CN106619569B - 共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法，制备方法为：(1)聚赖氨酸接枝β‑环糊精衍生物的制备；(2)载化疗药物的纳米粒子的制备；(3)共载化疗药物和核酸的纳米粒子的制备；(4)共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备；本发明制备工艺简单，易于操作，省时节能，且所用载体材料生物安全性高，具有良好生物相容性、可生物降解性、无毒性，无免疫原性。本发明的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子具有典型的核‑壳结构，粒径为150～200nm，可以有效地将化疗药物和核酸同时携带进入高表达CD44分子的细胞，抑制细胞增殖，并具有显著的体内外肿瘤靶向性。

Description

共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法
技术领域
本发明属于纳米药物领域，具体地涉及一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法。
背景技术
恶性肿瘤的发病率、死亡率呈现逐年增加的趋势，严重威胁着人类的健康。近年来，随着肝外科技术、麻醉技术以及围手术期处理水平的不断进步，手术治疗成为治疗恶性肿瘤的首选。然而，临床绝大多数的患者在确诊时已经失去了手术的机会。化疗也是治疗恶性肿瘤的常见策略之一，但是由于肿瘤具有异质性，单一的化疗往往不能取得理想的疗效，且患者易对化疗产生耐受。
上个世纪60年代末，美国科学家Michael Blaese首次在医学界提出了基因治疗的概念。肿瘤的发生发展过程中涉及多种基因的表达和功能异常，而这些基因异常与细胞的生长、分化和死亡等密切相关。基因/药物联合治疗能够针对肿瘤细胞内的不同靶点发挥治疗作用，从而发挥协同治疗作用，提高药物疗效；与单一治疗方法相比，联合治疗方法可以减少药物剂量，从而降低毒副作用；此外，基因/药物联合治疗还能够有效地降低肿瘤耐药的发生。
然而，在实际应用中，联合治疗仍然面临着巨大的挑战，主要包括：如何保证核酸药物在体内不降解，如何解决化疗药物的溶解性问题，以及如何将二者同时靶向输送至肿瘤部位并实现有效释放。因此，设计一种简单有效的共输送体系是联合治疗成功的关键。
聚赖氨酸是一种阳离子多肽，其结构中的伯氨基通过质子化作用而使其带正电荷，通过静电作用可与表面带磷酸基的核酸复合形成纳米粒子。低分子量的赖氨酸(＜3000)可质子化伯氨基数量少，较难与核酸形成稳定的复合物，而高分子的聚赖氨酸虽然可以提高转染效率，但却有着细胞毒性大的缺点。因此，有必要对其进行结构改造、表面修饰等方法来提高其性能。
天然材料β-环糊精(β-Cyclodextrin,β-CD)，具有良好的生物相容性及可降解性等优势，其可以通过“主-客体”相互作用包合多种疏水性小分子，提高药物溶解性，增加药物稳定性。然而，单一的β-CD并不能与疏水性药物实现自组装。将β-环糊精引入聚合物的结构中使其具备特殊的结构与性质，是一种优良的药物载体材料。因此，将β-环糊精与聚赖氨酸有效的结合，不仅有效降低了聚赖氨酸的毒性，可以实现药物和核酸的共载。
目前，尚未有用透明质酸与共载化疗药物和核酸制成肿瘤靶向纳米粒子的报道。
发明内容
本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种制备简捷、省时节能的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子。
本发明的第二个目的是提供共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法。
本发明的第三个目的是提供共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将6-醛基化β-环糊精、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于pH＝4.4的醋酸盐缓冲溶液中，室温搅拌1-2h，加入氰基硼氢化钠，室温继续搅拌48～72h；加氢氧化钠水溶液使体系呈中性，在半透膜截留分子量为7000Da的条件下超纯水透析2d、透析液冷冻干燥获得聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物；所述聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物简称PLCD；
所述聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；
以赖氨酸结构单元计的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、6-醛基化β-环糊精和氰基硼氢化钠的摩尔比为1:(0.5～2):4；
(2)按质量比为1:(0.3～0.5)的比例，将PLCD与疏水性化疗药物溶解于二甲基亚砜中，室温搅拌8～12h，在半透膜截留分子量为8000～14000Da的条件下纯水透析24h、冷冻干燥，得到载化疗药物的纳米粒子；
(3)将载化疗药物的纳米粒子与核酸分别溶于DEPC水中，调节两种溶液的浓度使载化疗药物的纳米粒子与核酸的N/P摩尔比为30～50:1，将二者等体积混合，涡旋震荡20～30s，经室温静置孵育30～60min，得共载化疗药物和核酸的纳米粒子；
(4)将共载化疗药物和核酸的纳米粒子滴加于质量浓度为0.75～1.0mg/mL的透明质酸水溶液中，在200-400rpm的条件下，搅拌5-10min，得共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子；透明质酸与共载化疗药物和核酸的纳米粒子的质量比为(3～4):6。
疏水性化疗药物优选阿霉素、喜树碱或紫杉醇，也可以用其它的疏水性化疗药物。
核酸优选为质粒DNA、小干扰RNA、microRNA或无功能核苷酸序列，也可以使用其它的核酸。
质粒DNA优选质粒pEGFP-C1，也可以选其它的质粒。
小干扰RNA为c-myc siRNA，所述c-myc siRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
microRNA为miR-122，所述miR-122核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
无功能核苷酸序列为Control RNA或异硫氰酸荧光素标记的RNA，即FAM-RNA；所述Control RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述FAM-RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
透明质酸分子量为20000～40000Da。
上述方法制备的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子。
上述共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子在制备抗肝癌或抗乳腺癌药物中的应用。
本发明的优点：
本发明制备工艺简单，易于操作，省时节能，且所用载体材料生物安全性高，具有良好生物相容性、可生物降解性、无毒性，无免疫原性。
本发明的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子具有典型的核-壳结构，粒径为150～200nm，可以有效地将化疗药物和核酸同时携带进入高表达CD44分子的细胞，抑制细胞增殖，并具有显著的体内外肿瘤靶向性。
附图说明
图1，实施例1中β-环糊精(β-CD)、6-单-(对-甲苯磺酰基)-β-环糊精(6-Ts-CD)、6-醛基化β-环糊精(6-Ald-CD)、聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物(PLCD)的红外光谱图；
图2，实施例1中的β-CD、6-Ts-CD、6-Ald-CD、PLCD的核磁氢谱图；
图3，实施例1中不同氮磷比时载药体系PLCD/DOX压缩寡聚RNA的琼脂糖电泳结果；
图4，实施例1中氮磷比为30:1时共载药物和基因的纳米复合物(PDR)的电子显微镜照片(a)和粒径分布图(b)；
图5，实施例1中不同质量比时透明质酸(HA)包裹PDR纳米复合物后的琼脂糖电泳结果；
图6，实施例1中不同质量比时HA包裹PDR纳米复合物后的粒径和Zeta电位分析；
图7，实施例1中HA与PDR质量比为3:6时的共载药物和基因的肿瘤靶向纳米复合物(HPDR)的透射电子显微镜照片(a)及粒径分布图(b)；
图8，实施例2中PDR及HPDR在不同pH值介质中阿霉素的体外释放曲线。
图9，实施例3中PDR及HPDR分别处理肝癌细胞MHCC-97H后的激光共聚焦显微镜照片。
图10，实施例4中PDR及HPDR分别处理肝癌细胞MHCC-97H的细胞毒性比较。
图11，实施例5中PDR及HPDR在裸鼠体内的组织分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
质粒pEGFP-C1(市售)。
6-单-(对-甲苯磺酰基)-β-环糊精(6-Ts-CD)的合成
将180gβ-环糊精(β-CD)混悬于1.5L蒸馏水中，使用恒压滴液漏斗向混悬液中缓慢滴加60mL NaOH溶液(8.2M)。滴加完待溶液澄清后，将反应体系置于冰水浴中。另将45.4g对甲苯磺酰氯溶于135mL乙腈，逐滴加入至上述反应体系。将体系置于23℃水浴中，搅拌反应2h后，离心收集生成的沉淀，上清液用HCl调节pH至6左右，置于4℃冰箱中过夜，离心收集析出的沉淀。两次沉淀合并，在水中重结晶两次，真空干燥得到白色粉末6-单-(对-甲苯磺酰基)-β-环糊精(6-Ts-CD)(产率为12.9％)
6-醛基化-β-环糊精(6-Ald-CD)的合成
取4g上述制备的6-Ts-CD溶于40mL干燥的DMSO中，加入16mL三乙胺，反应体系在氮气保护下逐渐升高温度至135℃，继续搅拌反应5h，而后将反应产物倾入丙酮中，离心收集沉淀，经反复洗涤真空干燥即得6-Ald-CD(产率为69％)。
通过红外光谱仪和核磁共振波谱仪对β-CD、6-Ts-CD、6-Ald-CD进行化学结构表征，红外谱图见图1，核磁共振氢谱图见图2。
实施例1
(1)聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物(PLCD)的合成
将282mg(0.25mmol)6-Ald-CD、57mg(其中赖氨酸结构单元为0.25mmol)聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于5mL pH 4.4的醋酸盐缓冲溶液(0.2M)中，室温搅拌反应1h，加入62.8mg(1mmol)氰基硼氢化钠，室温继续搅拌72h，加2M的NaOH水溶液使体系调节至中性，而后将反应体系转移至透析袋中(截留分子量为7000Da)，超纯水中透析2d，透析液经冷冻干燥，所得白色絮状产物即为聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物(PLCD)，其中β-CD的取代度为12.9％。
所述聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；
通过红外光谱仪和核磁共振波谱仪对PLCD进行化学结构表征，红外谱图见图1，核磁共振氢谱图见图2。
(2)载阿霉素的纳米粒子的制备与表征
精密称取10mg PLCD及3.2mg盐酸阿霉素(含阿霉素3mg)溶于1mL二甲基亚砜中，加入2.2μL三乙胺使盐酸阿霉素脱盐，室温搅拌8h，将体系转移至透析袋中(截留分子量为8000～14000Da)，经纯水透析24h，透析液经冷冻干燥，所得暗红色絮状产物即得载阿霉素的纳米粒子(PLCD/DOX)；采用动态光散射检测PLCD/DOX的粒径为199.1nm，Zeta电位为40.5mV；采用紫外光谱法于480nm处检测DOX的载药量为11.0％。
(3)载阿霉素和Control RNA的纳米粒子的制备与表征
将Control RNA用DEPC水配制成0.1mg/mL，同时，PLCD/DOX用DEPC水溶解，分别配制成0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL及5.0mg/mL的溶液，然后取50μL各种浓度的PLCD/DOX溶液加入等体积的Control RNA溶液中，使得各个体系中PLCD/DOX与Control RNA的N/P摩尔比为1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1及50:1，涡旋震荡30s，室温静置孵育30min，即得共载阿霉素和Control RNA的复合物(PLCD/DOX)/RNA。
采用琼脂糖凝胶电泳法考察PLCD/DOX对Control RNA的复合能力，当N/P比大于等于30:1时，RNA的迁移可以完全被抑制，结果见图3。
N/P比为30:1时制备的(PLCD/DOX)/RNA简称为PDR。
采用透射电子显微镜(TEM)观察PDR纳米粒子呈规则球形，结构致密；采用动态光散射法检测PDR纳米粒子的粒径为168.9nm,Zeta电位为38.7mV；TEM照片与粒径分布图见图4。
(4)共载阿霉素和Control RNA的肿瘤靶向纳米粒子的制备与表征
将透明质酸(HA)溶于DEPC水中，分别稀释成0.25mg/mL,0.50mg/mL,0.75mg/mL及1.0mg/mL的水溶液，然后将100μL PDR溶液(1.505mg/mL)逐滴加入等体积的HA溶液中，使各个体系中的HA与PDR的质量比分别为1:6，2:6，3:6，4:6；200rpm搅拌5min，得共载阿霉素和Control RNA的肿瘤靶向纳米粒子HA/(PLCD/DOX)/RNA；
采用琼脂糖凝胶电泳法考察个HA修饰PDR后对RNA复合情况的影响，结果见图5，实验结果表明修饰HA后不会影响PDR对RNA的复合；采用动态光散射法表征不同HA/PDR质量比制备的纳米复合物的粒径及zeta电位变化，当HA/PDR的质量比增加至3:6时，纳米粒子的粒径为195.6nm，zeta电位由正电转变为负电，为-22.7mV，变化趋势如图6；
HA与PDR的质量比为3:6时制备的HA/(PLCD/DOX)/RNA简称HPDR。
采用TEM观察HPDR的形态呈规则球形，并具有典型的“核-壳”结构；TEM照片及粒径分布见图7。
实施例2
体外药物释放实验
将实施例1制备的PDR和HPDR各取三份，每份1mL，转移至透析袋中(截留分子量为8000～14000Da)，分别置于10mL pH 5.0、6.5及7.4的PBS溶液中，37℃避光振荡(100rpm)，于不同的时间点(见图8)取出1.5mL介质用于测试，并补充等体积的新鲜透析介质；采用紫外分光光度仪检测DOX的释放量(检测波长为480nm)。按照以下公式计算药物累积释放率：DOX累积释放率＝(DOX释放量/投入DOX总量)×100％。DOX释放曲线见图8，呈现缓慢释药的特性，并具有显著的pH敏感性。
实施例3
细胞摄取研究
以FAM-RNA替代实施例1中的Control RNA，其它同实施例1，制备的PDR和HPDR分别命名为PDRFAM和HPDRFAM。
采用肝癌细胞系MHCC-97H考查PDRFAM和HPDRFAM进入细胞的能力及定位；上述细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养，培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基；待细胞生长处于对数生长期，消化细胞按照5×104细胞/孔的密度接种于预先铺好激光共聚焦专用玻璃片的12孔板中，培养24h后，加入无血清培养基稀释的游离DOX，FAM-RNA，PDRFAM和HPDRFAM，使体系中DOX终浓度为3.3μg/mL，FAM-RNA终浓度为1.0μg/mL；孵育4h后，细胞经4％多聚甲醛固定，DAPI染细胞核，取出玻璃片，于激光共聚焦显微镜下观察细胞内荧光情况，结果见图9。PDRFAM和HPDRFAM均能同时携载DOX和FMA-DNA进入细胞，且经HPDRFAM处理的细胞内荧光明显增强，说明HPDRFAM较PDRFAM具有明显的肿瘤靶向性。
实施例4
细胞毒性研究
采用肝癌细胞系MHCC-97H研究实施例1中的PDR和HPDR对细胞的杀伤作用。上述细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养，培养基为含10％FBS的高糖DMEM培养基。待细胞生长处于对数生长期，消化细胞按照4×104细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24h后，加入不同浓度的PDR和HPDR。孵育48h后，加入CCK-8测定于450nm处测定吸光度。按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率＝(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)×100％，结果见图10。结果表明：PDR和HPDR对肝癌细胞的杀伤作用呈现浓度依赖性，且HPDR具有更强的细胞杀伤作用。
实施例5
小鼠体内组织分布考察
以近红外荧光探针Cy5.5对实施例1制备的PDR和HPDR进行标记，方法如下：
步骤(1)、(2)同实施例1步骤(1)、(2)
(3)Control RNA用DEPC水配制成0.1mg/mL，PLCD/DOX用DEPC水溶解，配制成3.0mg/mL的溶液，Cy5.5溶于二甲基亚砜中，使其终浓度为5mg/mL，取6.0μL Cy5.5的二甲基亚砜溶液加入200μL PLCD/DOX的水溶液中，室温搅拌4h，然后将其加入200μL的ControlRNA液中，使体系中PLCD/DOX与Control RNA的N/P摩尔比为30:1，涡旋震荡30s，室温静置30min，得Cy5.5标记的PDR，命名为PDRCy5.5。
(4)将透明质酸(HA)溶于DEPC水中，稀释成0.75mg/mL，然后将200μL PDRCy5.5溶液(1.505mg/mL)逐滴加入等体积的HA溶液中，使体系中的HA与PDRCy5.5的质量比为3:6；200rpm搅拌5min，得Cy5.5标记的HPDR，命名为HPDRCy5.5。
MHCC-97H裸鼠肝癌皮下移植瘤模型：对数生长期的MHCC-97H细胞经胰酶消化离心后，用无血清DMEM培养基重悬，并调整细胞浓度至5×107个/mL。然后用注射器吸取200μL上述细胞悬液接种于裸鼠皮下，裸鼠经饲养3～4周后，即形成MHCC-97H荷瘤裸鼠用于以下实验。
将荷瘤裸鼠分为3组，经尾静脉分别注射生理盐水、PDRCy5.5和HPDRCy5.5，然后利用活体成像分别于2h，8h，24h观察Cy5.5在裸鼠体内各组织脏器中的分布，成像照片见图11。结果表明：PDRCy5.5和HPDRCy5.5在8h开始滞留于肝脏，给药24h后PDRCy5.5主要富集于肝脏和肿瘤，而HPDRCy5.5主要富集于肿瘤部位，说明HPDR具有更强的肿瘤靶向性。
实施例6
一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将6-醛基化β-环糊精、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于pH＝4.4的醋酸盐缓冲溶液中，室温搅拌2h，加入氰基硼氢化钠，室温继续搅拌48h；加氢氧化钠水溶液使体系呈中性，在半透膜截留分子量为7000Da的条件下超纯水透析2d、透析液冷冻干燥获得聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物；所述聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物简称PLCD；
所述聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；
以赖氨酸结构单元计的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、6-醛基化β-环糊精和氰基硼氢化钠的摩尔比为1:0.5:4；
(2)按质量比为1:0.4的比例，将PLCD与喜树碱溶解于二甲基亚砜中，室温搅拌10h，在半透膜截留分子量为8000～14000Da的条件下纯水透析24h、冷冻干燥，得到载喜树碱的纳米粒子；
(3)将载喜树碱的纳米粒子与pEGFP-C1分别溶于DEPC水中，调节两种溶液的浓度使载喜树碱的纳米粒子与pEGFP-C1的N/P摩尔比为30:1，将二者等体积混合，涡旋震荡20s，经室温静置孵育60min，得共载喜树碱和pEGFP-C1的纳米粒子；
(4)将共载喜树碱与pEGFP-C1的纳米粒子滴加于质量浓度为1.0mg/mL的透明质酸水溶液中，在300rpm的条件下，搅拌10min，得共载喜树碱与pEGFP-C1的肿瘤靶向纳米粒子；透明质酸与共载喜树碱与pEGFP-C1的纳米粒子的质量比为3:6。
实施例7
一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)将6-醛基化β-环糊精、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于pH＝4.4的醋酸盐缓冲溶液中，室温搅拌1.5h，加入氰基硼氢化钠，室温继续搅拌60h；加氢氧化钠水溶液使体系呈中性，在半透膜截留分子量为7000Da的条件下超纯水透析2d、透析液冷冻干燥获得聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物；所述聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物简称PLCD；
所述聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；
以赖氨酸结构单元计的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、6-醛基化β-环糊精和氰基硼氢化钠的摩尔比为1:2:4；
(2)按质量比为1:0.5的比例，将PLCD与紫杉醇溶解于二甲基亚砜中，室温搅拌12h，在半透膜截留分子量为8000～14000Da的条件下纯水透析24h、冷冻干燥，得到载紫杉醇的纳米粒子；
(3)将载紫杉醇的纳米粒子与c-myc siRNA分别溶于DEPC水中，调节两种溶液的浓度使载紫杉醇的纳米粒子与c-myc siRNA的N/P摩尔比为50:1，将二者等体积混合，涡旋震荡30s，经室温静置孵育30min，得共载紫杉醇和c-myc siRNA的纳米粒子；
(4)将共载紫杉醇和c-myc siRNA的纳米粒子滴加于质量浓度为0.75mg/mL的透明质酸水溶液中，在400rpm的条件下，搅拌8min，得共载紫杉醇和c-myc siRNA的纳米粒子的肿瘤靶向纳米粒子；透明质酸与共载紫杉醇和c-myc siRNA的纳米粒子的质量比为4:6。
用miR-122或异硫氰酸荧光素标记的RNA替代本实施例的c-myc siRNA，其它同本实施例，制备出相应的HPDR。
实验证明，实施例6和实施例7制备的HPDR分别采用TEM观察形态呈规则球形，并具有典型的“核-壳”结构；粒径分布与实施例1的HPDR相似。
体外药物释放实验证明，实施例6和实施例7制备的HPDR呈现缓慢释药的特性，并具有显著的pH敏感性。
细胞摄取实验证明，实施例6和实施例7HPDRFAM具有明显的肿瘤靶向性。
细胞毒性实验证明，实施例6和实施例7HPDR具有强的细胞杀伤作用。
SEQ ID NO.1(5’-AACGUUAGCUUCACCAACAUU-3’)
SEQ ID NO.2(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3')
SEQ ID NO.3(5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)
SEQ ID NO.4(5’-FAM-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市肿瘤医院
<120> 共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
aacguuagcu ucaccaacau u 21
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aattctccga acgtgtcacg t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aattctccga acgtgtcacg t 21

Claims (9)

1.一种共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将6-醛基化β-环糊精、聚-L-赖氨酸氢溴酸盐溶于pH＝4.4的醋酸盐缓冲溶液中，室温搅拌1-2h，加入氰基硼氢化钠，室温继续搅拌48～72h；加氢氧化钠水溶液使体系呈中性，在半透膜截留分子量为7000Da的条件下超纯水透析2d、透析液冷冻干燥获得聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物；所述聚赖氨酸接枝β-环糊精衍生物简称PLCD；
所述聚-L-赖氨酸氢溴酸盐粘均分子量为15000～30000Da；
以赖氨酸结构单元计的聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、6-醛基化β-环糊精和氰基硼氢化钠的摩尔比为1:(0.5～2):4；
(2)按质量比为1:(0.3～0.5)的比例，将PLCD与疏水性化疗药物溶解于二甲基亚砜中，室温搅拌8～12h，在半透膜截留分子量为8000～14000Da的条件下纯水透析24h、冷冻干燥，得到载化疗药物的纳米粒子；
(3)将载化疗药物的纳米粒子与核酸分别溶于DEPC水中，调节两种溶液的浓度使载化疗药物的纳米粒子与核酸的N/P摩尔比为30～50:1，将二者等体积混合，涡旋震荡20～30s，经室温静置孵育30～60min，得共载化疗药物和核酸的纳米粒子；
(4)将共载化疗药物和核酸的纳米粒子滴加于质量浓度为0.75～1.0mg/mL的透明质酸水溶液中，在200-400rpm的条件下，搅拌5-10min，得共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子；透明质酸与共载化疗药物和核酸的纳米粒子的质量比为(3～4):6。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的疏水性化疗药物为阿霉素、喜树碱或紫杉醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的核酸为质粒DNA、小干扰RNA或microRNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述质粒DNA为质粒pEGFP-C1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述小干扰RNA为c-myc siRNA，所述c-mycsiRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述microRNA为miR-122，所述miR-122核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的透明质酸分子量为20000～40000Da。
8.权利要求1～7之一的方法制备的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子。
9.权利要求8的共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子在制备抗肝癌或抗乳腺癌药物中的应用。
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