JPS62294432A - リン脂質を基材としたリポソ−ムと医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリン脂質として特に、ホスファチジルイノシト
ール・マンノシド類を基材とした新規なリポソームに関
する。また、不発明はこの新規リポソームを含有する医
薬組成物に関する。

リン脂質（ホスホリピｒ）が水性媒質中で、水性媒質の
微細液滴を封入して論るリン脂質の小球体よりなる小胞
（ｙｅｓｉｃｌｅ）を形成できる特性を有することは知
られている。このような小胞はリポソーム（１ｊｐｏｓ
ｏｍｅ　）と言われ、医薬の担持剤、移行剤として用い
ることが知られている。最近の研究で王として開発され
ているリポソームは、リポソームに担持された医薬＊買
がその作用の対象とするターゲット細胞の近辺でのみ又
は該細胞と接触し友時にのみ医薬を放出できる型のリポ
ソームである。

上記のターゲット細胞に対して十分な特異性を示し且つ
生体内で満足すべき安定性をもつリポソームを完成する
ことには、解決すべき困難な技術的問題がある。

腫瘍細胞を阻止する研究分野では、モノサイト（単核白
血球）及び（又は）マクロファージ（大食細胞）を活性
化する技術が仰られている。事実、活性化これたマクロ
ファージは腫瘍細胞殺減作用を有することが知られてい
る。試験管内試験が示すところによれば、成る種の′＄
ＩＪ′ｊｌ［、特にムラミルジペプチ）’　（ｍｕｒａ
ｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ　；　ＭＤＰ　）とその誘導
体はマクロファージを活性化でき且つマクロファージの
抗腫瘍作用を誘起できる。モノサイト及び（又は）マク
ロファージの活性化剤としてＭＤＰ又はこれの誘導体は
特に興味がもたれている。

ＭＤＰ等の化合物は化学台底で製造できるからである。

しかしながら、これらＭＤＰ等の化合物は生体中で直接
に使用できない欠点があり、その理由は、投与後に尿中
に極めて早く排泄ばれるからである。

最近の研究によれば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）と
ホスファチジルセリン（ＰＳ）を基材としたリポソーム
に封入してムラミルジペプチＰ（ＭＤＰ）を用いてマク
ロファージを活性ｆヒすることが提案された。この種の
リポソームは、ターゲット細胞がマクロファージである
場合に特に興味があると言われる〔主として曽根三部ら
の論文：ｒＲａｅｓｎｔ　Ａｄｖ、　ｔｎ　ＲＪ、Ｓ、
　Ｒｅ５ｓａｒｃｈＪＪλ巻／！ｒ７−２００頁＜１ｑ
ｒ３）及び［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、　Ｊ／２Ｙ巻／
３／３〜１３１７頁（ｌりＪ’２）：並びにシュロット
等ｒ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｊ　４ｔ７巻ｇ７〜り
μ頁（ツタｔ３）〕。

本発明者らは、研究の結果、主としてマクロフアークに
接近して医薬をマクロファージへ運搬する担持体として
作用できる新規なリポソームの創製に成功した。不発明
によるリポソームの有利な特性は、このリポソームがマ
クロファージにより捕捉、取込まれることが前出の研究
者で提案されたｐｃ−ｐｓ型のリポソームにより妨害さ
れないことである。・換言すれば、本発明のリポソーム
のマクロファージによる捕捉、取込み機構は、ＰＣ−ｐ
ｓｉリポソームのマクロファージによる捕捉、取込み機
構と異なるのであり、これによって、相互に防害するこ
となくｐｃ−ｐｓ型リポソームと本発明のリポソームと
の相異なる２つの型のリポソームの併用がｏＪ能になる
。

マクロファージをターゲット細胞とすることのできるリ
ポソームについての研究では、ホスファチジルコリン（
ＰＣ）とアミノマンノシル比したコレステロール誘導体
を基材としたリポソームを使用することも提案されてい
る〔つ（ｖＶｕ）等の論文：ｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｈ
、　Ａｃ、　Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ、　Ｊ　７１巻μ号２
０３３〜２０３７頁（ｌりＩ／年弘月号）参照〕。

つ等の研究によれは、前記のアミノマンノシル化し友物
質を基材としたリポソームは、ホスファチジルコリン−
コレステロール型のリポソームによって妨害される。捷
た、つ等の研究によれば、ｄ＝スファチジルコリンーコ
レステロールを基材とし几すボンーム、あるいはホスフ
ァチジルコリン−マンノシル化コレステロールを基材と
したり７１セノームがマイ７の腹腔マクロファージによ
り捕捉、取込まれるのは、前記のアミノマンノシル化ｕ
導体を基材としたリポソームの場合と違って、微弱であ
る。

不発明者が今回予想外にも、発見したところによれば、
成る特定のマンノシル化されたＩＪン脂實をリポソーム
基材として用いると、リポソームのマクロファージによ
る捕捉、取込み率が十分に高いリポソームをｉｌｌ　ｎ
することができ、しかも、そのリポソーム取込み率は、
従来既知のホスファチジルコリンーホスファチジルセＩ
Ｊ　７）ＩＩ　（ＰＣ−ＰＳ型）リポソームが共存する
場合にも低減しないのである。

すなわち、不発明者らによって、リポソームの製造に基
材としてホスファチジルイノシトール・マンノシタ類（
ｐｈｏａｐｈａｔｉｄｙｌ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｍａｎ
ｎｏｓ　−１ｄｅｓ　）を有利に使用できることが知見
された。

このようなホスファチジルイノシトールｅマンノシｌ−
１類の代表例には、ミコバクテリウム属の微生物から抽
出ばれたものがある。このような微生物からホスファチ
ジルイノシトール・マンソンＰを抽出する技術は知られ
てあり、例えばＣ，Ｅ、ノ（ローらによりｒ　Ｔｈｅ　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈａ
ｍ−ｉｓｔｒｙ　Ｊ　２３１巻）号６７〜７６頁（ｌり
６３年１月）に記載ばれた方法で行い得る。これに原料
として用い得る微生物の例には、ミコノ々クテリウムー
ツペルクロシス（Ｍｙｅｏｂａｅｔａｒｉｕｍ　ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌ　−ｏｓｉｓ　）、ミコバクテリウム−ｙｇ
ビス（Ｍｙｃｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉａ　）
　（主としてＣａｌｍｅｔｔａ及びＧｕｅｒｉｎ細菌）
及びミコバクテリウム・プレイ（Ｍｙｅｏｂａｅ−ｔｅ
ｒｌｕｍ　ｐｈＬｅｉ　）　（ＡＴＣＣＪ　ｊ　ｕ　）
、等がある。

ホスファチジルイノシトールーマンノシＰの化学構造は
特に前記の文献に記載される如＜　Ｃ，Ｅ。

Ｂａ　１１　ｏｕ　　等の研究から知られており二また
Ｔ。

Ｋｕｂｌｃａ及びり、Ｇ、　Ｗａｙｎｅ　編の文献−Ｔ
ｈｅ　Ｍｙｅｏｂａ　−ｃｔｅｒｉａ″原典、Ａ部（ｌ
りと４ｔ）、特に７６章、３７２〜≠／ｊ頁をも参照ば
れたい。

不発明は時にリポソームを製造する［際して次式（１）
： ％式％（） （式中Ｒ及びＲ′は各々個々に７７〜２５個の炭素原子
を有する脂肪族基を表わし２、これらの基は場合により
二重結合全含有しており、（Ｍａｎ）ｘけイノシトール
に結合した少な（とも１個のマンノシル化を表わし、Ｘ
けマンノース単位の数である）のホスファチジルイノシ
トール・マンソン２の使用に関する。

Ｒ及びＲ′が酸残基である代表的な脂肪酸には主として
ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸
、リグノセリン酸、オレイン酸又は別のオクタデセン酸
、パルミトレイン酸、ネルボン酸及びＩＯ−メチルステ
アリン酸がある。

前記の式（Ｉ　）［お込てＸは１〜ｊの整数であるのが
好ましい。

前記式（Ｉ）の代表的なホスファチ・ジルイノシトール
・マンソンＰには％に次＆（ｆｉｌＣｆ（−（）−Ｃｏ
吐 （式中２はＨ（元素純水素）又は−（Ｍａｎ）　　を表
わし、（、Ｍａ　ｎ　）は前述の如くであり、ｙはｌ−
μの整数であり、Ｒ及びＲ′は前述のｇｌ（である）の
ホスホミオイノシトール誘導体がある。

本発明はまた前述した如きホスファチジルイノシトール
・マンソンＰを用いて製造したリポソームに関する。こ
れらのリポソームは既知のリポソーム製造法により製造
でき、例えばり、Ｄ、Ｌｅｓａｒｍ−ａｎ及びＪ、Ｂａ
ｒｂｅｔ−４の−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｊｅ　Ｄｅｓ　
１ｉｏ−ｏＩｌｌｏｍｅｓ　”　Ｓａｍｉｎｌ　ｉｒｅ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｑｕｅ　ＩＮ８ＥＲＭ　。

ＩＮＳＥＲＭ版を参照されたい。

本発明により用いたホスファチジルイノシトールーマン
ノシｒは合成によＶ＃造でき、例えば工業製品であるイ
ノシトールホスフェートを原料として用ｂ１これを既知
の方法によりジアシルグリセロールと反応させ次Ａでマ
ンノシル比することにより製造できる。

不発明のリポソームはホスファチジルイノシトールーマ
ンノシ２に加えて、別のリン脂質例えばホスファチジル
コリン又はホスファチ・ジルセリン並びにリン脂質小胞
の透過性を減少させる薬剤を含有できる。この薬剤は主
としてステロール例えばコレステロールである。

ホスファチジルイノシトール・マンソンｒと透過性７減
少剤との重量比は例えばλ〜１０の範囲。

にある。

本発明は−また本発明のリポソームに封入したモノサイ
ト及び／′又はマクロファージ賦活化成分を含有してな
る製薬組成物に関する。

Ｍｉ前記の賦活化成分はマクロファージの抗腫瘍活性を
増大させ得る薬剤である。

本発明の特定の実施形式では、製薬組成物は前記のモノ
サイト及び／又はマクロファージ活性剤としてムラミル
ジベプチｒ　（ＭＤＰ　）又はその誘導体の一種を含有
してなる。

ＭＤＰは化合物、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−
Ｄ−イン−Ｇｌｙｎであることは知られている。

ＭＤＰの代表的な誘導体には次の化合物がある：ムラミ
ルトリベプチＰ例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ
ｔ−Ｄ−イソ−Ｇｌｙｎ　−メン−Ａ２ｐｍ　：ムラミ
ルテトラペプチＰ例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ　−
Ａｌａ　−Ｄ−インーＧｌｙｎ−メン−Ａ２　ｐｍ−Ｄ
−Ａｌａ：及びムラミルベンタベプチ）；’　例工ばＮ
−アセチルムラミル−Ｌ　−Ａｌｔ　−Ｄ−イノーＧｌ
ｙｎ−メソ−Ａ２ｐｍ　−Ｄ　−Ａｌａ　−Ｄ　−Ａｌ
ａ　０前記のＭＤＰ誘導体としてＭＤ　Ｐ　Ｃｈｏｌ　
（ＭＤＰ−Ｌ−７ラニルーコレステロール）も用い得る
：例えばＮ、Ｃ，Ｐｈ１ｌｌｉｐ等の−Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｒａ５ｐ、　Ｍｏｄ、”μ巻、４Ｌｔμ〜４Ａ７≠
頁（ｌり、ｒｔ）を参照されたい。

更には本発明の製薬組成物はガンマ−インターフェロン
の如き免疫活性剤を含有できる。

不発明の免疫活性組成物は例えば静脈内投与又は気管内
投与により又は鼻孔内投与用のエーロゾルの形でさえ投
与できる。

本発明の医薬組成物の薬量は用いた活性薬剤の関数であ
り、前記活性薬剤の薬量に一般に等しいか又はそれより
低（さえある。

本発明の医薬組成物は感染Ｃ）９クチリア　ウィルス又
は寄生による）に対する生体防御で免疫低下の処置に且
つまたガンの処置に特に肺ガン転移を含めてガン転移を
防止又は解消するのに主として用い得る。

不発明はまたガンの転移特に肺ガンの転移を防止し及び
／又は転移の根絶に有利となるように前述した如ｓ　Ｉ
Ｊボンームの使用に関する。

本発明を次の実施例により説明するが、これに限定ばれ
るものではない。

実施例／ リポソームの製造 キャメット　バチルス（Ｃａｍａｔｔｅ　ｂａｅｉｌｌ
ｕ＋ｓ　）及びグエリン（ＧｕｅｒｉＩＴ）バチルスの
マンノシル化シたリン脂質（ＰＬＭと略称）をＢａ１ｌ
Ｏｕ等のＪ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２３　ｊ巻、６り〜７６頁（
ｌり６３）に記載はれた方法により抽出した。このＰＬ
Ｍをス：／の重貴比でコレステロール（Ｐｒｏｌａｂｏ
社）と混合した＠ 該混合物をクロロホルムに溶解させ、丸底フラスコ中で
＃発乾固させた。リン酸塩緩衝剤をＰＬＭ、２（７〜当
りｉ、１の量で添加した。

次いでフラスコ中の混合物を激しく攪拌して渦流を生じ
づせ且つフラスコの壁面から脂質膜を脱離してリポソー
ムを形成スル。

次いでリポソームをμ℃で２ｊ分間２７．０００にＶで
６回遠心分離して封入されていなめ水性相を除去した。

各々の遠心分離後に、得られる沈着物を適当な容量のリ
ン酸塩緩衝剤に再＠濁させた。

次いでリポソームをセルロースアセテート　フィルター
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　）上で濾過して３μｍより大き
い直径のリポソームを除去した。

種々の測定値特にリポソームへの薬剤封入量を決定し得
るために同様な要領で脂質相及び／′又は水性相中に放
射性剤で標識したリポソームを製造した。

脂質相を標識（マーク）するにはＰＬＭに対してコン跡
量の　Ｃ−ＤＰＰＣ（ジノにルミトイルーｌ−（Ｃ）ホ
スファチジルコリン：　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃ
ｌｅａｒ社；　０＋０　／　ｍＣ１／ｍｒｎｏｌｅ　）
をクロロホルム溶液中で添刀口した。

水性相を標識するには、コン跡量の（３Ｈ）−ショ糖（
Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１社：り
、　Ｉ　Ｃｆ／ｍｍｏ　ｌ　ａ　）を添加した。

封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ　）の量ｊＯキのＰ
ＬＭを１０ｄのクロロホルム中でｕｊｍｇのコレステロ
ール及び０．、ｔｌｔｃＬの　Ｃ−ＤＰＰＣと混合しｔ
ｏ 前記したごとく、蒸発により被膜を形成させついでｌｊ
ＯμＣｔのトリチウム４＃蔗糖を含有するＰＢＳ緩衝液
ｊ−を添加した。前記したごとぐ、数回、遠心分離を行
った後、沈積物を／ｄのＰＢＳに再１’＆ｆｉさせつい
でミＩＪボア（Ｍｉｌｌｔｐｏｒａ　）　ｍ上で濾過し
た。

封入のｔはリン脂質／ＩＱ当りの水性相のマイクロリッ
トルで表わした。

遠心分離工程後、刊入量は７．９であることが認められ
た。

ミリポアフィルタ−上での濾過工程後、封入量はり、！
であることが認められた。

ＰＬＭ：コレステロールリポソームの安定性予備実験に
おいて、前述した方法と同様の方法に従って、コレステ
ロールを含有していないＰＬＭリボンームとコレステロ
ールを含有するＰＬＭリボソーム（ＰＬＭ：コレステロ
ールのｘ量比ｘ　：ｌ）を調製した。

水性相の漏洩（ｌｅａｋａｇｅ　）は牛胎児血清を！優
含有する媒体中で３７℃で３０分間培養（ｉｎｃｕｂ　
−ａｔｅ）した後の放射能（トリチウム標繊蔗砧）の漏
洩により測定した。ＰＬＭリボンームについての漏洩率
は全水性相の６７係であり、これに対し、ＰＬＭ：コレ
ステロールリポソームについての漏洩率は僅かｔｑｂで
あった。

実施例２ マクロファージによるリポソームの取込み量の測定 （＆）　　マウス炎症マクロファージの製造チオグリコ
レートを含有する媒体へ！−を注入することにより、マ
ウスにおける炎症性容量（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　
ｅｘｕｄａｔｓ＋　）を誘発させた。仏日後、腹腔滲出
細胞を捕集し、腹腔内をＭｇＭ媒体（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｓ　Ｐ＆５ｔｅｕｒ−Ｆｒａｎｃｅ　）で洗浄し友、　
＠出物と洗液とを一緒にし、細胞を分離させついでコ０
０　Ｘ　’　ｓ　μ℃でＩＯ分間壇心外離することによ
り捕集した。細胞を、抗生物質及び牛脂児血清全不活性
比補助剤と共に含有するＭＥＭ媒体に懸＠はせた。懸濁
液は／＃Ｉ７！中に２×７０６個のマクロファージが含
有されるように調節した。マククロファージの数はニュ
ートラルレツｒの添刀口（１ｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
　）により評価した。２−の懸濁液を直径３３．のペト
リ皿に注入しそしてこの懸＠Ｗを−ｔｑｂのＣ０２を含
有する湿った雰囲下、３７℃で３時間培養してマクロフ
ァージを付着させた。

付着しない細胞はリン酸塩緩衝液で３回洗浄することに
より除去した。

ｆｂ）　　ラット肺胞マクロファージの製造麻酔をかけ
たかつ腹大動脈から出血させたラットから肺を摘出し、
このラットを気管を介して！ゴのＯｏり係（重ｆ／′容
量）塩化ナトリウム水溶液で６回洗浄した。洗浄液を２
００ｘ？、＜Ａ℃でｌｊ分ｉＪ′Ｉ遠心分離した。洗浄
液を一緒にし、ｊ優の牛胎児血清と抗生物質を含有する
ＭＥＭ媒体の存在下で遠心分離した。遠心分離沈積物を
上記と同一のＭＥＭ媒体に再懸濁させ、濃度をＩＯ６マ
クロフアージ／　、／に調整した。前記したごと（、懸
蘭液をペトリ皿中に注入して細胞を付着させた。

付着しない細胞は洗浄により除去した。

（ｅｌ　　マクロファージによるリポソームの取込み（
ｃａｐｔｕｒｅ　）の測定 リポソームｆｔ６％の牛胎児血清及び抗生物質を含有す
るＭｇＭ媒体に懸濁させた。

ＩＪ　、ｔ？ソーム濃度を１０μ９／−〜グＯＯμ？／
−のリン脂質含有量に調整した。

リポソームを含有する媒体λ−を前記で得たマクロファ
ージ製剤に添加しついでよ４の００２ヲ含有する湿った
雰囲下、３７℃で培養した。培養時間が経過しｔ後、液
体媒体を除去し、マクロファージを燐酸塩緩衝液でμ回
洗浄した。

ｌ　％　Ｃｖ／ｖ）　　の　ト　リ　ト　ン　（Ｔｒｉ
ｔｏｎ　　）　　−Ｘ　　−１００を含有する燐酸塩緩
衝液０．６ｍｌを添加しついでマクロファージをゴムス
クレーノぐ−を用いて回収した。トリトン−Ｘ−１００
を含有する緩衝液０．６ｄを用いてこの操作を再度行っ
た。得られたλつの溶解物（１ｙｓｉｔｅ　）を−緒に
した。

結果 （ａ）　　マウス炎症マクロファージについて：培養時
間の影響 マクロファージ（≠×７０６／皿）を！　Ｏｎ？７／ｄ
のＰＬＭ：コレステロールリポソーム（重量比λ：ｌ）
を含有する媒体２ｄと共に培養した。このリポソームは
！　００　ｎｍの平均直径を有していた。

得られた結果を第１表に示す。

第　　　Ｉ　　　表 ｊ＠誉待時間　　　　取込まれた脂質の蓋（時間）　　
　　　　（マイクログラム）＋２２．０ ４Ａ　　　　　　　　　　　　Ｊｊ ６６．７ ．２０　　　　　　　　　　　／ＩＪ （ｂｌ　　マウス炎症マクロファージによるリポソーム
の取込み 濃度の影響 Ｐ　Ｃ／Ｐ　Ｓリポソーム（ホスファチジルコリン：ホ
スファチジルセリン）を慣用の方法で７＝３のモル比で
調製した。この比率は前記で引用し友文献中で５ｃｈｒ
ｏｉｔ等により推奨されている。

このリポソームをＰＬＭ：コレステロールリポソームと
比較した。

マクロファージを２−のリポソーム懸濁液と共に培地中
で培養した。

各々のリポソーム製剤は　Ｃ−ジノぞルミトイルホスフ
ァチジルコリンで標識を付した。

ｐ過後、リポソームは！　００１１ｍの平均直径を有し
ていた。

ベトリ皿１個当り、細胞数≠×７０６個の量のマクロフ
ァージを種々の飯度のリポソームと共に２時間培養した
。

得られた結果を第■表に示す。

第■表 リポソーム濃度　　　　取込まれたリン脂質の量（μｇ
）（リン月旨質のμつ一／′ｄ）　リポソームＰＬＭ　
　　リポソームＰＣ／ＰＳ３０　　　　　　　　　　　
Ｊ、７　　　　　　　　　／、１１００　　　　　　　
　　　　乙７　　　　　　　２．７２００　　　　　　
　　　　　　と２　　　　　　　　３．り弘ｏｏ　　　
　　　　　　　ｉｒ３　　　　　　　　　ｔｒ＋ｒ（ｃ
ｌ　　ラット肺胞マクロファージによるリポソームの取
込み縫 ！ｒ　００　ｎｍの平均直径を有するかつ　Ｃ−ジパル
ミトイルホスファチジルコリンで標識したリポソームの
取込み′！ｉをコニ／ＰＬＭ：コレステロールリポソー
ムについて測定し、ＰＣ：ＰＳＩＪボンームのそれと比
較した。

得られた結果を第■表に示す。

第■表 μり讐　　　　　により取込捷れた脂質のμＶ。

ＰＬＭ：コレステロール　　ｐｃ：ｐｓリボンーム　　
　　　　リポソーム ！ＯＪ、タ　　　　　　　　　　／、Ａ１００　　　　
　　　　　　／ｊ、３　　　　　　　　　１．１（ｄ）
抑制試験 標識付きＰＬＭ：コレステロールリポソームのｘンｙサ
イト−シス（細胞内取込み）の間に過剰量の無標識の同
一リポソームを添加するとマクロファージによる標識付
きリポソームの取込みが抑制される。

たとえば、マウスの炎症細胞マクロファージを各ペトリ
皿当りμ×ＩＯ６個の割合で使用しかつ前記と同様に　
Ｃで標識付けした２：／ＰＬＭ：コレステロールリポソ
ームと無標識の同一リポソーム及びｐｃ　：　ｐｓリポ
ソーム（モル比７：２）とを使用する。これらのリポソ
ームのすべては予め濾過しｔものであり、それらの平均
直径は２００ｎｍである。標識付きリポソームをリン脂
質ｊ′θμ強の量で単独で（すなわち対照試験）又はリ
ン脂質ＩＩ　００１１９／ｍｌの童で存在する前記無標
識の製剤のいずれか一方とともに培地中のマクロファー
ジに添加する。

２時１ｍ（＆、これらの細胞を洗滌しそして標識付きリ
ン脂質の取込み量を測定する。

抑制率（％）はつぎのどとく定義される。

ただし、 Ａ＝無標識リポソームの存在における取込み量Ｂ＝対照
試験における取込み量 である。

結果を第■表に示す。

第■表 なしく対照試験）　　　　　　　　３．１　　　　、　
　　−ＰＬＭ：コレステロール　　　　１．０　　　　
　　７≠ＰＣ：ＰＳ　　　　　　　　　　　　３．１　
　　　　　　０上記試験結果から、Ｐ　Ｃ：　Ｐ　Ｓ　
ＩＪボソームはＰＬＭ：コレステロールリポソームの取
込みに対して何等抑制効果をもたないことが認められる
。

したがってこれら二つの型のリポソームは異なる機構に
従って取込まれるものと考えられる。

実施例３ ラットの肺胞炎（ａｌｖｅｏｌａｒ　）マクロファージ
の試験管内活性化試験 本試験においてはＭＤＰの好脂性誘導体、すなわちＭＤ
Ｐ−Ｌ−７ラニル一コレステロール誘導体（以下ＭＴＰ
Ｃｈｏｌと略称する）を使用する。この物質の活性は他
の系においてすでに立征されている（　Ｎ、Ｃ，Ｐｈｉ
ｌｌｉｐｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅａｐ、　Ｍｏｄ、
　。

≠、（目−ａ７４Ａ（ｔ９１ｊ）参照）。

ホスファチジルイノシトール　マンソンｒ（ＰＬＭ）及
びコレステロールを２：ｌのモル比テ含有するリポソー
ムを調製しそしてＭＴＰＣｈｏｌをリン脂質／２０μＶ
当りｌキの濃度で配合する。

比較のため、Ｍ　Ｔ　Ｐ　Ｃｂ　ｏ　１を含まない同様
のリポソームを調製する。

これらのリポソームは滅菌条件下で調製しかつ平均直径
４Ａ≠Ｏｎｍ　ｆ与えるように濾過したものである。

ラットの肺胞炎マクロファージをｌ−当りｇ×１０５個
、弘×７０５個又はλ×ｌθ　個のマクロファージを含
む懸濁物として２６個のウェルを本つ皿のキャップ（ｃ
ｕｐｕｌｅａ　）中にウェル当す０．２！ｄの量で接種
する。粘着した後、ＭＥＭ単独又はＭＴＰＣｈｏｌを含
まない“空の（ｅｍｐｔｙ）　−ＰＬＭ：コレステロー
ルリポソームを含むＭＥＭ又はＭＴＰＣｈｏｌを配合し
たＰＬＭ：コレステロールリポソームを含むＭＥＭのい
ずれかである培地０．２！１ｄを添加する。これらの混
合物を３７℃で一晩＠養し、洗滌しそして同遺伝子型（
１１ｙｎｇｓｎｌｅ）標的細胞〔フィブロヒスチオサイ
ドーム（Ｆｉｂｒｏｈｉｓｔｉ　−ｏｃｙｔｏｍｅ）　
Ｐ　７７　）を／　ＯｑＦａ／ｍｔｃＤ破テ（作用因子
（エフェクター）／標的細胞比がｒ、ｕ及びλとなるよ
うに）、重水素（トリチウム）で標識されたチミジン（
Ｈ−ＴｄＲ）の溶液（チミジンの最終製置１．２μＭで
）とともに添加する。これらの混合物を再度３７℃で２
０時間培誉する。腫瘍細胞のＤＮＡを採取しそして標識
された前駆物質（プリカーサ−）の取込量を液体シンチ
レーションをもつβ分光計を用いて測定する。

結果 マクロファージの活性化は単独で培養された腫瘍細胞と
比較してマクロファージの存在下で培養された腫瘍細胞
の成長抑制（３Ｈ−ＴｄＲの取込量の減少）が認められ
ることから明らかである。培地単独で処理されたマクロ
ファージは活性化されない、また°空の”リポソーム、
リン脂質コθμｆ／−〜μ００μｒ／ａｇ　、で予備培
養されたマクロファージも標的細胞の成長の認め得る抑
制を示さない。

ｒ 他方、Ｍ　’ｌ’　Ｐ　Ｃｈ　ｏ　１を含むリポソーム
は上記したすべてのａｔにおいてマクロファージを活性
化し、＋、　＊がって腫瘍細胞の成長を顕著に抑制し得
る。

第Ｖ光にＭＴＰＣｈｏｌを含む（θ、１７μシー）又は
含まないリポソームｌゴ当９２０μＶのリン脂質コθＨ
Ｑを用いて得られ定結果を示す。

第　　Ｖ　　表 マクロファージの予備処理　　下記の作用因子／標的細
胞比でマクロファージを含む標的細胞の成長 （腫瘍のみのｑｈ） コ　　　　昼　　　　ｒ ”９の＝ｌＪボア　−，１，７４Ａ　　　　６１　　　
７Ｊリポソーム−ＭＴＰＣｈｏｌ　　　　　　≠７　　
　　　　／Ｊ　　　　　　１０実施例μ 肺胞炎マクロファージの生体内活性化試験実施例３にお
けるごとく調製したリポソームをＭＴＰＣｈｏｌを配合
し又は配合することなく使用する。ラットにｏ、ｏｒａ
ｑ７ｋｆのＭＴＰＣｈｏｌを含む又は含まないＰＬＭ：
コレステロールリポソームの形のＰＬＭ１０１１／ｋｌ
を静脈内注射する。

２４１時間後、これらのラットを殺しそして肺胞炎マク
ロファージを採取する。これらのマクロファージは前述
し友ごとき同遺伝子型標的細胞に対する静細胞作用（ｅ
ｙｔｏ蓼ｔａｔｉｅ　ｐｏｗｅｒ　）について予め試験
されたものである。

結果 これらの結果を成長抑制率（Ｇ、１．４　）として下記
のごとく表わす。

Ｇ、ｉ　、優＝（／−Ｘ／Ｒ）Ｘ１００ただし、 Ｘ　Ｉｄ　該ＩＪボンームで処理されたラットから採取
したマクロファージの存在下で培養された標的細胞によ
る５Ｈ−ＴｄＲの取込み量であり、Ｒ＃′ｉ対照試験の
ラットからのマクロファージの存在下で培養された標的
細胞による３Ｈ−ＴｄＲの取込み量である。

これらの結果から、°空の”リポソームは若干のマクロ
ファージを活性化し得るが、該リボソ−人中にＭＴＲＣ
ｈｏｌを配合すると恩着な活性比が生ずることが認めら
れる（第■表参照）。

μ　　　　　　　　　　　　を 実施例よ ＭＤＰ誘導体含有リポソームによる処理が生体内におけ
る肺胞転移の形成に及ぼす効果ラットに同遺伝子型腫瘍
細胞（フィブロ七スチオサイトームｐ７７細胞）をラッ
ト当り細胞数ｊＸ１０５個の量で静脈内注射した。一群
のラットはＰＢＳ緩衝溶液０．３よｄ中にＭＴＰＣｈｏ
Ｌを含むリポソームで、ｔｍｙ７ｗのリン脂質用量、す
なわち０．０１■／−のＭＴＰＣｈｏｌ用量で静脈内注
射により処理した。これらの注射は腫瘍ａ／＠を注射し
た日を０として、７日目、３日目、７日目、／。

Ｂ１及び／４をＢ１に行なった。

第二群のラットには′空の”リポソーム（すなわちＭＴ
ＰＣｈｏｌを配合しない）を注射し、第三群のラットは
非処理のま＼とした。腫瘍細胞移植／Ｊ’日後に各群の
ラットを殺しそして肉眼で観察できる肺胞転移細胞数（
ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｅｔａ
ｓｔａｓａｓ　）を数えた。

結果を第１表に示す。

第１表 処　　理　　　　転移細胞数 （平均値上標準偏差） 非処理　　　　　　９６±／１ “空の”リポソーム　　　　　タＯｆｊリポソーム−Ｍ
ＴＰＣｈｏ　ｌ＊４１１　：Ｉ：／　２これらの結果は
”空の”リポソームは腫瘍の拡展に対して効果を示さな
いが、ＭＴＰＣｈｏｌを含むリポソームは肉眼で認め得
る転移細胞数をｊＯ僑減少せしめたことを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リン脂質としてホスファチジルイノシトール・マン
   ノシド類が用いられてあることを特徴とする、リン脂質
   を基材としたリポソーム。 ２、ホスファチジルイノシトール・マンノシド類はミコ
   バクテリウム属微生物の抽出物である特許請求の範囲第
   １項記載のリポソーム。 ３、ホスファチジルイノシトール・マンノシド類は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ及びＲ′は夫々に、炭素数１１〜２５の脂肪
   族基を示し、この脂肪族基は場合により２重結合を含有
   してもよく、（Ｍａｎ）＿ｘはイノシトールに結合した
   少なくとも１つのマンノシド基を示し、ｘはマンノース
   単位の数を示す〕で表わされるものである特許請求の範
   囲第１項記載のリポソーム。 ４、Ｒ及びＲ′は夫々に、ミリスチン酸、パルミチン酸
   、ステアリン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、オレイン
   酸の如きオクタデセン酸、パルミトレイン酸、ネルボン
   酸及び１０−メチルステアリン酸からなる群から選ばれ
   る酸の残基を示す特許請求の範囲第３項記載のリポソー
   ム。 ５、ｘが１〜５の範囲の数である特許請求の範囲第３項
   記載のリポソーム。 ６、ホスファチジルイノシトール、マンノシド類は次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ及びＲ′は夫々に、炭素数１１〜２５の脂肪
   族基を示し、この脂肪族基は場合により２重結合を含有
   してもよく、Ｚは水素原子又は −（Ｍａｎ）＿ｙ（但し（Ｍａｎ）は少なくとも１つの
   マンノシド基である）を示し、ｙは１〜４の範囲の数で
   ある〕で表わされるホスファチジルミオイノシトール・
   マンノシドである特許請求の範囲第１項記載のリポソー
   ム。 ７、リン脂質小胞の透過性減少剤も含有する特許請求の
   範囲第１項記載のリポソーム。 ８、リン脂質小胞の透過性減少剤はステロールである特
   許請求の範囲第７項記載のリポソーム。 ９、ステロールはコレステロールである特許請求の範囲
   第１項記載のリポソーム。 １０、リン脂質小胞の透過性減少剤とリン脂質との重量
   比が２〜１０の範囲にある特許請求の範囲第７項記載の
   リポソーム。 １１、特許請求の範囲第１項記載のリポソーム中にモノ
   サイト（単核白血球）活性化物質又はマクロファージ（
   大食細胞）活性化物質又はこれら両者を封入してなる免
   疫賦活剤組成物。 １２、モノサイト又はマクロファージ活性化物質はムラ
   ミルジペプチド又はこれの誘導体、あるいはガンマーイ
   ンターフェロンである特許請求の範囲第１１項記載の組
   成物。