本專利申請案主張美國臨時專利申請案序列第62/242,835號(申請於2015年10月16日)、第62/242,873號(申請於2015年10月16日)、第62/244,061號(申請於2015年10月20日)及第62/244,082號(申請於2015年10月20日)之權益，該等申請案各以其全文引用的方式併入本文中。
穩定之喜樹鹼組合物可包括囊封一或多種喜樹鹼化合物之脂質體。脂質體可用於投與醫藥品，包括化療劑。本發明提供穩定之喜樹鹼化合物之含磷脂組合物，例如，脂質體伊立替康，其可產生較少量的溶血磷脂(例如溶血PC)。
喜樹鹼脂質體可以捕獲劑囊封喜樹鹼於脂質組合物(例如含磷脂微脂粒)內部。例如，圖1A顯示描繪具有約110 nm之直徑且具有囊封伊立替康之脂質膜的伊立替康脂質體的示意圖。該示意圖中的脂質膜包含含酯磷脂MPEG-2000-DSPE。該等MPEG-2000-DSPE脂質位於雙層膜之內部及外部脂質層，因此其PEG單元分別位於脂質體中或在脂質體外表面處。圖1B顯示圖1A中所大體上描繪的脂質體之一特定實施例的截面，其中該單層脂質雙層膜包含DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE並囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯。
現已發現可製得新穎穩定之包含含酯磷脂之伊立替康脂質體組合物，其等甚至在2至8℃(諸如4℃)延長儲存後具有低溶血PC水平，該組合物包括囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯(SOS)之脂質體(伊立替康-SOS脂質體)且冷凍儲存期間溶血PC之形成顯著減少。本發明部分係基於許多出乎意料的觀察結果。第一，當所囊封伊立替康的量相對所共囊封之SOS捕獲劑的量增加時，伊立替康-SOS脂質體組合物驚人地具有冷凍儲存期間實質上較少的溶血PC。第二，當含伊立替康-SOS脂質體之水性介質在製造後但於儲存前的pH高於6.5時，伊立替康-SOS脂質體組合物驚人地具有冷凍儲存期間較少的溶血PC。第三，當組合物中所檢測到的殘餘脂質體捕獲劑銨/經取代之銨陽離子的量低於100 ppm時，伊立替康-SOS脂質體組合物驚人地具有較少的溶血PC。
脂質體喜樹鹼組合物之組分脂質
相關技術中已知可為脂質體之組分的多種脂質(尤其磷脂)，諸如磷脂醯乙醇胺及磷脂醯絲胺酸，且以其他此等磷脂製造脂質體係在相關技術的技能內。在一些實施例中，本發明之脂質體係由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成。下方描述關於存於本文中所揭示脂質體製劑中之脂質之較佳實施例。
可選擇脂質體組分以製造形成囊封並滯留活性物質直到將該活性物質遞送至腫瘤部位之單層及/或多層微脂粒之脂質體雙層膜。較佳地，該脂質體微脂粒係單層的。針對經組合以製造能夠主動加載並滯留活性物質同時維持活體內低蛋白質結合且因此延長其循環壽命之脂質體時之其性質選擇該等脂質體組分。
DSPC較佳為囊封伊立替康之脂質體之雙層中主要的脂質組分(例如，佔所有脂質成分總重量之74.4%)。DSPC具有55℃之相變溫度(Tm)。
膽固醇可較佳佔所有脂質成分總重量之約24.3%。其可以可有效使脂質體磷脂膜穩定使得其等不受血漿蛋白質干擾的量併入，以減小造成脂質體從循環快速清除之血漿調理素之結合的程度，且減小與形成雙層之磷脂組合之溶質/藥物之滲透性。
MPEG-2000-DSPE可較佳佔全部脂質雙層組分總重量之約1.3%。可選擇於伊立替康脂質體表面上之其量及存在以提供防止脂質體聚集之最小空間障壁。顯示本發明之塗覆MPEG-2000-DSPE之脂質體在尺寸及藥物囊封方面穩定。
在一些實施例中，脂質體製劑之脂質膜較佳由以下成分組成：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)，其比為每200個非-PEG-磷脂分子約一個聚乙二醇(PEG)改質磷脂分子。
在較佳實施例中，本發明之脂質體係由以3:2:0.015莫耳比組合的DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE之混合物製得。在較佳實施例中，本發明之脂質體製劑包含濃度為約6.81 mg/mL之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、濃度為約2.22 mg/mL之膽固醇及濃度為約0.12 mg/mL之甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)。
在更佳的實例中，本發明之脂質體製劑包含濃度為6.81 mg/mL之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、濃度為2.22 mg/mL之膽固醇及濃度為0.12 mg/mL之甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)。
喜樹鹼組成物捕獲劑
在一些實施例中，本發明之脂質體囊封一或多種捕獲醫藥品於脂質體中之藥劑(後文稱為捕獲劑)。該捕獲劑較佳包含具有複數個帶負電基團之聚陰離子化合物，或包含兩種或更多種不同此等化合物之組合。在非限制性實例中，該聚陰離子捕獲劑為二價陰離子、三價陰離子、多價陰離子、聚合多價陰離子、聚陰離子化多元醇或聚陰離子化糖。在本發明之內文中，聚陰離子捕獲劑可為聚陰離子化多元醇或糖，諸如其羥基經陰離子基團完全或部分改質或置換(陰離子化)之多元醇或糖。在一非限制性實例中，聚陰離子化多元醇或聚陰離子化糖可包含多元醇單元或糖單元及連接至其之陰離子基團。較佳地，當於水性介質時，聚陰離子化糖或聚陰離子化多元醇捕獲劑之至少一個陰離子基團在pH 3至12，較佳pH 6.5至8之pH範圍內超過50%發生離子化，或，替代性地，該(等)陰離子基團具有3或更小，較佳2或更小之pKa。在一較佳實施例中，該捕獲劑包含具有1.0或更小之pKa之硫酸酯部分。在一非限制性實例中，聚陰離子捕獲劑之每單位例如碳鏈中的每個碳原子或環或糖中每單醣單位可具有至少兩個、三個或四個帶負電基團之電荷密度。
在本發明之一些實施例中，可藉由將聚陰離子化糖或聚陰離子化多元醇與一或多個其他單價或多價陰離子(例如，氯離子、硫酸根、磷酸根等)之混合物用作捕獲劑來提高脂質體組合物之釋放速率。在提高緩釋組合物之釋放速率之另一個非限制性實例中，將具有不同聚陰離子化程度之不同聚陰離子化糖及/或聚陰離子化多元醇之混合物用作捕獲劑。
在一些實施例中，例如，利用捕獲脂質體之喜樹鹼或喜樹鹼衍生化合物，本發明脂質體內部聚離子化的程度為脂質體內部總陰離子之90%以上、或99%以上、或介於0.1%與99%之間、10%與90%之間、或20%與80%之間。
在一些實施例中，該捕獲劑為硫酸化糖及/或多元醇。本發明之例示性硫酸化糖為硫酸化蔗糖，包括(但不限於)蔗糖六硫酸酯、蔗糖七硫酸酯及蔗糖八硫酸酯(參見Ochi. K.等人，1980, Chem. Pharm. Bull., 第28卷，第638至641頁)。類似地，在鹼觸媒的存在下，與磷醯氯或氯磷酸二乙酯反應，得到聚磷酸化多元醇或糖。亦自天然來源單離聚磷酸化多元醇。例如，可自玉米單離肌醇聚磷酸酯(諸如肌醇六磷酸酯(植酸))。多種適於實踐本發明之硫酸化、磺化及磷酸化糖及多元醇係揭示於例如美國專利第5,783,568號中，該案係以其全文引用方式併入本文中。多元醇及/或糖與多於一個硼酸分子複合，亦得到聚陰離子化(聚硼酸化)產物。多元醇及/或糖在鹼的存在下與二硫化碳反應，得到聚陰離子化(聚硫代碳酸酯化、聚黃原酸酯)衍生物。聚陰離子化多元醇或糖衍生物可呈游離酸形式單離得，且利用適宜的鹼，例如，利用鹼金屬氫氧化物、氫氧化銨，或較佳利用經取代之胺，例如，與本發明之經取代之銨對應之胺(呈純形式或呈經取代之氫氧化銨形式)中和，得到本發明經取代之銨之聚陰離子鹽。或者，可單離聚陰離子化多元醇/糖之鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋇鹽或鎂鹽並藉由任何已知的方法(例如，藉由離子交換)轉化成適宜的形式(例如，經取代之銨鹽形式)。硫酸化糖捕獲劑之非限制性實例為硫酸化蔗糖化合物，包括(但不限於)蔗糖六硫酸酯、蔗糖七硫酸酯及蔗糖八硫酸酯(SOS)。例示性多元醇捕獲劑包括肌醇聚磷酸酯，諸如肌醇六磷酸酯(亦稱為植酸或IHP)或其他二醣之硫酸化形式。
在本發明之一個較佳實施例中，該捕獲劑為硫酸化聚陰離子，其之一非限制性實例為蔗糖八硫酸酯(SOS)。硫糖酯亦稱為蔗糖八硫酸酯(octasulfate/sucrooctasulfate)(SOS)。製備呈各種鹽(例如，銨鹽、鈉鹽或鉀鹽)形式之蔗糖硫酸酯之方法在相關領域中係熟知的(例如，美國專利4,990,610，該專利係以其全文引用之方式併入本文中)。蔗糖八硫酸酯(亦稱為硫糖酯)為具有呈其全質子化形式之式(II)之結構之蔗糖之經全取代硫酸酯：
。
製備呈各種鹽(例如，銨鹽、鈉鹽或鉀鹽)形式之硫糖酯之方法在相關領域中係熟知的(參見，例如，美國專利第4,990,610號，該專利係以其全文引用之方式併入本文中)。同樣地，可設想其他二醣(例如，乳糖及麥芽糖)之硫酸化形式，以製備乳糖八硫酸酯及麥芽糖八硫酸酯。
在一些實施例中，本發明之脂質體調配物包含喜樹鹼化合物(諸如伊立替康或拓樸替康)及陰離子捕獲劑(諸如SOS)。本發明之脂質體較佳包含以化學計量比的喜樹鹼化合物與陰離子捕獲劑。例如，伊立替康脂質體調配物可囊封約8:1莫耳比的伊立替康及蔗糖八硫酸酯。穩定之脂質體組合物可囊封式(I)(其中x為約8)之伊立替康組合物：
。
該脂質體伊立替康可包括囊封於脂質體中之式(I)組合物。較佳地，該式(I)組合物係形成(例如沉澱)於包含膽固醇及一或多種磷脂(例如，包括含PEG磷脂)之脂質體中。例如，可藉由使(1)喜樹鹼化合物(例如，伊立替康、拓樸替康及類似物)與(2)囊封聚硫酸化陰離子捕獲劑 (例如，蔗糖八硫酸酯)之脂質體以形成穩定之脂質體伊立替康組合物之製程反應，於脂質體中形成式(I)之化合物。較佳地，該脂質體伊立替康組合物具有大於6.5(例如，7.0至7.5，包括7.25、7.3及7.5)之pH。
較佳的穩定之喜樹鹼組合物包括脂質體伊立替康。
穩定之喜樹鹼組合物包括含有伊立替康或其鹽之高密度喜樹鹼化合物脂質體調配物，伊立替康部分之濃度等效於由4.5至5.5 mg/mL鹽酸伊立替康三水合物所提供者(即3.9至4.8 mg/mL無水伊立替康游離鹼)，且包含濃度為6.13至7.49 mg/mL(較佳約6.81 mg/mL)之DSPC、濃度為2至2.4 mg/mL(較佳約2.22 mg/mL)之膽固醇及濃度為0.11至0.13 mg/mL(較佳約0.12 mg/mL)之MPEG-2000-DSPE，及其特徵係在冷凍儲存(2至8℃)期間存在少量溶血PC(若存在)，同時亦提供適宜量的喜樹鹼化合物(較佳呈更有效之內酯形式)。本發明包括製造後可在冷凍(即2至8℃)下儲存至少前6個月，較佳至少前9個月而不形成高於20莫耳%之溶血PC水平之醫藥喜樹鹼化合物脂質體組合物。更佳地，本發明提供組合物，其包含某一等效於由4.7至5.3 mg/mL鹽酸伊立替康三水合物 (即，4.1至4.6 mg無水伊立替康部分游離鹼)(伊立替康可呈囊封於脂質體中之蔗糖八硫酸酯形式存在)所提供者之量之伊立替康部分、及6.4至7.2 mg/mL之DSPC、2.09至2.35 mg/mL之膽固醇及約0.113至0.127 mg/mL之MPEG-2000-DSPE，該組合物當在2至8℃儲存6或9個月時含不超過20莫耳%之溶血PC或當在2至8℃儲存21個月時含不超過2 mg/mL之溶血PC。
伊立替康 / 硫酸酯化合物克 - 當量比 (ER) 之計算
可藉由確定每單位(例如1 mL)脂質體組合物之經脂質體共囊封之伊立替康(I)及硫酸酯化合物(S)的莫耳量，及利用公式：ER = I/(SN)，其中N為硫酸酯化合物陰離子的價數(例如，對於硫糖酯而言，N為8，及對於游離硫酸根SO
4 2-
而言，N為2)，計算得每種伊立替康製劑之伊立替康/硫酸酯化合物克-當量比(ER)。例如，含7.38 mM伊立替康及1.01 mM硫糖酯(N=8)之脂質體伊立替康硫糖酯組合物將具有為7.38/(1.01x8)=0.913之ER。較佳地，硫酸酯化合物(S)為每莫耳SOS含8個硫酸酯部分之蔗糖八硫酸酯。該脂質體組合物將具有7.1至7.5之pH且具有一種以下ER範圍：較佳地，0.85至1.2、0.85至1.1，或最佳地，0.9至1.05，諸如約1.02。或者，該脂質體組合物將具有等效於由500 g(±10%)無水伊立替康游離鹼/mol磷脂所提供者之伊立替康部分量且具有一種以下ER範圍：較佳地，0.85至1.1，最佳地，0.9至1.05，諸如約1.02。
穩定之喜樹鹼組合物之 pH
可調整或以其他方式選擇脂質體組合物之pH以提供期望之儲存穩定性性質(例如，減少4℃儲存經過180天期間脂質體中溶血PC之形成)，例如，藉由製備pH為約6.5至8.0或其間的任何適宜pH值(包括，例如，7.0至8.0、及7.25)之組合物。在一些實施例中，該pH為約6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。如本文所述，如更詳細所提供，製備具有特定pH值、等效於由無水伊立替康游離鹼濃度(mg/mL)所提供者之伊立替康部分及各種濃度之蔗糖八硫酸酯之伊立替康脂質體。更佳地，在製造後但於儲存前之pH係介於7.1與7.5之間且甚至更佳地，介於約7.2與7.3之間，且最佳地，為約7.25。可藉由標準方法，例如，適宜地使用1N HCl或1N NaOH來調整該pH。
在本發明之一些實施例中，在製造後但於儲存前脂質體伊立替康製劑之pH大於6.5，較佳地，介於7.2與7.3之間。在本發明之一些實施例中，該pH為7.2至7.5。
穩定之喜樹鹼組合物之化合物克 - 當量比 ( 「 ER 」 )
穩定之脂質體喜樹鹼組合物可具有大於6.5之pH且包括囊封伊立替康及具有大於0.9(例如，0.9至1.1)之伊立替康/硫酸酯化合物克-當量比(「ER」)的硫酸酯聚陰離子捕獲劑之脂質體。可藉由確定每單位(例如1 mL)脂質體組合物之經脂質體共囊封之伊立替康(I)及硫酸酯化合物(S)的莫耳量，及利用公式：ER = I/(SN)，其中N為硫酸酯化合物陰離子的價數(例如，對於硫糖酯而言，N為8，及對於游離硫酸根SO
4 2-
而言，N為2)，I為脂質體伊立替康組合物中所囊封伊立替康的濃度，及S為脂質體伊立替康組合物中所囊封蔗糖八硫酸酯之硫酸酯基的濃度，計算得伊立替康SOS脂質體製劑之ER。較佳地，硫酸酯化合物(S)為每莫耳SOS含8個硫酸酯部分之蔗糖八硫酸酯。
雖然以直接確定脂質體伊立替康組合物(S·N)中所囊封蔗糖八硫酸酯硫酸酯基之濃度為較佳，但亦可從脂質體磷脂濃度(P，mol/L)、脂質體內部空間中之SOS硫酸酯基濃度(用於製備捕獲劑脂質體之溶液中SOS硫酸酯基之濃度；參數B，參見本文中之穩定比定義)及每單位脂質體磷脂之脂質體內部(截留)體積(即，錯隔於脂質體微脂粒內部空間中之體積(Ve，L/mol磷脂))確定S·N：
S·N = P·Ve·B
舉例而言，對於藉由透過100 nm聚碳酸酯過濾器擠出得到的磷脂醯膽鹼-膽固醇脂質體而言，截留體積可接近1.7 L/mol磷脂(Mui等人 1993, Biophys.J., 第65卷，第443至453頁)。在此情況中，以471 g/mol磷脂及0.45M之SOS硫酸酯基濃度定量加載伊立替康(分子量586.7)至囊封SOS之脂質體中，將得到以下之ER
(471/586.7)/(1.7·0.45) = 1.049
當以0.65M硫酸酯基之SOS濃度時，ER將為：
(471/586.7)/(1.7·0.65) = 0.726
類似地，以500 g(±10%)/mol磷脂及0.45M之SOS硫酸酯基濃度定量加載伊立替康(分子量586.7)至囊封SOS之脂質體中，將得到約1.11之ER，當以0.65M硫酸酯基之SOS濃度進行時，ER將為約0.77。
製備穩定之喜樹鹼組合物
穩定之喜樹鹼組合物可包含喜樹鹼脂質體。脂質體已用於投與醫藥品，包括化療藥物。相關技術一般已知關於囊封藥物之脂質體之各種技術及其製法且因此不以任何細節形式在本文中進一步描述。參見，例如，美國專利第8,147,867號，該專利係以其全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，囊封一或多種喜樹鹼化合物於微脂粒中之脂質體包含至少一種磷脂。可依包括以下之多步驟法將該喜樹鹼化合物例如加載或以其他方式截留於脂質體中：(a)形成囊封陰離子捕獲劑及陽離子於含磷脂之脂質體微脂粒中之捕獲劑脂質體，及(b)於隨後使該捕獲劑脂質體與該喜樹鹼化合物在可有效加載喜樹鹼化合物至捕獲劑脂質體中並滯留該喜樹鹼化合物於具有捕獲劑之脂質體內部之條件下接觸以形成喜樹鹼脂質體。
可利用跨脂質體膜梯度將該等喜樹鹼化合物加載至捕獲劑脂質體中，造成該等喜樹鹼化合物進入捕獲劑脂質體中以形成喜樹鹼脂質體。較佳地，該等捕獲劑脂質體具有跨膜濃度梯度之跨膜陽離子，諸如銨或經取代之銨，當加熱超過脂質體之脂質組分之相變溫度時，可有效使得捕獲劑脂質體中之銨/經取代之銨交換為喜樹鹼化合物。較佳地，捕獲劑在捕獲劑脂質體中之濃度相較在其周圍的介質中而言更大。此外，該等捕獲劑脂質體可包含一或多種除了由銨/經取代之銨陽離子產生的梯度之外的跨膜梯度。例如，包含於捕獲劑脂質體組合物中之脂質體可另外或替代性地包含跨膜pH梯度、離子梯度、電化學電位梯度及/或溶解度梯度。
在一些實施例中，用於製備脂質體之捕獲劑(例如，SOS及/或另一硫酸化多元醇捕獲劑(包括其可接受之鹽))具有0.3至0.8、0.4至0.5、0.45至0.5、0.45至0.475、0.45至0.5、0.3、0.4、0.45、0.475、0.5、0.6、0.7或0.8M硫酸酯基之濃度，例如，該等特定值±10%。在一個較佳實施例中，用於製備脂質體之捕獲劑為SOS且具有約0.45至約0.475M硫酸酯基之濃度。在一個更佳的實施例中，用於製備脂質體之捕獲劑為SOS且具有0.45M或0.475M硫酸酯基之濃度。
較佳地，在適宜的溫度，例如，在加載期間超過組分磷脂之第一相變溫度而在加載喜樹鹼化合物後降低至低於該組分磷脂之第一相變溫度之溫度，較佳在約室溫下，將喜樹鹼化合物與捕獲劑脂質體在水性介質中培養，使喜樹鹼化合物加載至捕獲劑脂質體中。培養時間通常基於組分脂質的性質、意欲加載至脂質體中之喜樹鹼化合物及培養溫度。典型地，幾分鐘(例如30至60分鐘)至幾小時之培養時間係足夠的。
因為達到大於85%，典型地大於90%之高截留效率，故通常不需要移除未包覆的實體。然而，若有此種需要，則可藉由各種方法(諸如(例如)尺寸篩除層析、透析、超過濾、吸附及沉澱)從組合物移除未截留的喜樹鹼化合物。
在一些實施例中，該等喜樹鹼脂質體為伊立替康脂質體。可藉由包括以下步驟之方法來製備該等伊立替康脂質體：(a)製備呈硫糖酯之三乙基銨鹽(TEA-SOS)形式之含三乙胺(TEA)之脂質體，及(b)於隨後使該TEA-SOS脂質體與伊立替康在可有效地使伊立替康進入脂質體且允許對應量之TEA離開該脂質體(由此消除或減小TEA跨所得脂質體之濃度梯度)之條件下接觸。
喜樹鹼脂質體藥物加載期間之脂質體外離子強度
在本發明之一些實施例中，在小於等效於50 mM NaCl之離子強度，或更佳地，小於等效於30 mM NaCl之離子強度之離子強度下的水溶液中進行脂質體之喜樹鹼加載。於藥物的加載後，可添加更大濃度的鹽溶液(例如NaCl溶液)以提高離子強度至高於等效於50 mM NaCl之離子強度，或更佳地，高於等效於100 mM NaCl，較佳等效於約140至160 mM NaCl之間之離子強度。
捕獲劑陽離子
本發明之陽離子可在加熱超過如上所述脂質組分之相變溫度時以可有效將喜樹鹼化合物加載至捕獲劑脂質體中的量囊封於捕獲劑脂質體中。該等陽離子係經選擇使得其等可在加載喜樹鹼化合物至脂質體中期間離開捕獲劑脂質體。可在製得加載有喜樹鹼化合物之脂質體後移除脂質體外陽離子。
在本發明之一些實施例中，脂質體中之陽離子連同捕獲劑為經取代之銨化合物。在本發明之一些實施例中，該經取代之銨化合物具有至少約8.0之pKa。在本發明之一些實施例中，該經取代之銨化合物具有如在水溶液中於環境溫度下測得至少約8.0、至少約8.5、至少約9.0、至少9.5、至少10.0、至少10.5或至少11.0之pKa。在本發明之一些實施例中，該經取代之銨化合物具有約8.0至12.0、約8.5.至11.5或約9.0至11之pKa。在一個較佳實施例中，pKa為約TEA之pKa，或約DEA之pKa。
此等經取代之銨化合物之非限制性實例為下式之化合物：N(R
1
)(R
2
)(R
3
)(R
4
)
+
，其中R
1
、R
2
、R
3
及R
4
各者獨立地為氫或具有總共至多18個碳原子之有機基團且其中R
1
、R
2
、R
3
及R
4
中之至少一者為有機基團，其係具有至多8個碳原子之烴基，該烴基可為烷基、亞烷基、雜環烷基、環烷基、芳基、烯基或環烯基或其經羥基取代之衍生物，其烴部分中視情況包含一或多個形成醚、酯、硫醚、胺或醯胺鍵之S、O或N原子。該經取代之銨可為空間位阻銨化合物(例如，具有至少一個具有與銨氮原子直接連接之第二或第三碳原子之有機基團)。此外，R
1
、R
2
、R
3
及R
4
中之至少一者必須為氫。較佳地，該經取代之銨陽離子為三乙基銨(質子化TEA)或二乙基銨(質子化DEA)。
因喜樹鹼化合物在可有效形成喜樹鹼化合物脂質體之條件下加載至囊封陰離子捕獲劑之脂質體中，故捕獲劑脂質體中經取代之銨陽離子之濃度可減小。本發明之脂質體可包含陰離子捕獲劑及隨後被移除及/或由在隨後的藥物加載步驟中加載至脂質體中之喜樹鹼化合物置換的銨或經取代之銨陽離子。
在一個較佳實施例中，喜樹鹼化合物脂質體中銨或經取代之銨陽離子之濃度低到足可在含磷脂之喜樹鹼脂質體製劑冷凍儲存長時間後提供低量溶血PC。例如，如實例3中所述(包括圖7中之數據)，於具有小於約100 ppm，較佳介於20 ppm與80 ppm之間，較佳小於約50 ppm，甚至更佳小於約40 ppm，又更佳小於30 ppm之經取代之銨陽離子之伊立替康SOS脂質體製劑中觀察到溶血PC形成的量減少。
在一些實施例中，伊立替康SOS脂質體(諸如樣品24至29；實例之表10)包含小於100 ppm或約15至100 ppm之經取代之銨SOS捕獲劑抗衡離子。在一些實施例中，伊立替康SOS脂質體(諸如樣品24至29；實例之表10)包含約15至80 ppm之經取代之銨。在一些實施例中，伊立替康SOS脂質體包含約40至80 ppm之經取代之銨。在一些實施例中，伊立替康SOS脂質體(諸如樣品24至29；實例之表10)包含約80至100 ppm之經取代之銨。在一個較佳實施例中，以任何上述ppm濃度存在之經取代之銨係衍生自TEA或DEA。
穩定之喜樹鹼組合物之穩定比
當藉由使(1)喜樹鹼藥物與(2)囊封聚硫酸化陰離子捕獲劑之脂質體反應來製造基於磷脂之含喜樹鹼脂質體時，所得的加載藥物的脂質體之穩定性係取決於如由至少約950之穩定比所定義的喜樹鹼、陰離子捕獲劑及形成脂質體之磷脂之比，穩定比如下文所定義。穩定比係取決於捕獲劑-脂質體中硫酸酯基之初始濃度及脂質體中之所囊封喜樹鹼與磷脂之比。如本文中所使用，穩定比(「SR」)定義如下：
SR = A/B，
其中：
a. A為藥物加載過程期間囊封於捕獲劑脂質體中之伊立替康部分之量，單位為組合物中每莫耳磷脂之等效於無水伊立替康游離鹼的克數；及
b. B為用於製造捕獲劑脂質體之硫糖酯(或其他捕獲劑)溶液中硫酸酯基之濃度，表示為莫耳/升(以硫酸酯基的濃度計)。
就確定穩定比而言，由諸如實例中所述的分析法確定脂質體製劑中磷脂之莫耳數。據此計算得進行脂質體加載之伊立替康部分的量(上述A)。
就確定穩定比而言，硫糖酯(或其他捕獲劑)溶液中硫酸酯基之濃度B(表示為莫耳/升)係計算為添加至脂質(該等脂質通常係溶解於醇中，其體積通常為添加至脂質之捕獲劑溶液之體積之10%或小於該體積)之溶液中硫糖酯(或本文所揭示之其他捕獲劑)之濃度(單位為莫耳/升)。因此，就硫糖酯而言，硫酸酯基之濃度B為硫糖酯之濃度乘以8(即，一個硫糖酯分子中硫酸酯基之數量)、或乘以所使用的特定捕獲劑之硫酸酯基之數量。(參見實例1。)
在本發明之一些實施例中，穩定比及pH均增加至大於6.5。因此，在本發明之某些較佳實施例中，穩定比為942至1130，且pH為7.2至7.5，且伊立替康及SOS捕獲劑係以約8:1莫耳比存於脂質體組合物中。較佳地，穩定比為942至1130，pH為約7.25，且伊立替康組合物及SOS捕獲劑係以8:1莫耳比存於脂質體中。可以類似方式控制囊封其他喜樹鹼化合物之脂質體調配物中溶血PL(且特定言之溶血PC)之量。
例如，該等新穎的穩定之伊立替康脂質體製劑可具有相比依其他方法製得的伊立替康SOS脂質體少80%之溶血PC(例如，冷凍儲存9個月後，相比比較樣品12中所觀察到少80%之溶血PC)。在以0.65M之硫酸酯基濃度下以8:1莫耳比的三乙胺(TEA)及蔗糖八硫酸酯(「SOS」或「硫糖酯」)[(TEA)
8
SOS]的存在下加熱具有3:2:0.015莫耳比之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)之脂質混合物，以產生TEA-SOS捕獲劑脂質體，來製得以約724之穩定比之樣品12之(比較)脂質體伊立替康。移除未囊封於TEA-SOS捕獲劑脂質體中之(TEA)
8
SOS後，使用伊立替康之溶液在導致以下之條件下將伊立替康加載至所得的含TEA-SOS捕獲劑脂質體之製劑中：移除TEA且將由TEA-SOS捕獲劑脂質體製劑中500 g(±10%)無水伊立替康游離鹼/莫耳磷脂所提供者之總量之伊立替康加載至脂質體中。伊立替康脂質體組合物之pH為6.5(依本文實例部分中之子部分「pH測量」測得)，伊立替康脂質體中每mL伊立替康脂質體組合物為4.3 mg伊立替康部分。該等含磷脂醯膽鹼脂質體伊立替康組合物在冷凍儲存(2至8℃)3個月期間產生30莫耳%超量(相對伊立替康脂質體組合物中磷脂醯膽鹼之總量計)之溶血PC水平(且在9個月期間，產生超過35莫耳%之溶血PC)。
例示性實施例中穩定比及溶血 PC 含量之計算
依本文所述方法(製備及表徵各樣品之其他實驗細節包含於下方實例中)製備一系列不同伊立替康脂質體製劑。伊立替康脂質體製劑各者中所測得的溶血PC之含量匯總於表1A(在冷凍儲存9個月後進行之溶血PC測量)及表1B(在冷凍儲存6個月後進行之溶血PC測量，對於表1A中所列的子組樣品而言)中。各伊立替康脂質體製劑包含直徑約110±20 nm，較佳110±10 nm之囊封伊立替康與蔗糖八硫酸捕獲劑之單層狀雙層脂質體。該等脂質體係由具有3:2:0.015莫耳比的DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE之混合物形成且接著以每莫耳磷脂約471 g伊立替康部分(提供等效於500 g(±10%)無水伊立替康HCl之伊立替康部分量之伊立替康或其鹽)之濃度加載伊立替康。各伊立替康脂質體製劑包含不同量之SOS捕獲劑且在不同pH值進行調配。在不同的時間點測量各伊立替康脂質體製劑中溶血PC之含量，包括在連續冷凍儲存(於4℃下)9個月後所有樣品之測量值。利用SOS之質子化TEA抗衡離子來加載表1A中之所有樣品(即，使伊立替康加載至囊封如表1A中所指定之不同濃度之TEA
8
SOS之脂質體中)。
表 1A
：
伊立替康脂質體穩定比及溶血 PC( 於 4 ℃ 下， 9 個月後 )a | 樣品 | 截留於脂質體中之硫糖酯中硫酸酯基之莫耳(M)濃度 | 穩定比 | pH | 9個月時之[溶血PC之莫耳%] |
| 比較例(12) | 0.65 | 724 | 6.5 | 35.4 |
| 1 | 0.45 | 1047 | 6.5 | 25.4 |
| 2 | 0.475 | 992 | 6.5 | 23.6 |
| 3 | 0.5 | 942 | 6.5 | 35.7 |
| 4 | 0.6 | 785 | 6.5 | 35.8 |
| 5 | 0.45 | 1047 | 7.25 | 11.1 |
| 6 | 0.45 | 1047 | 6.5 | 17.4 |
| 7 | 0.45 | 1047 | 7.25 | 8.1 |
| 8 | 0.45 | 1047 | 7.5 | 7.1 |
| 9 | 0.6 | 785 | 6.5 | 34.7 |
| 10 | 0.6 | 785 | 7.25 | 29 |
| 11 | 0.6 | 785 | 7.5 | 28.7 |
| 13 | 0.45 | 1047 | 7.25 | 13.8 |
| 14 | 0.65 | 724 | 6.5 | 32.1 |
a
依如本文中所述之方法B測得。
圖2A顯示描繪在4℃儲存9個月後於表1A中之各樣品中測得的溶血PC之含量的圖。樣品12標記為表1A及圖2A中之比較例。具有大於約900之穩定比及大於6.5(例如，7.25及7.5)之pH兩者之樣品在4℃冷凍儲存9個月後包含小於20莫耳%之溶血PC。圖2C為穩定比值對在4℃儲存6個月後液體伊立替康脂質體組合物之溶血PC之相對含量(莫耳%)(表6中之數據)的圖。以開口圓指示之數據點對應於具有在製造後但於儲存前測得之大於6.5(7.25或7.5)之pH之伊立替康樣品。以菱形指示之數據點對應於具有在製造後但於儲存前測得之6.5之pH之伊立替康樣品。在各樣品之製造期間，如本文中所定義計算得穩定比。在製得各樣品之後，在儲存的前6個月後測量溶血PC之莫耳%。
表 1B
：
伊立替康脂質體穩定比及溶血 PC( 於 4 ℃ 下， 6 個月後 )b | 樣品 | 截留於脂質體中之硫糖酯中硫酸酯基之莫耳(M)濃度 | 穩定比 | pH | 6個月時之[溶血PC之莫耳%] |
| 1 | 0.45 | 1047 | 6.5 | 19.5 |
| 2 | 0.475 | 992 | 6.5 | 17 |
| 3 | 0.5 | 942 | 6.5 | 26.5 |
| 4 | 0.6 | 785 | 6.5 | 30.2 |
| 5 | 0.45 | 1047 | 7.25 | 7.1 |
| 6 | 0.45 | 1047 | 6.5 | 14.6 |
| 7 | 0.45 | 1047 | 7.25 | 7.4 |
| 8 | 0.45 | 1047 | 7.5 | 5.4 |
| 9 | 0.6 | 785 | 6.5 | 29.8 |
| 10 | 0.6 | 785 | 7.25 | 24.1 |
| 11 | 0.6 | 785 | 7.5 | 22.8 |
| 13 | 0.45 | 1047 | 7.25 | 9.72 |
b
依如本文中所述之方法B測得。
圖2B顯示描繪在4℃儲存6個月後於表1B之各樣品中測得的溶血PC之含量的圖。具有大於約989之穩定比及大於6.5(例如，7.25及7.5)之pH兩者之樣品在4℃冷凍儲存6個月後包含小於20莫耳%之溶血PC。
圖3A至3D為顯示選自表1A及1B之具有6.5之pH之伊立替康脂質體製劑中溶血PC之莫耳%的圖。各樣品在4℃儲存0個月、1個月、3個月、6個月、9個月及/或12個月後測定溶血PC。該等圖包括對數據之線性回歸線，作為對各樣品中溶血PC(莫耳%)隨時間增加之速率的估算。各圖之斜率、y-截距及R
2
值之匯總顯示於下表1C中。
表 1C
：
pH 6.5 下溶血 PC 之莫耳 % 對冷凍儲存時間 ( 月 ) | 圖 | 樣品 | 穩定比 | y-截距(溶血PC 莫耳%) | 斜率(每個月溶血PC之莫耳%) | R2 |
| 3A | 1 | 1047 | 2.8 | 2.6 | 0.9909 |
| 3A | 6 | 1047 | 4.8 | 1.5 | 0.97763 |
| 3B | 2 | 992 | 3.5 | 2.2 | 0.9999 |
| 3B | 3 | 942 | 6.8 | 3.2 | 0.9996 |
| 3C | 4 | 785 | 11.1 | 2.8 | 0.9370 |
| 3D | 12 | 724 | 14.3 | 2.3 | 0.6838 |
| 3D | 14 | 724 | 9.6 | 2.4 | 0.9096 |
在一些實施例中，含囊封於直徑為約100 nm(例如，100 ± 20 nm)之脂質體中之伊立替康SOS之伊立替康脂質體製劑之穩定性在穩定比大於942之伊立替康脂質體的情況下係明顯增加的。藉由維持500 g(±10%)伊立替康部分(如上文所說明，以無水游離鹼計)對總磷脂之恆定藥物加載率，但改變SOS捕獲劑之濃度，來評估穩定比對脂質體製劑中溶血PC之形成之影響。表2提供表1中在如(比較)樣品12之相同pH(6.5)下但以不同SOS捕獲劑濃度(即，以不同穩定比)調配的伊立替康脂質體製劑中所檢測到溶血PC莫耳%量之匯總。表2說明含SOS捕獲劑及伊立替康之伊立替康脂質體具有大於942之穩定比可減少冷凍儲存期間溶血PC之形成。相對比較例伊立替康脂質體製劑減少SOS捕獲劑的量(即，增大穩定比)至多30%，導致在冷凍儲存9個月後溶血PC之含量略微減少約1%。然而，增加具有大於942之穩定比之伊立替康脂質體製劑中SOS捕獲劑之量，導致在4℃冷凍儲存9個月後所存在之溶血PC的量(莫耳%)明顯且意外地衰減。例如，大於942之穩定比在後來增量增加5%(即，樣品2中992之穩定比)會導致所存在溶血PC的量(莫耳%)相比樣品3大幅減小34%，等效於溶血PC的量(莫耳%)相比樣品12減少33%(如在4℃冷凍儲存9個月時測得)。總體而言，在4℃冷凍儲存9個月後，藉由提高伊立替康脂質體之穩定比超過942，使得溶血PC(莫耳%)相比比較例樣品12減少約28至51%。在一些實施例中，伊立替康SOS脂質體組合物具有超過942之穩定比。在較佳實施例中，伊立替康SOS脂質體製劑具有為942至1130或更大之穩定比(例如，992至1047之穩定比)。
表 2
：
伊立替康脂質體穩定比及溶血 PC( 於 4 ℃ 下， 9 個月後， pH 6.5) | 1
樣品 | 2
穩定比 | 3
9個月時之溶血PC | 4
SR%之增加，相對比較例 | 5
9個月時之溶血PC%，相對比較例 | 6
SR%增加之增量 | 7
9個月時溶血PC%之增量 |
| 12(比較例) | 724 | 35.4 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 9 | 785 | 34.7 | +8.3 | -2 | +8 | -2 |
| 3 | 942 | 35.7 | +30 | +1 | +20 | +3 |
| 2 | 992 | 23.6 | +37 | -33 | +5 | -34 |
| 6 | 1047 | 17.4 | +44 | -51 | +6 | -26 |
| 1 | 1047 | 25.4 | +44 | -28 | +6 | +8 |
表2說明含SOS捕獲劑及伊立替康之穩定之伊立替康脂質體(pH 6.5)中具有大於942(較佳地，大於950，且最佳地，大於992)之穩定比對於減少冷凍儲存期間脂質體內溶血PC之形成具關鍵性。總體而言，藉由製備具有超過950(例如950至1050)之穩定比之伊立替康脂質體組合物(pH 6)，使得4℃儲存6個月期間脂質體內溶血PC減少約28至51%。相對用於製備比較例伊立替康脂質體製劑(比較樣品3及12)之SOS捕獲劑之對應濃度減小用於製備捕獲劑脂質體中之SOS捕獲劑之濃度(即，增大穩定比)至多30%，導致在冷凍儲存9個月後溶血PC的量略微減少約1%。然而，在加載伊立替康以形成具有992或更大之穩定比之伊立替康脂質體製劑前增加用於形成捕獲劑脂質體之SOS捕獲劑之量會導致所得伊立替康脂質體在製得後冷凍儲存的前9個月後溶血PC之形成明顯且意外地衰減。例如，表2中之數據顯示超過942之穩定比增加5%導致4℃儲存9個月後溶血PC減少34%(樣品2與樣品3相比)。穩定比從992(樣品2)增加至1047(SR增加6%)導致4℃儲存9個月後所產生之溶血PC減少26%(樣品6與樣品2相比)，及4℃儲存9個月後所產生之溶血PC增加8%(樣品1與樣品2相比)。因此，較佳的伊立替康SOS脂質體組合物具有超過1000之穩定比，包括具有1000至1200之穩定比或更大穩定比(例如，為1053至111之穩定比)之伊立替康SOS脂質體製劑。
在本發明之一些實施例中，在製造後但於儲存前提高該製劑之pH超過pH 6.5，含囊封於直徑約100±20 nm，較佳100±10 nm之脂質體中之伊立替康SOS之伊立替康脂質體製劑之穩定性明顯增加。藉由維持每莫耳磷脂471 g或500 g伊立替康部分(如上文所說明，以無水游離鹼計)之恆定藥物加載率但改變伊立替康脂質體組合物之最終pH之pH，來評估pH對脂質體製劑中溶血PC之形成之影響。表3提供表1中在不同pH值下調配的伊立替康脂質體製劑中溶血PC之含量之匯總。表3A記錄表1中由以每莫耳磷脂總計471 g伊立替康部分(如上文所說明，基於無水游離鹼計)(即，471/0.6或785之穩定比)加載脂質體(囊封硫酸酯基濃度為0.6M之TEA
8
SOS)形成之伊立替康脂質體製劑之數據。相對於樣品4及樣品9二者(此兩者在製造後但於儲存前具有pH 6.5)計算溶血PC形成之改變%。表3B記錄表1中由以每莫耳磷脂總計471 g伊立替康部分(如上文所說明，基於無水游離鹼計)(例如，471/0.45或1047之穩定比)加載脂質體(囊封硫酸酯基濃度為0.45M之TEA
8
SOS)形成之伊立替康脂質體製劑之數據。相對於樣品1及樣品6二者(此兩者在製造後但於儲存前具有為6.5之pH)計算溶血PC形成之改變%。
表 3A
：
伊立替康脂質體製劑 pH 及溶血 PC( 於 4 ℃ 下， 9 個月後， 471 g 伊立替康部分 /mol 磷脂， 0.6M SOS 硫酸酯基濃度 ) | 樣品 | 穩定比 | 於9個月時之溶血PC | pH | 於9個月時相對樣品4之溶血PC% | 於9個月時相對樣品9之溶血PC% |
| 4 | 785 | 35.8 | 6.5 | 0 | +3% |
| 9 | 785 | 34.7 | 6.5 | -3% | 0 |
| 10 | 785 | 29 | 7.25 | -19% | -16% |
| 11 | 785 | 28.7 | 7.5 | -20% | -17% |
表 3B
：
伊立替康脂質體製劑 pH 及溶血 PC( 於 4 ℃ 下， 9 個月後， 471 g 伊立替康部分 /mol 磷脂， 0.45M SOS 捕獲劑濃度 ) | 樣品 | 穩定比 | 9個月時之溶血PC | pH | 9個月時相對樣品1之溶血PC% | 9個月時相對樣品6之溶血PC% |
| 1 | 1047 | 25.4 | 6.5 | 0 | +46% |
| 6 | 1047 | 17.4 | 6.5 | -31% | 0 |
| 5 | 1047 | 11.1 | 7.25 | -56% | -36% |
| 7 | 1047 | 8.1 | 7.25 | -68% | -53% |
| 13 | 1047 | 13.8 | 7.25 | -46% | -21% |
| 8 | 1047 | 7.1 | 7.5 | -72% | -59% |
在上文表3A及3B之數據中，使pH從6.5增加至7.25或7.5，具有785之穩定比之伊立替康SOS脂質體中溶血PC之量減少約15至20%(表3A)及具有1047之穩定比之伊立替康SOS脂質體中溶血PC之量減少約20至70%(表3B)。有鑑於先前的報告，此點係未預期的，這表明6.5之pH針對磷脂醯膽鹼水解最小化為最佳(Grit, M等人，「Hydrolysis of partially saturated egg phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions and the effect of cholesterol incorporation on hydrolysis kinetics」, The Journal of pharmacy and pharmacology (1993) 第45卷，第6期，第490至495頁)。
圖4A至4C描繪顯示於選自表1A及1B之具有7.25或7.5之pH之伊立替康脂質體製劑中各樣品於4℃儲存0個月、1個月、3個月、6個月及/或9個月後所測得的溶血PC之莫耳%之曲線。該等曲線包括各樣品中溶血PC隨時間增加之速率之線性回歸線。各圖之斜率、y-截距及R
2
值之匯總顯示於下表4中。在具有超過942(例如1047)之穩定比及7.25或7.5之pH之伊立替康脂質體製劑樣品(例如，於pH 7.25下，在圖4A及4C中比較樣品5、7及13與樣品10，或於pH 7.5下，在圖4B中比較樣品8與圖4C中樣品11)中觀測到較少量的溶血PC。此外，在9個月後於具有低於942之穩定比之伊立替康脂質體製劑中測得較多的溶血PC (例如，樣品10及11中，穩定比為785，6個月後，甚至在超過6.5之pH下，兩者均具有大於20莫耳%之溶血PC)。
表 4
：
於 pH＞6.5 下，溶血 PC 之莫耳 % 對冷凍儲存時間 ( 月數 ) | 圖 | 樣品 | pH | 穩定比 | y-截距(溶血PC莫耳%) | 斜率
(每個月溶血PC莫耳%) | R2 |
| 4A | 7 | 7.25 | 1047 | 2.4 | 0.68 | 0.9217 |
| 4A | 5 | 7.25 | 1047 | 0.73 | 1.1 | 0.9946 |
| 4A、4B | 13 | 7.25 | 1047 | 1.2 | 1.4 | 0.9999 |
| 4B | 8 | 7.50 | 1047 | 1.3 | 0.65 | 0.9805 |
| 4C | 10 | 7.25 | 785 | 8.6 | 2.4 | 0.9732 |
| 4C | 11 | 7.50 | 785 | 8.4 | 2.3 | 0.9731 |
表 5
：
於 SR＞942 下冷凍儲存 6 及 9 個月後之溶血 PC 莫耳 % | 圖 | 樣品 | pH | 穩定比 | 6個月時之[溶血PC 莫耳%] | 9個月時之[溶血PC 莫耳%] |
| 3B | 2 | 6.5 | 992 | 17 | 23.6 |
| 3A | 1 | 6.5 | 1047 | 19.5 | 25.4 |
| 3A | 6 | 6.5 | 1047 | 14.6 | 17.4 |
| 4A | 5 | 7.25 | 1047 | 7.1 | 11.1 |
| 4A | 7 | 7.25 | 1047 | 7.4 | 8.1 |
| 4B | 13 | 7.25 | 1047 | 9.72 | 13.8 |
| 4B | 8 | 7.5 | 1047 | 5.4 | 7.1 |
額外喜樹鹼組合物
喜樹鹼組合物可為包含一或多種喜樹鹼化合物及一或多種磷脂之緩釋組合物，在製得喜樹鹼組合物(例如，當將喜樹鹼組合物密封於用於醫藥投與之無菌容器中時開始)，接著冷凍儲存(即2至8℃)一段時間後，產生減少量的溶血磷脂。
該等穩定之緩釋組合物可包括含喜樹鹼化合物及磷脂或其他的可水解以形成溶血磷脂之組分之基質組合物。基質組合物可經組態成囊封一或多種喜樹鹼化合物於含磷脂及其他組分(諸如膽固醇及共價連接至PEG之脂質)之微脂粒中之脂質體。
在本發明之一些實施例中，例如，藉由製備具有一定量之陰離子捕獲劑及一定量之喜樹鹼化合物之基質組合物，以及使含基質組合物之介質具有指定的pH以有效減小基質組合物中溶血磷脂形成之量，使基質組合物穩定化。
在本發明之一些實施例中，該緩釋組合物為含硫糖三乙銨(SOS)及以可釋放方式與含脂質及/或生物相容性聚合物(例如，環糊精、生物可降解聚合物(諸如PGA(聚乙醇酸))及/或PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸)))之組合物締合之伊立替康之奈米粒子。
在其他實例中，該緩釋調配物為含以可釋放方式締合之化合物(諸如拓樸替康、伊他立替康(etirinotecan)及/或伊立替康(例如，以可釋放方式截留或滯留喜樹鹼或喜樹鹼衍生化合物之奈米粒子或聚合物))之基質組合物。基質組合物可包括生物相容性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)或功能上等效之物質。在一個較佳實施例中，生物相容性聚合物為聚乙二醇(MW 2000)。在一個更佳實施例中，生物相容性聚合物為甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)。
在一些實施例中，該緩釋調配物可包含共軛至生物相容性聚合物(諸如環糊精或環糊精類似物(例如硫酸化環糊精))之喜樹鹼化合物。例如，該緩釋調配物可包含化學結合至喜樹鹼化合物(例如伊立替康及/或SN-38)之含環糊精聚合物。與環糊精-喜樹鹼共軛之化合物可以醫藥上可接受之劑量投與。喜樹鹼-環糊精共軛物之實例包括含環糊精聚合物共軛物及相關中間物。
在本發明之一些實施例中，該含脂質及/或生物相容性聚合物之緩釋組合物包含脂質基質及/或錯合劑，諸如經調配以在儲存期間滯留喜樹鹼化合物且接著於患者身體中釋放該化合物之含環糊精組合物。
在本發明之一些實施例中，該基質組合物包含磷脂，諸如磷脂醯膽鹼衍生物，其係經穩定以減少冷凍儲存期間溶血PC之形成。
較佳地，由包括以下之多步驟方法製備該緩釋組合物：(a)形成含捕獲劑之基質組合物，且(b)使該基質與喜樹鹼化合物在可有效地穩定滯留該喜樹鹼化合物於所得的含捕獲劑及喜樹鹼化合物之緩釋組合物中之條件下接觸，該喜樹鹼化合物與該基質組合物以允許在投與給個體後按期望釋放喜樹鹼化合物於個體身體中之方式締合。
在一個較佳實施例中，本發明之緩釋組合物包含伊立替康部分濃度等效於由4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼/mL所提供者之伊立替康或其鹽，同時亦包含在4℃冷凍儲存6個月時小於約1 mg/mL(或小於約20莫耳%)之溶血PC。在一個較佳實施例中，本發明之緩釋組合物包含伊立替康部分濃度等效於由4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼/mL所提供者之伊立替康或其鹽，同時亦包含在2至8℃(甚至更佳在約4℃)冷凍儲存12個月時小於約2 mg/mL(或小於約30莫耳%)之溶血PC。
該緩釋組合物可包含脂質體。脂質體通常包含含一或多個圍封水性內部之脂質雙層之微脂粒。脂質體組合物通常包含含在介質(諸如脂質體外部之水性流體)中之脂質體。脂質體脂質可包括與水性介質接觸後自發地形成雙層膜之兩性脂質組分，諸如磷脂，例如，磷脂醯膽鹼。脂質體亦可包含膜硬化組分，諸如固醇，例如，膽固醇。在一些情況中，脂質體亦包含與親水性聚合物共軛之脂質，諸如，可減小脂質體聚集之傾向及亦具有其他有益效果之聚乙二醇(PEG)脂質衍生物。一種該PEG-脂質為N-(甲氧基-PEG)-氧基羰基-二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺，(其中PEG部分具有約2000之分子量)或MPEG-2000-DSPE。脂質體通常具有在微米或次微米範圍內之尺寸且因其攜帶醫藥物質(包括抗癌藥物，諸如伊立替康)及以多種有益方式改變其醫藥性質之能力被良好認可。此領域中已知製備並表徵醫藥脂質體組合物之方法(參見，例如，Lasic D. Liposomes: From physics to applications, Elsevier, Amsterdam 1993；G. Gregoriadis(編), Liposome Technology, 第3版，第1至3卷，CRC Press, Boca Raton, 2006；Hong等人，美國專利第8,147,867號，其出於所有目的以其全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，如本文一或多個實例或其他實施例中所述製備該等脂質體，但提高最終脂質體組合物之濃度使得該調配物包含等效於濃度為約10、15、20、25、30、35、40、45或50 mg/mL之鹽酸伊立替康三水合物之伊立替康部分濃度。在一些實施例中，伊立替康部分濃度係等效於5至10、10至20、20至30、30至40或40至50 mg/mL之鹽酸伊立替康三水合物。在一些實施例中，使用此段落下所提及的脂質體組合物以治療哺乳動物之腦瘤或任何其他病症，如美國專利第8,658,203號所述，該專利以其全文引用之方式併入本文中。
該囊封伊立替康之脂質體調配物可為含脂質體之可注射調配物(包括可於後來在投與患者前用醫藥上可接受之稀釋劑稀釋之可注射調配物)。在一些實施例中，添加一定量之伊立替康或其鹽至含一或多種捕獲劑之脂質體，其中伊立替康係以等效於(以無水伊立替康游離鹼的克數計)200 g、300 g、400 g、500 g、600 g或700 g/mol磷脂之伊立替康部分濃度存在。在一些實施例中，伊立替康在藥物加載過程中係以等效於(以無水伊立替康游離鹼的克數計)200至300 g、400至550 g、450至600 g或600至700 g/mol磷脂之伊立替康部分濃度存在。較佳地，每莫耳脂質體磷脂加載約500 g(±10%)部分至伊立替康脂質體，包括471 g伊立替康部分/mol總伊立替康脂質體磷脂。本文中之特定實例包括每莫耳總脂質體磷脂含471 g伊立替康部分之穩定之伊立替康脂質體以及每莫耳總脂質體磷脂含500 g伊立替康部分之伊立替康脂質體之測量值。
在一些實施例中，脂質體製劑中等效於由無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分濃度為約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.3、約4.5、約5.0、約5.5或約6.0 mg/mL。在一些實施例中，脂質體製劑中等效於由無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分濃度為2.5至3.5、3.5至4.5、4.5至5.5或5.5至6.5 mg/mL。最佳地，其為4.5至5.5 mg/mL。在較佳的實施例中，脂質體製劑中伊立替康部分之濃度為約4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼/mL，且在一個更佳實施例中，其為4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼/mL。該脂質體製劑可為具有約10 mL體積之脂質體製劑中含約43 mg無水伊立替康游離鹼之小瓶，其可於後來在靜脈內投與患者前進行稀釋(例如，稀釋至500 mL醫藥上可接受之稀釋劑)。
因此，本發明之一些實施例提供一種製造含囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯(SOS)於由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成之單層狀磷脂雙層微脂粒中之穩定之伊立替康脂質體之伊立替康脂質體製劑之方法，其包括以下步驟：(a)使含伊立替康之溶液與囊封三乙基銨(TEA)陽離子及0.4至0.5M之硫酸酯濃度(由TEA
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SOS所提供)之蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑且不含伊立替康之捕獲劑脂質體在可有效加載500 g(±10%)伊立替康部分/莫耳磷脂至捕獲劑脂質體中之條件下接觸以形成伊立替康SOS脂質體，及(b)將該等伊立替康SOS脂質體與2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)組合以獲得具有7.25至7.50之pH之伊立替康脂質體製劑，得到經穩定以形成在4℃儲存3個月期間小於10莫耳%溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)(相對伊立替康脂質體中磷脂醯膽鹼的總量計)之伊立替康脂質體製劑。
可分多個步驟製得儲存穩定之伊立替康脂質體，該等步驟包括形成含TEA脂質體，接著在TEA離開脂質體時加載伊立替康加載至脂質體中。該第一步驟可包括藉由水合並分散脂質體脂質於硫糖TEA之溶液中來形成含硫糖TEA之脂質體。此可例如藉由將脂質(包括DSPC及膽固醇)溶解於經加熱之乙醇中，且在高於脂質體脂質之轉變溫度(T
m
)之溫度(例如60℃或更高)下將該已溶解且經加熱之脂質溶液分散於硫糖TEA水溶液中進行。該脂質分散液可藉由透過具有限定孔徑(例如100 nm)之塗佈顯影(track)蝕刻聚碳酸酯膜擠出形成具有75至125 nm(諸如80至120 nm，或在一些實施例中，90至115 nm)之平均尺寸之脂質體。硫糖TEA可包括每莫耳當量之硫糖酯至少8莫耳當量之TEA以獲得可具有約0.40至0.50M之硫酸酯濃度及經選擇以防止脂質體磷脂在分散及擠出步驟期間發生不可接受的降解之pH(例如，約6.5)(例如，經選擇以將該等步驟期間脂質體磷脂之降解最小化之pH)之溶液。然後，例如，藉由在伊立替康囊封前透析、凝膠層析、離子交換或超過濾，可自脂質體分散液移除未截留的TEA-SOS。該等脂質體可藉由加載足量的伊立替康至脂質體中穩定化以減少所得脂質體組合物中TEA的量至某一水平，該水平導致在4℃(或更通常地，5 ± 3℃)儲存180天後溶血PC之形成小於所給定最大水平，例如，以mg/mL/月、或單位時間轉化成溶血PC之PC%轉化率，諸如，莫耳%溶血PC/月測得。接下來，通常藉由任何適宜的已知方法(例如，藉由凝膠層析、透析、透析過濾、離子交換或超過濾)自脂質體移除加載製程期間自脂質體交換進入外部介質中之TEA連同任何未截留之伊立替康。該脂質體外部介質可與可注射等滲流體(例如，氯化鈉之等滲溶液)進行交換，在所期pH下進行緩衝。
在一些實施例中，當TEA的量小於約25 ppm或小於約20 ppm時，可獲得在4℃下180天後含約3.9至4.7 mg/mL之伊立替康及小於20%之溶血PC之伊立替康脂質體組合物。提高脂質體外部伊立替康脂質體組合物之pH亦可使得含大於25 ppm TEA之伊立替康硫糖酯脂質體儲存穩定，導致在4℃下180天後額外溶血PC之形成小於20%之伊立替康脂質體。例如，含約4至5 mg伊立替康/mL及100 ppm TEA且具有脂質體外部約7至8之pH之伊立替康脂質體組合物在4℃下180天後溶血PC之形成亦可小於20%。在另一個實例中，包含約3.9至4.7 mg/mL伊立替康及脂質體外部介質之pH在7至8範圍內且殘餘TEA的量小於約25 ppm(或較佳地，小於20 ppm)之脂質體組合物，在4℃下經180天累積於脂質體組合物中之溶血PC的量可為10莫耳%或更小。
本發明因此提供一種伊立替康脂質體組合物，其包含囊封於具有至少990(例如，990至1100、或約1111)之溶血PC穩定比之磷脂脂質體中之伊立替康硫糖酯。
本發明亦提供一種伊立替康脂質體組合物，該組合物包含囊封於含3:2莫耳比的DSPC及膽固醇之微脂粒中之等效於由無水伊立替康游離鹼所提供者之4.3 mg/mL(±10%)部分及0.4至0.5M濃度之硫酸酯，且該微脂粒中具有400至600 g伊立替康/mol磷脂之比。
本發明亦提供含總計約4.3 mg伊立替康部分/mL之伊立替康脂質體組合物，其中伊立替康之至少98%係經蔗糖八硫酸酯(SOS)以約8:1之伊立替康:SOS莫耳比囊封於脂質體組合物中，該等脂質體具有75至125 nm之平均尺寸。穩定之高密度伊立替康脂質體之尺寸較佳為約110 nm (±20 nm)，且更佳為110 nm (±10 nm)(於脂質體藥物加載後測得)。較佳地，醫藥組合物中伊立替康之至少約95%係囊封於脂質體中。脂質體較佳包含3:2莫耳比的DSPC及膽固醇。
本發明亦可提供一種製造含囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯(SOS)於由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成之單層狀磷脂雙重微脂粒中之穩定之伊立替康脂質體組合物之醫藥的方法，其包括以下步驟：(a)使伊立替康與囊封三乙基銨(TEA)陽離子及硫酸酯濃度為0.4至0.5M之蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑(呈不含伊立替康之TEA
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SOS形式)之捕獲劑脂質體在可有效加載伊立替康部分至捕獲劑脂質體中且允許自該捕獲劑脂質體釋放TEA陽離子之條件下接觸，以形成伊立替康SOS脂質體，(b)將該等伊立替康SOS脂質體與2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)組合以獲得具有7.25至7.50之pH之伊立替康脂質體製劑，得到經穩定以在4℃儲存3個月期間形成小於10莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)(相對伊立替康脂質體中磷脂醯膽鹼的總量計)之伊立替康脂質體製劑，及(c)將伊立替康SOS脂質體與HEPES之組合調配成醫藥。
在該等方法之一些實施例中，伊立替康脂質體製劑中之伊立替康SOS脂質體包含總計小於100 ppm之TEA。在一些實施例中，單層狀脂質雙層微脂粒係由6.81 mg/mL 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、2.22 mg/mL膽固醇及0.12 mg/mL甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成。在一些實施例中，伊立替康脂質體製劑包含總計500 g(±10%)伊立替康/mol總的穩定之伊立替康脂質體磷脂，且伊立替康脂質體製劑中伊立替康之至少98%係囊封於伊立替康脂質體中。在一些實施例中，伊立替康脂質體製劑進一步包含4.05 mg/mL 2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。在一些實施例中，伊立替康脂質體製劑進一步包含8.42 mg/mL之氯化鈉。在一些實施例中，伊立替康脂質體製劑具有等效於由約4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分濃度。在一些實施例中，穩定之伊立替康脂質體係囊封伊立替康及SOS於式(I)之化合物(其中x=8)中。
在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存3個月後包含小於2莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存3個月後包含小於5莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該脂質體組合物在2至8℃儲存6個月後包含小於10莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存9個月後包含小於10莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存6個月後包含小於5莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存9個月後包含小於5莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存6個月後包含小於2莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存9個月後包含小於2莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存12個月後包含小於10莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存12個月後包含小於5莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存12個月後包含小於2莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存24個月後包含小於10莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存24個月後包含小於5莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物在2至8℃儲存24個月後包含小於2莫耳%之溶血PC。在一些實施例中，該組合物包含小於100 ppm之經取代之銨。在一些實施例中，該組合物包含介於20與80 ppm之間之經取代之銨化合物，其為質子化TEA或DEA。
在其他實施例中，該穩定之喜樹鹼化合物係呈包括一或多個組分小瓶之套組提供以用於製備喜樹鹼組合物。例如，用於製備脂質體伊立替康之套組可包括以下(儲存於單獨容器或相同容器之單獨部分中)：
․ 伊立替康溶液(例如，注射用伊立替康HCl)；
․ 囊封捕獲劑之脂質體(例如，由蔗糖八硫酸酯溶液形成之捕獲劑脂質體)；及
․ 將伊立替康溶液與捕獲劑脂質體組合以形成脂質體伊立替康組合物之說明書，該組合物包含囊封於脂質體伊立替康脂質體中之治療有效量之伊立替康(例如， 500 g(±10%)伊立替康/mol捕獲劑脂質體中總磷脂及4.3 mg總伊立替康/mL脂質體伊立替康組合物)。
喜樹鹼組合物之治療用途
本發明之喜樹鹼組合物(包括本文中所揭示之伊立替康脂質體及其他組合物及製劑)可用於療法及治療方法中，及/或用於製備用於治療疾病諸如癌症之藥物中。在一些實施例中，一種療法包括投與喜樹鹼組合物以用於治療癌症。例如，該癌症係選自由以下組成之群：基底細胞癌、神經管胚細胞瘤、肝癌、橫紋肌肉瘤、肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭部或頸部癌症、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部位之癌症、胃癌、結腸癌、乳癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何傑金病(Hodgkin's disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統之癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌症、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統腫瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、脊椎軸腫瘤、腦幹膠質瘤及垂體腺瘤、或一或多種該等癌症之組合。在一些實施例中，該癌症為胰臟癌，視情況係胰臟之腺癌，諸如胰臟之轉移性腺癌，例如，基於吉西他濱之治療後已發生疾病進展之情況。在一些實施例中，該癌症為卵巢癌。在一些實施例中，該癌症為小細胞肺癌。在一些實施例中，該癌症為膽道癌。
當用作療法時，脂質體組合物可與一或多種其他化合物或組合物一起用於治療方案中。脂質體組合物與一或多種其他化合物或組合物之投與可係同時、分開或連續的。該一或多種其他化合物或組合物可係其他治療劑，例如，其他抗癌藥物，或可係經設計以改善治療劑之不利副作用之化合物。在一些實施例中，該脂質體組合物係與甲醯四氫葉酸一起投與。在一些實施例中，該脂質體組合物係與5-氟尿嘧啶(5-FU)一起投與。在一些實施例中，該脂質體組合物係與甲醯四氫葉酸及5-氟尿嘧啶(5-FU)一起投與。此三路方案可用於治療胰臟癌，如前一段落中所論述。5-FU可以2400 mg/m
2
之劑量投與，及甲醯四氫葉酸可以200 mg/m
2
(l形式)或400 mg/m
2
(l + d外消旋形式)之劑量投與。在一些實施例中，該組合物亦係以與吉西他濱一起之治療方案投與。
在脂質體組合物用於治療卵巢癌之一些實施例中，脂質體組合物係與PARP(聚ADP核糖聚合酶)抑制劑一起投與。
在一些實施例中，緩釋基質可為經組態以滯留捕獲劑之奈米粒子(例如，二氧化矽或聚合物)或聚合物聚集物(例如PEG聚合物)。在藥物加載期間，該基質可與喜樹鹼化合物在可有效地同時滯留喜樹鹼化合物及捕獲劑之條件下接觸，從而形成穩定之緩釋調配物。
在一些實施例中，穩定之喜樹鹼組合物為伊立替康SOS脂質體製劑，其係經調配以用於在對流強化遞送療法期間經腦實質內投與給患者。最終脂質體製劑中等效於由無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分之濃度為約17、約20、約25、約30、約35或約40 mg/mL。在一些實施例中，最終脂質體製劑中等效於由無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分之濃度為17至20、17至25、17至30、17至35或17至40 mg/mL。最佳地，伊立替康脂質體製劑中等效於由無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分(例如，呈伊立替康蔗糖八硫酸酯形式)總濃度為17 mg/mL或35 mg/mL。該脂質體製劑可在圍封伊立替康蔗糖八硫酸酯脂質體之無菌容器中，呈以等效於由約17 mg/mL或約35 mg/mL或17至35 mg/ml無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分濃度之脂質體製劑，以用於局部投與患者(例如，投與至診斷罹患膠質瘤之患者腦中，作為對流強化遞送療法之一部分地投與腦內某一部位)。17至35 mg/mL濃度之伊立替康脂質體可等效地表示為20至40 mg鹽酸伊立替康三水合物/mL伊立替康脂質體製劑中所存在之無水伊立替康游離鹼之量。例如，可將該脂質體伊立替康製劑以提供總計等效於由17 mg、26 mg、52 mg或70 mg總無水伊立替康游離鹼所提供者之伊立替康部分之劑量投與至患者腦中(例如，經由一或多個手術置於瘤內部位中之導管)。歷時約2至4小時(例如，2至3小時、3至4小時或2至4小時)的時間，遞送至患者腦中瘤內部位中之伊立替康脂質體製劑之伊立替康總體積可為約1至2 mL(例如，1.0、1.5或2.0 mL)。
該等伊立替康脂質體較佳包含囊封於由含3:2莫耳比的DSPC及膽固醇之脂質形成之微脂粒中之伊立替康硫糖酯。該微脂粒亦可包含聚乙二醇(PEG)衍生之磷脂，諸如MPEG-2000-DSPE。MPEG-2000-DSPE的量可小於脂質體脂質之1莫耳%(例如，約0.3莫耳%，含於由3:2:0.015莫耳比的DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE組成之微脂粒中)。PEG可分佈在圍住封伊立替康之脂質體脂質微脂粒內部及外部上。所囊封的伊立替康較佳係呈與蔗糖之硫酸酯(硫糖酯)之鹽形式，諸如伊立替康硫糖酯(CAS註冊號1361317-83-0)。較佳地，伊立替康脂質體組合物中伊立替康之至少95%且最佳至少約98%係囊封於脂質體微脂粒中，其中總伊立替康部分濃度為約3.87至4.73 mg伊立替康(無水游離鹼)/mL伊立替康脂質體組合物。脂質體外部伊立替康脂質體組合物之pH較佳為約6.5至8.0、或約6.6至8.0、6.7至8.0、6.8至8.0、6.9至8.0或7.0至8.0，且較佳地，約7.2至7.6。在一些實施例中，該pH為約7.2至7.5。在一些實施例中，該pH為約7.25。在其他實施例中，該pH為約7.25至7.5。在其他實施例中，該pH為約7.4至7.5。
組合實施例
可將來自本文中編號實施例之特徵與來自本文所揭示的其他實施例(包括關於組合物之實施例及關於製劑之實施例兩者)之特徵組合。
上述方法具有與本說明書中其他地方所述之組合物及製劑之實施例相同的特徵，因為其等係關於製備該等組合物及製劑。亦可將在組合物及製劑態樣所揭示之特徵與前一段中所揭示之方法組合。因此，可將前面子部分及本文任何地方(諸如下文編號實施例部分)之特徵與該子部分之段落中之方法中所揭示之特徵組合。
例如，以下為本文中所揭示及/或例示之實施例之各種組合之實例：
․ 一種伊立替康脂質體組合物，其在4℃儲存180天後包含約3.9至4.7 mg/ml之伊立替康部分及小於20%之溶血PC。
․ 一種伊立替康脂質體組合物，其包含囊封於具有至少990(例如，990至1100、或約1111)之溶血PC穩定比的磷脂脂質體中之伊立替康硫糖酯。
․ 一種伊立替康脂質體組合物，該組合物包含4.3 mg/mL(±10%)伊立替康部分及囊封於含3:2莫耳比的DSPC及膽固醇之微脂粒中之0.4至0.5M濃度之硫酸酯，且該微脂粒中具有450至550 g伊立替康/mol總磷脂之比。
․ 一種伊立替康脂質體組合物，其包含總計約4.3 mg伊立替康部分/mL，其中伊立替康之至少98%係與蔗糖八硫酸酯(SOS)以約8:1之伊立替康:SOS莫耳比囊封於脂質體組合物中，該等脂質體具有75至125 nm之平均尺寸。
․ 如任一上述實施例之組合物，其中該伊立替康脂質體係藉由包括使伊立替康與囊封於磷脂脂質體中之三乙基銨(TEA)硫糖酯接觸之步驟的方法得到。
․ 如前一實施例之組合物，其中TEA-SOS之濃度為約0.40至0.50M。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其中該脂質體之尺寸為約110 nm(±10%)。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其包含約433 g伊立替康部分/mol磷脂。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其中該伊立替康脂質體組合物包含小於約100 ppm之三乙胺。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其中該伊立替康脂質體組合物為脂質體含在液體中之溶液，其中該伊立替康脂質體外部之該液體具有約7.0至8.0，例如7.25至7.5，諸如7.25之pH，視情況，其中該伊立替康脂質體外部之該液體為醫藥上可接受之可注射流體。
․ 如任一前述實施例之組合物，其包含量等效於由4.5至5.5 mg/ml鹽酸伊立替康三水合物所提供者之伊立替康部分。
․ 如任一前述實施例之組合物，其中該伊立替康脂質體組合物中伊立替康之至少約95%係囊封於該脂質體中。
․ 如任一前述實施例之組合物，其中該脂質體包含3:2莫耳比的DSPC及膽固醇，諸如，其中該脂質體包含3:2:0.015莫耳比的DSPC、膽固醇及MPEG(2000)-DSPE。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其具有990至1200之穩定比。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其具有至少0.9、至少0.95、至少0.98、至少0.99或基本上1.0之經脂質體囊封之伊立替康/硫糖酯克-當量比。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其中該脂質體磷脂在約4℃儲存180天後包含不大於20莫耳%之溶血PC。
․ 如前述實施例中任一項之組合物，其中該伊立替康脂質體組合物進一步包含伊立替康脂質體外部具有約7.0至8.0之pH之醫藥上可接受之可注射流體，包含4.3 mg/mL計算為游離鹼之伊立替康，且視情況係藉由包括使伊立替康與囊封於磷脂脂質體中之三乙基銨(TEA)硫糖酯(視情況具有約0.40至0.50N之所囊封硫糖TEA濃度)接觸之步驟的方法獲得。
․ 如任一前述實施例之組合物，其中該組合物包含約433 g伊立替康部分/mol磷脂及不大於約100 ppm之囊封於磷脂脂質體中之三乙基銨。
․ 如任一前述實施例之組合物，其具有至少0.9之所囊封伊立替康/硫糖酯克-當量比。
․ 如任一前述實施例之組合物，其中所囊封伊立替康硫糖酯之至少90%，諸如，至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%(換言之，基本上全部)係呈每一個硫糖酯分子包含八個伊立替康分子之化學計量鹽之沉澱或膠凝形式。
․ 如任一前述實施例之組合物，其中所囊封伊立替康硫糖酯之至少98%，諸如至少99%係呈每一個硫糖酯分子包含八個伊立替康分子之化學計量鹽之沉澱或膠凝形式。
․ 如任一前述實施例之伊立替康脂質體組合物，其具有不大於約100 ppm之三乙基銨(TEA)。
․ 如任一前述實施例之伊立替康脂質體組合物，其具有不大於約20 ppm之三乙基銨(TEA)。
․ 如任一前述實施例之伊立替康脂質體組合物，其具有約10 mL之總體積。
․ 如任一前述實施例之伊立替康脂質體組合物，其包含6.81 mg/mL 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、2.22 mg/mL膽固醇及0.12 mg/mL甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)。
․ 如任一前述實施例之伊立替康脂質體組合物，其在伊立替康脂質體內部及外部均包含聚乙二醇。
․ 一種經調配用於投與給患者之穩定之可注射單位劑量伊立替康脂質體組合物，該組合物包含足以遞送70 mg伊立替康/m
2
患者體表面積之伊立替康劑量，其中：
。 伊立替康之至少99%係囊封於含磷脂及膽固醇之微脂粒中且其中磷脂之至多20莫耳%為溶血PC，其餘為DSPC，其中該微脂粒係呈具有在7.0至8.0範圍內之pH之可注射流體形式；或
。該可注射單位劑量脂質體組合物為如上述任一實施例之脂質體組合物之單位劑量。
․ 一種可注射伊立替康脂質體單位劑型，其包含：
。呈囊封於含磷脂脂質體中之單位劑型之至少約98%之伊立替康，該磷脂包含不大於約20莫耳%之溶血PC；及
。 如上述任一實施例之脂質體組合物。
․ 如上述一實施例中所揭示之單位劑型，其中該伊立替康係囊封於藉由基本上由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成之脂質膜圍封之微脂粒中。
․ 如實施例29或30之單位劑型，其中該單位劑型包含至少約6.81 mg/mL 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、約2.22 mg/mL膽固醇及約0.12 mg/mL甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE) L。
․ 如實施例29至31中任一項之單位劑型，其中該單位劑型進一步包含作為緩衝劑之2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)及作為等滲性試劑之氯化鈉。
․ 如實施例1至27中任一項之脂質體組合物或如實施例29至32中任一項之單位劑量，其係用於治療中。
․ 如本文中一實施例中所揭示之脂質體組合物或單位劑量，其係用於治療癌症中。
․ 如本文中一實施例中所揭示之脂質體組合物或單位劑量之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：基底細胞癌、神經管胚細胞瘤、肝癌、橫紋肌肉瘤、肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭部或頸部癌症、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部位之癌症、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何傑金病、食道癌、小腸癌、內分泌系統之癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴球性淋巴瘤、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌症、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統腫瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、脊椎軸腫瘤、腦幹膠質瘤及垂體腺瘤、或一或多種該等癌症之組合。
․ 如任一上述實施例之脂質體組合物或單位劑量，其中該癌症為胰臟癌，視情況係胰臟之腺癌，諸如胰臟之轉移性腺癌，例如，基於吉西他濱之治療後已發生疾病進展之情況。
․ 如任一上述實施例之脂質體組合物或單位劑量，其中該癌症為結腸癌。
․ 如任一上述實施例之脂質體組合物或單位劑量，其中該脂質體組合物或單位劑量係與甲醯四氫葉酸及/或5-氟尿嘧啶一起使用，視情況，其中脂質體組合物或單位劑量、甲醯四氫葉酸及/或5-氟尿嘧啶之投與係同時、分開或連續的。
․ 如上述實施例中任一項之脂質體組合物或單位劑量，其中該脂質體係以可提供等效於80 mg/m
2
鹽酸伊立替康三水合物之伊立替康量之劑量投與。
․ 一種治療有此需要的患者之基於吉西他濱之治療後疾病進展後胰臟之轉移性腺癌之方法，其包括經靜脈內投與該患者本文實施例中任一項之可注射伊立替康脂質體單位劑型或如上述任一實施例之單位劑量，其於以可提供等效於80 mg/m
2
鹽酸伊立替康三水合物之伊立替康量之量囊封於包含含小於約20%溶血PC之磷脂之脂質體中之單位劑型中包含伊立替康之至少約98%。
․ 一種儲存穩定之脂質體伊立替康組合物，其具有7.00至7.50之pH且包括囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯在由膽固醇及磷脂(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE))組成之單層狀雙層微脂粒中之伊立替康脂質體之分散液，其伊立替康部分的濃度等效於(以無水伊立替康游離鹼的g計) 500 mg伊立替康/mmol總脂質體磷脂及4.3 mg伊立替康/mL脂質體伊立替康組合物，該儲存穩定之脂質體伊立替康組合物經穩定以在4℃儲存6個月期間形成小於1 mg/mL之溶血PC。
․ 如上述一實施例之脂質體伊立替康組合物，其係藉由包括以下步驟之方法製得：
(a) 在由具有0.4至0.5M之硫酸鹽濃度及介於5與7之間之pH之DEA
8
SOS製得的溶液中形成脂質分散液，該分散液中的脂質係DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE，各者間的莫耳比為約3:2:0.015；
(b)透過至少一個0.1 µm膜擠出在60至70℃之間之該脂質分散液以形成脂質體；
(c) 實質上移除脂質體外部的衍生自DEA
8
SOS及/或DEA
8
SOS之離子；
(d) 使該等脂質體在介於60至70℃之間的溫度下與使用伊立替康游離鹼或伊立替康鹽製得的溶液接觸，藉此形成囊封伊立替康之脂質體製劑；
(e) 實質上移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS及/或DEA
8
SOS之物質及伊立替康成分；及
(f) 將該組合物之pH調整為7.0至7.5。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其中該脂質分散液係透過至少兩個相堆疊的0.1 µm聚碳酸酯膜擠出。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其中該等脂質體具有如藉由動態光散射測得110 nm之平均尺寸且其中該尺寸係由累積量法確定。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其具有等效於4.3 mg/ml無水伊立替康游離鹼之總伊立替康部分含量。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其中：
步驟(a)中，由具有介於0.43至0.47M間之硫酸酯濃度之DEA
8
SOS形成該等脂質體；且
步驟(d)中，使用伊立替康游離鹼或伊立替康鹽製得的該溶液具有等效於500 g(±10%)無水伊立替康游離鹼/莫耳DSPC之伊立替康部分含量；且
步驟(f)中，將該組合物之pH調整為7.2至7.3。
․ 如前述實施例中任一項之脂質體組合物，其在約4℃儲存前包含小於1莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)，及在約4℃儲存180天後包含20莫耳%或更少(相對總脂質體磷脂計)之溶血PC。
․ 如上述任一實施例之脂質體組合物，其在約4℃儲存6個月、9個月或12個月後包含20莫耳%或更少(相對總脂質體磷脂計)之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其包含總計6.1至7.5 mg之DSPC/ml、2至2.4 mg膽固醇/ml、及0.11至0.13 mg之MPEG-2000-DSPE/ml，均含在等滲緩衝劑水溶液中。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其中該脂質體伊立替康包含介於2 mM與20 mM之間之濃度之伊立替康脂質體於等滲HEPES緩衝劑水溶液中。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其進一步包含130至160 mM濃度之氯化鈉。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其中囊封於該等脂質體中之該伊立替康係呈為蔗糖八硫酸鹽之膠凝或沉澱狀態。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其中該等伊立替康脂質體具有如藉由準彈性光散射測得95至115 nm之直徑。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其包含總計6.81 mg DSPC/ml、2.22 mg膽固醇/ml、及0.12 mg MPEG-2000-DSPE/ml、4.05 mg/mL HEPES水性緩衝劑及8.42 mg氯化鈉/mL。
․
如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其具有7.25之pH，其中該等伊立替康脂質體具有如藉由準彈性光散射測得110 nm之直徑。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其在約4℃儲存6個月後形成小於1 mg/mL之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其係藉由包括以下步驟之方法製得：
(a)在具有約0.45M之硫酸酯濃度及約6.5之pH之DEA
8
SOS溶液中形成脂質分散液，該分散液中之該等脂質由各自3:2:0.015莫耳比的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成；
(b)透過至少一個0.1 µm膜擠出在60至70℃之間之該脂質分散液以形成脂質體；
(c) 移除脂質體外部的衍生自DEA
8
SOS之離子；
(d) 使該等脂質體在介於60至70℃之間之溫度下與使用鹽酸伊立替康三水合物製得的溶液接觸，以形成囊封約500 g(±10%)伊立替康/莫耳總脂質體磷脂之脂質體製劑；
(e) 移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS之物質及伊立替康成分；且
(f) 將該組合物之pH調整為約7.3。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其包含總計小於100 ppm之DEA。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其包含總計小於100 ppm之DEA。
․ 如上述任一實施例之脂質體伊立替康組合物，其中在約4℃儲存6個月後，脂質體之至少98%係囊封於伊立替康脂質體中。
․
一種伊立替康脂質體製劑，其包含囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯(SOS)於由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成之直徑為約110 nm之單層狀脂質雙層微脂粒中之穩定之伊立替康脂質體，其中該等穩定之伊立替康脂質體係藉由包括以下步驟之方法得到：
(a) 使伊立替康與囊封二乙基銨(DEA)陽離子及濃度為0.4至0.5M(以硫酸酯基濃度計)之蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑(呈TEA
8
SOS形式)不含伊立替康之捕獲劑脂質體在可有效加載500 g(±10%)伊立替康部分/mol總脂質體磷脂至捕獲劑脂質體中且允許自捕獲劑脂質體釋放DEA陽離子之條件下接觸，以形成伊立替康SOS脂質體，且
(b) 將該等伊立替康SOS脂質體與2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)組合以獲得具有7.25至7.50之pH之伊立替康脂質體製劑，得到經穩定以在4℃儲存3個月期間形成小於10莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)(相對伊立替康脂質體中磷脂醯膽鹼的總量計)之伊立替康脂質體製劑。
․ 如上述任一實施例之伊立替康脂質體製劑，其中該伊立替康脂質體製劑中之伊立替康SOS脂質體包含總計小於100 ppm之TEA。
․ 如上述任一實施例之伊立替康脂質體製劑，其中該單層狀脂質雙層微脂粒由6.81 mg/mL 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、2.22 mg/mL膽固醇、及0.12 mg/mL甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成。
․ 如上述任一實施例之伊立替康脂質體製劑，其包含總計500 mg伊立替康/mol穩定之伊立替康脂質體總磷脂，且該伊立替康脂質體製劑中伊立替康之至少98%係囊封於伊立替康脂質體中。
․ 如上述任一實施例之伊立替康脂質體製劑，其中該伊立替康脂質體製劑進一步包含在約7.25至7.50之pH下約4.05 mg/mL 2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
․ 如上述任一實施例之伊立替康脂質體製劑，其中該伊立替康脂質體製劑進一步包含約8.42 mg/mL氯化鈉。
․ 如上述任一實施例之伊立替康脂質體製劑，其具有總計約4.3 mg伊立替康/mL伊立替康脂質體製劑。
․ 如任一前述實施例之組合物，其中該伊立替康脂質體係藉由包括使伊立替康與囊封於磷脂脂質體中之銨接觸之步驟之方法獲得。
․ 一種伊立替康脂質體製劑，其包含囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯(SOS)於由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇、及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成之直徑為約110 nm之單層狀脂質雙層微脂粒中之穩定之伊立替康脂質體，其中該等穩定之伊立替康脂質體係藉由包括以下步驟之方法獲得：
(a) 使伊立替康與囊封銨陽離子及蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑之捕獲劑脂質體在可有效加載500 g(±10%)伊立替康部分/mol總脂質體磷脂至捕獲劑脂質體中且允許自捕獲劑脂質體釋放銨陽離子之條件下接觸，以形成伊立替康SOS脂質體，且
(b) 將該等伊立替康SOS脂質體與2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)組合以獲得具有7.25至7.50之pH之伊立替康脂質體製劑，得到經穩定以在4℃儲存3個月期間形成小於10莫耳%溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)(相對伊立替康脂質體中磷脂醯膽鹼的總量計)之伊立替康脂質體製劑。
․ 一種SN38脂質體製劑，其包含於含有1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)之脂質體中包含伊立替康及/或SN-38之穩定之脂質體，其經穩定以在4℃儲存3個月期間形成小於10莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)(相對脂質體中磷脂醯膽鹼的總量計)。
․ 如上述任一實施例之伊立替康脂質體製劑，其中該等穩定之伊立替康脂質體囊封30至100 ppm TEA或DEA、伊立替康及SOS於式(I)之化合物中(其中x為8)，
。
在一個實施例中，本文中所揭示的伊立替康脂質體組合物為穩定之伊立替康脂質體組合物，其包含囊封於具有至少990(例如，990至1100、或約1111)之溶血PC穩定比之磷脂脂質體中之伊立替康硫糖酯，其中該脂質體組合物包含至少一個以下特徵：
(i) 該脂質體之尺寸為約110 nm(±10%)，
(ii) 該組合物包含約433 g或至少約433 g伊立替康部分/mol磷脂，
(iii) 該組合物包含小於100 ppm之三乙胺，
(iv) 該組合物包含伊立替康脂質體外部的具有約7.25之pH之醫藥上可接受之可注射流體，
(v) 該脂質體包含3:2莫耳比的DSPC及膽固醇，
(vi) 該組合物具有至少0.9、至少0.95、至少0.98或基本上1.0之經脂質體囊封之伊立替康/硫糖酯克-當量比；及
(vii) 該經囊封之伊立替康硫糖酯之至少90%，諸如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%(換言之，基本上全部)係呈每一個硫糖酯分子包含八個伊立替康分子之化學計量鹽之沉澱或膠凝形式。
在一個實施例中，本文中所揭示的伊立替康脂質體組合物為含囊封於具有至少990(例如，990至1100、或約1111)之溶血PC穩定比之磷脂脂質體中之伊立替康硫糖酯之穩定之伊立替康脂質體組合物，其中：
(i) 該脂質體之尺寸為約110 nm(±10%)，
(ii) 該組合物包含約433 g或至少約433 g伊立替康部分/mol磷脂，
(iii) 該組合物包含小於約100 ppm之三乙胺，
(iv) 該組合物包含伊立替康脂質體外部的具有約7.25之pH之醫藥上可接受之可注射流體，
(v) 該等脂質體包含3:2莫耳比的DSPC及膽固醇，
(vi) 該組合物具有至少0.9、至少0.95、至少0.98或基本上1.0之經脂質體囊封之伊立替康/硫糖酯克-當量比；及
(vii) 經囊封之伊立替康硫糖酯之至少90%，諸如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%(換言之，基本上全部)係呈每一個硫糖酯分子包含八個伊立替康分子之化學計量鹽之沉澱或膠凝形式。
實施例1：一種儲存穩定之脂質體伊立替康組合物，其具有7.00至7.50之pH且包括囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯在由膽固醇及磷脂(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端的聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE))組成之微脂粒中之伊立替康脂質體之分散液，其中伊立替康部分的濃度(以無水伊立替康游離鹼的克數計)等效於500 mg(±10%)伊立替康部分/mmol總脂質體磷脂及4.3 mg伊立替康部分/mL脂質體伊立替康組合物，該儲存穩定之脂質體伊立替康組合物經穩定以在4℃儲存的前6個月期間形成小於20莫耳%之溶血PC。
實施例2：一種儲存穩定之脂質體伊立替康組合物，其具有7.00至7.50之pH且包括囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯在由膽固醇及磷脂(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端的聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE))組成之單層狀雙層微脂粒中之之伊立替康脂質體之分散液，其中伊立替康部分的濃度(以無水伊立替康游離鹼的克數計)等效於500 mg(±10%)伊立替康部分/mmol總脂質體磷脂及4.3 mg伊立替康部分/mL脂質體伊立替康組合物，該儲存穩定之脂質體伊立替康組合物具有0.85至1.2之伊立替康/硫酸鹽化合物克-當量比。
實施例3：一種儲存穩定之脂質體伊立替康組合物，其經穩定化以在4℃儲存的前6個月期間形成小於20莫耳%溶血PC，該脂質體伊立替康組合物係由包括以下步驟之方法製得：
(a) 在由具有0.4至0.5M之硫酸鹽濃度及介於5與7之間之pH之TEA
8
SOS及/或DEA
8
SOS製得的溶液中形成脂質分散液，該分散液中之脂質係DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE，各者間的莫耳比為約3:2:0.015；
(b)透過至少一個0.1 µm膜擠出在60至70℃之間的該脂質分散液以形成脂質體；
(c) 實質上移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS及/或DEA
8
SOS之離子；
(d) 使該等脂質體在介於60至70℃之間的溫度下與使用伊立替康游離鹼或伊立替康鹽製得的溶液接觸，藉此形成囊封伊立替康之脂質體製劑；
(e) 實質上移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS及/或DEA
8
SOS之物質及伊立替康成分；及
(f) 將該組合物之pH調整為7.0至7.5。
實施例4：如實施例1至3中任一項之脂質體伊立替康組合物，其係藉由包括以下步驟之方法製得：
(a) 在由具有0.4至0.5M之硫酸鹽濃度及介於5與7之間之pH之TEA
8
SOS製得的溶液中形成脂質分散液，該分散液中之脂質係DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE，各者間的莫耳比為約3:2:0.015；
(b)透過至少一個0.1 µm膜擠出在60至70℃之間至該脂質分散液以形成脂質體；
(c) 實質上移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS之離子；
(d) 使該等脂質體在介於60至70℃之間的溫度下與使用伊立替康游離鹼或伊立替康鹽製得的溶液接觸，藉此形成囊封伊立替康之脂質體製劑；
(e) 實質上移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS之物質及伊立替康成分；及
(f) 將該組合物之pH調整為7.0至7.5。
實施例5：如實施例4之脂質體伊立替康組合物，其中該脂質分散液係透過至少兩個相堆疊的0.1 µm聚碳酸酯膜擠出。
實施例6：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其中該等脂質體具有如藉由動態光散射測得110 nm之平均尺寸且其中該尺寸係由累積量法確定。
實施例7：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其具有等效於4.3 mg/ml無水伊立替康游離鹼之總伊立替康部分含量。
實施例8：如實施例3至6中任一項之脂質體伊立替康組合物，其中：
步驟(a)中，由具有介於0.43M至0.47M之間之硫酸酯濃度之TEA
8
SOS形成脂質體；且
步驟(d)中，使用伊立替康游離鹼或伊立替康鹽製得的溶液具有等效於500 g(±10%)無水伊立替康游離鹼/莫耳DSPC之伊立替康部分含量；且
步驟(f)中，將該組合物之pH調整為7.2至7.3。
實施例9：如前述實施例中任一項之脂質體組合物，其在約4℃儲存前包含小於1莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)，且在約4℃儲存180天後包含20莫耳%或更少(相對總脂質體磷脂計)之溶血PC。
實施例10：如實施例9之脂質體組合物，其在約4℃儲存6個月、9個月或12個月後包含20莫耳%或更少(相對總脂質體磷脂計)之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)。
實施例11：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其包含總計6.1至7.5 mg DSPC/ml、2至2.4 mg膽固醇/ml、及0.11至0.13 mg MPEG-2000-DSPE/ml，均含在等滲緩衝劑水溶液中。
實施例12：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其中該脂質體伊立替康包含濃度介於2 mM與20 mM之間之含在等滲HEPES緩衝劑水溶液中之伊立替康脂質體。
實施例13：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其進一步包含濃度為130至160 mM之氯化鈉。
實施例14：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其中囊封於脂質體中之該伊立替康係呈蔗糖八硫酸酯鹽之膠凝或沉澱狀態。
實施例15：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其中該等伊立替康脂質體具有如藉由準彈性光散射測得95至115 nm之直徑。
實施例16：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其包含總計6.81 mg DSPC/ml、2.22 mg膽固醇/ml、及0.12 mg MPEG-2000-DSPE/ml、4.05 mg/mL HEPES緩衝劑水溶液及8.42 mg氯化鈉/mL。
實施例17：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其具有為7.25之pH，其中該等伊立替康脂質體具有如藉由準彈性光散射測得110 nm之直徑。
實施例18：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其在約4℃儲存6個月後形成小於1 mg/mL之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)。
實施例19：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其係藉由包括以下步驟之方法製得：
(a)在具有約0.45M之硫酸酯濃度及約6.5之pH之TEA
8
SOS溶液中之形成脂質分散液，該分散液中之脂質係由各自3:2:0.015莫耳比的1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成；
(b)透過至少一個0.1 µm膜擠出在60至70℃之間至該脂質分散液以形成脂質體；
(c) 實質上移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS之離子；
(d) 使該等脂質體在介於60℃至70℃之間之溫度與使用鹽酸伊立替康三水合物製得的溶液接觸，以形成囊封約500 g(±10%)伊立替康/mol總脂質體磷脂之脂質體製劑；
(e) 實質上移除脂質體外部的衍生自TEA
8
SOS之物質及伊立替康成分；及
(f) 將該組合物之pH調整至約7.3。
實施例20：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其包含總計小於100 ppm之TEA。
實施例21：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其包含總計30至100 ppm之TEA或DEA。
實施例22：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其中在約4℃儲存6個月後該伊立替康之至少98%係囊封於伊立替康脂質體中。
實施例23：如前述實施例中任一項之脂質體伊立替康組合物，其包含式(I)之伊立替康組合物於伊立替康脂質體中(其中x為8)：
。
實例
以下實例中描述若干伊立替康脂質體製劑之合成及表徵。除非實例中另有指示，否則該等伊立替康脂質體可藉由以下多步驟法獲得。本發明因此亦提供依照該子部分及實例中所述之製備方法製造伊立替康脂質體之方法及其變型及組合。
首先，將形成脂質體之脂質溶解於經加熱之乙醇中。該等脂質包含DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE。除非另有指示，否則DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE係以3:2:0.015莫耳比存在。使所得的乙醇-脂質組合物在可有效形成適當尺寸(例如80至120 nm或95至115 nm等)之含經取代之銨離子及聚陰離子捕獲劑(SOS)之基本上單層脂質體之條件下分散於含經取代之銨及聚陰離子之水性介質中。可例如藉由將乙醇性脂質溶液與含經取代之銨離子及聚陰離子之水溶液在高於脂質轉變溫度之溫度(例如60至70℃)下混合，且在壓力下透過一或多個具有限定孔徑(例如50 nm、80 nm、100 nm或200 nm)之塗佈顯影蝕刻(例如聚碳酸酯膜)膜過濾器擠出所得的脂質懸浮液(多層脂質體)，形成脂質體分散液。較佳地，該經取代之銨為質子化三乙胺(TEA)或二乙胺(DEA)且該聚陰離子為蔗糖八硫酸酯(SOS)， 較佳以化學計量比組合(例如TEA
8
SOS)。可根據加載至脂質體之伊立替康的量來選擇TEA
8
SOS之濃度(例如，以實質上或完全消除跨脂質體之濃度加載梯度，及/或提供含約1:8莫耳比的SOS及伊立替康之脂質體)。例如，為製備具有471 g或500 g伊立替康部分/mol磷脂之伊立替康SOS脂質體，所使用的TEA
8
SOS較佳具有約0.4至0.5M之硫酸酯基(例如0.45M或0.475M之硫酸酯基、或0.45M或0.475M之SOS)之 濃度。接著，(例如，藉由凝膠過濾、透析或超過濾/透析過濾)移除所有或實質上所有未截留之TEA或SOS。
接著使所得捕獲劑脂質體(例如，囊封經取代之銨化合物，諸如TEA
8
SOS或DEA
8
SOS)與伊立替康溶液在可有效加載伊立替康至捕獲劑脂質體中之條件(即，允許伊立替康進入脂質體中，與TEA交換而留下脂質體之條件)下接觸。伊立替康加載溶液(例如，為15 mg/ml無水伊立替康-HCl，其可使用對應量之伊立替康-HCl三水合物製得)較佳包含滲透劑(例如5%葡萄糖)及6.5之pH(除非另外規定，否則本說明書中所提及的pH值係在室溫下測定)。藉由提高組合物的溫度高於脂質體脂質之轉變溫度(例如，至60至70℃)以加速經取代之銨化合物(例如TEA)及伊立替康之跨膜交換來促進藥物加載。在一些實施例中，脂質體中之伊立替康硫糖酯係呈膠凝或沉澱狀態。
藉由跨脂質體與經取代之銨化合物(例如TEA或DEA)交換加載伊立替康較佳係持續直到全部或實質上全部經取代之銨化合物(例如TEA) 自脂質體移除，藉此消除全部或實質上全部跨脂質體之濃度梯度。較佳地，伊立替康脂質體加載製程持續直到伊立替康與SOS之克-當量比為至少0.9、至少0.95、0.98、0.99、或1.0(或約0.9至1.0、0.95至1.0、0.98至1.0或0.99至1.0之範圍)。較佳地，伊立替康脂質體加載製程持續直到至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或更多之TEA自脂質體內部移除。在本發明之一些實施例中，依此方式使用TEA
8
SOS製得的伊立替康SOS脂質體組合物包含小於100 ppm之TEA。在本發明之一些實施例中，依此方式使用TEA
8
SOS製得的伊立替康SOS脂質體組合物包含20至100 ppm、20至80 ppm、40至80 ppm或40至100 ppm之TEA。
可移除脂質體外伊立替康及經取代之銨化合物(例如TEA或DEA)以獲得最終伊立替康脂質體產品。可藉由多種方法，其非限制性實例包括凝膠(尺寸排除)層析、透析、離子交換、及超過濾/透析過濾方法，來促進此移除。脂質體外部介質改由可注射之醫藥上可接受之流體，例如緩衝(pH在7.1至7.5之間，較佳地，pH在7.2與7.3之間)等滲鹽水更換。最終，脂質體組合物係例如藉由0.2微米過濾滅菌，分配至單劑量小瓶中，貼標籤並儲存(例如，在 2至8℃冷凍) 直至使用。在移除殘餘的脂質體外伊立替康及銨/經取代之銨離子(例如TEA)的同時，脂質體外部介質可改由醫藥上可接受之流體更換。
捕獲劑之量化
出於本發明之目的，基於用於製備脂質體之濃度量化脂質體捕獲劑及經取代之銨化合物抗衡離子(例如TEA
8
SOS)並基於捕獲劑之硫酸酯基數進行計算。例如，本文中0.1M TEA
8
SOS將表示為0.8 M/L硫酸酯，因為每個SOS分子具有八個硫酸酯基。在使用不同捕獲劑之情況中，將調整此計算，端視每個捕獲劑分子中陰離子基團(例如硫酸酯基)的數量。
伊立替康脂質體製劑中溶血 PC 之量化
藉由述於實例9中之HPLC法(「方法A」)獲得所測試伊立替康蔗糖八硫酸酯脂質體製劑中溶血PC的量，可得到圖11B及12中之數據。
使用不同的製備型(TLC)方法(本文中，「方法B」)，獲得本文中樣品1至23之溶血PC測量值，藉由以下TLC法接著磷酸鹽分析，而非緊接上文論述的HPLC法(方法A)，測定溶血磷脂。藉由方法B依以下步驟測量溶血PC。使用以水配衡之PD-10管柱(GE Healthcare)，將含約500 nmol磷脂(PL)之脂質體樣品之一個等分試樣(例如0.05 mL之10 mM PL脂質體溶液)脫鹽。用水自該管柱洗脫樣品且分成三個各含約150 nmol PL之部分，接著使用離心式濃縮機(Savant Speed Vac濃縮機，型號SVC100X)在真空下乾燥。將經乾燥之脂質溶解於30 μl氯仿/甲醇(5/1，vol/vol)中且使用玻璃針筒施覆至正相矽膠TLC板(Uniplate by Analtech，目錄號44921)之非吸附區。用由氯仿/甲醇/30%氫氧化銨/水(60/40/2.5/3.75，v/v/v/v)組成之流動相運行TLC且使用碘蒸氣使脂質可視化。藉由刮除TLC上對應於磷脂及溶血磷脂之斑點至個別12 × 75 mm矽酸硼管中進行PL之測定以用於後續磷酸鹽分析。
實例中提供經脂質體共囊封之伊立替康及硫酸酯化合物之莫耳量之量化。
材料
為了製備實例1中之樣品1至5及13及實例2中之樣品12及樣品14至18，USP GMP級鹽酸伊立替康((+)-7-乙基-10-羥基喜樹鹼10-[1,4'-二哌啶]-1'-羧酸酯，單鹽酸鹽，三水合物，CAS註冊號100286-90-6)係購自SinoPharm(台灣台北市)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇(MW-2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺((MPEG-2000-DSPE)係購自Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)；超純膽固醇(Chol)係從Calbiochem(La Jolla, CA, USA)獲得；及蔗糖八硫酸酯係從Euticals(Lodi, Italy)獲得。
為了製備實例1中之樣品6至11，鹽酸伊立替康三水合物係從PharmaEngine(台灣)獲得；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇(MW-2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺((MPEG-2000-DSPE)係購自Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)；超純膽固醇(Chol)係從Calbiochem(La Jolla, CA, USA)獲得；及蔗糖八硫酸酯係從Euticals(Lodi, Italy)獲得。
為了製備實例8中之樣品19至23，長春瑞濱(Vinorelbine)(VNB)係從藥房呈酒石酸長春瑞濱溶液10 mg/mL(Glaxo-SmithKline)獲得，及拓樸替康(TPT)粉末係從Taiwan Liposome Company(台灣台北市)作為禮物獲得。
所有其他具分析或更佳純度之化學品係從常見的供應商獲得。
方法：在下文未另外指示之程度上，以下方法係用於製備樣品1至5及13(實例1)及樣品6至11及19至23(實例2)、及樣品12、及14至18(實例3)。
三乙基銨蔗糖八硫酸酯之製備
使用離子交換層析，自蔗糖八硫酸酯之鈉鹽製得蔗糖八硫酸酯三乙基銨(TEA
8
SOS)及蔗糖八硫酸酯二乙基銨(DEA
8
SOS)。簡言之，將15 g蔗糖八硫酸酯(鈉鹽)溶解於水中以得到2.64M之硫酸酯濃度。利用Dowex 50W-8X-200陽離子交換樹脂以製得蔗糖八硫酸酯之酸性形式。用2體積的1N NaOH洗滌所界定的樹脂兩次，接著用ddH
2
O(二次蒸餾水)洗滌至中性pH，用2體積的1N HCl洗滌兩次，及最終用ddH
2
O洗滌至中性且接著重複。將450 mL體積之樹脂倒至管柱且用3體積的3N HCl洗滌，且接著用ddH
2
O沖洗直到導電率達到小於1 μS/cm。將蔗糖八硫酸酯(鈉鹽)溶液(約10%之管柱容量)加載於管柱上並用ddH
2
O洗脫。使用導電率檢測器監測管柱洗脫物以檢測蔗糖八硫酸酯自管柱之洗脫。接著用三乙胺或二乙胺滴定酸性蔗糖八硫酸酯至介於6至7之間之pH且使用自B. Sorbo等人, Methods in Enzymology, 143:3-6, 1984改良之方法(參見硫酸鹽測定)測定硫酸酯含量。最後，將該溶液稀釋至對應於0.65M硫酸酯之硫酸酯濃度。pH通常在6至7範圍內。使用鈉電極測定殘餘的鈉，及不進一步使用殘餘鈉超過1莫耳%之任何溶液。
硫酸酯基之測定
以基於比濁分析之檢定測定蔗糖八硫酸酯溶液中之硫酸酯含量。溶液由以下組成：(1)含在100 mL水中之15 g PEG 6000及1.02 g乙酸鋇；(2)含在1 mL水中之142 mg硫酸鈉；(3)鋇工作溶液：攪拌下將0.1 mL硫酸鈉溶液逐滴添加至100 mL鋇溶液。該溶液應於使用前平衡1小時且可儲存不超過一週；(4)0.4M檸檬酸三鈉溶液；(118 mg檸檬酸三鈉/mL水)；及(5) 自1N硫酸以10 mM稀釋於水中之硫酸酯標準品。使用硼矽酸酯試管，使標準品及溶液達成100 μl之最終體積。使標準品在0.2至1 μmol硫酸酯(20至100 μl 10 mM標準品)之範圍內。就0.6M硫酸酯溶液之樣品而言，使用1/100之稀釋及100 μl(0.6 μmol)之體積。用100 μl 70%高氯酸處理各100 μl樣品/標準品並在110至120℃加熱12分鐘。冷卻後，添加0.8 mL 0.4M檸檬酸三鈉溶液，接著渦轉。從攪拌鋇工作溶液取0.25 mL體積轉移至各管並立刻渦轉。允許所有樣品/標準品平衡1小時，接著渦轉並在600 nm下測量吸光度。使用SO
4
濃度對OD600之線性標準曲線以測定未知的SO
4
濃度。
藉由 HPLC 之蔗糖八硫酸酯測定
可基於由已知濃度之標準品產生之蔗糖八硫酸酯峰的面積，計算得樣品中蔗糖八硫酸酯之濃度(mg/mL)。接著使用所計算得的蔗糖八硫酸酯之濃度以計算樣品中硫酸酯之濃度(mM)。
藉由HPLC，使用Phenomenex, Bondclone 10 μ NH
2
，300 x 3.90 mm，PN 00H-3128-C0、或Waters μBondapak NH
2
10 μm 125 Å(3.9 mm x 300 mm)(零件號WAT084040)，使用0.60M硫酸銨之移動相，pH 3.0，以1.00 mL/min在40℃之管柱溫度下洗脫，來層析待分析的樣品。亦在40℃下，藉由折射率檢測器，例如，使用具有折射率檢測器之Agilent HPLC檢測樣品。使用USP蔗糖八硫酸鉀七水合物作為參考標準；CAS 76578-81-9，目錄號1551150。
使用基線至基線積分法對SOS檢定標準及檢定對照樣品積分。接著，使用基線至基線積分法對該等TEA-SOS樣品積分。可手動進行此：在空隙體積谷前開始基線至SOS尾端結束，接著在TEA峰開始處及兩個峰之間的低點引一條線。備註：若在空隙體積谷前開始至SOS尾端結束之單一基線跨TEA峰與SOS峰之間的低點，則可使用兩條單獨線，其將近似基線至基線法。TEA-SOS樣品將顯示對SOS峰之滯留時間約0.45之相對滯留時間之TEA峰。
藥物分析
在Dionex系統上，使用Supelco C
18
前導管柱在前的C
18
逆相二氧化矽管柱(Supelco C
18
管柱，250 mm x 4 mm內徑，粒度為5 µm)，進行伊立替康之HPLC分析。使用50 µl之樣品注入體積，且用由0.21M乙酸三乙基銨水溶液pH 5.5及乙腈(73:27，v:v)組成之流動相以1.0 mL/min之流速等濃度洗脫管柱。通常，伊立替康及SN-38分別在5.1 min及7.7 min內洗脫。使用二極體陣列檢測器，藉由375 nm下之吸光度，檢測伊立替康，且藉由螢光(370 nm激發及535 nm發射)檢測SN-38。
磷酸酯測定
使用以下磷酸酯測定法以分析樣品1至23。經改良之Bartlett磷酸酯檢定可用於測量磷脂(PL)。將在10至40 nmol範圍之磷酸酯之標準品置於12 × 75 mm硼矽酸酯管中且確切地如該等樣品進行處理。將硫酸(100 μl 6M H
2
SO
4
)添加至置於加熱塊中之各管且加熱至180℃持續45分鐘。添加過氧化氫(20 μl 30%溶液)至各管且接著在150℃加熱30分鐘。隨後，添加鉬酸銨(0.95 mL 2.2 g/l溶液)及抗壞血酸(50 μl 10%水溶液)至各管。渦轉後，在沸水中將該等管顯影15分鐘且接著使其冷卻至室溫。就使用薄層層析(TLC)之溶血脂質分析而言，藉由以1000 rpm離心5分鐘使二氧化矽粒化，且藉由讀取823 nm下之吸光度測量上清液中之藍色。不含二氧化矽之樣品可省去該離心步驟。
藥物滯留及穩定性
藉由使用PD-10(Sephadex G-25)尺寸排除管柱，從脂質體外伊立替康分離脂質體伊立替康，來測定脂質體伊立替康穩定性(在藥物滯留方面)。藉由比較分離脂質體外伊立替康之前及之後之伊立替康(HPLC)與PL(述於磷脂測定中)比，來確定藥物洩露。藉由在HPLC分析後觀察層析圖中之其他峰來判定伊立替康之降解。分別使用以下公式1及2計算得伊立替康與磷脂比及藥物囊封效率。
(1) 伊立替康與磷脂比(g伊立替康/mol PL) =
[ 伊立替康 ] (mg/mL) *1000
[磷脂] (mM)
(2) 囊封效率(%) =
( 伊立替康與磷脂比 )AC
(伊立替康與磷脂比)BC
其中(伊立替康與磷脂比)AC為於G-25尺寸排除管柱上純化後之藥物與磷脂比及(伊立替康與磷脂比)BC為於管柱上純化前之藥物與磷脂比。
脂質體組合物中所囊封及游離伊立替康之測定
使用濾筒吸附法測定實例3及4之伊立替康硫糖酯脂質體組合物中之經脂質體囊封及游離(非囊封)伊立替康。藉由連續通入2 mL甲醇、1 mL HEPES緩衝鹽水(HBS；5 mM HEPES、140 mM NaCl，pH 6.5)及0.5 mL含在生理鹽水中之10%人血清白蛋白，接著通入1 mL HBS，來處理Oasis 60 mg 3 cc HLB濾筒(Waters)。用生理鹽水將脂質體伊立替康硫糖酯組合物稀釋至約2.2 mg/mL伊立替康，且施加0.5 mL等分試樣於濾筒上。收集洗脫物，用兩份HBS(1.5 mL，3 mL)沖洗濾筒，且將沖洗液與該洗脫物組合以製得脂質體溶離份。另用1.5 mL HBS沖洗濾筒且用兩份3 mL甲醇-HCl(90體積%甲醇，10體積% 18 mM HCl)洗脫。將洗脫物組合以得到游離藥物溶離份。將脂質體藥物溶離份轉移至25 mL量瓶中，且將游離藥物溶離份轉移至10 mL量瓶中，用甲醇-HCl達到刻度，充分混合，並在60℃加熱該等脂質體溶離份量瓶10分鐘以溶解藥物。冷卻後，過濾該等溶液，且使用逆相HPLC，於Phenomenex Luna C18(2)管柱上，經20 mM磷酸鉀(pH 3.0)甲醇混合物(60:40，以體積計)等濃度洗脫，藉由254 nm下UV檢測，量化兩個溶離份中之伊立替康。對藥物峰進行積分，且藉由與相同條件下使用鹽酸伊立替康三水合物USP參考標準得到的線性標準曲線比較，計算得樣品中伊立替康的量。藥物囊封率係經計算為囊封藥物相對於樣品中游離及囊封藥物總體之百分率。
pH 測量
始終地在環境溫度(即，20至25℃)下使用電位滴定標準玻璃電極法測量pH。因此，藉由將玻璃電極放入脂質體調配物中且獲得pH讀數，來測量脂質體調配物之pH。
樣品之 TEA/DEA ppm 之分析
藉由頂部空間氣相層析(GC)分離，利用毛細管GC管柱(50 m x 0.32 mm x 5 μm Restek Rtx-5(5%苯基-95%二甲基聚矽氧烷))上之梯度溫度洗脫，接著，火焰離子化檢測(FID)，來進行樣品之分析。分析樣品製劑及標準製劑，且將所得的峰面積反應進行比較。使用外標準量化殘餘胺(例如，TEA或二乙胺(DEA))的量。就TEA而言，該標準係≥ 99%。其他試劑包括三乙二醇(TEG)、氫氧化鈉及去離子(DI)水。
GC條件為：載氣：氦；管柱流速：20 cm/s(1.24 mL/min)；分流比：10:1(其可加以調整，只要滿足所有系統合適性標準即可)；注入模式：10:1分流；內襯：2 mm的直槽(推薦但並非必須)；注入口溫度：140℃，檢測器溫度：260℃(FID)；初始管柱烘箱溫度：40℃；管柱烘箱溫度程式：
速率(℃/min) 溫度(℃) 保持時間(min)
n/a 40 0 0
2 100 0
20 240 17
54 min的運行時間。
頂部空間參數：盤溫度：90℃；樣品環溫度：100℃；傳輸線溫度：100℃；平衡時間：60分鐘；注入時間：1分鐘；小瓶壓力：10 psi；加壓時間：0.2分鐘；振盪：開(中等)；注入體積：1.0 mL頂部空間；GC週期時間：60分鐘(推薦但並非必須)。
若未檢測到TEA，則報告為「未檢測到」；若TEA結果為＜ 30 ppm，則報告為＜ QL (30 ppm)；若TEA結果為≥ 30 ppm，則報告全數。
脂質體尺寸之測定
利用動態光散射(DLS)，使用Malvern ZetaSizer Nano ZS
TM
或類似的儀器，在緩衝劑水溶液(例如，10 mM NaCl，pH 6.7)中，於23至25℃下，使用累積量法，測定脂質體粒度。記錄z-平均粒度及多分散性指數(PDI)。使用100 nm聚合物之奈米球NIST可追溯標準品(Thermo Scientific 3000系列奈米球尺寸標準品P/N 3100A、或具有包括流體動力學直徑之分析憑證之等效物)驗證儀器性能。如本文中所使用，「DLS」係指動態光散射及「BDP」係指原料藥。
實例 1
：
SOS 捕獲劑濃度及 pH 對於脂質體伊立替康製劑儲存穩定性之影響
該研究的目標尤其係測定囊封伊立替康及蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑之脂質體當在約4℃下儲存特定時間段時之物理及化學穩定性之任何變化。就該研究而言，減小SOS捕獲劑之脂質體濃度，同時維持471 g伊立替康部分/總磷脂莫耳數之比。
依多步驟法，使用不同濃度之SOS捕獲劑，且調整最終脂質體製劑之pH至不同pH值，製得一系列伊立替康SOS脂質體製劑。各伊立替康SOS脂質體製劑包含等效於5 mg/mL鹽酸伊立替康三水合物之伊立替康部分濃度。藉由實例1之多步驟法製得樣品1至5及13之伊立替康SOS脂質體製劑。
分別稱出對應於3:2:0.015莫耳比之量(例如，1264 mg/412.5 mg/22.44 mg)的DSPC、膽固醇(Chol)及PEG-DSPE。將脂質溶解於氯仿/甲醇(4/1，v/v)中，徹底混合，並分為4個等分試樣(A至D)。使用旋轉蒸發器在60℃下將各樣品蒸發至乾燥。藉由室溫下置於真空(180微托)12小時自脂質移除殘餘氯仿。在60℃下將經乾燥之脂質溶解於乙醇中，且添加適宜濃度之經預先加熱的TEA
8
SOS使得最終醇含量為10%(v/v)。脂質濃度為約75 mM。在約65℃下使用Lipex熱桶擠出機(Northern Lipids, Canada)透過2個堆疊之0.1 µm聚碳酸酯膜(Nuclepore™) 10次擠出脂質分散液，以產生具有95至115 nm之典型平均直徑(藉由準彈性光散射測定；參見子部分「脂質體尺寸之測定」)之脂質體。視需要調整擠出型脂質體之pH以校正擠出期間pH之變化。藉由離子交換層析及尺寸排除層析之組合來純化該等脂質體。首先，用1N NaOH處理Dowex™ IRA 910樹脂，接著用去離子水洗滌3次，且然後接著用3N HCI洗滌3次，之後用水洗滌多次。使脂質體通過所製得的樹脂，且藉由使用流式細胞電導計(Pharmacia, Uppsala, Sweden)測定洗脫溶離份之導電率。若導電率小於15 µS/cm，則認為該等溶離份可接受用於進一步純化。接著將脂質體洗脫物施加至以去離子水平衡之Sephadex G-75(Pharmacia)管柱，且測定所收集脂質體溶離份之導電率(通常小於1 µS/cm)。藉由添加40%葡萄糖溶液至5%(w/w)之最終濃度，且自原液(0.5M，pH 6.5)添加緩衝劑(Hepes)至10 mM之最終濃度，來實現跨膜等滲壓。
考慮到自各批次分析之憑證獲得之水含量及雜質水平，藉由將伊立替康•HCl三水合物粉末溶解於去離子水中形成15 mg/mL無水伊立替康-HCl，來製備伊立替康原液。藉由添加500 g無水伊立替康HCl(等效於471 g無水伊立替康游離鹼)/mol脂質體磷脂的量之伊立替康並在熱水浴中加熱至60 ± 0.1℃持續30分鐘引發藥物之加載。自水浴移除後，藉由浸入冰冷的水中使該等溶液快速冷卻。藉由尺寸排除層析，使用以Hepes緩衝鹽水(10 mM Hepes，145 mM NaCl，pH 6.5)平衡並洗脫之Sephadex G75管柱，移除脂質體外藥物。藉由HPLC分析樣品之伊立替康且藉由Bartlett法(參見子部分「磷酸酯測定」)分析磷酸酯。就儲存而言，將該等樣品分成4 mL等分試樣，且使用1N HCl或1N NaOH調整pH，在無菌條件下無菌過濾，並填充至無菌透明玻璃小瓶中，在氬氣下用Teflon®內襯螺紋蓋密封並置於4℃之恆溫控制冰箱中。在限定的時間點，自各樣品移取一等分試樣並測試外觀、脂質體尺寸、藥物/脂質比、及藥物及脂質化學穩定性。
就實例1而言，藉由動態光散射，使用Coulter奈米粒度儀在90°角測定經稀釋之樣品中之脂質體尺寸分佈並表示為可藉由累積量法獲得之平均值±標準偏差(nm)。
如下進一步獲得樣品1至5及13之伊立替康脂質體製劑。新擠出的脂質體包含兩組，各組併入以(A) 0.45M硫酸酯基(112.0±16 nm)、(B) 0.475M硫酸酯基(105.0±16 nm)、(C) 0.5M硫酸酯基(97±30 nm)、及(D) 0.6M硫酸酯基(113±10nm)之濃度之TEA
8
SOS作為捕獲劑。樣品1至5及13係以471 g無水伊立替康游離鹼/mol總脂質體磷脂之初始比加載並如上文在實例1之說明中所述純化(等效於500 g無水伊立替康HCl)。樣品1、5及13係衍生自擠出型樣品(A)；樣品2係來自擠出型樣品(B)；樣品3及4係分別來自擠出型樣品(C)及(D)。純化後，在滅菌及填充小瓶前使用1N HCl或1 N NaOH進行pH調整。樣品1至5之數據顯示於表7(實例1)中，及樣品13之數據顯示於表8(實例2)中。
如下進一步獲得樣品6至11之伊立替康脂質體製劑。新擠出的脂質體包含兩組，各組併入以(A) 0.45M硫酸酯基(116±10 nm)及(B) 0.6M硫酸酯基(115.0±9.0 nm)之濃度之TEA
8
SOS作為捕獲劑。樣品6至8係源自擠出型樣品(A)，及樣品9至11係源自擠出型樣品(B)。純化後，若需要則藉由適宜地添加1N HCl或1N NaOH來進行pH調整。如實例2中所述製得樣品12且出於比較之目的而包含於表7中。
特定伊立替康脂質體組合物之具有脂質體外pH值、伊立替康游離鹼濃度(mg/mL)及不同濃度之蔗糖八硫酸酯之伊立替康脂質體列於下表6(在4℃儲存6個月)及表7中，且如本文所述更詳細地所提供般進行製備。
圖4A至4C為顯示選自表7之具有大於6.5(即7.25或7.5，如各圖中所指示)之pH之伊立替康脂質體製劑中溶血PC之莫耳%之曲線圖。在各樣品於4℃儲存的前1個月、3個月、6個月及/或9個月後，以本文中所揭示的方法B(TLC)測定溶血PC。該等曲線圖包括對各樣品之數據之線性回歸線，作為各樣品中溶血PC隨時間之增加速率(莫耳%)之評估。驚人地，增加伊立替康脂質體製劑之pH超過6.5(例如，7.25及7.5)，在4℃冷凍儲存期間測得的溶血PC的量相比以相當穩定比形成之伊立替康脂質體減少。此趨勢在不同濃度之脂質體伊立替康下明顯。例如，就以約4.3 mg伊立替康部分/mL之強度製得的脂質體伊立替康組合物而言，樣品5及7中測得之溶血PC莫耳%水平在所有數據點(製造後在4℃儲存的前1個月、6個月及9個月後)相比在pH 6.5下之樣品1測得之溶血PC莫耳%水平(表7中之數據)明顯減小。類似地，就以約18.8 mg伊立替康部分/mL之強度製得的脂質體伊立替康組合物而言，樣品13中測得的溶血PC莫耳%水平在所有數據點(製造後在4℃儲存的前1個月及9個月後)相比在pH 6.5下之樣品12或樣品14中任一樣品測得的溶血PC莫耳%水平(表8中之數據)明顯更低。
表 6
：
冷凍儲存 6 個月後溶血 PC 測量值 | 樣品 | pH | 藥物(mg/mL) | 伊立替康(g)/mol PL | [硫糖酯] mM | 溶血PC%(180天) | 溶血PC穩定比 |
| 1 | 6.5 | 4.7 | 471 | 56.25 | 19.5 | 1047 |
| 2 | 6.5 | 4.7 | 471 | 59.375 | 17 | 992 |
| 4 | 6.5 | 4.7 | 471 | 75 | 30.2 | 785 |
| 5 | 7.25 | 4.7 | 471 | 56.25 | 7.1 | 1047 |
| 6 | 6.5 | 4.7 | 471 | 56.25 | 14.6 | 1047 |
| 7 | 7.25 | 4.7 | 471 | 56.25 | 7.4 | 1047 |
| 8 | 7.5 | 4.7 | 471 | 56.25 | 5.4 | 1047 |
| 9 | 6.5 | 4.7 | 471 | 75 | 29.8 | 785 |
| 10 | 7.25 | 4.7 | 471 | 75 | 24.1 | 785 |
| 11 | 7.5 | 4.7 | 471 | 75 | 22.8 | 785 |
| 13 | 7.25 | 4.7 | 471 | 56.25 | 9.7 | 1047 |
源自實例1中比較性穩定性研究之其他結果提供於下表7中。在4℃儲存脂質體製劑1個月、3個月、6個月、9個月及/或12個月後測定溶血PC之莫耳%，如表7中所指示。就各樣品而言，表7提供用於製備脂質體之SOS之濃度，表示為硫酸酯基之莫耳濃度(一個SOS分子包含8個硫酸酯基)。除非另有指示，否則表7中之所有伊立替康脂質體係分別使用471 g伊立替康部分(等效於500 g無水伊立替康HCl鹽中伊立替康部分的量)/莫耳總脂質體磷脂之伊立替康部分(如上所說明，基於無水游離鹼計)與總磷脂比製得。表7亦包含各樣品之穩定比，計算為471 g伊立替康部分(以無水游離鹼計)/mol磷脂之比除以用於製備脂質體之硫酸酯基之濃度(單位為mol/L)。述於表7中之樣品之脂質體各具有介於約89至112 nm之間之尺寸測量值(體積加權平均值)及至少87.6%之伊立替康囊封效率。依子部分「藥物滯留及穩定性」測定囊封效率。
表 7
：
具有不同穩定比及 pH 之伊立替康脂質體製劑 ( 由 3:2:0.015 莫耳比的 DSPC 、膽固醇 (Chol) 及 PEG-DSPE 形成之脂質體微脂粒 )c | 樣品 | pH | 截留於脂質體中之硫糖酯中硫酸酯基之莫耳濃度 | 穩定比
| 時間(月數) | 溶血PC之莫耳% | 尺寸 | SN38% |
| 12 | 6.5 | 0.65M
| 724 | 0
1
3
9
12 | 3.8 (±0.6)
18.3 (±1.2)
32.7 (±1.9)
35.4 (±0.5)
37.9 | 110.3±19.7
120.1±12.3
107.6±20.2
101.2±26.0
106.4±26.0 |
0.5
0.3
0.3
0.2 |
| 4 | 6.5 | 0.60M
| 785 | 1
3
6
9 | 10.1 (±0.3)
30.2 (±0.9)
35.8 (±0.6) | 107.6±12.4
109.5±13.0
105.3±17.7
105.7±27.9 | 0.030
0.014
0
0.005 |
| 9 | 6.5 | 0.60M
| 785 | 1
3
6
9 | 11.3 (±0.8)
22.1 (±1.3)
29.8 (±1.9)
34.7 (±1.2) | 107.6±26.6
108.6±13.4
112.6±9.4
111.1±15.2 |
0.016
0.010
0.005 |
| 10 | 7.25 | 0.6M
| 785 | 1
3
6
9 | 9.6 (±0.8)
16.9 (±1.1)
24.1 (±0.8)
29.0 (±0.6) | 98.9±7.0
108.4±11.8
103.0±8.9
105.9±23.8 |
0.011
0.010
0.005 |
| 11 | 7.5 | 0.60M
| 785 | 1
3
6
9 | 9.33 (±0.5)
17.1 (±5.01)
22.8 (±0.7)
28.7 (±3.1) | 102.2±23.6
102.6±9.8
105.9±18.1
112.4±15.3 |
0.012
0.010
0.005 |
| 3 | 6.5 | 0.50M
| 942 | 1
3
6
9 | 9.9 (±0.2)
26.5 (±0.3)
35.7 (±0.6) | 109.7±13.7
104.7±12.6
106.6±12.7
88.5±36.5 | 0.024
0.014
0
0.006 |
| 2 | 6.5 | 0.475M
| 992 | 1
3
6
9 | 5.7 (±0.2)
17.0 (±0.4)
23.6 (±1.0) | 89.4±31.9
84.9±33.8
93.4±26.0
102.6±18.8 | 0.028
0.018
0.006 |
| 1 | 6.5 | 0.45M
| 1047 | 1
3
6
9 | 5.0 (±0.1)
19.5 (±0.6)
25.4 (±0.6) | 108.5±13.6
98.6±31.3
112.6±11.4
93.8±27.90 | 0.036
0.022
0
0 |
| 6 | 6.5 | 0.45M
| 1047 | 1
3
6
9 | 5.6 (±1.37)
9.6 (±1.4)
14.6 (±0.5)
17.4 (±0.4) | 106.7±18.2
96.4±26.0
98.2±24.0
109.2±12.6 |
0.051
0.01
0.006 |
| 5 | 7.25 | 0.45M
| 1047 | 1
3
6
9 | 2.0 (±0.3)
7.1 (±0.4)
11.1 (±0.1) | 106.4±18.5
103.9±18.8
107.2±17.3
100.0±28.1 | 0.033
0.015
0
0.007 |
| 7 | 7.25 | 0.45M
| 1047 | 1
3
6
9 | 3.2(±0.3)
3.8 (±0.5)
7.4 (±0.5)
8.1 (±0.7) | 105.3±13.1
104.1±16.7
105.5±13.4
107.3±13.0 |
0.022
0.010
0.006 |
| 8
| 7.5 | 0.45M
| 1047 | 1
3
6
9 | 2.2 (±0.1)
2.8 (±0.1)
5.4 (±0.2)
7.1 (±1.2) | 102.8±14.2
103.5±11.1
91.8±28.6
108.2±19.0 |
0.018
0.010
0.006 |
c
依如本文中所述之方法B測得。
該儲存穩定性研究之結果證實用於製備脂質體之SOS捕獲劑之濃度(測得為硫酸酯之莫耳濃度)減小，同時無水伊立替康游離鹼(單位為g)與總脂質體磷脂(單位為mol)之比保持不變，導致伊立替康SOS脂質體之儲存穩定性更大，如藉由在4℃冷凍儲存6個月及9個月後伊立替康脂質體製劑中所檢測到之溶血PC的量測得。在製造為6.5之pH(參見本文中所述之「pH測量」法)之脂質體製劑時，減小脂質體製造期間SOS捕獲劑之濃度導致在4℃儲存後脂質體製劑中所檢測到之溶血PC的量減少。
在不受理論約束下，據信一旦製備期間自脂質體外捕獲劑純化，脂質體之內部空間酸化。此可歸因於移除脂質體外TEA
8
SOS後捕獲劑鹽之胺組分從脂質體內部至外部再分佈，且在每次發生時氫離子脂質體內沉積。所添加的能夠質子化之藥物諸如伊立替康亦分佈在脂質體之外部與內部空間之間。分佈於脂質體內部中之藥物之質子化及經質子化之藥物與硫糖酯之結合實現藥物之脂質體內加載且導致TEA及氫離子二者之脂質體內濃度減小，從而降低脂質體內酸化之程度。就伊立替康脂質體而言，假設在500 g鹽酸伊立替康(即，471 mg伊立替康)/mol脂質體磷脂之藥物加載下，其中SOS之硫酸酯濃度為0.6M ，則存在過量的脂質體內TEA不完全耗盡。雖然不是滯留藥物於脂質體中之基礎，但此可提供酸性脂質體內部，該酸性脂質體內部可造成脂質體之藥物及脂質組分降解，如樣品7及13中所看到。相比之下，樣品8及5具有500 g鹽酸伊立替康(即471 mg伊立替康部分)/mol之相同藥物加載，但分別為0.45M硫酸酯及0.475M硫酸酯之更低SOS濃度。在該等特定情況中，所測得的溶血脂質之水平更低。最後，顯然的是最穩定的脂質體調配物將更大藥物/捕獲劑比與更大外部pH(即pH 7.25)組合。
樣品1至11之伊立替康脂質體在4℃下至多9個月時保留良好的膠態穩定性，如藉由不存在沉澱及相對狹窄且可再現之粒度分佈判斷，其中伊立替康部分濃度對應於4.71 mg/mL無水伊立替康游離鹼。伊立替康係以在延長儲存時期之最小洩露(＜10%) (參見本文中所述之「藥物滯留及穩定性」方法) 有效且穩定地經截留。
樣品1及2具有約471 g伊立替康部分(如上文所說明，以無水游離鹼計)/mol磷脂之相同初始加載，但分別為0.45M硫酸酯基及0.475M硫酸酯基之更低SOS濃度。類似地，樣品6、7及8具有0.45M硫酸酯之更低SOS濃度，為，但471 g伊立替康部分(如上文所說明，以無水游離鹼計)/mol磷脂之相同藥物加載，導致溶血脂質含量顯著更低 (9個月後，為7至17%)。
在pH 6.5之樣品中測得溶血PC水平之增加，不論脂質體製造期間之藥物加載或捕獲劑濃度，對於一些樣品(1、2及3)而言，增加達到磷脂之35莫耳%。調整pH至7.25使得脂質體不易形成溶血PC，其水平達到總PC之9.72%(例如，比較樣品1與13中之溶血PC水平)。具有更大藥物與捕獲劑濃度比及更高pH之樣品形成較少的溶血脂質，如9個月後具有7至8莫耳%溶血脂質之樣品7及8中可看到。更大藥物捕獲劑比及更高pH(例如，與樣品12相比)之組合減少溶血脂質之形成。最穩定之脂質體調配物將更大的藥物/捕獲劑比(即，相對伊立替康游離鹼的量所定義的高於942之穩定比)與更大的高於6.5之外部pH組合(例如，比較樣品1及13)。
另外，經9個月伊立替康脂質體製劑1至11中測得之SN38%不大於約0.05% SN38(即，SN38之相對量，藉由與伊立替康及SN38相比較)，而樣品12伊立替康脂質體製劑具有經相同時間測得之0.20至0.50% SN38(藉由本文中所述之「藥物分析」法測定)。在樣品1至5及13各者中，伊立替康係以自脂質體之低洩露 (小於13%；藉由本文中所述之「藥物滯留及穩定性」法測定)及轉化成活性細胞毒性SN-38之低轉化率 (小於0.1%，且在於更大pH(7.25)下儲存之樣品中，小於0.05%)穩定地截留。
實例 2
：
液體製劑中伊立替康脂質體之漸增濃度
該儲存穩定性研究之目標係測定當在4℃儲存時脂質體伊立替康SOS之物理及化學穩定性之任何變化。在該研究期間，用於脂質體製劑之蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑之濃度保持在0.65M之硫酸酯基濃度，但改變下列：(1)製備伊立替康脂質體(使用TEA
8
SOS或DEA
8
SOS)期間SOS捕獲劑之初始抗衡離子、(2)無水伊立替康游離鹼的量(單位為克)與磷脂(單位為mol)之比(約471 g或707 g伊立替康部分(如上文所說明，以無水游離鹼計)/mol磷脂)、(3)液體伊立替康製劑中無水伊立替康游離鹼之濃度(4.7 mg/mL或18.8 mg/mL於液體伊立替康脂質體製劑中所囊封的伊立替康(以鹽酸伊立替康三水合物中伊立替康部分之當量濃度計))、(4) 調整伊立替康脂質體製劑之pH(pH 6.5或7.25)、及(5)伊立替康脂質體製劑之緩衝劑(HEPES或組胺酸)。
所研究的調配物參數包括：脂質體尺寸、伊立替康脂質體中之藥物與磷脂比、伊立替康藥物囊封效率及一般外觀、伊立替康降解產物之存在、及溶血PC(單位為莫耳%)之形成。
依多步驟法，使用相對所囊封伊立替康不同濃度之SOS捕獲劑，且將最終脂質體製劑之pH調整至不同pH值，製得一系列伊立替康SOS脂質體製劑。分別稱出對應於3:2:0.015莫耳比的量(730.9 mg/238.5 mg/13.0 mg)之DSPC、膽固醇(Chol)及PEG-DSPE。將脂質溶解於氯仿/甲醇(4/1，v/v)中，徹底混合，並分為2個等分試樣。使用旋轉蒸發器在60℃下將各樣品蒸發至乾燥。藉由室溫下置於真空(180微托)12小時自脂質移除殘餘氯仿。在60℃下將經乾燥之脂質溶解於乙醇中，且添加經預先加熱的TEA
8
SOS或DEA
8
SOS(在0.65M硫酸酯基之濃度下)使得最終醇含量為10%(v/v)並將該等樣品分別命名為A及B。脂質濃度為約75 mM。透過0.1 µm聚碳酸酯膜(Nuclepore™)擠出該脂質分散液10次，以製得具有95至115 nm之典型平均直徑之脂質體。視需要(用1N NaOH)調整擠出型脂質體之pH至所選製劑pH。藉由離子交換層析及尺寸排除層析之組合來純化該等脂質體。。首先，用1N NaOH處理Dowex™ IRA 910樹脂，接著用去離子水洗滌3次，且然後接著用3N HCI洗滌3次，之後用水洗滌多次。藉由使用流式細胞電導計(Pharmacia, Uppsala, Sweden)測量洗脫溶離份之導電率。若導電率小於15 µS/cm，則認為該等溶離份可接受用於進一步純化。接著將脂質體洗脫物施加至以去離子水平衡之Sephadex G-75(Pharmacia)管柱，且測量所收集脂質體溶離份之導電率(通常小於1 µS/cm)。藉由添加40%葡萄糖溶液至5%(w/w)之最終濃度來實現跨膜等滲壓，且自原液(0.5M，pH 6.5)添加緩衝劑(Hepes)至10 mM之最終濃度。
考慮到自各批次分析憑證獲得之水含量及雜質水平，藉由將326.8 mg伊立替康•HCl三水合物粉末溶解於20.0 mL去離子水中形成15 mg/mL無水伊立替康-HCl，來製備伊立替康原液。藉由添加500g/mol或750g/mol磷脂之無水伊立替康游離鹼且在熱水浴中加熱至60 ± 0.1℃持續30 min引發藥物之加載。自水浴移除後藉由浸入冰冷的水中使該等溶液快速冷卻。藉由尺寸排除層析，使用針對樣品A以Hepes緩衝鹽水(10 mM)(HBS)(pH 6.5)及針對樣品B以組胺酸緩衝鹽水(pH 7.25)平衡並洗脫之Sephadex G75管柱，移除脂質體外藥物。藉由HPLC分析該等樣品之伊立替康且藉由Bartlett法(參見「磷酸酯測定」)分析磷酸酯。
就儲存而言，將該等樣品分成4 mL等分試樣，且若需要則使用1N HC1或1N NaOH調整pH，在無菌條件下無菌過濾，並填充至無菌透明玻璃小瓶中，在氬氣下用Teflon® 內襯螺紋蓋密封並置於4℃之恆溫控制冰箱中。在限定的時間點，自各樣品移取等分試樣並測試外觀、尺寸、藥物/脂質比、及藥物及脂質化學穩定性。
藉由動態光散射，使用在90°角的Coulter奈米粒度儀測定經稀釋之樣品中之脂質體尺寸並表示為可藉由累積量法獲得之平均值±標準偏差(nm)。
比較性穩定性研究之結果提供於表8(就使用TEA
8
SOS捕獲劑起始材料製得的樣品而言)及表9(就使用DEA
8
SOS捕獲劑起始材料製得的樣品而言)中。
表 8
：
用含在 Hepes 緩衝液中之 TEA8
SOS 捕獲劑製得之伊立替康脂質體 (10 mM)d | 樣品 | 最終製劑之pH
| [伊立替康]/總莫耳之PL | 截留於脂質體中之硫糖酯中硫酸酯基之莫耳濃度 | 穩定比 | [伊立替康] g/mol | 時間(月) | 溶血PC莫耳% |
| 12 | 6.5 | 471 | 0.65M | 724 | 5 | 0
1
3
9
12 | 3.8 (±0.6)
18.3 (±1.2)
32.7 (±1.9)
35.4 (±0.5)
37.9 (±0.5) |
| 14 | 6.5 | 471 | 0.65M
| 724 | 20 | 0
1
3
9
12 | 3.8 (±0.6)
15.9(±0.6)
19.2(±0.3)
32.1(±0.5)
36.0(±0.8) |
| 13 | 7.25 | 471 | 0.45M
| 1047 | 20 | 1
6
9 | 2.6 (±0.6)
9.72 (±1.9)
13.8 (±1.0) |
d
依如本文中所述之方法B測得。
樣品13(實例2，表8)係以相比樣品1至5(實例1)大4倍的濃度(20 mg伊立替康/mL)儲存且仍保留良好的膠態穩定性，且未觀察到聚集或沉澱。
表9：
用 0.65M 之硫酸酯基濃度之 DEA8
SOS 捕獲劑 (pH 7.25) 製備伊立替康脂質體 e | 樣品 | mg伊立替康/mL | [伊立替康]/總莫耳PL
| 穩定比 | 時間(月) | 溶血PC莫耳% | 尺寸 | SN38% |
| 15 | 18.8 | 471
| 724 | 0
1
3
9
12 | 2.6 (±0.2)
8.8(±1.2)
6.9(±0.8)
9.6(±0.5)
11.0(±0.4) | 106.8±18.3
106.3±26
85.9±30.8
97.1±19.0
116.1±26.6 |
0.05
0.08
0.05
0.04 |
| 16 | 18.8 | 707
| 1086 | 0
1
3
9 | 2.0 (±0.6)
0.9(±0.1)
0.93(±0.5)
2.3(±0.1) | 101.0±23.0
112.3±23.5
93.2±25.0
99.2±19.7 |
0.01
0.09
0.03 |
| 17 | 4.7 | 707
| 1086 | 0
1
3
9
12 | 2.0 (±0.6)
0.4 (±0.2)
1.1 (±0.4)
1.5 (±0.2)
1.5 (±0.1) | 101.0±23
112.6±23.3
102.4±16.2
99.5±15.8
106.2±22.5 |
0.07
0.05
0.06
0.04 |
| 18 | 18.8 | 707
| 1086 | 0
1
3
9
12 | 2.0 (±0.6)
0.7 (±0.3)
0.4 (±0.4)
0.1 (±0.1)
1.5 (±0.1) | 101.0±23
108.1±23.7
100.2±18.0
98.1±18.3
100.0±26.5 |
0.01
0.04
0.03
0.01 |
e
依如本文中所述之方法B測得。
新擠出的脂質體尺寸囊封(A)0.65M硫酸酯之TEA
8
SOS (113.0±23.8nm)或(B)0.65M硫酸酯基之DEA
8
SOS(103.2±21.1 nm) (唯一的例外係樣品13，其具有0.45M硫酸酯基)中任一者。自(A)衍生出樣品12及14及自樣品(B)衍生出樣品15至18，且樣品12、14、15及16係以471 g無水伊立替康游離鹼(等效於500 g無水伊立替康HCl)/mol總脂質體磷脂加載及樣品16至18係以750 g伊立替康部分(如上文所說明，以無水游離鹼計)/mol磷脂加載。純化後，適宜地使用1N HCl或1N NaOH進行pH之調整且如表7及8中所述調整至pH 6.5或7.25。如實例1中所述製得樣品12且出於比較之目的而包含於表8中。
數據顯示該等脂質體在4℃下長達一年保留良好的膠態穩定性，如藉由不存在沉澱及相對狹窄且可再現之粒度分佈判斷。其次，明顯地，更濃樣品當在高pH及提高的藥物與磷脂比下儲存時其膠態穩定性亦良好，表明在等效於20 mg/mL及40 mg/mL鹽酸伊立替康三水合物之伊立替康部分濃度下，該等脂質體係穩定的且抗聚集物形成。
在所有情況中，伊立替康係以低洩露及活性細胞毒性SN-38的低轉化率(即，SN38之相對量，與伊立替康及SN38相比較) 穩定地截留於脂質體中；在所有情況中，小於0.5莫耳%，及樣品12除外，小於0.1莫耳% SN-38。藉由本文中所述之「藥物滯留及穩定性」法及「藥物分析」法獲得數據。
在已調整至pH 6.5且以471 g伊立替康部分(如上文所說明，使用等效量之500 g無水伊立替康HCl)/mol磷脂製得之樣品中測得溶血PC水平之增加，就樣品12及14而言，達到36至37莫耳%(之總磷脂醯膽鹼)，而調整pH至7.25使得脂質體不易形成溶血脂質，且就樣品15而言，一年後溶血PC水平僅接近11莫耳% (之總磷脂醯膽鹼)。
使脂質體pH從6.5改變為7.25對於膠態穩定性或藥物洩露無不利影響。
實例 3
：
具有不同量之 TEA(SOS 捕獲劑抗衡離子 ) 之穩定之伊立替康脂質體之儲存穩定性
藉由加載伊立替康至囊封蔗糖八硫酸酯(SOS)及經取代之銨抗衡離子(例如，質子化TEA)之脂質體中製得伊立替康脂質體。藉由製造多種含不同量之所囊封殘留經取代之銨離子之伊立替康SOS脂質體，在4℃於冷凍下儲存該等伊立替康SOS脂質體6個月，且接著測量該等伊立替康SOS脂質體中溶血PC之量(單位為莫耳%)，來評估改變加載藥物之伊立替康SOS脂質體中經取代之銨之殘留量之效應。
數據顯示減少伊立替康SOS脂質體中經取代之銨離子之量導致在4℃冷凍儲存6個月後溶血PC之水平更低。特定言之，具有小於100 ppm(例如，20至100 ppm TEA)之經取代之銨之伊立替康SOS脂質體展現冷凍儲存(4℃)6個月後溶血PC之形成水平更低。
依本發明之某些實施例，遵循本文中所述之方案，製備脂質體伊立替康硫糖酯之六個批次(樣品24至29)，其等分別具有1046至1064之穩定比、3:2:0.015莫耳比的DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE之脂質組成。
藉由HPLC(本文中之方法A)測定表10中之溶血PC的量。
表 10
：
pH 7.3 之伊立替康脂質體製劑 ( 囊封於由 3:2:0.015 莫耳比的 DSPC 、膽固醇 (Chol) 及 PEG-DSPE 形成之微脂粒中之伊立替康 SOS) | 樣品
(批次) | D
(mm) | 伊立替康mg/mL | DL比 g/mol | pH | 伊立替康/SOS 克當量比 | TEA ppm | 初始溶血PC mg/mLf | 溶血PC速率 mg/mL/月 | 180天時之溶血PC莫耳%g |
| 24 (1) | 110 | 4.51 | 502 | 7.3 | 1.020±0.012 | 16 | 0.060 | 0.0077 | 2.2 |
| 25 (2) | 109 | 4.38 | 517 | 7.3 | 1.018±0.031 | 14 | 0.059 | 0.0124 | 3.0 |
| 26 (3) | 109 | 4.43 | 481 | 7.3 | 0.963±0.008 | 39 | 0.148 | 0.0309 | 6.9 |
| 27 (4) | 107 | 4.43 | 469 | 7.3 | 0.965±0.019 | 79 | 0.081 | 0.0313 | 5.4 |
| 28 (5) | 108 | 4.43 | 487 | 7.3 | 0.983±0.021 | 18 | 0.060 | 0.0126 | 2.8 |
| 29 (6) | 112 | 4.43 | 503 | 7.3 | 0.907±0.009 | 100 | 0.110 | 0.0585 | 10.1 |
f
依如本文中所述之方法A測得。
g
依如本文中所述之方法A測得。
藉由透過100 nm聚碳酸酯膜(Nuclepore)擠出分散於TEA-SOS溶液(0.4至0.5M硫酸酯)中之脂質，獲得脂質體(100至115 nm)，自脂質體外TEA-SOS藉由針對於滲透平衡葡萄糖溶液切向流透析過濾緩衝液交換純化，藉由提高溫度至68℃加載伊立替康，且攪拌30分鐘，快速冷卻，且自脂質體外TEA及任何未囊封藥物藉由針對於緩衝生理氯化鈉溶液切向流透析過濾緩衝液交換純化。藉由通過0.2 µm膜過濾器來無菌過濾伊立替康硫糖酯脂質體組合物，無菌分配至無菌玻璃小瓶中，且在冷凍條件(5 ± 3℃)下培養。在約0個月、3個月、6個月、9個月且在一些情況中，12個月之冷凍儲存時間點，取出各批次之一式兩份小瓶且使用HPLC法利用蒸發散射檢測器分析累積溶血PC之量。脂質體組合物亦藉由粒度、伊立替康及脂質體磷脂濃度、脂質體組合物之pH、伊立替康/硫糖酯克-當量比(Iri/SOS比)及殘留三乙基銨(質子化TEA)(呈三乙胺形式)表徵。藉由DLS法，使用Malvern ZetaSizer NanoZS
TM
測定平均粒度(D)及多分散性指數(PDI)。藉由HPLC測定脂質體組合物中之伊立替抗濃度。於硫酸/過氧化氫混合物中消解脂質體後，藉由藍色磷鉬酸鹽法以分光光度方式測定總磷脂。
將脂質體製劑中藥物量(作為無水游離鹼)(單位為g)除以脂質體磷脂之莫耳量，計算得藥物/脂質(DL)比。使脂質體通過經生理鹽水洗脫之Sephadex G-25凝膠層析管柱(PD-10, GE Healthcare)後，量化經脂質體截留之SOS。為測定伊立替康/SOS克-當量比，將經洗脫之脂質體溶離份之0.1 mL等分試樣(以一式三份)與0.05 mL 70%高氯酸混合，在95 至100℃水解1小時，用0.8 mL 1M乙酸鈉中和，過濾以移除不溶性脂質產物，且藉由比濁法使用基本上如方法下方所述之鋇-PEG試劑量化濾液中硫糖酯衍生之硫酸酯基的量。在70%酸化(0.1M HCl)異丙醇水溶液中裂解相同脂質體洗脫物之另一組一式三份的等分試樣且藉由分光光度法於365 nm下分析伊立替康。藉由將藥物莫耳濃度測定值除以硫酸酯基莫耳濃度測定值計算得各洗脫脂質體溶離份中之伊立替康/硫糖酯克-當量比(Iri/SOS比)。如子部分「pH測量」中所述測量pH。藉由頂部空間氣相層析(GC)分離，利用毛細管GC柱上之梯度溫度洗脫，接著火焰離子化檢測(FID)，來量化TEA。結果以TEA之ppm(份/百萬份)表示。藉由針對標準品之外部量化測定TEA之水平。
5、6、7、10、11A、11B及12中之數據係從藉由加載具有約400至600 mg(例如，約500 g)伊立替康部分/mol總磷脂(約1000至1200範圍內之穩定比)及製造後約7.0至7.5(例如，約7.25)之pH的0.4至0.5M TEA
8
SOS捕獲劑脂質體製得的脂質體伊立替康樣品獲得。在圖5至7中所指示的時間點，使用實例9之HPLC法測量該等脂質體伊立替康樣品各者中溶血PC的量。
將溶血PC累積數據(單位為mg溶血PC/mL脂質體組合物)對儲存時間作圖，如圖5(樣品24至26/批次1至3)或圖6(樣品27至29/批次4至6)中所顯示。觀察到線性校正，其中溶血PC累積從約0.008 mg/mL/月至約0.06 mg/mL/月變化，越高速率表徵具有越高TEA量之組合物。藉由多點數據之線性接近(圖5A及5B)測定儲存第180天(約6個月)時累積的溶血PC的量且表示為PC之莫耳%，取溶血PC之分子量等於523.7 g/mol。所有六個批次(樣品24至29；參見表10)在冷凍儲存第180天時累積小於20莫耳%之溶血PC。具有小於20 ppm之TEA及大於0.98之Iri/SOS克當量比之批次顯示溶血PC累積最少(小於約0.015 mg/mL/月，第180天之溶血PC為3.0莫耳%或更少)；具有小於80 ppm之TEA之批次係以約0.03 mg/mL/月或更小之速率累積溶血PC，且在第180天具有小於7莫耳%之溶血PC；具有100 ppm之殘留TEA之批次係以約0.06 mg/mL/月之速率累積溶血PC，且在第180天具有約10莫耳%之溶血PC。
圖7為顯示在5 ± 3℃儲存之溶血PC之累積速率(單位為mg/mL/月)對穩定之伊立替康硫糖酯脂質體組合物中之TEA含量(單位為ppm)所作之圖、及從數據導出之線性回歸線。類似於實例3，製備脂質體伊立替康硫糖酯之五個其他批次。該等製劑係以約4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼/mL之伊立替康部分(如上文所說明，以無水游離鹼計)儲存且如實例3中所述週期性地分析溶血PC之形成及TEA含量。溶血PC累積之速率係經計算為藉由擬合各批次隨儲存時間變化之溶血PC數據所獲得之線性回歸線的斜率且以BDP/DP配對批次之平均TEA讀數對TEA含量作曲線(圖6)。如下從圖可知，具有約25 ppm或更少之TEA之製劑係以小於0.02 mg/mL/月之速率累積溶血PC(經180天時間小於2.5莫耳%之溶血PC增加)；具有小於約70 ppm之TEA之製劑係以小於0.033 mg/mL/月之速率累積溶血PC(經 180天時間小於4.3莫耳%之溶血PC增加)，及所有製劑具有小於約100 ppm之TEA且係以小於0.062 mg/mL/月之速率累積溶血PC(經 180天時間小於8.0莫耳%之溶血PC增加)。
樣品24、25及28各具有小於20 ppm(例如，約10至20 ppm)之經取代之銨離子(質子化TEA)且具有在4℃冷凍儲存6個月後所觀察到最低量之溶血PC(2.2至3莫耳%之溶血PC)。樣品26與27相比較，伊立替康SOS脂質體中殘留的經取代之胺捕獲劑抗衡離子(例如，質子化TEA)從約39 ppm增加至79 ppm(增加103%)係藉由在180天後所觀察到溶血PC的量意外下降 (從6.9莫耳%減小至5.4莫耳%，溶血PC減少22%)實現。然而，伊立替康SOS脂質體中殘留的經取代之銨離子(例如，質子化TEA)之量進一步從79 ppm(樣品27)增加至100 ppm(樣品29)(即，增加27%)係藉由使在4℃冷凍儲存6個月後所觀察到溶血PC的量另增加87%(即，從樣品27中之5.4莫耳%增加至樣品29中之10.1莫耳%)實現。
實例 4
：
伊立替康與硫糖酯之相互作用
圖8為顯示如實例4中所述藉由將鹽酸伊立替康及硫糖三乙銨在不同比例的硫糖酯(SOS)之水溶液中組合形成之沉澱中伊立替康及硫糖酯之克-當量含量之圖。
當將鹽酸伊立替康之溶液與含硫糖三乙銨之脂質體組合時，可消除氫離子且可形成伊立替康硫糖酯鹽。為研究伊立替康與硫糖三乙銨之間之反應，製備25 mM(16.93 mg/mL)鹽酸伊立替康三水合物USP水溶液及250 meq/L (31.25 mM)硫糖三乙銨(TEA-SOS)溶液(基本上如「方法」部分中所述)。用水稀釋鹽酸伊立替康溶液之等分試樣，加熱至65℃，且與TEA-SOS溶液之等分試樣組合以得到一系列介於9:1與1:9之間之伊立替康SOS克-當量比，在兩種化合物之總克-當量濃度總和等於25 meq/L下。藉由渦轉快速地混合該等樣品，在65℃培養30分鐘，在冰水中冷卻，且允許在4至6℃平衡過夜。在所有樣品中，觀察到沉澱。第二天，以10000x g離心該等樣品5分鐘且再以14000x g離心5分鐘，且分離透明上清液流體(於大量稀鬆白色至淺棕黃色之沉澱上)並基本上如實例中所述分析未沉澱之伊立替康及SOS之量以確定沉澱之量及組成。將該等結果對樣品中SOS之克-當量百分比作曲線 (圖8)。在20至80當量% SOS之範圍中，兩種組分之圖係由兩個在50當量%值處相遇的線性分支組成，這指示伊立替康及硫糖酯形成化學計量為每一個硫糖酯之硫糖酯基一個伊立替康分子(即，每一個硫糖酯(SOS)分子八個伊立替康(IRI)分子)之不溶性鹽：
8 IRI.HCl + TEA
8
SOS à (IRI.H)
8
SOS ↓ + TEACl
不管質子化伊立替康分子及硫糖酯陰離子之分子大小及形狀之顯著差異，其鹽驚人地保持接近的化學計量：一個硫糖酯分子八個質子化伊立替康分子，甚至在任一組分大量地過量下(圖8)。因此，伊立替康硫糖酯可呈難溶、沉澱或膠凝形式存於脂質體中。使鹽沉澱保持其嚴格化學計量之事實允許該過程進行至當硫糖酯之幾乎所有或基本上所有硫酸酯基結合至藥物分子時的點。與實例6之伊立替康-硫糖酯克當量比測量值一致，在一些實施例中，加載伊立替康以獲得本發明之穩定之脂質體之過程可包括脂質體沉澱化學計量藥物鹽直到至少90%、至少95%、或甚至至少98%，且在一些情況中，基本上所有的游離脂質體硫糖酯藉由其伊立替康鹽之沉澱及/或膠凝自脂質體水相耗盡。
實例 5
：
伊立替康硫糖酯之製備及穩定性測定。
將量為1.64 g之鹽酸伊立替康三水合物添加至160 mL經0.008 mL 1N HCl酸化之水，且伴隨攪拌下基於65℃水浴加熱直到藥物溶解。伴隨強力攪拌下添加5 mL 0.46M(以硫酸酯濃度計)硫糖三乙銨，且再攪拌五分鐘。在4至6℃儲存過夜後將淡黃色油性沉澱固化成脆性物質。用玻璃棒研磨該物質以提供絮狀灰白色沉澱且在冷凍下培養25天。藉由離心分離沉澱，且丟棄上清液溶液。將集結粒再懸浮於五體積的去離子水中，且藉由離心沉澱；再重複此洗滌步驟兩次直到上清液之pH為約5.8。最後，將集結粒再懸浮於等體積的去離子水中以得到約26 mL或具有46.0 mg/mL(游離鹼)之伊立替康含量之產物(理論產率為84%)。將產物之等分試樣溶解於1N HCl中且分析伊立替康(藉由於365 nm下在70%異丙醇水溶液-0.1 N HCl中進行分光光度分析)及使用硫酸鋇比濁分析檢定來分析在經稀釋(1:4)之高氯酸中水解後之硫酸酯。測得伊立替康與SO
4
之莫耳比為1.020 ± 0.011。添加伊立替康硫糖酯懸浮液之等分試樣至去離子水至0.93、1.85及3.71 mg/mL之最終藥物鹽濃度。伴隨振盪下在4至6℃培養該等樣品22小時，藉由以14000 g離心10 min移除固體物質，且藉由分光光度法分析上清液流體中之伊立替康。發現溶液中伊立替康之濃度分別為58.9 ± 0.90 μg/mL、63.2 ± 0.6 μg/mL、及63.4 ± 1.3 μg/mL，平均相當於1.32 x 10
-5
M之伊立替康硫糖酯莫耳溶解度。
實例 6
：
各種伊立替康脂質體
使用25 mm擠出機、中空纖維、或用於初始透析過濾步驟之切向流過濾(TFF)設置、微米級藥物加載、及用於EAV過濾前最終透析過濾之TFF設置，實施該實例之所有實驗。由於加載藥物之材料的體積有限，生物安全櫃中改用20 cm
2
EAV過濾器替代兩個EBV過濾器來進行稀釋後之最終過濾。
表 11 ： | 樣品 | 31a
(2a) | 31b
(2b) | 32a
(3a) | 32b
(3b) | 33
(4) | 34
(5) |
| 所囊封的伊立替康之濃度(mg/mL) | 4.56 | 4.68 | 4.65 | 4.58 | 5.2 | 5.1 |
| 所囊封的伊立替康%(%) | 98.4 | 99.2 | 98.2 | 99.3 | 99.7 | 99.8 |
| DSPC:膽固醇莫耳比 | 3.03:1.00 | 2.96:1.00 | 3:1 | 3:1 |
| 伊立替康:磷脂比(mg/mol) | 486 | 486 | 458 | 458 | 502 | 481 |
| pH | 7.28 | 7.28 | 6.41 | 6.41 | 7.3 | 7.3 |
| 粒度測量值(USP729) (nm) (PDI) | 90至130 (0.05) | 110 (0.10) | 109 (0.05) |
| 溶血PC濃度(mg/mL) | ＜0.060 | 0.175 | 0.076 | 0.573 | 0.24 | 0.79 |
| 溶血PC濃度(莫耳%)h | 4.04 | | 12.72 | | 5.11 | 16.43 |
h
依如本文中所述之方法A測得。
參考表11，製備一系列具有不同量之溶血PC之不同伊立替康脂質體。除非另有指示，否則伊立替康脂質體囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯於由3:2:0.015莫耳比的DSPC、膽固醇及MPEG2000DSPE組成之微脂粒中。
藉由如實例1中所述(除如該實例中所指出外)製備脂質體，且接著在脂質體擠出後於72℃保持擠出型脂質體8小時，在8小時末調整pH至6.2至6.9，得到具有約45莫耳%溶血PC(即，約1.7 mg/mL)之組合物，來獲得樣品30(批次1)。製備MLV之時被認為時間0。使用基線實驗1之等分試樣進行該實驗。用具有更小DSPC:膽固醇莫耳比(在其他樣品中改成約2:1替代3:1)之脂質體製備樣品30(批次1)之組合物。所得的伊立替康脂質體組合物具有高水平之溶血PC(即，大於1 mg/mL並大於40莫耳%之溶血PC)。
使用實例1之方法製備樣品31a及31b(批次2a及2b)，修改處在於測試伊立替康藥物加載前增加脂質體中之TEA-SOS溶液濃度對於所得伊立替康脂質體組合物之特徵之效應及減小伊立替康藥物加載速率15%對於所得伊立替康脂質體組合物之特徵之效應。藉由形成具有囊封0.5M硫酸酯基濃度之TEA-SOS溶液之含DSPC及膽固醇(以表11中所提供的比)之微脂粒以形成多層微脂粒(MLV)之脂質體，且使該等脂質體與鹽酸伊立替康溶液以510 g無水伊立替康游離鹼/mol PL之量接觸以加載藥物至脂質體中，得到樣品31a(2a)之物質。藉由在40℃維持樣品31a(2a)之脂質體組合物1週，接著再次分析樣品，得到樣品31b(2b)之物質。所得的樣品31a及31b(2a及2b)之伊立替康脂質體組合物均包含極低水平之溶血PC(即，樣品31a(2a)中，小於約0.06 mg/mL或4莫耳%，及樣品31b(2b)中，約0.175 mg/mL)。
使用實例1之方法製備樣品32a及32b(分別為批次3a及3b)，所選修改處為研究調配物緩衝液pH及減小之伊立替康藥物加載速率之組合效應。藉由形成具有囊封TEA-SOS溶液之含DSPC及膽固醇(以表10中所提供的比)之微脂粒以形成MLV之脂質體，且使該等脂質體與伊立替康接觸以加載藥物至脂質體中，於經選擇以提供約6.50之pH(而非樣品30(1)中約7.25之pH)之緩衝液中以表11中所指示的伊立替康藥物加載速率(相比樣品33(4)及34(5)，伊立替康藥物加載速率更低)形成伊立替康蔗糖八硫酸酯於脂質體中，得到樣品32a(3a)之物質。藉由在40℃維持樣品3a之組合物1週，接著再次分析樣品，得到樣品32b(3b)之物質。所得的伊立替康脂質體組合物32a(3a)及32b(3b)均分別含0.076 mg/mL及0.573 mg/mL之溶血PC之低水平。
依實例1中所述之方法製備樣品33(4)及34(5)。藉由形成具有囊封TEA-SOS溶液之含DSPC及膽固醇(表11中所提供的比)之微脂粒以形成MLV之脂質體，且使該等脂質體與伊立替康接觸以加載藥物至脂質體中，於經選擇以提供約7.25之pH(而非樣品3a及3b中之約6.5之pH)之緩衝液中以500 g伊立替康部分(以無水游離鹼計)/mol磷脂形成伊立替康蔗糖八硫酸酯於脂質體中，得到樣品33(4)及34(5)之物質。所得的伊立替康脂質體組合物3a及3b均分別包含0.24 mg/mL及0.79 mg/mL之溶血PC之低水平。
圖12為顯示樣品33(4)(圓形，下方線)及樣品34(5)(「+」數據點，上方線)中測得的溶血PC之量之圖。相比樣品33(4)，樣品34(5)中溶血PC形成之速率更大。對圖12中數據點之線性擬合如下：
樣品33(4)：溶血PC，mg/mL = 0.0513596 + 0.0084714*累積時間
樣品34(5)：溶血PC，mg/mL = 0.1766736 + 0.0279783*累積時間
22個月時樣品33及34中伊立替康脂質體製劑之總溶血PC濃度分別為0.24 mg/mL及0.79 mg/mL。
實例 7
：
伊立替康脂質體注射液 (ONIVYDE®)
儲存穩定之伊立替康脂質體製劑之一個較佳實例為以ONIVYDE®(伊立替康脂質體注射液)(Merrimack Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA)出售的產品。ONIVYDE®產品為拓樸異構酶抑制劑，與鹽酸伊立替康三水合物調配成適於靜脈內使用之脂質體分散液。組合氟尿嘧啶及甲醯四氫葉酸時，指示ONIVYDE®產品用於治療罹患遵照基於吉西他濱之治療疾病進展後胰臟之轉移性腺癌之患者。
ONIVYDE®產品之推薦劑量為70 mg/m
2
，每2週一次藉由歷時90分鐘靜脈內輸注進行投與。ONIVYDE®產品係組合甲醯四氫葉酸及氟尿嘧啶投與以用於治療胰臟癌之特定形式。已知為UGT1A1*28等位基因之同合子之該等胰臟癌患者中ONIVYDE®產品之推薦起始劑量為50 mg/m
2
，歷時90分鐘經靜脈內輸注進行投與。如隨後的週期中所耐受，增加ONIVYDE®產品之劑量至70 mg/m
2
。對血清膽紅素超過正常值上限之患者未推薦ONIVYDE®產品之劑量。
如下投與ONIVYDE®產品至患者。首先，從小瓶取出經計算體積之ONIVYDE®產品。接著在500 mL 5%葡萄糖注射液USP或0.9%氯化鈉注射液USP中稀釋該量之ONIVYDE®產品且藉由輕輕倒置混合。應保護稀釋液免受光影響。接著，當在室溫儲存該製劑4小時內或當在冷凍條件(2℃至8℃(36℉至46℉))下儲存該製劑24小時內投與該稀釋液。投與前使稀溶液達到室溫，且其不應為冷凍的。接著，歷時90分鐘在不使用線中過濾器下輸注該稀釋液，且丟棄未使用的部分。
ONIVYDE®產品係由鹽酸伊立替康三水合物(一種拓樸異構酶抑制劑)調配成適於靜脈內使用之脂質體分散液。鹽酸伊立替康三水合物之化學名稱為(S)-4,11-二乙基-3,4,12,14-四氫-4-羥基-3,14-二側氧基-1H-吡喃并[3',4':6,7]-吲嗪并[1,2-b]喹啉-9-基-[1,4'聯哌啶]-1'-羧酸酯單鹽酸鹽三水合物。經驗式為C
33
H
38
N
4
O
6
∙HCl∙3H
2
O且分子量為677.19 g/mol。分子結構式為：
。
ONIVYDE®產品係呈無菌白色至淺黃色之不透光等滲脂質體分散液形式提供。每一10 mL單劑量小瓶裝納43 mg伊立替康游離鹼當量，濃度為4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼/mL(即，4.3 mg伊立替康部分/mL)。該脂質體為直徑約110 nm之單層狀脂質雙層微脂粒，其囊封含呈膠凝或沉澱狀態作為蔗糖八硫酸酯鹽之伊立替康之水空間。該微脂粒係由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC) 6.81 mg/mL、膽固醇2.22 mg/mL及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE) 0.12 mg/mL組成。每mL亦包含作為緩衝液之4.05 mg/mL之2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)及作為等滲性試劑之8.42 mg/mL之氯化鈉。
伊立替康脂質體注射液為囊封於脂質雙層微脂粒或脂質體中之拓樸異構酶1抑制劑。拓樸異構酶1藉由引起單股斷裂解開DNA中之扭轉應變。伊立替康及其活性代謝產物SN-38可逆地結合至拓樸異構酶1-DNA複合物且防止單股斷裂之再接合，從而導致暴露時間依賴性雙股DNA損傷及細胞死亡。在具有人類腫瘤異種移植之小鼠中，以相比伊立替康HCl低5倍的伊立替康HCl當量劑量投與之伊立替康脂質體實現SN-38之類似腫瘤內暴露。
使用群體藥物動力學分析評估罹患癌症之患者之總伊立替康及總SN-38之血漿藥物動力學，該患者以介於50 mg/m
2
與155 mg/m
2
之間之劑量接受作為單藥或作為組合化療之一部分之ONIVYDE®產品，及353位罹患癌症之患者。
下文呈現以70 mg/m
2
作為單藥或組合化療之一部分投與ONIVYDE®產品後總伊立替康及總SN-38之藥物動力學參數。
表12：
平均值 (± 標準偏差 ) 總伊立替康及總 SN-38 之匯總
C
max
：最大血漿濃度
AUC
0-∞
：外推至無窮大時間之血漿濃度曲線下面積
t
1/2
：最終之排除半衰期(Terminal elimination half-life)
CL：清除率
V
d
：分佈體積
在50 mg/m
2
至155 mg/m
2
之劑量範圍內，總伊立替康之Cmax及AUC係隨劑量增加。另外，總SN-38之Cmax係隨劑量成比例增加；然而，總SN-38之AUC隨劑量低於按比例增加。
伊立替康脂質體之直接測量值顯示伊立替康之95%保持脂質體囊封狀，且總體與囊封形式之間的比不隨時間自給藥後0至169.5小時變化。
ONIVYDE®產品應儲存在2℃至8℃(36℉至46℉)，應保護免遭光影響，且不應為冷凍的。
關於長期穩定性置放多個ONIVYDE®產品製劑且在2至8℃(冷凍條件)儲存12至36個月的時間進行分析。結果以圖9、10、11A及11B之圖形式作曲線，如下文所述。在一個研究中，測量12個ONIVYDE®產品製劑經12至36個月的粒度(圖9)及粒度分佈(圖10)。PDI維持甚低於0.1，及所有樣品係低於約0.05。在另一研究中，測定13個不同ONIVYDE®產品製劑經12至36個月之pH(圖11A)。在研究期間，所有樣品之pH維持大於6.8。在另一研究中，測量16個不同ONIVYDE®產品製劑冷凍儲存期間經12個月之溶血PC的量(圖11B)。所有樣品之溶血PC的量維持低於1 mg/mL。
出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例中之伊立替康游離鹼濃度之目的，如「實例」部分中所提供量化伊立替康游離鹼。出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例之脂質組成之目的，使用標準HPLC法(係相關技術中之標準)量化脂質。
出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例之脂質體之平均粒度(D)及多分散性指數(PDI)之目的，將DLS法與Malvern ZetaSizer Nano ZS
TM
結合使用。
出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例中溶血PC之存在之目的，如「實例」部分中所述量化溶血PC。另外，本發明內文中亦設想可如說明書中所述藉由HPLC量化溶血PC。
實例 8
：
拓樸替康及長春瑞濱脂質體
該儲存穩定性研究之目標係測定當在4℃儲存時用蔗糖八硫酸酯捕獲劑製得的拓樸替康(TPT)脂質體及長春瑞濱(VNB)脂質體之物理及化學穩定性之任何變化。具體而言，該研究檢查脂質體製造期間蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑濃度從0.6M減小至0.45M硫酸酯基，同時維持如下指示之每mol磷脂拓樸替康或長春瑞濱與磷脂比，是否將對於存於脂質體樣品中之溶血PC的量具有影響。類似地，檢查pH從6.5增加至7.5之影響，以測定此種pH之增加是否會減少脂質體組合物中溶血PC之存在。TPT及VNB係用SOS捕獲劑囊封於含3:2:0.015莫耳比的DSPC、膽固醇(Chol)及PEG-DSPE之脂質體中。所研究的調配物參數包括：溶液pH(6.5至7.5)、脂質體製備期間蔗糖八硫酸酯捕獲劑之濃度(0.45至0.6M硫酸酯)、所囊封的藥物(TPT或VNB)、及藥物與脂質比(脂質體加載期間， 500 g TPT HCl/mol磷脂；就VNB而言，脂質體加載期間350至450 g VNB部分/mol磷脂)。該穩定性研究期間提及的脂質體之各種物理化學性質為：脂質體尺寸、藥物與磷脂比、藥物囊封效率、一般外觀及溶血脂質之形成。
分別稱出對應於3:2:0.015莫耳比的量(790.15 mg/257.8 mg/14.0 mg)之DSPC、膽固醇(Chol)及PEG-DSPE。將脂質溶解於氯仿/甲醇(4/1，v/v)中，徹底混合，並分為2個等分試樣(A及B)。使用旋轉蒸發器在60℃下將各樣品蒸發至乾燥。藉由室溫下置於真空(180微托)12小時自脂質移除殘餘氯仿。在60℃下將經乾燥之脂質溶解於乙醇中，且添加適宜濃度之經預先加熱的TEA
8
SOS以使最終醇含量為10%(v/v)。總磷脂濃度為約75 mM。透過0.1 µm聚碳酸酯膜(Nuclepore™)擠出該脂質溶液10次，以產生具有95至115 nm之典型平均直徑之脂質體。若需要，則視需要(用1N NaOH)調整擠出型脂質體之pH至pH 6.5。藉由離子交換層析及尺寸排除層析之組合來純化該等脂質體。首先，用1N NaOH處理Dowex™ IRA 910樹脂，接著，用去離子水洗滌3次，且然後接著用3N HCI洗滌3次，之後用水洗滌多次。藉由使用流式細胞電導計(Pharmacia, Uppsala, Sweden)測定洗脫溶離份之導電率。若導電率小於15 µS/cm，則認為該等溶離份可接受用於進一步純化。接著將脂質體洗脫物施加至以去離子水平衡之Sephadex G-75 (Pharmacia)管柱，且測定所收集脂質體溶離份之導電率(通常小於1 µS/cm)。添加40%葡萄糖溶液以達到5%(w/w)之最終濃度，且自原液(0.5M，pH 6.5)添加緩衝劑(Hepes)至10 mM之最終濃度。
藉由溶解50 mg於10 mL去離子水中，製得鹽酸拓樸替康之原液。以針對表13中結果各調配物所指示的藥物/脂質比添加藥物至脂質體溶液。就TPT加載而言，加載前調整pH至pH 6.0。直接自購自藥房的市售USP注射溶液添加長春瑞濱，且加熱前用1N NaOH調整所得混合物之pH至6.5。藉由加熱脂質體/藥物混合物至60℃持續30分鐘引發藥物之加載。自水浴移除後藉由浸入冰冷的水中使該等溶液快速冷卻。藉由尺寸排除層析，使用以Hepes(10 mL)緩衝鹽水(HBS)(pH 6.5)平衡並洗脫之Sephadex G75管柱，移除脂質體外藥物。藉由HPLC分析樣品之伊立替康且藉由Bartlett法(參見磷酸酯測定)分析磷酸酯。
就儲存而言，將該等樣品分成4 mL等分試樣，且若需要則使用1N HC1或1N NaOH調整pH，在無菌條件下無菌過濾，並填充至無菌透明玻璃小瓶中，在氬氣下用Teflon®內襯螺紋蓋密封並置於4℃之恆溫控制冰箱中。在限定的時間點，自各樣品移取等分試樣並測試外觀、尺寸、藥物/脂質比、及藥物及脂質化學穩定性。藉由動態光散射，使用在90°角的Coulter奈米粒度儀測定經稀釋之樣品中之脂質體尺寸並表示為藉由累積量法獲得之平均值±標準偏差(nm)。
比較性穩定性研究之結果提供於表13中。
表 13
：
用 TEA8
SOS 捕獲劑製得之拓樸替康及長春瑞濱脂質體 (0.6N SOS 硫酸酯，以 2 mg/mL 藥物濃度儲存 ) | 樣品 | 藥物 | [克藥物]/總莫耳PL | pH | 時間(月) | 溶血PC莫耳%i | 尺寸±SD |
| 19 | TPT | 500i
| 6.5 | 0
1
3
6
9 | 0
12.2(±0.71)
25.0(±0.9)
25.9(±0.5)
29.0(±1.4) | 115.0±9.5
107.3±16.9
108.4±9.1
102.3±25.2
108.6±19.2 |
| 20 | TPT | 500j
| 7.25 | 0
1
3
6
9 | 0
10.0(±0.4)
19.0(±0.5)
23.3(±2.2)
29.4(±3.1) | 115.0±9.5
109.0±16.8
108.6±15.8
105.5±13.6
110.6±12.1 |
| 21 | VNB | 350
| 6.5 | 0
1
3
6
9 | 0
2.2(±1.1)
9.5(±1.2)
9.5 (±0.6) | 115.0±9.5
105.3±16.7
105.8±18.1
102.8±8.9
103.4±23.3 |
| 22 | VNB | 350
| 7.25 | 0
1
3
6
9 | 0
1.3(±0.1)
5.0 (±0.5)
5.5 (±2.6) | 115.0±9.5
105.3±16.7
105.8±18.1
102.8±8.9
103.4±23.2 |
| 23 | VNB | 450 | 6.5 | 0
1
3
6
9 | 0
0.3(±0.1)
3.1(±1.1)
3.4(±0.3) | 115.0±9.5
90.6±29.6
104.7±21.2
106.4±16.7
133.3±16.6 |
i
依如本文中所述之方法B測得。
j
500 g拓樸替康HCl/mol總磷脂
樣品19及20中未觀察到儲存介質pH對於加載拓樸替康之脂質體中溶血脂質之生成之影響。樣品19及20中之兩種調配物展現9個月後接近30莫耳%之溶血脂質，儘管樣品19係儲存在pH 6.5下及樣品20係儲存在pH 7.25下。
與兩種脂質體喜樹鹼對比，脂質體長春瑞濱抗脂質水解性更大，因為樣品21中測得的溶血脂質的量最大，9個月後，具有9.5莫耳%之溶血脂質。雖然不明顯，但亦可檢測到關於穩定比及儲存介質pH之相依性。更大的穩定比會導致脂質水解減少(樣品21與23相比較)。7.25之pH亦使得所觀察到脂質水解的量減小(樣品21與22相比較)。
實例 9
：用於測量溶血PC之HPLC法(「方法A」)
使用HPLC，藉由蒸發光散射檢測，獲得所測試伊立替康蔗糖八硫酸酯脂質體製劑中溶血PC的量，以得到圖11B及12中之數據。適宜的HPLC法(本文中稱為「方法A」)係用於測量藥品中硬脂酸、溶血PC、膽固醇及DSPC (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼)之量之定量法。使用甲醇-四氫呋喃溶液將該等脂質體解離成其個別脂質組分。使用配備蒸發光散射檢測器之逆相高壓液相層析量化該等脂質組分。
樣品及標準製法 標準製法： 溶血 PC
藉由用85:15甲醇-四氫呋喃稀釋適宜量之溶血PC至4、8、20、32及40 µg/mL之標靶最終濃度來製備五點標準曲線。
硬脂酸
藉由用85:15甲醇-四氫呋喃稀釋適宜量之硬脂酸至2、4、10、16及20.4 µg/mL之標靶最終濃度，來製備五點標準曲線。
膽固醇
藉由用85:15甲醇-四氫呋喃稀釋適宜量之膽固醇至90、144、183.7、224.9及266.6 µg/mL之標靶最終濃度，來製備五點標準曲線。
DSPC
藉由用85:15甲醇-四氫呋喃稀釋適宜量之DSPC至220、352、449、549.8及651.7 µg/mL之標靶最終濃度，來製備五點標準曲線。
分析對照
藉由在稀釋劑(85:15甲醇-四氫呋喃)中稀釋硬脂酸至9.0 µg/mL及18.0 µg/mL之標靶最終濃度，來製備分析對照。
樣品製法：
藉由在85:15甲醇-四氫呋喃溶液中稀釋各樣品至475 µg/mL之標靶最終DSPC濃度，製備樣品。
溶液穩定性
測試樣品標準及分析對照已展現當在環境溫度儲存時長達48小時之可接受之溶液穩定性。
儀器及儀器參數
適宜高壓層析系統配備有能夠視需要改變運行中增加及過濾設定以確保恰當峰檢測之蒸發光散射檢測器。儀器操作參數列於表14中。
表 14
：
層析條件 | 層析參數 | 層析條件及設定點 |
| 管柱 | Phenomenex Luna C8(2) 100 µm，150 mm x 3 mm，具有前導管柱Phenomenex C8 4x2.0 mm |
| 注入體積 | 20 µL |
| 管柱溫度 | 30℃ |
| 流速 | 1.0 mL/分鐘 |
| 流動相A | 100 mM乙酸銨 pH 4.0 |
| 流動相B | 甲醇 |
| ELSD設定 | 氣壓：3.5 bar
溫度：40℃ |
| 梯度 | 時間 ( 分鐘 ) | 流動相 A (%) | 流動相 A (%) |
| 0 | 15 | 85 |
| 3 | 8 | 92 |
| 6 | 0 | 100 |
| 9 | 0 | 100 |
| 9.1 | 15 | 85 |
| 12 | 15 | 85 |
表 15
：
系統適合性 | 參數 | 接受標準 |
| 洗脫譜 | 稀釋劑空白、工作標準及分析對照之層析圖譜係與測試法中所顯示之實例相當。 |
| 板 | 校正標準層級5(n=5次注射)中，DSPC及膽固醇之平均板≥2000 |
| 拖尾 | 校準標準層級5(n=5次注射)中，DSPC及膽固醇之平均拖尾≤1.5 |
| 信雜比 | 校準標準層級1中，溶血PC峰之信雜比≥10 |
| 精確度 | 校準標準層級5(n=5次注射)中溶血PC、硬脂酸、DSPC及膽固醇之RSD%≤6.0 |
| 直線性 | 就溶血PC、硬脂酸、DSPC及膽固醇標準校準曲線而言，R2
≥0.99。 |
| 精確度 | 就標準校準曲線內DSPC及膽固醇而言，回收率% = 90至110% |
| 精確度 | 就硬脂酸對照而言，回收率% = 80至120% |
藉由分析樣品峰面積與標準曲線，測定各脂質之濃度。二階多項式方程(二次曲線)趨勢線係用於計算溶血PC及硬脂酸之脂質濃度。線性趨勢線係用於計算DSPC及膽固醇之脂質濃度。
代表性層析圖呈現於圖13A及圖13B中。
本文中所引用的所有參考文獻之全文係以引用之方式併入本文中。
。
該脂質體伊立替康可包括囊封於脂質體中之式(I)之組合物。較佳地，式(I)之組合物係形成(例如沉澱)於包含膽固醇及一或多種磷脂(例如，包括含PEG磷脂)之脂質體中。例如，藉由使(1)喜樹鹼化合物(例如，伊立替康、拓樸替康及類似物)與(2)囊封聚硫酸化之陰離子捕獲劑(例如蔗糖八硫酸酯)之脂質體以形成穩定之脂質體伊立替康組合物之製程反應，式(I)之化合物可形成於脂質體中。較佳地，該脂質體伊立替康組合物具有大於6.5(例如，7.0至7.5，包括7.25、7.3及7.5)之pH。
較佳的穩定之喜樹鹼組合物包括脂質體伊立替康組合物，其包含囊封於包含膽固醇及磷脂1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(例如MPEG-2000-DSPE)之伊立替康脂質體中之伊立替康或其鹽(例如伊立替康蔗糖八硫酸酯)於等滲緩衝劑水溶液中，該脂質體伊立替康組合物在2至8℃儲存的前3個月後包含(或形成)小於10莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)，在2至8℃儲存的前6個月(或180天)後包含(或形成)小於20莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)，及/或在2至8℃儲存的前9個月後(例如，製造後穩定性測試的前9個月期間)包含(或形成)小於25莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)。
該等伊立替康脂質體較佳包含以3:2:0.015莫耳比的膽固醇、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(例如MPEG-2000-DSPE)，每毫莫耳總脂質體磷脂囊封500 mg(±10%)伊立替康。穩定之脂質體伊立替康組合物較佳包含每mL脂質體伊立替康組合物提供總計約4.3 mg伊立替康部分之伊立替康脂質體，其中至少約98%之伊立替康囊封於伊立替康脂質體(例如，呈伊立替康蔗糖八硫酸酯，諸如上述之式(I)化合物)中。某些較佳的脂質體組合物為儲存穩定之脂質體伊立替康組合物，其具有7.00至7.50(例如，7.0、7.25、7.3、7.5)之pH且包括囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯在由膽固醇及磷脂(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE))組成之單層狀雙層微脂粒中之伊立替康脂質體之分散液，其伊立替康部分的濃度等效於(以無水伊立替康游離鹼的g計)500 mg(±10%)伊立替康/mmol總脂質體磷脂及4.3 mg伊立替康/mL脂質體伊立替康組合物，該儲存穩定之脂質體伊立替康組合物經穩定以在4℃儲存的前6個月期間形成小於1 mg/mL之溶血PC。例如，某些較佳的醫藥脂質體伊立替康組合物包含於等滲緩衝劑水溶液中之囊封於以4.3 mg/mL伊立替康部分、6.81 mg/mL之1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、2.22 mg/mL之膽固醇及0.12 mg/mL之甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)之伊立替康脂質體中之伊立替康或其鹽(例如伊立替康蔗糖八硫酸酯)，該脂質體組合物在2至8℃儲存3個月後包含小於10莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)，在2至8℃儲存6個月(或180天)後包含小於20莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)，及/或在2至8℃儲存9個月後包含小於25莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)。
在一些實施例中，藉由一種包括以下之方法製備該脂質體組合物：使含伊立替康部分之溶液與囊封三乙基銨(TEA)之捕獲劑脂質體及濃度為0.4至0.5M(以硫酸根基團濃度計)之蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑(呈TEA8
SOS(較佳TEA8
SOS捕獲劑溶液))在可有效加載500 g(±10%)伊立替康部分/mol磷脂至含PL捕獲劑脂質體中且允許自該捕獲劑脂質體釋放TEA陽離子之條件下接觸，以形成伊立替康SOS脂質體，及(b)將該等伊立替康SOS脂質體與2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)組合以獲得具有7.25至7.50之pH之伊立替康脂質體組合物，得到經穩定以形成4℃儲存3個月期間小於10莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)(相對伊立替康脂質體組合物中磷脂醯膽鹼的總量計)之伊立替康脂質體組合物。
例如，本發明提供一種伊立替康脂質體組合物，其包含囊封伊立替康蔗糖八硫酸酯(SOS)於由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)、膽固醇及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE)組成之直徑為約110 nm的單層狀雙層微脂粒中之穩定之伊立替康脂質體，其中該等經穩定之伊立替康脂質體係藉由包括以下步驟之方法得到：(a)使伊立替康與囊封三乙基銨(TEA)陽離子之捕獲劑脂質體及濃度為0.4至0.5M(以硫酸酯基團濃度計)之蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑(呈TEA8
SOS)在可有效加載500 g(±10%)伊立替康部分/mol磷脂至捕獲劑脂質體中且允許自該捕獲劑脂質體釋放TEA陽離子之條件下接觸，以形成伊立替康SOS脂質體，及(b)將該等伊立替康SOS脂質體與2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)組合以獲得具有7.25至7.50之pH之伊立替康脂質體組合物，得到經穩定以在4℃儲存3個月期間形成小於10莫耳%之溶血磷脂醯膽鹼(溶血PC)(相對伊立替康脂質體組合物中磷脂醯膽鹼的總量計)之伊立替康脂質體組合物。
該等脂質體伊立替康組合物可用於治療診斷罹患各種形式之癌症之患者。例如，可於無需其他抗癌藥下投與脂質體伊立替康以治療小細胞肺癌(SCLC)。在一些實施例中，組合其他抗癌藥投與脂質體伊立替康組合物。例如，可投與脂質體伊立替康組合物、5-氟尿嘧啶及甲醯四氫葉酸(無其他抗癌藥下)以治療診斷罹患胰臟轉移性腺癌且基於吉西他濱(gemcitabine)之治療後疾病進展之患者。可投與脂質體伊立替康組合物、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸及奧沙利鉑(oxaliplatin)(無其他抗癌藥下)以治療診斷罹患先前未經治療之胰臟癌的患者。可投與脂質體伊立替康組合物、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸及EGFR抑制劑(例如，寡株抗體EGFR抑制劑，諸如MM-151)以治療診斷罹患結腸直腸癌的患者。
除非本說明書中另作敘述，否則脂質體組合物包含某一量之伊立替康，伊立替康的克數(呈游離鹼或鹽形式)對磷脂的莫耳數之比等效於由471 g或500 g(±10%)伊立替康游離鹼/mol磷脂所提供者的比。
如本文中所使用(且除非另作指明，否則)，「伊立替康部分」僅指伊立替康內酯；即，無水伊立替康內酯游離鹼。
如本文中所使用(且除非另作指明，否則)，術語「喜樹鹼」包括喜樹鹼及喜樹鹼衍生物，包括伊立替康、拓樸替康、勒托替康(lurtotecan)、西拉替康(silatecan)、聚二乙醇化伊他立替康(etirinotecan pegol)、TAS 103、9-胺基喜樹鹼、7-乙基喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、9-硝基喜樹鹼、10,11-亞甲基二氧基喜樹鹼、9-胺基-10,11-亞甲基二氧基喜樹鹼、9-氯-10,11-亞甲基二氧基喜樹鹼、(7-(4-甲基哌嗪并亞甲基)-10,11-亞乙基二氧基-20(S)-喜樹鹼、7-(4-甲基哌嗪并亞甲基)-10,11-亞甲基二氧基-20(S)-喜樹鹼及7-(2-N-異丙胺基)乙基)-(20S)-喜樹鹼及其立體異構體、鹽及酯。
如本文中所使用(且除非另作指明，否則)，「DLS」係指動態光散射及「BDP」係指原料藥產品。
在一些實施例中，本發明之脂質體係囊封一或多種捕獲醫藥品於脂質體中之藥物(後文稱為捕獲劑)。
如本說明書中所使用，「緩釋組合物」包括當每兩週一次以等效於70 mg/m2
伊立替康游離鹼之劑量投與給人時提供80至125%之以下藥物動力學參數之伊立替康組合物：Cmax 37.2 (8.8) µg伊立替康(呈無水游離鹼)/mL及AUC0-∞
1364 (1048) h∙μg伊立替康/mL(對於伊立替康而言)；或(對於SN-38而言)，Cmax 5.4 (3.4) µg SN-38(呈無水游離鹼)/mL；AUC0-∞
620 (329) h∙ng SN-38/mL。
除非另有指示，否則脂質體製劑可包括具有至少一個脂質雙層之(例如，球形或實質上球形)微脂粒，且可視情況包括多層及/或單層微脂粒、及囊封及/或不囊封醫藥活性化合物(例如喜樹鹼)及/或捕獲劑之微脂粒。例如，除非另有指示，否則包含喜樹鹼脂質體之醫藥脂質體製劑可視情況包括不包含喜樹鹼化合物之脂質體，包括單層及多層脂質體與喜樹鹼化合物及/或捕獲劑之混合物或不含喜樹鹼化合物及/或捕獲劑。
。實例
以下實例中描述若干伊立替康脂質體製劑之合成及表徵。除非實例中另有指示，否則該等伊立替康脂質體可藉由以下多步驟法獲得。本發明因此亦提供依照該子部分及實例中所述之製備方法製造伊立替康脂質體之方法及其變型及組合。
首先，將形成脂質體之脂質溶解於經加熱之乙醇中。該等脂質包含DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE。除非另有指示，否則DSPC、膽固醇及MPEG-2000-DSPE係以3:2:0.015莫耳比存在。使所得的乙醇-脂質組合物在可有效形成適當尺寸(例如80至120 nm或95至115 nm等)之含經取代之銨離子及聚陰離子捕獲劑(SOS)之基本上單層脂質體之條件下分散於含經取代之銨及聚陰離子之水性介質中。可例如藉由將乙醇性脂質溶液與含經取代之銨離子及聚陰離子之水溶液在高於脂質轉變溫度之溫度(例如60至70℃)下混合，且在壓力下透過一或多個具有限定孔徑(例如50 nm、80 nm、100 nm或200 nm)之塗佈顯影蝕刻(例如聚碳酸酯膜)膜過濾器擠出所得的脂質懸浮液(多層脂質體)，形成脂質體分散液。較佳地，該經取代之銨為質子化三乙胺(TEA)或二乙胺(DEA)且該聚陰離子為蔗糖八硫酸酯(SOS)， 較佳以化學計量比組合(例如TEA8
SOS)。可根據加載至脂質體之伊立替康的量來選擇TEA8
SOS之濃度(例如，以實質上或完全消除跨脂質體之濃度加載梯度，及/或提供含約1:8莫耳比的SOS及伊立替康之脂質體)。例如，為製備具有471 g或500 g伊立替康部分/mol磷脂之伊立替康SOS脂質體，所使用的TEA8
SOS較佳具有約0.4至0.5M之硫酸酯基(例如0.45M或0.475M之硫酸酯基、或0.45M或0.475M之SOS)之 濃度。接著，(例如，藉由凝膠過濾、透析或超過濾/透析過濾)移除所有或實質上所有未截留之TEA或SOS。
接著使所得捕獲劑脂質體(例如，囊封經取代之銨化合物，諸如TEA8
SOS或DEA8
SOS)與伊立替康溶液在可有效加載伊立替康至捕獲劑脂質體中之條件(即，允許伊立替康進入脂質體中，與TEA交換而留下脂質體之條件)下接觸。伊立替康加載溶液(例如，為15 mg/ml無水伊立替康-HCl，其可使用對應量之伊立替康-HCl三水合物製得)較佳包含滲透劑(例如5%葡萄糖)及6.5之pH(除非另外規定，否則本說明書中所提及的pH值係在室溫下測定)。藉由提高組合物的溫度高於脂質體脂質之轉變溫度(例如，至60至70℃)以加速經取代之銨化合物(例如TEA)及伊立替康之跨膜交換來促進藥物加載。在一些實施例中，脂質體中之伊立替康硫糖酯係呈膠凝或沉澱狀態。
藉由跨脂質體與經取代之銨化合物(例如TEA或DEA)交換加載伊立替康較佳係持續直到全部或實質上全部經取代之銨化合物(例如TEA) 自脂質體移除，藉此消除全部或實質上全部跨脂質體之濃度梯度。較佳地，伊立替康脂質體加載製程持續直到伊立替康與SOS之克-當量比為至少0.9、至少0.95、0.98、0.99、或1.0(或約0.9至1.0、0.95至1.0、0.98至1.0或0.99至1.0之範圍)。較佳地，伊立替康脂質體加載製程持續直到至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或更多之TEA自脂質體內部移除。在本發明之一些實施例中，依此方式使用TEA8
SOS製得的伊立替康SOS脂質體組合物包含小於100 ppm之TEA。在本發明之一些實施例中，依此方式使用TEA8
SOS製得的伊立替康SOS脂質體組合物包含20至100 ppm、20至80 ppm、40至80 ppm或40至100 ppm之TEA。
可移除脂質體外伊立替康及經取代之銨化合物(例如TEA或DEA)以獲得最終伊立替康脂質體產品。可藉由多種方法，其非限制性實例包括凝膠(尺寸排除)層析、透析、離子交換、及超過濾/透析過濾方法，來促進此移除。脂質體外部介質改由可注射之醫藥上可接受之流體，例如緩衝(pH在7.1至7.5之間，較佳地，pH在7.2與7.3之間)等滲鹽水更換。最終，脂質體組合物係例如藉由0.2微米過濾滅菌，分配至單劑量小瓶中，貼標籤並儲存(例如，在 2至8℃冷凍) 直至使用。在移除殘餘的脂質體外伊立替康及銨/經取代之銨離子(例如TEA)的同時，脂質體外部介質可改由醫藥上可接受之流體更換。捕獲劑之量化
出於本發明之目的，基於用於製備脂質體之濃度量化脂質體捕獲劑及經取代之銨化合物抗衡離子(例如TEA8
SOS)並基於捕獲劑之硫酸酯基數進行計算。例如，本文中0.1M TEA8
SOS將表示為0.8 M/L硫酸酯，因為每個SOS分子具有八個硫酸酯基。在使用不同捕獲劑之情況中，將調整此計算，端視每個捕獲劑分子中陰離子基團(例如硫酸酯基)的數量。伊立替康脂質體製劑中溶血 PC 之量化
藉由述於實例9中之HPLC法(「方法A」)獲得所測試伊立替康蔗糖八硫酸酯脂質體製劑中溶血PC的量，可得到圖11B及12中之數據。
使用不同的製備型(TLC)方法(本文中，「方法B」)，獲得本文中樣品1至23之溶血PC測量值，藉由以下TLC法接著磷酸鹽分析，而非緊接上文論述的HPLC法(方法A)，測定溶血磷脂。藉由方法B依以下步驟測量溶血PC。使用以水配衡之PD-10管柱(GE Healthcare)，將含約500 nmol磷脂(PL)之脂質體樣品之一個等分試樣(例如0.05 mL之10 mM PL脂質體溶液)脫鹽。用水自該管柱洗脫樣品且分成三個各含約150 nmol PL之部分，接著使用離心式濃縮機(Savant Speed Vac濃縮機，型號SVC100X)在真空下乾燥。將經乾燥之脂質溶解於30 μl氯仿/甲醇(5/1，vol/vol)中且使用玻璃針筒施覆至正相矽膠TLC板(Uniplate by Analtech，目錄號44921)之非吸附區。用由氯仿/甲醇/30%氫氧化銨/水(60/40/2.5/3.75，v/v/v/v)組成之流動相運行TLC且使用碘蒸氣使脂質可視化。藉由刮除TLC上對應於磷脂及溶血磷脂之斑點至個別12 × 75 mm矽酸硼管中進行PL之測定以用於後續磷酸鹽分析。
實例中提供經脂質體共囊封之伊立替康及硫酸酯化合物之莫耳量之量化。材料
為了製備實例1中之樣品1至5及13及實例2中之樣品12及樣品14至18，USP GMP級鹽酸伊立替康((+)-7-乙基-10-羥基喜樹鹼10-[1,4'-二哌啶]-1'-羧酸酯，單鹽酸鹽，三水合物，CAS註冊號100286-90-6)係購自SinoPharm(台灣台北市)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇(MW-2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺((MPEG-2000-DSPE)係購自Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)；超純膽固醇(Chol)係從Calbiochem(La Jolla, CA, USA)獲得；及蔗糖八硫酸酯係從Euticals(Lodi, Italy)獲得。
為了製備實例1中之樣品6至11，鹽酸伊立替康三水合物係從PharmaEngine(台灣)獲得；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC)及甲氧基封端之聚乙二醇(MW-2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺((MPEG-2000-DSPE)係購自Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)；超純膽固醇(Chol)係從Calbiochem(La Jolla, CA, USA)獲得；及蔗糖八硫酸酯係從Euticals(Lodi, Italy)獲得。
為了製備實例8中之樣品19至23，長春瑞濱(Vinorelbine)(VNB)係從藥房呈酒石酸長春瑞濱溶液10 mg/mL(Glaxo-SmithKline)獲得，及拓樸替康(TPT)粉末係從Taiwan Liposome Company(台灣台北市)作為禮物獲得。
所有其他具分析或更佳純度之化學品係從常見的供應商獲得。
方法：在下文未另外指示之程度上，以下方法係用於製備樣品1至5及13(實例1)及樣品6至11及19至23(實例2)、及樣品12、及14至18(實例3)。三乙基銨蔗糖八硫酸酯之製備
使用離子交換層析，自蔗糖八硫酸酯之鈉鹽製得蔗糖八硫酸酯三乙基銨(TEA8
SOS)及蔗糖八硫酸酯二乙基銨(DEA8
SOS)。簡言之，將15 g蔗糖八硫酸酯(鈉鹽)溶解於水中以得到2.64M之硫酸酯濃度。利用Dowex 50W-8X-200陽離子交換樹脂以製得蔗糖八硫酸酯之酸性形式。用2體積的1N NaOH洗滌所界定的樹脂兩次，接著用ddH2
O(二次蒸餾水)洗滌至中性pH，用2體積的1N HCl洗滌兩次，及最終用ddH2
O洗滌至中性且接著重複。將450 mL體積之樹脂倒至管柱且用3體積的3N HCl洗滌，且接著用ddH2
O沖洗直到導電率達到小於1 μS/cm。將蔗糖八硫酸酯(鈉鹽)溶液(約10%之管柱容量)加載於管柱上並用ddH2
O洗脫。使用導電率檢測器監測管柱洗脫物以檢測蔗糖八硫酸酯自管柱之洗脫。接著用三乙胺或二乙胺滴定酸性蔗糖八硫酸酯至介於6至7之間之pH且使用自B. Sorbo等人, Methods in Enzymology, 143:3-6, 1984改良之方法(參見硫酸鹽測定)測定硫酸酯含量。最後，將該溶液稀釋至對應於0.65M硫酸酯之硫酸酯濃度。pH通常在6至7範圍內。使用鈉電極測定殘餘的鈉，及不進一步使用殘餘鈉超過1莫耳%之任何溶液。硫酸酯基之測定
以基於比濁分析之檢定測定蔗糖八硫酸酯溶液中之硫酸酯含量。溶液由以下組成：(1)含在100 mL水中之15 g PEG 6000及1.02 g乙酸鋇；(2)含在1 mL水中之142 mg硫酸鈉；(3)鋇工作溶液：攪拌下將0.1 mL硫酸鈉溶液逐滴添加至100 mL鋇溶液。該溶液應於使用前平衡1小時且可儲存不超過一週；(4)0.4M檸檬酸三鈉溶液；(118 mg檸檬酸三鈉/mL水)；及(5) 自1N硫酸以10 mM稀釋於水中之硫酸酯標準品。使用硼矽酸酯試管，使標準品及溶液達成100 μl之最終體積。使標準品在0.2至1 μmol硫酸酯(20至100 μl 10 mM標準品)之範圍內。就0.6M硫酸酯溶液之樣品而言，使用1/100之稀釋及100 μl(0.6 μmol)之體積。用100 μl 70%高氯酸處理各100 μl樣品/標準品並在110至120℃加熱12分鐘。冷卻後，添加0.8 mL 0.4M檸檬酸三鈉溶液，接著渦轉。從攪拌鋇工作溶液取0.25 mL體積轉移至各管並立刻渦轉。允許所有樣品/標準品平衡1小時，接著渦轉並在600 nm下測量吸光度。使用SO4
濃度對OD600之線性標準曲線以測定未知的SO4
濃度。藉由 HPLC 之蔗糖八硫酸酯測定
可基於由已知濃度之標準品產生之蔗糖八硫酸酯峰的面積，計算得樣品中蔗糖八硫酸酯之濃度(mg/mL)。接著使用所計算得的蔗糖八硫酸酯之濃度以計算樣品中硫酸酯之濃度(mM)。
藉由HPLC，使用Phenomenex, Bondclone 10 μ NH2
，300 x 3.90 mm，PN 00H-3128-C0、或Waters μBondapak NH2
10 μm 125 Å(3.9 mm x 300 mm)(零件號WAT084040)，使用0.60M硫酸銨之移動相，pH 3.0，以1.00 mL/min在40℃之管柱溫度下洗脫，來層析待分析的樣品。亦在40℃下，藉由折射率檢測器，例如，使用具有折射率檢測器之Agilent HPLC檢測樣品。使用USP蔗糖八硫酸鉀七水合物作為參考標準；CAS 76578-81-9，目錄號1551150。
使用基線至基線積分法對SOS檢定標準及檢定對照樣品積分。接著，使用基線至基線積分法對該等TEA-SOS樣品積分。可手動進行此：在空隙體積谷前開始基線至SOS尾端結束，接著在TEA峰開始處及兩個峰之間的低點引一條線。備註：若在空隙體積谷前開始至SOS尾端結束之單一基線跨TEA峰與SOS峰之間的低點，則可使用兩條單獨線，其將近似基線至基線法。TEA-SOS樣品將顯示對SOS峰之滯留時間約0.45之相對滯留時間之TEA峰。藥物分析
在Dionex系統上，使用Supelco C18
前導管柱在前的C18
逆相二氧化矽管柱(Supelco C18
管柱，250 mm x 4 mm內徑，粒度為5 µm)，進行伊立替康之HPLC分析。使用50 µl之樣品注入體積，且用由0.21M乙酸三乙基銨水溶液pH 5.5及乙腈(73:27，v:v)組成之流動相以1.0 mL/min之流速等濃度洗脫管柱。通常，伊立替康及SN-38分別在5.1 min及7.7 min內洗脫。使用二極體陣列檢測器，藉由375 nm下之吸光度，檢測伊立替康，且藉由螢光(370 nm激發及535 nm發射)檢測SN-38。磷酸酯測定
使用以下磷酸酯測定法以分析樣品1至23。經改良之Bartlett磷酸酯檢定可用於測量磷脂(PL)。將在10至40 nmol範圍之磷酸酯之標準品置於12 × 75 mm硼矽酸酯管中且確切地如該等樣品進行處理。將硫酸(100 μl 6M H2
SO4
)添加至置於加熱塊中之各管且加熱至180℃持續45分鐘。添加過氧化氫(20 μl 30%溶液)至各管且接著在150℃加熱30分鐘。隨後，添加鉬酸銨(0.95 mL 2.2 g/l溶液)及抗壞血酸(50 μl 10%水溶液)至各管。渦轉後，在沸水中將該等管顯影15分鐘且接著使其冷卻至室溫。就使用薄層層析(TLC)之溶血脂質分析而言，藉由以1000 rpm離心5分鐘使二氧化矽粒化，且藉由讀取823 nm下之吸光度測量上清液中之藍色。不含二氧化矽之樣品可省去該離心步驟。藥物滯留及穩定性
藉由使用PD-10(Sephadex G-25)尺寸排除管柱，從脂質體外伊立替康分離脂質體伊立替康，來測定脂質體伊立替康穩定性(在藥物滯留方面)。藉由比較分離脂質體外伊立替康之前及之後之伊立替康(HPLC)與PL(述於磷脂測定中)比，來確定藥物洩露。藉由在HPLC分析後觀察層析圖中之其他峰來判定伊立替康之降解。分別使用以下公式1及2計算得伊立替康與磷脂比及藥物囊封效率。
(1) 伊立替康與磷脂比(g伊立替康/mol PL) =[ 伊立替康 ] (mg/mL) *1000
[磷脂] (mM)
(2) 囊封效率(%) =( 伊立替康與磷脂比 )AC
(伊立替康與磷脂比)BC
其中(伊立替康與磷脂比)AC為於G-25尺寸排除管柱上純化後之藥物與磷脂比及(伊立替康與磷脂比)BC為於管柱上純化前之藥物與磷脂比。脂質體組合物中所囊封及游離伊立替康之測定
使用濾筒吸附法測定實例3及4之伊立替康硫糖酯脂質體組合物中之經脂質體囊封及游離(非囊封)伊立替康。藉由連續通入2 mL甲醇、1 mL HEPES緩衝鹽水(HBS；5 mM HEPES、140 mM NaCl，pH 6.5)及0.5 mL含在生理鹽水中之10%人血清白蛋白，接著通入1 mL HBS，來處理Oasis 60 mg 3 cc HLB濾筒(Waters)。用生理鹽水將脂質體伊立替康硫糖酯組合物稀釋至約2.2 mg/mL伊立替康，且施加0.5 mL等分試樣於濾筒上。收集洗脫物，用兩份HBS(1.5 mL，3 mL)沖洗濾筒，且將沖洗液與該洗脫物組合以製得脂質體溶離份。另用1.5 mL HBS沖洗濾筒且用兩份3 mL甲醇-HCl(90體積%甲醇，10體積% 18 mM HCl)洗脫。將洗脫物組合以得到游離藥物溶離份。將脂質體藥物溶離份轉移至25 mL量瓶中，且將游離藥物溶離份轉移至10 mL量瓶中，用甲醇-HCl達到刻度，充分混合，並在60℃加熱該等脂質體溶離份量瓶10分鐘以溶解藥物。冷卻後，過濾該等溶液，且使用逆相HPLC，於Phenomenex Luna C18(2)管柱上，經20 mM磷酸鉀(pH 3.0)甲醇混合物(60:40，以體積計)等濃度洗脫，藉由254 nm下UV檢測，量化兩個溶離份中之伊立替康。對藥物峰進行積分，且藉由與相同條件下使用鹽酸伊立替康三水合物USP參考標準得到的線性標準曲線比較，計算得樣品中伊立替康的量。藥物囊封率係經計算為囊封藥物相對於樣品中游離及囊封藥物總體之百分率。pH 測量
始終地在環境溫度(即，20至25℃)下使用電位滴定標準玻璃電極法測量pH。因此，藉由將玻璃電極放入脂質體調配物中且獲得pH讀數，來測量脂質體調配物之pH。樣品之 TEA/DEA ppm 之分析
藉由頂部空間氣相層析(GC)分離，利用毛細管GC管柱(50 m x 0.32 mm x 5 μm Restek Rtx-5(5%苯基-95%二甲基聚矽氧烷))上之梯度溫度洗脫，接著，火焰離子化檢測(FID)，來進行樣品之分析。分析樣品製劑及標準製劑，且將所得的峰面積反應進行比較。使用外標準量化殘餘胺(例如，TEA或二乙胺(DEA))的量。就TEA而言，該標準係≥ 99%。其他試劑包括三乙二醇(TEG)、氫氧化鈉及去離子(DI)水。
GC條件為：載氣：氦；管柱流速：20 cm/s(1.24 mL/min)；分流比：10:1(其可加以調整，只要滿足所有系統合適性標準即可)；注入模式：10:1分流；內襯：2 mm的直槽(推薦但並非必須)；注入口溫度：140℃，檢測器溫度：260℃(FID)；初始管柱烘箱溫度：40℃；管柱烘箱溫度程式：
速率(℃/min) 溫度(℃) 保持時間(min)
n/a 40 0 0
2 100 0
20 240 17
54 min的運行時間。
頂部空間參數：盤溫度：90℃；樣品環溫度：100℃；傳輸線溫度：100℃；平衡時間：60分鐘；注入時間：1分鐘；小瓶壓力：10 psi；加壓時間：0.2分鐘；振盪：開(中等)；注入體積：1.0 mL頂部空間；GC週期時間：60分鐘(推薦但並非必須)。
若未檢測到TEA，則報告為「未檢測到」；若TEA結果為＜ 30 ppm，則報告為＜ QL (30 ppm)；若TEA結果為≥ 30 ppm，則報告全數。脂質體尺寸之測定
利用動態光散射(DLS)，使用Malvern ZetaSizer Nano ZSTM
或類似的儀器，在緩衝劑水溶液(例如，10 mM NaCl，pH 6.7)中，於23至25℃下，使用累積量法，測定脂質體粒度。記錄z-平均粒度及多分散性指數(PDI)。使用100 nm聚合物之奈米球NIST可追溯標準品(Thermo Scientific 3000系列奈米球尺寸標準品P/N 3100A、或具有包括流體動力學直徑之分析憑證之等效物)驗證儀器性能。如本文中所使用，「DLS」係指動態光散射及「BDP」係指原料藥。實例 1
：SOS 捕獲劑濃度及 pH 對於脂質體伊立替康製劑儲存穩定性之影響
該研究的目標尤其係測定囊封伊立替康及蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑之脂質體當在約4℃下儲存特定時間段時之物理及化學穩定性之任何變化。就該研究而言，減小SOS捕獲劑之脂質體濃度，同時維持471 g伊立替康部分/總磷脂莫耳數之比。
依多步驟法，使用不同濃度之SOS捕獲劑，且調整最終脂質體製劑之pH至不同pH值，製得一系列伊立替康SOS脂質體製劑。各伊立替康SOS脂質體製劑包含等效於5 mg/mL鹽酸伊立替康三水合物之伊立替康部分濃度。藉由實例1之多步驟法製得樣品1至5及13之伊立替康SOS脂質體製劑。
分別稱出對應於3:2:0.015莫耳比之量(例如，1264 mg/412.5 mg/22.44 mg)的DSPC、膽固醇(Chol)及PEG-DSPE。將脂質溶解於氯仿/甲醇(4/1，v/v)中，徹底混合，並分為4個等分試樣(A至D)。使用旋轉蒸發器在60℃下將各樣品蒸發至乾燥。藉由室溫下置於真空(180微托)12小時自脂質移除殘餘氯仿。在60℃下將經乾燥之脂質溶解於乙醇中，且添加適宜濃度之經預先加熱的TEA8
SOS使得最終醇含量為10%(v/v)。脂質濃度為約75 mM。在約65℃下使用Lipex熱桶擠出機(Northern Lipids, Canada)透過2個堆疊之0.1 µm聚碳酸酯膜(Nuclepore™) 10次擠出脂質分散液，以產生具有95至115 nm之典型平均直徑(藉由準彈性光散射測定；參見子部分「脂質體尺寸之測定」)之脂質體。視需要調整擠出型脂質體之pH以校正擠出期間pH之變化。藉由離子交換層析及尺寸排除層析之組合來純化該等脂質體。首先，用1N NaOH處理Dowex™ IRA 910樹脂，接著用去離子水洗滌3次，且然後接著用3N HCI洗滌3次，之後用水洗滌多次。使脂質體通過所製得的樹脂，且藉由使用流式細胞電導計(Pharmacia, Uppsala, Sweden)測定洗脫溶離份之導電率。若導電率小於15 µS/cm，則認為該等溶離份可接受用於進一步純化。接著將脂質體洗脫物施加至以去離子水平衡之Sephadex G-75(Pharmacia)管柱，且測定所收集脂質體溶離份之導電率(通常小於1 µS/cm)。藉由添加40%葡萄糖溶液至5%(w/w)之最終濃度，且自原液(0.5M，pH 6.5)添加緩衝劑(Hepes)至10 mM之最終濃度，來實現跨膜等滲壓。
考慮到自各批次分析之憑證獲得之水含量及雜質水平，藉由將伊立替康•HCl三水合物粉末溶解於去離子水中形成15 mg/mL無水伊立替康-HCl，來製備伊立替康原液。藉由添加500 g無水伊立替康HCl(等效於471 g無水伊立替康游離鹼)/mol脂質體磷脂的量之伊立替康並在熱水浴中加熱至60 ± 0.1℃持續30分鐘引發藥物之加載。自水浴移除後，藉由浸入冰冷的水中使該等溶液快速冷卻。藉由尺寸排除層析，使用以Hepes緩衝鹽水(10 mM Hepes，145 mM NaCl，pH 6.5)平衡並洗脫之Sephadex G75管柱，移除脂質體外藥物。藉由HPLC分析樣品之伊立替康且藉由Bartlett法(參見子部分「磷酸酯測定」)分析磷酸酯。就儲存而言，將該等樣品分成4 mL等分試樣，且使用1N HCl或1N NaOH調整pH，在無菌條件下無菌過濾，並填充至無菌透明玻璃小瓶中，在氬氣下用Teflon®內襯螺紋蓋密封並置於4℃之恆溫控制冰箱中。在限定的時間點，自各樣品移取一等分試樣並測試外觀、脂質體尺寸、藥物/脂質比、及藥物及脂質化學穩定性。
就實例1而言，藉由動態光散射，使用Coulter奈米粒度儀在90°角測定經稀釋之樣品中之脂質體尺寸分佈並表示為可藉由累積量法獲得之平均值±標準偏差(nm)。
如下進一步獲得樣品1至5及13之伊立替康脂質體製劑。新擠出的脂質體包含兩組，各組併入以(A) 0.45M硫酸酯基(112.0±16 nm)、(B) 0.475M硫酸酯基(105.0±16 nm)、(C) 0.5M硫酸酯基(97±30 nm)、及(D) 0.6M硫酸酯基(113±10nm)之濃度之TEA8
SOS作為捕獲劑。樣品1至5及13係以471 g無水伊立替康游離鹼/mol總脂質體磷脂之初始比加載並如上文在實例1之說明中所述純化(等效於500 g無水伊立替康HCl)。樣品1、5及13係衍生自擠出型樣品(A)；樣品2係來自擠出型樣品(B)；樣品3及4係分別來自擠出型樣品(C)及(D)。純化後，在滅菌及填充小瓶前使用1N HCl或1 N NaOH進行pH調整。樣品1至5之數據顯示於表7(實例1)中，及樣品13之數據顯示於表8(實例2)中。
如下進一步獲得樣品6至11之伊立替康脂質體製劑。新擠出的脂質體包含兩組，各組併入以(A) 0.45M硫酸酯基(116±10 nm)及(B) 0.6M硫酸酯基(115.0±9.0 nm)之濃度之TEA8
SOS作為捕獲劑。樣品6至8係源自擠出型樣品(A)，及樣品9至11係源自擠出型樣品(B)。純化後，若需要則藉由適宜地添加1N HCl或1N NaOH來進行pH調整。如實例2中所述製得樣品12且出於比較之目的而包含於表7中。
特定伊立替康脂質體組合物之具有脂質體外pH值、伊立替康游離鹼濃度(mg/mL)及不同濃度之蔗糖八硫酸酯之伊立替康脂質體列於下表6(在4℃儲存6個月)及表7中，且如本文所述更詳細地所提供般進行製備。
圖4A至4C為顯示選自表7之具有大於6.5(即7.25或7.5，如各圖中所指示)之pH之伊立替康脂質體製劑中溶血PC之莫耳%之曲線圖。在各樣品於4℃儲存的前1個月、3個月、6個月及/或9個月後，以本文中所揭示的方法B(TLC)測定溶血PC。該等曲線圖包括對各樣品之數據之線性回歸線，作為各樣品中溶血PC隨時間之增加速率(莫耳%)之評估。驚人地，增加伊立替康脂質體製劑之pH超過6.5(例如，7.25及7.5)，在4℃冷凍儲存期間測得的溶血PC的量相比以相當穩定比形成之伊立替康脂質體減少。此趨勢在不同濃度之脂質體伊立替康下明顯。例如，就以約4.3 mg伊立替康部分/mL之強度製得的脂質體伊立替康組合物而言，樣品5及7中測得之溶血PC莫耳%水平在所有數據點(製造後在4℃儲存的前1個月、6個月及9個月後)相比在pH 6.5下之樣品1測得之溶血PC莫耳%水平(表7中之數據)明顯減小。類似地，就以約18.8 mg伊立替康部分/mL之強度製得的脂質體伊立替康組合物而言，樣品13中測得的溶血PC莫耳%水平在所有數據點(製造後在4℃儲存的前1個月及9個月後)相比在pH 6.5下之樣品12或樣品14中任一樣品測得的溶血PC莫耳%水平(表8中之數據)明顯更低。表 6
：冷凍儲存 6 個月後溶血 PC 測量值 
。
ONIVYDE®產品係呈無菌白色至淺黃色之不透光等滲脂質體分散液形式提供。每一10 mL單劑量小瓶裝納43 mg伊立替康游離鹼當量，濃度為4.3 mg/mL無水伊立替康游離鹼/mL(即，4.3 mg伊立替康部分/mL)。該脂質體為直徑約110 nm之單層狀脂質雙層微脂粒，其囊封含呈膠凝或沉澱狀態作為蔗糖八硫酸酯鹽之伊立替康之水空間。該微脂粒係由1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷膽鹼(DSPC) 6.81 mg/mL、膽固醇2.22 mg/mL及甲氧基封端之聚乙二醇(MW 2000)-二硬脂醯基磷脂醯基乙醇胺(MPEG-2000-DSPE) 0.12 mg/mL組成。每mL亦包含作為緩衝液之4.05 mg/mL之2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)及作為等滲性試劑之8.42 mg/mL之氯化鈉。
伊立替康脂質體注射液為囊封於脂質雙層微脂粒或脂質體中之拓樸異構酶1抑制劑。拓樸異構酶1藉由引起單股斷裂解開DNA中之扭轉應變。伊立替康及其活性代謝產物SN-38可逆地結合至拓樸異構酶1-DNA複合物且防止單股斷裂之再接合，從而導致暴露時間依賴性雙股DNA損傷及細胞死亡。在具有人類腫瘤異種移植之小鼠中，以相比伊立替康HCl低5倍的伊立替康HCl當量劑量投與之伊立替康脂質體實現SN-38之類似腫瘤內暴露。
使用群體藥物動力學分析評估罹患癌症之患者之總伊立替康及總SN-38之血漿藥物動力學，該患者以介於50 mg/m2
與155 mg/m2
之間之劑量接受作為單藥或作為組合化療之一部分之ONIVYDE®產品，及353位罹患癌症之患者。
下文呈現以70 mg/m2
作為單藥或組合化療之一部分投與ONIVYDE®產品後總伊立替康及總SN-38之藥物動力學參數。
表12：平均值 (± 標準偏差 ) 總伊立替康及總 SN-38 之匯總 
Cmax
：最大血漿濃度
AUC0-∞
：外推至無窮大時間之血漿濃度曲線下面積
t1/2
：最終之排除半衰期(Terminal elimination half-life)
CL：清除率
Vd
：分佈體積
在50 mg/m2
至155 mg/m2
之劑量範圍內，總伊立替康之Cmax及AUC係隨劑量增加。另外，總SN-38之Cmax係隨劑量成比例增加；然而，總SN-38之AUC隨劑量低於按比例增加。
伊立替康脂質體之直接測量值顯示伊立替康之95%保持脂質體囊封狀，且總體與囊封形式之間的比不隨時間自給藥後0至169.5小時變化。
ONIVYDE®產品應儲存在2℃至8℃(36℉至46℉)，應保護免遭光影響，且不應為冷凍的。
關於長期穩定性置放多個ONIVYDE®產品製劑且在2至8℃(冷凍條件)儲存12至36個月的時間進行分析。結果以圖9、10、11A及11B之圖形式作曲線，如下文所述。在一個研究中，測量12個ONIVYDE®產品製劑經12至36個月的粒度(圖9)及粒度分佈(圖10)。PDI維持甚低於0.1，及所有樣品係低於約0.05。在另一研究中，測定13個不同ONIVYDE®產品製劑經12至36個月之pH(圖11A)。在研究期間，所有樣品之pH維持大於6.8。在另一研究中，測量16個不同ONIVYDE®產品製劑冷凍儲存期間經12個月之溶血PC的量(圖11B)。所有樣品之溶血PC的量維持低於1 mg/mL。
出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例中之伊立替康游離鹼濃度之目的，如「實例」部分中所提供量化伊立替康游離鹼。出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例之脂質組成之目的，使用標準HPLC法(係相關技術中之標準)量化脂質。
出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例之脂質體之平均粒度(D)及多分散性指數(PDI)之目的，將DLS法與Malvern ZetaSizer Nano ZSTM
結合使用。
出於在不同儲存時間點測定ONIVYDE®產品實施例中溶血PC之存在之目的，如「實例」部分中所述量化溶血PC。另外，本發明內文中亦設想可如說明書中所述藉由HPLC量化溶血PC。實例 8
：拓樸替康及長春瑞濱脂質體
該儲存穩定性研究之目標係測定當在4℃儲存時用蔗糖八硫酸酯捕獲劑製得的拓樸替康(TPT)脂質體及長春瑞濱(VNB)脂質體之物理及化學穩定性之任何變化。具體而言，該研究檢查脂質體製造期間蔗糖八硫酸酯(SOS)捕獲劑濃度從0.6M減小至0.45M硫酸酯基，同時維持如下指示之每mol磷脂拓樸替康或長春瑞濱與磷脂比，是否將對於存於脂質體樣品中之溶血PC的量具有影響。類似地，檢查pH從6.5增加至7.5之影響，以測定此種pH之增加是否會減少脂質體組合物中溶血PC之存在。TPT及VNB係用SOS捕獲劑囊封於含3:2:0.015莫耳比的DSPC、膽固醇(Chol)及PEG-DSPE之脂質體中。所研究的調配物參數包括：溶液pH(6.5至7.5)、脂質體製備期間蔗糖八硫酸酯捕獲劑之濃度(0.45至0.6M硫酸酯)、所囊封的藥物(TPT或VNB)、及藥物與脂質比(脂質體加載期間， 500 g TPT HCl/mol磷脂；就VNB而言，脂質體加載期間350至450 g VNB部分/mol磷脂)。該穩定性研究期間提及的脂質體之各種物理化學性質為：脂質體尺寸、藥物與磷脂比、藥物囊封效率、一般外觀及溶血脂質之形成。
分別稱出對應於3:2:0.015莫耳比的量(790.15 mg/257.8 mg/14.0 mg)之DSPC、膽固醇(Chol)及PEG-DSPE。將脂質溶解於氯仿/甲醇(4/1，v/v)中，徹底混合，並分為2個等分試樣(A及B)。使用旋轉蒸發器在60℃下將各樣品蒸發至乾燥。藉由室溫下置於真空(180微托)12小時自脂質移除殘餘氯仿。在60℃下將經乾燥之脂質溶解於乙醇中，且添加適宜濃度之經預先加熱的TEA8
SOS以使最終醇含量為10%(v/v)。總磷脂濃度為約75 mM。透過0.1 µm聚碳酸酯膜(Nuclepore™)擠出該脂質溶液10次，以產生具有95至115 nm之典型平均直徑之脂質體。若需要，則視需要(用1N NaOH)調整擠出型脂質體之pH至pH 6.5。藉由離子交換層析及尺寸排除層析之組合來純化該等脂質體。首先，用1N NaOH處理Dowex™ IRA 910樹脂，接著，用去離子水洗滌3次，且然後接著用3N HCI洗滌3次，之後用水洗滌多次。藉由使用流式細胞電導計(Pharmacia, Uppsala, Sweden)測定洗脫溶離份之導電率。若導電率小於15 µS/cm，則認為該等溶離份可接受用於進一步純化。接著將脂質體洗脫物施加至以去離子水平衡之Sephadex G-75 (Pharmacia)管柱，且測定所收集脂質體溶離份之導電率(通常小於1 µS/cm)。添加40%葡萄糖溶液以達到5%(w/w)之最終濃度，且自原液(0.5M，pH 6.5)添加緩衝劑(Hepes)至10 mM之最終濃度。
藉由溶解50 mg於10 mL去離子水中，製得鹽酸拓樸替康之原液。以針對表13中結果各調配物所指示的藥物/脂質比添加藥物至脂質體溶液。就TPT加載而言，加載前調整pH至pH 6.0。直接自購自藥房的市售USP注射溶液添加長春瑞濱，且加熱前用1N NaOH調整所得混合物之pH至6.5。藉由加熱脂質體/藥物混合物至60℃持續30分鐘引發藥物之加載。自水浴移除後藉由浸入冰冷的水中使該等溶液快速冷卻。藉由尺寸排除層析，使用以Hepes(10 mL)緩衝鹽水(HBS)(pH 6.5)平衡並洗脫之Sephadex G75管柱，移除脂質體外藥物。藉由HPLC分析樣品之伊立替康且藉由Bartlett法(參見磷酸酯測定)分析磷酸酯。
就儲存而言，將該等樣品分成4 mL等分試樣，且若需要則使用1N HC1或1N NaOH調整pH，在無菌條件下無菌過濾，並填充至無菌透明玻璃小瓶中，在氬氣下用Teflon®內襯螺紋蓋密封並置於4℃之恆溫控制冰箱中。在限定的時間點，自各樣品移取等分試樣並測試外觀、尺寸、藥物/脂質比、及藥物及脂質化學穩定性。藉由動態光散射，使用在90°角的Coulter奈米粒度儀測定經稀釋之樣品中之脂質體尺寸並表示為藉由累積量法獲得之平均值±標準偏差(nm)。
比較性穩定性研究之結果提供於表13中。表 13
：用 TEA8
SOS 捕獲劑製得之拓樸替康及長春瑞濱脂質體 (0.6N SOS 硫酸酯，以 2 mg/mL 藥物濃度儲存 ) 