CN115501239A - 一种靶向肺癌耐药肿瘤的仿生载药体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向肺癌耐药肿瘤的仿生载药体系及其制备方法和应用，该仿生载药体系是将布加替尼药物锚定到COF纳米颗粒上得到COF‑Brig纳米材料，将奥希替尼药物包埋到COF‑Brig纳米材料的介孔结构中得到COF‑Brig@Osi纳米材料，然后采用肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜对COF‑Brig@Osi纳米材料进行包裹得到。本发明的载药体系一方面能实现对耐药肿瘤细胞的主动靶向递送、对抗肿瘤药物的按需释放，极大的提高了抗肿瘤药物在耐药肿瘤部位的浓度，另一方面，还能实现抗肿瘤药物在耐药细胞中的级联响应性释放，进而达到增强抗肿瘤的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种靶向肺癌耐药肿瘤的仿生载药体系及其制备方法和应用。
背景技术
肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌占肺癌的85％，5年存活率只有19％。奥希替尼(Osimertinib,Osi)作为第三代EGFR-TKI被FDA批准用于EGFR突变晚期NSCLC患者的一、二线治疗，且疗效显著。但接受奥希替尼治疗的患者最终会产生耐药而导致疾病进展。既往报道，化疗药物：西妥昔单抗；ALK抑制剂：布加替尼(Brigatinib，Brig)等药物与奥希替尼联用可有效克服奥希替尼获得性耐药。然而，肿瘤异质性决定了耐药细胞的分布不均，传统给药方式限制了药物在耐药细胞的局部浓度，加大药物剂量会增加毒副作用。如何提高耐药肿瘤部位的药物浓度是增强抗肿瘤疗效的关键。
纳米技术是传递药物的新策略。共价有机框架(COF)是一种由共价键连接的结晶多孔聚合物。与传统高分子材料相比，COF具有良好的化学稳定性，丰富可调节的微孔结构，对组成、拓扑和孔隙度的可预测性控制等优势，很容易地将诊断和治疗药物固定在其结构中，实现药物的有效装载。同时，与新兴的无机纳米颗粒(金属、碳、二氧化硅等)相比，COF具有更好的生物相容性、更有前景的生物降解和更容易的表面功能化，广泛用于药物传递。尽管当前的COF材料具有丰富、规则的微孔道结构的优点。但其介孔率较低，很难实现对双药或多药的独立装载和级联响应释放(Wang B,Liu X,GongP,et al.Fluorescent COFs witha highly conjugated structure for visual drug loading and responsive release[J].Chemical Communications,2020,56(4):519-522.)。因此，迫切需要开发一种高结晶、多孔隙的COF纳米载药系统用于多重药物递送。
由于纳米材料自身不具靶向性，只能依靠“增强阻滞与渗透效应(EPR效应)”被动富集到肿瘤部位。如何实现纳米载体对肿瘤细胞的主动靶性一直是人们努力解决的方向。据报道，癌细胞膜具有免疫逃逸和同源黏附能力。因此，大量研究者采用癌细胞膜伪装纳米颗粒实现对同源细胞的特异性结合。然而，人们还未考虑对敏感和耐药细胞的单独靶向性。目前的技术手段仍然无法实现靶向奥希替尼耐药细胞的功能。因此，如何实现载药系统主动靶向到耐药细胞而非敏感细胞是人们面临的又一关键难题。
发明内容
发明人意外发现采用奥希替尼耐药细胞膜包裹的载药系统对耐药肿瘤的靶向性更强，但用敏感细胞膜包裹的纳米载药系统却未能区分敏感和耐药细胞。针对COF纳米载体装载双药和响应级联响应释放的难题，我们采用重结晶方法成功的合成了结晶度高、孔隙丰富的COF纳米载体，以实现对Brig和Osi药物的分层装载和级联响应释放。针对COF纳米载药体系对耐药肿瘤的主动靶向功能性差的难题，我们采用奥希替尼耐药细胞膜包裹的载药系统可实现对耐药肿瘤的靶向特异性。
基于此，本发明保护如下技术方案：
一种靶向肺癌耐药肿瘤的仿生载药体系，是将布加替尼药物锚定到COF纳米颗粒上得到COF-Brig纳米材料，将奥希替尼药物包埋到COF-Brig纳米材料的介孔结构中得到COF-Brig@Osi纳米材料，然后采用肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜对COF-Brig@Osi纳米材料进行包裹得到；
所述COF纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：(1)合成COP纳米颗粒：以4,4'-二硫二酰二苯甲醛、1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐为原料，采用三氟乙酸或醋酸作为席夫碱反应的催化剂，采用席夫碱型亚胺键连接方式合成含有二硫键的非晶共价有机聚合物COP纳米颗粒；重结晶法合成高孔隙COF纳米颗粒：将制备的COP纳米颗粒分散到刻蚀液中，在50-120℃条件下充分反应后，离心收集高介孔COF纳米颗粒，洗涤去除残留反应物，即得。
在上述技术方案中，COF-Brig纳米材料的合成是利用COF纳米颗粒中的亚胺氮上的孤对电子通过氢键锚定布加替尼药物分子；COF-Brig@Osi纳米材料的制备是通过BSA包埋的方法，将奥希替尼药物包埋到COFs材料的介孔结构中；采用物理挤压的方法将肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜包裹到COF-Brig@Osi纳米材料表面。
上述的靶向肺癌耐药肿瘤的仿生载药体系的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成COP纳米颗粒：以4,4'-二硫二酰二苯甲醛、1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐为原料，采用三氟乙酸或醋酸作为席夫碱反应的催化剂，采用席夫碱型亚胺键连接方式合成含有二硫键的非晶共价有机聚合物COP纳米颗粒；
(2)重结晶法合成高孔隙COF纳米颗粒：将制备的COP纳米颗粒分散到刻蚀液中，在50-120℃条件下充分反应后，离心收集高介孔COF纳米颗粒，洗涤去除残留反应物，即得；
(3)COF纳米颗粒装载Brigatinib药物:将布加替尼药物溶解到THF或无水乙醇溶液中，再将COFs纳米颗粒加入布加替尼溶液中，分散均匀，搅拌、充分反应，反应完成后离心、洗涤，去除残余的布加替尼药物，得到COF-Brig纳米颗粒；
(4)装载Osimertinib药物：采用BSA或聚乙二醇捕获奥希替尼药物并包埋到COFs介孔中：向奥希替尼溶液中加入COF-Brig纳米颗粒，分散均匀，将分散液滴入到BSA溶液中，搅拌、充分反应，反应完成后离心、洗涤去除残余的奥希替尼药物，得到COF-Brig@Osi纳米材料；
(5)采用物理挤压的方法将肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜包裹到COF-Brig@Osi纳米材料表面，得到载药体系COF-Brig@Osi-M纳米颗粒。
步骤(1)中4,4'-二硫二酰二苯甲醛、1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐的溶剂为乙腈，向4,4'-二硫二酰二苯甲醛的乙腈分散溶液中加入三氟乙酸，搅拌、充分反应；再加入1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐的乙腈溶液，室温充分反应，离心收集产物，用乙醇和N,N-二甲基乙酰胺洗涤去除残留的反应物，获得COP纳米颗粒；
所述催化剂为三氟乙酸，三氟乙酸的用量为每0.01摩尔4,4'-二硫二酰二苯甲醛使用400-600μL三氟乙酸，优选每0.01摩尔4,4'-二硫二酰二苯甲醛使用450-550μL或者500μL三氟乙酸；
优选4,4'-二硫二酰二苯甲醛溶液的浓度为0.35-0.55mM或0.4-0.5mM，1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐溶液的浓度为0.2-0.4mM或0.25-0.35mM；
优选4,4'-二硫二酰二苯甲醛与1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐的使用量比例为摩尔比3:2。
步骤(2)中，
将制备的COP纳米颗粒分散到刻蚀液中，在50-100℃或50-90℃或60-80℃条件下反应12-60h，优选42-54h或44-52h或48h；离心收集介孔COF纳米颗粒用乙醇洗涤去除残留反应物；
所述刻蚀液包含：10～40mlN,N-二甲基乙酰胺、10～40ml1,3,5-三甲基苯、0.5-3ml水和0.5-2.5ml三氟乙酸，其中N,N-二甲基乙酰胺、1,3,5-三甲基苯的体积比为：1～4﹕1～4，优选4﹕1；水的体积优选2ml，三氟乙酸的体积优选2ml；
COP纳米颗粒与刻蚀液的用量比为COP纳米颗粒的质量与刻蚀液的体积比为1mg﹕40～60ml，优选1mg﹕45～55ml或50ml。
步骤(3)中，
布加替尼药物与COFs纳米颗粒的摩尔质量比为0.01～10mmol﹕1mg，优选0.01～0.1mmol:1mg或0.01～0.05mmol:1mg或0.02～0.05mmol:1mg；
将COFs纳米颗粒加入布加替尼溶液中超声震荡至分散均匀，搅拌过夜反应，离心后采用乙醇洗涤。
步骤(4)中，
所述奥希替尼溶液的溶剂为乙醇，奥希替尼与COF-Brig纳米颗粒的摩尔质量比为0.001～10mmol﹕1mg，优选0.004～10mmol﹕1mg或0.004～1mmol﹕1mg或0.004～0.1mmol﹕1mg或0.004～0.05mmol﹕1mg或0.004～0.02mmol﹕1mg，向奥希替尼溶液中加入COF-Brig纳米颗粒，采用超声震荡分散均匀，将分散液滴入到BSA溶液中，搅拌反应2-10h，反应完成后离心，并用去离子水洗涤去除残余的奥希替尼药物；
所述BSA溶液制备方法为：将10mgBSA分散到1ml2.5mMNaCl溶液中，完全溶解后加入200μL0.1mMNaOH溶液。
步骤(5)中，
将COF-Brig@Osi纳米颗粒和肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜混合均匀，用挤出机通过纳米级聚碳酸酯滤膜反复挤出混合物，然后高速离心获得COF-Brig@Osi-M纳米颗粒；
COF-Brig@Osi纳米颗粒与肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜的质量比为1:2～7，优选1:3～7或1:4～6或1:5；
优选所述纳米级聚碳酸酯滤膜的孔径为200nm；所述高速离心为15000rpm下离心10min。
本发明还保护上述的仿生载药体系在递送布加替尼和奥希替尼抗肿瘤药物中的应用或者在制备肿瘤治疗药物中的应用。
在上述的应用技术方案中，所述肿瘤为肺癌，优选非小细胞肺癌；优选所述肿瘤为奥希替尼获得性耐药型。
本发明的有益效果是：
针对COF纳米载体装载双药和响应级联响应释放的难题，我们采用重结晶方法成功的合成了结晶度高、孔隙丰富的COF纳米载体，以实现对Brig和Osi药物的分层装载和级联响应释放。
针对COF纳米载药体系对耐药肿瘤的主动靶向功能性差的难题，我们采用奥希替尼耐药细胞膜包裹的载药系统(其合成过程如图15所示)可实现对耐药肿瘤的特异性靶向。
本发明的载药体系能实现对抗肿瘤药物的按需释放，极大的提高了抗肿瘤药物在耐药肿瘤部位的浓度，进而达到增强抗肿瘤的效果。
本发明提出的利用奥希替尼耐药细胞膜包裹高孔隙COF纳米载药系统有望成为克服奥希替尼耐药的有效手段。一方面，该体系能实现对耐药肿瘤细胞的主动靶向递送；另一方面，还能实现抗肿瘤药物在耐药细胞中的级联响应性释放，进而达到增强抗肿瘤的效果。
附图说明
图1是合成的COP的TEM图。
图2是高孔隙COF纳米颗粒的TEM和SEM图。
图3是COF-Brig的TEM结构图。
图4是COF-Brig@Osi的TEM结构图。
图5是高孔隙COF纳米颗粒装载Brigatinib和Osimertinib药物的装载量优化和包封率。
图6是高孔隙COF纳米载体装载双药前后的比表面积变化。
图7是合成的COF-Brig@Osi-M纳米颗粒TEM图。
图8是高介孔COF纳米载药体系包裹细胞膜前后粒径变化。
图9是高介孔COF纳米载药体系包裹细胞膜后材料表面的细胞膜蛋白谱(SDS-PAGE)。
图10是COF-Brig@Osi-M纳米颗粒对PC-9OR耐药细胞的活性抑制效果及其IC50值。
图11是COF-Brig@Osi-M纳米颗粒抑制PC-9OR耐药细胞克隆形成实验。
图12是裸鼠注射COFCy5-Brig@Osi-MPC-9纳米颗粒组主要脏器和肿瘤的荧光强度。
图13是裸鼠注射COFCy5-Brig@Osi-MPC-9OR1纳米颗粒组主要脏器和肿瘤的荧光强度。
图14是N-cadherin、EPCAM和Galectin-3蛋白在敏感和耐药细胞膜的表达情况。
图15是本发明的载药体系的合成过程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学试剂和材料，如无特殊说明，均为本领域常规试剂和材料，均可商购获得。
主要试剂和材料来源：
4,4'-二硫二酰二苯甲醛：CAS：100538-31-6，
1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐：CAS号：69146-57-2，
PC-9OR细胞株：人非小细胞肺癌奥希替尼耐药细胞株，由本实验室建立获得。
PC-9细胞：人肺腺癌细胞，商购。
实施例1制备COF-Brig@Osi
一、COP纳米颗粒的合成：
采用席夫碱型亚胺键连接方式合成含有二硫键的非晶共价有机聚合物(covalentorganicpolymers，COP)纳米颗粒：
用乙腈溶解4,4'-二硫二酰二苯甲醛(4,4'-disulfanediyldibenzaldehyde，0.45mM)，完全分散后，向25ml的分散溶液中快速加入500μL三氟乙酸，磁力搅拌10min。再将提前配制的1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐(Benzene-1,3,5-triyltrimethanamine，0.3mM)乙腈溶液25ml缓慢加入前述溶液中，室温反应0.5h，离心收集产物，用乙醇和N,N-二甲基乙酰胺洗涤多次，去除残留的反应物，获得COP纳米颗粒，合成的COP的TEM图如图1所示。二、重结晶法合成高孔隙COF纳米颗粒(COFs)
将制备的1mgCOP纳米颗粒分散到50ml提前配制的刻蚀液中(刻蚀液成分：40mlN,N-二甲基乙酰胺、10ml1,3,5-三甲基苯、2ml水和2ml三氟乙酸)，在70℃条件下反应48h后，离心收集介孔COF纳米颗粒，并用乙醇洗涤多次。形成的高孔隙COF纳米颗粒的TEM和SEM图如图2所示，相比于COP纳米颗粒，重结晶合成的COF纳米颗粒的粒径变化不大，约为160-170nm，但COFs纳米颗粒呈现出显著的大孔隙结构，这对装载药物非常有利。
三、高孔隙COF纳米颗粒装载Brigatinib和Osimertinib抗肿瘤药物：
(1)高孔隙COF纳米材料装载Brigatinib药物(即为COF-Brig)：
通过COFs中亚胺氮上的孤对电子锚定布加替尼分子：将布加替尼药物溶解到无水四氢呋喃(THF)溶液中，再将不同浓度(1,2,5,10mM)的布加替尼THF溶液(10ml)分散1mgCOFs纳米颗粒，超声震荡10min，并用磁力搅拌过夜。反应完成后离心，并用乙醇洗涤多次，去除残余的布加替尼药物。
优化Brigatinib药物的装载量和包封率：经检测，如图5所示1mgCOFs对1,2,5,10mM不同浓度的布加替尼装载量分别为0.05、0.13、0.33、0.41mM，相对于的包封率分别为21.4、24.0、28.3、19.6％。因此，确定出最优布加替尼装载条件为：5mM布加替尼溶液，其相应的装载率和包封率为：0.33mM和28.3％。
装载布加替尼后COF-Brig纳米颗粒的TEM结构如图3所示，对应的BET比表面积见图6。对比装载前COF纳米颗粒的TEM结果可以看出，装载后COF的部分介孔结构被药物所占据，BET结果进一步揭示出COF-Brig纳米颗粒的比表面积有所下降。图8展示了纳米颗粒水合粒径的分布图，装载Brigatinib后COF-Brig的粒径与COF相当，约为170nm。
(2)高孔隙COF纳米材料装载Brigatinib后再装载Osimertinib药物(即为COF-Brig@Osi)：
采用牛血清白蛋白(BSA)捕获奥希替尼药物并包埋到COFs介孔中：将10mgBSA分散到1ml2.5mMNaCl溶液中，完全溶解后加入200μL0.1mMNaOH溶液。同时配制5mM奥希替尼乙醇溶液4ml，并加入1mgCOF-Brig纳米颗粒，超声震荡10min，并用磁力搅拌，使COF-Brig纳米颗粒完全分散。最后将含有奥希替尼药物的COF-Brig乙醇溶液滴入到1ml前面配制的BSA溶液中，搅拌6h。反应完成后离心，并用去离子水洗涤多次，去除残余的奥希替尼药物。装载双药后的TEM结构如图4所示。
优化Osimertinib药物的装载量和包封率：将已装载布加替尼的COF-Brig纳米颗粒用于装载奥希替尼药物。Osimertinib设置的不同浓度分别是1,2,5,10mM。Osimertinib的装载量和包封率如图5所示。1mgCOFs装载Brigatinib药物后对1,2,5,10mM不同浓度的Osimertinib药物的装载量分别为0.05、0.11、0.26、0.39mM，相对于的包封率分别为24.3、23.9、26.1、20.0％。确定出最优奥希替尼装载条件为：5mM奥希替尼溶液，其相应的装载率和包封率为：0.26mM和26.1％。
高孔隙COF纳米载体装载双药前后的TEM图揭示出，COF的介孔结构几乎被药物完全占据。如图6所示的比表面积显著降低。图8中水合粒径结果揭示出COF-Brig@Osi纳米颗粒的粒径约为180nm。
实施例2制备奥希替尼耐药细胞膜包裹的COF-Brig@Osi纳米材料
(1)提取肺癌奥希替尼耐药细胞膜：
首先将PC-9OR耐药细胞分散在低渗裂解缓冲液中(低渗裂解缓冲液：20mMTrisHCl、10mMKCl、2mMMgCl2和1片不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂)，并用均质器破碎。将细胞溶液离心(3200g，5min)收集上清液。再将上清液以20000g离心30min，丢弃沉淀，并使用超高速离心机再次以80000g离心1.5h，去除上清液。收集PC-9OR耐药细胞膜，然后在微型挤出机上通过400nm的聚碳酸酯多孔膜物理挤出PC-9OR耐药细胞膜囊泡。PC-9敏感细胞膜提取方法与PC-9OR相同。
(2)采用物理挤压的方法包裹COF-Brig@Osi纳米材料：
将100μg/ml的COF-Brig@Osi纳米颗粒的PBS溶液0.5ml和0.5mlPC-9OR耐药细胞膜囊泡PBS溶液(浓度500ug/ml)混合，超声10min后，用小型挤出机通过含有200nm孔径的聚碳酸酯薄膜反复挤出混合物，然后在15000rpm下离心10min，获得COF-Brig@Osi-M纳米颗粒。PC-9敏感细胞膜包裹方法与PC-9OR相同。合成的COF-Brig@Osi-M纳米颗粒结构如图7所示：TEM结果揭示出，纳米颗粒表面包裹一层厚度约为8nm厚的细胞膜，该厚度与文献报道的单层细胞膜厚度一致。图9所示的SDS-PAGE结果展示了纳米材料包裹细胞膜后蛋白谱的保留情况，发现细胞膜上的蛋白成功的转移到纳米材料表面，从而实现了材料的同源靶向黏附功能。高介孔COF纳米载药体系包裹细胞膜前后粒径变化如图8所示：COF-Brig@Osi-M纳米颗粒的粒径约为200nm。
实施例3体外评估COF-Brig@Osi-M纳米载药体系的抗肿瘤效应
(1)COF-Brig@Osi-M纳米颗粒对PC-9OR耐药细胞的杀伤效果
通过CCK-8实验方法测试COF-Brig@Osi-M纳米颗粒对PC-9OR耐药细胞的毒副作用。将PC-9OR细胞按5x103个/孔的数量铺在96孔板中，培养12h。再加入不同浓度的COF-M、COF-Brig-M、COF-Osi-M和COF-Brig@Osi-M纳米颗粒(浓度设置：0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10mg/ml)。37℃共孵育72h，遗弃培养基，加入10％的CCK-8溶液，孵育2h后测试450nm的吸光度值。并计算细胞存活率，如图10所示：COF-M、COF-Brig-M纳米颗粒对PC-9OR细胞的活性抑制效果差，COF-Osi-M有一定抑制效果，但IC50较大(约为2.2mg/ml)。而COF-Brig@Osi-M纳米颗粒对PC-9OR细胞的活性有显著的抑制效果，其IC50约为0.45mg/ml。
(2)COF-Brig@Osi-M纳米颗粒抑制PC-9OR耐药细胞克隆形成
通过克隆形成实验评估COF-Brig@Osi-M纳米颗粒抑制PC-9OR耐药细胞的增殖能力。将PC-9OR细胞按1x103个/孔的数量铺在6孔板中，培养24h。再分别加入0.2mg/ml浓度(IC25)的COF-M、COF-Brig-M、COF-Osi-M和COF-Brig@Osi-M纳米颗粒。37℃共孵育15天后，遗弃培养基，用PBS清洗3次，室温晾干。每孔加入0.5ml结晶紫，染色1h后吸出结晶紫，室温晾干，并用PBS清洗1次，最后拍照。
实验结果如图11所示：COF-M、COF-Osi-M对PC-9OR细胞的克隆形成抑制作用不显著，COF-Brig-M有一定的抑制效果。但COF-Brig@Osi-M纳米颗粒对PC-9OR细胞的克隆形成有显著的抑制效果。
以上实验结果显示，高介孔COF装载Brig和Osi双药后对PC-9OR耐药细胞的活性和增殖均有显著的抑制作用。
实施例4体内评估COF-Brig@Osi-M纳米载药体系的靶向性
(1)为了观察COF-Brig@Osi-M纳米颗粒在肺癌移植瘤裸鼠动物模型的体内靶向性，将COF-Brig@Osi用荧光素Cy5标记，并用敏感细胞膜MPC-9或耐药细胞膜MPC-9OR1包裹，即为COFCy5-Brig@Osi-MPC-9和COFCy5-Brig@Osi-MPC-9OR。
(2)裸鼠肺癌移植瘤模型构建：将密度为1x107/mL的PC-9敏感细胞和PC-9OR耐药细胞悬液皮下分别接种在裸鼠的左右腋下，一周后出现100mm3左右肿瘤块。
(3)观察COFCy5-Brig@Osi-MPC-9和COFCy5-Brig@Osi-MPC-9OR纳米颗粒在不同肿瘤中的靶向情况：经尾静脉将纳米颗粒注射到小鼠体内。给药8h后，处死小鼠，取出小鼠的脏器(心、肝、脾、肺、肾)和移植瘤，通过成荧光像仪观察纳米颗粒在脏器和移植瘤的分布情况。
注射COFCy5-Brig@Osi-MPC-9纳米颗粒组主要脏器和肿瘤的荧光强度如图12所示：在肝的荧光强度最强，在肿瘤、肺和肾脏的荧光强度较强，在心脏和脾脏的荧光强度较弱。表明纳米材料在肝部位富集明显，在肿瘤部位富集较多。对比PC-9和PC-9OR肿瘤发现，敏感细胞膜PC-9包裹材料后在PC-9和PC-9OR肿瘤的荧光强度基本非常接近。表明敏感细胞膜包裹纳米材料对敏感和耐药肿瘤的靶向效果相当，未能区分敏感和耐药肿瘤。
注射COFCy5-Brig@Osi-MPC-9OR1纳米颗粒组主要脏器和肿瘤的荧光强度如图13所示：在肿瘤部位的荧光强度最强，在肝、肺和肾脏的荧光强度较强，在心脏和脾脏的荧光强度较弱。表明纳米材料在肿瘤部位富集明显。对比PC-9和PC-9OR肿瘤发现，耐药细胞膜PC-9OR包裹材料后在耐药肿瘤的荧光强度非常强，但在敏感肿瘤中的荧光强度较弱。由此表明耐药细胞膜包裹纳米材料后对耐药肿瘤的靶向效果显著。
从以上结果可知，敏感细胞膜包裹纳米材料后对PC-9、PC-9OR1肿瘤的靶向效果相当。耐药细胞膜包裹纳米材料后对PC-9OR肿瘤的靶向效果显著优于PC-9敏感肿瘤。
实施例5耐药细胞膜靶向作用的机制分析
采用SDS-PAGE实验检测PC-9敏感细胞和PC-9OR耐药细胞膜的总蛋白谱和靶向相关粘附蛋白N-cadherin、EPCAM和Galectin-3蛋白在敏感和耐药细胞膜的表达情况。
实验方法：将实施例2中提取的敏感和耐药细胞膜用于SDS-PAGE和WesternBlot实验，并与敏感和耐药细胞作对比，SDS-PAGE和WesternBlot实验方法采用常规方法。
实验结果如图14所示：从SDS-PAGE蛋白图谱可以看出，敏感细胞膜和耐药细胞膜中存在多种蛋白表达量的差异，耐药细胞膜中大量蛋白呈显著高表达的现象。通过WesternBlot实验进一步分析细胞黏附相关蛋白N-cadherin、EPCAM和Galectin-3蛋白的表达情况。对比敏感细胞膜发现，耐药细胞膜中的N-cadherin和Galectin-3蛋白是显著高表达的，EPCAM蛋白变化不显著。
从以上结果可知：耐药细胞膜对耐药肿瘤的显著靶向性归因于N-cadherin和Galectin-3蛋白的高表达。
Claims (10)
1.一种靶向肺癌耐药肿瘤的仿生载药体系，其特征在于：是将布加替尼药物锚定到COF纳米颗粒上得到COF-Brig纳米材料，将奥希替尼药物包埋到COF-Brig纳米材料的介孔结构中得到COF-Brig@Osi纳米材料，然后采用肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜对COF-Brig@Osi纳米材料进行包裹得到；
所述COF纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：(1)合成COP纳米颗粒：以4,4'-二硫二酰二苯甲醛、1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐为原料，采用三氟乙酸或醋酸作为席夫碱反应的催化剂，采用席夫碱型亚胺键连接方式合成含有二硫键的非晶共价有机聚合物COP纳米颗粒；重结晶法合成高孔隙COF纳米颗粒：将制备的COP纳米颗粒分散到刻蚀液中，在50-120℃条件下充分反应后，离心收集高介孔COF纳米颗粒，洗涤去除残留反应物，即得。
2.根据权利要求1所述的靶向肺癌耐药肿瘤的仿生载药体系，其特征在于：
COF-Brig纳米材料的合成是利用COF纳米颗粒中的亚胺氮上的孤对电子通过氢键锚定布加替尼药物分子；COF-Brig@Osi纳米材料的制备是通过BSA包埋的方法，将奥希替尼药物包埋到COFs材料的介孔结构中；
采用物理挤压的方法将肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜包裹到COF-Brig@Osi纳米材料表面。
3.权利要求1或2所述的仿生载药体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成COP纳米颗粒：以4,4'-二硫二酰二苯甲醛、1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐为原料，采用三氟乙酸或醋酸作为席夫碱反应的催化剂，采用席夫碱型亚胺键连接方式合成含有二硫键的非晶共价有机聚合物COP纳米颗粒；
(2)重结晶法合成高孔隙COF纳米颗粒：将制备的COP纳米颗粒分散到刻蚀液中，在50-120℃条件下充分反应后，离心收集高介孔COF纳米颗粒，洗涤去除残留反应物，即得；
(3)COF纳米颗粒装载Brigatinib药物:将布加替尼药物溶解到THF或无水乙醇溶液中，再将COFs纳米颗粒加入布加替尼溶液中，分散均匀，搅拌、充分反应，反应完成后离心、洗涤，去除残余的布加替尼药物，得到COF-Brig纳米颗粒；
(4)装载Osimertinib药物：采用BSA或聚乙二醇捕获奥希替尼药物并包埋到COFs介孔中：向奥希替尼溶液中加入COF-Brig纳米颗粒，分散均匀，将分散液滴入到BSA溶液中，搅拌、充分反应，反应完成后离心、洗涤去除残余的奥希替尼药物，得到COF-Brig@Osi纳米材料；
(5)采用物理挤压的方法将肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜包裹到COF-Brig@Osi纳米材料表面，得到载药体系COF-Brig@Osi-M纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中4,4'-二硫二酰二苯甲醛、1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐的溶剂为乙腈，向4,4'-二硫二酰二苯甲醛的乙腈分散溶液中加入三氟乙酸，搅拌、充分反应；再加入1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐的乙腈溶液，室温充分反应，离心收集产物，用乙醇和N,N-二甲基乙酰胺洗涤去除残留的反应物，获得COP纳米颗粒；
所述催化剂为三氟乙酸，三氟乙酸的用量为每0.01摩尔4,4'-二硫二酰二苯甲醛使用400-600μL三氟乙酸，优选每0.01摩尔4,4'-二硫二酰二苯甲醛使用450-550μL或者500μL三氟乙酸；
优选4,4'-二硫二酰二苯甲醛溶液的浓度为0.35-0.55mM或0.4-0.5mM，1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐溶液的浓度为0.2-0.4mM或0.25-0.35mM；
优选4,4'-二硫二酰二苯甲醛与1,3,5-三(氨基甲基)苯三盐酸盐的使用量比例为摩尔比3:2。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，
将制备的COP纳米颗粒分散到刻蚀液中，在50-100℃或50-90℃或60-80℃条件下反应12-60h，优选42-54h或44-52h或48h；离心收集介孔COF纳米颗粒用乙醇洗涤去除残留反应物；
所述刻蚀液包含：10～40ml N,N-二甲基乙酰胺、10～40ml 1,3,5-三甲基苯、0.5-3ml水和0.5-2.5ml三氟乙酸，其中N,N-二甲基乙酰胺、1,3,5-三甲基苯的体积比为：1～4﹕1～4，优选4﹕1；水的体积优选2ml，三氟乙酸的体积优选2ml；
COP纳米颗粒与刻蚀液的用量比为COP纳米颗粒的质量与刻蚀液的体积比为1mg﹕40～60ml，优选1mg﹕45～55ml或50ml。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中布加替尼药物与COFs纳米颗粒的摩尔质量比为0.01～10mmol﹕1mg，优选0.01～0.1mmol:1mg或0.01～0.05mmol:1mg或0.02～0.05mmol:1mg；
步骤(3)中将COFs纳米颗粒加入布加替尼溶液中超声震荡至分散均匀，搅拌过夜反应，离心后采用乙醇洗涤。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，
所述奥希替尼溶液的溶剂为乙醇，奥希替尼与COF-Brig纳米颗粒的摩尔质量比为0.001～10mmol﹕1mg，优选0.004～10mmol﹕1mg或0.004～1mmol﹕1mg或0.004～0.1mmol﹕1mg或0.004～0.05mmol﹕1mg或0.004～0.02mmol﹕1mg，向奥希替尼溶液中加入COF-Brig纳米颗粒，采用超声震荡分散均匀，将分散液滴入到BSA溶液中，搅拌反应2-10h，反应完成后离心，并用去离子水洗涤去除残余的奥希替尼药物；
所述BSA溶液制备方法为：将10mgBSA分散到1ml 2.5mMNaCl溶液中，完全溶解后加入200μL0.1mMNaOH溶液。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，
将COF-Brig@Osi纳米颗粒和肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜混合均匀，用挤出机通过纳米级聚碳酸酯滤膜反复挤出混合物，然后高速离心获得COF-Brig@Osi-M纳米颗粒；
COF-Brig@Osi纳米颗粒与肺癌奥希替尼耐药细胞的细胞膜的质量比为1:2～7，优选1:3～7或1:4～6或1:5；
优选所述纳米级聚碳酸酯滤膜的孔径为200nm；所述高速离心为15000rpm下离心10min。
9.权利要求1或2所述的仿生载药体系在递送布加替尼和奥希替尼抗肿瘤药物中的应用或者在制备肿瘤治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肺癌，优选非小细胞肺癌；优选所述肿瘤为奥希替尼获得性耐药型。
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| CN115154473A (zh) * | 2022-08-04 | 2022-10-11 | 中国人民解放军陆军特色医学中心 | 布格替尼作为axl、c-met、st3gal4抑制剂的新应用 |
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