TW202237069A - 用於遞送具經改良的治療指數之抗癌藥劑之組合物與方法 - Google Patents

用於遞送具經改良的治療指數之抗癌藥劑之組合物與方法 Download PDF

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Abstract

本文揭示脂質體醫藥組合物，其可遞送兩種或更多種蛋白激酶抑制劑以便以協同模式發揮用於治療癌症之功能。囊封於脂質體載劑中的該等蛋白激酶抑制劑之組合適用於實現所需藥物滯留、每一治療性化合物之持續藥物釋放概況及協同治療作用。本發明亦揭示用於製備此等脂質體醫藥組合物之方法及此等脂質體醫藥組合物用於治療癌症之用途。

Description

用於遞送具經改良的治療指數之抗癌藥劑之組合物與方法
本揭示內容係關於經由將組合之活性醫藥成分(API)囊封於脂質體之雙層及/或水性核心隔室中而改良癌症治療的醫藥調配物及方法。
在過去二十年間，蛋白激酶酶家族由於其在一系列細胞活動之訊號轉導及調節中之關鍵作用而已成為治療各種類型之人類疾病的最重要藥物目標中之一者。超過六十種小分子蛋白激酶抑制劑已由美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration；FDA)批准作為治療劑，其靶向在藥物動力學特性、成本、患者順應性及藥物儲存方面具有優勢之約二十種不同癌症相關蛋白激酶。許多基於蛋白激酶抑制劑之藥物候選物當前處於臨床前或臨床研發階段。然而，在臨床使用蛋白激酶抑制劑之一段時間之後快速產生抗藥性及其毒性、嚴重副作用及受損功效在臨床腫瘤學及實驗腫瘤學兩者中提出關鍵挑戰且仍存在主要問題。為了克服臨床評定中之此等挑戰，組合兩種或更多種蛋白激酶抑制劑之組合療法為癌症治療之基礎，特定言之希望避開治療相關抗藥性且與單一療法方法相比改良功效。對蛋白激酶抑制劑之抗藥性為常見問題，尤其在患者通常已暴露於多種先前治療線之後的轉移性階段中。由於產生抗藥性，患者可在治療期間或治療完成之後不久經歷快速疾病進展。此抗性使得用於患者之治療選擇之數目有限。因此，為使抗藥性之影響降至最低，已嘗試同時組合使用兩種或更多種具有不相關作用機制及不同抗藥性模式之抗癌藥物。
靶向療法在其主動靶向特異性細胞受體之能力方面比化學療法具有優勢。習知化學療法不會有效區分腫瘤細胞但快速分裂正常細胞，由此產生非特異性副作用。相反，目標特異性抗癌療法干擾不同於正常細胞的在腫瘤生長或進展中具有重要作用的分子目標。另外，彼等藥劑中之一些充當多重抗藥性(MDR)相關蛋白質之抑制劑，藉此增加反應率。與習知化學療法相比，整體靶向療法提供具有較小毒性及較高反應率的較寬治療窗(therapeutic window)。
在最近幾年期間，蛋白激酶抑制劑之組合已在臨床中廣泛用於增強癌症治療。然而，組合方案之傳統混合液投與通常受不同藥物之間的不同藥物動力學影響。在常見的臨床前及臨床實踐中，組合蛋白激酶抑制劑藥物療法以各種量及/或以不同給藥排程單獨投與，而無需經設計以控制藥物之遞送或半衰期的醫藥製劑。此等投與方法具有限制組合藥物治療之治療用途的各種缺陷。通常，首先單獨研發此類方案之組分，而不考慮在其組合使用時可能出現的許多問題，諸如靶上拮抗作用及不良事件之增強。儘管來自組合治療之有益治療有效性在考慮各抗癌藥物之理論上非重疊作用機制時為有前景的，以上臨床癌症治療中的常見組合遠非完美，通常具有中等增強功效及累加毒性。因此，已基於藉由使用載劑介導之藥物遞送系統同時遞送兩種或更多種藥物的假設，藉由併入奈米技術與抗癌治療來研究各種方法，藥物遞送系統之組合可產生協同抗癌作用，減小個別藥物相關之毒性，控制藥物釋放及/或使各藥物之藥物動力學統一。近年來，已報導脂質體、樹枝狀聚合物、聚合物奈米粒子及水溶性聚合物-藥物結合物作為用於遞送多種藥物混合液之載劑。( Markman, J. L., 等人， Adv. Drug Delivery Rev. 2013, 65, 1866-1879)。
在奈米載劑中，基於脂質之奈米粒子已藉由克服P-gp介導之外流，經由增強滲透及滯留(enhanced permeability and retention；EPR)作用將藥物隔離在腫瘤部位處且一旦內化就逃脫內體清除而顯示出極佳的結果。舉例而言，CPX-351 (Vyxeos ®)為囊封阿糖胞苷(cytarabine)及道諾黴素(daunorubicin)之雙重藥物脂質調配物，其經合理設計以改良患有急性骨髓性白血病(AML)之患者的傳統7+3阿糖胞苷/道諾黴素化學療法方案的功效( Lawrence D Mayer 等人 , International Journal of Nanomedicine 2019:14, 3819-3830)。為實現多種蛋白激酶抑制劑用於癌症治療之有效遞送，一些研究已嘗試將此類藥物囊封至基於脂質體之遞送媒劑中，該遞送媒劑經設計以保護藥物免受將另外造成其自血流快速清除的機制。然而，仍需要用於組合蛋白激酶抑制劑遞送之新穎的基於脂質體之遞送系統來改良藥物遞送特異性，實現協同治療作用，減小抗藥性及藥物相關副作用，且整體提高藥物治療指數。
本揭示內容提供呈基於脂質體之藥物遞送系統形式的醫藥組合物及用於使用基於脂質體之藥物遞送系統向患者投與有效量之一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑(例如，阿法替尼(afatinib)、尼達尼布(nintedanib)、阿貝西尼(abemaciclib)、舒尼替尼(sunitinib)、克卓替尼(crizotinib)、達沙替尼(dasatinib)、塞利替尼(ceritinib)、奧希替尼(osimertinib)、普納替尼(ponatinib)、盧佐替尼(ruxolitinib)或其他)的方法。兩種或更多種蛋白激酶抑制劑可囊封至脂質體之水性核心隔室中(例如，對於親水性、水溶性抑制劑)或囊封至脂質體之脂質雙層中(例如，對於親脂性、不良水溶性抑制劑)。
在一些實施例中，一種單一脂質體媒劑可攜帶親脂性及親水性蛋白激酶抑制劑兩者，其中親水性抑制劑在水性核心中且親脂性抑制劑在脂質雙層中。此等組合物允許將兩種或更多種蛋白激酶抑制劑以協調的方式遞送至疾病部位，藉此確保蛋白激酶抑制劑可以所需量或比率存在於疾病部位處。兩種或更多種蛋白激酶抑制劑之組合遞送可藉由將該兩種或更多種蛋白激酶共囊封於如上文所提及之一種基於脂質之遞送媒劑內或藉由將各抑制劑囊封至單獨的基於脂質之遞送媒劑中來實現。在後一情況下，組合物之藥物動力學(PK)係由基於脂質之遞送媒劑自身來控制，使得實現協調的遞送(其限制條件為遞送系統之PK類似)。
在一個態樣中，本揭示內容提供一種醫藥組合物，其包含懸浮於液體介質中之脂質體，該液體介質含有水及維持pH之緩衝劑。脂質體包含由外部脂質雙層膜包圍之內部水性隔室。脂質雙層膜含有形成內部隔室之親水性內表面、親脂性雙層及與組合物之液體介質接觸之親水性外表面。關於蛋白激酶抑制劑在脂質體調配物內之位置的三種主要情境為值得注意的。情境I：內部水性隔室含有一種、兩種或更多種親水性蛋白激酶抑制劑。情境II：親脂性雙層含有一種、兩種或更多種親脂性蛋白激酶抑制劑。情境III：內部水性隔室含有一或多種親水性蛋白激酶抑制劑，且在同一脂質體中，親脂性雙層含有一或多種親脂性蛋白激酶抑制劑。對於以上所有三種情境，共囊封之蛋白激酶抑制劑可自脂質體釋放且誘導協同治療作用。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種用於非經腸投與之脂質體組合物，其包含一種、兩種或更多種以治療學上有效的比率囊封於脂質體內部之蛋白激酶抑制劑，尤其為非拮抗性之彼等蛋白激酶抑制劑。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種根據本文所揭示之任何實施例的醫藥組合物，其用於治療需要治療之個體之癌症或癌症藥物之抗藥性及副作用，其中該癌症係選自乳癌、黑素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤或類似癌症，其中蛋白激酶抑制劑係藉由對癌細胞具有協同細胞毒性或細胞抑制作用之脂質體來遞送。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種治療癌症或癌症之抗藥性且降低癌症藥物之毒性及副作用的方法。本揭示內容包括向需要治療之個體投與治療有效量的根據本文所揭示之任何實施例之醫藥組合物。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種製備脂質體醫藥組合物之方法，其中該脂質體係藉由包含以下之過程製得：主動載藥或被動載藥或藉由將被動載藥且接著主動載藥聯合在一起進行之依序載藥。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種治療套組，其包含容器及該容器中的複數種根據本文所揭示之任何實施例之載藥脂質體，其中該等載藥脂質體可懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中。
在另一實施例中，脂質體組合物包含兩種或更多種呈組合蛋白激酶抑制劑藥劑之間的莫耳比的蛋白激酶抑制劑，其對培養物中之相關細胞及腫瘤勻漿展現所需生物作用。較佳地，該莫耳比係藥劑為非拮抗的之比率。
在另一實施例中，本揭示內容提供一種藉由投與本發明之組合物來將治療有效量之組合蛋白激酶抑制劑(例如，阿法替尼/尼達尼布、阿法替尼/達沙替尼、阿法替尼/塞利替尼、阿貝西尼/舒尼替尼、奧希替尼/阿法替尼、奧希替尼/克卓替尼、塞利替尼/達沙替尼或其他)遞送至所需目標(例如，腫瘤部位)的方法。
在另一實施例中，本揭示內容提供一種藉由投與穩定地與第一遞送媒劑締合之蛋白激酶抑制劑及穩定地與第二遞送媒劑締合之另一激酶抑制劑來遞送治療有效量的蛋白激酶抑制劑之組合的方法。第一及第二遞送媒劑可含於單獨的小瓶中，同時或依次向患者投與小瓶之內含物。在一個實施例中，組合蛋白激酶抑制劑之莫耳比為非拮抗的。
在另一實施例中，本揭示內容提供一種製備治療組合物之方法，該治療組合物包含含有一定比率的兩種或更多種蛋白激酶抑制劑以實現所需治療作用的脂質體。該方法包含：(a)提供一組兩種或更多種蛋白激酶抑制劑，其中該組包含至少一種，但較佳多種比率之藥物；(b)測試該組之成員在一定濃度範圍內對相關細胞培養物或腫瘤勻漿發揮生物作用的能力；(c)選擇該組之成員，其中該比率在適合之濃度範圍內對細胞培養物及腫瘤勻漿提供所需治療作用；及(d)將由該組之成功成員代表的藥物之比率穩定地締合至基於脂質之藥物遞送媒劑中。在一些實施例中，有時較佳地，上述所需治療作用為非拮抗的。
如下文進一步描述，在根據上文所描述之方法設計適當組合時，有時較佳地，選擇非拮抗比率作為組合指數(CI) ≤ 1.1 (等於或小於1.1)之彼等比率。具體言之，CI＜0.9指示藥物組合之協同作用，其中將0.9 ≤ CI ≤ 1.1之範圍視為累加作用，且將CI ＞ 1.1視為藥物組合之拮抗作用。
在其他實施例中，設計適合的脂質調配物以使得其穩定地併入有效量之兩種或更多種蛋白激酶抑制劑之組合且允許在活體內持續釋放組合藥物。有時較佳地，調配物含有聚乙二醇化mPEG-DSPE或至少一種帶負電脂質，諸如磷脂醯甘油(DSPG)。
在其他實施例中，脂質體可由天然磷脂及合成類似物(諸如電荷兩性離子磷脂醯膽鹼)或類似物藉由主動載藥、被動載藥或被動且接著主動載藥過程之依序組合來製備。可添加微量比例之陰離子磷脂(諸如磷脂醯甘油)以產生用於膠體穩定的淨負表面電荷。對於主動載藥方法，基於共負載藥物之物理特性使用各種捕獲劑(例如，硫酸銨、過渡金屬離子及以下之銨鹽或經取代之銨鹽：聚陰離子化硫酸化環糊精、磺基丁醚環糊精、聚陰離子化硫酸化糖、聚磷酸鹽及其類似物)。
將兩種或更多種基於激酶抑制劑之抗癌藥物囊封於脂質體中為刺激促成腫瘤之生長及發育之多個傳訊路徑中的相互作用(cross-talking)的新穎方法。激酶抑制劑之組合由於其在一系列細胞活動之訊號轉導及調節中之關鍵作用而為用於治療各種類型之人類疾病的有用治療方法。
在另一實施例中，本揭示內容提供如本文中之任何實施例實例中所揭示及/或藉由根據本文所揭示之任何實施例或實例之方法製備的脂質體。
基於以下詳細描述、實例及申請專利範圍將更好地瞭解本揭示內容之其他態樣或優點。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2020年12月14日申請之美國臨時專利申請案第63/125,386號的優先權，其之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
採用組合藥物療法的基本原理為協同藥物相互作用。首先，當應用具有不同分子目標之多種藥物時，可延遲諸如癌細胞突變之癌症適應過程。其次，當多種藥物靶向不同細胞路徑時，其可協同作用以獲得更高的治療功效及更高的目標選擇性。臨床研究中用於多種癌症之當前可用的組合方案非常限於投與兩種或更多種抗癌藥劑之物理混合物。臨床研究中之常見臨床上使用之組合方案一般可基於其作用機制進行分類，包括：(1)非特異性小分子化學治療劑之組合；(2)特異性細胞受體靶向劑及化學治療劑之組合；及(3)特異性細胞受體靶向劑(例如，小分子蛋白質激酶抑制劑、大分子抗體、核酸等)之組合。
在本揭示內容中，吾人已鑑別出容納一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑以用於癌症治療及癌症抗藥性預防所需之藥物遞送調配物(例如，阿法替尼、尼達尼布、阿貝西尼、舒尼替尼、克卓替尼、達沙替尼、奧希替尼、塞利替尼、盧佐替尼或類似物)。含有藥物組合之此類調配物產生改良之治療指數、減小之抗藥性及副作用、在載劑中之優良藥物滯留，此引起各藥劑之延長血液循環時間及持續釋放。吾人進一步證實此等藥物在囊封於脂質體中時之協同比率可隨時間推移成功地在血液隔室中維持，其相比於呈其習知劑型(例如，錠劑或簡單可注射)之藥物組合產生增強的功效。
本揭示內容提供包含囊封一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑之脂質體的組合物，其中所選蛋白激酶抑制劑之組合以對相關細胞或腫瘤勻漿展現所需細胞毒性、細胞抑制或生物作用之莫耳比率存在。有時較佳地，本文提供之脂質體組合物包括以對相關細胞或腫瘤勻漿展現非拮抗作用之莫耳比負載有兩種激酶抑制劑的脂質體。
在一個態樣中，本揭示內容提供一種醫藥組合物，其包含懸浮於液體介質中之脂質體，其中該液體介質含有水及pH緩衝劑；其中該脂質體含有由外部脂質雙層膜包圍之內部隔室，其中內部水性隔室在水性介質中含有親水性蛋白激酶抑制劑；其中脂質雙層膜含有形成內部隔室之親水性內表面、親脂性雙層及與組合物之液體介質接觸的親水性外表面；且其中脂質雙層膜含有疏水性蛋白激酶抑制劑，且脂質體內囊封的多種蛋白激酶抑制劑可以協同或累加模式釋放。
在一個實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之水性內部隔室進一步包含捕獲劑。捕獲劑係選自硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，三乙銨肌醇六磷酸鹽及三(羥甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸鹽)之銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似物與鹵化物、硫酸根及葡糖酸根相對離子之鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)、溴化十六烷基三甲基銨(cetrimonium bromide)、硬脂基二甲基苄基氯化銨)、聚氧乙烯(亦即，聚乙二醇)及椰子胺(coconut amine)。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，兩種激酶抑制劑以約60:1至約1:60莫耳/莫耳之範圍內之莫耳比，有時較佳地約30:1至約1:30，且有時更佳地約10:1至約1:10、約5:1至約1:5、約3:1至約1:3、約2:1至約1:2或約1:1之莫耳比囊封。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，(a)外部雙層膜包含一或多種磷脂；及(b)雙層膜之外表面經選自聚乙二醇、帶電脂質及其組合之表面改質劑改質。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，脂質體懸浮液之pH在約5-8之範圍。水性介質進一步包含以下中之一或多者：水、緩衝劑、分散介質，且視情況包含等張劑，例如蔗糖、甘露醇、氯化鈉或其類似物。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，脂質體包含選自以下之脂質：磷脂(例如，HSPC、DSPC、DDPC、DEPC、DLPC、DMPC、DPPC、PSPC、SMPC、SOPC、SPPC、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、甘油醣脂、神經鞘糖脂)、固醇及其衍生物。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，固醇包含約0-60莫耳%之總脂質。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之平均粒度(直徑)介於4.5 nm至450 nm之間，有時較佳地介於25 nm與300 nm之間，且有時更佳地介於50 nm至200 nm之間。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之脂質雙層膜包含(a)磷脂之至少10莫耳%總脂質，該磷脂選自膽鹼磷脂(0-80莫耳%總脂質，例如HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂醯甘油(0-70莫耳%總脂質，例如DSPG)、磷脂醯肌醇、甘油醣脂、神經鞘糖脂(例如，鞘磷脂)及其組合；(b)固醇，較佳地膽固醇或其衍生物之0至60莫耳%總脂質；及(c)視情況與聚乙二醇衍生之帶電磷脂，0-10莫耳%總脂質(例如，mPEG-2000-DSPE)。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之脂質雙層膜之外表面包含表面帶負電脂質(例如，DSPG)或含有聚乙二醇之表面改質劑(例如，mPEG-2000-DSPE)，其中總脂質與總囊封激酶抑制劑之莫耳比至少相等(1:1)。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，蛋白激酶抑制劑選自阿卡拉布魯替尼(acalabrutinib)、阿貝西尼、阿法替尼、阿法利貝(aflibercept)、阿來替尼(alectinib)、阿瓦替尼(avapritinib)、阿西替尼(axitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、布加替尼(brigatinib)、貝美替尼(binimetinib)、伯舒替尼(bosutinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡普尼布(capmatinib)、塞利替尼、考比替尼(cobimetinib)、克卓替尼、達拉非尼(dabrafenib)、達可替尼(dacomitinib)、達沙替尼、恩拉非尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄達替尼(erdafitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、非達替尼(fedratinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉列替尼(gilteritinib)、依魯替尼(ibrutinib)、埃克替尼(icotinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、拉羅替尼(larotrectinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、勞拉替尼(lorlatinib)、米哚妥林(midostaurin)、來那替尼(neratinib)、尼羅替尼(nilotinib)、尼達尼布、奈妥舒迪(netarsudil)、奧希替尼、帕瑞替尼(pacritinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、吡昔替尼(pexidartinib)、培米替尼(pemigatinib)、帕博西尼(palbociclib)、普納替尼(ponatinib)、吡昔替尼、普納替尼、普拉替尼(pralsetinib)、奎紮替尼(quizartinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、瑞博西尼(ribociclib)、力普替尼(ripretinib)、盧佐替尼、塞爾帕替尼(selpercatinib)、司美替尼(selumetinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼、坦羅莫司(temsirolimus)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、圖卡替尼(tucatinib)、優帕替尼(upadacitinib)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)、澤布替尼(zanubrutinib)及塞維-阿法利貝(ziv-aflibercept)及更多者或其組合。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，脂質體包含選自以下之實例蛋白激酶抑制劑： (a)    單獨囊封之阿法替尼或尼達尼布； (b)    共囊封之阿法替尼及尼達尼布； (c)    單獨囊封之阿貝西尼或舒尼替尼； (d)    共囊封之阿貝西尼及舒尼替尼； (e)    單獨囊封之達沙替尼或阿法替尼； (f)    共囊封之達沙替尼及阿法替尼； (g)    單獨囊封之塞利替尼或阿法替尼； (h)    共囊封之塞利替尼及阿法替尼； (i)    單獨囊封之奧希替尼或阿法替尼； (j)    共囊封之奧希替尼及阿法替尼； (k)    單獨囊封之奧希替尼或克卓替尼； (l)    共囊封之奧希替尼或克卓替尼； (m)   單獨囊封之達沙替尼或塞利替尼； (n)    共囊封之達沙替尼及塞利替尼； (o)    單獨囊封之阿法替尼或克卓替尼； (p)    共囊封之阿法替尼及克卓替尼； (q)    呈約30:1至約1:30莫耳比之阿法替尼及尼達尼布； (r)    呈約30:1至約1:30莫耳比之阿貝西尼及舒尼替尼； (s)    呈約30:1至約1:30莫耳比之達沙替尼及阿法替尼； (t)    呈約30:1至約1:30莫耳比之塞利替尼及阿法替尼； (u)    呈約30:1至約1:30莫耳比之奧希替尼及阿法替尼； (v)    呈約30:1至約1:30莫耳比之奧希替尼及克卓替尼； (w)   呈約30:1至約1:30莫耳比之塞利替尼及達沙替尼；及 (x)    呈約30:1至約1:30莫耳比之阿法替尼及克卓替尼。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，組合激酶抑制劑可在投與後以協同模式依序釋放。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，共囊封藥劑(例如，蛋白激酶抑制劑)之莫耳比如以下：當在活體外分析中向與癌症相關之癌細胞提供一個濃度範圍內時(此時受影響細胞之分率為約0.20至0.80)，該範圍至少20%內展現協同作用。
在另一實施例中，在醫藥組合物中，經組合蛋白激酶抑制劑囊封之脂質體在活體內投與之後使協同莫耳藥物比率在血液中維持至少一小時。
在其他實施例中，跨膜pH梯度係藉由銨離子之濃度梯度或具有銨衍生物或經取代之銨離子的有機化合物之濃度梯度形成。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種藉由使用跨膜pH梯度或過渡金屬作為驅動力之主動載藥過程來製備脂質體醫藥組合物的方法，其中脂質體係藉由包含以下步驟之過程製得： (a)在包含水、脂質及捕獲劑之溶液中形成多層脂質體囊泡； (b)在高溫下(例如，在40-75℃之範圍內)將多層脂質體囊泡多次擠出通過聚碳酸酯膜(例如，大小為50 nm或100 nm)，以形成單層脂質體； (c)藉由透濾或尺寸排阻層析或其他緩衝液交換方法大體上移除脂質體外部之捕獲劑； (d)在高溫(例如，40-75℃)下在包含一或多種活性醫藥成分(API，例如親水性及水溶性激酶抑制劑)之水溶液中加熱未負載脂質體，藉此形成囊封藥物之脂質體；以及 (e)將組合物之pH調節至約5-8；及 (f)視情況，藉由凍乾作用形成乾燥形式之產物。
藉由上文提及之主動載藥方法製備的載藥脂質體之架構示於圖5 (I)中。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種藉由被動負載脂質體醫藥組合物製備脂質體醫藥組合物的方法；其中被動負載方法包含以下步驟： (a)在一種類型有機溶劑或有機溶劑之混合物中形成包含至少一或多種API (例如，親酯性及不良水溶性蛋白激酶抑制劑)的脂質溶液； (b)蒸發有機溶劑且在水溶液中水合脂質/API混合物以形成脂質體囊泡； (c)藉由在高溫(例如，40-75℃)下擠出、音波處理或均質化脂質分散液來減小粒度，以形成單層脂質體； (d)將組合物之pH調節至約5-8；及 (e)視情況，藉由凍乾作用形成乾燥形式之產物。
藉由上文提及的被動載藥方法製備的載藥脂質體之架構示於圖5 (III)中。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種藉由依序地首先執行被動負載且接著執行其主動負載來製備脂質體醫藥組合物之方法；其中聯合之被動/主動負載包含以下步驟： (a)在一種類型有機溶劑或有機溶劑之混合物中形成包含至少一種親脂性蛋白激酶抑制劑脂質溶液； (b)蒸發有機溶劑且在含有至少一種類型之捕獲劑的水溶液中水合脂質/藥物混合物，以形成多層脂質體； (c)藉由在高溫(例如，40-75℃)下擠出、音波處理或均質化脂質分散液來減小粒度，以形成單層脂質體； (d)藉由透濾、尺寸排阻層析或其他方法移除自步驟(a)及(b)引入之額外脂質親脂性蛋白激酶抑制劑及捕獲劑； (e)在高溫(例如，40-75℃)下在包含一或多種親水性蛋白激酶抑制劑之水溶液中加熱脂質體，以用於載藥； (f)將組合物之pH調節至約5-8；及 (g)視情況，藉由凍乾作用形成乾燥形式之產物。
藉由上文提及的聯合之被動/主動載藥方法製備的載藥脂質體之架構示於圖5 (II)中。
在一些實施例中，API為蛋白激酶抑制劑或蛋白激酶抑制劑之組合。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種根據本文所揭示之任何實施例的醫藥組合物，其用於治療需要治療之個體的癌症、癌症抗藥性及副作用，其中該癌症視情況選自乳癌、黑素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤等。其中共囊封之激酶抑制劑可藉由對癌細胞具有協同細胞毒性或細胞抑制作用之脂質體來遞送。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種治療癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與治療有效量的根據本文所揭示之任何實施例的醫藥組合物。
在一些實施例中，與投與呈游離形式之激酶抑制劑(例如錠劑、膠囊、無脂質體之可注射劑或類似物)相比，使用脂質體醫藥組合物之治療方法具有減小的藥物副作用。
在一個實施例中，癌症為非小細胞肺癌。
在另一實施例中，癌症為大腸直腸癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，癌症為大腸直腸癌或肺癌，其中肺癌由野生型EGFR之高水準磷酸化或EGFR胺基酸序列內之突變引起。
在另一實施例中，癌症為大腸直腸癌或肺癌，其中肺癌由VEGFA或VEGFA胺基酸序列內之突變引起。
在另一實施例中，治療為抗藥性相關癌症。
在一個實施例中，個體為人類。
在另一實施例中，個體為非人類哺乳動物或禽類。
在本揭示內容之一些實施例中，上述基於脂質之遞送媒劑包含第三或第四藥劑。可包括任何治療劑、診斷劑或化妝劑。
在另一態樣中，本揭示內容提供如本文中任何實施例實例中所揭示及/或藉由根據本文所揭示之任何實施例或實例之方法製備的複數種載藥脂質體。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種治療套組，其包含容器及在容器中的複數種根據本文所揭示之任何實施例之載藥脂質體，其中載藥脂質體懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中或可懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中。
本揭示內容之基於脂質之遞送媒劑不僅可用於非經腸投與，且亦可用於局部、經鼻、皮下、腹膜內、肌肉內、氣霧或經口遞送，或藉由將遞送媒劑施加至目標部位處或目標部位附近的天然或合成可植入裝置上或其中以用於治療目的或醫學成像及類似者。在一個實施例中，本揭示內容之基於脂質之遞送媒劑用於非經腸投與，有時較佳地，靜脈內投與。
如熟習此項技術者將理解，所有載藥脂質體及由其製備之醫藥組合物必須在需要向需要治療之個體投與時使用的任何材料及過程的無菌條件下製備。因此，雖然本揭示內容不限於此，但本文中所揭示或所主張且意欲用於治療個體之所有脂質體及醫藥組合物為無菌的。
本文中所描述之一些較佳實施例並不意欲為詳盡的或將本發明之範疇限制為所揭示的精確形式。其經選擇及描述以解釋本發明之原理及其應用及實際使用，以允許熟習此項技術者瞭解其教示內容。
1. 組合物
A.治療劑：蛋白激酶抑制劑
i. 酪胺酸激酶抑制劑(TKI) 抑制酪胺酸激酶路徑之化合物可為有用的。下文列出研究中所描述之一些較佳化合物。 ALK 藥物目標 ：阿瓦替尼、阿來替尼、布加替尼、克卓替尼、塞利替尼、勞拉替尼及其類似者； BCR-Abl 藥物目標：伯舒替尼、達沙替尼、伊馬替尼、尼羅替尼、普納替尼及其類似者； BTK 藥物目標：依魯替尼、阿卡拉布魯替尼、澤布替尼及其類似者； c-Met 藥物目標：克卓替尼、卡博替尼、卡普尼布及其類似者； EGFR 家族藥物目標 ：阿法替尼、達可替尼、吉非替尼、埃羅替尼、埃克替尼、拉帕替尼、來那替尼、凡德他尼、奧希替尼、圖卡替尼及其類似者； JAK 家族藥物目標：巴瑞替尼、非達替尼、盧佐替尼、托法替尼及其類似者； PDGFR α/β 藥物目標 ：阿西替尼、阿瓦替尼、吉非替尼、伊馬替尼、樂伐替尼、尼達尼布、帕唑帕尼、瑞戈非尼、力普替尼、索拉非尼、舒尼替尼、優帕替尼及其類似者； RET 藥物目標 ：阿來替尼、卡博替尼、普拉替尼、塞爾帕替尼、凡德他尼及其類似者； Src 家族藥物目標：伯舒替尼、達沙替尼、普納替尼、凡德他尼及其類似者； VEGFR 家族藥物目標 ：阿西替尼、卡博替尼、樂伐替尼、尼達尼布、瑞戈非尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、凡德他尼及其類似者。
舉例而言，阿法替尼為抑制來自酪胺酸激酶受體EGFR (erbB1/ HER1)、HER 2 (erb2)及HER 4 (erb4)之所有EGFR家族的傳訊的經口不可逆ErbB家族阻斷劑。與第一代EGFR抑制劑相比，研發此小分子化合物旨在延緩獲得性抗性以改良臨床結果。實際上，在一系列治療領域及適應症中，阿法替尼單藥療法已證實持久的臨床活性，其似乎優於其他靶向療法。基於關鍵III期研究中與標準基於鉑之化學療法相比PFS之顯著改良，在2013年，美國、歐洲及日本批准經口阿法替尼錠劑以用於治療攜帶不同類型之EGFR突變的患有非小細胞肺癌(NSCLC)之患者。然而，在所有臨床研究中，阿法替尼具有定義明確的安全概況，主要為胃腸道及皮膚不良事件(AE)。阿法替尼最常見的≥ 3級AE為腹瀉(5.4-14.4%)、皮疹/痤瘡(9.7-16.2%)及口腔炎/黏膜炎(5.4-8.7%) ( Solca F,等人 (2012), J Pharmacol Exp Ther 343: 342-350)。
尼達尼布為小分子抑制劑，其經批准用於在患有晚期肺腺癌之患者中在化學療法失敗之後與細胞毒性多西他賽組合的二線治療。尼達尼布競爭性地結合於VEGFR受體(VEGFR) 1-3、PDGFR a/b、FGFR 1-4之激酶域內的ATP結合位點且抑制Src家族酪胺酸激酶(Src、Lck、Lyn)、Flt-3及RET。另外，尼達尼布藉由減小腫瘤生長及轉移展現其他抗癌作用且經批准用於治療患有特發性肺部纖維化(IPF)之患者。經口尼達尼布(膠囊)在歐洲經批准與多西他賽組合用於患有腺癌組織學之晚期NSCLC之患者的二線治療(2015)，且在美國及歐洲經批准用於治療患有特發性肺部纖維化之患者(2014)。然而，儘管特異性靶向癌基因依賴性細胞，但與典型化學療法相當的嚴重副作用之發生及抗藥性之快速發展為臨床研究中用激酶抑制劑進行成功治療的主要限制(Hilberg F等人， Cancer Res., 2008, 68: 4774-4782)
另一較佳TKI抑制劑舒尼替尼(SUN)為抑制PDGFR (A及B)、VEGFR1、VEGFR2、FLT3R、c-Kit及RET介導之傳訊的多靶向酪胺酸激酶抑制劑。在2017年，FDA批准Pfizer之SUTENT ®形式之蘋果酸舒尼替尼作為輔助療法以用於治療具有高風險的腎切除後的復發性腎細胞癌(RCC)、疾病進展或對甲磺酸伊馬替尼不耐受之後的胃腸基質瘤(GIST)、晚期腎細胞癌之成年患者。在患有不可切除之局部晚期或轉移性疾病之患者中的進展性、良好分化之胰臟神經內分泌腫瘤(pNET)。
ii.     其他激酶抑制劑 用於靶向癌症療法之其他激酶抑制劑可為有用的。下文列出研究中描述之一些較佳化合物。 B-Raf 絲胺酸 / 蘇胺酸藥物目標：達拉非尼、恩拉非尼、維羅非尼及其類似者； CDK 家族藥物目標：阿貝西尼、帕博西尼、索拉非尼、瑞博西尼及其類似者； CSF1R 藥物目標：吡昔替尼及其類似者； FGFR1/2/3/4 藥物目標 ：厄達替尼、培米替尼及其類似者； FKBP12/mTOR 藥物目標 ：依維莫司、西羅莫司( Sirolimus)、坦羅莫司及其類似者； Flt3 藥物目標：吉列替尼、米哚妥林、奎紮替尼及其類似者； MEK1/2 藥物目標：貝美替尼、考比替尼、司美替尼、曲美替尼及其類似者； ROCK1/2 藥物目標：奈妥舒迪及其類似者； ROS1 藥物 目標：恩曲替尼及其類似者； Syk 藥物目標：福他替尼及其類似者； STK1 藥物目標：奎紮替尼及其類似者； TRKA/B /C 藥物目標：恩曲替尼、拉羅替尼及其類似者。
B.非經腸調配物 本文中所描述之化合物可經調配以用於非經腸投與。如本文所用，「非經腸投與」意謂藉由除經由消化道或非侵入性局部或區域途徑以外的任何方法投與。舉例而言，非經腸投與可包括藉由注射及藉由輸注靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、玻璃體內、瘤內、肌肉內、皮下、結膜下、囊泡內、心包內、臍內投與至患者。
可使用此項技術中已知之技術將非經腸調配物製備為水性組合物。通常，可將此類組合物製備為可注射調配物，例如溶液或懸浮液；適用於在注射之前添加復原介質後製備溶液或懸浮液的固體形式；乳液，諸如油包水(w/o)乳液、水包油(o/w)乳液及其微乳液、脂質體或乳脂體。
載劑可為含有例如水、緩衝液及等張劑之溶劑或分散介質，例如糖、HEPES緩衝液或氯化鈉等。
可在與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑適當混合的水或另一種溶劑或分散介質中製備呈游離酸或鹼或其藥理學上可接受之鹽形式的活性化合物之溶液及分散液，該賦形劑包括但不限於界面活性劑、分散劑、乳化劑、pH調節劑、黏度調節劑及其組合。
調配物可含有防腐劑以防止微生物生長。適合的防腐劑包括但不限於對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及硫柳汞。調配物亦可含有抗氧化劑以防止活性劑降解。
通常將調配物緩衝至3-8之pH以便在復原時非經腸投與。適合緩衝液包括但不限於HEPES緩衝液、磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液及檸檬酸鹽緩衝液。
水溶性聚合物通常用於非經腸投與之調配物中。適合的水溶性聚合物包括但不限於聚乙烯吡咯啶酮、葡聚糖、羧甲基纖維素及聚乙二醇。
藉由將於適當溶劑或分散介質中之所需量的活性化合物按需要併入上文所列之賦形劑中之一或多者，隨後進行過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將各種經滅菌活性成分併入至含有基礎分散介質及來自上文所列之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑的情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥技術，其自其先前經無菌過濾之溶液中產生活性成分加上任何額外所需成分之散劑。可以使得粒子本質上為多孔之方式製備散劑，此可增加粒子之溶解度。用於製備多孔粒子之方法為此項技術中已知的。
2. 控制釋放 調配物本文中所描述之非經腸調配物可調配成用於控制釋放，包括立即釋放、延遲釋放、延長釋放、脈衝式釋放及其組合。
對於非經腸投與，可將一或多種化合物及視情況選用之一或多種額外活性劑併入至提供化合物及/或一或多種額外活性劑之控制釋放的微粒子、奈米粒子或其組合中。在其中調配物含有兩種或更多種藥物之實施例中，藥物可經調配用於相同類型之控制釋放(例如，延遲、延長、立即或脈衝式)或藥物可經獨立地調配以用於不同類型之釋放(例如，立即及延遲、立即及延長、延遲及延長、延遲及脈衝式等)。
舉例而言，可將化合物及/或一或多種額外活性劑併入至提供藥物之控制釋放的奈米粒子及微粒子中。藉由自奈米粒子及微粒子中擴散藥物及/或藉由水解及/或酶促降解降解聚合物粒子來控制藥物之釋放。適合的聚合物包括脂質及其他天然或合成脂質衍生物。
水不溶之蛋白質(諸如玉米蛋白)亦可用作用於形成含有藥物之奈米粒子及微粒子的材料。另外，水溶性的蛋白質、多醣及其組合可與藥物一起調配成微粒子且隨後進行交聯以形成不可溶的網狀物。舉例而言，環糊精可與個別藥物分子複合且隨後交聯。
將藥物囊封或併入載劑材料中以產生含有藥物之奈米粒子及微粒子可經由已知醫藥調配技術實現。在以磷脂或磷脂類材料調配之情況下，通常將載劑材料加熱至高於其熔融溫度且添加藥物以形成包含懸浮於載劑材料中之藥物粒子、溶解於載劑材料中之藥物或其混合物的混合物。奈米粒子及微粒子可隨後經由若干方法調配，包括(但不限於)凝結、擠出、噴霧冷卻或水性分散之過程。在一些較佳過程中，將脂質加熱至高於其熔融溫度，在水溶液中復原，擠出且載藥。此等過程為此項技術中已知的。
3. 測定活體外非拮抗組合藥物比率在本發明之另一實施例中，可將蛋白激酶抑制劑以協同或累加(亦即非拮抗)比率囊封至脂質體中。藉由在一定濃度範圍內評定藥劑對來自個別患者活組織切片之相關細胞培養物及/或腫瘤勻漿之生物活性或作用來測定蛋白激酶抑制劑之治療學上有效的非拮抗比率。可使用使得測定維持所需治療作用的蛋白激酶抑制劑藥劑之比率的任何方法。舉例而言，除非另外指出，否則Chou-Talalay中位數效應法用於本申請案中所揭示之實例中(Chou, T.C., J. Theor. Biol.,1976, 39:253-276)。
通常使用培養物中之細胞活體外測定基礎實驗資料。有時較佳地，如上文所解釋，繪製為受影響細胞之分數(Fa)之函數的組合指數(CI)為濃度範圍之替代參數。較佳的藥劑組合為在實質Fa值範圍內顯示協同作用或累加作用的彼等藥劑組合。在其中超過1%細胞受影響的至少約5%濃度範圍(亦即，大於0.01之Fa範圍)內為非拮抗的時，選擇藥劑組合。有時較佳地，總體濃度之較大部分展現有利的CI；例如Fa範圍0.2-1.0之5%。有時更佳地，約10%之此範圍展現有利的CI。有時甚至更佳地，約20%之Fa範圍、高於約50%或高於至少約70%之0.2至1.0之Fa範圍用於組合物中。可在多種藥劑比率下再評估在Fa值之實質範圍內顯示協同作用的組合，以定義最佳比率以增強非拮抗相互作用之強度且增加觀測到協同作用的Fa範圍。
雖然期望在細胞受影響之整個濃度範圍內具有協同作用，但已觀測到，在許多情況下，當使用諸如MTT分析之分光光度法時，結果在0.2至0.8之Fa範圍內顯著更可靠。因此，儘管藉由本發明之組合展現的協同作用經闡述存在於0.01或更大之廣泛範圍內，但有時較佳地，協同作用建立在0.2至0.8之Fa範圍內。然而，其他更敏感的分析可用於評估Fa值大於0.8時之協同作用，例如生物發光或群落生成分析。
最佳組合比率可進一步用作單一醫藥單元以測定與第三藥劑之協同或累加相互作用。另外，三-藥劑組合可用作用以測定與第四藥劑之非拮抗相互作用的單元等等。
如上文所闡述，將用「相關」細胞進行對細胞培養物之活體外研究。細胞之選擇將視藥劑之既定治療用途而定。僅一種相關細胞株或細胞培養物類型需要展現所需非拮抗作用，以便為組合物落入本發明之範疇內提供基礎。
舉例而言，在本發明之一個較佳實施例中，藥劑組合意欲用於抗癌療法。在一常見實施例中，藥劑組合意欲用於多種癌症，諸如白血病或淋巴瘤、乳癌、三陰性乳癌、胃腸癌、大腸直腸癌、RCC及肺癌。接著對待測試之細胞及測試之性質進行適當的選擇。特定言之，腫瘤細胞株為適合的個體且細胞死亡或細胞停滯之量測為適當終點。如下文將進一步論述，在試圖尋找用於其他適應症之適合非拮抗組合的情形下，可採用除細胞毒性或細胞停滯外的其他目標細胞及標準。
對於涉及抗腫瘤劑之測定，細胞株可自標準細胞株儲存庫(例如，NCI或ATCC)、學術機構或包括商業來源之其他組織獲得。一些較佳的細胞株將包括一或多種選自由NCI/NIH之發展治療計劃(Developmental Therapeutics Program)鑑別的細胞株。此計劃使用之腫瘤細胞株篩選目前鑑別約60種不同的腫瘤細胞株，其表示白血病、黑素瘤及肺癌、大腸癌、腦癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、胃癌及腎癌等。所需濃度範圍內之所需非拮抗作用僅需要展示於單一細胞類型上；然而，有時較佳地至少兩種細胞株、有時更佳地三種細胞株、五種細胞株或甚至10種細胞株展現此作用。細胞株可為已建立的腫瘤細胞株或自患者樣本獲得之原代培養物。細胞株可來自任何物種，但較佳來源將為哺乳動物且特定言之人類。細胞株可在藉由各種實驗室條件下選擇來進行基因改變。
在一個較佳實施例中，給定作用(Fa)係指將細胞毒性劑施加至細胞培養物之後的細胞死亡或細胞停滯。在本發明中，可藉由MTT分析來量測細胞死亡或成活力。可針對除癌症以外之疾病適應症來測定兩種或更多種藥劑之非拮抗比率，且此資訊可用於製備用於治療此等疾病之兩種或更多種藥物之治療性調配物。關於活體外分析，可選擇許多可量測終點來定義藥物協同作用，其限制條件為彼等終點對於特定疾病而言為治療上相關的。如上文所闡述，將用「相關」細胞進行對細胞培養物之活體外研究。細胞之選擇將視藥劑之既定治療用途而定。可使用由腫瘤樣本均質化成單一細胞產生之「腫瘤勻漿」來對個別患者活組織切片或整個腫瘤進行活體外研究。在一個較佳實施例中，給定作用(Fa)係指將細胞毒性劑施加至「相關」細胞培養物之後的細胞死亡或細胞停滯。可使用此項技術中已知之多種方法來量測細胞死亡或成活力。
4. 製備基於脂質之遞送媒劑在奈米粒子遞送系統中，脂質體為最廣泛使用的具有若干獨特特徵之醫藥學載劑中之一者，該等特徵包括：(1)由載劑介導之延長的藥物循環半衰期，(2)減少之非特異性攝取，(3)經由被動增強滲透及滯留(EPR)作用及/或藉由併入靶向配體之主動靶向在腫瘤部位處之累積增加，(4)主要為內飲攝取，有可能繞過多重抗藥機制，及(5)基於各藥劑之藥理學配置調整其相對比率的能力，(6)在同一平台中攜載多種藥物(親水性及親脂性藥物)之單一遞送系統可引起各藥物之同步及受控藥物動力學，從而產生改良的藥物功效，以及(7)改良的藥物溶解度及生物可用性( Mamot, C., 等人 ， Drug Resist. Updates 2003, 6, 271-279)。
有時較佳地，用於本發明之脂質載劑為脂質體。適用於本發明之脂質體包括大單層囊泡(LUV)、多層囊泡(MLV)、小單層囊泡(SUV)及交指融合脂質體。用於本發明之脂質體可經製備以含有磷脂醯膽鹼脂質或磷脂類材料，諸如二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)或氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)。
本發明之脂質體亦可含有固醇，諸如膽固醇。脂質體亦可含有治療性脂質，其實例包括醚脂質、磷脂酸、膦酸酯、腦醯胺及腦醯胺類似物、神經鞘胺醇及神經鞘胺醇類似物及含絲胺酸之脂質。
脂質體亦可用表面穩定親水性聚合物-脂質結合物(諸如聚乙二醇-DSPE)來製備，以提高循環壽命。亦可將帶負電荷之脂質(諸如磷脂醯甘油(PG)及磷脂醯肌醇(PI))之併入添加至脂質體調配物中以增加載劑之循環壽命。此等脂質可用於代替親水性聚合物-脂質結合物作為表面穩定劑。有時較佳地，脂質體可含有磷脂醯甘油(PG)及/或磷脂醯肌醇(PI)以防止聚集，藉此增加載劑之血液駐留時間。
在一個實施例中，根據本發明之脂質體組合物用於治療癌症及感染疾病。藉由投與本發明之脂質體來實現將經囊封藥物遞送至腫瘤部位。有時較佳地，脂質體之粒度平均直徑小於300 nm。有時更佳地，脂質體之粒度平均直徑小於200 nm。由於內皮中之穿孔或間隙，腫瘤脈管系統通常比正常脈管系統更容易滲漏。此允許200 nm或更小(平均直徑)之遞送媒劑穿透非連續的內皮細胞層及包圍將血液供應至腫瘤之血管的下層基底膜。外滲之後遞送媒劑選擇性累積至腫瘤部位產生增強的抗癌藥物遞送及治療有效性。
可利用各種方法將活性劑囊封在脂質體中。「囊封」包括藥劑與基於脂質之遞送媒劑之共價或非共價締合。舉例而言，此可藉由藥劑與脂質體之一或多個外層之相互作用或藥劑在脂質體內之截留來進行，在脂質體之不同部分之間實現平衡。因此，可藉由與脂質體之雙層相互作用經由與脂質組分共價或非共價相互作用或脂質體之水性內部中之截留，或在內部水相及雙層之間處於平衡而使藥劑締合來囊封藥劑。「負載」係指將一或多種藥劑囊封至遞送媒劑中之動作。
可經由囊封於單獨遞送媒劑中或同一遞送媒劑內來實現所需組合之囊封。當需要囊封至單獨脂質體中時，各脂質體之脂質組成可能完全不同以允許協調的藥物動力學。藉由改變脂質體媒劑組成，可匹配囊封藥物之釋放速率以允許將所需比率之藥物遞送至腫瘤部位。改變釋放速率之方法包括增加形成囊泡之脂質之醯基鏈長度以改良藥物滯留，控制表面接枝親水性聚合物(諸如mPEG-DSPE上之聚乙二醇)自脂質體膜中的交換及將膜硬化劑(諸如固醇或神經鞘磷脂)併至膜中。熟習此項技術者應顯而易見，若需要以特定藥物比率投與第一及第二藥物且若第二藥物在第一藥物之脂質體組合物(例如，DMPC/膽固醇)內保留不良，則可藉由將第二藥物囊封於具有增加之醯基鏈長度之脂質的脂質體組合物(例如，DSPC/膽固醇)中來實現改良之藥物動力學。當囊封於單獨脂質體中時，應容易接受，可藉由在投與之前組合適當量之各脂質體囊封藥物，針對個別患者產生已在患者特異性基礎上測定以提供最佳治療活性的兩種藥物之比率。替代地，兩種或更多種藥劑可經囊封於同一脂質體內。
用於囊封之技術視治療劑及遞送媒劑之性質而定。舉例而言，可使用被動及主動負載方法兩者將治療劑負載至脂質體中。將活性劑囊封於脂質體中之被動方法涉及在脂質體之製備期間囊封藥劑。此技術引起多層囊泡(MLV)之形成，其可在擠出時轉化為大單層囊泡(LUV)或小單層囊泡(SUV)。另外，另一適合的被動囊封方法涉及在形成脂質體之後的被動平衡。此過程涉及在經改變或非環境(基於溫度、壓力等)條件下培育預先形成之脂質體且將治療劑(例如，蛋白激酶抑制劑)添加至脂質體之外部。治療劑接著藉由穿過脂質膜平衡進入脂質體內部。接著使脂質體返回至環境條件且經由滲析或另一適合方法移除未囊封的治療劑(若存在)。藉由上文提及的被動載藥方法製備之載藥脂質體之實例示於圖5 (III)中。
藥物囊封之主動負載方法包括pH梯度負載方法及主動過渡金屬負載技術。基於跨膜pH梯度之負載方法利用單陰離子或聚陰離子之銨鹽或經取代之銨鹽作為捕獲劑，該捕獲劑在囊封治療劑之前預負載至脂質體中。彼等捕獲劑建立跨膜pH梯度且亦可與治療劑形成沈澱物、聚集或膠凝，此兩者均用作用於將藥劑主動負載至脂質體中之驅動力。關於pH梯度，通常公認脂質體之內部與外部環境之間的pH值差至少大於一個單位。用於建立且維持脂質體上之pH梯度的其他方法涉及使用可插入脂質體膜中且跨越膜運輸以交換質子的離子載體。其中，基於活性過渡金屬之負載技術利用過渡金屬經由錯合或配位驅動藥劑至脂質體中之攝取。藉由上文提及的主動載藥方法製備之載藥脂質體之實例示於圖5 (I)中。
適合的捕獲劑可為陰離子、陽離子、兩性或非離子活性劑，包括但不限於含有羧酸鹽、聚磷酸鹽、磺酸鹽(包括長鏈烷基磺酸鹽及烷基芳基磺酸鹽)及硫酸鹽之活性劑。陽離子捕獲劑包括四級銨化合物，諸如苯紮氯銨、苄索氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、硬脂基二甲基苄基氯化銨、聚氧乙烯及椰子胺及其類似物。
捕獲劑之更特定實例包括硫酸銨、過渡金屬及以下之銨鹽或經取代之銨鹽：聚陰離子化硫酸化環糊精、磺基丁醚環糊精、聚陰離子化硫酸化糖、聚磷酸鹽及其類似物。
具體言之，捕獲劑包括以下聚陰離子化硫酸化糖之銨鹽或經取代之銨鹽：蔗糖八硫酸鹽、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸乙醯肝素及硫酸化玻尿酸、褐藻糖膠(fucoidan)、半乳聚糖(galactan)、角叉菜膠(carrageenan)、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)、半乳褐藻聚糖(galactofucan)、甘露糖醛酸葡聚糖(mannoglucuronofucan)、硫酸阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactans sulfate)、硫酸甘露聚糖(mannan sulfate)、硫酸化異鼠李聚糖(sulfated heterorhamnan)及硫酸木甘露聚糖(xylomannan sulfate)及其類似物。
具體言之，捕獲劑包括以下形式之磺基丁醚環糊精之銨鹽或經取代之銨鹽：磺基丁醚-α-環糊精、磺基丁醚-β-環糊精及磺基丁醚-γ-環糊精及其類似物。
具體言之，捕獲劑包括以下聚磷酸鹽之銨鹽或經取代之銨鹽：植酸、三磷酸、聚磷酸及環狀三偏磷酸鹽。
具體言之，上述聚陰離子之相對離子包括銨及經取代之銨，其進一步包括以下之質子化形式：三乙胺、三乙醇胺、三(羥甲基)胺基甲烷或緩血酸胺、二乙醇胺、乙二胺、三丁胺、1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷、二乙基乙醇胺、二乙醇乙胺、乙醇胺、𠰌啉及其類似物。
基於過渡金屬離子之捕獲劑包括以下之鹽形式：銅離子、鋅離子、錳離子、鎳離子及鈷離子。金屬之相對離子包括硫酸根、氯化物、葡糖酸根、溴化物及氫氧化物。
更具體言之，用於脂質體載藥之捕獲劑包括以下：硫酸銨、蔗糖八硫酸三乙銨(TEA-SOS)、三乙銨磺基丁醚β-環糊精(TEA-SBE-β-CD)；磺基丁醚-β-環糊精之三(羥甲基)胺基甲烷鹽(Tris-SBE-β-CD)、植酸或肌醇六磷酸之三乙銨鹽(TEA-IP6)、葡糖酸銅、硫酸銅、氯化銅及硫酸鋅。
截流之被動及主動載藥方法亦可經聯合以將含有親脂性藥物及親水性藥物兩者之脂質體調配物製備成單一遞送媒劑。具體言之，親脂性藥物可首先藉由被動負載負載至脂質體中，接著同一脂質體隨後用於經由主動負載方法負載親水性藥物。藉由上文提及的聯合被動/主動載藥方法製備的載藥脂質體之實例示於圖5 (II)中。
5.活體內投與本發明之組合物 如上文所提及，可將本發明之遞送媒劑組合物投與至溫血動物，包括人類以及家禽物種。對於治療人類病痛，合格的醫師將使用已建立之方案確定應如何關於投與之劑量、排程及途徑使用本發明之組合物。若囊封於本發明之遞送媒劑組合物中之藥劑對個體之健康組織展現降低的毒性，則此類應用亦可利用劑量遞增。
在一個實施例中，非經腸，亦即動脈內、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投與本發明之醫藥組合物。有時較佳地，藉由彈丸注射或輸注注射靜脈內或腹膜內投與醫藥組合物。
在其他方法中，本發明之醫藥或化妝用製劑可藉由將製劑直接施加至組織而與目標組織接觸。可藉由局部「開放(open)」或「封閉(closed)」程序進行施加。藉由「局部」，意謂將多藥製劑直接施加至暴露於環境之組織，諸如皮膚、口咽、外耳道及其類似者。「開放」程序為包括切開患者皮膚且直接觀察施加醫藥製劑之皮下組織的彼等程序。此通常藉由手術程序來實現，諸如用以進入肺部之開胸術、用以進入腹部內臟之腹部開腹術或用以進入目標組織之其他直接手術方法。「封閉」程序為侵入性程序，其中內部目標組織不直接可視化，而是經由皮膚中的小傷口插入器械來進入。舉例而言，可藉由針灌洗向腹膜投與製劑。替代地，可經由內窺鏡裝置投與製劑。
包含本發明之遞送媒劑的醫藥組合物係根據標準技術製備且可包含水、緩衝液、0.9%生理鹽水、0.3%甘胺酸、5%右旋糖、等滲蔗糖溶液及其類似物，包括用於增強穩定性之醣蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白及其類似物。此等組合物可藉由習知、熟知的滅菌技術來滅菌。所得水溶液可封裝使用或在無菌條件下過濾且凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水溶液組合。組合物可含有接近生理條件所需的醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節及緩衝劑、張力調節劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣及其類似物。替代地，遞送媒劑懸浮液可包括脂質保護劑，其保護脂質在儲存時免受自由基及脂質過氧化損害。親脂性自由基淬滅劑(諸如α-生育酚)及水溶性鐵特異性螯合劑(諸如鐵胺)為適合的。
醫藥調配物中之遞送媒劑之濃度可廣泛變化，諸如自小於約0.05重量%，通常為或至少約2至5重量%至多達10至30重量%，且將根據所選擇的特定投與模式，主要藉由流體體積、黏度及其類似物來選擇。舉例而言，可增加濃度以降低與治療相關之流體負載。替代地，可將由刺激性脂質構成之遞送媒劑稀釋至低濃度以減輕投與部位處之炎症。對於診斷，所投與之遞送媒劑之量將視所使用之特定標記、經診斷之疾病狀態及臨床醫師之判斷而定。
遞送媒劑調配物之劑量將視藥物與脂質之比率及投與醫師基於患者之年齡、體重及病狀之意見而定。
除醫藥組合物之外，適用於獸醫學用途之調配物可以適合於個體之方式製備及投與。較佳的獸醫學個體包括哺乳動物物種，例如非人類靈長類動物、狗、貓、牛、馬、綿羊及家養家禽。個體亦可包括實驗室動物，例如，特定言之，大鼠、兔、小鼠及天竺鼠。
6.封裝套組 本發明組合物中之治療劑可單獨地調配於個別組合物中，其中各治療劑與適當遞送媒劑穩定締合。只要協調遞送媒劑之藥物動力學以使得所投與治療劑之比率維持在治療目標處，就可單獨向個體投與此等組合物。因此，構築套組係有用的，該等套組包括在單獨容器中的包含與至少一種第一治療劑穩定締合之遞送媒劑的第一組合物及在第二容器中的包含與至少一種第二治療劑穩定締合之遞送媒劑的第二組合物。容器可接著封裝於封裝套組中。
套組亦將包括關於向個體投與組合物之模式的說明書，至少包括對待投與的各組合物之量之比率的描述。替代地或另外，套組經構築以使得預量測各容器中之組合物之量，使得一個容器之內含物與另一容器之內含物組合表示正確比率。替代地或另外，容器可標記有允許根據可見刻度分配適當量的量測刻度。容器本身可用於投與；例如，套組可在單獨注射器中含有適當量之各組合物。包含預調配之正確比率之治療劑的調配物亦可以此方式封裝，使得直接自預封裝於套組中之注射器中投與調配物。
定義 除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術術語、標記及其他科學術語或術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。在一些情況下，為了清楚起見及/或為便於參考，本文中定義具有通常所理解含義之術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中一般理解存在實質性差異。熟習此項技術者充分理解且通常使用習知方法論採用本文中描述或提及之許多技術及程序。按需要，除非另外指出，否則涉及可商購套組及試劑之使用的程序通常根據製造商所定義之方案及/或參數進行。本文所提及之所有專利、申請案、公開之申請案及其他公開案以全文引用之方式併入本文中。若此章節中所闡述之定義與以引用方式併入本文中的專利、申請案、公開之申請案及其他公開案中所闡述之定義相反或者不一致，則以此章節中所闡述之定義，而非以引用方式併入本文中的定義為凖。
如本文所用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數種指示物，且反之亦然，任何複數形式包括單數指示物。
除非另外定義，否則術語「約」或「大約」通常包括所指示數目之至多±10%。舉例而言，「約10%」可指示9%至11%之範圍，且「約20」可意謂18至22之範圍。有時較佳地，「約」包括指示值之至多±5%。替代地，「約」包括指示值之至多±5%。當在範圍之前使用「約」時，其適用於範圍之下限及上限兩者。
如一般熟習此項技術者將理解，如本文所用之術語「大體上」意謂「大部分」或「基本上」，且若可定量量測，則其係指至少90%，較佳至少95%，更佳至少98%。
除非另外指出，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開放式術語(亦即，意謂「包括但不限於」)。
如本文所用，術語「協同作用」意謂兩種或更多種藥物之間的相互作用，其造成藥物之總作用大於各藥物之個別作用之總和。
「協同比率」意謂可獲得協同作用之組合中使用的兩種或更多種藥物之莫耳比。
如本文所用，術語「協同細胞毒性作用」係指兩種或更多種藥物之間的相互作用，其造成藥物之總作用大於各藥物之個別作用之總和。此總作用引起細胞殺死及最終腫瘤縮小。
如本文所用，術語「協同細胞抑制作用」係指兩種或更多種藥物之間的相互作用，其造成藥物之總作用大於各藥物之個別作用之總和。此總作用引起在不直接殺死細胞之情況下的腫瘤生長抑制。
術語「累加作用」意謂藉由兩種或更多種藥物之作用產生的組合作用等於其單獨作用之總和。
「累加比率」意謂可獲得累加作用之組合中使用的兩種或更多種藥物之莫耳比。
術語「非拮抗比率」係指協同比率及累加比率兩者。
如本文所用，術語「拮抗作用」意謂對暴露於兩種或更多種藥物之治療反應，其小於將個別藥物之已知作用加在一起時所預期的治療性反應。
如本文所用，術語「拮抗比率」係指可獲得拮抗作用之組合使用的兩種或更多種藥物之莫耳比。
術語「組合指數」係指用於測定藥物相互作用之程度的參數。組合指數(CI)可基於中位數效應分析演算法來計算，如Chou及Talalay描述(T.C. Chou及P. Talalay, Adv. Enzyme Reg.,1984, 22:27-55)。CI值＜ 0.9指示協同藥物相互作用；0.9 ≤CI≤ 1.1反映累加作用，且CI ＞1.1指示拮抗作用。
術語「受影響分數」係指在活體外分析中受特定藥物劑量影響其生長的細胞之分數。受影響分數用於計算組合指數，如Chou及Talalay所描述。
「相關」細胞係指適合於測試所需生物作用之至少一種細胞培養物或細胞株。由於此等藥劑用作抗腫瘤劑，因此「相關」細胞係由國家癌症研究所(National Cancer Institute；NCI)/國立衛生研究院(National Institutes of Health；NIH)之發展治療計劃鑑別為適用於其抗癌藥物發現計劃的細胞株之彼等細胞。目前，DTP篩選利用60種不同的人類腫瘤細胞株。需要證實對此類細胞株中之至少一者的所需活性。
「腫瘤勻漿」係指自患者活組織切片或腫瘤之均質化產生的細胞。可由合格醫師經由標準醫學技術實現完整腫瘤或腫瘤活組織切片之提取，且可在實驗室中使用此項技術中熟知之多種方法進行將組織均質化為單一細胞。
如本文中所用，術語「捕獲劑」係指存在於脂質體之水性隔室內且用於將一或多種藥物截留且保留在脂質體內之相同位置內的化學化合物。
術語「脂質體」係指由一或多個磷脂雙層構成之球形囊泡，其與細胞膜之結構非常類似。
如本文所用之片語「單層囊泡」係指由一個脂質雙層膜構成之球形囊泡，該脂質雙層膜限定單個封閉的水性隔室。雙層膜由兩層脂質構成：內層及外層。外層中之脂質分子以其親水性頭部部分朝向外部水性環境且其疏水性尾部向下指向脂質體之內部來定向。脂質之內層直接位於外層下方，脂質以其頭部面向脂質體之水性內部且其尾部朝向脂質之外層之尾部來定向。
如本文所用之片語「多層囊泡」係指由超過一個脂質雙層膜構成之脂質體，該等膜限定超過一個封閉的水性隔室。膜同心地配置以使得不同膜由水性隔室分隔開，非常像洋蔥。
「蛋白激酶抑制劑」意謂一大類獨特且有效的抗腫瘤劑，其特異地靶向在癌細胞中改變且造成其中之一些異常生長的蛋白激酶。蛋白激酶抑制劑之作用通常為細胞抑制的，其意謂在不直接殺死細胞之情況下抑制腫瘤生長。因此，蛋白激酶抑制劑毒性較小，且在適當患者群體中，蛋白激酶抑制劑比習知化學治療劑更有效。
「釋放」意謂囊封於脂質體中之藥物穿過構成脂質體之脂質膜且接著離開至脂質體外部。
如本文所用，術語「囊封」係指包圍內相，其通常產生與外部介質分隔開之內部空腔。因此，如本文所描述「囊封」內相/內部空腔之組分。如本文所描述，被包圍或囊封之內相為脂質雙層及水相。負載至脂質體之內部空腔中且因此直至觸發脂質體釋放為止不可供外部介質使用的治療藥物之量將視為「囊封」於脂質體內。
如本文所用，片語「共囊封」及「共囊封的」係指兩種或更多種治療劑囊封於脂質體內之情況。
如本文所用，術語「被動負載」係指脂質體藥物產品製備中使用之載藥技術。在一種情形下，可藉由在脂質體形成期間囊封治療劑來實現被動負載。在另一情形下，被動負載涉及在形成脂質體之後的被動藥物平衡。
如本文所用，片語「主動負載」係指脂質體藥物產品製備中使用之載藥技術。此項技術中常用之主動負載方法包括跨膜pH梯度負載技術及過渡金屬負載技術。前者利用單陰離子或聚陰離子之銨鹽或經取代之銨鹽作為捕獲劑，該捕獲劑在囊封治療劑之前經預負載至脂質體中。基於如藉由pH梯度所測定之平衡，治療劑可「主動地」擴散至脂質體之水性隔室中，經由形成沈澱物、聚集或膠凝而與預負載捕獲劑相互作用，此用作將治療劑囊封於脂質體內部的另一驅動力。基於過渡金屬之負載技術利用過渡金屬經由錯合或配位驅動藥劑攝取至脂質體中。總體而言，與自被動負載技術獲得之囊封效率相比，藉由使用主動負載技術可實現高得多的治療劑囊封效率(例如，＞ 90%)。
術語「平均粒度」係指脂質體之平均直徑。此可藉由基於動態光散射之儀器來量測。
術語「經取代之銨」意謂銨離子中之氫原子經一或多種烷基或一些其他有機基團取代以形成經取代之銨離子。
術語「三陰性乳癌」係指一種類型之乳癌，其中癌細胞不具有雌激素或孕酮受體，且亦不產生過多的稱為人類表皮生長因子受體2 (HER2)之蛋白質。亦即，細胞對以上受體之全部三種測試均測試為「陰性」。
術語「非小細胞肺癌」(NSCLC)係指除小細胞肺癌(SCLC)以外的任何類型之上皮肺癌。最常見類型之NSCLC為鱗狀細胞癌、大細胞癌及腺癌，但存在不太頻繁出現的若干其他類型，且所有類型可以異常組織學變體出現。
術語「腎細胞癌」(RCC)係指一種起源於近曲小管內壁之腎癌，近曲小管為腎臟中輸送原尿之極小管之一部分。RCC為成年人中最常見的腎癌類型，造成大約90-95%之病例。
術語「抗藥性癌症」係指對給定治療劑展示抗性之癌症類型。當癌細胞對通常能夠將其殺死或削弱其之藥物沒有反應時，出現抗藥性。抗藥性可在給與治療之前存在(固有抗性)或可在藥物治療期間或之後出現(獲得性抗性)。在癌症治療中，存在許多可對抗癌藥物具有抗性之事物。舉例而言，DNA變化或其他遺傳變化可改變藥物進入癌細胞之方式或藥物在癌細胞內分解之方式。抗藥性導致癌症治療無法發揮功能或導致癌症復發。
術語「有效量」係指實現所需生物或治療作用所必需或足以實現所需生物或治療作用的量。
術語「治療有效量」意謂有效遞送延遲所治療之特定疾病、病症或病狀發作，抑制所治療之特定疾病、病症或病狀進展，或完全中斷所治療之特定疾病、病症或病狀，或以其他方式對待治療的個體提供所需作用所需的治療有效量之活性劑之量。如一般熟習此項技術者應理解，治療有效量隨患者之年齡、病狀及性別以及患者之疾病、病症或病狀之性質及程度而變化，且劑量可由個別醫師(或獸醫)調節。
術語「醫藥學上可接受」描述在生物學上或在其他方面非所需(亦即，不會引起不可接受水準之不合需要的生物作用或以有害方式相互作用)的材料。
術語「治療(treating)」及「治療(treatment)」或其類似術語係指逆轉、緩解、抑制或減緩此類術語適用之疾病、病症或病狀之進展，或此類疾病、病症或病狀之一或多種症狀。
本文所使用之術語「個體」或「患者」係指人類患者或哺乳動物，諸如貓、狗、牛、馬、猴或其類似者。
術語「總脂質」係指調配物中所用之全部脂質及脂質衍生物，包括磷脂(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC及DSPG)、固醇(例如，膽固醇)及與聚乙二醇結合之磷脂(例如，mPEG-DSPE)。
藉由以下實例進一步描述本發明。提供實例僅僅係為了參考特定實施例說明本發明。此等例證雖然說明本發明之某些特定實施例，但並不描繪限制或限定本發明之範疇。
以下縮寫用於本申請案： ABE：阿貝西尼 ABE-L：囊封有阿貝西尼之脂質體 ABE/SUN-L：共囊封有阿貝西尼及舒尼替尼之脂質體 AE：不良事件 AFA：阿法替尼 AFA-L：囊封有阿法替尼之脂質體 AFA/CER-L：共囊封有阿法替尼及塞利替尼之脂質體 AFA/DAS-L：共囊封有阿法替尼及達沙替尼之脂質體 AFA/NIN-L：共囊封有阿法替尼及尼達尼布之脂質體 API：活性醫藥成分 CER：塞利替尼 CER-L：囊封有塞利替尼之脂質體 Chol：膽固醇 CI：組合指數 CRI：克卓替尼 CRI-L：囊封有克卓替尼之脂質體 DAS：達沙替尼 DAS-L：囊封有達沙替尼之脂質體 DAS/CER-L：共囊封有達沙替尼及塞利替尼之脂質體 DDPC：1,2-二癸醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 DEPC：1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 DLPC：1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 DMPC：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼  DPPC：1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼  DSPC：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 DSPG：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸甘油 EDTA：乙二胺四乙酸 ED 75及ED 90：影響細胞培養物中75%及90%細胞所需的有效劑量 Fa：受影響分數 GIST：胃腸基質瘤 HBS：HEPES緩衝生理鹽水(20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4) HEPES：N-2-羥基乙基-哌𠯤-N-2-乙磺酸 HSPC：氫化L-α-磷脂醯膽鹼 LUV：大單層囊泡 MLV：多層囊泡 mPEG-2000-DSPE，鈉鹽：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉 MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-聯苯-2-H四唑鎓溴化物 NIN：尼達尼布 NIN-L：囊封有尼達尼布之脂質體 NSCLC：非小細胞肺癌 OSI：奧希替尼 OSI-L：囊封有奧希替尼之脂質體 OSI/AFA-L：共囊封有奧希替尼及阿法替尼之脂質體 OSI/CRI-L：共囊封有奧希替尼及克卓替尼之脂質體 PG：磷脂醯甘油 PSPC：1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 RCC：腎細胞癌瘤 SBE-α-CD：磺基丁醚-α-環糊精 SBE-β-CD：磺基丁醚-β-環糊精 SBE-γ-CD：磺基丁醚-γ-環糊精 SMPC：1-硬脂醯基-2-肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 SOPC：1-硬脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 SPPC：1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 SUN：舒尼替尼 SUN-L：囊封有舒尼替尼之脂質體 SUV：小單層囊泡 TEA：三乙胺 TEA-SOS：蔗糖八硫酸三乙銨 TEA-SBE-β-CD：三乙銨磺基丁醚-β-環糊精 Tris-SBE-β-CD：三(羥甲基)胺基甲烷磺基丁醚-β-環糊精
實驗方法
材料所有蛋白激酶抑制劑係購自Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA)，諸如馬來酸阿法替尼(AFA)、乙磺酸尼達尼布(NIN)、甲磺酸阿貝西尼(ABE)、蘋果酸舒尼替尼(SUN)、克卓替尼(CRI)、單水合達沙替尼(DAS)、塞利替尼(CER)、甲磺酸奧希替尼(OSI)及其他。氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(mPEG-2000-DSPE，Na鹽)及膽固醇係購自Lipoid GmbH, Germany。其他試劑係獲自Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA)。在研究期間使用之所有其他化學品均為試劑級且未經進一步純化即使用。
癌細胞株包括HT-29 (大腸直腸癌細胞株)、H1975 (非小細胞肺癌，NSCLC細胞株)、MSTO-211H (間皮瘤細胞株)、HCC827 (NSCLC細胞株)、786-O (腎細胞癌瘤細胞株)、Caki-1 (腎細胞癌瘤細胞株)及其他之所有細胞株係獲自美國典型培養物保藏中心[American Type Culture Collection；ATCC] (Manassas VA, USA)。藉由遵循供應商之建議來培養細胞。培養基補充有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青黴素G鈉及100 μg/mL硫酸鏈黴素。在37℃下在5% CO 2氛圍中培育所有細胞。
脂質體製備下文列出通用藥物脂質體製備方法。
主動載藥方法：經由主動負載製備載藥脂質體之通用步驟係如下：(1)脂質水合作用及尺寸減小；(2)滲析/緩衝液交換；(3)藉由跨膜pH梯度或過渡金屬螯合進行載藥及最後(4)調節最終載藥脂質體懸浮液之pH。舉例而言，在約50-70℃下，使mPEG-2000-DSPE (0-10%莫耳/莫耳總脂質)或DSPG (0-50%莫耳/莫耳總脂質)、膽固醇(0-60%莫耳/莫耳總脂質)及DSPC/HSPC (0-80%總脂質)溶解於乙醇中且在含有以下捕獲劑中之一者的水溶液中水合：硫酸銨、聚磷酸鹽(n＝5-18)、TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD、Tris-SBE-β-CD或過渡金屬之鹽(例如，葡糖酸銅及硫酸銅)。含有用於穩定劑之mPEG-2000-DSPE的脂質體稱為「聚乙二醇化脂質體」。含有用於穩定之DSPG的脂質體稱為「DSPG脂質體」。隨後，在劇烈攪拌下混合有機相及水相，持續大約30分鐘以允許乳化。使乳液在約50-70℃下使用聚碳酸酯膜(50-100 nm)經歷尺寸減小(例如，擠出)，以獲得所需脂質體粒度及粒度分佈(PDI)，且接著快速冷卻以產生未負載脂質體。此後，藉由在滲析膜上擴散來洗掉脂質體外部之外部捕獲劑。為將藥物負載至脂質體中，用所需緩衝溶液稀釋未負載之脂質體懸浮液。將一種或兩種藥物(例如，阿法替尼、尼達尼布、克卓替尼、阿貝西尼、舒尼替尼、奧希替尼)添加至上述未負載之脂質體懸浮液中且在高溫(50-70℃)下在平緩攪拌下使載藥進行30-45 min。此主動負載方法通常產生高於95%之藥物囊封效率。經由主動負載方法負載有化合物的脂質體之架構示於圖5 (I)中。
依序被動及主動載藥方法：可經由依序被動及主動負載方法將親水性(水溶性)藥物及親脂性(不良水溶性)藥物兩者共負載至脂質體中。具體言之，首先將親脂性化合物被動地囊封於脂質體之脂質雙層內。隨後，經由主動負載方法將親水性藥物負載至脂質體之水性核心中。如下描述製備過程之實例。首先製備脂質(例如，DSPG：0-70%莫耳/莫耳，膽固醇：0-50%莫耳/莫耳，及DSPC：0-50%莫耳/莫耳)以及親脂性蛋白激酶抑制劑(諸如，單水合達沙替尼、塞利替尼及其他)之有機溶液。以下有機溶劑可用於此類目的，例如甲醇、乙醇或甲醇/氯仿之混合物及其他。接著，有機脂質/藥物混合物溶液藉由在50-60℃之水浴中經由旋轉蒸發移除溶劑而乾燥，以形成薄膜。此後，乾燥脂質膜經含有以下捕獲劑中之一者的水溶液水合：諸如硫酸銨、TEA-SOS、Tris-SBE-β-CD及TEA-SBE-β-CD。使水合過程在劇烈攪拌下在50-70℃下進行若干小時，以形成多層囊泡(MLV)。接著，將混濁的MLV懸浮液在50-70℃下擠出或均質化，以獲得所需脂質體粒度及粒度分佈。藉由滲析擴散或其他分離方法移除外部捕獲劑及脂質體外部之未囊封藥物。接著藉由所選緩衝溶液稀釋此脂質體懸浮液且加熱至約50-70℃。隨後將水溶性激酶抑制劑(諸如阿法替尼、克卓替尼及奧希替尼等)以限定藥物與脂質比率添加至溫熱的脂質體懸浮液中且使載藥過程在50-70℃下進行30-60 min，以獲得共負載藥物脂質體。基於依序載藥方法之含有親水性化合物及親脂性化合物兩者的此類脂質體之架構示於圖5 (II)中。
被動載藥方法：可經由被動載藥方法將一或多種親脂性(不良水溶性)化合物負載至脂質體中。舉例而言，首先製備脂質(例如，DSPG：0-50%莫耳/莫耳，膽固醇：0-60%莫耳/莫耳，及DSPC：0-50%莫耳/莫耳)以及親脂性蛋白激酶抑制劑(諸如單水合達沙替尼、塞利替尼及其他)之有機溶液。以下有機溶劑可用於此類目的，例如甲醇、乙醇或甲醇/氯仿之混合物及其他。接著，脂質/藥物溶液藉由在50-60℃之水浴中經由旋轉蒸發移除溶劑而乾燥，以形成薄膜。此後，用所需緩衝溶液水合脂質膜且使水合過程在劇烈攪拌下在50-70℃下進行若干小時，以形成多層囊泡(MLV)。接著，將混濁的MLV懸浮液在50-70℃下擠出或均質化，以獲得所需脂質體粒度及粒度分佈。藉由滲析擴散或其他方法移除外部捕獲劑及脂質體外部之未囊封藥物。共負載有親脂性化合物的此類脂質體之架構示於圖5 (III)中。
脂質體之表徵 粒度及 ζ ( 澤塔 ) 電位 .使用Nano-S90 ZetaSizer (Malvern Instruments, UK)來量測脂質體藥物產品之流體動力粒度、多分散性指數(PDI)及ζ電位。在量測之前，用蒸餾水充分稀釋各樣本。
形態表徵 .低溫穿透電子顯微術(Cryo-TEM)用於使用低溫TEM-Titan Krios 80/300 Kev穿透電子顯微鏡(ThermoFisher Scientific)檢查共負載脂質體之尺寸及形態。
載藥及囊封 .脂質體產物之藥物含量(分析)係藉由將已知量之負載脂質體溶解於Triton-X100水溶液中且藉由HPLC-UV分析定量藥物含量來測定。游離藥物含量係藉由首先經由尺寸排阻層析(SEC)將游離藥物與脂質體分離，且接著藉由HPLC-UV分析定量未負載藥物含量來測定。囊封效率(EE%)係如下計算：自總藥物含量減去游離藥物含量除以總藥物含量。
活體外藥物釋放研究 .可經由基於滲析之方法來評估載藥脂質體之活體外釋放。舉例而言，首先將限定體積之脂質體產物(約1-2 mL)添加至滲析袋(分子量截止值10 kDa)中，其在pH 7.4之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)緩衝液中預水合隔夜。接著將滲析袋置放於含有150 mL PBS (pH 7.4)之玻璃儲集器中。使溶解研究在平緩攪拌下在37℃下進行。以預定時間間隔取樣釋放培養基之等分試樣(約1 mL)且儲集器補充有等體積之新鮮培養基。藉由HPLC-UV方法來測定特定化合物之藥物含量。接著基於各時間點處之釋放藥物含量來產生累積藥物釋放概況。
用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究對於組合藥物方案，視莫耳藥物比率而定，組合所涉及之兩種或更多種化合物可展現協同相互作用、累加相互作用或拮抗相互作用。為了以定量方法研究彼等藥物-藥物相互作用，在此研究中，遵循先前報導程序使用基於組合指數(CI)之方法(Chou, T.C., J. Theor. Biol. (1976) 39:253-276)。
如下簡單陳述關於細胞培養及脂質體藥物功效評估之通用方案。使用標準細胞培養技術在其對數生長期中收集黏附癌細胞株。細胞濃度係藉由血細胞計數器來測定且接著藉由其各別培養基稀釋至目標細胞濃度。接著將細胞接種至96孔盤上。培養盤上之映射經設計以包括處理組、僅細胞對照(無藥物處理)及僅培養基對照(無細胞且無藥物處理)。將細胞接種濃度最佳化，使得在細胞接種後48小時對未處理對照細胞執行之MTT分析將在590 nm處產生大約1.0之吸收值。
在藥物處理之前，將細胞接種培養盤在標準細胞培養物培育箱中在37℃及5% CO 2下培育24小時。第二天，使用各別細胞培養基製備關於單獨藥物或限定莫耳藥物比率之藥物組合的藥物稀釋液。接著96孔培養盤中之細胞培養基經含有藥物或藥物組合之新鮮培養基置換。培育另外24小時之後，遵循製造商之方案藉由MTT分析評定細胞成活力。藉由自藥物處理孔中減去藉由僅培養基孔獲得之吸光度值，且接著標準化至無藥物對照孔(僅細胞對照)來測定相對存活百分比。隨後計算各孔在各藥物濃度下之受影響細胞之分數(fa)或細胞生長抑制(%)。接著藉由用於藥物協同作用分析之軟體CompuSyn來計算且處理藥物組合之作用。計劃採用中位數效應分析演算法，其產生組合指數值作為協同作用程度之定量指標。基於此分析方法，CI＜0.9指示協同作用，範圍0.9 ≤CI≤ 1.1反映累加作用，且CI ＞1.1指示拮抗作用。CI曲線通常用表示y軸之CI與x軸上受影響細胞之比例或受影響分數(Fa)來說明。鑑別藥物組合之協同比率且接著用於未來的研究。
藉由載藥脂質體進行之活體外腫瘤細胞生長抑制為研究藉由脂質體藥物產品對細胞生長之活體外抑制，用負載組合藥物之脂質體(含有協同性藥物與藥物莫耳比)及對應負載單一藥物之脂質體兩者來處理癌細胞。如下陳述簡單實驗程序。將癌細胞以適當接種密度接種於96孔培養盤上。在藥物處理之前，將細胞接種培養盤在標準細胞培養物培育箱中在37℃及5% CO 2下培育24小時。第二天，使用各別細胞培養基製備關於脂質體藥物產品之連續稀釋液。接著96孔培養盤中之細胞培養基經含有囊封藥物之脂質體的新鮮培養基置換。在總計48小時培育之後，遵循製造商之方案藉由MTT分析評定細胞成活力。藉由自藥物處理孔中減去藉由僅培養基孔獲得之吸光度值，且接著標準化至無藥物對照孔(僅細胞對照)來測定相對存活百分比。藉由自100%減去細胞成活力%來計算細胞生長抑制百分比。
活體內功效研究 HT-29 及 H1975 異種移植模型之研發 . 使六週齡雌性BALB/c裸鼠在右側肋腹區域中皮下注射分散於100 μL PBS緩衝液中的約1×10 7個HT-29大腸直腸癌或H1975 NSCLC細胞。當腫瘤尺寸達到約150-200 mm 3時，將小鼠隨機分成6組，其中各組中有六隻小鼠(n＝6)在整個研究時段中，使小鼠保持處於20±2℃及50-60%相對濕度下。所有動物處置程序係根據由機構動物倫理委員會(Institutional Animal Ethical Committee)批准之方案。
藥物投與及腫瘤尺寸量測 .當腫瘤尺寸達至如上文所陳述之所需尺寸時，接著經由尾部靜脈靜脈內(IV)注射將以下樣本注射至攜帶腫瘤之小鼠中：(1)生理鹽水對照；(2)游離AFA溶液；(3)游離AFA/NIN組合溶液；(4)脂質體AFA (AFA-L)；(5)脂質體NIN (NIN-L)；及(6)組合AFA/NIN-L。對於各藥物調配物，採用以下劑量：7.0 mg/kg呈游離鹼形式之AFA及38.9 mg/kg呈游離鹼形式之NIN。在每兩天(Q2D)投與藥物調配物持續約20天之情況下，執行功效研究。使用測徑規在兩個維度中每週兩次量測腫瘤尺寸，且以mm 3為單位使用下式表示體積：V＝0.5 * (a) * (b 2)，其中a及b分別為腫瘤之長徑及短徑。
統計資料分析 . 藉由在p ＜ 0.05之顯著水準下進行單向ANOVA以及鄧尼特氏測試(Dunnett test)來測定在MTT分析期間且在活體內抗腫瘤研究中共負載藥物脂質體處理組與其他處理組之間的統計差異。所有觀測結果表示為平均值± SD (n＝6)。
實例提供以下實例以說明而非限制所揭示的本發明。
實例 1 阿法替尼脂質體之製備及物理表徵 藉由如實驗方法中所描述之主動載藥方法來製備阿法替尼脂質體(AFA-L)。馬來酸阿法替尼之結構展示於圖1A中。進行系統實驗以鑑別且最佳化調配物及製造過程條件(諸如脂質選擇、脂質體之組成、藥物與脂質比率、捕獲劑及過程條件等)中影響脂質體之物理化學特性(例如，脂質體粒度、粒度分佈、囊封效率、脂質體穩定性、藥物釋放概況及其他者)的主要因素。
具體言之，AFA-L係基於HSPC/mPEG-2000-DSPE/膽固醇之脂質組成使用以下捕獲劑將化合物主動地負載至脂質體中來製備：硫酸銨、TEA-SOS或TEA-S-β-CD。總體而言，聚乙二醇化AFA-L展現以下物理特性：平均粒度大約90 nm，PDI＜0.100，囊封效率(EE%) ＞95.0%及ζ-電位(表面電荷) ＜ -40 mV。使用各種捕獲劑之阿法替尼脂質體之EE%展示於圖2中。結果反映藥物與脂質比率對有效負載之EE%具有顯著影響。亦即，當比率為1:8或1:4 (w/w)時，在所有三種捕獲劑中，對於AFA-L獲得接近99%之EE。然而，當藥物與脂質重量比為1:2時，與使用之捕獲劑無關，觀察到所有脂質體之阿法替尼EE%之急劇下降。脂質與藥物比率可影響脂質體容量以及內部捕獲劑可用性，且結果指示足量之脂質對於確保可獲得高藥物囊封效率至關重要。
另外，帶負電DSPG脂質亦用於製備脂質體以供囊封阿法替尼。實驗方法中提及脂質體製造過程。具體言之，使用以下捕獲劑調配負載阿法替尼之DSPG脂質體以將有效負載主動囊封至脂質體中，亦即硫酸銨、TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD。典型的負載阿法替尼之DSPG脂質體具有以下物理參數：平均粒度大約110 nm，PDI＜0.100，囊封效率(%) ＞95.0%及ζ電位＜-30 mV。
實例 2 尼達尼布脂質體之製備及表徵 進行系統研究以鑑別和優化調配及製造過程中可能影響載藥脂質體之物理化學特性的主要因素。藉由如實驗方法中所描述之主動負載方法來製備尼達尼布脂質體(NIN-L)。乙磺酸尼達尼布之結構展示於圖1B中。圖3展示捕獲劑及藥物與脂質重量比兩者對藥物囊封效率(EE%)之影響。當使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑時，對於測試的所有藥物與脂質比率獲得高EE% (接近100%)。相比之下，當TEA-SOS及硫酸銨用作捕獲劑時，僅在1:16及1:8之藥物與脂質比率(w/w)下觀測到高EE%。當藥物與脂質比率增加至1:4時，對於具有TEA-SOS及硫酸銨之脂質體獲得EE%顯著下降。上述結果反映，在所評估之所有捕獲劑當中，TEA-SBE-β-CD對尼達尼布之囊封展示優良特性。
另外，帶負電之DSPG亦用於製備脂質體以便囊封尼達尼布。實驗部分中提及脂質體製造過程。具體言之，使用用於主動囊封有效負載之以下捕獲劑(亦即硫酸銨、TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD)調配負載尼達尼布之DSPG脂質體。典型的負載尼達尼布之DSPG脂質體具有以下物理參數：平均粒度大約120 nm，PDI ＜0.100，囊封效率(%) ＞95.0%及ζ-電位＜ -30 mV。
實例 3製備TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD捕獲劑 已知參與主動負載之捕獲劑對有效負載囊封、滯留以及其溶解概況起關鍵作用。除常用硫酸銨外，此處研究了基於聚陰離子之捕獲劑以用於囊封激酶抑制劑。參與此工作之兩種聚陰離子(亦即TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD)之結構展示於圖4中。
製備 TEA-SOS 及 TEA-SBE-β-CD ：首先使離子交換管柱裝填基於磺化聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物之陽離子交換樹脂珠粒。接著，用約1N HCl平衡樹脂，且隨後用去離子水洗滌直至溶離液之pH接近中性為止。此後，將蔗糖八硫酸鈉鹽(SOS)或SBE-β-環糊精之溶液添加至管柱中且用去離子水溶離。接著用三乙胺將溶離液滴定至pH 4.0-6.0。在一些情況下，三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)用作為滴定之基質以產生聚陰離子之Tris鹽，例如Tris-SEB-β-環糊精或Tris-SOS。
實例 4 製備阿法替尼及尼達尼布共負載脂質體 如實驗方法中所描述，經由跨膜pH梯度藉由主動負載方法製備共負載聚乙二醇化脂質體(聚乙二醇化AFA/NIN-L)。脂質組成係基於mPEG-2000-DSPE/膽固醇/DSPC或mPEG-2000-DSPE/膽固醇/HSPC。各種類型之捕獲劑用於製備此類雙重載藥脂質體，亦即硫酸銨、TEA-SBE-β-CD、Tris-SBE-β-CD、TEA-SOS、葡糖酸銅/TEOA。在載藥步驟中，將限定莫耳比之AFA及NIN (例如，1:10、1:5或1:1之AFA與NIN)引入脂質體懸浮液中。聚乙二醇化AFA/NIN-L之流程展示於圖5 (I)中。進行系統實驗以鑑別且最佳化調配物及製造過程條件(諸如脂質選擇、脂質體之組成、藥物與脂質比率、藥物與藥物莫耳比、捕獲劑及過程條件等)中影響脂質體之物理化學特性(例如，脂質體粒度、粒度分佈、囊封效率、脂質體穩定性、藥物釋放概況及其他)的主要因素。
除聚乙二醇化脂質體外，亦研發用於囊封蛋白激酶抑制劑之DSPG脂質體。在此情況下，脂質組成係基於DSPG、膽固醇及DSPC或HSPC。不同類型之捕獲劑(諸如硫酸銨)可用於囊封主動負載之藥物。詳細的脂質體製備方法描述於實驗方法部分(主動載藥方法)中。如圖5 (I)中所說明，兩種抑制劑均位於脂質體之水性核心隔室內部。
實例 5 AFA/NIN脂質體之物理化學特表徵 執行關於AFA/NIN共負載脂質體之物理化學表徵。使用以上提及之捕獲劑(實例4)的脂質體產品之藥物囊封效率概述於下表1中。如自結果所反映，除葡糖酸銅/TEOA以外之所有捕獲劑對於AFA及NIN兩者在所測試之全部三種藥物莫耳比下產生極高EE% (約99%)。當葡糖酸銅/TEOA用作捕獲劑時，獲得顯著較低的EE%。藉此，對於AFA及NIN之共囊封，結果指示，在藥物囊封方面，基於pH梯度之負載方法優於基於過渡金屬之方法。使用硫酸銨及TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑的AFA/NIN共負載聚乙二醇化脂質體之粒度及粒徑分佈分別展示於圖6及圖7中。所有組合藥物脂質體展現平均粒度大約100 nm以及多分散性(PDI) ＜0.100，此指示狹窄粒徑分佈 表 1.藥物莫耳比及捕獲劑兩者對AFA/NIN共負載聚乙二醇化脂質體之物理化學特性的影響
樣本名稱 AFA : NIN ( 莫耳比) 平均粒度(nm)/PDI EE% (NH 4) 2SO 4 EE% TEA-SBE-β-CD EE% TEA-SOS EE% Tris-SBE-β-CD EE% 葡糖酸 銅/TEOA
AFA NIN AFA NIN AFA NIN AFA NIN AFA NIN
AFA/NIN-L 1:10 110 / ＜ 0.1 99.4 100 100 99.4 99.7 100 - -
AFA/NIN-L 1:5 110 / ＜ 0.1 99.5 99.9 100 99.3 99.8 100 99.5 99.8 -
AFA/NIN-L 1:1 110 / ＜ 0.1 99.8 100 100 98.9 99.9 99.8 - 70.7 88.4
脂質與藥物莫耳比對藥物囊封效率(EE%)及粒度之影響展示於下表2中。已發現，隨著脂質與藥物莫耳比降低，AFA及NIN之EE%略微減小。但對於所研究的所有條件獲得整體高於95%之EE% (表2)。此外，觀測到脂質體粒度隨著調配物中脂質與藥物莫耳比減小而減小。 表 2.脂質與藥物重量比對具有TEA-SBE-β-CD捕獲劑之AFA及NIN共負載聚乙二醇化脂質體之囊封效率(EE%)及粒度的影響
樣本名稱 (AFA/NIN-L) AFA : NIN 莫耳比 總脂質:總藥物比率 (w/w) 平均粒度(nm) / PDI EE%
AFA NIN
1130-1 1:1 7.5:1 100 / ＜ 0.1 100 98.9
1130-2 1:5 7.3:1 100 / ＜ 0.1 100 99.3
1130-3 1:1 3.8:1 91 / ＜ 0.1 99.7 99.2
1130-4 1:5 3.6:1 92 / ＜ 0.1 99.5 99.6
1130-5 1:1 1.9:1 89 / ＜ 0.1 95.8 96.4
1130-6 1:5 1.8:1 91 / ＜ 0.1 98.0 98.7
執行低溫-TEM以觀測在AFA與NIN之1:5莫耳比下使用TEA-SOS作為捕獲劑的AFA/NIN共負載脂質體之形態。如圖8A中所展示，結果揭示脂質體在形狀上為球形且在脂質體之水性核心內部觀測到黑色條狀結構。咸信深色沈澱物係由藥物及捕獲劑形成之複合物。平均而言，自TEM揭示之粒度(80-100 nm)與藉由動態光散射發現之結果一致。彼等結果證實藥物以沈澱狀態很好地囊封在脂質體之水性核心隔室內部。
與聚乙二醇化AFA/NIN-L脂質體相比，DSPG-AFA/NIN-L脂質體之平均粒度為大約137 nm且PDI為0.099，其中在AFA:NIN藥物莫耳比1:1下具有捕獲劑硫酸銨。阿法替尼及尼達尼布在DSPG-AFA/NIN-L中之囊封效率(%)分別為68%及85%。結果反映，對於全部有效負載可獲得可接受水準之EE%，且對於兩種共負載脂質體可獲得小於150 nm之粒度與窄多分散性。然而，使用DSPG-AFA/NIN-L的EE%不如聚乙二醇化AFA/NIN-L脂質體。
實例 6 AFA/NIN-L活體外釋放及穩定性研究 藉由滲析在45℃下在加速條件下在pH 7.4 PBS緩衝溶液下執行來自AFA/NIN共負載聚乙二醇化脂質體(在1:5莫耳藥物比率下使用硫酸銨或TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之AFA/NIN-L)之藥物釋放研究。總體而言，如圖9A中所展示，自脂質體獲得AFA及NIN兩者之持續釋放概況，且AFA之釋放速率比NIN之釋放速率更快。有效負載自共負載脂質體之釋放速率類似於對應API自使用相同類型之捕獲劑的單一載藥脂質體之釋放速率，其指示將AFA及NIN共囊封至一種脂質體中不會改變其溶解概況。此外，圖9A中之結果反映，與使用硫酸銨之脂質體之滯留相比，使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之脂質體對AFA展現優良滯留。此表明AFA可具有與TEA-SBE-β-CD之較強相互作用，此產生較慢藥物釋放概況。
藉由記錄在4℃ (長期儲存條件)及25℃ (加速條件)下儲存時在45天之時段內粒度、粒度分佈(PDI)及囊封效率(EE%)之變化來評定使用硫酸銨作為捕獲劑的聚乙二醇化AFA/NIN共負載脂質體之物理穩定性。在初始、1週、4週、8週及16週儲存時獲取樣本之等分試樣且分別藉由動態光散射及HPLC分析來測定粒度表徵及EE%。表3中所示之結果指示，AFA/NIN共負載脂質體在4℃及25℃儲存條件下物理上穩定45天。 表 3.在4℃ (長期儲存)及25℃ (加速)儲存條件下聚乙二醇化AFA/NIN-L (硫酸銨用作捕獲劑)之物理穩定性
週 在 4 ℃ 下儲存 在 25 ℃ 下儲存
平均粒度(nm)/PDI 藥物含量(mg/mL) EE % 平均粒度(nm)/PDI 藥物含量(mg/mL) EE %
0 87 / ＜0.1 1.05 99.3 87 / ＜0.1 1.05 99.3
1 87 / ＜0.1 1.01 99.6 87 / ＜0.1 1.02 99.6
4 87 / ＜0.1 1.0 99.7 87 / ＜0.1 1.0 99.5
8 88 / ＜0.1 0.99 99.6. 86 / ＜0.1 0.99 99.5
16 87 / ＜0.1 0.98 99.7 87 / ＜0.1 1.0 99.7
實例 7 阿貝西尼及舒尼替尼共負載脂質體之製備及表徵 基於實驗方法(主動載藥方法)中所提及之程序來製備共負載有阿貝西尼(ABE，CDK家族抑制劑)及舒尼替尼(SUN，PDGFR α/β抑制劑)之脂質體。圖1 (C、D)中描述甲磺酸阿貝西尼及蘋果酸舒尼替尼之結構。聚乙二醇化脂質體(mPEG-2000-DSPE/膽固醇/DSPC)及DSPG脂質體(DSPG/膽固醇/DSPC)兩者用於主動載藥(參見實驗方法)。不同類型之捕獲劑用於雙重藥物囊封，亦即TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD及Tri-SBE-β-CD。在載藥步驟中，將呈限定莫耳比(例如，1:5)之ABE及SUN兩者引入脂質體懸浮液中以進行主動載藥。共負載有彼等兩種抑制劑的聚乙二醇化脂質體之流程展示於圖5 (I)中。如由流程所說明，兩種藥物均位於脂質體之水性核心隔室內部。使用不同類型之捕獲劑的單一載藥脂質體及ABE/SUN共負載脂質體兩者之物理化學表徵展示於表4中。對於所有藥物產品獲得高藥物囊封效率(＞99%)。對於所有類型之脂質體，觀測到大約100 nm之粒度與窄粒度分佈(PDI ＜ 0.1) (表4)。 表 4.關於ABE-L、SUN-L及ABE/SUN-L之聚乙二醇化脂質體的物理化學表徵
樣本名稱 莫耳比 (ABE : SUN) 捕獲劑 平均粒度 (nm) / PDI ζ 電位 (mV) EE%
ABE SUN
ABE-L-SOS - TEA-SOS 102 / 0.072 -20.6 99.8 -
SUN-L-SOS - TEA-SOS 105 / 0.083 -34.1 - 99.8
ABE/SUN-L-SOS 1:5 TEA-SOS 102 / 0.033 -36.5 99.5 99.7
ABE/SUN-L-TEA-CD 1:5 TEA-SEB-β-CD 94 / 0.047 -35.3 99.5 99.6
ABE/SUN-L-Tris-CD 1:5 Tris-SEB-β-CD 98 / 0.050 -35.8 99.8 99.2
亦研究ABE/SUN共負載聚乙二醇化脂質體之溶解概況。如圖9B中所示，不論所採用之捕獲劑如何，ABE之釋放速率比SUN之釋放速率更慢。此外，對於相同藥物，與來自使用Tris-SBE-β-CD之脂質體的藥物釋放速率相比，使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之脂質體展現更慢的藥物釋放速率。結果指示，捕獲劑中之聚陰離子之相對離子在控制藥物釋放速率方面起重要作用，且就將藥物保留在脂質體內而言，TEA優於Tris。
除聚乙二醇化脂質體外，亦研發用於囊封蛋白激酶抑制劑之DSPG脂質體。在此情況下，脂質組成係基於DSPG、膽固醇及DSPC或HSPC。不同類型之捕獲劑(諸如硫酸銨)可用於囊封主動負載之藥物。詳細的脂質體製備方法描述於實驗方法部分(主動載藥方法)中。如圖5 (I)中所說明，兩種抑制劑均位於脂質體之水性核心隔室內部。與聚乙二醇化ABE/SUN-L脂質體相比，DSPG-ABE/SUN-L脂質體之平均粒度為大約149 nm且PDI為0.166，其中在ABE:SUN藥物莫耳比1:1下具有捕獲劑硫酸銨。阿貝西尼及舒尼替尼在DSPG-ABE/SUN-L中之囊封效率(%)分別為91%及85%。結果反映，對於全部有效負載可獲得可接受水準之EE%，且對於兩種共負載脂質體可獲得大約150 nm之平均粒度與窄多分散性。然而，藉由DSPG-ABE/SUN-L的EE%不如用聚乙二醇化AFA/NIN-L脂質體的EE%好。
實例 8 阿法替尼及克卓替尼共負載脂質體之製備及表徵 基於實驗方法(主動載藥方法)中所提及之程序來製備共負載有阿法替尼(AFA，EGFR抑制劑)及克卓替尼(CRI，ALK抑制劑)之脂質體。二順丁烯二酸阿法替尼及克卓替尼之結構描述於圖1 (A及E)中。聚乙二醇化脂質體(mPEG-2000-DSPE/膽固醇/DSPC)及DSPG脂質體(DSPG/膽固醇/DSPC)兩者用於主動負載雙重藥物(參見實驗方法)。不同類型之捕獲劑用於雙重藥物囊封，亦即TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD及Tri-SBE-β-CD。在載藥步驟中，將呈限定莫耳比(例如，1:1)之AFA及CRI兩者引入脂質體懸浮液中以進行主動載藥。共負載有彼等兩種抑制劑的聚乙二醇化脂質體之流程展示於圖1 (I)中。如由流程所說明，兩種抑制劑均位於脂質體之水性核心隔室內部。關於單一載藥脂質體及AFA/CRI共負載聚乙二醇化脂質體兩者之物理化學表徵的結果概述於表5中。資料反映，對於所評估之所有捕獲劑，兩種抑制劑高效地囊封於脂質體中(＞ 99% EE%)。AFA/CRI共負載脂質體之平均粒度為大約100 nm，且獲得窄粒徑分佈(PDI ＜ 0.1)。 表 5.關於AFA-L、CRI-L及AFA/CRI-L之聚乙二醇化脂質體的物理化學表徵
樣本名稱 莫耳比 AFA : CRI 捕獲劑 平均粒度 (nm) / PDI ζ 電位 (mV) EE%
AFA AFA
AFA-L-SOS - TEA-SOS 110 / 0.103 -25.7 96.8 -
CRI-L-SOS - TEA-SOS 112 / 0.035 -36.5 - 99.8
AFA/CRI-L-SOS 1:1 TEA-SOS 105 / 0.043 -45.4 99.5 99.6
AFA/CRI-L- Tris-CD 1:1 Tris-SEB-β-CD 98 / 0.049 -42.8 99.4 99.7
AFA/CRI-L-TEA-CD 1:1 TEA-SEB-β-CD 94 / 0.033 -44.6 99.8 99.6
亦研究ABE/CRI共負載聚乙二醇化脂質體之溶解概況。如圖9C中所展示，資料反映，在固定脂質組成下，AFA及CRI展現類似的釋放速率。對於相同藥物，與其中DSPC含量為68% (w)之脂質組成相比，包括高DSPC含量74% (w)之脂質組成顯著減緩藥物釋放速率。結果指示，形成雙層之脂質DSPC之含量在脂質體內之藥物滯留方面起重要作用。
實例 9 奧希替尼及阿法替尼共負載聚乙二醇化脂質體之製備及表徵 基於實驗方法(主動載藥方法)中所提及之程序來製備共負載有兩種EGFR靶向激酶抑制劑奧希替尼(OSI)及阿法替尼(AFA)之脂質體。甲磺酸奧希替尼及二順丁烯二酸阿法替尼之化學結構分別展示於圖1F及圖1A中。聚乙二醇化脂質體調配物(mPEG-2000-DSPE/膽固醇/DSPC)用於脂質體製備。共負載有彼等兩種抑制劑的聚乙二醇化脂質體之流程展示於圖1 (I)中。四種不同類型之捕獲劑用於共負載脂質體中之每一者，包括硫酸銨、Tris-SBE-β-CD、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS。在載藥步驟中，將呈限定莫耳比(例如，1:1)之OSI及AFA兩者引入脂質體懸浮液中以進行主動載藥。如由流程所說明，兩種抑制劑均位於脂質體之水性核心隔室內部。共負載脂質體及其對應單一載藥脂質體之物理化學特性展示於表6中。如自結果所反映，OSI/AFA共負載脂質體對於所採用之所有捕獲劑的兩種有效負載展現極高囊封效率。對於所有脂質體，載藥脂質體之粒度範圍為大約100 nm，具有低多分散性指數(PDI ＜ 0.1)。 表 6.關於OSI-L、AFA-L及OSI/AFA-L之聚乙二醇化脂質體的物理化學表徵
樣本名稱 莫耳比 (OSI : AFA) 捕獲劑 平均粒度 (nm) / PDI ζ 電位 (mV) EE%
OSI OSI
OSI-L - TEA-SOS 106 / 0.068 -24.6 100 -
AFA-L - TEA-SOS 110 / 0.103 -25.7 - 96.8
OSI/AFA-L-SOS 1:1 TEA-SOS 107 / 0.045 -34.9 99.9 99.7
OSI/AFA-L-Tris-CD 1:1 Tris-SEB-β-CD 97 / 0.075 -33.6 94.6 94.9
OSI/AFA-L-TEA-CD 1:1 TEA-SEB-β-CD 92 / 0.069 -35.9 99.9 99.8
OSI/AFA-L-AS 1:1 (NH 4) 2SO 4 113 / 0.060 -15.8 99.8 99.7
進行低溫TEM以觀測在OSI與AFA莫耳比為1:1之情況下OSI/AFA共負載聚乙二醇化脂質體之形態。TEA-SOS用作此脂質體藥物產品之捕獲劑。如自TEM影像揭示(圖8B)，在脂質體之水性核心中形成圓形及不同的藥物沈澱物。來自TEM表徵之結果證實抑制劑成功地囊封於脂質體內。
實例 10 奧希替尼及克卓替尼共負載聚乙二醇化脂質體之製備及表徵 基於實驗方法(主動載藥方法)中所提及之程序來製備共負載有EGFR抑制劑奧希替尼(OSI)及ATK抑制劑克卓替尼(CRI)之脂質體。具有mPEG-2000-DSPE/膽固醇/DSPC之脂質組成的聚乙二醇化脂質體調配物用於脂質體製備。四種不同類型之捕獲劑用於主動載藥，包括硫酸銨、Tris-SBE-β-CD、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS。在載藥步驟中，將呈限定莫耳比(例如1:1)之OSI及CRI兩者引入脂質體懸浮液中以進行主動載藥。共負載有彼等兩種抑制劑的聚乙二醇化脂質體之流程展示於圖5 (I)中。如由流程所說明，兩種抑制劑均位於脂質體之水性核心隔室內部。此等共負載藥物脂質體之物理化學特性展示於表7中。如自結果所反映，OSI/CRI共負載脂質體對於除Tris-SBE-β-CD以外的所採用之所有捕獲劑的兩種有效負載展現極高囊封效率。對於所有共負載脂質體，載藥脂質體之粒度範圍為大約100 nm，具有低多分散性指數(PDI ＜ 0.1)。 表 7.關於OSI-L、CRI-L及OSI/CRI-L之聚乙二醇化脂質體的物理化學表徵
樣本名稱 莫耳比 (OSI:CRI) 捕獲劑 平均粒度 (nm) / PDI ζ 電位 (mV) EE%
OSI OSI
OSI-L - TEA-SOS 106 / 0.068 -24.6 100 -
CRI-L - TEA-SOS 112 / 0.035 -36.5 - 99.8
OSI/CRI-L- SOS 1:1 TEA-SOS 110 / 0.089 -40.8 99.5 99.4
OSI/CRI-L- Tris-CD 1:1 Tris-SEB-β-CD 99 / 0.116 -36.7 87.4 78.9
OSI/CRI-L- TEA-CD 1:1 TEA-SEB-β-CD 98 / 0.098 -35.9 99.9 99.1
OSI/CRI-L-AS 1:1 (NH 4) 2SO 4 111 / 0.082 -14.7 99.1 85.7
實例 11 達沙替尼及阿法替尼共負載DSPG脂質體之製備及表徵 如圖5 (II)中所展示之雙重藥物囊封之情境II所說明，不良水溶性親脂性蛋白激酶抑制劑可首先經由被動負載囊封於脂質雙層內，且隨後另一水溶性(親水性)蛋白激酶抑制劑主動負載於脂質體之水性核心內部。當前實例描述基於依序被動及主動負載方法將達沙替尼(DAS，不良水溶性)及阿法替尼(AFA，水溶性)負載至脂質體中。詳細的製備過程提供於實驗方法(依序被動及主動載藥方法)中。表8中之結果顯示所得AFA/DAS脂質體之物理化學特性。脂質體組合物係基於DSPG/膽固醇/DSPC。最終載藥脂質體中之DAS與AFA莫耳比為3.0。將樣本儲存在2-8℃下以監測短期穩定性研究且結果展示於圖10中。資料反映，AFA/DAS-L脂質體產物在冷藏條件下為物理上穩定的。 表 8.AFA-L、DAS-L及AFA/DAS-L之DSPG脂質體之物理化學特
樣本名稱 捕獲劑 平均粒度(nm) / PDI AFA : DAS 莫耳比
AFA-L TEA-SBE-β-CD 134 / 0.043 -
DAS-L - 134 / 0.193 -
AFA/DAS-L TEA-SBE-β-CD 130 / 0.213 1 : 3
實例 12 達沙替尼及塞利替尼DSPG共負載脂質體之製備及表徵 如圖5 (III)中所展示之雙重藥物囊封之情形III所說明，兩種不良水溶性(親脂性)蛋白激酶抑制劑可經由被動載藥方法共負載至脂質體之脂質雙層中。當前實例描述基於實驗方法(被動載藥方法)中提及之程序將塞利替尼(CER)及達沙替尼(DAS)囊封至脂質體中。DAS/CER共負載脂質體之物理化學特性展示於表9中。囊封DAS與囊封CER在共負載脂質體中之最終比率為1.8:1 (mol:mol)。將樣本儲存於冰箱中以監測短期穩定性研究。如圖11中所展示，在研究時間框內，DAS/CER共負載脂質體在2-8℃下為物理上穩定的。 表 9.共負載有DAS/CER之DSPG脂質體之物理化學特性
樣本名稱 平均粒度 (nm) / PDI 莫耳比 DAS : CER
CER-L 156 / 0.152 n/a
DAS-L 124 / 0.217 n/a
DAS/CER-L 105 / 0.193 1.8 : 1
CryoTEM用於觀測以1.8:1之莫耳藥物比率共負載有DAS/CER的DSPG脂質體之形態。如圖8C中所展示，觀測到具有單層結構之脂質體，且脂質體之中央水性核心為空的。結果指示，不良水溶性化合物(DAS及CER)兩者囊封於脂質體之脂質層內。
實例 13 關於阿法替尼及尼達尼布之組合在癌細胞中之協同作用的活體外評估 對於藥物組合方案，兩種或更多種藥物可展現協同、累加或拮抗相互作用。為鑑別具有協同作用的阿法替尼與尼達尼布(AFA/NIN)之莫耳比，活體外測試AFA/NIN之各種藥物與藥物(drug-to-drug)比率在癌細胞株中之細胞毒性作用。在以下癌細胞株中以10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5及1:10莫耳比使用AFA/NIN執行細胞毒性作用之量測：HT-29大腸直腸癌、A-549非小細胞株癌症(NSCLC)、MCF-7乳癌、H1975 NSCLC及HCC827 NSCLC。包括來自在對應細胞株中僅AFA及僅NIN之處理的細胞毒性作用作為對照。
關於細胞培養、藥物處理、用於細胞毒性量測之MTT分析的詳細程序描述於實驗方法部分(用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究)中。基於活體外功效結果，接著使用基於劑量效應分析之Chou及Talalay之理論的軟體CompuSyn測定各阿法替尼/尼達尼布劑量之組合指數。在此理論中，『中位數效應方程式』用於計算在此項技術中廣泛使用之多種生物化學方程式。此方程式之推導已產生更高階的方程式，諸如用於計算組合指數(CI)之方程式。如先前所提及，CI可用於確定在各種比率下超過一種藥物之組合是否為拮抗的(CI＞1.1)、累加的(0.9≤CI≤1.1)或協同的(CI＜0.9)。表10展示藉由用於所測試之各癌細胞株之CI方法所鑑別的協同AFA/NIN莫耳比。基於隨在HT-29大腸直腸癌及H1975 NSCLC細胞株中評估的AFA/NIN之組合之細胞生長抑制(%)變化的CI值之代表性曲線分別展示於圖12及圖13中。彼等協同藥物比率接著用於脂質體藥物產品調配物以靶向特定癌細胞。 表 10.針對阿法替尼及尼達尼布之組合鑑別的對各種類型之癌細胞株的協同藥物莫耳比
藥物組合 癌細胞株 協同藥物莫耳比 (AFA : NIN)
AFA + NIN HT-29大腸直腸 2.5:1、1:1、1:2.5及1:5
A-549 NSCLC 1:1及1:5
MCF-7乳癌 1:1
H1975 NSCLC 5:1、1:1、1:2.5及1:5
HCC827 NSCLC 1:2.5及1:5
實例 14 關於阿貝西尼及舒尼替尼之組合在癌細胞中之協同作用的活體外評估 為鑑別具有協同作用的阿貝西尼與舒尼替尼(ABE/SUN)之莫耳比，活體外測試ABE/SUN之各種藥物與藥物比率在癌細胞株中之細胞毒性作用。在以下癌細胞株中以10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5及1:10莫耳比使用ABE/SUN執行細胞毒性作用之量測：HT-29大腸直腸癌、A-549非小細胞株癌症(NSCLC)、786-O腎細胞癌瘤(RCC)及Caki-1 RCC。包括來自在對應細胞株中僅ABE及僅SUN之處理的細胞毒性作用作為對照。
關於細胞培養、藥物處理、用於細胞毒性量測之MTT分析及CI值計算的詳細程序描述於實驗方法部分(用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究)中。表11展示藉由用於所測試之各癌細胞株之CI方法所鑑別的協同ABE/SUN莫耳比。基於隨在786-O RCC及Caki-1 RCC中評估的ABE/SUN之組合之細胞生長抑制(%)變化的CI值之代表性曲線分別展示於圖14及圖15中。彼等經鑑別協同藥物比率接著用於脂質體藥物產品調配物以靶向特定癌細胞。 表 11.針對阿貝西尼及舒尼替尼之組合鑑別的對各種類型之癌細胞株的協同藥物莫耳比
藥物組合 癌細胞株 協同藥物莫耳比 (ABE : SUN)
ABE + SUN HT-29大腸直腸 1:5
A-549 NSCLC 1:5及1:10
786-O RCC 5:1
Caki-1 RCC 1:5
實例 15 關於阿法替尼及克卓替尼的之組合在癌細胞中之協同作用的活體外評估 為鑑別具有協同作用的阿法替尼與克卓替尼(AFA/CRI)之莫耳比，活體外測試AFA/CRI之各種藥物與藥物比率在癌細胞株中之細胞毒性作用。在以下癌細胞株中以10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5及1:10莫耳比使用AFA/CRI執行細胞毒性作用之量測：MSTO-211H間皮瘤及H1975 NSCLC。包括來自在對應細胞株中僅AFA及僅CRI之處理的細胞毒性作用作為對照。
用於細胞培養、藥物處理、用於細胞毒性量測之MTT分析及CI值計算的詳細程序描述於實驗方法部分(用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究)中。表12展示藉由用於所測試之各癌細胞株之CI方法所鑑別的協同AFA/CRI莫耳比。基於隨在MSTO-211H間皮瘤及H1975 NSCLC細胞株中評估的AFA/CRI之組合之細胞生長抑制(%)變化的CI值之代表性曲線分別展示於圖16及圖17中。彼等經鑑別協同藥物比率接著用於脂質體藥物產品調配物以靶向特定癌細胞。 表 12.針對阿法替尼及克卓替尼之組合鑑別的對各種類型之癌細胞株的協同藥物莫耳比
藥物組合 癌細胞株 協同藥物莫耳比 (AFA : CRI)
AFA + CRI MSTO-211H間皮瘤 1:1
H1975 NSCLC 5:1, 2.5:1及1:1
實例 16 關於奧希替尼及阿法替尼的組合在癌細胞中之協同作用的活體外評估 為鑑別具有協同作用的奧希替尼與阿法替尼(OSI/AFA)之莫耳比，活體外測試OSI/AFA之各種藥物與藥物比率在癌細胞株中之細胞毒性作用。在以下癌細胞株中以10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5及1:10莫耳比使用OSI/AFA執行細胞毒性作用之量測：H1975 NSCLC及HCC827 NSCLC。包括來自在對應細胞株中僅OSI及僅AFA之處理的細胞毒性作用作為對照。
用於細胞培養、藥物處理、用於細胞毒性量測之MTT分析及CI值計算的詳細程序描述於實驗方法部分(用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究)中。表13展示藉由用於所測試之各癌細胞株之CI方法所鑑別的協同OSI/AFA莫耳比。基於隨在H1975 NSCLC及HCC827細胞株中評估的OSI/AFA之組合之細胞生長抑制(%)變化的CI值之代表性曲線分別展示於圖18及圖19中。彼等經鑑別協同藥物比率接著用於脂質體藥物產品調配物以靶向特定癌細胞。 表 13.針對奧希替尼及阿法替尼之組合鑑別的對各種類型之癌細胞株的協同藥物莫耳比
藥物組合 癌細胞株 協同藥物莫耳比 (OSI : AFA)
OSI + AFA H1975 NSCLC 5:1、2.5:1、1:1及2.5:1
HCC827 NSCLC 5:1及1:1
實例 17 關於奧希替尼及克卓替尼之組合在癌細胞中之協同作用的活體外評估 為鑑別具有協同作用的奧希替尼與克卓替尼(OSI/CRI)之莫耳比，活體外測試OSI/CRI之各種藥物與藥物比率在癌細胞株中之細胞毒性作用。在以下癌細胞株中以10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5及1:10莫耳比使用OSI/CRI執行細胞毒性作用之量測：H1975 NSCLC及HCC827 NSCLC。包括來自在對應細胞株中僅OSI及僅CRI之處理的細胞毒性作用作為對照。
用於細胞培養、藥物處理、用於細胞毒性量測之MTT分析及CI值計算的詳細程序描述於實驗方法部分(用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究)中。表14展示藉由用於所測試之各癌細胞株之CI方法所鑑別的協同OSI/CRI莫耳比。基於隨在H1975 NSCLC及HCC827細胞株中評估的OSI/CRI之組合之細胞生長抑制(%)變化的CI值之代表性曲線分別展示於圖20及圖21中。彼等經鑑別協同藥物比率接著用於脂質體藥物產品調配物以靶向特定癌細胞。 表 14.針對奧希替尼及克卓替尼之組合鑑別的對各種類型之癌細胞株的協同藥物莫耳比
藥物組合 癌細胞株 協同藥物莫耳比 (OSI : CRI)
OSI + CRI H1975 NSCLC 5:1及1:2.5
HCC827 NSCLC 1:5及1:2.5
實例 18 關於阿法替尼及達沙替尼之組合在癌細胞中之協同作用的活體外評估 為鑑別具有協同作用的阿法替尼與達沙替尼(AFA/CRI)之莫耳比，活體外測試AFA/DAS之各種藥物與藥物比率在癌細胞株中之細胞毒性作用。在以下癌細胞株中以10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5及1:10莫耳比使用AFA/DAS執行細胞毒性作用之量測：MSTO-211H間皮瘤、H1975 NSCLC及HCC827 NSCLC。包括來自在對應細胞株中僅AFA及僅DAS之處理的細胞毒性作用作為對照。
用於細胞培養、藥物處理、用於細胞毒性量測之MTT分析及CI值計算的詳細程序描述於實驗方法部分(用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究)中。表15展示藉由用於所測試之各癌細胞株之CI方法所鑑別的協同AFA/DAS莫耳比。基於隨在H1975 NSCLC及HCC827細胞株中評估的AFA/DAS之組合的細胞生長抑制(%)變化的CI值之代表性曲線分別展示於圖22及圖23中。彼等經鑑別協同藥物比率接著用於脂質體藥物產品調配物以靶向特定癌細胞。 表 15.針對阿法替尼及達沙替尼之組合鑑別的對各種類型之癌細胞株的協同藥物莫耳比
藥物組合 癌細胞株 協同藥物莫耳比 (AFA : DAS)
AFA + DAS MSTO-211H間皮瘤 1:1、2.5:1及5:1
H1975 NSCLC 5:1及1:2.5
HCC827 NSCLC 1:5及1:2.5
實例 19 關於達沙替尼及塞利替尼的組合在癌細胞中之協同作用的活體外評估 為鑑別具有協同作用的達沙替尼與塞利替尼(DAS/CER)之莫耳比，活體外測試DAS/CER之各種藥物與藥物比率在癌細胞株中之細胞毒性作用。在以下癌細胞株中以10:1、5:1、2.5:1、1:1、1:2.5、1:5及1:10莫耳比使用DAS/CER執行細胞毒性作用之量測：H1975 NSCLC及HCC827 NSCLC。包括來自在對應細胞株中僅DAS及僅CER之處理的細胞毒性作用作為對照。
用於細胞培養、藥物處理、用於細胞毒性量測之MTT分析及CI值計算的詳細程序描述於實驗方法部分(用於藥物協同作用測定之活體外細胞毒性研究)中。表16展示藉由用於所測試之各癌細胞株之CI方法所鑑別的協同DAS/CER莫耳比。基於隨在H1975 NSCLC及HCC827細胞株中評估的DAS/CER之組合的細胞生長抑制(%)變化的CI值之代表性曲線分別展示於圖24及圖25中。彼等經鑑別協同藥物比率接著用於脂質體藥物產品調配物以靶向特定癌細胞。 表 16.針對達沙替尼及塞利替尼之組合鑑別的對各種類型之癌細胞株的協同藥物莫耳比
藥物組合 癌細胞株 協同藥物莫耳比 (DAS : CER)
DAS + CER H1975 NSCLC 5:1、1:1、1:2.5、1:5
HCC827 NSCLC 5:1, 2.5:1
實例 20 藉由阿法替尼/尼達尼布共負載脂質體進行之活體外腫瘤細胞生長抑制 活體外研究藉由共負載有兩種激酶抑制劑(例如，AFA/NIN-L)之脂質體及對應單一載藥脂質體兩者(例如，AFA-L及NIN-L)進行之癌細胞生長抑制。用於此研究中之所有載藥脂質體經聚乙二醇化，且TEA-SOS用作用於所有藥物產品之捕獲劑。
簡單實驗程序係陳述如下：以適當接種密度將癌細胞接種於96孔培養盤上。在藥物處理之前，將細胞接種培養盤在標準細胞培養物培育箱中在37℃及5% CO 2下培育24小時。第二天，使用各別細胞培養基製備關於脂質體藥物產品之連續稀釋液。接著96孔培養盤中之細胞培養基經含有脂質藥物之新鮮培養基置換。在總計48小時培育之後，遵循製造商之方案藉由MTT分析評定細胞成活力。藉由自藥物處理孔中減去僅培養基孔獲得之吸光度值，且接著標準化至未處理對照孔(僅細胞對照)來測定相對存活百分比。藉由自100%減去細胞成活力%來計算細胞生長抑制百分比。
AFA/NIN脂質體藥物產品之細胞生長抑制展示於表17中。總體而言，雙重載藥脂質體在其協同比率下之細胞生長抑制能力顯著大於各囊封藥物僅以累加方式對其活性作出貢獻時所預期的細胞生長抑制能力。具體言之，在2.34 µM之總藥物濃度下，AFA/NIN-L之細胞生長抑制為59%。相比之下，在0.39 µM及1.95 µM之濃度下，AFA-L及NIN-L之對應細胞生長抑制分別為37%及3%，基於累加計算得到僅40%之總抑制。因此，藉由藥物組合方法功效增加50%。總體而言，上述結果顯示，當採用相同藥物比率時，實例13中所示的基於AFA/NIN之游離藥物組合之協同作用可良好地轉化成雙重載藥脂質體。 表 17.藉由AFA/NIN共負載脂質體(AFA/NIN-L)對H1975 NSCLC細胞之活體外細胞生長抑制
樣本名稱 細胞株 劑量 細胞生長抑制(%)
AFA-L H1975 NSCLC 0.39 µM 37%
NIN-L 1.95 µM 3%
AFA/NIN-L (1:5莫耳比) 2.34 µM 59%
實例 21 藉由阿法替尼/達沙替尼共負載脂質體進行之活體外腫瘤細胞生長抑制 活體外研究藉由共負載有兩種激酶抑制劑(例如，AFA/DAS-L)之脂質體及對應單一載藥脂質體兩者(例如，AFA-L及DAS-L)進行之癌細胞生長抑制。用於此研究之所有載藥脂質體為DSPG脂質體，且TEA-SBE-β-CD用作捕獲劑。
實例20中提及關於細胞培養、脂質體藥物產品處理及藉由MTT分析定量細胞生長抑制的方法。AFA/DAS脂質體藥物產品之細胞生長抑制展示於表18中。總體而言，雙重載藥脂質體在其協同比率下之細胞生長抑制能力顯著大於各囊封藥物僅以累加方式對其活性作出貢獻時所預期的細胞生長抑制能力。具體言之，在34 nM之總藥物濃度下，AFA/DAS-L之細胞生長抑制為88%。相比之下，在24 nM及10 nM之濃度下，AFA-L及DAS-L之對應細胞生長抑制分別為3%及33%，基於累加計算得到僅36%之總抑制。因此，藉由藥物組合方法功效增加2.4倍。總體而言，上述結果顯示，當採用相同藥物比率時，實例18中所示的基於AFA/DAS之游離藥物組合之協同作用可良好地轉化成雙重載藥脂質體調配物。 表 18.藉由共負載脂質體(AFA/DAS-L)對HCC827 NSCLC細胞之活體外細胞生長抑制
樣本名稱 細胞株 劑量 細胞生長抑制(%)
AFA-L HCC827 NSCLC 24 nM 3%
DAS-L 10 nM 33%
AFA/DAS-L (2.6:1莫耳比) 34 nM 88%
實例 22 關於共負載聚乙二醇化AFA/NIN脂質體之活體內藥物動力學研究 在BALB/c裸鼠中進行游離阿法替尼及尼達尼布組合(資料未展示)及AFA/NIN-L (1:5 AFA:NIN莫耳比)之活體內藥物動力學研究。具有用作捕獲劑之TEA-SOS的聚乙二醇化AFA/NIN-L之製備描述於實驗方法部分中。經由尾部靜脈將阿法替尼及尼達尼布游離藥物混合液以及莫耳比為1:5之聚乙二醇化AFA/NIN-L之混合物靜脈內投與至小鼠且隨時間推移監測AFA及NIN兩者之血漿濃度。所有藥物調配物之劑量為7.0 mg/kg阿法替尼游離鹼(10.3 mg/kg二順丁烯二酸阿法替尼)及38.9 mg/kg尼達尼布游離鹼(46.8 mg/kg甲磺酸尼達尼布)。在靜脈內投與之後，在多個時間點處藉由心臟穿刺收集血液(3隻小鼠/時間點)且將其置放於經EDTA塗佈之微容器中。將樣本離心以分離血漿，且將血漿轉移至另一管中。接著，用LC-MS定量AFA及NIN血漿水準。接著根據所量測之AFA及NIN血漿水準計算PK參數。
pK研究結果揭示，游離AFA及游離NIN藥物溶液在IV投與之後快速消除，且難以測定游離AFA及游離NIN之半衰期(T 1/2)值。與游離藥物溶液相比，AFA及NIN在聚乙二醇化AFA/NIN-L中之PK概況展示延長的循環時間(圖26A)。兩種藥物在AFA/NIN-L脂質體中之曲線下面積(Area Under Curve；AUC)比游離藥物溶液中之彼等AUC增加＞ 700 (AFA)及＞ 350 (NIN)倍。聚乙二醇化AFA/NIN-L脂質體中兩種藥物之最大滯留時間(Maximum Retention Time；MRT)亦比游離藥物溶液中之彼等MRT增加＞ 4.5 (AFA)及6 (NIN)倍。此等PK結果顯示，與AFA及NIN之游離藥物相比，共負載AFA/NIN-L脂質體顯著延長藥物滯留且在小鼠展現AFA及NIN之血漿藥物水準大量增加。另外，注意到，AFA/NIN-L脂質體藥物產品在上文提及的藥物劑量下經小鼠良好耐受且在此PK研究中未觀測到不良事件。
另外，亦可在不同時間點處測定血漿中之AFA與NIN之莫耳比。圖26B展示靜脈內投與至小鼠之後在總計48小時內血漿中AFA/NIN之莫耳比。結果反映，來自脂質體調配物之AFA與NIN之莫耳比在48小時之時程內極好地維持處於其初始進料水準。相比之下，對於游離藥物混合液組，觀測到藥物莫耳比與初始進料之較大偏差(以莫耳計，AFA:NIN＝1:5) (資料未示出)。如實例13中所論述，維持在5:1至1:5之範圍內的AFA:NIN之莫耳比在HT-29癌細胞株及H-1975癌細胞株兩者中展現協同細胞生長抑制作用。因此，PK研究之結果顯示，經適當設計之脂質體調配物可在較長時間段內維持協同藥物莫耳比。此外，LC-MS分析指示，循環脂質體藥物調配物含有完整的藥物且對於任一化合物，未觀測到阿法替尼與尼達尼布之間的降解及交叉相互作用之證據。
實例 23 攜帶H1975 NSCLC異種移植腫瘤之小鼠的活體內腫瘤消退 在攜帶H1975異種移植腫瘤之小鼠中評估AFA/NINL抑制NSCLC癌症之潛能。為使藥物組合之治療性活性最大化且為捕獲活體外細胞株研究觀測到之協同益處，需要將藥物組合以協同藥物與藥物比率遞送至腫瘤部位。出於此目的，研發出以已知在H1975 NSCLC細胞中具有協同作用之固定比率含有AFA及NIN的脂質體調配物(實例4)。接著在H1975 NSCLC模型中活體內評估此調配物之抗腫瘤活性。具有TEA-SOS作為捕獲劑的以協同莫耳比1:5共囊封有AFA及NIN之聚乙二醇化脂質體用於此研究。
實驗方法部分(活體內功效研究)中提及腫瘤細胞接種及腫瘤異種移植建立。將小鼠組織成由生理鹽水對照組及藥物處理組組成之適當處理組，包括(1)游離AFA，(2) AFA-L，(3) NIN-L，(4) AFA/NIN混合游離藥物混合液溶液(AFA:NIN莫耳比為1:5)，及(5) AFA/NIN-L (AFA:NIN莫耳比為1:5)。使小鼠靜脈內注射所需體積之樣本，以基於各個別小鼠之體重每兩天向動物投與目標劑量(7.0 mg/kg AFA游離鹼、38.9 mg/kg NIN游離鹼)持續總共27天。隨時間推移量測且監測腫瘤體積及小鼠重量。
如圖27A中所展示，一般而言，與在攜帶腫瘤之生理鹽水對照組以及其他藥物處理組(包括游離AFA藥物、AFA-L單藥療法、NIN-L單藥療法及組合游離AFA/NIN混合液溶液)中觀測到的彼等腫瘤生長相比，共負載脂質體(AFA/NIN-L)在27天處理之後顯著抑制腫瘤生長。對於對照、游離AFA及AFA-L組，平均腫瘤尺寸(n=6)在完整時程之治療之後顯著增加(＞15倍)。此暗示游離阿法替尼在此特定細胞株中不具有任何抑制，此可能歸因於其對阿法替尼之抗性。對於游離AFA/NIN組合混合液及NIN-L組，平均腫瘤尺寸在20天處理之後分別增加約170%及47%。相比之下，自AFA/NIN-L處理之小鼠中觀測到腫瘤體積之顯著減小，此對應於在相同時段之處理之後的10%尺寸減小。
另外，與來自對照之小鼠相比，所有藥物處理組未引起小鼠體重之顯著減低(圖27B)。因此，結果指示所有藥物治療組均不存在全身性毒性。然而，觀測到對於藉由AFA/NIN游離藥物混合液處理之組，小鼠尾部之注射部位腫脹且發紅。相比之下，脂質體調配物(亦即AFA-L、NIN-L及AFA/NIN-L)不對注射部位會造成任何損害。因此，吾人可推斷，藉由脂質體囊封保護小鼠在注射部位處免受與AFA及NIN相關之毒性。來自對照(未處理)及所有藥物處理小鼠的剝離H1975異種移植腫瘤塊之照片呈現於圖27C中。自藉由AFA/NIN游離藥物混合液、NIN-L及AFA/NIN-L處理之小鼠中觀測到顯著的腫瘤尺寸減小且在AFA/NIN-L ＞ NIN-L ＞ AFA/NIN游離藥物混合液之次序中觀測到此類減小之程度。相比之下，自未處理對照組、游離AFA及AFAL處理組觀測到顯著更大的腫瘤尺寸，且在彼等三個組當中不存在顯著的腫瘤尺寸差異。此等結果指示，與其他藥物調配物相比，AFA/NIN-L展現顯著改良的抗腫瘤活性。
不受理論束縛，咸信AFA/NIN-L對腫瘤生長之此抑制歸因於奈米級脂質體調配物之增強的滲透性及滯留(EPR)作用，其可改良腫瘤部位中之藥物遞送特異性。因此，關於游離藥物混合液與脂質體藥物組合之間的功效的比較反映，藉由當前脂質體調配物實現之優良生物分佈可產生更高效的腫瘤抑制。有趣的發現，藉由AFA游離藥物及AFA-L單藥療法處理之小鼠具有與如生理鹽水對照組中所觀測到的腫瘤生長速率類似的腫瘤生長速率，此暗示H1975 NSCLC細胞株之潛在的固有阿法替尼抗藥性特性。此外，與來自NIN-L或AFA-L之作用相比，藉由AFA/NIN-L組合施加的對腫瘤生長抑制之作用明顯更強。結果指示，自活體外研究(實例13)中發現的AFA與NIN之間的協同作用可在活體內環境中良好的轉化成脂質體調配物。總體而言，上述結果顯示，藉由將固定協同AFA:NIN莫耳比囊封於脂質體內部可顯著改良抗腫瘤活性。
實例 24 攜帶HT-29大腸直腸細胞異種移植腫瘤之小鼠的活體內腫瘤消退 如實例15中所描述，亦在攜帶HT-29大腸直腸腫瘤之小鼠的腫瘤異種移植模型中評估AFA/NIN共負載脂質體調配物之抗腫瘤活性。具有TEA-SOS作為捕獲劑的以協同莫耳比1:5 (AFA/NIN)共囊封有AFA及NIN之聚乙二醇化脂質體用於此研究。
實驗方法部分(活體內功效研究)中提及腫瘤細胞接種及腫瘤異種移植建立。將小鼠組織成由生理鹽水對照組及藥物處理組組成之適當處理組，該等藥物治療組包括(1)游離AFA，(2) AFA-L，(3) NIN-L，(4) AFA/NIN混合游離藥物混合液溶液(AFA:NIN莫耳比為1:5)，及(5) AFA/NIN-L (AFA:NIN莫耳比為1:5)。使小鼠靜脈內注射所需體積之樣本，以基於各個別小鼠之體重每兩天向動物投與目標劑量(7.0 mg/kg AFA游離鹼、38.9 mg/kg NIN游離鹼)持續總共四週。隨時間推移量測且監測腫瘤體積及小鼠重量。
如圖28A中所展示，一般而言，與在攜帶腫瘤之生理鹽水對照組以及其他藥物處理組(包括游離AFA藥物、AFA-L單藥療法)中觀測到的彼等腫瘤生長相比，共負載脂質體(AFA/NIN-L)在19天處理之後顯著抑制腫瘤生長。對於對照、游離AFA及AFA-L組，平均腫瘤尺寸(n＝6)在19天處理之後顯著增加(＞6倍)。此暗示游離阿法替尼在此特定細胞株中不具有任何抑制，此可能歸因於其對阿法替尼之抗性。對於游離AFA/NIN組合混合液及NIN-L組，平均腫瘤尺寸在19天處理之後分別增加約95%及64%。相比之下，來自AFA/NIN-L處理組之平均腫瘤尺寸(n＝6)在同一處理時段僅增加24%。
此外，與來自對照相比，作為單藥療法及與呈游離藥物或脂質體形式之尼達尼布組合的阿法替尼未造成體重顯著降低(圖28B)。因此，結果指示所有藥物治療組均不存在全身性毒性。然而，類似地如H1975 NSCLC異種移植研究(實例23)中所描述，觀測到對於藉由AFA/NIN游離藥物混合液處理之組，小鼠尾部之注射部位腫脹且發紅。相比之下，AFA-L、NIN-L及AFA/NIN-L不對注射部位造成任何損害。因此，吾人可推斷，脂質體調配物保護小鼠免受與AFA及NIN相關之毒性。來自對照(未處理)及所有藥物處理小鼠的剝離HT-29異種移植腫瘤塊之照片呈現於圖28C中。自藉由AFA/NIN游離藥物混合液、NIN-L及AFA/NIN-L處理之小鼠中觀測到顯著的腫瘤尺寸減小且在AFA/NIN-L ＞ NIN-L ＞ AFA/NIN游離藥物混合液之次序中觀測到此類減小之程度。相比之下，自未處理對照組、游離AFA及AFAL處理組觀測到顯著更大的腫瘤尺寸，且在彼等三個組當中不存在顯著的腫瘤尺寸差異。此等結果指示，與其他藥物調配物相比，AFA/NIN-L展現顯著改良的抗腫瘤活性。
不受理論束縛，咸信AFA/NIN-L對腫瘤生長之此抑制歸因於奈米級脂質體調配物之增強的滲透性及滯留(EPR)作用，其可改良腫瘤部位中之藥物遞送特異性。因此，關於游離藥物混合液與脂質體藥物組合之間的功效的比較反映，藉由當前脂質體調配物實現之優良生物分佈可產生更高效的腫瘤抑制。有趣的發現，藉由AFA游離藥物及AFA-L單藥療法處理之小鼠具有如與生理鹽水對照組中所觀測到的腫瘤生長速率類似的腫瘤生長速率，此暗示HT-29大腸直腸細胞株之潛在的固有阿法替尼抗藥性特性。此外，與來自NIN-L或AFA-L之作用相比，藉由AFA/NIN-L組合施加的對腫瘤生長抑制之作用明顯更強。結果指示，自活體外研究(實例13)中發現的AFA與NIN之間的協同作用可在活體內環境中良好的轉化成脂質體調配物。總體而言，上述結果顯示，藉由將固定協同AFA:NIN莫耳比囊封於脂質體內部可顯著改良抗腫瘤活性。
前述實施例及實例僅出於說明性目的提供且並不意欲限制本發明之範疇。對上文所描述之實施例及實例的許多變化可為可能的。由於基於本揭示內容，對上文所描述之實施例及實例之各種修改及變化對於熟習此項技術者而言將顯而易見，因此此類修改及變化在本發明之精神及範疇內。所引用之所有專利或非專利參考文獻均以全文引用之方式併入本文中，而不承認其作為先前技術。
圖1說明一些實例蛋白激酶抑制劑之化學結構。A：二順丁烯二酸阿法替尼；B：乙磺酸尼達尼布；C：甲磺酸阿貝西尼；D：蘋果酸舒尼替尼；E：克卓替尼；F：甲磺酸奧希替尼；G：單水合達沙替尼；H：塞利替尼。 圖2說明藥物與脂質比(w/w，總脂質濃度經固定呈8 mg/mL)對使用硫酸銨(AS)、TEA-SBE-β-CD及TEASOS作為捕獲劑的聚乙二醇化AFA-L之囊封效率(EE%)的影響。 圖3說明藥物與脂質比(w/w，總脂質濃度經固定呈8 mg/mL)對使用硫酸銨(AS)、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS作為捕獲劑的聚乙二醇化NIN-L之尼達尼布囊封效率(EE%)的影響。 圖4說明捕獲劑TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS之結構。 圖5說明共負載於聚乙二醇化脂質體內的組合抗癌蛋白激酶抑制劑之實例。說明總共三種關於抗癌抑制劑在脂質體內之位置的情景： 情境 I ：兩種親水性(水溶性)抗癌抑制劑負載於脂質體之水性核心內； 情境 II ：一種親水性(水溶性)抗癌抑制劑負載於水性核心中而另一種親脂性(不良水溶性)抗癌抑制劑囊封於脂質雙層中；情境III：兩種親脂性(不良水溶性)抗癌抑制劑負載於脂質體之脂質雙層內。 圖6說明1:10、1:5、1:1 AFA與NIN莫耳比的聚乙二醇化AFA-L、NIN-L及AFA/NIN-L之粒度分佈(強度%)。(NH 4) 2SO 4用作上述所有脂質體藥物產品之捕獲劑。 圖7說明1:10、1:5、1:1 AFA與NIN莫耳比的聚乙二醇化AFA-L、NIN-L及AFA/NIN-L之粒度分佈(強度%)。TEA-SBE-β-CD用作上述所有脂質體藥物產品之捕獲劑。 圖8說明A：AFA/NIN-L；B：OSI/AFA-L及C：DAS/CER-L之低溫穿透電子顯微術(Cryo-TEM)影像。AFA/NIN-L及OSI/AFA-L兩者為使用TEA-SOS作為捕獲劑之聚乙二醇化脂質體。DAS/CER-L係基於DSPG脂質體。用於脂質體中的AFA/NIN、OSI/AFA及DAS/CER之莫耳比分別為1:5、1:1及1.8:1。 圖9說明負載蛋白激酶抑制劑之脂質體之活體外溶解概況。在45℃加速條件下進行溶解研究。A：負載AFA及/或NIN之聚乙二醇化脂質體之溶解概況。研究以下脂質體藥物產品：(1)使用硫酸銨(AS)作為捕獲劑的僅負載AFA之脂質體(AFA-L-AS，實心正方形)；(2)使用AS作為捕獲劑的僅負載NIN之脂質體(NIN-L-AS，空白三角形)；(3)使用AS作為捕獲劑的共負載AFA及NIN之脂質體(AFA/NIN-L-AS，對於AFA，實心三角形，對於NIN，空白菱形)；及(4)使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑的共負載AFA及NIN之脂質體(AFA/NIN-L-CD，對於AFA，實心圓，且對於NIN，空白正方形)。對於共負載脂質體，AFA與NIN之莫耳比經製備為1:5。B：共負載ABE及SUN (莫耳比為1:5)之聚乙二醇化脂質體之溶解概況。研究以下藥物產品：(1)使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之共負載ABE/SUN (對於SUN，實心圓，且對於ABE，實心正方形)；(2)使用Tris-SBE-β-CD作為捕獲劑之共負載ABE/SUN (對於SUN，實心三角形，且對於ABE，實心菱形)。C：來自使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之共負載聚乙二醇化脂質體的AFA與CRI (莫耳比為1:1)之溶解概況。研究以下兩種脂質體藥物產品：(1)具有含有74 wt% DSPC之脂質組合物的共負載AFA/CRI脂質體(對於AFA，實心正方形，且對於CRI，實心三角形)。(2)具有含有68 wt% DSPC之脂質組合物的共負載AFA/CRI脂質體(對於AFA，空白正方形，且對於CRI，空白三角形)。 圖10說明藉由動態光散射分析的共負載AFA/DAS之脂質體之物理穩定性。將樣本儲存於2-8℃下且在預定時間點處量測平均粒度(nm)及多分散性(PDI)。TEA-SBE-β-CD用作用於主動負載AFA之捕獲劑。脂質體中AFA與DAS之莫耳比為3:1。 圖11說明藉由動態光散射分析的共負載CER/DAS之脂質體之物理穩定性。將樣本儲存於2-8℃下且在預定時間點處量測平均粒度及多分散性(PDI)。 圖12A及圖12B (統稱為圖12)說明阿法替尼(AFA)及尼達尼布(NIN)在HT-29大腸直腸細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨阿法替尼/尼達尼布比率及藥物濃度而變化的阿法替尼及尼達尼布在HT-29大腸直腸細胞中之協同模式的活體外評估。固定阿法替尼/尼達尼布莫耳比之濃度經設計以提供廣泛範圍之細胞生長抑制(由Fa指示)。展示隨固定藥物比率之細胞生長抑制而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨阿法替尼/尼達尼布莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(灰色欄，Fa＝0.90)下繪製之HT-29大腸直腸細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖13A及圖13B (統稱為圖13)說明阿法替尼(AFA)及尼達尼布(NIN)在H1975非小細胞肺癌(NSCLC)細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同AFA與NIN莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同AFA/NIN莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於H1975 NSCLC的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖14A及圖14B (統稱為圖14)說明阿貝西尼(ABE)及舒尼替尼(SUN)在786-O腎癌細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同ABE與SUN莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同ABE/SUN莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於786-O腎癌細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖15A及圖15B (統稱為圖15)說明阿貝西尼(ABE)及舒尼替尼(SUN)在Caki-1腎癌細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同ABE與SUN莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同ABE/SUN莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於Caki-1腎癌細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖16A及圖16B (統稱為圖16)說明阿法替尼(AFA)及克卓替尼(CRI)在MSTO-211H間皮瘤細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同AFA與CRI莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同AFA/CRI莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於MSTO-211H細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖17A及圖17B (統稱為圖17)說明阿法替尼(AFA)及克卓替尼(CRI)在H1975 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同AFA與CRI莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同AFA/CRI莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於H1975 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖18A及圖18B (統稱為圖18)說明奧希替尼(OSI)及阿法替尼(AFA在H1975 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同OSI與AFA莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同OSI/AFA莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於H1975 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖19A及圖19B (統稱為圖19)說明奧希替尼(OSI)及阿法替尼(AFA)在HCC827 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同OSI與AFA莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同OSI/AFA莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於HCC827 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖20A及圖20B (統稱為圖20)說明克卓替尼(CRI)及奧希替尼(OSI)在H1975 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同CRI與OSI莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同CRI/OSI莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於H1975 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖21A及圖21B (統稱為圖21)說明克卓替尼(CRI)及奧希替尼(OSI)在HCC827 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同CRI與OSI莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同CRI/OSI莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於HCC827 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖22A及圖22B (統稱為圖22)說明阿法替尼(AFA)及達沙替尼(DAS)在H1975 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同AFA與DAS莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同AFA/DAS莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於H1975 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖23A及圖23B (統稱為圖23)說明阿法替尼(AFA)及達沙替尼(DAS)在HCC827 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同AFA與DAS莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同AFA/DAS莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於HCC827 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖24A及圖24B (統稱為圖24)說明達沙替尼(DAS)及塞利替尼(CER)在H1975 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同DAS與CER莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同DAS/CER莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於H1975 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖25A及圖25B (統稱為圖25)說明達沙替尼(DAS)及塞利替尼(CER)在HCC827 NSCLC細胞中之協同模式的活體外評估。A：隨不同DAS與CER莫耳比之細胞生長抑制(由Fa指示)而變化的組合指數(CI)值之代表性曲線圖，其中CI值＜1、約1且＞1分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：隨不同DAS/CER莫耳比而變化之ED 75(黑色欄，Fa＝0.75)及ED 90(白色欄，Fa＝0.90)下繪製之基於HCC827 NSCLC細胞的CI之活體外評估(n＝3次獨立重複)。 圖26A及圖26B (統稱為圖26)說明關於共負載有AFA/NIN (AFA/NIN莫耳比為1:5)之脂質體的藥物動力學研究。在靜脈內注射時，將AFA/NIN-L以7.0 (AFA游離鹼)/38.9 (NIN游離鹼) mg/kg投與至BALB/c雌性裸小鼠(n＝3隻/時間點)。藥物產品含有TEA-SOS作為捕獲劑。根據絕對血漿濃度計算各時間點處循環血漿AFA與NIN莫耳比。A：隨時間推移之血漿藥物濃度。B：隨時間推移血漿中AFA與NIN莫耳藥物比率。 圖27A、圖27B及圖27C (統稱為圖27)說明藉由脂質體共遞送之阿法替尼(AFA)及尼達尼布(NIN)針對基於H1975 NSCLC細胞之細胞株衍生之異種移植模型的活體內功效。A：隨時間推移之腫瘤體積變化。插圖：隨時間推移，藉由游離AFA/NIN混合液、NIN-L及AFA/NIN-L治療之小鼠的腫瘤生長。B：隨時間推移之體重變化。C：在研究完成時，來自經解剖之各群組的代表性腫瘤異種移植之照片。每兩天靜脈內治療攜帶腫瘤之雌性BALB/c裸鼠(n＝6隻/組)，持續總共20天。關於各處理群組之資訊係如下描述：生理鹽水(空白三角形)；游離AFA溶液(7.0 mg/kg，空白菱形)；AFA及NIN之游離組合(7.0 mg/kg AFA及38.9 mg/kg NIN，空白正方形)；脂質體AFA-L (7.0 mg/kg，實心菱形)；脂質體NIN-L (38.9 mg/kg，實心圓形)及AFA/NIN-L之脂質體組合(7.0 mg/kg AFA及38.9 mg/kg NIN，實心正方形)。對於所有脂質藥物產品，TEA-SOS用作脂質內捕獲劑。對於AFA/NIN-L，AFA與NIN莫耳藥物比率為1:5。 圖28A、圖28B及圖28C (統稱為圖28)說明藉由脂質體共遞送之阿法替尼(AFA)及尼達尼布(NIN)針對基於HT-29大腸直腸癌細胞之細胞株衍生之異種移植模型的活體內功效。A：隨時間推移之腫瘤體積變化。插圖：隨時間推移，藉由游離AFA/NIN混合液、NIN-L及AFA/NIN-L治療之小鼠的腫瘤生長。B：隨時間推移之體重變化。C：在研究完成時，來自經解剖之各群組的代表性腫瘤異種移植之照片。每兩天靜脈內治療攜帶腫瘤之雌性BALB/c裸鼠(六隻/群)，持續總共19天。關於各處理群組之資訊係如下描述：生理鹽水(空白三角形)；游離AFA溶液(7.0 mg/kg，空白菱形)；AFA及NIN之游離組合(7.0 mg/kg AFA及38.9 mg/kg NIN，空白正方形)；脂質體AFA-L (7.0 mg/kg，實心菱形)；脂質體NIN-L (38.9 mg/kg，實心圓形)及AFA/NIN-L之脂質體組合(7.0 mg/kg AFA及38.9 mg/kg NIN，實心正方形)。對於所有脂質藥物產品，TEA-SOS用作脂質內捕獲劑。對於游離AFA/NIN混合液溶液及AFA/NIN-L，AFA與NIN莫耳藥物比率為1:5。

Claims (22)

  1. 一種醫藥組合物，其包含脂質體、一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑及液體介質，其中該脂質體包含水性內部核心及親酯性外部雙層膜，且其中該雙層膜包含包覆該內部核心之內表面及與該液體介質接觸之外表面；且其中一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑囊封於該水性內部核心或疏水性脂質雙層膜或兩者中；且其中囊封於該脂質體內部之該兩種或更多種蛋白激酶抑制劑可自該脂質體釋放以便以協同模式發揮功能。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該脂質雙層膜包含：(a)至少10 mol%選自以下之磷脂：磷脂醯膽鹼(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂醯甘油(0-70 mol%總脂質，例如DSPG)、磷脂醯環己六醇、甘油醣脂、神經鞘醣脂(例如，神經鞘磷脂)及其組合；(b)固醇；及(c)視情況與聚乙二醇衍生之帶電磷脂(0-10莫耳%總脂質，例如mPEG-2000-DSPE)。
  3. 如請求項2之醫藥組合物，其中該固醇包含約0-60 mol%總脂質，例如膽固醇，或其衍生物。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中該脂質雙層膜之該外表面包含帶負電脂質(例如，DSPG)或含有聚乙二醇之表面改質劑(例如，mPEG-2000-DSPE)，其中該總脂質與該總蛋白激酶抑制劑之莫耳比至少相等(≥ 1:1)。
  5. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中該兩種激酶抑制劑之莫耳比在約60:1至約1:60，視情況約30:1至約1:30或約10:1至約1:10之範圍。
  6. 如請求項1至5中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質體之平均粒度介於4.5 nm至450 nm之間，視情況介於25 nm與300 nm之間或介於50 nm至200 nm之間。
  7. 如請求項1至6中任一項之醫藥組合物，其中該等蛋白激酶抑制劑獨立地選自阿卡拉布魯替尼(acalabrutinib)、阿貝西尼(abemaciclib)、阿法替尼(afatinib)、阿法利貝(aflibercept)、阿來替尼(alectinib)、阿瓦替尼(avapritinib)、阿西替尼(axitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、布加替尼(brigatinib)、貝美替尼(binimetinib)、伯舒替尼(bosutinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡普尼布(capmatinib)、塞利替尼(ceritinib)、考比替尼(cobimetinib)、克卓替尼(crizotinib)、達拉非尼(dabrafenib)、達可替尼(dacomitinib)、達沙替尼(dasatinib)、恩拉非尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄達替尼(erdafitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、非達替尼(fedratinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉列替尼(gilteritinib)、依魯替尼(ibrutinib)、埃克替尼(icotinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、拉羅替尼(larotrectinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、勞拉替尼(lorlatinib)、米哚妥林(midostaurin)、來那替尼(neratinib)、尼羅替尼(nilotinib)、尼達尼布(nintedanib)、奈妥舒迪(netarsudil)、奧希替尼(osimertinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、吡昔替尼(pexidartinib)、培米替尼(pemigatinib)、帕博西尼(palbociclib)、普納替尼(ponatinib)、吡昔替尼、普納替尼、普拉替尼(pralsetinib)、奎紮替尼(quizartinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、瑞博西尼(ribociclib)、力普替尼(ripretinib)、盧佐替尼(ruxolitinib)、塞爾帕替尼(selpercatinib)、司美替尼(selumetinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、坦羅莫司(temsirolimus)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、圖卡替尼(tucatinib)、優帕替尼(upadacitinib)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)、澤布替尼(zanubrutinib)、塞維-阿法利貝(ziv-aflibercept)及其組合。
  8. 如請求項1至7中任一項之醫藥組合物，其中該等蛋白激酶抑制劑係如下： a)  單獨囊封之阿法替尼或尼達尼布； b)  共囊封之阿法替尼及尼達尼布； c)  單獨囊封之阿貝西尼或舒尼替尼； d)  共囊封之阿貝西尼及舒尼替尼； e)  單獨囊封之達沙替尼或阿法替尼； f)  共囊封之達沙替尼及阿法替尼； g)  單獨囊封之塞利替尼或阿法替尼； h)  共囊封之塞利替尼及阿法替尼； i)   單獨囊封之奧希替尼或阿法替尼； j)   共囊封之奧希替尼及阿法替尼； k)  單獨囊封之奧希替尼或克卓替尼； l)   共囊封之奧希替尼或克卓替尼； m) 單獨囊封之達沙替尼或塞利替尼； n)  共囊封之達沙替尼及塞利替尼； o)  單獨囊封之阿法替尼或克卓替尼； p)  共囊封之阿法替尼及克卓替尼； q)  呈約30:1至約1:30莫耳比之阿法替尼及尼達尼布； r)  呈約30:1至約1:30莫耳比之阿貝西尼及舒尼替尼； s)  呈約30:1至約1:30莫耳比之達沙替尼及阿法替尼； t)   呈約30:1至約1:30莫耳比之塞利替尼及阿法替尼； u)  呈約30:1至約1:30莫耳比之奧希替尼及阿法替尼； v)  呈約30:1至約1:30莫耳比之奧希替尼及克卓替尼； w) 呈約30:1至約1:30莫耳比之塞利替尼及達沙替尼；及 x)  呈約30:1至約1:30莫耳比之阿法替尼及克卓替尼。
  9. 如請求項1至8中任一項之醫藥組合物，其中該脂質體分散液液體介質包含水、緩衝劑(例如，組胺酸、HEPES或其他)及張力調節劑(例如，蔗糖、氯化鈉或其他)及視情況選用之控制釋放賦形劑。
  10. 如請求項1至9中任一項之醫藥組合物，其中該液體介質之pH在約5-8之範圍。
  11. 如請求項1至10中任一項之醫藥組合物，其中脂質體中之該等共囊封之蛋白激酶抑制劑可在投與後釋放以便以協同模式發揮功能。
  12. 如請求項1至11中任一項之醫藥組合物，其中該兩種或更多種共囊封之蛋白激酶抑制劑之莫耳比如以下：當在活體外分析中向與癌症相關的癌細胞提供一個濃度範圍內時(此時受影響細胞之分率為約0.20至0.80 ，亦即約20%至80%)，該範圍至少20%內展現協同作用。
  13. 如請求項1至12中任一項之醫藥組合物，其中經兩種或更多種蛋白激酶抑制劑囊封之該脂質體在活體內投與之後使協同莫耳藥物比率在血液中維持至少一小時。
  14. 如請求項1至13中任一項之醫藥組合物，其中當蛋白激酶抑制劑囊封於該水性內部核心內時，該脂質體之內部隔室進一步包含捕獲劑。
  15. 如請求項14之醫藥組合物，其中該捕獲劑係選自硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，三乙銨肌醇六磷酸鹽及三(羥甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸鹽)之銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似者與鹵化物、硫酸根及葡糖酸根之鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)、溴化十六烷基三甲基銨(cetrimonium bromide)、硬脂基二甲基苄基氯化銨)、聚氧乙烯(亦即聚乙二醇)、椰子胺(coconut amine)及其組合。
  16. 一種製備囊封蛋白激酶抑制劑之脂質體的載藥方法，該(等)蛋白激酶抑制劑僅位於脂質體水性內部核心內，該方法包含以下步驟： (a)在包含捕獲劑之溶液中形成脂質分散液，該捕獲劑係選自硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，三乙銨肌醇六磷酸鹽及三(羥甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸鹽)之銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似者與鹵化物、硫酸根及葡糖酸根之鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨、苄索氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、硬脂基二甲基苄基氯化銨)、聚氧乙烯(亦即，聚乙二醇)、椰子胺及其組合； (b)藉由在高溫下擠出、音波處理或均質化該脂質分散液來減小脂質體粒度； (c)實質性地移除該脂質體外部之該捕獲劑； (d)用包含一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑之溶液於高溫下溫熱未負載脂質體，藉此形成載藥脂質體； (e)將組合物之pH調節至約5-8；及 (f)視情況，藉由凍乾作用形成乾燥形式之產物。
  17. 一種製備囊封蛋白激酶抑制劑之脂質體的載藥方法，該(等)蛋白激酶抑制劑係僅於脂質體疏水性脂質雙層膜內，其包含以下步驟： (a)在有機溶劑中形成包含一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑之脂質溶液； (b)移除該(等)有機溶劑且在水性溶液中水合脂質/藥物混合物以形成脂質體； (c)藉由在高溫下擠出、音波處理或均質化脂質分散液來減小該等脂質體之粒度，以形成組合物； (d)將該組合物之pH調節至約5-8；及 (e)視情況，藉由凍乾作用形成乾燥形式之產物。
  18. 一種製備脂質體之方法，該(等)脂質體在脂質體水性內部核心及脂質雙層膜兩者中囊封有蛋白激酶抑制劑，其包含以下步驟： (a)在有機溶劑中形成包含一或多種蛋白激酶抑制劑之脂質溶液； (b)移除該(等)有機溶劑且在含有捕獲劑之溶液中水合脂質/藥物混合物以形成脂質體，其中該捕獲劑係選自硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)之銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，三乙銨肌醇六磷酸鹽及三(羥甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸鹽)之銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似者與鹵化物、硫酸根及葡糖酸根之鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨、苄索氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、硬脂基二甲基苄基氯化銨)、聚氧乙烯(亦即，聚乙二醇)、椰子胺及其組合； (c)藉由在高溫下擠出、音波處理或均質化脂質分散液來減小該等脂質體之粒度； (d)實質性地移除該脂質體外部之該捕獲劑； (e)藉由包含至少一種蛋白激酶抑制劑之溶液於高溫下溫熱上述脂質體分散液； (f)將組合物之pH調節至約5-8；及 (g)視情況，藉由凍乾作用形成乾燥形式之產物。
  19. 一種治療癌症之方法，其包含向需要治療之個體投與治療有效量的如請求項1至15中任一項之醫藥組合物。
  20. 如請求項19之方法，與投與呈游離形式之激酶抑制劑(例如錠劑、膠囊、無脂質體之傳統注射劑或類似物)相比，該方法具有減小的藥物副作用及抗藥性。
  21. 如請求項19或20之方法，其中該癌症為非小細胞肺癌、大腸直腸癌、腎細胞癌、乳癌、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌、胃腸道基質瘤或其他癌症。
  22. 一種治療套組，其包含容器及該容器中之複數種載藥脂質體，其中該等載藥脂質體懸浮於或可懸浮於準備向需要治療個體投與之無菌稀釋劑溶液中，其中該載藥脂質體包含一種、兩種或更多種激酶抑制劑，其中該脂質體包含水性內部核心及親脂性外部雙層膜，該雙層膜包含包覆該內部核心之內表面及與該液體介質接觸之外表面；且其中該一種、兩種或更多種蛋白激酶抑制劑囊封於該水性內部核心或疏水性脂質雙層膜或兩者中；且其中囊封於該脂質體內部之該兩種或更多種蛋白激酶抑制劑可自該脂質體釋放以便以協同模式發揮功能。
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