл и оставляют на 5 мин для осаждения фиброзной ткани, которая формирует ткань селезенки. Осажденную фиброзную ткань удаляют. После этого для получения лимфоцитов осадок центрифугируют в среде для выделения лимфоцитов М-БМБ (ЛМК.О Со., Ь1б.). Дополнительно проводят эксперимент для проверки эффективности представления антигена молекулами класса II у мышей БО11.10 (которые распознают ОУА пептид, представленный Н-2А^а/ОУА323-339), которые являются мышами линии ВАЬВ/е. Лимфоциты 1х10⁷ ресуспендируют в 1 мл раствора ИРМЬВ и добавляют по 100 мкл каждой суспензии в каждую лунку, содержащую СБ11Ь-положительные клетки (2-ά), с по

- 7 012618 следующим культивированием. Через 48 ч собирают супернатант и определяют количество ΙΝΕ-γ, содержащегося в супернатанте.

Результаты представлены на фиг. 1 и 2. Как показывают результаты на фиг. 1 и 2, если объекту вводят яичный альбумин (ОУА), заключенный в липосому, покрытую маннозой, то антиген представлен обеими молекулами МНС класса I и класса II, и эффективно вырабатывается ΙΝΡ-γ.

Пример 3. Индукция СТЬ на клетках лимфомы мышей ЕЬ4.

Клетки ЕЬ4 вводят подкожно сингенной мыши линии С57ВЬ/6 для получения большого количества клеток ЕЬ4. Данную клеточную массу гомогенизируют в РВ8 и 100000 г полученного супернатанта используют в качестве ЕЬ4 антигена.

ЕЬ4 антиген помещают в липосому, покрытую олигоманнозой, и вводят 1 мкг белка подкожно мыши линии С57ВЬ/6 для иммунизации (всего 3 раза с интервалами в 1 неделю).

Через 3 недели после первой иммунизации выделяют селезенку, погружают в 5 мл сбалансированного раствора Хенкса и растирают между двух предметных стекол. Размельченную таким образом селезенку переносят в центрифужную пробирку объемом 15 мл и оставляют на 5 мин для осаждения фиброзной ткани, которая формирует ткань селезенки. Осажденную фиброзную ткань удаляют. После этого для получения лимфоцитов осадок центрифугируют в среде для выделения лимфоцитов М-8МЕ (ЛМКО Со., Ыб.). Выделенные таким образом лимфоциты используют в качестве эффекторных клеток. После этого эффекторные клетки стимулируют растворенным белковым антигеном (100 мкг ЕЬ4/10⁷ клеток) в течение 3 дней. Эффекторные клетки смешивают с клетками-мишенями (ЕЬ4 клетки: 10⁴ клеток/лунку) в следующих соотношениях (Е/Т соотношения =50:1; 25:1; 12,5:1; 6,25:1; 3,125:1 и 1:1). Через восемь часов культивирования измеряют цитотоксичность, используя набор Су1оТох96 аккау кй (Рготеда).

Результаты измерения представлены на фиг. 3. Как следует из результатов, показанных на фиг. 3, если субъекту вводят ЕЬ4 антиген, помещенный в липосому, то СТЬ могут быть эффективно индуцированы.

Пример 4.

ОУА, помещенный в ОМЬ (покрытая олигоманнозой липосома, ОМЬ/ОУА), ОУА, помещенный в непокрытую олигоманнозой липосому (ВЬ/ОУА), или только ОУА вводят в брюшную полость мыши (5 мкг ОУА). Через 1 ч выделяют интраперитониальные клетки и помещают их на чашку Петри для последующего культивирования в течение 1 ч. После этого взвешенные клетки удаляют и к адгезированным клеткам добавляют свежую среду КРМП640. Через 24 ч собирают среду и определяют в ней цитокины с помощью ИФА. Результаты представлены на фиг. 4. 1Ь12 вырабатывают только ОМЬ/ОУА.

Пример 5.

ОМЬ/ОУА или ЬР8 (10 нг) вводят в брюшную полость мыши, как в примере 4. Через 1 ч собирают интраперитониальные клетки и затем определяют количество цитокинов, произведенных макрофагами. Результаты представлены на фиг. 5. В результате ЬР8 стимуляции преимущественно образуются 1Ь1 и ΤΝΡ, тогда как 1Ь12 преимущественно образуется в результате ОМЬ стимуляции.

Пример 6.

СЭ8-положительные Т-клетки и СЭ4-положительные Т-клетки получают из трансгенных мышей ОТ-1 и ОТ-2, которым вводили ТСК, которые распознают ОУА_257-264 на Н-2К^Ь (МНС класс I) и ТСК, которые распознают ОУА_323-зз₉ на Н-2А^Ь (МНС класс II) соответственно. В то же время ОУА, содержащие ОМЬ, вводят в брюшную полость мыши С57/ВЬ6 и через 1 ч собирают интраперитониальные клетки. Полученные клетки культивируют и затем используют адгезированные клетки как макрофаги. Указанные Т-клетки и макрофаги используют в смешанной культуре. Через 24 ч собирают культуральный раствор и определяют количество цитокинов, содержащихся в среде. Результаты представлены на фиг. 6.

Пример 7.

Сравнивают отдельное введение ОУА с введением ОУА, помещенного в ОМЬ, в показателях эффективности представления антигена. Применяют способ, описанный в примере 6. Результаты представлены на фиг. 7. При введении 2 мкг ОУА, инкапсулированного в ОМЬ, количество выделенных цитокинов почти равно количеству, полученному при отдельном введении ОУА (1000 мкг). Таким образом, полагают, что представление антигена МНС класса II при использовании ОМЬ примерно в 500 раз выше, чем при отдельном введении ОУА. То есть представление антигена может быть проведено очень эффективно путем инкапсулирования антигена в ОМЬ.

Пример 8.

Мышей линии С57ВЬ/6 иммунизируют ОУА/ОМЬ (примерно 1 мкг ОУА) (подкожное введение дважды с интервалом в одну неделю). Схема иммунизации для активации кишечного иммунитета показана на фиг. 8. Через неделю после заключительной иммунизации получают клетки селезенки мыши, стимулированные антигеном. После этого измеряют содержание цитокинов в среде (фиг. 9). В то же время оценивают цитотоксичность на клетках линии ЕС7 (клетки, которые вносят ОУА гены в клетки ЕЬ4 и представляют ОУА пептиды на своих собственных молекулах МНС класса I) в качестве клетокмишеней (фиг. 9). У мышей, иммунизированных ОУА, инкапсулированным в ОМЬ, наблюдают значительное образование цитокина ТЫ и выраженную цитотоксичность. С другой стороны, когда в качестве

- 8 012618 мишени используют родительскую линию ЕЬ4, то ни в одном случае не наблюдают цитотоксичности. Соответственно, можно сказать, что индуцирована антигенспецифическая СТЬ.

Пример 9.

Через неделю после заключительной иммунизации, как описано в примере 8, 1х10⁶ ЕС-7 трансплантируют в область спины иммунизированной мыши. Через 3 недели измеряют объем опухоли. Результаты представлены на фиг. 10. В случае, если мышь иммунизирована ОУА/ОМЬ, развитие опухоли полностью ингибировано.

Пример 10.

Трансплантируют 1 х 10⁶ ЕС-7 в область спины каждой иммунизированной мыши. На 9-й день после трансплантации (объем опухоли примерно 100 мм³) мышь прививают ОМЬ/ОУЛ (1 мкл ОУА). После этого измеряют объем опухоли. Результаты представлены на фиг. 11. В группе, которой вводили ОМЬ/ОУА, наблюдают инволюцию опухоли практически у всех мышей, и в трех случаях опухоль полностью исчезла. Коэффициент выживаемости мышей с привитой опухолью представлен на фиг. 12. В группе, которой вводили ОМЬ/ОУА, данный коэффициент выживаемости заметно увеличен.

Пример 11.

Вводят ОМЬ/ОУА (5 мкл ОУА) в назальную полость каждой мыши, всего 3 раза с интервалом в 1 неделю. Через 1 неделю после финальной иммунизации из мыши выделяют назально-ассоциированные лимфатические ткани (ИАЪТ) и селезенку и измеряют количество выработанных цитокинов после стимуляции антигеном. Результаты представлены на фиг. 13. В группе, которой вводили ОМЬ/ОУА, наблюдается значительное образование цитокина ТЫ в ЫАЬТ.

Промышленное применение

Согласно настоящему изобретению стало возможным предоставить липосомную композицию, которая стимулирует молекулы МНС класса I и класса II антигенпредставляющей клетки, эффективно представлять антигенный пептид, такой как раковый антиген. Согласно настоящему изобретению создан простой способ иммунизации, в котором не нужна операция получения клеток из тела пациента и последующего их возвращения обратно. В частности, липосомная композиция согласно настоящему изобретению делает возможным инкапсулирование белка, действующего как раковый антиген, и прямое введение белка пациенту. Таким образом, липосомная композиция согласно настоящему изобретению является удобной для вакцинальной терапии.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показано количество ΙΝΕ-γ, образованного клетками селезенки трансгенной ТСКспецифичной к ОУА пептиду ограниченной по МНС класса I мыши.

На фиг. 2 показан ответ клеток селезенки трансгенной ТСК-специфичной к ОУА пептиду ограниченной по МНС класса II мыши на макрофаг из брюшной полости, в который был заключен ОУА.

На фиг. 3 показана индукция цитотоксических Т-клеток иммунизацией Мап3-липосомой.

На фиг. 4 показано количество цитокина, образованного интраперитониальными клетками после введения в брюшную полость липосомы, покрытой олигоманнозой (ОМЬ/ОУА), или подобного ей соединения.

На фиг. 5 показано количество цитокина, образованного интраперитониальными клетками после введения в брюшную полость ОМЬ/ОУА или ЬР8.

На фиг. 6 показано количество цитокина, образованного в случае, когда СЭ8-положительные Тклетки и СЭ4-положительные Т-клетки получают из ТСК трансгенных мышей ОТ-1, которые распознают ОУА_257-264 (МНС класс I), и ТСК трансгенных мышей ОТ-2, которые распознают ОУА_323-зз₉ (МНС класс II), соответственно, и когда СЭ8-положительные Т-клетки, СЭ4-положительные Т-клетки и макрофаги используют для смешанной культуры.

На фиг. 7 показаны результаты, полученные при сравнении случая отдельного введения ОУА и случая инкапсулирования ОУА в ОМЬ и последующего введения ОМЬ, в показателях эффективности представления антигена.

На фиг. 8 показана схема иммунизации для активации кишечного иммунитета.

На фиг. 9 показаны результаты, полученные выделением клеток селезенки через 1 неделю после заключительной иммунизации для активации кишечного иммунитета, стимулированием клеток антигеном и измерением количества цитокина, содержащегося в среде, и результаты оценки цитотоксичности, полученные на клетках-мишенях линии ЕС7.

На фиг. 10 показаны результаты, полученные трансплантацией ЕС-7 в область спины каждой мыши, подвергнутой кишечной иммунизации, через 1 неделю после заключительной иммунизации и измерения объема опухоли через 3 недели.

На фиг. 11 показаны результаты измерения объема опухоли после прививки ОМЬ/ОУА на 9-й день после трансплантации ЕС-7 в область спины каждой мыши.

На фиг. 12 показан коэффициент выживаемости мышей с привитой опухолью.

На фиг. 13 показаны результаты, полученные при введении ОМЬ/ОУА в назальную полость каждой мыши, выделении лимфатической ткани, ассоциированной с назальной полостью (ИАЬТ), и селезенки

- 9 012618 мыши через 1 неделю после заключительной иммунизации и измерения количества цитокина, наработанного после антигенной стимуляции.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Липосомная композиция, содержащая липосому, покрытую олигосахаридом, и антигенную субстанцию, и которую используют для представления антигенного пептида молекулами МНС класса I и класса II антигенпредставляющей клетки, где олигосахарид представляет собой маннопентозу или маннотриозу и антигенная субстанция представляет собой раковый антиген и липосому вводят в брюшную полость, подкожно, на слизистую носа, и она инкорпорируется в антигенпредставляющую клетку, такую как макрофаг, и в результате антигенный пептид представляется на молекулах МНС класса I и класса II.
2. Липосомная композиция по п.1, которую используют для индукции цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ).