CN114652699A - 一种尺寸转变型纳米递药载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物制剂技术领域，具体公开了一种尺寸转变型纳米递药载体及其制备方法和应用，该纳米递药载体是由偶氮苯化合物与水溶性的壳聚糖或壳聚糖衍生物通过静电相互作用、氢键或共价键结合形成的复合物；所述纳米递药载体在生物体血液循环中能够稳定存在，并能够在病灶微环境中响应还原性物质而发生氮氮双键的还原裂解，从而实现纳米递药载体尺寸的转变。本发明纳米递药载体较大的初始尺寸可保障载体获得长循环时间促进病灶富集，偶氮苯中的氮氮双键被还原后转变成粒径较小的载体，可增强组织渗透，从而将药物递送至病灶组织深部发挥疗效，该递药载体化学组成简单，稳定性好，毒副作用小，具有很好的应用价值。

Description

一种尺寸转变型纳米递药载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，更具体地，涉及一种尺寸转变型纳米递药载体及其制备方法和应用。
背景技术
在现代药剂学中，药物传递系统发挥着重要作用，递药载体能够把药物在必要的时间、以必要的量、输送到必要的部位，以达到最大的疗效和最小的毒副作用。其中，尺寸转变型纳米递药载体是一类在血液循环中稳定存在、经病灶部位特殊微环境触发可转变为小尺寸粒子的特殊载体类型，其较大的初始尺寸可保障载体获得长循环时间以促进其在病灶部位的富集，转变后粒径较小可增强组织渗透，从而将药物递送至病灶部位深部发挥疗效。
然而，为实现病灶部位环境触发尺寸转变和药物控释，目前的尺寸转变型递药载体常需引入多种响应性官能团，导致其化学成分复杂，增加了对纳米制剂及其代谢产物的生物安全性和体内行为表征的难度，不利于后期临床转化。另一方面，目前缺乏对相似结构组成的纳米药物载体在同一刺激响应因素下发生尺寸转变速度调节的研究，以及载体的尺寸转变速度快慢对药物治疗效果的影响。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种尺寸转变型纳米递药载体及其制备方法和应用，旨在解决现有的尺寸转变型递药载体均含有响应性官能团且组成复杂导致其生物安全性检测及体内行为表征困难的问题，以及进一步研究尺寸转变型纳米递药载体的尺寸转变速度对于药物治疗效果的影响。
为实现上述目的，本发明提供了一种尺寸转变型纳米递药载体，所述纳米递药载体是由偶氮苯化合物与水溶性壳聚糖或壳聚糖衍生物通过静电相互作用、氢键或共价键结合形成的复合物，所述偶氮苯化合物的结构通式如式I所示：
Figure BDA0003538711290000021
R1和R2中远离苯环的端基均为羧基、醛基、碳碳双键或环氧基，R1和R2中靠近苯环的基团相互独立地为羧基、氰基、硝基、酰胺基、二烷基氨基、烷基氨基、氨基、羟基或烷氧基；
所述纳米递药载体在生物体血液循环中能够稳定存在，并能够在病灶微环境中响应还原性物质而发生氮氮双键的还原裂解，从而实现纳米递药载体尺寸的转变，通过调整所述偶氮苯化合物上与苯环连接的推/吸电子基团类型能够有效调控所述纳米药物载体的尺寸转变速度快慢。
优选地，所述壳聚糖衍生物为羟乙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖或羟丁基壳聚糖。
优选地，所述R1和R2中远离苯环的端基均为羧基，所述羧基与所述壳聚糖或壳聚糖衍生物中氨基的物质的量比为(0.5-2):1。
优选地，所述羧基与所述氨基的物质的量比为2:1。
优选地，所述R1和R2中靠近苯环的基团相互独立地为羧基、氰基或硝基。
优选地，所述R1中靠近苯环的基团为羧基、氰基或硝基，所述R2中靠近苯环的基团为酰胺基、二烷基氨基、烷基氨基、氨基、羟基或烷氧基。
按照本发明的另一方面，还提供了一种上述尺寸转变型纳米递药载体的制备方法，包括如下步骤：将所述偶氮苯化合物溶于其良性溶剂中，将所述壳聚糖或其衍生物溶于溶剂中，一边搅拌一边将偶氮苯化合物溶液缓慢滴加到壳聚糖或其衍生物的溶液中，室温下搅拌过夜，制得尺寸转变型纳米递药载体凝胶。
按照本发明的另一方面，还提供了一种上述尺寸转变型纳米递药载体在制备疾病治疗药物中的应用。
按照本发明的另一方面，还提供了一种纳米载药系统，包括上述尺寸转变型纳米递药载体和负载在所述尺寸转变型纳米递药载体上的药物。
优选地，所述药物为疏水性药物。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明通过偶氮苯化合物的端基与水溶性的壳聚糖或其衍生物之间的静电相互作用/氢键/共价键结合制备纳米递药载体，其化学组成简单，偶氮苯化合物交联壳聚糖或其衍生物形成大分子纳米粒子，在病灶特殊微环境下触发偶氮苯的氮氮双键发生还原裂解，从而使得纳米粒子尺寸发生转变；通过改变偶氮苯化合物中苯环上的推吸电子基团来调控纳米递药载体尺寸转变速度的快慢，进而研究递药载体尺寸转变速度对抗病药物治疗效果的影响。
(2)本发明探讨不同氧浓度、推/吸电子基团及取代位置对偶氮苯裂解响应性的影响规律，进而筛选出在肿瘤组织内部具有不同裂解响应速度的纳米递药载体，快裂解型载体可快速发生尺寸转变以深入渗透，慢裂解型载体则可用于长效释放药物，以满足不同环境下药物递送需求。
(3)本发明尺寸转变型纳米递药载体制备方法简单易行，成本低，所使用的原料易获取，所用偶氮苯化合物可通过人工合成或者直接购买，原料生物安全性高。
(4)本发明提供的纳米递药载体应用于疾病治疗药物中，在病灶微环境下可被生物体内自身存在的还原性物质还原，转变成小尺寸粒子，以期实现药物在病灶组织内的深入渗透和长效释放的双重效果，避免了外生型刺激响应对组织或细胞产生的副作用。
(5)本发明提供的尺寸转变型纳米递药载体可用于负载多种药物，适用性广，稳定性好，靶向性高。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的偶氮苯化合物的核磁共振氢谱图；
图2是本发明实施例2制备的偶氮苯化合物的核磁共振氢谱图；
图3是本发明实施例3制备的偶氮苯化合物的核磁共振氢谱图；
图4是本发明实施例6中Azo-GC纳米递药载体的合成示意图；
图5是本发明实施例9中不同浓度的各偶氮苯化合物、羟乙基壳聚糖以及复合物的4T1细胞活性检测图(A)和3T3细胞活性检测图(B)；
图6是本发明实施例10中三种Azo-GC纳米递药载体在连二亚硫酸钠作用下反应溶液的吸光度变化图(A)和反应过程中复合物的粒径变化图(B)；
图7是本发明实施例10中三种Azo-GC纳米递药载体在连二亚硫酸钠溶液作用一定时间后TEM表征图；
图8是本发明实施例11中三种Azo-GC纳米递药载体在肝微粒体酶作用下、不同氧含量下的降解曲线图；
图9是本发明实施例12中三种Azo-FITC/GC及H2BPDC-FITC/GC纳米递药载体共孵育24h后在4T1细胞球内的渗透电镜图；
图10是本发明实施例12中三种Azo-FITC/GC及H2BPDC-FITC/GC纳米递药载体共孵育48h后在4T1细胞球内的渗透电镜图；
图11是本发明实施例13中三种Dox@Azo-GC纳米凝胶在室温下放置30天后DLS粒径变化图；
图12是本发明实施例13中三种Dox@Azo-GC纳米凝胶在4T1细胞内共聚焦显微镜图；
图13是本发明实施例16中不同处理下4T1荷瘤小鼠给药期间的体重变化图；
图14是本发明实施例16中不同处理下4T1荷瘤小鼠给药期间的肿瘤体积变化图；
图15是本发明实施例16中不同处理下4T1荷瘤小鼠给药结束后剥离肿瘤的形态大小(A)及称重图(B)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种尺寸转变型纳米递药载体，该纳米递药载体是由偶氮苯化合物与水溶性壳聚糖或壳聚糖衍生物通过静电相互作用、氢键或共价键结合形成的复合物，所述偶氮苯化合物的结构通式如式I所示：
Figure BDA0003538711290000051
R1和R2中远离苯环的端基均为羧基、醛基、碳碳双键或环氧基，R1和R2中靠近苯环的基团相互独立地为羧基(-COOH)、氰基(-CN)、硝基(-NO2)、酰胺基(-NHCOR)、二烷基氨基(-NR2)、烷基氨基(-NHR)、氨基(-NH2)、羟基(-OH)或烷氧基(-OR)；
所述纳米递药载体在生物体血液循环中能够稳定存在，并能够在病灶微环境中响应还原性物质而发生氮氮双键的还原裂解，从而实现纳米递药载体尺寸的转变，通过调整所述偶氮苯化合物上与苯环连接的推/吸电子基团类型能够有效调控所述纳米药物载体的尺寸转变速度快慢。
目前，已有研究报道，由于偶氮苯类物质可在紫外光照射下由反式构型向顺式构型转化，在可见光或加热条件下又能重新使顺式构型向反式构型转变，因此偶氮苯类物质被用于药物递送系统中，在光照条件下通过偶氮苯结构的变化进而引起纳米粒子的形态变化，从而引发药物释放。考虑到长时间的光照射会对组织及细胞产生一定副作用，因而偶氮苯这类光响应型物质在生物体内的应用受到限制。本发明利用偶氮苯化合物中的氮氮双键对还原性物质的响应机制，制备的纳米递药载体可在生物体内的酶等生理活性物质作用下发生氮氮双键的还原裂解，实现递药载体在病灶微环境发生尺寸转变。生物体内能够介导偶氮苯化合物氮氮双键还原裂解的还原性物质包括谷胱甘肽、偶氮苯还原酶、肝微粒体等等，其中偶氮苯还原酶广泛存在于结肠、微生物以及肝脏中，肝微粒体又称肝药酶，主要存在于肝细胞内质网中。
偶氮苯是小分子疏水性化合物，在生物体内容易被巨噬细胞吞噬，将其与水溶性壳聚糖或壳聚糖衍生物这类高分子化合物结合，形成的初始复合物是较大尺寸的纳米粒子，在生物体内可获得长循环时间，使得能够在病灶组织大量富集；利用生物体内还原性物质(例如谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、偶氮苯还原酶)对偶氮苯化合物中的氮氮双键进行还原裂解，使得复合物裂解成多个小聚合物，增强病灶组织渗透性。同时，壳聚糖是天然高分子物质，生物安全性好。
具体地，偶氮苯化合物上带有羧基时，偶氮苯化合物上的羧基与壳聚糖上的氨基能够以静电相互作用或氢键方式结合；偶氮苯化合物上带有醛基时，醛基与壳聚糖上的氨基以共价键方式结合；偶氮苯化合物上带有碳碳双键时，碳碳双键与壳聚糖上的氨基以共价键方式结合；偶氮苯化合物上带有环氧基团时，环氧基团与壳聚糖上的氨基以共价键方式结合。
一些实施例中，所述壳聚糖衍生物为羟乙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖或羟丁基壳聚糖，这类物质水溶性更好。
一些实施例中，式I中R1和R2中远离苯环的端基均为羧基，该羧基与壳聚糖或壳聚糖衍生物中氨基的物质的量比为(0.5-2):1。可优选偶氮苯化合物两端分别带有一个羧基，在PBS缓冲液环境下，利用偶氮苯化合物的端羧基与壳聚糖衍生物上氨基的静电相互作用或氢键方式结合制备纳米凝胶，通过调整偶氮苯化合物与壳聚糖衍生物的投料比来控制羧基与氨基的比例，以研究带有不同电性的纳米凝胶在生理条件下的稳定性以及其粒径大小。当羧基的比例太大时，所制备的纳米凝胶容易发生沉积，并且尺寸增大，不利于在肿瘤组织富集。进一步优选地，羧基/氨基比为1:2，这样能使纳米凝胶带正电，在维持纳米凝胶在生理条件下稳定的同时，也更有利于细胞内化。
本发明通过探讨不同氧浓度、推吸电子基团及取代位置对偶氮苯裂解响应性的影响规律，筛选出了在肿瘤乏氧区域可发生缓慢裂解的纳米递药载体，更有利于长效释放药物，不容易被清除，在该慢响应纳米递药载体中，偶氮苯化合物上R1和R2中靠近苯环的基团相互独立地为羧基、氰基或硝基等吸电子基团，例如该偶氮苯化合物的结构式可如式II所示。
Figure BDA0003538711290000071
本发明通过探讨不同氧浓度、推吸电子基团及取代位置对偶氮苯裂解响应性的影响规律，还筛选出了在肿瘤乏氧区域可发生快速裂解的纳米递药载体，偶氮苯结构可在一定时间内快速响应还原性物质，使得递药载体发生尺寸转变，从而实现药物的深入渗透，在该快响应纳米递药载体中，偶氮苯化合物上R1中靠近苯环的基团为羧基、氰基或硝基等吸电子基团，R2中靠近苯环的基团为酰胺基、二烷基氨基、烷基氨基、氨基、羟基或烷氧基等给电子基团，例如该偶氮苯化合物的结构式可如式III所示。
Figure BDA0003538711290000072
本发明通过探讨不同氧浓度、推吸电子基团及取代位置对偶氮苯裂解响应性的影响规律，还筛选出了一种尺寸转变型递药载体，其偶氮苯结构中，R1中靠近苯环的基团为吸电子基团，例如羧基(-COOH)，R2中靠近苯环的一端在苯环和原本吸电子基团(如-COOH)之间连接有甲基，以屏蔽羧基的吸电子效应，从而得到一种氮氮双键还原裂解响应相对较慢的偶氮苯化合物，其结构式可如式IV所示，进而使得该递药载体的尺寸转变速度较慢。
Figure BDA0003538711290000073
Figure BDA0003538711290000081
本发明还提供了一种尺寸转变型纳米递药载体的制备方法，其包括如下步骤：将所述偶氮苯化合物溶于其良性溶剂中，将所述壳聚糖或其衍生物溶于溶剂中，一边搅拌一边将偶氮苯化合物溶液缓慢滴加到壳聚糖或其衍生物的溶液中，室温下搅拌过夜，制得尺寸转变型纳米递药载体凝胶。
一些实施例中，优选水溶性的壳聚糖衍生物来制备纳米递药载体，将壳聚糖衍生物溶解于中性PBS缓冲液中，偶氮苯化合物溶于氢氧化钠溶液中，再用PBS缓冲液稀释到合适浓度。
本发明还提供了上述尺寸转变型纳米递药载体在制备疾病治疗药物中的应用，尤其在制备抗肿瘤药物方面，本发明验证了其包载疏水性抗肿瘤药物表现出的优异的抗肿瘤药效。本发明简化了递药载体化学组成，筛选的快响应型纳米载体可快速响应裂解而发生尺寸转变，快速地深入渗透肿瘤组织内部；筛选的慢响应型纳米载体可用于药物的长效释放，有望在肿瘤组织中实现二阶响应性。
本发明还具体提供了一种纳米载药系统，其包括上述尺寸转变型纳米递药载体和负载在该尺寸转变型纳米递药载体上的药物。
一些实施例中，本发明纳米载药系统中负载的药物为疏水性药物，利用疏水包裹进行载药，该疏水性药物包括但不限于阿霉素、紫杉醇、喜树碱等。
本发明拟通过探讨不同氧浓度、推吸电子基团及取代位置对偶氮苯裂解响应性的影响规律，筛选出在病灶微环境可发生快速裂解和缓慢裂解的偶氮苯结构，其中快裂解型偶氮苯可使其发生尺寸转变，而慢裂解型偶氮苯则用于释放药物。在简化载体化学组成的基础上，以期实现药物在病灶组织内深入渗透和长效释放的双重效果，为研发新型纳米递药系统提供新思路。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1偶氮苯化合物AA-Azo的制备
Figure BDA0003538711290000091
称取4-硝基苯甲酸(12mmol)于反应瓶中，加入氢氧化钠(144mmol)和30mL去离子水，将该混合液置于70℃反应条件下使之完全溶解，随后滴加热的葡萄糖溶液(72mmol)，滴加完毕使其在70℃下反应12h，反应结束后过滤收集滤饼，将滤饼溶于热水中，用稀醋酸调节溶液pH至5～6，经过滤、洗涤、干燥后得到如式II所示的AA-Azo化合物，产率为75.3％，核磁共振氢谱图如图1所示。
实施例2偶氮苯化合物A-Azo的制备
Figure BDA0003538711290000092
(1)称取4-硝基苯乙酸(30mmol)于反应瓶，加入浓硫酸(2.1mL)和无水乙醇(21mL)，将该混合液置于80℃反应条件下搅拌反应过夜。反应结束后经旋蒸、萃取、洗涤、干燥，得到对硝基苯乙酸乙酯。
(2)称取对硝基苯乙酸乙酯(14.3mmol)于反应瓶，加入乙二醇单甲醚(42mL)、氯化铵(24mmol)、去离子水(11mL)、锌粉(41.3mmol)，将该混合液置于室温下反应过夜。反应结束后，过滤去除不溶物，在氮气氛围下，将反应液逐渐滴加至六水合三氯化铁(38.8mmol)、乙醇(18mL)和去离子水(75mL)的混合液中，在0℃下反应30min，将混合液倒入冷水中，过滤后在乙醇中重结晶，得到对亚硝基苯乙酸乙酯。
(3)称取对亚硝基苯乙酸乙酯(7.7mmol)和4-氨基苯甲酸(7.7mmol)于反应瓶，25mL冰乙酸，将该混合液在室温下搅拌过夜，反应结束后经柱层析纯化，将纯化后的产物溶于乙醇/水(1:2)的混合溶液中，加入氢氧化钠溶液(2M,8mL)，室温下搅拌过夜，反应结束后使用盐酸溶液(1M)调节pH至1～2，经过滤、洗涤、干燥得到如式IV所示的A-Azo化合物，产率为54.9％，核磁共振氢谱图如图2所示。
实施例3偶氮苯化合物AD-Azo的制备
Figure BDA0003538711290000101
(1)称取N-甲基苯胺(10mmol)于反应瓶，加入无水碳酸钠(15mmol)、溴乙酸乙酯(11mmol)和乙醇(20mL)，加热使其回流反应14h。反应结束后，加入去离子水淬灭反应，经萃取、洗涤、干燥得到2-[(甲基苯基)氨基]乙酸乙酯。
(2)称取2-[(甲基苯基)氨基]乙酸乙酯(7.3mmol)和37％盐酸(5mL)于反应瓶，在0℃下缓慢滴加4-氨基苯甲酸(7.3mmol)、18％盐酸(15mL)和亚硝酸钠(7.3mmol)的混合液，将上述混合液在室温下搅拌4h，反应结束后过滤、洗涤、干燥，将所得到的产物溶于甲醇/水(4:1)的混合液中，加入一水合氢氧化锂(9mmol)，将上述混合液在室温下搅拌过夜，反应结束后经旋蒸、萃取、柱层析纯化产物，得到如式III所示的AD-Azo化合物，产率为55.4％，核磁共振氢谱图如图3所示。
实施例4式V所示偶氮苯化合物交联壳聚糖制备纳米递药载体
Figure BDA0003538711290000102
称取壳聚糖(2mmol)于反应瓶，加入0.06M稀盐酸使其溶解，随后加入式V所示的偶氮苯的乙醇溶液，将该溶液在60℃下搅拌反应7h，反应结束后经蒸发、透析，得到纳米递药载体产物。
实施例5式VI所示偶氮苯化合物交联壳聚糖制备纳米递药载体
Figure BDA0003538711290000111
称取壳聚糖(2mmol)于反应瓶，加入0.06M稀盐酸使其溶解，随后加入式VI所示的偶氮苯的甲醇溶液，在室温下搅拌反应3h，反应结束后经蒸发、透析，得到纳米递药载体产物。
实施例6Azo-CS纳米递药载体的制备
将壳聚糖(CS)溶解于0.06M稀盐酸，同理分别将实施例1～实施例3偶氮苯化合物溶于0.07M氢氧化钠溶液中，用PBS缓冲液将壳聚糖稀释至2.56mM，再用PBS缓冲液将偶氮苯化合物稀释至1.28/2.56/0.64mM，在搅拌下，取1mL偶氮苯化合物溶液缓慢滴加至1mL壳聚糖溶液中，室温下搅拌过夜后成功制备氨基/羧基比分别为1:1、1:2、2:1的纳米递药载体，利用动态光散射(DLS)表征上述纳米凝胶的粒径分布，表征结果如表1所示。
表1 Azo-CS纳米递药载体的DLS表征结果
Figure BDA0003538711290000112
实施例7 Azo-GC纳米递药载体的制备
如图4所示，将羟乙基壳聚糖(GC)溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)配制浓度为2.56mM的羟乙基壳聚糖溶液，同理分别将实施例1～实施例3制备的偶氮苯化合物溶于0.07M氢氧化钠溶液中，再用PBS缓冲液将偶氮苯化合物稀释至1.28/2.56/0.64mM，在搅拌下，取1mL偶氮苯化合物溶液缓慢滴加至1mL羟乙基壳聚糖溶液中，室温下搅拌过夜后成功制备氨基/羧基比分别为1:1、1:2、2:1的纳米递药载体。利用动态光散射(DLS)表征上述纳米凝胶的粒径分布，表征结果如表2所示。本实施例制备的Azo-GC纳米递药载体粒径分布均在200nm～300nm左右，后续实验中选择羧基/氨基比为1:2的体系进行研究，因为氨基过量可使纳米凝胶带正电，而生物细胞膜通常带负电，这样既能维持纳米凝胶在生理条件下稳定，也更有利于细胞内化。
表2 Azo-GC纳米递药载体的DLS表征结果
Figure BDA0003538711290000121
实施例8 Azo-FITC/GC纳米递药载体的制备
将羟乙基壳聚糖、异硫氰酸荧光素(FITC)溶解于0.5M碳酸钠缓冲液中，反应液在室温下避光搅拌过夜，反应结束后使用透析袋(MWCO 3500)去离子水透析24h，反应结束后冷冻干燥，得到产物FITC标记羟乙基壳聚糖(FITC/GC)，通过紫外可见吸收光谱仪测量其在490nm处的吸收值来计算FITC的标记含量。同实施例7，分别将实施例1～实施例3制备的偶氮苯化合物溶于0.07M氢氧化钠溶液中，将FITC/GC溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)中，调节偶氮苯化合物与羟乙基壳聚糖之间的比例，控制混合后溶液中羟乙基壳聚糖的浓度为1.28mM，利用壳聚糖上氨基与偶氮苯化合物上羧基之间的静电相互作用/氢键制备氨基/羧基比为2:1的纳米递药载体。此外，将4,4-联苯二甲酸(H2BPDC)溶解于0.08M氢氧化钠溶液中，调节其与羟乙基壳聚糖之间的比例，控制混合后溶液中羟乙基壳聚糖的浓度为1.28mM，制备氨基/羧基比为2:1的纳米递药载体作为对照。利用DLS表征上述递药载体的粒径分布，表征结果如表3所示。由表3可以看出，本发明Azo-FITC/GC纳米递药载体初始粒径较H2BPDC-FITC/GC粒径大。
表3 Azo-FITC/GC纳米递药载体的DLS表征结果
材料 AA-FITC/GC A-FITC/GC AD-FITC/GC H2BPDC-FITC/GC
D<sub>h</sub>/nm 205.8 187.1 240.4 175.6
实施例9 Azo-GC纳米递药载体的细胞毒性实验
将4T1细胞和3T3细胞以1×104细胞/孔的密度接种在96孔板中，每孔含有胎牛血清含量为10％的培养基100μL，在37℃、5％CO2浓度的条件下培养过夜。然后，除去培养基，换之以新鲜的培养基，分别加入相应浓度的实施例1～实施例3制备的三种偶氮苯化合物、羟乙基壳聚糖以及纳米递药载体复合物，培养24h后，利用CCK-8试剂检测细胞活性，用酶标仪读取450nm处的吸收值。
细胞存活率按如下公式计算：
细胞存活率(％)＝100％×[A(实验孔)-A(空白孔)]/[A(对照孔)-A(空白孔)]
A(实验孔)：含细胞的培养基溶液、CCK-8试剂、待测物在450nm处的吸收值
A(对照孔)：含细胞的培养基溶液、CCK-8试剂、无待测物在450nm处的吸收值
A(空白孔)：不含细胞的培养基溶液、CCK-8试剂、无待测物在450nm处的吸收值
检测结果如图5所示，本发明实施例1～实施例3提供的偶氮苯化合物及其与羟乙基壳聚糖复合后所形成的纳米递药载体均具有良好的生物相容性，满足生物安全要求。
实施例10 Azo-GC纳米递药载体的体外响应实验
本实施例采用的三种Azo-GC纳米递药载体为实施例7中制备的氨基/羧基比为2:1的偶氮苯-羟乙基壳聚糖纳米凝胶AA-GC、A-GC和AD-GC。取50μL 100mM连二亚硫酸钠溶液，分别加入至950μL三种纳米递药载体中，通过紫外可见吸收光谱仪检测溶液吸光度的变化，以表征偶氮苯降解过程；利用DLS表征递药载体的尺寸转变过程，并利用origin9.0进行曲线拟合，计算半衰期，检测结果如图6所示。向纳米凝胶中加入连二亚硫酸钠溶液至特定时间后，向其中加入10μL质量分数为30％的过氧化氢溶液中止纳米凝胶的还原裂解，随后将混合液转移至透析袋(MWCO 3500)透析过夜，将铜网浸入透析后的溶液中，烘干后进行TEM表征，结果如图7所示。
从图6可以看出，在连二亚硫酸钠的还原作用下，所制备的Azo-GC纳米递药载体的尺寸由最初的200nm左右逐渐缩减至30nm左右，满足体内长循环、富集以及肿瘤深层渗透的需求。使用TEM表征不同还原时间下随着偶氮苯化合物的裂解纳米凝胶的粒径变化过程和形貌，结果如图7所示，证实了纳米凝胶的尺寸是由大到小逐步缩减的。在断裂响应速度上，实施例1的偶氮苯化合物与GC的复合体(AA-GC)响应最慢，实施例3的偶氮苯化合物与GC的复合体(AD-GC)响应最快，实施例2的偶氮苯化合物与GC的复合体(A-GC)响应介于二者之间。
实施例11 Azo-GC纳米递药载体的肝微粒体酶降解实验
本实施例采用的三种Azo-GC纳米递药载体为实施例7中制备的氨基/羧基比为2:1的偶氮苯-羟乙基壳聚糖纳米凝胶AA-GC、A-GC和AD-GC，对其进行肝微粒体酶降解实验，探讨不同氧浓度环境对于递药载体断裂响应的影响，具体操作如下：
取三种纳米递药载体各20μL于聚合管中，分别加入10μL肝微粒体、10μL 20mM的NADPH；调节充入的氮气/氧气混合气体比例，控制聚合管内的氧浓度分别为0％、3％、6.4％、10％；将所有样品在37℃孵育一系列时间，反应结束后，离心，取上层清液，利用紫外可见吸收光谱仪检测溶液吸光度，并利用origin9.0进行曲线拟合，计算半衰期，检测结果如图8所示。
从检测结果可以看出，对于同一Azo-GC纳米递药载体而言，氧含量越低，载体的断裂响应速度越快，氧含量升高，会阻碍载体发生尺寸转变，说明肿瘤乏氧区域有利于偶氮苯发生断裂，使得纳米递药载体转变成小粒径，从而便于药物的组织渗透。
实施例12 Azo-FITC/GC纳米递药载体在3D细胞球中的渗透性实验
本实施例采用的三种Azo-FITC/GC纳米递药载体为实施例8中制备的氨基/羧基比为2:1的偶氮苯-羟乙基壳聚糖纳米凝胶AA-FITC/GC、A-FITC/GC和AD-FITC/GC。将贴壁生长的4T1细胞用胰酶消化后，取细胞数约为1×104的细胞悬液加入至超低吸附的96孔板中，轻轻摇晃均匀后将细胞置于37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养。每间隔2天换液，约7天后形成直径约为200nm的4T1细胞球。加入三种纳米递药载体，在37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养24h后，用PBS洗涤三次，转移至激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)玻底培养皿中，再重新加入少量的无血清培养基使之保持悬浮状态，用CLSM观察并拍照。同样地，用GC和H2BPDC-FITC/GC作为对照，结果如图9、10所示。
从图9可以看出，乏氧条件下共孵育24h后，GC由于一直保存着较小的尺寸，因此在细胞球内部的渗透较深；AD-FITC/GC的断裂响应快于A-FITC/GC且远快于AA-FITC/GC，因此AD-FITC/GC的渗透更深一些；H2BPDC-FITC/GC在细胞球内部不会发生尺寸转变，一直保持着较大的尺寸，因此荧光分布在细胞球的外层区域。进一步延长孵育时间至48小时，如图10所示，可以看到AD-FITC/GC、A-FITC/GC和AA-FITC/GC在肿瘤球的大部分区域均显示出较强的荧光，表明所制备的三种尺寸转变型纳米凝胶药物载体均具备优越的肿瘤组织渗透能力。
实施例13 Dox@Azo-GC纳米载药系统的制备
本实施例以阿霉素(DOX)作为抗癌药物，通过疏水包裹将其负载到不同的载药体系中。首先，称取2.4mgDOX·HCl，加入1mL二甲基亚砜(DMSO)使之完全溶解，然后稀释配制浓度为4.8、9.6、19.2、38.4、76.8μg/mL的溶液，在最大吸收波长处(480nm)测定吸光度，绘制标准曲线。
称取DOX·HCl(10mg)于反应瓶，向其中加入1mL二甲基亚砜和7.2μL三乙胺，避光反应过夜后待用。分别称取一定量的AA、A、AD以及GC溶于DMSO中，配置成10mg/mL的溶液。对于AA体系而言，取10mg/mL的AA-DMSO溶液17.3μL，加入10mg/mL GC-DMSO 52.5μL、10mg/mLDOX-DMSO 10μL，在超声下，以200μL/min的速度滴加1920μL PBS，滴加完毕避光搅拌6h，随后置于透析袋(3500Da)避光透析过夜，随后通过紫外测量吸光度计算载药量和包封率；对于A体系而言，取10mg/mL的A-DMSO溶液18.2μL，加入10mg/mL GC-DMSO 52.5μL、10mg/mLDOX-DMSO 10μL，在超声下，以200μL/min的速度滴加1919μL PBS，滴加完毕避光搅拌6h，随后置于透析袋(3500Da)避光透析过夜，随后通过紫外测量吸光度计算载药量和包封率；对于AD体系而言，取10mg/mL的AD-DMSO溶液20μL，加入10mg/mL GC-DMSO 52.5μL、10mg/mLDOX-DMSO 10μL，在超声下，以200μL/min的速度滴加1918μL PBS，滴加完毕避光搅拌6h，随后置于透析袋(3500Da)避光透析过夜，随后通过紫外测量吸光度计算载药量和包封率。载药量和包封率的计算公式如下：
Figure BDA0003538711290000161
Figure BDA0003538711290000162
表4 Azo-GC纳米递药载体中阿霉素的含量测定
样品 载药量/％ 包封率/％
Dox@AA-GC 4.72 24.75
Dox@A-GC 4.98 26.13
Dox@AD-GC 5.01 26.31
实施例14纳米载药系统的稳定性测试
本实施例针对实施例13制备的三种Dox@Azo-GC载药纳米凝胶，进一步研究其体外稳定性，如图11所示，在室温放置30天后，三种载药纳米凝胶的粒径基本无变化，无显著变大趋势，该结果显示Dox@Azo-GC载药纳米凝胶具有较好的体外稳定性。
实施例15纳米载药系统的细胞摄取测试
将4T1细胞以1×105个细胞/孔的密度接种至共聚焦培养皿中，加入800μL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养过夜。更换新鲜的无血清培养基(pH 7.4)，分别加入实施例13制备的三种纳米凝胶，共孵育4h后使用PBS洗涤三次，加入200μLHoechst 33342染色液染色30min，用PBS洗涤三次，再加入1μMLysotrackerred染色15min，在上转换激光共聚焦显微镜下观察。结果如图12所示，在孵育4h后，标记在羟乙基壳聚糖上的FITC荧光与细胞核共定位，并未进入溶酶体中，表明纳米凝胶能够顺利进入细胞核释放药物进行治疗。
实施例16纳米载药系统的抗肿瘤活性测试
选取5周龄的Balb/c雌性小鼠适应喂养1周，随后将4T1细胞用PBS缓冲液稀释至密度为2×107个细胞/mL，在小鼠的背部右侧皮下接种100μL细胞悬液建立4T1皮下肿瘤模型。喂养一周后，肿瘤体积达到100-150mm3，将小鼠随机分成游离阿霉素组、PBS对照组以及Dox@AD-GC、Dox@A-GC、Dox@AA-GC给药组，每组3只，每隔一天进行尾静脉注射给药，给药剂量为Dox 2mg/kg，每次给药时记录小鼠肿瘤体积以及小鼠体重。治疗14天后，用颈椎脱臼法处死小鼠，取出小鼠肿瘤进行称重，计算肿瘤抑制率。
为了研究Dox@Azo-GC纳米凝胶的生物安全性，我们记录了给药期间小鼠的体重变化，结果如图13所示，游离阿霉素组、PBS对照组以及Dox@AD-GC、Dox@A-GC、Dox@AA-Gc给药组体重均无显著影响，表明所用剂量的药物对小鼠均无明显的毒副作用。
为了评价Dox@Azo-GC纳米凝胶的体内抗肿瘤效果，我们实时监测了给药期间小鼠肿瘤体积变化。如图14所示，PBS对照组的荷瘤小鼠其肿瘤一直处于快速生长状态，相比游离阿霉素组和PBS对照组，Dox@Azo-GC纳米凝胶显示出优越的抑瘤效果。在抑瘤实验结束后，将剥离的肿瘤组织进行称重，结果如图15所示，Dox@Azo-GC纳米凝胶具有最强的抑瘤能力，并且Dox@AD-GC纳米凝胶的抑瘤率达到92％。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种尺寸转变型纳米递药载体，其特征在于：所述纳米递药载体是由偶氮苯化合物与水溶性壳聚糖或壳聚糖衍生物通过静电相互作用、氢键或共价键结合形成的复合物，所述偶氮苯化合物的结构通式如式I所示：
Figure FDA0003538711280000011
R1和R2中远离苯环的端基均为羧基、醛基、碳碳双键或环氧基，R1和R2中靠近苯环的基团相互独立地为羧基、氰基、硝基、酰胺基、二烷基氨基、烷基氨基、氨基、羟基或烷氧基；
所述纳米递药载体在生物体血液循环中能够稳定存在，并能够在病灶微环境中响应还原性物质而发生氮氮双键的还原裂解，从而实现纳米递药载体尺寸的转变，通过调整所述偶氮苯化合物上与苯环连接的推/吸电子基团类型能够有效调控所述纳米药物载体的尺寸转变速度快慢。
2.根据权利要求1所述的尺寸转变型纳米递药载体，其特征在于：所述壳聚糖衍生物为羟乙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖或羟丁基壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的尺寸转变型纳米递药载体，其特征在于：所述R1和R2中远离苯环的端基均为羧基，所述羧基与所述壳聚糖或壳聚糖衍生物中氨基的物质的量比为(0.5-2):1。
4.根据权利要求3所述的尺寸转变型纳米递药载体，其特征在于：所述羧基与所述氨基的物质的量比为2:1。
5.根据权利要求1所述的尺寸转变型纳米递药载体，其特征在于，所述R1和R2中靠近苯环的基团相互独立地为羧基、氰基或硝基。
6.根据权利要求1所述的尺寸转变型纳米递药载体，其特征在于：所述R1中靠近苯环的基团为羧基、氰基或硝基，所述R2中靠近苯环的基团为酰胺基、二烷基氨基、烷基氨基、氨基、羟基或烷氧基。
7.权利要求1-6任一所述的尺寸转变型纳米递药载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述偶氮苯化合物溶于其良性溶剂中，将所述壳聚糖或其衍生物溶于溶剂中，一边搅拌一边将偶氮苯化合物溶液缓慢滴加到壳聚糖或其衍生物的溶液中，室温下搅拌过夜，制得尺寸转变型纳米递药载体凝胶。
8.权利要求1-6任一所述的尺寸转变型纳米递药载体在制备疾病治疗药物中的应用。
9.一种纳米载药系统，其特征在于：包括权利要求1-6任一所述的尺寸转变型纳米递药载体和负载在所述尺寸转变型纳米递药载体上的药物。
10.根据权利要求9所述的纳米载药系统，其特征在于：所述药物为疏水性药物。
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