JP2006523713A - 薬剤併用物送達用組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】併用薬を投与するときの非拮抗的な効果を達成する。
【解決手段】抗悪性腫瘍薬などの２又はそれ以上の薬剤を非拮抗的な組み合わせで安定的に相互作用した送達媒体を含む組成物。

Description

関連出願との相互参照
本願は、２００１年１０月３日に提出された米国仮出願第６０／３２６，６７１号；２００１年１１月１７日に提出された米国仮出願第６０／３４１，５２９号；２００２年２月１５日に提出された米国仮出願第６０／３５６，７５９号；２００２年４月２３日に提出されたカナダ略式出願（Canadian informal application）第２，３８３，２５９号；２００２年８月７日に提出された米国仮出願第６０／４０１，９８４号及び２００２年９月６日に提出された米国仮出願第６０／４０８，７３３号に基づく米国特許法１１９条ｅ項の利益を請求する２００２年１０月３日に提出された米国特許出願第１０／２６４，５３８号の一部継続出願である。これらの出願の内容は、参照により本願に組み込まれる。
本発明は、治療薬の相乗的又は相加的な組み合わせ（combinations）に係る改善された送達のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、送達媒体を含む製剤を用意することにより薬剤が目的とする標的に送達されるときに相乗効果的又は相加的な割合を確実に維持する送達系に関する。
癌、エイズ（ＡＩＤＳ）、感染症、免疫不全及び循環器不全（cardiovascular disorder）等、多くの生命をあやうくする疾病の進行は、複数の分子メカニズムによって影響される。このような複雑性のため、単一の薬剤で治療を行うことには、成果において限界があった。そこで、薬剤の併用が、疾病に懸命に取り組むため、特に癌の治療において、多くの場合、採用されている。投与した薬剤の数と急性リンパ性白血病等の癌の治癒率との相関性は高いと思われる（Ｆｒｅｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８８）４：２０２７−２０３７）。ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ロイコボリン救援を伴うメトトレキセート及びシタラビン（ＡＣＯＭＬＡ）或いはシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びブレオマイシン（ＣＨＯＰ−ｂ）の併用物を利用する臨床試験が、細網肉腫を治療するためにうまく利用されている（Ｔｏｄｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（１９８４）２：９８６−９９３）。
薬剤の併用効果は、相乗効果が得られるような割合で併用物が供給された場合に高められる。薬剤の相乗効果的な併用物が、より低い服用所要量により毒性を減少させ、癌治癒率を上昇させ（Ｂａｒｒｉｅｒｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９２）１２：３９７−４０２；Ｓｃｈｉｍｐｆｆ、Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｃａｒｅ Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）１：５−１８）、微生物の多剤耐性株の拡散を減少させることも示されている（Ｓｈｌａｅｓら、Ｃｌｉｍ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９３）１７：Ｓ５２７−Ｓ５３６）。異なる作用メカニズムをもつ薬剤を選択することにより、このように相乗効果がもたらされて、生化学的な経路において複数の部位が攻撃されうる（Ｓｈａｈ及びＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）７：２１６８−２１８１）。Ｌ−カナバニン及び５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）（５−ＦＵ）等の併用物が、何れかの薬剤単独の併用効果よりもラット大腸腫瘍モデルにおいてより高い抗腫瘍活性を示すと報告されている（Ｓｗａｆｆｅｒら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ（１９９５）６：５８６−８９３）。シスプラチン及びエトポシドは、ヒト小細胞型肺癌株細胞、ＳＢＣ−３の増殖を抑制することにおいて、相乗効果を示す（Ｋａｎａｚａｗａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９７）７１（３）：３１１−３１９）。
ビンブラスチン及び組換え型インターフェロン−β（Ｋｕｅｂｌｅｒら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．（１９９０）１０：２８１−２９１）；
シスプラチン及びカルボプラチン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｎｉｐｐｏｎ Ｃｈｉｒｙｏ Ｇａｋｋａｉ Ｓｈｉ（１９９０）２５：２６８４−２６９２）；
エチルデヒドロキシ−スパルソマイシン（Ethyl deshydroxy-sparsomycin）及びシスプラチン又はシトシンアラビノシド（cytosine arabinoside（AraC））又はメトトレキセート又は５−ＦＵ又はビンクリスチン（Ｈｏｆｓら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ（１９９４）５：３５−４２）；
オール トランス（trans） レチノイン酸及び酪酸又はトリブチリン（Ｃｈｅｎら、Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９９）１１２：３５２−３５５）；並びに
シスプラチン及びパクリタキセル（Ｅｎｇｂｌｏｍら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）７９：２８６−２９２）
について相乗効果の追加報告が見出される。
前記研究において、相乗効果に対する成分の比率の重要性が認められた。例えば、５−フルオロウラシル及びＬ−カナバニンは、１：１のモル比で相乗的であるが、５：１の比で拮抗的であることが分かり、シスプラチン及びカルボプラチンは１３：１の曲線下面積（area under the curve）（ＡＵＣ）比で相乗効果（作用）を示したが、１９：５で拮抗効果（作用）を示した。
他の薬剤併用物においては、その相互作用の併用比率依存性は記載されていなかったが、相乗的な相互作用を示すことが明らかにされている。このリストはかなり広範にわたっており、場合によっては生体内研究が含まれるが、主としてインビトロ培養の報告からなる。
非常に多数の報告に加えて、多数の併用物が臨床上有効であることが示されている。以下、これらを表に記載する。
Figure 2006523713
ａＦＤＡ：米国食品薬品局（United States Food and Drug Administration）
さらに、特定の他の併用物は、文献中の各種報告から非拮抗性の併用効果又は臨床上の有効性を示す可能性があると仮定され、或いは領域研究グループによって治療の基準として受け入れられうる。これらは以下である。
Figure 2006523713

Figure 2006523713
相乗的な薬剤併用物の使用と付随する前記利点にもかかわらず、それら薬剤併用物の治療的使用を制限する各種の欠陥がある。例えば、相乗効果は、多くの場合、薬剤の作用を受ける時間（持続時間）及び投与の順序等の各種要因に依存する（Ｂｏｎｎｅｒ及びＫｏｚｅｌｓｋｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９０）３９：１０９−１１２）。シスプレインと組み合わせてエチルデヒドロキシ−スパルソマイシンを用いる研究から、相乗効果が併用割合、治療期間及び治療順序によって影響されることが示される（Ｈｏｆｓら、上掲）。
このように、薬剤の併用により相乗効果が示されるためには、これらの薬剤は規定した割合になる量にしなければならないということが知られている。実際に、薬剤の同一の組み合わせは、同一の割合で拮抗的で、別の割合で相乗的で、さらに別の割合で相加的であるかもしれない。拮抗作用の発生を防止して、薬剤が少なくとも相加的であるようにすることが望ましい。本発明は、個々の割合で得られる結果も濃度に依存することを認識する。いくつかの割合は、ある濃度で拮抗的であり、別の濃度で非拮抗的である。本発明は、標的での濃度は投与した濃度と異なる場合があるので、被験者の標的位置に達したときに目的とする又は投与した割合を維持する処方でこれらの薬剤を送達することによって、並びに目的とする濃度範囲で主として非拮抗的であるような割合とすることによって、相乗的又は相加的な範囲にある成分の割合を保証する。
国際公開第００／５１６４１号公報には、相乗的であるといわれる抗ウイルス剤の併用物を投与することが記載されている。インビトロ試験を用いて、相乗的な割合が決定された。しかしながら、生体内でこの割合が維持されるであろう投与のいかなる形態について何ら教示していない。実際には、公報は、成分が経時又は同時投与される場合があると述べる。
国際公開第０１／１５７３３号公報には、 自己免疫疾患を治療するための、相乗的であると推定される組成が記載されている。また、処方の方法では、送達後、この割合が維持されることは保証されていない。
Ｄａｏｕｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９１）２８：３７０−３７６には、ヒト卵巣癌細胞におけるシスプラチン及びリポソームバリノマイシン（liposomal valinomycin）の相乗的な細胞傷害作用が記載されている。この論文には、ヒト卵巣腫瘍由来株細胞、ＣａＯＶ−３の培養組織を治療するために、遊離型のシスプラチン及びリポソームでカプセル化したバリノマイシンが使用されるインビトロ試験が記載されている。著者らは、相乗作用及び拮抗作用を示す濃度範囲を決定した。リポソームカプセル化を用いて、バリノマイシンを可溶化した。実験は、インビトロで行われるので、生体内送達は無関係である。
Ｄａｏｕｄに対し２００１年４月１０日に付与された米国特許第６，２１４，８２１号には、トポイソメラーゼＩ阻害剤及びスタウロスポリンを含む医薬組成物が記載されている。請求の範囲（クレーム）は、スタウロスポリンがトポイソメラーゼＩ阻害剤誘導Ｓ期停止を抑制し、正常なｐ５３機能を欠如しているヒト乳癌細胞に対する細胞障害性を高める能力を有するという発見に基づいていると思われる。特定の医薬処方は示唆されていない。
Ｆｏｕｎｔａｉｎらに対する米国特許第５，０００，９５８号には、生体内で増強された効果を発揮するといわれるリポソームに封入した抗菌剤の混合物が記載されている。抗菌剤の適当な割合は、生体外で相乗効果について経験的に試験する併用効果試験によって決定される。ある濃度範囲にわたって相乗的な割合が保証されることについての議論はなされていない。
Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ（２００１）２９８：３６９−３７５には、リポソーム同時封入した（co-encapsulated）ゲンタマイシン及びセフタジジムの生体内での相乗的な相互作用が記載されている。望ましい割合は、Ｆｏｕｎｔａｉｎ（上掲）の併用効果試験と類似の併用効果試験を用いて決定されたが、濃度範囲にわたって相乗効果が維持される割合の決定についての議論はなされていない。
本発明は、第一に、投与される製剤の薬物動態を制御することによって、治療薬の決められた相乗的又は相加的な割合を維持することができるということを認識し、第二に、標的組織に達する薬剤混合物における成分濃度は投与される成分濃度と同一でない可能性があるので、非拮抗的な割合がある濃度範囲にわたって示されなければならないということを認識する。相乗作用及び相加作用を維持することの問題は、治療薬がリポソーム等の送達媒体で封入される（即ち、安定に会合される）ときに送達媒体が薬物動態を決定し、このように封入した薬剤が同様の方法で作用するであろうということの認識によって並びにある濃度範囲にわたって主として相乗的／相加的である割合を選択することによって解決される。
本発明は、薬剤がある濃度範囲にわたって相乗的又は相加的（即ち非拮抗的）な割合で媒体中に存在する、二又はそれ以上の薬剤を封入する送達媒体組成物を用いる、非拮抗的な割合の治療薬、好ましくは抗腫瘍剤を投与する方法に関する。封入の前に、組み合わせ（併用）における治療薬の割合は、その組み合わせによって目的とする濃度範囲にわたって相乗作用又は相加作用が示されるように選択される。送達媒体への封入は、二又はそれ以上の薬剤が協調して疾病部位に送達されることを可能とし、その結果、薬剤が非拮抗的な割合で疾病部位に存在しうることが保証される。非拮抗的な割合を疾病部位で維持するように投与される送達媒体で、薬剤が同時封入されようと別々に封入されようと、この結果は得られるであろう。組成物の薬物動態（pharmacokinetics）（ＰＫ）は、送達が協調して行われるように（送達系のＰＫが比較できるということを前提にして）送達媒体自体によって制御される。
そこで、一つの視点において、本発明は、目的とする濃度範囲にわたって相乗的又は相加的となる割合で媒体組成物で封入した二又はそれ以上の薬剤を含む非経口投与用の送達媒体組成物を提供する。前記送達媒体組成物は、これらの割合でその送達媒体組成物で薬剤を封入することを含む方法によって調製される。当該薬剤の非拮抗的な割合は、ある濃度範囲にわたって生物活性或いは薬剤の関連する細胞培養又は無細胞系への効果を測定すること、一つの形態として、「組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）」を決定するアルゴリズムを適用することによって決定される。更に以下に記載するように、認知されているアルゴリズムを用いて、組み合わせ指数を、各濃度レベルで算出することができる。ある濃度範囲にわたってＣＩが相乗作用又は相加作用を示す割合が選択される。好ましくは、当該ＣＩは、広範な濃度範囲にわたって相乗的である。好ましい薬剤は、抗腫瘍剤である。目的とする濃度範囲にわたって非拮抗効果を維持する薬剤の割合を決定するいかなる方法を用いてもよい。
より具体的には、本発明は、送達媒体を含む組成物であって、当該送達媒体が、この送達媒体中に封入された少なくとも第一治療薬及び第二治療薬を、細胞の１％超が作用されるような濃度範囲（作用した画分（Fraction affected）（ｆａ）＞０．０１））の少なくとも５％にわたって培養組織又は無細胞系の関連した細胞に非拮抗的な生物学的効果を示す第二薬に対する第一薬のモル比で含む組成物、或いは送達媒体を含む組成物であって、当該送達媒体が、この送達媒体で封入した少なくとも第一治療薬及び第二治療薬を、当該薬剤が抗腫瘍剤である場合に関連した細胞に非拮抗的な細胞障害効果又は細胞増殖抑制効果を示す第二薬に対する第一薬のモル比で含む組成物に関する。出願人らは、「関連したないし適切な（relevant）」細胞によって、目的とする生物学的効果をテストするのに適した少なくとも１つの細胞培養又は細胞株（株細胞）を表現する。例えば、前記薬剤が抗腫瘍剤である場合には、「関連した」細胞は、それらの抗癌剤発見プログラムとして有用である米国立癌研究所（National Cancer Institute）（ＮＣＩ）／国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）の開発治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）（ＤＴＰ）によって同定される細胞株であろう。現在、ＤＴＰ選別（DTP screen）は、６０の異なるヒト腫瘍株細胞を利用する。そのような細胞株の少なくとも１つについて、目的とする活性が示されることが必要であろう。
別の視点において、本発明は、前記本発明の組成物を投与することによって目的とする標的に対して相乗的又は相加的な割合の二又はそれ以上の治療薬を送達する方法に向けられる。そのような組成物の投与は、単一組成物の形態にある必要はないが、送達媒体の薬物動態を協調して働かせるように、即ち標的組織又は器官に達するときに投与した治療薬の割合が維持されるような方法で設計するように送達媒体中に治療薬を含む別々の組成物の同時又は同時に近い投与を含みうる。したがって、一又はそれ以上の治療薬と安定に会合した送達媒体をそれぞれ含む別々の組成物は、本願において記載されるように、非拮抗的であると決定されている治療薬の割合で被検体（被験者）に送達されうる。
別の視点において、送達媒体を含む治療組成物を製造する方法であって、当該送達媒体が、ある濃度範囲にわたって非拮抗的である割合で少なくとも二つの治療薬を含む方法に向けられる。当該方法は、少なくとも二つの治療薬のパネルであって、少なくとも１種の、好ましくは多数の多種多様な割合で前記薬剤を投与されたパネルを用意すること、適当な濃度範囲にわたってパネルのメンバーの関連した細胞培養又は無細胞系に生物学的効果を及ぼす能力を試験すること、その割合によって適当な濃度範囲にわたって前記細胞培養若しくは無細胞系に相乗的又は相加的な効果が与えられるパネルのメンバーを選択すること；並びにパネルのうち好結果のメンバーによって示される割合で薬剤を薬剤送達媒体で封入すること（即ち安定に会合させること）を含む。前記決定から結果として生ずる割合は、単一の製剤を調製するための基準として使用されることに加えて、少なくとも１つの治療薬と安定に会合した送達媒体をそれぞれ含む別々の組成物について被検体に投与すべき相対量を決定するために使用されてもよい。したがって、本願において相乗的又は相加的であると決定される治療薬の割合については、単一の組成物で、或いは別々に調製した組成物の正確な割合で被検体に与えられてもよい。
別の視点において、本発明は、キットに向けられる。当該キットは、別々のコンテナ（容器）に、送達媒体と安定に会合した第一治療薬を含む第一組成物と、第二治療薬と安定に会合した送達媒体を含む第二組成物とを含む。二つのコンテナは、二つの組成物が正確な割合で投与されるように較正されてもよい；また、或いは更に前記キットは、単に正確な割合に関する指示書を含んでもよい。
更に以下に記載されるように、好ましい形態として、前記方法に従って適当な組み合わせを設計するに際しては、非拮抗的な割合は、関連した細胞培養又は無細胞測定系によって規定したように、細胞の１％超又はそれ以上（ｆａ＞０．０１）、好ましくは細胞の２０〜８０％（ｆａ＝０．２〜０．８）に作用する投与量又は濃度の少なくとも５％にわたって、≦１．１の組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）となる割合として選択される。
（略語）
下記略語が用いられる：
ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン；ＰＳ：ホスファチジルセリン；ＤＰＰＳ：ジパルミトイルホスファチジルセリン；ＤＳＰＳ：ジステアロイルホスファチジルセリン；ＤＬＰＳ：ジラウロイルホスファチジルセリン；ＤＯＰＳ：ジオレイルホスファチジルセリン；ＰＯＰＳ：パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン；ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＳＭ：スフィンゴミエリン；ＰＧ：ホスファチジルグリセロール；ＰＩ：ホスファチジルイノシトール；ＰＡ：ホスファチジン酸；ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン；ＤＭＰＣ：ジミリストイルホスファチジルコリン；ＤＳＰＧ：ジステアロイルホスファチジルグリセロール；ＤＳＰＥ：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；Ｃｈｏｌ：コレステロール；ＣＨ又はＣＨＥ：コレステリルヘキサデシルエーテル；
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；ＤＳＰＥ−ＰＥＧ：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−Ｎ-［ポリエチレングリコール］；ＰＥＧが数字を伴うとき、その数字はＤａｌｔｏｎでのＰＥＧの分子量である；ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００：ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［ポリエチレングリコール］２０００；
ＳＵＶ：小単層小胞；ＬＵＶ：大単層小胞；
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブロマイド；ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＯＤ：光学濃度；ＯＧＰ：Ｎ−オクチル ベータ−Ｄ−グルコピラノシド；ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸；ＨＥＰＥＳ：Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］；ＨＢＳ：ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）；ＳＨＥ：３００ｍＭ スクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ；ＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０：培養液中の細胞の５０、７５及び９０％を作用するのに必要とされる有効量；ＬＤ５０：培養液中の細胞の５０％死亡率をもたらすために必要とされる投与量；ＣＩ：組み合わせ指数；ＣＩ ｍａｘ又はＣＩ最大：異なる割合の薬剤のＣＩ値に最大の差が認められる場合の、単一のｆａ値（０．２〜０．８）について選択されるＣＩ値；ｆａ：作用した画分；ＴＥＡ：トリエタノールアミン；
ＦＤＡ：米国食品薬品局。
本発明の方法は、インビトロで目的とする濃度範囲にわたって非拮抗的である治療薬の割合を決定すること、及びこのような非拮抗的な割合を、その割合が目的とする活性の部位で維持されることを保証しうる方法で与えることを含む。その相乗的又は相加的な割合は、二又はそれ以上の治療薬につき少なくとも１つの割合について関連した細胞培養又は無細胞系に対する濃度範囲にわたってインビトロでテストされるときに得られる結果に、標準的な分析ツールを適用することによって決定される。実例として、個々の薬剤及びその各種組み合わせは、各種濃度レベルで、例えば細胞死を引き起こす又は細胞増殖を阻害する、細胞培養又は無細胞系への生物学的な効果についてテストされる。予め設定した割合の濃度レベルを、生存細胞百分率に対してプロットして、相関を得る。この相関を、公知の及び確立された数学的技術によって処理して、「組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）」を算定することができる。その数学的手法は、１（即ち、０．９〜１．１）のＣＩが薬剤の相加的な効果を表し；ＣＩ＞１（即ち、＞１．１）が拮抗的な効果を表し；＜１（即ち、＜０．９）のＣＩが相乗的な効果を表すというものである。
一つの一般的なアプローチを図１に示す。示したように、薬剤Ａ及びＢは、以下に記載したＭＴＴ試験によって試験されて、細胞死又は細胞静止（cell stasis）を引き起こす能力について、二つの異なる割合で、個々に及び合わせてテストされる。最初に、薬剤Ａ，Ｂ、及び二つの異なる併用割合（Ｙ：Ｚ及びＸ：Ｙ）の濃度間の相関性を、細胞障害性に対してプロットし、未処置（無治療）のコントロール細胞の生存に基づく百分率として計算する。期待されるように、個々の薬剤及びその組み合わせの両方について細胞生存への用量依存的な効果がある。この相関性が確認されていれば、細胞生存又は作用した画分（ｆａ）を、ＣＩを計算する際の濃度の代理として使用することができる。
ＣＩ計算の結果を、同様に図１に示す；この指標は、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ、Ａｄｖａｎｃｅ Ｅｎｚ．Ｒｅｇｕｌ．（１９８５）２２：２７−５５の方法によって、作用した細胞の画分の関数として算出される。仮定上の状態において、薬剤Ａ＋Ｂの第一の割合（Ｘ：Ｙ）が全ての濃度で非拮抗的である一方で、第二の割合（Ｙ：Ｚ）の組み合わせは拮抗的である。したがって、広い範囲にわたる濃度にもかかわらず非拮抗的でありうる薬剤Ａ＋Ｂの割合（割合１）を提供することができる。本発明の組成物に含めるのに最適であるのは、この割合である。
本発明者らは、薬剤併用の各種割合の「ＣＩ最大（CI maximum）」を計算することによって相乗作用への割合及び濃度の影響（効果）の別の図も作成した。「ＣＩ最大」は、異なる割合の薬剤のＣＩ値に最大の差が認められた場合の、単一のｆａ値（０．２〜０．８）について選択されるＣＩ値と定義される。これを、図２Ａ及び２Ｂに図示する；示されるように、イチノテカン／カルボプラチンの割合が１：１０のとき、そのＣＩは、作用した画分の値が０．２である場合に、残りの割合のＣＩとは非常に異なる。ｆａ０．２でのこの割合のＣＩ値は、示されるように、約２．０である。
非拮抗的な割合のインビトロでの決定については、二つの薬剤のみの併用（組み合わせ）に対して図示しているが、三又はそれ以上の薬剤の併用に対して同一の技術の適用することにより、同様の方法で濃度範囲にわたるＣＩ値が与えられる。
この方法で得られる割合は、予め決定されている割合の薬剤を、非拮抗的な割合が維持されうることを保証するリポソーム又は他の微粒子で封入することによって、医薬組成物として、維持される。したがって、当該組成物は、本質的に粒子（微粒子）状である送達媒体を含み、目的とする割合の治療薬を含む。
前記薬剤は、両方が同一の送達媒体に含まれるよう同時にカプセル化されることが好ましいが、これは必須でない。粒状担体は、同様の薬物動態を共有することができるので、その作用物質は、たとえ別々にカプセル化されても、その製剤から連係して送達される。
「封入ないしカプセル化（encapsulation）」は、送達媒体との安定な会合を意味する。したがって、薬剤又は複数の薬剤が、生体内に投与されるときに安定に媒体と会合している限り、媒体で薬剤又は複数の薬剤を取り囲むことは必要とされない。「〜と安定に会合した」及び「中に封入（カプセル化）した」又は「〜で封入（カプセル化）した」又は「〜で又は〜と同時（封入）カプセル化した」は、同義語であることを意味する。これらは、本明細書中、区別なく用いられる。安定な会合は、好ましくは開裂結合（cleavable linkage）を伴う送達媒体との共有結合、非共有結合、並びに送達媒体等の内部に薬剤を捕捉するのを含む種々の手段によって生じさせてもよい。その会合は、治療される被検体の標的部位に送達されるまで薬剤が非拮抗的な割合で送達媒体と会合しつづけるよう、十分に安定でなければならない。
送達媒体には、脂質担体、リポソーム、脂質ミセル（lipid micelles）、リポタンパクミセル（lipoprotein micelles）、脂質安定化乳剤（lipid-stabilized emulsion）、サイクロデキストリン、ポリマーナノ粒子（polymer nanoparticles）、ポリマーミクロ粒子（polymer microparticles）、ポリマー−脂質ハイブリッド系、及び誘導体化された単鎖ポリマー（derivatize single chain polymers）等が含まれうる。リポソームは、「リポソーム：合理的なデザイン（Liposomes: Rational Design）」（Ａ．Ｓ．Ｊａｎｏｆｆ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社，ニューヨーク）に記載されるように、又はその技術について熟知できる者（当業者）に知られているその他の技術によって、調製されうる。本発明において使用するリポソームは、「低コレステロール（low-cholesterol）」になるように調製されてもよい。そのようなリポソームは、「無コレステロール（cholesterol free）」であるか或いは「実質的に無コレステロール（substantially no cholesterol）」又は「本質的に無コレステロール（essentially no cholesterol）」を含む。リポソームに関して本願において使用される「無コレステロール」の語は、リポソームがコレステロール不存在下で調製されることを意味する。「実質的に無コレステロール」の語は、リポソームの相転移特性を有意に変化させるには不十分であるコレステロール量の存在を見込む（典型的には２０ｍｏｌ％未満のコレステロール）。リポソームへの２０ｍｏｌ％未満のコレステロールの混合により、リポソームを２０ｍｏｌ％を超えるコレステロールを用いて調製するときには最適に保持されない薬剤についての保持が可能となる。更に、２０ｍｏｌ％未満のコレステロールを用いて調製したリポソームでは、相転移温度が狭く、カプセル化した薬剤を熱処理により放出するリポソーム（熱感受性リポソーム（thermosensitive liposome））の調製のために利用されうる特性が発揮される。本発明のリポソームは、エーテル脂質（ether lipid）、ホスファチジン酸、ホスホン酸塩類、セラミド及びセラミド類似物、スフィンゴシン及びスフィンゴシン類似物並びにセリン含有脂質を含む治療用の脂質（therapeutic lipid）をも含んでもよい。リポソームを、循環寿命を高めるべく、ポリエチレングリコール−ＤＳＰＥ等の水溶性ポリマー−脂質複合体（hydrophilic polymer-lipid conjugate）を表面安定化して調製してもよい。リポソーム製剤に、ホスファチジルグリセロール（phosphatidylglycerol）（ＰＡ）及びホスファチジルイノシトール（phosphatidylinositol）（ＰＩ）等の負荷電した脂質の混合を加えて、担体の循環寿命を増大させてもよい。これらの脂質を、表面安定化剤（surface stabilizing agent）として水溶性ポリマー−脂質複合体に替えて用いてもよい。本発明の形態では、ＰＧ又はＰＩを含む無コレステロールリポソームを使用して凝集を防止し、それにより担体の血液残存時間を増大させてもよい。
ミセルは、疎水性の核中にわずかにある可溶性の薬剤を送達するのに利用される複数の両親媒性脂質又はポリマー成分からなる自己集合粒子（self-assembling particle）である。ミセルの送達媒体の調製のため各種の手段が利用でき、当業者により容易に実施されうる。例えば、脂質ミセルを、Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（２０００）２００（１）：２７−３９（参照により本願に組み込まれる）に記載されるように調製してもよい。リポタンパクミセルを、低密度及び高密度リポタンパク並びにカイロミクロンを含む天然又は人工リポタンパクから調製することができる。脂質安定化乳剤は、脂質の単層（単分子膜）又は二重層（二分子膜）等の乳化成分によって安定化した油入核（oill filled core）を含むように調製したミセルである。その核は、トリアシルグリセロール（コーン油）等の脂肪酸エステルを含んでもよい。単層又は二重層は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ等の水溶性ポリマー脂質複合体を含んでもよい。これらの送達媒体を、水溶性ポリマー脂質複合体の存在下、油の均質化によって調製してもよい。脂質安定化乳剤中に取り込まれる薬剤については、一般に水溶性が低い。ステアリン酸エステル類又はポリ（エチレンオキシド）ブロック−ポリ（ヒドロキシエチル−Ｌ−アスパルトアミド（poly(ethylene oxide)block-poly(hydroxyethyl-l-aspartamide)）及びポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（ヒドロキシヘキシル−Ｌ−アスパルトアミド（poly(ethylene oxide)-block-poly(hydroxyhexyl-l-aspartamide)）のミセル等のリポタンパクと類似の特性を示す合成ポリマー類似物を、本発明の実施において使用してもよい（Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（２０００）５２：８３１−８３５）。
サイクロデキストリンは、空孔形成する（cavity-forming）、水溶性の少糖類であって、空孔に水不溶性の薬剤を収容することができるオリゴ糖類を含む。薬剤は、当業者において公知の方法を用いてサイクロデキストリン中に包接される（カプセル化される）。例えば、Ａｔｗｏｏｄら編、「包接化合物（Inclusion Compounds）」第２巻及び第３巻、アカデミック出版（Academic Press）、ニューヨーク州（１９８４）；Ｂｅｎｄｅｒら、「サイクロデキストリン化学（Cyclodextrin Chemistry）」、シュプリンガー出版社（Springer-Verlag）、ベルリン（１９７８）；Ｓｚｅｉｔｌｉら、「サイクロデキストリン類及びそれらの包接複合体（Cyclodextrins and Their Inclusion Complexes）」、Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋｉａｄｏ、ブダペスト、ハンガリー（１９８２）並びに国際公開公報第００／４０９６２号を参照すべきである。
ナノ粒子及びミクロ粒子は、ポリマーの殻（ナノカプセル（nanocapsules））に或いはポリマーマトリックス（ナノスフィア（nanospheres））中全体にわたって分散した固体又は液体として取り囲まれた薬剤の凝縮核（concentrated core）を含んでもよい。ナノ粒子及びミクロ粒子を調製する一般的な方法は、Ｓｏｐｐｉｍａｔｈら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００１）７０（１−２）：１−２０）によって記載され、その参考文献は本願に組み込まれる。使用可能な他のポリマーの送達媒体として、親水性の殻に取り囲まれた疎水性の核を含む薬剤を含むブロック共重合体ミセルが挙げられる；それらの送達媒体は、一般に疎水性の薬剤用の担体として利用され、Ａｌｌｅｎら、コロイド及び表面 Ｂ：生物界面（Colloids and Surfaces B: Biointerfaces）（１９９９）１１月１６（１−４）：３−２７において認められるように調製されうる。ポリマー−脂質ハイブリッド系は、脂質モノマーに取り囲まれたポリマーナノ粒子からなる。ポリマー粒子は、疎水性薬剤組み込み用のカーゴスペース（cago space）として役立つが、脂質単層は、疎水性の核及び外部水性環境間の干渉を安定化させる。ポリカプロラクトン（polycaprolactone）及びポリ（ｄ，ｌ−ラクチド）等のポリマーが使用されうるが、脂質単層は、一般に脂質の混合物から構成される。適当な調製方法は、ポリマーナノ粒子のために上記参照した方法と同様である。誘導体化された単鎖ポリマーは、ポリマー−薬剤複合体を生ずる生物活性剤の共有結合に適したポリマーである。非常に多くのポリマーが、ポリアミノ酸類、デキストリン又はデキストラン等の多糖類、並びにＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide）（ＨＰＭＡ）共重合体等の合成ポリマーを含むポリマー−薬剤複合体の合成のため提案されている。適当な調製方法が、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ及びＭｏｒｐｕｒｇｏ、ＩＬ Ｆａｒｍａｃｏ（１９９９）５４（８）：４９７−５１６において詳述され、参照により本願に組み込まれる。
送達媒体は、このようにして提供され、その結果、治療成分の投与割合の送達が安定して行われる。したがって、その割合を、組成物を含む媒体での薬剤の簡便な同時カプセル化によって維持してもよく、或いは、媒体が組成物の薬物動態を、同一の方法で非拮抗的な薬剤の割合を維持するよう制御する場合には、薬剤を別々の媒体でカプセル化することができる。
好ましくは、本発明の組成物は、拮抗的でない抗腫瘍剤の組成物を送達するために使用される。下記詳細な記載において、治療薬の割合を決定する方法並びに本発明の送達系中に目的とする割合のものをカプセル化する方法が示される。
簡単には、一つのケースとして、第一に、個々の薬剤を各種のインビトロ又はインビボ試験で別々にスクリーニングして、それらの個々の活性を測定する。その後、複数組の薬剤を組み合わせ、同一のスクリーニング方法で試験する。この最初のスクリーニングでは、薬剤の割合は、予め同定した５０％活性（ＩＣ５０値）を有する濃度のモル比である。一方、別の固定した割合（典型的には１：１０、１：１及び１０：１のモル比）が、処方目的を考慮して、選択される。細胞生存への薬剤効果に基づいて計算される平均値、及び薬剤投与量を、ＣａｌｃｕＳｙｎコンピュータプログラムに入力し、それから、その出力データを評価して、作用した細胞の画分（ｆａ）の関数として組み合わせ指数（Combination Index）（ＣＩ）を規定する。
ＣａｌｃｕＳｙｎ法が、抗腫瘍剤、臓器移植用免疫抑制剤、自家骨髄移植用の白血病細胞を除去する混合物（combined purging leukemic cell for autologous bone marrow transplantation）、殺虫剤、生物学的応答調節物質、多剤耐性阻害剤、抗菌剤、抗ＨＩＶ剤、抗疱疹及び他の抗ウイルス剤等の各種薬剤をテストするのにうまく適用されている。
図１１Ａにおける１：１のモル比のシスプラチン：ダウノルビシンと同様の相互作用挙動を示す薬剤の組み合わせは、即ち拮抗的であり、追求しない。ｆａ＞０．０１（即ち、１：１及び１０：１のモル比のイリノテカン：カルボプラチン；図２Ａ）より高いｆａ値の実質的な範囲（好ましくは、少なくとも約２０％）にわたって非拮抗的な相互作用を有する化合物の組み合わせを、このインビトロスクリーニング試験で、各種の異なる薬剤／薬剤の割合について再評価して、非拮抗的な相互作用の強度（効果）を高め（即ち、より低いＣＩ値）、且つ相乗作用が認められるｆａの範囲を増大させるのに最適な割合を規定する。
このようにして同定した最適化された非拮抗的な薬剤の組み合わせから、送達媒体中の製剤の組成物は二重薬剤組成物（dual-agent composition）と規定され、及び／又は当該最適化された非拮抗的な薬剤の組み合わせを、単一の医薬単位として使用して、第三の薬剤との相乗的又は相加的な相互作用を測定することができる。
（非拮抗的な割合のインビトロ測定）
本発明の組成物を調製するため、先ず送達媒体中に含まれる薬剤の目的とする割合が、
決定されなくてはならない。好ましくは、前記割合は、濃度の範囲にわたって併用により相乗作用又は相加作用が発揮される割合であろう。そのような割合は、各種数学的なモデルを用いて細胞培養又は無細胞系において生体外で決定されうる。
濃度範囲にわたって相乗的又は相加的な併用効果を示す薬剤の割合の決定を、以下に記載した実験データの型に基づき、各種のアルゴリズムを用いて行ってもよい。これらの方法として、アイソボログラム法（Ｌｏｅｗｅら、Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ（１９５３）３：２８５−２９０；Ｓｔｅｅｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．（１９７９）５：２７−５５）、ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ法（fractional product method）（Ｗｅｂｂ、酵素及び代謝阻害剤（Enzyme and Metabolic Inhibitors）（１９６３）Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１−５．ニューヨーク：アカデミック出版（Academic Press））、モンテカルロシミュレーション法（Monte Carlo simulation method）、Ｃｈｏｕ、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．（１９７６）３９：２５３−７６；及びＣｈｏｕ、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９７４）１０：２３５−２４７に記載された式に基づくＣｏｍｂｉＴｏｏｌ、ＣｏｍｂｏＳｔａｔ並びにＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ半有効法（median-effect method）が挙げられる。これに代わる方法として、生存画分（Ｚｏｌｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）８０：４１３−４１６）、コントロールと比較したユニットを形成する顆粒球／マクロファージコロニーに対する応答百分率（percentage response）（Ｐａｎｎａｃｃｉｕｌｌｉら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９９）１９：４０９−４１２）及びその他（Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８９）４１：９３−１４１；Ｇｒｅｃｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９５）４７：３３１−３８５）が挙げられる。
Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ半有効法が好ましい。その分析は、特定の効果を生ずる投与量、ｆａが下記によって与えられる式を利用する：
Ｄ＝Ｄｍ［ｆａ／（１−ｆａ）］１／ｍ
ここで、Ｄは、使用した薬剤の投与量であり、ｆａは、その投与量により作用した細胞の画分であり、Ｄｍは、強度を示す半有効投与量であり、ｍは、投与量−効果曲線の形を表す係数である（一次反応に対してｍは１である）。
この式を、さらに巧みに用いて、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ、Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．（１９８４）２２：２７−５５により；並びにＣｈｏｕらによる「化学療法における相乗作用及び拮抗作用（Synergism and Antagonism in Chemotherapy）」Ｃｈｏｕ及びＲｉｄｅｏｕｔ編、アカデミック出版（Academic Press）：ニューヨーク １９９１：２２３−２４４において記載されるように、多種多様な薬剤効果式に基づいて組み合わせ指数（Combination Index）（ＣＩ）を計算することができる。この計算のためのコンピュータプログラム（ＣａｌｃｕＳｙｎ）は、Ｃｈｏｕの、マイクロコンピュータを用いる投与量−効果分析（Dose-effect analysis）：ＥＤ５０、ＬＤ５０、相乗作用、拮抗作用、低投与危険度（low-dose risk）、レセプターリガンド結合及び酵素反応速度論の定量化において認められる（ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びソフトウェア（Software）；ケンブリッジ：バイオソフト １９８７）。
組み合わせ指数式は、酵素反応速度モデルに由来したＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの多種多様な薬剤−効果式に基づいている。式により、相乗作用及び拮抗作用ではなく、相加作用のみが判定される。しかしながら、ＣａｌｃｕＳｙｎプログラムによれば、相乗作用は、期待した相加作用よりも高いものとして規定され、拮抗作用は、期待した相加作用よりも低いものとして規定される。１９８３年にＣｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙは、ＣＩ＝１を相加作用としたが、このようにして二つの薬剤の多種多様な薬剤効果式から、作用について同一又は類似の形態を有する相互に排他的な薬剤（mutually exclusive drug）に対して下記式が得られる：
ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２ ［式１］
そして、さらに、作用について完全に独立した形態を有する相互に非排他的な薬剤（mutually non-exclusive drug）に対して下記式が提案される：
ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２＋（Ｄ１）（Ｄ２）／（Ｄｘ）１（Ｄｘ）２ ［式２］
ＣＩ＜１、＝１、及び＞１は、それぞれ相乗作用、相加作用、及び拮抗作用を示す。式１又は式２は、（分子において）組み合わせ（併用）における薬剤１、（Ｄ）１、及び薬剤２、（Ｄ）２、が実際の実験においてｘ％を阻害することを表す。したがって、実験的に認められるｘ％阻害は、概数でなくてもよいが、最も多くは小数部を有する。式１及び式２の（分母において）（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は、それぞれｘ％を阻害する薬剤１及び薬剤２単独の投与量である。
簡単にするため、併用において二つを超える薬剤が含まれるときには、多くの場合、相互排他性が想定される（ＣａｌｃｕＳｙｎマニュアル及びソフトウェア（Software）；ケンブリッジ：バイオソフト １９８７）。
根底にある実験データは、一般に培養中の細胞又は無細胞系を用いて生体外で測定される。好ましくは、組み合わせ指数（ＣＩ）は、前記説明したように、濃度範囲の代理パラメータである図１に示される作用した細胞の画分（ｆａ）の関数としてプロットされる。薬剤の好ましい組み合わせは、ｆａ値の実質的な範囲にわたって相乗作用又は相加作用を示す組み合わせである。細胞の１％超が作用される濃度範囲、即ち０．０１よりも高いｆａの範囲の少なくとも５％にわたって相乗作用を示す薬剤の組み合わせが、選択される。濃度全体のより広い部分において、好適なＣＩ；例えば、０．２〜０．８のｆａの範囲の５％が示されることが好ましい。この範囲の１０％において好適なＣＩが示されることがより好ましい。更に好ましくは、ｆａの範囲の２０％、好ましくは０．２〜０．８のｆａの範囲の５０％、最も好ましくは０．２〜０．８のｆａの範囲の少なくとも７０％を超える範囲が組成物において採用される。ｆａ値の実質的な範囲にわたって相乗作用を示す組み合わせを、各種の薬剤の割合で再評価して、非拮抗的な相互作用の強度を高め且つ相乗作用が認められるｆａ値の範囲を増大させるのに最適な割合を規定してもよい。
細胞が作用される濃度の全範囲にわたって相乗作用を有することが望ましいであろうが、多くの事例において、その結果が、０．２〜０．８のｆａの範囲でかなり確実であるということが認められている。したがって、本発明の組成物により示される相乗作用は、０．０１又はそれ以上の広範な範囲内に存在することが示されるが、相乗作用は０．２〜０．８のｆａの範囲において確認されることが好ましい。
最適な併用割合を単一の医薬単位として更に用いて、第三の薬剤との相乗的又は相加的な相互作用を判定してもよい。更に、第三の薬剤の併用を一つの単位として用いて、第四の薬剤との相乗的又は相加的な相互作用を判定する等してもよい。
上記に示されるように、細胞培養のインビトロ研究が、「関連した」細胞について行われるであろう。細胞の選択は、薬剤の目的とする治療用途に依存するであろう。本発明の目的の範囲内に収まるよう組成物のベースを与えるため、一つの関連した株細胞又は細胞培養型だけは、必要とされる非拮抗的な効果を示す必要がある。
例えば、本発明の一つの好ましい形態において、薬剤の併用は、抗癌治療を目的とする。そのとき、テストされるべき細胞及びテストの性質について適当な選択がなされるであろう。特に腫瘍株細胞は、適当な被検体であり、細胞死又は細胞静止の測定は適当なエンドポイント（end point）である。以下に更に議論するつもりであるが、別の徴候に適した非拮抗的な組成物を見出すための試みと関連して、細胞障害性又は細胞静止以外の他の標的細胞及び診断基準を、採用することができる。
抗腫瘍剤を含む測定のため、株細胞を、一般的な株細胞貯蔵所（例えば、ＮＣＩ又はＡＣＣ）から、学術的な研究所又は商業上の出所を含む他の機構から得てもよい。好ましい株細胞には、ＮＣＩ／ＮＩＨの開発治療プログラムによって同定された株細胞から選択される一又はそれ以上が含まれるであろう。このプログラムによる使用される腫瘍株細胞のスクリーニングによって、現在、白血病、メラノーマ、並びに肺、大腸、脳、卵巣、乳房、前立腺及び腎臓の癌の典型を示す６０の異なる腫瘍株細胞が同定（識別）される。目的とする濃度範囲にわたって要求される非拮抗的な効果は、単一の細胞型において示されるだけでよい；しかしながら、少なくとも二つの株細胞がこのような効果を示すことが好ましく、より好ましくは三つの株細胞、より好ましくは五つの株細胞、及びより好ましくは十の株細胞がこのような効果を示す。株細胞は、いかなる種からのものであってもよいが、好ましいソースは、哺乳類、特にヒトであろう。株細胞は、各種の実験条件下の選択によって、及び／又は外因性の遺伝子物質の付加又は削除によって遺伝子的に変化されうる。株細胞を、任意の遺伝子導入技術によって形質移入してもよい。この遺伝子導入技術には、ウイルス又はプラスミド・ベース形質移入法（plasmid-based transfection method）が含まれるが、これに限定されない。修飾（改変）には、特定のタンパク質又はペプチドの発現をコードするｃＤＮＡ、プロモーター又はエンハンサーシーケンス等の制御要素或いはアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡの導入が含まれる。遺伝子操作された組織培養株細胞には、腫瘍抑制遺伝子、即ちｐ５３、ｐＴＥＮ及びｐ１６等の遺伝子を含む及び含まない系統；並びにのドミナントネガティブ法（dominant negative method）、遺伝子挿入法（gene insertion method）及びその他の選択法の使用により作成された系統が含まれうる。細胞生存度を定量化するため、例えば、抗腫瘍剤をテストするために使用されうる好ましい組織培養細胞株には、Ｈ４６０、ＭＣＦ−７、ＳＦ−２６８、ＨＴ２９、ＨＣＴ−１１６、ＬＳ１８０、Ｂ１６−Ｆ１０、Ａ５４９、Ｃａｐａｎ膵臓、ＣＡＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ１、ＰＣ−３、ＭＸ−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１が含まれるが、これらに限定されない。
一つの好ましい形態において、与えられる効果（ｆａ）とは、細胞培養液への細胞障害剤（cytotoxic agent）の適用後の細胞死又は細胞静止（cell stasis）をいう。細胞死又は生存度を、例えば、下記方法を用いて、測定することができる：
Figure 2006523713
「ＭＴＴ試験」が好ましい。
二又はそれ以上の薬剤の非拮抗的な割合を、癌以外の疾患の徴候のために決定することができ、このデータを使用して、これらの疾患の治療用の二又はそれ以上の薬剤の治療用製剤を調製することができる。インビトロ試験に関し、多くの測定可能なエンドポイントを、薬剤の相乗作用を規定するのに選択することができ、与えられるそれらのエンドポイントは特定の疾患に治療上関連性がある。
したがって、例えば、当業者は、生体外で、ＩＬ−１、ＩＬ−１８、ＣＯＸ−２、ＴＮＦ又はインターフェロン−ガンマ等の炎症誘発性サイトカインの抑制を測定することによって、炎症性疾患の治療のために選択される二又はそれ以上の薬剤の非拮抗的な割合を規定することができるであろう。他の炎症性シグナルには、プロスタグランジンＥ２（prostaglandin E2）及びトロンボキサンＢ２（thromboxane B2）の阻害が含まれるが、これらに限定されない。特に、エンドトキシン媒介性マクロファージ（endotoxin-mediated macrophage）活性化により、追加薬剤又は薬剤併用の抗炎症性効果を測定するのに適したインビトロ試験が与えられる。エンドトキシン媒介性マクロファージ活性化は、技術として一般に使用される。そのような試験において、大量に増殖したマクロファージは、リポ多糖等のエンドトキシンの付加によって活性化される。活性化すると、ＩＬ−１及びＴＮＦ等のサイトカインのマクロファージ分泌が、ＣＯＸ−２の活性化と同様に測定可能となる。候補抗炎症性薬剤は、加えられ、ＩＬ−１、ＴＮＦ、及びＣＯＸ−２を抑制する能力に基づいて評価される。１×１０−７Ｍ デキサメタゾンでの滴定が、ポジティブコントロールとして一般に使用される。マクロファージ活性化を含む試験が薬剤併用の広範なスクリーニングに適していること並びにＩＬ−１、ＴＮＦ、及びＣＯＸ−２の抑制が相乗効果を規定するのに適したエンドポイントであることは、当業者にとって明白であろう。炎症性シグナルを測定することに加え、研究者らは、二又はそれ以上の薬剤の白血球機能への効果を測定する生体外モデルの使用を考慮することができる。機能試験には、脱顆粒、スーパーオキシド生成、及び白血球遊走の抑制が含まれるが、これらに限定されない。
癌と同様、増殖は、動脈硬化症、再狭窄又は血管増殖性の特性（vasculoproliferative attribute）を有する他の循環器疾患の発生において、重要な現象である。したがって、当業者は、本願において示され、血管の関連した増殖性細胞群に適用される方法により薬剤の相乗作用を評価することによって、二又はそれ以上の薬剤の非拮抗的な割合を見出すことができる。特に、血管形成の後に結果として生ずる冠状動脈及び末梢動脈の再狭窄等の再狭窄は、平滑筋及び内皮細胞の増殖に起因しうる（Ｆｕｓｔｅｒ，Ａｒｃｈ Ｍａｌ Ｃｏｅｕｒ Ｖａｉｓｓ（１９７７）９０ Ｓｐｅｃ Ｎｏ６：４１−４７）。本願に示した標準的な方法を用いて、当業者は、二又はそれ以上の薬剤が内皮細胞又は平滑筋細胞の増殖を阻害するよう非拮抗的に作用するかどうかを測定することができる。これらの測定法を、不死化した株細胞（immortalized cell line）を用いて又は、好ましくは一次株細胞（primary cell line）を用いて行うことができる。これらの株細胞を、商業上の出所（例えば、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア）から又は新鮮な組織（例えば、臍静脈、動脈、脳）から得ることができるが、細胞増殖を促進する適当な増殖因子で維持しなければならない。二又はそれ以上の薬剤の癌細胞への相乗作用を測定する測定と同様、そのような測定には、増殖及び遊走の阻害のエンドポイントが含まれうるが、これに限定されない。増殖エンドポイントは、本願において記載したＭＴＴ試験等の生／死試験、［３Ｈ］−チミジン取り込みによる増殖の測定、又はその他同様の試験に依存しうる。また、癌細胞を分割するのと同様、内皮細胞及び平滑筋細胞の増殖は、細胞周期におけるチェックポイントによって制御され、細胞周期阻害を測定する試験を用いて、血管増殖性の疾患の治療のために選択される二又はそれ以上の薬剤の非拮抗的な割合を規定することができる。
薬剤の非拮抗的な組み合わせも、菌又はウイルス感染に対する活性のため同定されうる。抗菌剤の同定における第一のステップとして、薬剤の最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration）（ＭＩＣ）を、当業者において公知の古典的なマイクロタイター液体希釈（microtitre broth dilution）又は寒天希釈抗菌試験によって測定することができる。これらの試験は、研究所安全及び規格委員会（National Committee of Laboratory Safety and Standards）（ＮＣＬＳＳ）によって規定されている。標準の液体希釈試験は、「実験薬の抗生物質（Antibiotics in Laboratory Medicine）」、Ｌｏｒｉａｎ，Ｖ．第４版、５２−１１１、ウィリアムズ及びウィルキンス、バルチモアの液体培地におけるアムステルダム（１９９６）抗菌剤の感受性試験（Susceptibility testing of Antimicrobials）で公開されている。ＭＩＣは、感染生体の生体外での増殖を阻害（阻止）するであろう抗生物質の最低濃度と定義される。上述した試験において、ＭＩＣは、（例えば、スポットにつき１０４コロニー形成単位（colony forming unit）［ＣＦＵ］で）小さいスポット（small spot）の細菌の種菌（inoculum）を異なる濃度の薬剤を含む増殖培地（例えば、寒天培地）にプレーティングすることによって測定されうる。一方、細菌は、異なる濃度の薬剤を含む増殖培地の懸濁液に接種されうる。更に、細菌を、上記のように処理してもよいし、或いは特定の細胞群（即ち、マクロファージ）に細胞内感染として内在させてもよい。後者の例において、標準の方法により培養液で増殖された哺乳類細胞が、低濃度の細菌への短時間の曝露によって細胞内細菌感染される。細菌の細胞内複製をさせるまでの期間の後、細胞及びそれらの細胞内細菌は、哺乳類細胞を用いる細胞障害性試験について記載したのと同一の方法で、薬剤を用いて治療される。薬剤が効果的な濃度で与えられたときに薬剤にとって細菌の増殖を阻害するのに十分である適当な期間の後、細菌の増殖を、（ｉ）種菌スポット（inoculum spot）の存在又は不存在（及び必要に応じて、大きさ）の測定；（ii）治療に耐え抜いた細菌数の計算を可能とするための、寒天増殖平板上に処理した細菌の懸濁液の既知量のプレーティング及び段階希釈；（iii）顕微鏡（目視による）測定；（iv）増殖の対数期における細菌が薬剤（又は複数の薬剤）を含む増殖培地中に懸濁され、それから接種後各種の時間で既知量が取り出されて、生存している細菌の計算のため増殖寒天培地上に段階希釈される時間−死滅曲線（time-kill curve）；（v）生存細菌の数の計算を可能にするため当業者に公知のその他分光学的、分析的、インビトロ又はインビボの方法、を含む各種の手段によって測定することができる。死滅細胞内在感染（kill intracellular-resident infection）に対する薬剤、又は薬剤併用の有効性は、一般に、宿主細胞を界面活性剤（detergents）（１％トリトン Ｘ−１００＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウム等）で溶解して、細胞を遊離させ、その後生存している細胞の数を計算するため溶菌液（lysate）を寒天増殖平版上に段階希釈した後、評価される。
効果的な薬剤の併用は、前記記載の手段を用いて拮抗的、相加的、又は相乗的な活性について評価される。具体的には、複数組の化合物が、等モルでありうる固定した割合、又はＭＩＣ値の割合或いはその他の固定した割合で細菌に適用（投与）され、細菌がその複数組の化合物の各種濃度で治療される。前記記載のように活性が測定される。各種の数学的な処理から、例えば、アイソボログラム及びＣＩ等によって、拮抗作用、相加作用、又は相乗作用が決定される。
抗ウイルス活性を有する薬剤又は薬剤の組み合わせについて広範なスクリーニングが、当業者に公知の多数のインビトロ試験、典型的にはプラークリダクション（plaque reduction）及び胞変性効果（cytopathic effect）（ＣＰＥ）阻害試験によって行われうる。これらの試験は、抗ウイルス性の薬剤又は複数の薬剤が組織培養におけるウイルス感染の効果を阻害する程度を直接測定することができる。プラークリダクション試験は、詳細に明らかにされたプラークを生成するウイルス及び株細胞組み合わせに対して好ましい。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓらは、各種モル比でのアフィディコリン又はその誘導体の多数のウイルスへの非拮抗的な抗ウイルス効果を測定するＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法と組み合わせたプラークリダクション試験の使用を示した（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓら、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（２００２）５２（５）：３９３−３９９）。詳細に明らかにされたプラークが特定のウイルス及び株細胞組み合わせによって生成可能でない場合には、ＣＰＥ阻害試験が好ましい。抗ウイルス剤の非拮抗的な組み合わせの迅速且つ簡便な同定のための別の方法として、細胞生存度、ウイルス産生及びＨＩＶ急性又は慢性感染試験（HIV acute or chronic infection assays）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞生存度は、細胞生存度を増加させる抗ウイルス性の薬剤又は薬剤の組み合わせの能力を測定するために使用されるが、この細胞生存度を、先に記載したＭＴＴ試験等の定量試験を用いて得ることができる。一方、ウイルス産生試験及び急性ＨＩＶ感染試験は、抗ウイルス活性を直接測定することを考慮してウイルス産生を減少させる薬剤の能力を評価する。上述の試験が、生体外での相乗、相加又は拮抗作用のため抗ウイルス剤併用をスクリーニングするのに適しており、そのため本発明の範囲内に含まれるということは当業者に明白であろう。
（好ましい薬剤併用）
前記示した非拮抗作用の判定基準を満たすと認められている治療薬の各種組み合わせは、その後薬剤送達媒体の剤型で提供される。「治療薬（thrapeutic agent）」は、単独で又は他の化合物と組み合わせて、望ましくない状態又は疾患に冒された被検体への目的とする（望ましい）効果のある化合物である。
特定の治療薬は、標的の疾患又は状態が癌であるときの併用に有利である。例えば：
癌細胞を増殖又は分裂させるシグナルを妨げる又は阻止する「シグナル伝達阻害剤（Signal transduction inhibitors）」；
「細胞傷害剤（Cytotoxic agents）」；
細胞が娘細胞に分裂する有糸分裂を伴う現象への発端を細胞に与える有糸分裂から、正常な細胞周期による細胞の発達、細胞の寿命を妨げる「細胞周期阻害剤（Cell cycle inhibitors）」又は「細胞周期調節阻害剤（Cell cycle control inhibitors）」；
細胞周期のチェックポイント、例えば、Ｓ／Ｇ２チェックポイント、Ｇ２／Ｍチェックポイント及びＧ１／Ｓチェックポイントの正常な機能を妨げる「チェックポイント阻害剤（Checkpoint inhibitors）」；
ＤＮＡ複製及び転写に必要な酵素、トポイソメラーゼＩ又はII活性を妨げる、カンプトテシン等の「トポイソメラーゼ阻害剤（Topoisomerase inhibitors）」；
チロシンキナーゼ活性を有する増殖因子レセプターの活性を妨げる「レセプターチロシンキナーゼ阻害剤（Receptor tyrosine kinase inhibitors）」；
プログラム細胞死を促進する「アポトーシス誘発剤（Apoptosis inducing agents）」；
必須代謝物（essential metabolite）によく似ており、そのためそれを含む生理反応を妨げる、ゲムシタビン又はヒドロキシ尿素等の「代謝拮抗剤（Antimetabolites）」；
テロメア長を延ばし並びに細胞及びその複製能力の寿命を延ばす酵素、テロメラーゼの活性を妨げる「テロメラーゼ阻害剤（Telomerase inhibitors）」；
ヒストン、細胞骨格タンパク質、転写調節因子、及び癌抑制遺伝子等の細胞タンパク質のリン酸化により細胞周期の異なる相間の主要な段階を制御するサイクリン依存性キナーゼを妨げる「サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（Cyclin-dependent kinase inhibitors）」；
「ＤＮＡ損傷剤（DNA damaging agents）」；
「ＤＮＡ修復阻害剤（DNA repair inhibitors）」；
腫瘍の増殖中に生ずる新たな血管の生成又は現存する血管の増殖を妨げる「抗血管新生剤（Anti-angiogenetic agents）」；並びに
ミトコンドリアの呼吸鎖機能を直接的又は間接的に破壊する「ミトコンドリア毒（Mitochondrial poisons）」
である。
腫瘍の治療用の組み合わせ（併用）として特に好ましいのは、上記示した臨床上承認された組み合わせである。これらの組み合わせは、ヒトでの使用のため既に承認されているので、適当な送達を保証する改善が特に重要である。
組み合わせて使用される可能性のある薬剤として、好ましくは、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、マイトマイシン Ｃ、ミトキサントロン等のＤＮＡ損傷剤；５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）（５−ＦＵ）又はＦＵＤＲ、ゲムシタビン及びメトトレキセートを含むＤＮＡ修復阻害剤；カンプトテシン、イリノテカン及びトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；ブレオマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビン等のＳ／Ｇ２又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤；Ｇ１／初期Ｓチェックポイント阻害剤；Ｇ２／Ｍチェックポイント阻害剤；ゲニステイン、トラスツズマブ、ＺＤ１８３９等のレセプターチロシンキナーゼ阻害剤；細胞傷害剤；アポトーシス誘発剤並びに細胞周期調節阻害剤が挙げられる。
一又はそれ以上の薬剤の作用メカニズムは、公知でないかもしれないし、誤認されているかもしれない。薬剤の全ての相乗的又は相加的な組み合わせが、本発明の目的の範囲内にある。好ましくは、腫瘍の治療のため、細胞増殖が制御されないようにする一を越えるメカニズムを阻害する組み合わせが、本発明による使用のため選択される。例えば、本発明には、細胞周期中に特定の点（ポイント）を生ずる組み合わせを選択し、それによって非拮抗的な効果をもたらすことが含まれる。例えば、ＤＮＡ損傷をもたらす薬剤を、代謝拮抗剤等のＤＮＡ修復を阻害する薬剤と組み合わせることができる。また、本発明には、他のことで細胞増殖をもたらすであろう多種多様な経路を遮断する組み合わせを選択することも含まれる。
特に好ましい組み合わせは、ＤＮＡ損傷剤とＤＮＡ修復阻害剤との組み合わせ、ＤＮＡ損傷剤とトポイソメラーゼＩ又はポイソメラーゼII阻害剤との組み合わせ、トポイソメラーゼＩ又はトポイソメラーゼII阻害剤とＳ／Ｇ２又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤との組み合わせ、Ｇ１／Ｓチェックポイント阻害剤又はＣＤＫ阻害剤とＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤との組み合わせ、レセプターチロシンキナーゼ阻害剤と細胞傷害剤との組み合わせ、アポトーシス誘発剤と細胞傷害剤との組み合わせ、アポトーシス誘発剤と細胞周期調節阻害剤との組み合わせ、Ｇ１／Ｓ又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤と細胞傷害剤との組み合わせ、トポイソメラーゼＩ又はII阻害剤とＤＮＡ修復阻害剤との組み合わせ、トポイソメラーゼＩ又はII阻害剤或いはテロメラーゼ阻害剤と細胞周期調節阻害剤との組み合わせ、トポイソメラーゼＩ阻害剤とトポイソメラーゼII阻害剤との組み合わせ、並びに二つの細胞傷害剤の組み合わせである。
組み合わせて使用されうる特定の薬剤には、シスプラチン（又はカルボプラチン）及び５−ＦＵ（又はＦＵＤＲ）、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びイリノテカン、イリノテカン及び５−ＦＵ（又はＦＵＤＲ）、ビノレルビン及びシスプラチン（又はカルボプラチン）、メトトレキセート及び５−ＦＵ（又はＦＵＤＲ）、イダルビシン及びアラＣ（araC）、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びタキソール、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びエトポシド、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びトポテカン、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びダウノルビシン、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びドキソルビシン、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びゲムシタビン、オキサリプラチン及び５−ＦＵ（又はＦＵＤＲ）、ゲムシタビン及び５−ＦＵ（又はＦＵＤＲ）、アドリアマイシン及びビノレルビン、タキソール及びドキソルビシン、フラボプリドール（flavopuridol）及びドキソルビシン、ＵＣＮ０１及びドキソルビシン、ブレオマイシン及びトリクロルペラジン（trichlorperazine）、ビノレルビン及びエデルホシン、ビノレルビン及びスフィンゴシン（及びスフィンゴシン類似物）、ビノレルビン及びホスファチジルセリン、ビノレルビン及びカンプトテシン、シスプラチン（又はカルボプラチン）及びスフィンゴシン（及びスフィンゴシン類似物）、スフィンゴシン（及びスフィンゴシン類似物）及びダウノルビシン並びにスフィンゴシン（及びスフィンゴシン類似物）及びドキソルビシンが含まれる。
一般に好ましい組み合わせには、ＦＤＡによって認可され臨床上有効であることが既に明らかにされている上記示した組み合わせ、並びに文献報告に基づいて更に提案される組み合わせが含まれる。本発明の方法において使用される候補薬剤は、これら特定の組み合わせに限定されないが、上記示した組み合わせは、適当な併用療法として開示されており、したがって、本発明の方法及び組成物において使用するのに好ましい。
いくつかの脂質は、アポトーシスを誘発する等の治療効果を発揮することができる「治療用脂質（therapeutic lipids）」である。このような定義に含まれるのは、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホン酸塩類、セラミド及びセラミド類似物、ジヒドロキシセラミド、フィトセラミド、スフィンゴシン及びスフィンゴシン類似物、スフィンゴミエリン、セリン含有脂質並びにスフィンガニンである。本願において定義される用語「セリン含有リン脂質（serine-containing phospholipid）」又は「セリン含有脂質（serine-containing lipid）」は、極性ヘッド基（polar head group）が、一方の末端でセリンと共有結合し、他方の末端でエーテル、エステル又はアミド結合により疎水性部分と結合した三炭素バックボーンと共有結合したリン酸基を含むリン脂質である。このような種類に含まれるのは、疎水性部分に二つの炭化水素鎖を有し、長さにおいて５〜２３炭素原子であり、飽和度が変化するホスファチジルセリン（phosphatidylserine）（ＰＳ）等のリン脂質類である。セリン含有リン脂質又はセリン含有脂質に関し、用語 疎水性部分とは、一又はそれ以上の芳香族、脂肪族又は複素環基で任意に置換された、長い飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖等の極性基をいう。
治療用脂質とその他薬剤との組み合わせを用いて、同様に相乗又は相加作用を得ることができる（実施例１７〜２１参照）。
（非拮抗的な併用効果を示す割合を決定するための高処理能力スクリーニング（High Throughput Screening））
複数の薬剤の化学的なライブラリ（chemical library）が異なる割合で互いにスクリーニングされて、新規の非拮抗的な薬剤の併用が同定されうる。化学的なライブラリには、新規又は従来の薬剤が含まれうる。二つの薬剤の併用についてのスクリーニングに加えて、非拮抗的な併用効果について、三つ又は四つの薬剤の併用をスクリーニングしてもよい。好ましくは、薬剤の相乗作用を決定するのに用いられるデータ分析方法論は、半有効分析法（Median Effect Analysis）である。この方法によれば、薬剤のライブラリが、個々に、そして異なる割合で組み合わせてテストされる。それから、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙによって開発された前記方法を用いて、組み合わせ指数が計算される。特定の割合で非拮抗作用を示す薬剤の併用物は、非拮抗的な割合で、送達媒体でカプセル化される。
高処理能力スクリーニングシステムは、市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ社、ホプキントン、マサチューセッツ州；Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、メンター、オハイオ州；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、フラートン、カリフォルニア州；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ナティック、マサチューセッツ州等参照）。これらのシステムにより、通常、全サンプル及び試薬のピペット分注、液体懸濁、設定時間でのインキュベーション、並びに測定に適した検出器におけるマイクロプレートの最終読み取りを含む全処理が、自動化される。これらの設定変更可能なシステムにより、高処理能力、迅速な起動、並びに高度の汎用性及びカスタマイゼーション（customization）が確保される。そのようなシステムの製作者により、各種高処理能力スクリーニング法の詳細なプロトコルが提供される。
（非拮抗的な併用物の調製）
前記のように薬剤の適当な割合が決定された場合には、その適当な割合の薬剤は、一又はそれ以上の送達媒体組成物であって、一又はそれ以上の送達媒体が二又はそれ以上の薬剤をカプセル化する送達媒体組成物に入れられる。組成物中の全ての送達媒体が同一である必要があるとは限らない。組成物中の送達媒体は、その投与経路に依存する大きさの粒子であり、水性溶媒又はその他の溶媒中に懸濁可能であり、本発明の薬剤をカプセル化することができる。そのような媒体には、例えば、先に述べたような脂質担体、リポソーム、サイクロデキストリン、ナノカプセル及びナノスフィアを含む、ポリマーナノ粒子及びポリマーミクロ粒子、ブロックコポリマーのミセル、脂質安定化乳剤、誘導体化された単鎖ポリマー、ポリマー−脂質ハイブリッド系、脂質ミセル、リポタンパクミセルが含まれる。静脈内投与用の送達媒体は、通常、直径約４〜６０００ｎｍである。好ましい直径は、直径約５〜５００ｎｍであり、より好ましくは直径約５〜２００ｎｍである。吸入、くも膜下腔内、関節内、動脈内、腹腔内又は皮下投与用の送達媒体は、通常、４μｍから５０μｍ超過までである。眼内投与用にデザインされる送達媒体組成物は、一般に、より小さい。
前記説明したように、生物活性剤が、予め決定された割合で単一の組成物に処方されうるか、或いは連係して働く薬物動態を有する送達媒体を含有する別々の組成物が、予め決定された割合と一致した割合でこれら組成物を投与するための指示書と共に、用いられうる。したがって、別々の組成物の薬剤を記載した割合で同時又は経時投与することによって、目的とする割合となりうる。
治療薬は、送達媒体で「封入ないしカプセル化」される。「封入ないしカプセル化（encapsulation）」には、先に記載したように、薬剤の送達媒体との共有結合又は非共有結合的な会合が含まれる。例えば、これは、薬剤の送達媒体の外層又は複数の外層との相互作用或いは薬剤の送達媒体内での捕捉によるものでありうるが、その送達媒体の異なる割合間で平衡状態となる。例えば、リポソームについて、薬剤のカプセル化は、脂質成分との共有結合又は非共有結合的な相互作用を介したリポソーム二分子膜との相互作用による薬剤の会合或いはリポソームの水性の内部での捕捉によるもの、或いは内部水相と二分子膜との間で平衡状態にあるものとすることができる。ポリマーベースの送達媒体について、カプセル化とは、薬剤の直鎖又は非直鎖ポリマーとの共有結合ということができる。更に、非限定的な例として、ポリマーマトリックス全体にわたる薬剤の分散、或いはナノカプセル、ブロックコポリマーのミセル又はポリマー−脂質ハイブリッド系の核における薬剤の集中が挙げられる。「負荷（loading）」とは、一又はそれ以上の薬剤を送達媒体でカプセル化する行為をいう。
目的とする組成物のカプセル化を、別々の送達媒体でのカプセル化、又は同一の送達媒体でのカプセル化の何れかにより行うことができる。リポソーム等の別々の送達媒体でのカプセル化を望む場合には、各リポソームの脂質組成物は、連係して働く薬物動態とするため、全く異なっている可能性がある。媒体組成物を変更することによって、カプセル化した薬剤の放出率を、非拮抗的な割合の薬剤が腫瘍部位に送達されるように、合わせることができる。放出率を変更する手段には、薬剤保持時間を改善するよう脂質を形成する小胞のアシル鎖長を増大させること、リポソーム膜外に表面接合したＰＥＧ等の親水性ポリマーの交換を制御すること、並びにステロール又はスフィンゴミエリン等の膜硬化剤（membrane-regidifying agent）を膜に組み込むことが含まれる。第一及び第二薬剤が特定の薬剤の割合で投与されることが望まれる場合、並びに第二薬剤が第一薬剤のリポソーム組成物（例えば、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）内であまりよく保持されない場合には、薬物動態を、アシル鎖長を増大させた脂質を含むリポソーム組成物（例えば、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ）で第二薬剤をカプセル化することによって改善してもよいことは、当業者において自明であるはずである。一方、二又はそれ以上の薬剤を、同一の送達媒体でカプセル化してもよい。
カプセル化の技術は、送達媒体の性質に依存している。例えば、治療薬は、受動的（passive）及び能動的（active）の両方の負荷方法を用いて、リポソーム中に負荷されうる。
薬剤をリポソームでカプセル化する受動的な方法には、リポソームの調製中に薬剤をカプセル化することが含まれる。この方法において、薬剤は、捕捉した水性域（entrapped aqueous space）内で会合又はカプセル化した膜であってもよい。これには、対象の薬剤を含む水相を、反応容器の壁に付着した乾燥小胞形成脂質（dried vesicle-forming lipid）の膜に接した状態にする、Ｂａｎｇｈａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６５）１２：２３８、によって記載された受動的な捕捉方法が含まれる。機械的手段による攪拌の際には、脂質の膨張が生じるであろうし、多重層リポソーム（multilamellar vesicle）（ＭＬＶ）が形成するであろう。押出し（extrusion）により、ＭＬＶは、大きな１枚膜リポソーム（large unilameller vesicle）（ＬＵＶ）又は小さな１枚膜リポソーム（small unilameller vesicle）（ＳＵＶ）に転換されうる。用いられうる別の受動的な負荷方法には、Ｄｅａｍｅｒ及びＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｕｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９によって記載された方法が含まれる。この方法には、小胞形成脂質をエーテル中に溶解させることが含まれるが、エーテルを先ず蒸発させて表面上に薄膜を形成させその後この膜をカプセル化されるように水相と接した状態にする代わりに、エーテル溶液が前記水相中に直接注入され、その後エーテルが蒸発され、それによって、カプセル化した薬剤を含むリポソームが得られる。更に使用されうる方法は、水に不溶性の有機溶媒を含む脂質溶液が水性担体相で乳化され，その後、その有機溶媒が減圧下除去される、Ｓｚｏｋａ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（１９７８）７５：４１９４、によって記載された逆相エバポレーション（Reverse Phase Evaporation）（ＲＥＶ）法である。
使用されうる受動的な捕捉の別の方法には、リポソームを連続的に脱水及び再水和処理すること、或いは凍結及び解凍することが含まれる。脱水は、エバポレーション（evaporation）又は凍結乾燥によって行われる。この技術は、Ｋｉｒｂｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）９７９−９８４、によって開示されている。また、Ｓｈｅｗ及びＤｅａｍｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８５）８１６：１−８）により、超音波処理により調製したリポソームがカプセル化されるべき溶質を含む水溶液中に混合され、それからその混合物が回転フラスコ中で窒素存在下乾燥される方法が記載されている。再水和の際には、溶質のかなりの画分がカプセル化された大きなリポソームが生ずる。
多くの薬剤併用のため、二又はそれ以上の薬剤の受動的なカプセル化が可能である。このアプローチは、水緩衝溶液における薬剤の溶解性並びに高い割合にある送達媒体内で捕捉されない薬剤によって制限される。脂質サンプルと薬剤を同時凍結乾燥すること、並びに薬剤を可溶化させておく最小体積で再水和することによって、負荷を改善してもよい。緩衝液のｐＨを変更すること、温度を上昇させること、或いは緩衝液からの塩の添加又は除去によって、溶解性を改善してもよい。
カプセル化の能動的な方法を用いてもよい。例えば、リポソームを、金属錯体生成（metal-complexation）又はｐＨ勾配負荷（pH gradient loading）技術により、負荷してもよい。ｐＨ勾配負荷を用いて、選択したｐＨの水相をカプセル化するリポソームが生成される。水和したリポソームは、選択した異なるｐＨの水性環境におかれて、薬剤又はその他カプセル化されるべき薬剤における電荷が除去又は最小化される。一旦、薬剤がリポソーム内に移動すると、結果的に、内部のｐＨにより薬剤が脂質二分子膜を透過するのを防いで、リポソーム中に薬剤を捕捉する荷電薬剤状態（charged drug state）になる。
ｐＨ勾配を形成するため、もとの外部媒体（external medium）を、異なる濃度のプロトンを有する新たな外部媒体と交換（置換）することができる。外部媒体の交換（置換）を、（下記実施例において示したように）新たな媒体で平衡化されているゲル濾過カラム、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムに脂質小胞調製物を通すことによる、或いは遠心分離、透析又は関連した技術による等の各種技術によって行うことができる。内部媒体（internal medium）は、外部媒体に関して酸性又は塩基性の何れかであってもよい。
ｐＨ勾配の確立の後、ｐＨ勾配負荷可能剤（pH gradient loadable agent）が混合物に添加され、前記のようにリポソームでの薬剤のカプセル化が起こる。
ｐＨ勾配を用いる負荷を、参照により本願に組み込まれる米国特許第５，６１６，３４１号、５，７３６，１５５号及び５，７８５，９８７号に記載された方法により実施してもよい。ｐＨ勾配負荷の好ましい方法は、ｐＨ２〜６の内部緩衝液（internal buffer）及び中性の外部緩衝液（external buffer）としてクエン酸塩を利用するクエン酸塩ベースの負荷方法（citrate-based loading method）である。
全リポソームにわたってｐＨ勾配を確立し、維持するために、各種の方法を用いてもよく、全ての方法が、参照により本願に組み込まれる。この方法には、リポソーム膜中に挿入でき、イオンをプロトンと引き換えにして膜全体にわたって輸送することができるイオノフォア（ionophore）の使用が含まれうる（例えば、米国特許第５，８３７，２８２号参照）。リポソーム内部でカプセル化される化合物であって、リポソーム膜全体にわたってプロトンを輸送し、それによってｐＨ勾配を形成することができる化合物（例えば、米国特許第５，８３７，２８２号参照）を利用してもよい。これらの化合物は、脱プロトン化されたときに中性であり、プロトン化されたときに荷電をもつイオン化可能な成分を含む。中性の脱プロトン化した形態（この形態はプロトン化した状態と平衡状態にある）は、リポソーム膜を通過することができ、それによってプロトンをリポソーム内部に残し、その結果、内部ｐＨの減少を引き起こす。そのような化合物の例として、塩化メチルアンモニウム（methylammonium chloride）、硫酸メチルアンモニウム（methylammonium sulfate）、硫酸エチレンジアンモニウム（ethylenediammonium sulfate）（米国特許第５，７８５，９８７号参照）及び硫酸アンモニウムが挙げられる。塩基性の内部ｐＨを設定することができる内部負荷緩衝液を利用することもできる。この場合には、中性形態は、プロトンがリポソーム内部から塩基性の内部を確立するように輸送されるため、プロトン化される。そのような化合物の例は、酢酸カルシウムである（米国特許第５，９３９，０９６号参照）。
二又はそれ以上の薬剤については、同一の能動的な負荷方法を用いてリポソーム中に負荷してもよく、或いは別の能動的な負荷方法の使用を伴ってもよい。例えば、金属錯体化負荷技術を、多種多様な薬剤を能動的に負荷すべく利用してもよく、或いはｐＨ勾配負荷等の別の能動的な負荷技術と組み合わせてもよい。金属を基剤とする負荷では、通常、受動的にカプセル化した金属イオンを含む（受動的に負荷した治療薬を含むか又は含まない）リポソームが使用される。金属イオンの塩は製薬学的に許容でき且つ水溶液に可溶であると推定されるので、金属イオンの各種塩が使用される。能動的に負荷した薬剤は、金属イオンと複合体を形成し、それによってそれがリポソーム内で複合体を形成したときに保持される能力があることに基づいて選択されるが、金属イオンと複合体を形成しないときにはリポソーム中に負荷する能力があることに基づいて選択される。金属と配位する能力がある薬剤は、通常、アミン類、カルボニル基、エーテル類、ケトン類、アシル基、アセチレン類、オレフィン類、チオール類、ヒドロキシル又はハライド基或いは金属イオンに電子を供与しそれによって金属イオンと複合体を形成する能力があるその他の適当な基等の配位部位を含む。金属を結合する活性剤の例として、フルオロキノロン等のキノロン；ナリジクス酸等のキノロン；ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシン等のアントラサイクリン；カナマイシン等のアミノグリコシド；並びにブレオマイシン、マイトマイシン Ｃ及びテトラサイクリン等のその他の抗生物質；並びにシクロホスファミド、チオセミカルバゾン、インドメタシン及びニトロプルシド等のナイトロジェンマスタード；トポテカン、イリノテカン、ルルトテカン（lurtotecan）、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン及び１０−ヒドロキシカンプトテシン等のカンプトテシン；並びにエトポシド等のポドフィロトキシンが挙げられるが、これらに限定されない。薬剤の取り込みを、外部媒体（培地）への薬剤の添加後、適当な温度で混合物をインキュベートすることによって立証してもよい。リポソームの組成、内部媒体の温度及びｐＨ、並びに薬剤の化学的性質に依存して、薬剤の取り込みが、何分間又は何時間もの期間にわたって生じうる。リポソーム内で薬剤と金属との間に配位が生ずるかどうかを測定する方法には、分光光度分析及びその他の当業者に公知の慣用技術が含まれる。
更に、リポソーム中においてイオノフォアの不存在下で行われる金属を基剤とする処置を用いるリポソーム負荷効率及び保持特性は、使用される金属及びリポソームの脂質組成物に依存する。脂質組成物及び金属を選択することによって、負荷又は保持特性を、目的とする負荷又はリポソームからの選択される薬剤の放出を行うように合わせることができる。
受動的及び能動的負荷方法を、送達媒体中に多種多様な薬剤を負荷するため経時で組み合わせてもよい。一例として、ＭｎＣｌ２の存在下シスプラチン等の受動的に捕捉した白金剤を含むリポソームを、その後用いて、リポソームの内部にドキソルビシン等のアントラサイクリンを能動的に包接させ（カプセル化し）てもよい。この方法は、受動的なカプセル化によりリポソームでカプセル化された多数の薬剤に適用できる可能性がある。
（キット）
本発明の組成物中の治療薬を、各治療薬が適当な送達媒体と安定に会合している個々の組成物として、別々に処方してもよい。これらの組成物を、送達媒体の薬物動態が治療の標的で投与される治療薬の割合が維持されるよう連係して働く限り、被検体に別々に投与することができる。したがって、分離したコンテナ内に、少なくとも第一治療薬と安定に会合している送達媒体を含む第一組成物と、第二コンテナとして、少なくとも１つの第二治療薬と安定に会合している送達媒体を含む第二組成物とを含有するキットを構成するのに有用である。前記コンテナは、そのとき前記キット内に包装されうる。
前記キットには、投与されるべき各組成物の量の割合に関する記述を少なくとも含む、被検体に対する組成物の投与形態に関する指示書も含まれるであろう。これに替えて、又は更に、前記キットは、各コンテナにおける組成物の量が予め測定されて構成され、その結果、一方のコンテナの内容物が他方のコンテナの内容物と組み合わされて正確な割合を表すように構成される。これに替えて、又は更に、前記コンテナには、目に見えるスケールによって適当な量の調剤（処方）を可能にする測定スケールが付けられてもよい。前記コンテナは、それ自体で投与に使われる；例えば、前記キットは、別々の注射器内にある適当な量の各組成物を含むかもしれない。予備処方された正確な割合の治療薬を含む製剤も同様にこの方法で包装されてもよく、その結果、前記製剤はキット内に包装された注射器から直接投与される。
（多種多様な薬剤をカプセル化する送達媒体組成物の治療的使用）
これらの送達媒体組成物を使用して、温血動物及びトリ種の各種の疾患を治療してもよい。したがって、本発明の方法及び組成物による治療に適した被検体には、ヒト、家畜又は家庭内動物、ニワトリ及びアヒル等の家禽被検体、及び研究使用のための実験動物等の哺乳類が含まれる。本発明の組成物の医薬用途の例としては、癌の治療、高血圧症、心不整脈及び再狭窄等の循環器疾患の治療、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫感染の治療、ワクチンとしての本発明の組成物の使用による疾患の治療及び／又は予防、炎症の治療或いは自己免疫性疾患の治療が挙げられる。
一つの形態として、本発明による送達媒体組成物は、腫瘍を治療するために使用することが好ましい。製剤化した薬剤の腫瘍部位への送達は、リポソーム又は他の粒子送達系の投与により行われる。リポソームは、直径２００ｎｍ未満であることが好ましい。腫瘍脈管構造は、内皮の開窓（fenestration）又は間隙（gap）により、一般に健常な脈管構造よりも漏出しやすい。これにより、直径２００ｎｍ以下の送達媒体は不連続な内皮細胞層、及び腫瘍に血液を供給する血管を取り囲む下位基底膜（underlying basement membrane）を透過する。血管外遊走後の腫瘍部位への送達媒体の選択的な蓄積により、薬剤の送達及び治療有効性が高まる。担体は血管外遊走するため、血管内で測定される担体薬剤−薬剤の割合は血管外域での担体薬剤−薬剤の割合に匹敵するであろうと想定されうる。
（送達媒体組成物の投与）
上述したように、本発明の送達媒体組成物を、ヒト並びに家禽種（domestic avian species）を含む温血動物に対して投与してもよい。ヒトの病気の治療のため、資格のある医師は、確立されているプロトコルを用いて、投与の量、スケジュール及び経路に関し、本発明の組成物がどのように利用されるべきか判断するであろう。本発明の送達媒体組成物でカプセル化された薬剤が被検体の健常組織に対する毒性を低減する場合には、そのような応用が投与の段階的増大（dose escalation）にも利用されうる。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、非経口、即ち、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内投与される。より好ましくは、前記医薬組成物は、ボーラス注射によって静脈内又は腹腔内投与される。例えば、Ｒａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；及びＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号を参照すべきである。
その他の方法として、本発明の医薬製剤を、組織に対する当該製剤の直接の施与（塗布）により標的組織と接触させることができる。当該施与は、局所的（topical）、「開放性（open）」又は「閉鎖性（closed）」処置によってなされる。「局所的（topical）」とは、皮膚、中咽頭、及び外耳道等の環境に露出した組織への医薬製剤の直接の施与を意味する。「開放性」処置は、患者の皮膚を切開すること及び医薬製剤が施与される下位組織を直接目に見えるようにすることを含む処置である。これは、一般に、肺に接触するための開胸術、腹部内臓に接触するための開腹術（abdominal laparotomy）、或いはその他の標的組織への直接的な外科的アプローチ等の外科的処置によってなされる。「閉鎖性」処置は、内部標的組織は直接目に見えないが、皮膚の小さい傷を通じて器具を挿入することによって接触する観血的処置である。例えば、前記製剤を、針洗浄（needle lavage）により腹膜に投与してもよい。同様に、前記医薬製剤を、脊髄麻酔又は脊髄のメトラズアミド（metrazamide）画像化のため一般に行われるように患者の適当な位置決めに続いて、腰椎穿刺中に、注入によって髄膜又は脊髄に投与してもよい。一方、前記製剤を、内視鏡検査装置により投与してもよい。
本発明の送達媒体を含む医薬組成物は、標準的な技術により調製されるが、これにはアルブミン、リポタンパク質、及びグロブリン等の安定性を高める糖タンパク質を含む水、緩衝水（buffered water）、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、及び５％デキストロース等が含有されうる。これらの組成物は、慣用又は公知の無菌化技術によって無菌化されうる。結果として生ずる水溶液は、使用のために包装され又は無菌条件下濾過され、それから凍結乾燥されうるが、凍結乾燥された製剤は投与前に無菌水溶液と併用される。前記組成物には、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウム等のｐＨ調整及び緩衝剤、並びに張性（浸透圧）調整剤（tonicity adjusting agent）等、生理学的な条件に近づけるのに必要とされるような製薬学的に許容できる補助物質を含有させてもよい。更に、送達媒体懸濁液には、貯蔵におけるフリーラジカル及び脂質過酸化障害（lipid-peroxidative damage）から脂質を保護する脂質保護剤（lipid-protective agent）を含有させてもよい。αトコフェロール等の親油性フリーラジカル失活剤及びフェリオキサミン（ferrioxamin）等の鉄特異性キレート剤（iron-specific chelator）が適している。
医薬製剤における送達媒体の濃度を、約０.０５重量％未満、多くの場合約２〜５重量％又は少なくとも約２〜５重量％から、１０〜３０重量％程度までのように、広範に変えることができ、選択される特定の投与形態に応じて、主に液量、及び粘度等により選択するであろう。例えば、濃度を、治療と付随した液体負荷量（fluid load）を低くするため増加させてもよい。一方、刺激性の脂質からなる送達媒体を、投与の部位での炎症を少なくするため、低い濃度まで希釈してもよい。診断に関し、投与される送達媒体の量は、使用される特定の標識、診断されている病状、及び臨床医の判断に依存するであろう。
本発明の医薬組成物は静脈内投与されることが好ましい。送達媒体製剤の投与量は、脂質に対する薬剤の割合及び投与する医師の患者の年齢、体重、及び状態に基づく所見に依存するであろう。
医薬組成物に加えて、獣医学的用途に適した製剤を、被検体に適した方法で調製、投与してもよい。好ましい獣医学の被検体には、哺乳類種、例えば、非ヒトの霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及び家禽が含まれる。被検体には、研究動物、例えば、特にラット、ウサギ、マウス、及びモルモットも含まれうる。
１を超える活性剤を含む単一の組成物が含まれる場合には、上記手順を本質的にとる。薬剤が別々の送達媒体組成物で投与される場合には、その投与は、目的とする割合が維持されるような方法で好時機に行われるべきである。典型的には、この投与を、計算された割合で組成物を同時投与することによって行うことができる。
（生体内での治療活性の評価）
二又はそれ以上のカプセル化剤を含む送達媒体組成物の治療活性を、動物モデルへの投与後に測定してもよい。動物モデルは腫瘍を含むことが好ましいが、送達媒体組成物を、その他の疾患の動物モデルに投与してもよい。免疫適格性及び免疫無防備状態、並びにノックアウト、或いは遺伝子組換えのモデルを含む近交系、非近交系、又は雑種起源の何れかのマウス及びラット等のげっ歯類種を、用いてもよい。
モデルは、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、くも膜下腔内、又は同所性の領域に細胞懸濁液、ブイヨン（brie）又は腫瘍断片として移植された固形又は非固形腫瘍からなるものとすることができる。腫瘍については、腫瘍原性／発癌性の薬剤の施与又は投与により形成されてもよく、或いは適当な遺伝子操作をされた動物モデルにおいて突発的に生じるようにさせてもよい。腫瘍型を、癌腫、内腫、メラノーマ、グリア細胞腫、白血病及びリンパ腫等の外皮、中皮、又は内皮起源の腫瘍からなるものとすることができる。
好ましい形態として、腫瘍のマウスモデルが使用される。免疫易感染性マウス（immune compromised mouse）で増殖したヒト異種移植固形腫瘍が、規定した遺伝学及び増殖特性に基づいて、利用及び選択されうる。これらの実験において利用される腫瘍細胞は、好ましい特性を発現するよう遺伝子操作又は選択され、マウスに注射される。
一旦、腫瘍が触診できる（測定できる）大きさまで増殖すると、送達媒体組成物を、好ましくは静脈内に、投与することができ、それら組成物の腫瘍増殖への効果がモニターされる。目的とする療法治療（therapeutic treatment）を、注射器、錠剤、液体、圧力（浸透圧等）を用いる経口、経鼻、皮下、静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、腫瘍内経路等のいくつかの適当な経路による数日又は数週間にわたる一回のボーラス（bolus）又はプッシュ（push）投与或いは複数又は継続的な投与からなるものとすることができる。投薬及びスケジュール依存性を、達しうる最大抗腫瘍活性を測定するために評価してもよい。
腫瘍を含む動物モデルにおいて治療活性を測定する各種の方法を、利用してもよい。これには、固形腫瘍モデル評価方法及び非固形腫瘍モデル評価方法が含まれる。
固形腫瘍モデル評価方法には、腫瘍容積（質量）、腫瘍重量阻害（tumor weight inhibition）（ＴＷＩ％）、腫瘍増殖遅延（tumor growth delay）（Ｔ−Ｃ）、腫瘍退縮、細胞死滅及びクローン原性試験が含まれる。
腫瘍容積測定値は、垂直長さ及び幅測定値（多くの場合高さ測定値も同様に得ることができる）のノギス測定から求められる。腫瘍容積（ｍＬ）又は質量（ｇ）は：
容積＝（長さ×幅２／２）；又は
容積＝π／６×（長さ×幅×高さ）
から計算される。データは、時間に関してプロットされる。
腫瘍重量阻害（ＴＷＩ％）は、規定された時点での、治療群の平均腫瘍重量をコントロール群の平均腫瘍重量で割り、１を引いて１００をかけることによって求められる。
腫瘍増殖遅延（Ｔ−Ｃ）は、任意に決定した腫瘍の大きさ（例えば３００ｍｇ）に達するまでの治療（Ｔ）群の日数のメジアン時間（median time）からそれと同一の腫瘍の大きさに達するまでのコントロール（Ｃ）群の日数のメジアン時間を差し引いたものとして測定される。
治療の結果としての腫瘍の退縮を、腫瘍モデルを評価する手段として用いてもよい。結果は、ある期間にわたる腫瘍の大きさ（質量）の減少として表される。
固形腫瘍モデル評価の細胞死滅法には、全てが予定した大きさ（例えば、２００ｍｇ）を超えるまで、キャリパによって繰り返し腫瘍を測定することを含めることができる。それから、腫瘍増殖及び腫瘍倍加時間（tumor doubling time）を測定することができる。ｌｏｇ１０細胞死滅（cell kill）パラメータを：
ｌｏｇ１０細胞死滅／投与量＝（Ｔ−Ｃ）／（（３．３２）（Ｔｄ）（投与の数））
ｌｏｇ１０細胞死滅（合計）＝（Ｔ−Ｃ）／（（３．３２）（Ｔｄ））
ｌｏｇ１０細胞死滅（正味）＝（（Ｔ−Ｃ）−（Ｒｘの持続時間））／（（３．３２）（Ｔｄ））
によって計算することができる。
ここで：（Ｔ−Ｃ）＝腫瘍増殖遅延（tumor growth delay）
Ｔｄ＝腫瘍倍加時間
である。
クローン原性（clonogenicity）試験は、治療の有効性を表す。これらの試験（検定）には、切除検定（excision assay）及び固形腫瘍からの細胞懸濁液のキャラクタリゼーション（characterization）が含まれる。
切除検定は、腫瘍から調製される懸濁液中の細胞画分が無限増殖の可能性（unlimited proliferative potential）を有する（即ちクローン原性である）ことを評価するのに用いられる。切除検定の三つの型は：
i）生体内接種から得る腫瘍を生ずるために必要とされる細胞数を測定する、ＴＤ５０、又はエンドポイント（限界）希釈（end point dilution）検定；
ii）個々の細胞の、例えば肺において、小瘤（nodule）（コロニー）形成する能力を評価するインビボコロニー検定；
iii）個々の細胞の、培養皿のプラスチック又はガラス表面上にコロニーが生ずるときには液体培地において、或いは懸濁液中でコロニーが生ずる場合には寒天培地等の半流動培地において、増殖してコロニーになる能力をテストするインビトロコロニー検定
である。
固形腫瘍からの細胞懸濁液のキャラクタリゼーションは、インビトロ及びインビボクローン原性試験、フローサイトメトリー測定のため、並びに細胞ベース毎に行われる多数の生化学的及び分子的分析のために必要とされる。調製は、酵素的、機械的、化学的、それらの組み合わせ、並びに界面活性剤等の多数の方法によってなされる。評価には、細胞産生量（cell yield）、細胞の形態、腫瘍細胞のクローン原性、生化学的又は分子的特徴の保持が含まれうる。
非固形腫瘍モデル評価方法には、寿命の増加（increase in life-span）（ＩＬＳ％）、腫瘍増殖遅延（tumor growth delay）（Ｔ−Ｃ）、長期間の生存（long-term survivors）（治癒（cures））の測定が含まれる。
寿命の増加（ＩＬＳ％）は、治療群対コントロール（対照）又は未治療群の寿命の増加百分率を測定する。腫瘍増殖遅延（Ｔ−Ｃ）は、治療（Ｔ）群の生存日数のメジアン時間（median time）からコントロール（Ｃ）群の生存日数のメジアン時間を差し引いたものを測定する。長期間の生存（治癒）は、未治療又はコントロール群の生存期間の３倍まで及びこれを超えるまで生存する治療群を測定する。
癌に冒されたヒトの治療活性を測定する方法には、生存度（survival）及び代理エンドポイント（surrogate endpoint）の測定が含まれる。生存度を合理的に評価する期間は、問題の腫瘍に依存する。例として、程度のリンパ腫を有する患者の生存率は、診断後５年又は１０年で検討されうるが、進行型の非小細胞肺癌等の攻撃的な疾患を有する患者の生存度は、診断後６又は１２ヶ月で評価されるのが最良かもしれない。
代理エンドポイントを用いて治療活性を測定する方法には、完全応答（complete response）（ＣＲ）、部分応答（partial response）（ＰＳ）、無増悪生存期間（progression-free survival）（ＰＦＳ）、腫瘍増殖停止時間（time-to-progression）（ＴＴＰ）又は応答持続時間（duration of response）（ＤＯＲ）、血漿（plasma）及び尿（urine）マーカ（marker）、酵素阻害（enzyme inhibition）及び／又はレセプター状態（receptor status）、遺伝子発現における変化（changes in gene expression）並びに生活の質（quality of life）（ＱＯＬ）が含まれる。
完全応答とは、治療されている腫瘍型に適した期間にわたっていかなる疾患の発現もなく、疾患の知られている部位の全てが消失することを意味する。評価は、上述した評価等の各種検査に基づく。
部分応答は、治療されている腫瘍型に適した期間にわたって新たな疾患が現れることなく、全ての病変部の双方向測定の産物の総計が少なくとも５０％増加することである。評価は、患者の各種検査（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、超音波診断、ＰＥＴスキャン、骨スキャン、理学的検査）に基づく。
無増悪生存期間（ＰＦＳ）:患者が生存し且つ存在する腫瘍の増殖も新たな腫瘍塊の出現もない治療からの継続時間。ＰＦＳを、継続時間として、或いは生存している又は診断後与えられた期間で無増悪（無進行）である患者の割合として表してもよい。
腫瘍増殖停止時間（ＴＴＰ）又は応答持続時間（ＤＯＲ）とは、存在する腫瘍塊の大きさの増大又は新たな腫瘍塊の出現の何れかについて測定する、治療から腫瘍増殖の進行までの継続時間をいう。
血漿及び尿マーカには、以下のマーカ：前立腺特異抗原（prostate specific antigen）（ＰＳＡ）及び癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen）（ＣＥＡ）等の測定マーカが含まれるが、これらに限定されない。
酵素阻害及び／又はレセプター状態。チロシンキナーゼレセプター、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、Ｈｅｒ−１及びＨｅｒ−２レセプター等であるが、これらに限定されない増殖因子レセプター。インテグリンリンクドキナーゼ（integrin-linked kinases）及びプロテインキナーゼ（protein kinases）等であり、これらに限定されない酵素。
遺伝子発現における変化には、遺伝子発現の系列分析（ゲノミクス（genomics））及びタンパク質発現の変化（プロテオミクス（proteomics））が含まれる。
生活の質（Quality of Life）（ＱＯＬ）として、５つの機能的な尺度（身体的（physical）、役割的（role）、認知的（cognitive）、社会的、及び感情的）、３つの症状の尺度（吐き気、痛み、及び疲労）、並びに健康全般及び生活の質の尺度について評価し得点を得るＥＯＲＴＣ ＱＬＱ−Ｃ３０採点法等の方法が挙げられる。その測定により、癌患者によって一般に報告される別の症状（呼吸困難、食欲低下、睡眠障害、便秘、及び下痢）の単項目の強度並びに認められる疾患及びその治療の財政的な影響も同様に得られる。
下記実施例は、詳述を目的として与えられ、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例
以下の方法を、下の実施例における細胞傷害性の決定及び非拮抗的な作用の評価のために用いている。
細胞傷害性アッセイ法
以下の実施例においては、標準的なテトラゾリウム比色ＭＴＴ細胞傷害性アッセイ法のプロトコール（Mosmannら、J. Immunol Methods (1983) 65（1-2）：55-63）を用いて、影響を受けた細胞の割合に関する読み取り値を測定した。簡潔に述べると、生存している細胞は、テトラゾリウム塩である3-(4,5-ジエチルチアゾイル-2-イル)-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロミド（3-(4,5-ジエチルチアゾイル-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロマイド、ＭＴＴ）を、分光分析によって読み取り可能な青色のホルマザンへと還元する。２５ｃｍ２フラスコ内で増殖させたヒトＨ４６０非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞などの細胞を継代し（継代数＜２０）、新鮮なＲＰＭＩ細胞培養液中に再懸濁した上で、９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェル当たり１０００細胞（１ウェル中に１００μＬ）の濃度でプレーティングする。続いて細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートする。その翌日に、薬剤の段階希釈物を１２ウェル細胞培養プレート中に用意する。前もって種々の溶液中に調製しておいた薬剤を新鮮なＲＰＭＩ細胞培養液中に希釈する。薬剤を、ラテン方格配置法又は「チェッカーボード」希釈法を用いて、単一の薬剤（２０μｌ）及び特定の固定比率での二剤の組み合わせ（増分２０μＬ）に関する適切な又は特定されたウェルに投与する。新鮮な培地を加えてウェル内の総容量を２００μＬにする。薬剤への曝露は７２時間にわたって行う。
薬剤曝露の後に、ＭＴＴ試薬（１ｍｇ/ｍＬ、ＲＰＭＩ中）を各ウェルに添加して容積を１ウェル当たり５０μＬとし、３〜４時間インキュベートする。続いてウェル内容物を吸引し、細胞を破壊して細胞内のホルマザン沈殿物を可溶化するために１５０μＬ のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加する。９６ウェルプレートをプレートシェーカーで振盪させ、波長５７０ｎｍに設定したマイクロプレート分光光度計で読み取る。吸光度（ＯＤ）の読み取り値を記録し、ブランクウェル（培地のみを含む）のＯＤ値を細胞を含む全ウェルから差し引く。薬剤に対する曝露後の細胞生存率は対照ウェル（薬剤に曝露されていない細胞）に対する百分率に基づく。全てのウェルを３回ずつ検討し、平均値を算出する。
薬剤の組み合わせに関するメディアンエフェクト解析
薬剤の組み合わせの解析には、Chou及びTalalayによるメディアンエフェクト原理を基礎とするソフトウエアプログラムCalcuSyn（Biosoft, Ferguson, MO, USA）を用いた。まず、二剤の組み合わせに関する固定比率を、単剤の細胞傷害性プロフィールによるＩＣ５０：ＩＣ５０比率から導き出す。続いて、製剤の目的を考慮して、より妥当な固定比率（例えば、１０：１〜１：１０の範囲；モル比）を選択する。細胞生存率に対する薬剤効果に基づいて算出した平均値から、用量及び各々の影響率の値をCalcuSynコンピュータプログラムに入力する。それにより前記コンピュータプログラムによって、薬剤の組み合わせが、相乗的、相加的又は拮抗的の何れであるかが、組み合わせ指数（ＣＩ）値に基づいて算出される。
実施例１
用量−効果分析の多様な表現
薬剤の量（用量又は濃度）とその生物学的作用との間の関係、並びに、薬剤の組み合わせの連合効果に関する定量分析は、様々なやり方で計測及び記述を行うことができる。図２は、このような５通りの方法を、一例としてイリノテカンとカルボプラチンとの組み合わせを用いて示している。
用量−効果分析に関するChou及びTalalayの理論に基づき、「メディアンエフェクト式」が様々な生化学的式の算出に用いられており、これらは当技術分野で広範囲に用いられている。この式の変形により、組み合わせ指数（ＣＩ）の算出に用いられるもののような高次式が生成される。前述の通り、ＣＩは、複数の薬剤の組み合わせ及び各組み合わせの種々の比率が拮抗的、相加的又は相乗的の何れであるかを決定するために用い得る。ＣＩプロットは一般に、ｙ軸を表すＣＩと、ｘ軸にある影響を受けた細胞の割合又は影響率（ｆａ）との関係を図示したものである。図２Ａは、イリノテカン／カルボプラチンがモル比１：１０では拮抗的であり（ＣＩ＞１．１）、１：１及び１０：１では相乗作用を有すること（ＣＩ＜０．９）を示している。
用いた薬剤比率に対するＣＩの依存性を表現する代替的な方法についても、本出願人らはデザインした。図２Ｂに示されているように、特定の組み合わせに関する比率特異的な作用の傾向がより適切に図示されるよう、「ＣＩ最大値」を各々の比率に対してプロットする。ＣＩ最大値とは、薬剤の異なる比率においてＣＩ値に最も大きな差異が観察される単一のｆａ値（０．２〜０．８の間）で得られたＣＩ値のことである。
個々の比率において用いる薬剤の濃度は効果（すなわち、相乗作用又は拮抗作用）を左右するのに一定の役割を果たすため、ＣＩを種々の濃度で測定することも重要と考えられる。これらの濃度は、Chou-Talalayによって「有効量」（ＥＤ）とも呼ばれ、インビトロアッセイ法において指定された割合の細胞に影響を及ぼすために必要な薬剤の濃度であり、すなわち、ＥＤ５０は、対照又は非投与細胞集団との対比において細胞の５０％に影響を及ぼすために必要な薬剤の濃度のことである。図２Ｃに示されているように、種々の比率の間における濃度-効果の傾向は容易に識別可能である。示されているエラーバーは平均値と１方向の標準偏差を表しており、これはCalcuSynプログラムによって直接決定される。
２種類又はそれ以上の薬剤の間の相乗的相互作用は、プラスの効果を得るために必要な各薬剤の量を減らし得る（「用量減少」としても知られる）という点で、有益である。Chou及びTalalayの「用量減少指数」（ＤＲＩ）は、所定の効果レベルにおいて、相乗的組み合わせにおける各薬剤の用量を各薬剤の単独での用量と比較してどの程度減少させ得るかの指標である。ＤＲＩは、治療的有効性を維持したままで用量減少が宿主に対する毒性低下につながるような臨床の場面では重要である。図２Ｄにおけるプロットは、単独投与で９０％の細胞死惹起に必要なイリノテカン及びカルボプラチンの濃度が、それらを非拮抗的な比率で併用した場合に必要とされる個々の濃度よりも、有意に高いことを示している。
更に、前記のデータを、古典的なアイソボログラムとして表現することもできる（図２Ｅ）。アイソボログラムには、種々のＥＤ値で作成し得るという利点があるが、しかし、解釈において高い効果レベルを選択するほどその読み取りは困難になる。この理由から、以下の実施例におけるデータは、一般に、図２Ａ及び２Ｂに示したプロットのタイプに従って提示されている。
実施例２
ＣＩは濃度に依存する
イリノテカン及び５-フルオロウラシル（５−ＦＵ）のモル比１：１及び１：１０での組み合わせ、並びに、エトポシド及びカルボプラチンのモル比１０：１及び１：１０での組み合わせという薬剤の組み合わせについて、相加的、相乗的又は拮抗的な作用に関し、前記の実施例の項で説明した標準的なテトラゾリウム比色ＭＴＴ細胞傷害性アッセイ法及びメディアンエフェクト解析を用いて、検討した。ＨＴ−２９細胞又はＭＣＦ−７細胞を、単一の薬剤、及び、所定比率での組み合わせの薬剤に対して曝露させた。単一の薬剤及び組み合わせについて、８種類の薬剤濃度を用いた。ＭＴＴアッセイ法によって吸光度値を入手し、これを対照に対する百分率に変換し、平均した上で、影響率の値に変換した。用量及び影響率の値をCalcuSynに入力し、図３に示されるＣＩとｆａとの関係を表すグラフを得た。
図３Ａは、イリノテカン及び５−ＦＵがモル比１：１では、影響率での用量の評価では、全濃度範囲にわたって非拮抗的であったことを示している。これに対して、モル比１：１０では、同じ２つの薬剤は低濃度では非拮抗的であるが、高濃度では拮抗的であった。図３Ｂに示されているように、エトポシド及びカルボプラチンはモル比１０：１では全濃度範囲にわたって拮抗的であった。これに対して、モル比１：１０では、エトポシド及びカルボプラチンは低濃度では拮抗的であるが、高濃度では非拮抗的であった。
シスプラチン及びエデルフォシンも、ＣＩをｆａに対してプロットすることによって概括されているように、モル比１０：１及び１：１でＨ４６０細胞において異なる併用効果を示した。図４に示されているように、モル比１０：１での組み合わせは、影響率の範囲のうち低濃度側の約５０％では非拮抗的であり、高濃度では拮抗的であったが、一方、モル比１：１では全濃度範囲にわたって相乗作用を示した。
すなわち、これらの結果は、相乗作用が、薬剤の相互の比率だけではなく、それらの濃度にも強く依存することを示している。
実施例３
種々の二剤の組み合わせに関するＣＩの決定
以下の表に示した様々な薬剤の組み合わせを、上記のＭＴＴ細胞傷害性アッセイ法プロトコール及びメディアンエフェクト解析手順を用いて、相加的、相乗的又は拮抗的な作用に関して検討した。ＣＩとｆａとの関係をみたグラフからの結果を、以下に表としてまとめている。非拮抗的な作用が認められたｆａ範囲の凡その百分率を、比率の後のカギ括弧中に記載している。測定はｆａ値０．２〜０．８の範囲で行い、ＣＩ値１．１未満に該当する曲線の百分率を決定することにより、相乗作用又は相加作用（非拮抗的）を示したｆａ範囲の百分率を算出した。データは、少なくとも１つの３試行からなる実験に基づく。
Figure 2006523713
ａ 「相乗的又は相加的である％」は、Chou-Talalay方法に基づくＣＩと影響率（ｆａ）とのプロット上で、ｆａ値０．２〜０．８の範囲において、拮抗的な範囲（ＣＩ値＞１．１が拮抗的）に該当しないｆａ範囲の％として算出される。ＣＩは、用量及びｆａ値をCalcuSynに入力することによって割り出した。
ｂ この比率に関するデータ集合は「相加的な」範囲内にあった（ＣＩが０．９〜１．１の間）。
実施例４
カルボプラチン及びダウノルビシンの相乗作用
相加的、相乗的又は拮抗的な作用を評価するための上記手順を、カルボプラチン／ダウノルビシンを、モル比１０：１、１：１及び１：１０でＨ４６０細胞にて用い、更にＭＣＦ−７細胞にて比率１０：１及び１：１で用いて繰り返した。上記のようにＣＩ-ｆａ曲線を作成し、続いてｆａ値０．５０、０．７５及び０．９０でのＣＩを決定（各々ＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０でのＣＩ値を得るため）することにより、各用量についての組み合わせ指数を決定した。標準偏差はCalcuSynプログラムによって算出した。図５Ａの挿入図に示されているように、カルボプラチン及びダウノルビシンはモル比１０：１では、ＭＣＦ−７細胞においてＥＤ５０、ＥＤ７５及びＥＤ９０値で相乗的な相互作用を示す。図５Ａの挿入図に更に示されているように、カルボプラチン及びダウノルビシンは１：１モル比の場合、ＥＤ７５及びＥＤ９０では平均ＣＩ値による判定で相乗的であるが、ＥＤ５０では相加的である。Ｈ４６０細胞においては、ＣＩ最大値とカルボプラチン／ダウノルビシンのモル比とのプロットから、モル比１０：１ではこれらの薬剤は相乗的であるが、モル比１：１では幾らか拮抗的な作用が観察されることが判明した。これに対して、比率１：１０では高い拮抗的作用が認められる（図５Ａ）。相乗作用に対する濃度の影響をより適切に図示するために、図５Ｂにおいても、このデータが、ＣＩと影響を受けたＨ４６０細胞の割合との関係としてプロットされている。モル比１：１のカルボプラチン／ダウノルビシンは、影響率の値が０．４２までの範囲では非拮抗的である。比率が１０：１だと、ｆａ値のかなりの範囲（０．２より上）で相乗作用が認められ、比率１：１０は全てのｆａ値で拮抗的である。図５Ｂの挿入図は、Ｈ４６０細胞において比率１０：１ではＥＤ５０、７５及び９０で相乗作用（平均ＣＩ値による判定）が観察され、比率１：１ではＥＤ５０で相加作用が示されることを示している。比率が１：１０だと、カルボプラチン／ダウノルビシンはＥＤ５０、７５及び９０値で高度に拮抗的である。このため、これらの結果に基づき、カルボプラチン及びダウノルビシンはモル比１：１０では、測定した全てのＥＤ値でＣＩ-ｆａプロット内の全てのｆａ範囲にわたって拮抗作用が認められるため、これ以降の製剤及びインビボ試験の対象としては選択されないと考えられる。モル比１０：１及び１：１のカルボプラチン：ダウノルビシンは、これらの比率の各々で、薬剤が（細胞の１％超が影響を受ける）ｆａ範囲の少なくとも５％にわたって相乗作用を示しているため、製剤及び有効性試験の対象として選択される。
実施例５
インビボでのカルボプラチン及びダウノルビシンの相乗作用の維持
単一のコレステロール非含有リポソーム中に、カルボプラチン及びダウノルビシンを、モル比１０：１、５：１及び１：１（カルボプラチン／ダウノルビシン）で共装填（co-load）した。ＤＳＰＣはクロロホルム中に溶解し、ＤＳＰＧは微量の１４Ｃ−ＣＨＥと共にクロロホルム／メタノール／水（５０：１０：１ ｖｏｌ/ｖｏｌ）中に溶解した。これらの溶液をモル比８０：２０（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ）で混ぜ合わせた。温度を６０℃超に保ちながら、溶媒をＮ２ガス流によって除去した。続いて脂質薄膜を真空ポンプ内に２分間置き、その後にクロロホルムのみの中に再び溶解した。続いてクロロホルムを上記のように除去した。それにより生じた脂質薄膜を、残留溶媒を除くために真空下に一晩おき、その後に、カルボプラチンの溶解性を高めるための４％（ｖ/ｖ）ＤＭＳＯと共に８０ｍｇ/ｍＬカルボプラチンを含む１５０ｍＭ ＣｕＳＯ４、ｐＨ ７．４（ｐＨはトリエタノールアミンで調整）中に再水和した。得られた多層膜小胞（ＭＬＶｓ）を７０℃で孔径８０及び１００ｎｍの積み重ねた２枚のフィルターに通して押し出し、合計１０回通過させた。この試料を生理食塩水中に入れた上で、接線流透析を用いる交換により、３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４（ＳＨＥ）中に入れた。モル比１０：１、５：１及び１：１のカルボプラチン／ダウノルビシンが得られる薬剤／脂質比で、６０℃にて５分間インキュベートすることにより、リポソーム中にダウノルビシン（微量の３Ｈ−ダウノルビシンを含む）を装填した。その後に、各試料の緩衝液を接線流によって生理食塩水に交換した。共装填製剤の調製途中の種々時点における薬剤装填程度を測定するため、液体シンチレーション計数によってダウノルビシン及び脂質の濃度を測定した。カルボプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定した。共装填製剤におけるモル比１０：１、５：１及び１：１のカルボプラチン／ダウノルビシンの場合、Ｂａｌｂ/ｃマウスに対して８ｍｇ/ｋｇカルボプラチンが静脈内投与され、ダウノルビシンの用量は各々１．２ｍｇ/ｋｇ、６ｍｇ/ｋｇ及び１２ｍｇ/ｋｇとなった。指定した時点（各時点当たりマウス３匹）で、血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡ被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心し、血漿を別にチューブに慎重に移した。液体シンチレーション計数を用いてダウノルビシン及び脂質の血漿中濃度を定量した；カルボプラチンの血漿中濃度は原子吸光分光法によって測定した。原子吸光分光法による定量のためには、標準曲線の直線範囲に収まるように試料を０．１％硝酸で希釈した。
図６における結果は、薬剤の平均血漿中濃度（＋／−標準偏差、ＳＤ）を指定時点でプロットしたものであるが、血漿中カルボプラチン モル濃度がダウノルビシンの１０倍であることから、カルボプラチン及びダウノルビシンをモル比１０：１で含む共装填リポソーム製剤は、静脈内投与後も薬剤比率が維持されていたことを示している。図７Ａ及び７Ｂにおける結果は、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソーム中に製剤化されたカルボプラチン／ダウノルビシンのモル比１０：１、５：１及び１：１が、これらの比率で調製された製剤の静脈内投与から２４時間の時間経過にわたって（各時点当たりマウス３匹）、血液区画において維持されたことを示している（図７Ｂは１：１カルボプラチン／ダウノルビシン製剤の投与後に得られた結果をより明確に強調している）。すなわち、これらの結果は、様々なモル比で２種類の薬剤の協調的な放出動態が達成され得ることを示している。
ＤＳＰＣ／ＳＭ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９０：５：５ｍｏｌ％）リポソーム中に、カルボプラチン及びダウノルビシンを共製剤化し、この製剤でもインビボでの薬剤の協調的な放出が達成され得るか否かを検討した。実施例４で相乗的であると決定されたモル比１０：１を選択した。
脂質をクロロホルム中に溶解し、クロロホルムをＮ２ガス下で除去し、試料を真空ポンプ内に一晩置くことにより、脂質薄膜（微量の１４Ｃ−ＣＨＥを含む）を上記のように調製した。それにより生じた脂質薄膜を、４０ｍｇ/ｍＬカルボプラチンを含む１５０ｍＭ ＣｕＳＯ４、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７．４（ｐＨはトリエタノールアミンで調整）中で水和させた。ＭＬＶを７０℃で孔径１００ｎｍの２枚の積み重ねたフィルターに通して押し出し、合計１０回通過させた。続いて試料を、カプセル化されなかった金属溶液（又はカルボプラチン）を除去するために接線流透析によって３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中に入れ換えた。ダウノルビシンの装填（微量濃度の３Ｈ−ダウノルビシンを含む）は、カルボプラチン／ダウノルビシンのモル比１０：１を達成するための薬剤濃度で６０℃にて５分間かけて行った。薬剤装填の程度を決定するために、ダウノルビシン及び脂質の濃度を液体シンチレーション計数によって測定した；カルボプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定した。雄性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスに対して、２．２５ｍｇ/ｋｇダウノルビシン及び１５ｍｇ/ｋｇカルボプラチンを、ＤＳＰＣ／ＳＭ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソーム中に共装填した組み合わせにより、静脈内に投与した。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で心臓穿刺によって血液を採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心し、血漿を別のチューブに慎重に移した。カルボプラチン及びダウノルビシンの血漿中濃度は、各々、原子吸光分光法及び液体シンチレーション計数によって測定した。
図８に示した結果は、薬剤の平均血漿中濃度（＋／−標準偏差、ＳＤ）を指定時点でプロットしたものであり、カルボプラチン及びダウノルビシンがＤＳＰＣ／ＳＭ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソーム中に製剤化された場合に、静脈内投与後に同じ速度で血漿区画から排出されたことを明らかにしている。すなわち、この時間経過中に存在したカルボプラチン（ｎｍｏｌ/ｍＬ）の血漿中濃度はダウノルビシン（ｎｍｏｌ/ｍＬ）の概ね１０倍であったことから、カルボプラチン及びダウノルビシンは１０：１のモル比に維持されていた。これらの結果は、単一のリポソーム中に共カプセル化された２種類の薬剤の薬物動態が、同様の薬物動態放出プロフィールを達成されるように協調させるのに、種々の製剤が利用可能であることを示している。
実施例６
リポソーム カルボプラチン及びダウノルビシンの有効性
ダウノルビシン及びカルボプラチンがモル比１：１（これは実施例４の製剤について選択された）で共カプセル化されたＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソーム（８０：２０ ｍｏｌ％）を、２５ｍｇ/ｍＬのカルボプラチンを含む溶液である１５０ｍＭ ＣｕＳＯ４、ｐＨ７．４（ｐＨはトリエタノールアミンで調整）中に脂質薄膜を水和させた点を除き、実施例５における記載通りに調製した。更に、脂質薄膜を乾燥させた後にメタノール又は水を除くためにクロロホルム中に再び溶解し、続いて溶媒を以前の記載通りに除去した。
有効性試験を、実施例２６の方法と同様に、まずＨ４６０細胞（１×１０６個）を雌性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスの側腹部に皮下接種することにより行った。腫瘍を約５０ｍｇ（０．０５ｃｍ３）のサイズになるまで増殖させ、その時点（第１２日）で製剤を尾静脈から注入した。マウス（各群当たりマウス４匹）には４日間隔で３回の注射を行った（ｑ４ｄスケジュール；第１２、１６及び２０日）。腫瘍の増殖はノギスによる直接測定によって評価した。マウスに対して、生理食塩水、モル比１：１の遊離薬剤カクテル、又は、カルボプラチン／ダウノルビシンのモル比１：１のリポソーム製剤の何れかを投与した。遊離物及びリポソーム製剤の投与の何れに関しても、用量は６．６ｍｇ/ｋｇカルボプラチン及び１０ｍｇ/ｋｇダウノルビシンとした。リポソーム製剤試料に関する脂質用量は２６０ｍｇ/ｋｇ脂質であった。
図９に提示した結果（各点は指定日に測定した平均腫瘍サイズ＋／−平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す）は、モル比１：１のリポソーム カルボプラチン及びダウノルビシンの投与により、遊離薬剤カクテル及び生理食塩水対照と比較して、有効性が高まることを示している。
カルボプラチン及びダウノルビシンがモル比１０：１（実施例４で相乗的であることが決定された）で共装填されたスフィンゴミエリン含有リポソームにおける有効性についても、この製剤を用いた場合にも、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソームで認められた大幅な有効性改善が得られるか否かを検討するために調べた。リポソームを孔径８０ｎｍ及び１００ｎｍフィルターに通して１０回押し出す処理を行った点を除き、実施例５に概要を述べた手順に従って、カルボプラチン及びダウノルビシンをＤＳＰＣ／ＳＭ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９０：５：５ｍｏｌ％）リポソーム中に共に製剤化した。更に、ダウノルビシンの装填の前に、接線流透析ではなく固定容積透析により、試料の緩衝液をＳＨＥ緩衝液に交換した。実施例２６に詳述した通りに、Ｈ４６０腫瘍を有する雌性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウス（各群当たりマウス４匹）に対し、１５ｍｇ/ｋｇカルボプラチン及び２．２５ｍｇ/ｋｇダウノルビシンを、リポソーム製剤化薬剤及び遊離薬剤カクテルとして、第１４、１８及び２２日に投与した。リポソーム薬剤は、３７５ｍｇ/ｋｇの脂質用量で投与された。
図１０に提示した結果（各点は指定日に測定した平均腫瘍サイズ＋／−ＳＥＭを表す）は、スフィンゴミエリン含有リポソーム中に非拮抗的なモル比である１０：１でカプセル化されたリポソーム カルボプラチン及びダウノルビシンが、遊離薬剤及び生理食塩水からなる対照との比較で、有効性を大きく高めることを示している。
実施例７
シスプラチン及びダウノルビシンの相乗作用
シスプラチン／ダウノルビシンの組み合わせについて、上述の方法を用いて、相加的、相乗的又は拮抗的な作用に関して調べた。その結果を図１１にまとめた。図１１Ａに示されているように、シスプラチン／ダウノルビシンのモル比１０：１ではｆａの全範囲にわたって相乗作用が観察されたが、モル比１：１では全てのｆａ範囲にわたって拮抗作用が示された。ＣＩ最大値（ＣＩ max）とシスプラチン／ダウノルビシン比率との関係をプロットした図１１Ｂは、組み合わせ指数に対して、２種類の薬剤の組み合わせ比率が依存的であることを更に示している。これらの結果は、モル比１０：１ではＣＩ最大値は相乗的であるが、モル比１：１及び１：１０ではＣＩ最大値は拮抗的であることを示している。
実施例８
インビボでのシスプラチン及びダウノルビシンの相乗作用の維持
シスプラチン及びダウノルビシンを、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソーム中に、実施例７で非拮抗的であることが特定されたモル比１０：１で共装填した。
シスプラチンのリポソーム中への受動的封じ込めは、まず１５０ｍＭ ＣｕＣｌ２、２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ７．４、ｐＨはトリエタノールアミンで調整）に４％（ｖ/ｖ）ＤＭＳＯを加えたものからなる溶液中に薬剤（４０ｍｇ/ｍＬ）を溶解し、そして、得られた溶液をシスプラチンの溶解性を高めるために８０℃に加熱することにより、行った。続いて、８０℃で前記シスプラチン溶液を、ＤＭＰＣ及びコレステロールと共に微量濃度１４Ｃ−ＣＨＥを含む脂質薄膜に添加した。水和した脂質薄膜を８０℃で２枚の１００ｎｍフィルターに通して押し出し、リポソームを室温まで冷却した。冷却後に、カプセル化されなかったシスプラチンをペレット化するために試料を卓上遠心器に入れて２０００×ｇ、５分間の遠心処理を行い、上清を収集した。過剰な金属イオンの除去は、セファデックスＧ−５０ゲル濾過カラムを通過させてリポソーム画分を収集することによって行った。
更にシスプラチンが装填されたリポソームへのダウノルビシン（微量濃度の３Ｈ−ダウノルビシンで標識）の装填は、リポソームを薬剤と共に６０℃で１５分間インキュベートすることにより、シスプラチン／ダウノルビシンのモル比が１０：１となるように行った。薬剤装填の程度を決定するために、シスプラチン濃度を原子吸光分光法によって測定し、そして、３Ｈ−ダウノルビシン及び脂質の濃度は液体シンチレーション計数によって測定した。
協調的な放出がこの製剤によって達成されるか否かを明らかにするために、装填されたリポソームを雄性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスの尾静脈に、マウス１匹につき５．０ｍｇ/ｋｇのシスプラチン及び１．０ｍｇ/ｋｇのダウノルビシンの用量にて、注入した。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺により採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を慎重に別のチューブに移した。リポソーム脂質及びダウノルビシンの血漿中濃度は何れも液体シンチレーション計数によって測定し、シスプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定した。
図１２に示した結果（各点は指定時点に測定した薬剤の平均血漿中濃度＋／−ＳＤを表す）は、測定がなされた時点において血漿中濃度（μｍｏｌ/ｍＬ）がモル比１０：１に維持されていたことから、ダウノルビシン及びシスプラチンの協調的な放出が達成されたことを示している。
上記の方法によってリポソームにシスプラチン及びダウノルビシンを共装填することもできるが、薬剤を単一のリポソーム中に装填するためにその他の技法を用いてもよい。代替的な方法では、シスプラチンをクエン酸、ｐＨ４．０と共に受動的に封じ込めた後にダウノルビシンを装填するためにｐＨ勾配を用いるものであり、緩衝液交換によって膜の内外にｐＨ勾配を生じさせる。この技法は以下のようにして行うことができる。
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）からなる脂質薄膜を上記のように微量の３Ｈ−ＣＨＥと共に調製する。シスプラチン粉末を１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１５０ｍＭクエン酸（ｐＨ４）に溶解することによって、シスプラチン溶液を調製する。シスプラチンの緩衝液への溶解性を最大限に高めるために、溶液を６５℃に加熱して、脂質薄膜に添加する。それにより得られたＭＬＶを、６５℃で、２枚の孔径１００ｎｍフィルターに通して押し出し、合計１０回通過させる。続いて、溶液を２０００×ｇで１０分間遠心することにより、カプセル化されなかったシスプラチンを製剤から除去する。それにより得られたリポソーム シスプラチンを含む上清を、封じ込められなかった残留シスプラチンを除去し、二重層の内外にｐＨ勾配を成立させるため、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）によって予め平衡化されたセファデックスＧ−５０カラムに、通過させる。
次にダウノルビシンをリポソーム中に装填する。まず熱平衡を達成するためにリポソームを６０℃で５分間インキュベートし、続いて薬剤／脂質モル比が０.１：１となるように、ボルテックス処理を行いながらダウノルビシンを脂質製剤に対して添加する。種々の時点での薬剤装填の程度を決定するために、リポソームをＯＧＰと共に溶解し、４８０ｎｍでダウノルビシンの吸光度を測定することによりダウノルビシンの濃度を測定する。前記製剤のシスプラチン濃度は原子吸光分光法を用いて測定する。脂質濃度は液体シンチレーション計数によって測定する。
２種類の薬剤の放出動態を協調させる代替的な手段は、各薬剤を別個の担体中に製剤化することによって達成される。これについては、シスプラチンをＤＭＰＣ／コレステロールリポソーム中に製剤化し、ダウノルビシンをＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソーム中に製剤化した上で、それらをモル比１０：１でマウスに静脈内投与することによって、証明された。
リポソーム シスプラチンは、シスプラチン（８．５ｍｇ/ｍＬ）を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８０℃中にまず溶解することによって調製した。この溶液を次に、微量の３Ｈ−ＣＨＥを含むＤＭＰＣ／コレステロール（５５：４５ｍｏｌ％）脂質薄膜に添加し、そして水和させた。それにより生じたＭＬＶを、８０℃にて、２枚の孔径１００ｎｍフィルターに通して押し出し、その後に、過剰な金属イオンを除去するための接線流透析によって、リポソームを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（ＨＢＳ）中に入れ換えた。押出処理の後、カプセル化されなかったシスプラチンをペレット化するために、リポソームを遠心した。シスプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定し、脂質濃度は液体シンチレーション計数によって測定した。
リポソーム ダウノルビシンは、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５ｍｏｌ％）及び微量の１４Ｃ−ＣＨＥから構成される脂質薄膜を、３００ｍＭ ＣｕＳＯ４溶液で水和させることによって調製した。それにより生じたＭＬＶを、重ね合わせた２枚の孔径１００ｎｍフィルターに７０℃で１０回通過させることによって押し出し処理した。押出処理の後に、リポソームを接線流透析によってＨＢＳ（ｐＨ７．４）中に入れ換えた。ダウノルビシン（微量濃度の３Ｈ−ダウノルビシンを含む）の装填は、最終的な薬剤／脂質重量比が０．１となるようにダウノルビシンを添加することによって開始し、その溶液を６０℃に１０分間保った。薬剤装填の程度は、３Ｈ−ダウノルビシン及び１４Ｃ−ＣＨＥ濃度を計測するための液体シンチレーション計数によって測定した。
雄性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスに対して、リポソーム シスプラチンを薬剤用量２ｍｇ/ｋｇとして、リポソーム ダウノルビシンを薬剤用量０．３７５ｍｇ/ｋｇとして、静脈内注射した。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を慎重に別のチューブに移した。シスプラチンの血漿中濃度は原子吸光分光法によって測定し、ダウノルビシン濃度はシンチレーション計数によって測定した。
図１３に示した結果（各点は指定時点に測定した薬剤の平均血漿中濃度＋／−ＳＤを表す）は、別個のリポソーム中に製剤化されたシスプラチン及びダウノルビシンが、静脈内投与後の種々の時点で１０：１のモル比を維持したことを明らかにしている。
実施例９
リポソーム シスプラチン及びダウノルビシンの有効性
別個のリポソーム中に製剤化したシスプラチン及びダウノルビシンの有効性を、実施例２６に詳述したようにＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウス（Ｈ４６０異種移植モデル）において評価した。Ｈ４６０腫瘍を有するマウス（各群当たりマウス４匹）に対して、生理食塩水、又は、実施例７で非拮抗的であるとインビトロで特定されたモル比１０：１でシスプラチン／ダウノルビシンを投与した。シスプラチン及びダウノルビシンは、押出処理後にＤＭＰＣ／ＣｈｏｌリポソームをＨＢＳに対して透析した点を除き、実施例８の記載通りに、各々、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソーム及びＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５ｍｏｌ％）リポソーム中に、製剤化した。薬剤の組み合わせを投与するマウスに対しては、薬剤を、遊離薬剤カクテル（カクテル；モル比１０：１）として、又は、リポソーム ダウノルビシンとリポソーム シスプラチンとの同時投与（リポソーム製剤；モル比１０：１）として、第１４、１７及び２１日に投与した。遊離物及び製剤化物の投与の何れに関しても、用量は２．０ｍｇ/ｋｇシスプラチン及び０．３７５ｍｇ/ｋｇダウノルビシンとした。脂質用量は、リポソーム シスプラチンについては４００ｍｇ/ｋｇであり、リポソーム ダウノルビシンについては３．７５ｍｇ/ｋｇであった。
図１４はその結果を示しており、ここで各データ点は指定日に測定した平均腫瘍サイズ＋／−ＳＥＭを表す。生理食塩水対照（黒丸）は腫瘍増殖を抑制しなかった；同様に、遊離カクテル（黒い逆三角）も腫瘍増殖に対してわずかな効果しか示さなかった。これに対して、リポソーム製剤（白い三角）は腫瘍増殖を少なくとも３２日間にわたって抑制した。
実施例１０
拮抗的なモル比にある薬剤組み合わせのリポソームによる投与効果
シスプラチン及びダウノルビシンを、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソーム中に、拮抗的であることが実施例７で決定されたモル比１：１で共装填した。シスプラチンは受動的に封じ込め、ダウノルビシンは能動的に封じ込めてシスプラチン／ダウノルビシンのモル比１：１を達成した。単一のリポソーム中への薬剤の装填には、実施例８で概要を示した手順を用いた。
ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム中への製剤化によって協調的な放出が達成されたか否かを明らかにするため、装填したリポソームをＢａｌｂ/ｃマウスの尾静脈に２ｍｇ/ｋｇシスプラチン及び３．７５ｍｇ/ｋｇダウノルビシンの用量にて注入した。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を慎重に別のチューブに移した。脂質及びダウノルビシンの血漿中濃度は何れも液体シンチレーション計数によって測定し、シスプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定した。その結果を図１５にまとめた（各データ点は指定時点で測定した薬剤の平均血漿中濃度＋／−ＳＤを表す）は、ダウノルビシン及びシスプラチンが血漿から同じ速度で排出され、そのため血漿中濃度（ｎｍｏｌ/ｍＬ）がモル比１：１に維持されたことを示している（図１５の挿入図を参照されたい）。
有効性試験は実施例２６の記載通りに行い、Ｈ４６０腫瘍を有する雌性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスに対して、２．５ｍｇ/ｋｇシスプラチン、４．７ｍｇ/ｋｇダウノルビシンを、カクテル又はリポソーム製剤（５２．８３ｍｇ/ｋｇの脂質を含む）として、第１１、１５及び１９日に投与した。
図１６における有効性の結果（各データ点は指定日に測定した平均腫瘍サイズ＋／−ＳＥＭを表す）は、拮抗的な比率にあるダウノルビシン及びシスプラチンの投与では、腫瘍増殖がかなり抑制されていた非拮抗的な比（モル比１０：１）の薬剤における結果（図１４参照）と比較した場合、腫瘍増殖の抑制には効果的でないことを示している。よって、これらの結果は、インビトロで一定の濃度範囲にわたって非拮抗的な作用を示す比率にある薬剤の組み合わせを選択することが、重要であることを強く示している。実際には、図１６で用いた薬剤の用量（２．５ｍｇ/ｋｇシスプラチン及び４．７ｍｇ/ｋｇダウノルビシン）は、図１４で用いた用量よりも高い（２ｍｇ/ｋｇシスプラチン、０．３７５ｍｇ/ｋｇダウノルビシン）。
実施例１１
シスプラチン及びトポテカンの相乗作用
シスプラチン／トポテカンを、モル比１０：１及びモル比１：１の両方で用いて、相乗的、相加的又は拮抗的な作用を決定するための上記手順（実施例１参照）を、繰り返し行った。図１７Ａに示されているように、シスプラチン／トポテカンはモル比１０：１では、５％〜９９％の細胞が影響を受ける（ｆａ＝０．０５〜ｆａ＝０．９９）広範囲の用量にわたって非拮抗的な相互作用を示した。これと対照的に、モル比１：１のシスプラチン／トポテカンは、同じｆａ範囲にわたって、拮抗性が強かった（図１７Ａ）。
濃度のこのような影響は、シスプラチン／トポテカンの様々なモル比に関するＣＩ最大値の算出からも明らかとなった。図１７Ｂに示されているように、拮抗作用はモル比１：１で最大となるように思われ、何れかの薬剤が過剰に存在する場合に非拮抗的な作用が明白となる。
実施例１２
インビボでのシスプラチン及びトポテカンの相乗作用の維持
シスプラチン及びトポテカンを、各々、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム及びＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム中に製剤化した上で、実施例１１で相乗的であることが特定されたモル比１０：１にてマウスに静脈内注射した。
リポソーム シスプラチンは、ＤＭＰＣ及びコレステロール（５５：４５ｍｏｌ％）からなる脂質薄膜を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び８．５ｍｇ/ｍＬシスプラチンからなる溶液で水和させることによって調製した。得られたＭＬＶを、８０℃で、重ね合わせた２枚の孔径１００ｎｍフィルターに１０回通過させることによって押し出し処理した。押出処理の後に試料を冷却し、沈殿したシスプラチンを遠心分離によって除去した。リポソーム中にカプセル化されなかった残留性の可溶性シスプラチンは、ＨＢＳに対する透析によって除去した。カプセル化されなかったシスプラチンの除去後に、薬剤濃度を原子吸光分光法によって測定した。
リポソーム トポテカンは、ＤＳＰＣ及びコレステロール（５５：４５ｍｏｌ％）から構成される脂質薄膜を３００ｍＭ ＭｎＳＯ４溶液で水和することにより調製した。得られたＭＬＶを、６５℃で、重ね合わせた２枚の１００ｎｍフィルターに１０回通過させることによって押し出し処理した。押出処理の後に、リポソームをゲル濾過クロマトグラフィーによりＳＨＥ緩衝液（３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び３０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）中に入れ換えた。トポテカンの装填は、１μｇのＡ２３１８７／脂質 μｍｏｌ（Ａ２３１８７は二重層を介した二価金属イオンとプロトン２個との交換を媒介する陽イオン性イオノフォアである）及びトポテカン（最終的なトポテカン／脂質 比率が０．０８（ｗ/ｗ）となる）を添加することによって開始させ、続いて溶液を６５℃で１５分間保持した。トポテカン装填程度の測定は、カプセル化された薬剤とカプセル化されなかった薬剤とをゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分離しTriton X-100中に溶解した後に３８０ｎｍの吸光度を測定して行った。
この製剤を、ＳＣＩＤ/ｒａｇ２雌性マウスに、尾静脈から静脈内注射した。前記リポソーム製剤の用量は、５ｍｇ/ｋｇシスプラチン及び０．７５８ｍｇ/ｋｇトポテカンとした。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して、血漿を慎重に別のチューブに移した。放射標識した脂質の定量には、液体シンチレーション計数を用いた。シスプラチンは原子吸光分光法を用いて測定し、トポテカンは過剰量の界面活性剤でリポソームを破壊した後に蛍光分光法（３８０ｎｍの励起及び５１８ｎｍの発光）によって測定した。
図１８（各データ点は指定時点で測定した薬剤の平均血漿中濃度＋／−ＳＤを表す）は、上述のリポソーム中で送達した場合の静脈内投与後の種々の時点でのシスプラチンの血漿中濃度がトポテカンの概ね１０倍であったことから、シスプラチン及びトポテカンの血漿中濃度がモル比１０：１に維持されたことを示している。これらの結果は、２つの別個のリポソーム中にカプセル化された２種類の薬剤の薬剤保持特性及びリポソーム排出特性について、協調的な薬剤排出速度が実現されるように協調させ得ることを示している。図１８の挿入図は、静脈内投与後に血漿中に存在するシスプラチン／トポテカンのモル比（＋／−ＳＤ）が、時間経過に伴ってほとんど変化しないことを示している。
非拮抗的な比率が確実にインビボで維持されるように、シスプラチン及びトポテカンを単一のリポソーム中に製剤化することも出来る。これは、シスプラチンの受動的封じ込めの後に、イオノフォアを介したトポテカンの装填を行うことによって実施し得る。シスプラチン粉末を１５０ｍＭ ＭｎＣｌ２溶液中に溶解することにより、シスプラチン溶液をまず調製する。シスプラチンのＭｎＣｌ２溶液への溶解性を最大限に高めるために、この溶液を６５℃に加熱する。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）から構成され、微量の３Ｈ−ＣＨＥを含む脂質薄膜をシスプラチン／ＭｎＣｌ２溶液によって水和させる。それにより生じたＭＬＶを、６５℃で、２枚の１００ｎｍフィルターに通して押し出し、合計１０回通過させる。続いて、前記製剤を室温まで冷却し溶液を２０００×ｇで遠心することによって、不溶性シスプラチンを該製剤から除去する。それにより得られたリポソーム シスプラチン及び可溶性だがカプセル化されなかったシスプラチンを含む上清を、ＳＨＥ緩衝液（３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び３０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））に対し室温で一晩透析する。
その後に、イオノフォアを介したプロトン勾配を用いて、トポテカンをリポソーム中に装填する。薬剤の取り込みは、薬剤／脂質重量比０．０８：１（ｗ/ｗ）で行わせる。二価陽イオンイオノフォアＡ２３１８７（１μｇイオノフォア／脂質μｍｏｌ）をリポソームに添加した後に、Ａ２３１８７の二重層への取り込みを促すために混合物を６０℃で１５分間インキュベートする。その後にトポテカンを添加し、薬剤の取り込みを促すために混合物を６０℃で６０分間インキュベートする。試料を３００ｍＭスクロースに対して透析することにより、カプセル化されなかったトポテカン及びＡ２３１８７を調製物から除去する。トポテカン装填の程度は、３８０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量する。シスプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定し、脂質濃度は液体シンチレーション計数によって測定する。
実施例１３
リポソーム シスプラチン及びトポテカンの有効性
別個のリポソーム中に装填されたシスプラチン及びトポテカンの有効性について、２種類の薬剤を別個のリポソーム中に製剤化し、そして、それらの製剤を実施例１１で非拮抗的であることが特定されたモル比１０：１で投与することによって調べた。リポソーム シスプラチンは、実施例１２の手順に記載通りにＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソーム中に受動的に封じ込めた。トポテカンについては、トポテカンの装填がトポテカン／脂質重量比が最終的に０．１（ｗ/ｗ）となるように行った点を除き、実施例１２の通りにＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）中に製剤化した。装填後に外部緩衝液をＨＢＳに交換した。
有効性試験は実施例２６に詳述するように行い、Ｈ４６０腫瘍を有する雌性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウス（各群当たりマウス４匹）に対し、生理食塩水（対照）、シスプラチン／トポテカンの遊離カクテル、又は、リポソーム混合物を、実施例１１で非拮抗的として特定されたモル比１０：１で静脈内に（第１３、１７、２１日に）投与した。遊離物及びリポソーム製剤の何れの投与に関しても、用量は１．６ｍｇ/ｋｇシスプラチン及び０．２５ｍｇ/ｋｇトポテカンとした。脂質用量はシスプラチン製剤については２５０ｍｇ/ｋｇであり、トポテカン製剤ではそれよりも２．５ｍｇ/ｋｇ多かった。
図１９はその結果を示している（各データ点は、指定日に測定した平均腫瘍サイズ＋／−ＳＥＭを表す）。生理食塩水対照（黒丸）及びシスプラチン／トポテカン１０：１カクテル（黒い三角）は、腫瘍体積の増加を停止させる効果がなかった。しかし、シスプラチン／トポテカン１０：１リポソーム製剤（白い三角）は、少なくとも３５日間にわたって腫瘍体積の増加を阻止した。
実施例１４
シスプラチン及びイリノテカンの相乗作用
シスプラチン及びイリノテカンのモル比１：１、１０：１、１：５及び１：１０での組み合わせについて、相乗作用、相加作用又は拮抗作用に関し、上述の方法（実施例１参照）に従って調べた。図２０Ａにまとめた結果は、モル比１０：１、１：５及び１：１０ではｆａ値の全範囲にわたって非拮抗的であるのに対し、１：１比率ではｆａ値のかなりの範囲にわたって拮抗的であったことを示している。図２０Ｂは更に、シスプラチン／イリノテカンのモル比に対して組み合わせ指数最大値をプロットすることにより概括されるように、組み合わせ効果の性質に対し比率が依存的であることを示している。
実施例１５
インビボでのシスプラチン及びイリノテカンの相乗作用の維持
６．０ｍｇ/ｍＬシスプラチンを含む２２５ｍＭ銅（７５ｍＭ ＣｕＣｌ２、１５０ｍＭ ＣｕＳＯ４、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ６．８）中に脂質薄膜を再水和させた点を除き、実施例５の記載通りに調製したＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（８０：２０ｍｏｌ％）リポソーム中に、シスプラチン及びイリノテカンを共装填した。押出処理及びカプセル化されなかった薬剤除去後のリポソーム シスプラチンの濃度はシスプラチン０．０２５モル／脂質１モルであった。得られたリポソームをＳＨＥ、ｐＨ６．８に対して一晩透析した。続いてイリノテカンを調製物に添加し、リポソームを４５℃で１．５時間インキュベートした。ＨＰＬＣによる測定では、添加したイリノテカンの６０％がリポソームに装填された。続いて、リポソームは、緩衝液を接線流によって０．９％生理食塩水に交換した。接線流の後において、当初のシスプラチン及びイリノテカンの約８０％をリポソームが保持していた。各々、原子吸光分光法及びＨＰＬＣ分析により測定したシスプラチン及びイリノテカンの分析から、最終調製物がシスプラチン／イリノテカンをモル比１：３で有することが示された。ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスに対し、２ｍｇ/ｋｇシスプラチン及び３８．６ｍｇ/ｋｇイリノテカンを静脈内投与した。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して、血漿を慎重に別のチューブに移した。イリノテカン及びシスプラチンの血漿中濃度は、各々、ＨＰＬＣ及び原子吸光分光法によって測定した。
図２１における結果（各データ点は指定時点で測定した薬剤の平均血漿中濃度＋／−ＳＤを表す）は、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧリポソーム中に共装填されたシスプラチン及びイリノテカンを含む製剤の静脈内注射後の薬剤排出速度が同程度であり、非拮抗的な薬剤モル比が投与後２４時間の経過にわたって維持され得ることを示している。
インビボでのリポソーム シスプラチン及びイリノテカンの協調的な放出も、この２種類の薬剤を別個の送達媒体中に製剤化した上で薬剤モル比１：５（シスプラチン／イリノテカン）で投与することによって達成された。
リポソーム シスプラチンは、上記の受動的な装填法に従って調製した。ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）からなる脂質薄膜を、８．５ｍｇ/ｍＬシスプラチンを含む１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液によって水和させた後に、上記のように押出処理を行った。上記のように遠心分離後の上清中リポソームを収集した後に、接線流透析によってＨＢＳに交換した。
リポソーム イリノテカンは、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５ｍｏｌ％）からなる脂質薄膜を、１５０ｍＭ ＣｕＣｌ２、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．８（ｐＨはＴＥＡで調整）からなる溶液によって水和させることによって調製した。得られたＭＬＶを６５℃で重ね合わせた２枚の孔径１００ｎｍフィルターに通して押し出し、接線流にて緩衝液をＨＢＳに交換した。押出処理を行ったリポソームに対し、イリノテカンを薬剤脂質重量比が０．１：１となるように６０℃で１分間かけて装填した。イリノテカンの装填の程度は、Triton X-100中へ溶解後に３７０ｎｍでの吸光度にて測定した；脂質濃度は液体シンチレーション計数によって測定した。
リポソーム シスプラチンは雄性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスに対し薬剤用量２．０ｍｇ/ｋｇとして投与し、リポソーム イリノテカンはマウスに対し２０ｍｇ/ｋｇで投与した。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を慎重に別のチューブに移した。イリノテカンの血漿中濃度はＨＰＬＣによって測定し、シスプラチン濃度は原子吸光分光法によって測定した。
この相乗的な比率（モル比１：５）で、これらのリポソーム製剤中にある状態で共に投与されたシスプラチン及びイリノテカンは、種々の時点でのイリノテカンの血漿中濃度（ｎｍｏｌ/ｍＬ）がシスプラチンの概ね５倍（ｎｍｏｌ/ｍＬ）であったことから証明されるように、１：５というこの比率を静脈内投与後にも維持した（図２２）。
実施例１６
リポソーム シスプラチン及びイリノテカンの有効性
別個のリポソーム中に製剤化されたリポソーム シスプラチン及びイリノテカンに対して有効性試験を行った。実施例１５に詳述した通りに、シスプラチンはＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソーム中に受動的に封じ込め、イリノテカンはＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５ｍｏｌ％）リポソーム中に装填した。実施例２６記載の方法に従い、リポソーム シスプラチン及びイリノテカンを、実施例１４で非拮抗的であることが決定されたモル比１：５にて、Ｈ４６０腫瘍を有するＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスに対して同時投与した。リポソーム シスプラチン及びイリノテカンの投与（第１４、１８及び２２日に各群当たりマウス４匹に対して）は、非拮抗的なモル比１：５にて、以下の用量で行った：１ｍｇ/ｋｇシスプラチン、１０ｍｇ/ｋｇイリノテカン及び１３０ｍｇ/ｋｇ脂質（白い四角）；２．５ｍｇ/ｋｇシスプラチン、２５ｍｇ/ｋｇイリノテカン及び１７５ｍｇ/ｋｇ脂質（白い三角）；又は、５ｍｇ/ｋｇシスプラチン、５０ｍｇ/ｋｇイリノテカン及び２５０ｍｇ/ｋｇ脂質（白い逆三角）。遊離シスプラチン／イリノテカンは、モル比１：５を反映する１ｍｇ/ｋｇシスプラチン及び１０ｍｇ/ｋｇイリノテカンの用量で、投与した（黒い四角）。
図２３（各データ点は指定日に測定した平均腫瘍サイズ＋／−ＳＥＭを表す）は、遊離薬剤カクテル及び生理食塩水を投与されたマウスとの比較においてリポソーム製剤の場合には腫瘍増殖が十分に抑制されたことを示している。
実施例１７
薬剤及び脂質の組み合わせの相乗作用
脂質二重層に組み入れられたＰＯＰＳ（黒い逆三角）、ＤＰＰＳ（黒い三角）、ＤＬＰＳ（黒丸）、ＤＳＰＳ（黒い菱形）又はＤＯＰＳ（黒い四角）といった種々の治療用脂質候補と共にビノレルビンをモル比１：１で含む組み合わせを、相加的、相乗的又は拮抗的な作用について、上述の方法（実施例１参照）を用いて検討した。
図２４における結果は、ビノレルビンと被験脂質との全ての組み合わせが、ｆａ値の相当な範囲にわたりＨ４６０細胞に対して相乗作用を示すことを、表している。特に、ビノレルビンとＤＬＰＳ、ＤＳＰＳ及びＤＯＰＳとの組み合わせは、ｆａ値の大部分で相乗作用を示し、ｆａ＝０．２〜ｆａ＝０．８の範囲で最も顕著であった。
実施例１８
リポソーム ビノレルビン及びホスファチジルセリンの薬物動態
以下の通りに、ＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％）からなるリポソームを調製し、そして、ビノレルビンを装填した。
脂質をクロロホルム中に１００ｍｇ/ｍＬの濃度で溶解した上で、適当量を混ぜ合わせた。これに対し例外的にＤＰＰＳは、ＣＨＣｌ３／メタノール／Ｈ２Ｏ／クエン酸緩衝液（２０：１０．５：１：１ ｖ/ｖ）を用い２５ｍｇ/ｍＬの濃度で溶解した。製剤化工程中の脂質追跡のため、微量の放射性脂質３Ｈ−ＣＨＥをこの時点で添加した。ごくわずかな溶媒が残るまでクロロホルムをＮ２ガス流によって除去した。残留溶媒を除去するため、得られた脂質薄膜を真空下に一晩置いた。脂質薄膜をクエン酸緩衝液（３００ｍＭ、ｐＨ ４．０）中に再水和させ、得られたＭＬＶを６５℃で２枚の孔径１００ｎｍフィルターに通して押し出し、合計１０回通過させた。
０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を用い外部緩衝液ｐＨを徐々に高めるｐＨ勾配装填法によって、これら製剤中にビノレルビンを装填した。既知量のリポソームを、対応する量のビノレルビン（薬剤／脂質重量比０．１（ｗ/ｗ））と混ぜ合わせ、６０℃で１５分間インキュベートした。ｐＨ勾配を確立するため、０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４をクエン酸緩衝液の１０倍の容積で添加した。実施例１７で非拮抗的として特定されたビノレルビン／ホスファチジルセリンのモル比が達成されるように、ビノレルビンをリポソーム中に装填した。
ビノレルビン装填リポソームの可溶化には界面活性剤ＯＧＰを用いた；薬剤濃度は２７０ｎｍでの吸光度によって測定し、脂質定量には液体シンチレーション計数を用いた。
それにより得られたビノレルビン装填リポソーム及び遊離ビノレルビンを、ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスに対し薬剤用量１０ｍｇ/ｋｇで静脈内投与した。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を慎重に別のチューブに移した。シンチレーション計数を用いて、血液を残留性３Ｈ−ＣＨＥリポソームマーカーに関し分析した。ビノレルビンの血漿中濃度はＨＰＬＣによりアッセイした。
遊離ビノレルビン投与との比較において、ビノレルビンをカプセル化したＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソームが、薬剤の血漿中濃度を大きく高めることを、図２５Ａ及び２５Ｂは示している。遊離ビノレルビンの平均曲線下面積（area under the curve：ＡＵＣ）０．１１２μｇ/ｍＬが、リポソーム中への製剤化により１２５．３μｇ/ｍＬに増加しており、平均ＡＵＣは１１２０倍の増加を示した。
実施例１９
Ｈ４６０ヒト肺癌モデルにおけるリポソーム ホスファチジルセリン及びビノレルビンの有効性
実施例１８の記載通りに、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％）リポソーム、ＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％）リポソーム、及び、ＤＡＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％）リポソームを調製し、ビノレルビンを装填した。ホスファチジルセリン及びビノレルビンはリポソーム中に非拮抗的なモル比（１：１）で存在させた。有効性試験は、実施例２６に記載した通りに、Ｈ４６０ヒト肺癌モデルを用いて行った。
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００及びＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなり且つビノレルビンをカプセル化されたリポソームを静脈内投与されたＨ４６０腫瘍保有マウス（各群当たりマウス４匹）について、図２６は示しているが、この投与により、遊離ビノレルビン及び生理食塩水の投与後に観察された腫瘍増殖速度と比較し増殖速度の低下が惹起された。腫瘍細胞の接種から１３日、１７日及び２１日後に、遊離ビノレルビンは５ｍｇ/ｋｇで投与し、そして、リポソーム ビノレルビンは薬剤５ｍｇ/ｋｇ、脂質５０ｍｇ/ｋｇの用量で投与した。
図２７（各データ点は指定日に測定した平均腫瘍サイズ＋／−ＳＥＭを表す）は、ＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＤＡＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００及びＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなり、且つ、ビノレルビンをカプセル化されたリポソームが、遊離ビノレルビン及び生理食塩水との関係において時間経過に伴う腫瘍体積増加の縮小が見られることを示している。腫瘍保有マウス（１群当たり４匹）に対して、ビノレルビンを用量５ｍｇ/ｋｇで投与し（遊離及びリポソーム）、脂質をリポソーム群に対しては用量５０ｍｇ/ｋｇで投与した。第１３、１７及び２１日に、マウスに静脈内投与を行った。
実施例２０
マウス白血病モデルにおけるリポソーム ホスファチジルセリン及びビノレルビンの有効性
リポソームを、孔径１００ｎｍフィルターと８０ｎｍフィルターを重ねたものに通して押し出した点を除き、実施例１８記載通りに、ＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％）からなるリポソームを調製し、ビノレルビンを装填した。
実施例２７の記載通りに、Ｐ３８８／ｗｔ細胞をＢＤＦ−１マウスの腹腔内に接種した。その後に、以下の何れかをＢＤＦ−１雌性マウスに腹腔内投与した：生理食塩水、遊離ビノレルビン（１０ｍｇ/ｋｇ）、及び、ビノレルビンが装填されたＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００リポソーム（１０ｍｇ/ｋｇビノレルビン及び１００ｍｇ/ｋｇ脂質）。遊離及びリポソーム ビノレルビンの腹腔内投与を、第１日目に、投与群当たり４匹のマウスに行った。
図２８に示した生存曲線は、ＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００からなるリポソーム中にカプセル化したビノレルビンの投与が、遊離ビノレルビン及び生理食塩水の投与と比較して、ＢＤＦ−１マウスの生存率の大幅な増加をもたらしたことを示している。
実施例２１
スフィンゴシンとドキソルビシンとの共製剤化
ホスファチジルセリンに加えて、他の治療用脂質をリポソーム膜に組み入れることも出来る。例えば、スフィンゴシン及びスフィンゴシン類似体はリポソーム中に製剤化することが受け入れられる脂質であり、水性内部にカプセル化した治療薬（例えば、ドキソルビシン）と共に製剤化することが出来る。このような薬学的組成物（スフィンゴシン）の調製は、以下のようにして行い得る。
スフィンゴシンの典型的なリポソーム製剤は、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／スフィンゴシン（４５：４５：１０ｍｏｌ％）から構成される。脂質薄膜を、以前の実施例に詳述した通りに調製する。その脂質薄膜をクエン酸緩衝液（３００ｍＭ、ｐＨ ４）中に再水和させ、得られたＭＬＶを６５℃で２枚の１００ｎｍフィルターに通して押し出し、合計１０回通過させる。続いて、ｐＨ勾配を成立させるためにＨＢＳ（ｐＨ ７．４）で平衡化したセファデックスＧ−５０カラム通過によるリポソーム外部緩衝液の交換からなるｐＨ勾配装填法を用い、これらの製剤中にドキソルビシンを装填する。
続いて、装填を行わせるために、リポソーム及びドキソルビシン溶液を共に６０℃でインキュベートする。種々の時点での装填程度を測定するため、１００μＬの試料を１ｍＬセファデックスＧ−５０スパンカラムにかけ、その後に遠心処理を行う。脂質の定量には液体シンチレーション計数を用い、ドキソルビシンの定量には４８０ｎｍでの吸光度を用いて、スパンカラムの溶出液の薬剤／脂質比を導き出す。薬剤のアッセイのためには、リポソームをTriton X-100中でインキュベートした後に吸光度の読み取りを行う。
実施例２２
フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）及びイリノテカン（ＣＰＴ−１１）の相乗作用
相加的、相乗的又は拮抗的な作用を計測するための上記手順を、ＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１を用い、モル比１０：１、５：１、１：１、１：５及び１：１０にて、ＨＴ−２９細胞において繰り返した。上述のようにＣＩ対ｆａ曲線を作成することにより、組み合わせ指数を各用量について決定した。影響を受けたＨＴ−２９細胞の割合に対してＣＩをプロットした図２９のデータは、相乗作用に対する濃度の影響を明白に示している。ＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１のモル比１０：１では０．７６未満のｆａ値で非拮抗的であり、モル比が１：５であれば０．６２未満のｆａ値で非拮抗的であるのに対し、比率が５：１又は１：１の場合は影響率の値の全範囲（０．２〜０．８）にわたって相乗作用が観察される。比率１：１０はｆａ値の相当な範囲（５０％超）にわたって拮抗的である。これらの結果に基づき、ＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１のモル比１：１がｆａ値の有意な範囲（細胞の１％超が影響を受ける範囲の少なくとも２０％）にわたって相乗作用を示したことから、この比率を製剤化及び有効性試験の対象として選択した。５：１及び１０：１の比率で調製した製剤も、ｆａ値の相当な範囲にわたって所定の非拮抗的な比率を示すという必要条件を満たすと考えられる。
実施例２３
インビボでのＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の相乗作用の維持
ＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１を、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０ｍｏｌ％）リポソーム中に、実施例Ａにおいて相乗的であることが特定されたモル比率１：１にて製剤化した。ＤＳＰＣ及びコレステロールをクロロホルム中に溶解し、ＤＳＰＧをクロロホルム／メタノール／水（１６／１８／１）中に溶解することによって脂質薄膜を調製した。これらの溶液を所定のモル比が得られるように混ぜ合わせ、リポソーム脂質の標識として微量の１４Ｃ−ＣＨＥを添加した。溶媒の除去後に、生じた脂質薄膜を、２５０ｍＭ ＣｕＳＯ４及び２５ｍｇ/ｍＬのＦＵＤＲ（微量の３Ｈ−ＦＵＤＲを含む）からなる溶液により７０℃で水和させた。得られたＭＬＶを、７０℃で、重ね合わせた２枚の孔径１００ｎｍフィルターに１０回通過させることにより、押し出し処理を行った。その後に、リポソームの緩衝液を接線流透析によってＳＨＥ、ｐＨ７．４に交換し、それにより、カプセル化されなかったＦＵＤＲ及びＣｕＳＯ４を除去した。
ＦＵＤＲとＣＰＴ−１１のモル比が１：１となるように、ＣＰＴ−１１をこれらのリポソームに添加した。試料を５０℃で５分間インキュベートすることにより、ＣＰＴ−１１のリポソームへの装填を促進した。装填後に、ＥＤＴＡ又はカプセル化されなかった薬剤を除去するため接線流透析により試料をＨＢＳ、ｐＨ７．４中に入れ換えた。ＣＰＴ−１１の装填程度は、ＨＰＬＣを用いて計測した。ＦＵＤＲ及び脂質の濃度は液体シンチレーションを用いて測定した。
これらの製剤を、Ｂａｌｂ/ｃ雌性マウスに尾静脈を介して静脈内注射した。リポソーム製剤の用量はＦＵＤＲ ８．３８ｍｇ/ｋｇ及びＣＰＴ１１ ２０ｍｇ/ｋｇであった。指定された時点（各時点当たりマウス３匹）で血液を心臓穿刺によって採取し、ＥＤＴＡを被覆したマイクロテイナーに入れた。試料を遠心して血漿を別のチューブに移した。血漿中の放射標識脂質及びＦＵＤＲの定量には、液体シンチレーション計数を用いた。ＣＰＴ−１１の血漿中濃度は、ＨＰＬＣを用いて定量した。
上記リポソーム中にある状態で送達した場合に、静脈内投与後の種々の時点でＦＵＤＲの血漿中濃度がＣＰＴ−１１の濃度と凡そ等しい事からＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の血漿中濃度がモル比１：１に維持されたことを、図３０は示している。各データ点は指定時点で測定した薬剤の平均血漿中濃度（薬剤ｎｍｏｌ／血漿ｍＬ）＋／−標準偏差を表す。
実施例２４
リポソーム ＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１の有効性
薬剤装填後にリポソーム外部緩衝液を０．９％ＮａＣｌに交換した点を除いて、実施例Ｂの記載通りに、ＦＵＤＲ及びイリノテカンをモル比１：１で共カプセル化したＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ（７０：２０：１０ｍｏｌ％）リポソームを調製した。
実施例２６の方法を用い、有効性試験を、側腹部に２×１０６個のＨＴ−２９細胞を皮下接種した雌性ＳＣＩＤ/ｒａｇ２マウスにおいて行った。腫瘍をそのサイズが１８０ｍｇ（０．１８ｃｍ３）に計測されるまで増殖させ、その時点（第２１日）で指定の製剤を注入した。腫瘍の増殖はノギスによる直接測定によって評価した。生理食塩水、モル比１：１の遊離薬剤カクテル、又は、ＦＵＤＲ／ＣＰＴ−１１のモル比１：１のリポソーム製剤の何れかを、マウスに対して単回投与（矢印）した。遊離物及びリポソーム製剤の投与の何れに関しても、用量は、９．２５ｍｇ/ｋｇ ＦＵＤＲ及び２５ｍｇ/ｋｇ ＣＰＴ−１１とした。リポソーム製剤試料に関する脂質用量は、脂質２７８ｍｇ/ｋｇであった。
図３１に提示した結果は、単一のリポソーム中にモル比１：１でカプセル化されたＦＵＤＲ及びＣＰＴ−１１が、遊離薬剤カクテル又は生理食塩水の何れかを注入したマウスと比較して、有意に、より良好な治療活性を実現することを示している。各データ点は平均腫瘍サイズ＋／−平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。
実施例２５
種々の３剤の組み合わせに関するＣＩの決定
トポテカン、シスプラチン、ＨＢ５−５Ａ（エデルフォシン類似体）及びスフィンゴシンを含む組み合わせの、相加的、相乗的又は拮抗的な作用について、標準的なテトラゾリウム比色ＭＴＴ細胞傷害性アッセイ法（実施例の項の細胞傷害性アッセイ法を参照）を用い検討した。以前の実施例に記載したメディアンエフェクト解析を用いて、併用効果を算出した。ＣＴとｆａとの関係を示すグラフを前の実施例の記載通りに作成し、ｆａ値０．５０、０．７５及び０．９０に対応するＣＩ値（ＥＤ５０、７５及び９０によって表される）を下表に記載した。
Figure 2006523713
ａ 組み合わせ指数（ＣＩ）は、用量-効果分析に関するChou-Talalay理論に基づく相乗作用（ＣＩ＜０．９）、又は、相加作用（ＣＩが０．９〜１．１の間）の決定のために用いられる。各値はCalcuSynソフトウエアを用いて算出される。
ｂ ＥＤ５０、ＥＤ７５、ＥＤ９０は、測定される応答の各々５０、７５又は９０％が影響を受ける薬剤の用量のことを指す。
実施例２６
皮下固形腫瘍法における腫瘍モデルの作製、細胞の調製、及び、移植
Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌細胞は、ＮＣＩのＤＣＴＣ腫瘍貯蔵所（Tumor Repository）から入手し得る。前記細胞は、継代２０回まで、組織培養下で維持される。２０回の継代後は、液体窒素中で保存していた凍結ストックからの新しい細胞を増殖させる。培養細胞が８０〜９０％コンフルエントに達した時点で、それらをハンクス平衡塩類溶液ですすぎ洗いし、付着した細胞を０．２５％トリプシン溶液によって分離する。血球計算器で細胞を算定し、濃度が２０×１０６細胞／ｍＬになるように培地で希釈する。
各マウスの下位背部の約２ｃｍ×２ｃｍの領域を、電気バリカンを用いて剃毛する。第０日に、２８ｇ針を用いて、１×１０６個の腫瘍細胞、容積５０μＬを、マウスに皮下接種する（接種１回／匹）。
腫瘍が約０．５０〜０．１００ｃｍ３の所定のサイズに達した時点で、投与の１日前又は投与日（〜第１０日から第１４日）に、全ての腫瘍を計測する。適切な腫瘍サイズを選択した後に、小さ過ぎる腫瘍と大き過ぎる腫瘍を除外し、腫瘍を無作為に分布させ（ｎ＝４）、各群の平均腫瘍体積を測定する。
マウスを、生理食塩水対照、媒体対照、陽性対照及び種々に希釈した被験物質などの対照群及び処置群からなる適切な投与群に、配分する。
投与群は以下の通りである：
Figure 2006523713
ａ ４〜７日毎の単回投与又は３回投与などの代替的な投薬計画も考慮可能。
個々のマウスの体重に基づいて、規定用量（指定のように１０μＬ/ｇ）をマウスに投与するために必要な容積の試料を、マウスに静脈内注射する。
腫瘍増殖の測定値はバーニアノギスを用いて計測し、測定は投与日から開始する。腫瘍の長さの測定（ｍｍ）は最長方向の軸から求め、幅の測定（ｍｍ）はこの軸に対して直交するようにする。長さ及び幅の測定値から、式（Ｌ×Ｗ２／２）／１０００を用いて腫瘍体積（ｃｍ３）を算出する。腫瘍測定時にマウスの体重を記録する。
有効性試験において、最終投与後１４日間にわたり、様々な日（一般には月曜、水曜及び金曜というように１日おき）に、個々のマウスの体重を記録する。
投与前及び投与期間にわたって、全動物を、生死及び罹患に関して、少なくとも１日１回観察し、必要と判断される場合は更に観察する。とりわけ、病気か健康かの徴候は、体重減少、食欲の変化、粗い毛並み、グルーミングの欠如、変化した歩調のような行動変化、傾眠、及び、全的なストレスの徴候、に基づく。重度の毒性又は癌関連疾患の徴候が見られた動物は、安楽死（ＣＯ２窒息）させ、他の毒性徴候を探すため剖検にかける。死にかけている動物は人道的事由から絶命させなければならないが、絶命の決定は動物管理技術者及び研究ディレクター／マネージャーの判断による。これらの何らかの及び全ての所見は生データとして記録され、死亡時間はその次の日として書き込まれる。
データは、表又は図の何れかの形式で以下のように示す：
１．投与開始前及びグループ分け後の各群についての、個々のマウスの腫瘍体積のプロット。
２．時間の関数としての各群の平均体重。
３．時間の関数としての各群の平均腫瘍体積。
４．図及び表を含む生データの作成、これには、腫瘍増殖 対 時間、腫瘍増殖抑制、及び、腫瘍増殖遅延が含まれる。
５．異常な又は顕著な観察所見の概要。
実施例２７
腹腔内腫瘍法における腫瘍モデルの作成、細胞の調製、及び、移植
体重別にマウスをグループ分けする。２５ｇ針を用いて、ＢＤＦ−１マウス（ｎ＝４）の腹腔内に、１×１０６個のＰ３８８細胞を容積５００μＬで、移植する（第０日）。ＡＴＣＣ癌細胞貯蔵部門（ATCC tumor repository）から入手したＰ３８８細胞は、ＢＤＦ−１マウス中で腹水として維持し、それを新たなマウスに週１回継代する。マウスを安楽死させ、２０ｇ針を用いて腹壁を介して腹水細胞を採取する。実験に用いる細胞は継代回数３〜２０回以内のものを用いる。マウス体内での２０回の継代後には、液体窒素中の凍結ストックから新しい細胞を取り出しマウスに接種する。実験用の細胞はハンクス平衡塩類溶液ですすぎ洗いし、血球計算器で算定した上で、濃度を２×１０６個／ｍＬにＨＢＳＳで希釈する。
試験群のグループ分けは、全マウスに腫瘍細胞を投与後に無作為に行う。必要なグループ分けは、固形腫瘍試験に対して行われるものと同様である（実施例２６参照）。
個々のマウスの体重に基づき、規定用量（指定されたように１０μＬ/ｇ）をマウスに投与するために必要な容積の試料を、マウスの静脈内又は腹腔内に注射する。腹腔内腫瘍の場合には、一般に、腫瘍細胞の接種から１日後に投与を開始する。
マウスの健康状態を、毎日詳細に観察する。
病的状態及び病態の進行の徴候については、実施例２６に記載した通りに詳細に観察する。マウスの体重を検査時に測定する。
マウスの絶命時には、腫瘍負荷及び／又は臓器外観の生理的に観察される変化の程度を評価するために肉眼的剖検を行う。所見は記録する。
群の体重を、有効性試験の間、最終投与後１４日間にわたって月曜から金曜まで記録する。
投与前及び投与期間にわたって、全動物を、生死及び罹患に関して、少なくとも１日１回観察し、必要と判断される場合は更に観察する。とりわけ、病気か健康かの徴候は、体重減少、食欲の変化、粗い毛並み、グルーミングの欠如、変化した歩調のような行動変化、傾眠、及び、全的なストレスの徴候、に基づく。重度の毒性又は癌関連疾患の徴候が見られた動物は、安楽死（ＣＯ２窒息）させ、他の毒性徴候を探すため剖検にかける。死にかけている動物は人道的事由から絶命させなければならないが、絶命の決定は動物管理技術者及び研究ディレクター／マネージャーの判断による。これらの何らかの及び全ての所見は生データとして記録され、死亡時間はその次の日として書き込まれる。
データは、表又は図で示すが、これには時間の関数としての各群の平均体重及び寿命の増加が含まれる。
治療薬の適当な割合（比率）を決定して製剤（処方）中に含有させる本発明の方法の概略図である。 組み合わせ（併用）及び相乗効果データを示す５つの方法を図示したものである。 組み合わせ（併用）及び相乗効果データを示す５つの方法を図示したものである。 組み合わせ（併用）及び相乗効果データを示す５つの方法を図示したものである。 組み合わせ（併用）及び相乗効果データを示す５つの方法を図示したものである。 組み合わせ（併用）及び相乗効果データを示す５つの方法を図示したものである。 影響を受けたＨＴ２９細胞（ｆａ）画分の関数としての１：１０（塗りつぶした四角）及び１：１（塗りつぶした丸）のモル比のイリノテカン：５−ＦＵについての組み合わせ指数（combination index）（ＣＩ）のグラフである。 影響を受けたＭＣＦ−７細胞（ｆａ）画分の関数としての１：１０（塗りつぶした菱形）及び１０：１（塗りつぶした四角形）のモル比のエトポシド：カルボプラチンについてのＣＩのグラフである。 影響を受けたＨ４６０細胞（ｆａ）画分の関数としての１：１０（塗りつぶした三角形）及び１：１（塗りつぶした丸）のモル比のシスプラチン：エデルホシンについてのＣＩのグラフである。 Ｈ４６０細胞における１０：１、１：１及び１：１０のモル比でのカルボプラチン：ダウノルビシンの関数としてのＣＩ最大値のグラフである。挿入図は、ＭＣＦ−７細胞における５０、７５及び９０の有効量（Effective Dose）（ＥＤ）値で１０：１及び１：１のモル比でのカルボプラチン：ダウノルビシンについてのＣＩの柱状図である。 影響を受けたＨ４６０細胞（ｆａ）画分の関数としての１：１０（塗りつぶした三角）、１：１（塗りつぶした四角形）及び１０：１（塗りつぶした丸）のモル比のカルボプラチン：ダウノルビシンについてのＣＩのグラフである。挿入図は、Ｈ４６０細胞における５０、７５及び９０のＥＤ値で１：１０、１：１及び１０：１のモル比でのカルボプラチン：ダウノルビシンについてのＣＩの柱状図である。 薬剤が非拮抗的な割合（１０：１）で単一のリポソーム（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ、８０：２０ｍｏｌ％）で製剤化されるときの静脈内投与後の時間の関数としての血漿中のカルボプラチン（中抜きの丸）及びダウノルビシン（塗りつぶした丸）濃度（ｎｍｏｌ／ｍＬ）のグラフである。 薬剤が１０：１（塗りつぶした丸）、５：１（中抜きの丸）及び１：１（塗りつぶした三角形）で単一のリポソーム（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ、８０：２０ｍｏｌ％）で製剤化されるときの三つの異なる割合で静脈内投与した後の時間の関数としてのカルボプラチン：ダウノルビシンのモル比のグラフである。 静脈内投与後の時間の関数として再プロットした図７Ａにおける１：１のカルボプラチン：ダウノルビシンのデータのグラフである。 薬剤が単一のリポソーム（ＤＳＰＣ／スフィンゴミエリン／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、９０：５：５ｍｏｌ％）で非拮抗的なモル比（１０：１）で製剤化されるときの静脈内投与後の時間の関数としての血漿中のカルボプラチン（塗りつぶした丸）及びダウノルビシン（中抜きの丸）濃度（ｎｍｏｌ／ｍＬ）のグラフである。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えたカルボプラチン及びダウノルビシンのカクテル（混合物）（塗りつぶした逆三角形）、単一のリポソームで製剤化したカルボプラチン及びダウノルビシン（中抜きの逆三角形）又は生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）の活性を比較するグラフである。カルボプラチン及びダウノルビシンは、１：１モル比でＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（８０：２０ｍｏｌ％）リポソームで製剤化した。矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えたカルボプラチン及びダウノルビシンのカクテル（塗りつぶした三角形）、単一のリポソームで製剤化したカルボプラチン及びダウノルビシン（中抜きの三角形）又は生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）の活性を比較するグラフである。カルボプラチン及びダウノルビシンは、１０：１モル比でＤＳＰＣ／ＳＭ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９０：５：５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化した。ｘ軸に沿った矢印は、投薬スケジュールを示す。 影響を受けたＨ４６０細胞（ｆａ）画分の関数としての１：１（塗りつぶした四角形）及び１０：１（塗りつぶした丸）のモル比のシスプラチン：ダウノルビシンについてのＣＩのグラフである。 Ｈ４６０細胞に対する１０：１、１：１及び１：１０モル比のシスプラチン：ダウノルビシンの関数としてのＣＩ最大値のグラフである。 薬剤が単一のリポソーム（ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５：４５ｍｏｌ％）で非拮抗的なモル比（１０：１）で製剤化されるときの静脈内投与後の時間の関数としての血漿中のシスプラチン（中抜きの丸）及びダウノルビシン（塗りつぶした丸）濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）のグラフである。 薬剤が二つの別々のリポソーム（シスプラチンについてＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５：４５ｍｏｌ％及びダウノルビシンについてＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、９５：５ｍｏｌ％）で非拮抗的なモル比（１０：１）で製剤化されるときの静脈内投与後の時間の関数としての血漿中のシスプラチン（塗りつぶした丸）及びダウノルビシン（中抜きの丸）濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）のグラフである。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えたシスプラチン及びダウノルビシンのカクテル（塗りつぶした逆三角形）、別々のリポソームで製剤化したシスプラチン及びダウノルビシン（中抜きの逆三角形）又は生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）の活性を比較するグラフである。シスプラチンは、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化し、ダウノルビシンは、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化し、非拮抗的なモル比（１０：１）で投与した。矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 薬剤を非拮抗的な１：１モル比で単一のリポソーム（ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５：４５ｍｏｌ％）で製剤化したとき静脈内投与後の各種時間での血漿中に残存するシスプラチン（塗りつぶした丸）及びダウノルビシン（中抜きの丸）の濃度（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を示すグラフである。挿入図は、投与後の各種時点でのシスプラチン：ダウノルビシンのモル比を示す。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えたシスプラチン及びダウノルビシンのカクテル（塗りつぶした三角形）、単一のリポソームで製剤化したシスプラチン及びダウノルビシン（中抜きの三角形）又は生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）の活性を比較するグラフである。薬剤は、非拮抗的なモル比（１：１）でＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化した。矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 影響を受けたＨ４６０細胞（ｆａ）画分の関数としての１：１（塗りつぶした丸）及び１０：１（中抜きの丸）のモル比のシスプラチン：トポテカンについてのＣＩのグラフである。 Ｈ４６０細胞に対するシスプラチン：トポテカンの関数としてのＣＩ最大値のグラフである。 薬剤が別々のリポソーム（シスプラチンについてＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５：４５ｍｏｌ％及びトポテカンについてＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５：４５ｍｏｌ％）で製剤化されるときに静脈内投与後の各種時間での血漿中に残存するシスプラチン（塗りつぶした丸）及びトポテカン（中抜きの丸）の濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）を示すグラフである。挿入図は、投与後の各種時点でのトポテカンに対するシスプラチンのモル比を示す。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えたシスプラチン及びトポテカンのカクテル（塗りつぶした三角形）、別々のリポソームで製剤化したシスプラチン及びトポテカン（中抜きの三角形）又は生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）の活性を比較するグラフである。シスプラチンは、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化し、トポテカンは、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化し、これらの薬剤を、非拮抗的なモル比（１０：１）で投与した。矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 影響を受けたＨ４６０細胞（ｆａ）画分の関数としての１：１（四角形）、１０：１（丸）、１：５（三角形）及び１：１０（菱形）のモル比のシスプラチン：イリノテカンについてのＣＩのグラフである。 Ｈ４６０細胞に対するシスプラチン：イリノテカンの関数としてのＣＩ最大値のグラフである。 薬剤を単一のリポソーム（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ、８０：２０ｍｏｌ％）中に同時負荷したときに静脈内投与後の各種時間での血漿中に残存するシスプラチン（塗りつぶした丸）及びイリノテカン（中抜きの丸）の濃度（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を示すグラフである。 薬剤が別々のリポソーム（シスプラチンについてＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５：４５ｍｏｌ％、イリノテカンについてＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、９５：５ｍｏｌ％）で製剤化したときに静脈内投与後の各種時間での血漿（ｎｍｏｌ／ｍＬ）中に残存するシスプラチン（塗りつぶした丸）及びイリノテカン（中抜きの丸）の濃度を示すグラフである。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えたシスプラチン及びイリノテカンのカクテル（塗りつぶした三角形）、別々にリポソームで製剤化し且つ異なる投与量で投与したシスプラチン及びイリノテカン（中抜きの記号）又は生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）の活性を比較するグラフである。ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化したシスプラチン、及びＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（９５：５ｍｏｌ％）リポソームで製剤化したイリノテカンを、非拮抗的なモル比（１：５）で投与した。矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 １：１のビノレルビン：ＰＳのモル比で作用したＨ４６０細胞（ｆａ）画分の関数としてのＰＯＰＳ（逆三角形）、ＤＰＰＳ（上向き三角形）、ＤＬＰＳ（丸）又はＤＯＰＳ（四角形）と組み合わせたビノレルビンについてのＣＩのグラフである。 ビノレルビン単独（塗りつぶした丸）又は１：１のビノレルビン：ＰＳのモル比でＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％リポソームでカプセル化したビノレルビン（中抜きの丸）のＳＣＩＤ／ｒａｇ２マウスへの静脈内投与後の時間の関数としての血漿中のビノレルビン濃度のグラフである。 図２５Ａのデータを用いた、ＳＣＩＤ／ｒａｇ２マウスへの静脈投与後のビノレルビン単独（黒い棒）又はＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％でカプセル化したビノレルビン（灰色の棒）についての血漿濃度の曲線下面積（area under the curve）（ＡＵＣ）を示す柱状図である。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えたビノレルビン単独（中抜きの丸）、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％リポソームでカプセル化したビノレルビン（塗りつぶした逆三角形）、ＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％リポソームでカプセル化したビノレルビン（中抜きの三角形）又は生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）の活性を比較するグラフである。ビノレルビン及びホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）は、非拮抗的なモル比（１：１）で製剤化した。矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 ヒトＨ４６０非小細胞肺腫瘍を有するマウスに与えた生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）；ビノレルビン単独（中抜きの丸）；ＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０（塗りつぶした逆三角形）、ＤＡＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％（中抜きの三角形）、及びＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％（塗りつぶした三角形）リポソームでカプセル化したビノレルビンの効果を示す。ビノレルビン及びホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ又はＤＳＰＳ）は、非拮抗的なモル比（１：１）で製剤化した。矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 生理食塩水コントロール（中抜きの三角形）；ビノレルビン単独（塗りつぶした丸）；及びＳＭ／Ｃｈｏｌ／ＤＰＰＳ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、３５：４５：１０：１０ｍｏｌ％リポソームでカプセル化したビノレルビン（塗りつぶした逆三角形）のＰ３８８マウス白血病を有しているマウスの生存百分率（percent survival）への効果を示す。ビノレルビン及びホスファチジルセリンは、非拮抗的なモル比（１：１）で製剤化した。ｘ軸に沿った矢印は、一回投与量を投与した日を示す。 各種の割合：１０：１（塗りつぶした四角形）；５：１（塗りつぶした丸）；１：１（塗りつぶした三角形）；１：５（塗りつぶした逆三角形）；及び１：１０（中抜きの丸）でのＦＵＤＲ：ＣＰＴ−１１の併用によって作用したＨＴ−２９画分の関数としてプロットしたＣＩを示す。 静脈内投与後の時間の関数としてのＦＵＤＲ（塗りつぶした丸）及びＣＰＴ−１１（中抜きの丸）の血漿濃度レベルのグラフである。 生理食塩水コントロール（塗りつぶした丸）、ＣＰＴ−１１／ＦＵＤＲのカクテル（中抜きの丸）及びＣＰＴ−１１／ＦＵＤＲ（塗りつぶした逆三角形）のリポソーム製剤の注入についての腫瘍細胞接種後の腫瘍容積対時間のグラフである。

Claims (24)

  1. 被験者を治療するためのキットであって、当該キットは、
    第一の容器内に少なくとも１つの第一の治療薬と安定的に結合した送達媒体を含む組成物と；
    第二の容器内に少なくとも１つの第二の治療薬と安定的に結合した送達媒体を含む第二の組成物と；を含み、
    前記第一及び第二の組成物中の送達媒体は、薬物動態学的な挙動に関して協調的であり；そして
    前記キットは、前記第一及び第二の組成物が非拮抗的な割合で投与されるための説明書を更に含むか、及び／又は前記容器内の前記第一及び第二の組成物の量が非拮抗的な前記第一及び第二の組成物の割合に比例しているか、及び／又は前記容器が、前記第一及び第二の組成物が非拮抗的な割合となる量を分注するために較正されていることを特徴とするキット。
  2. 前記容器がシリンジである請求項１に記載のキット。
  3. 前記治療薬が抗悪性腫瘍薬である請求項１又は２に記載のキット。
  4. 前記非拮抗的効果は、細胞障害性のためのインビトロアッセイにおいて＞１％の関連細胞が影響を受ける（ｆａ＞０．０１）濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されることを特徴とする請求項１〜３の何れか記載のキット。
  5. 前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて１０〜９０％の細胞が影響を受ける（ｆａ＝０．１〜０．９）濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されることを特徴とする請求項４に記載のキット。
  6. 前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて２０〜８０％の細胞が影響を受ける（ｆａ＝０．２〜０．８）濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されることを特徴とする請求項５に記載のキット。
  7. 前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて２０〜８０％の細胞が影響を受ける濃度範囲の少なくとも２０％にわたって示されることを特徴とする請求項６に記載のキット。
  8. 前記送達媒体は、４．５〜５００ｎｍの間の平均直径を有することを特徴とする請求項１〜７何れか記載のキット。
  9. 前記送達媒体は、２５０ｎｍより小さい平均直径を有することを特徴とする請求項８に記載のキット。
  10. 前記送達媒体は、リポソーム、及び／又は脂質ミセル、及び／又はブロックコポリマーミセル、及び／又は微粒子、及び／又はナノ粒子（超微粒子）、及び／又はポリマー脂質ハイブリッドシステム、及び／又は誘導体化一本鎖ポリマーを含むことを特徴とする請求項１〜９何れか記載のキット。
  11. 前記薬剤の少なくとも１つが、ＤＮＡ損傷薬剤、ＤＮＡ修復阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、細胞チェックポイント阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、細胞障害性薬剤、アポトーシス誘導剤、代謝拮抗剤、細胞周期調節阻害剤、治療用脂質、テロメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤、ミトコンドリア毒、シグナル伝達阻害剤、及び免疫剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１０何れか記載のキット。
  12. 前記第一の薬剤が細胞障害性薬剤であり、前記第二の薬剤が細胞周期阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がＤＮＡ障害性薬剤であり、前記第二の薬剤がＤＮＡ修復阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、前記第二の薬剤がＳ／Ｇ２又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がＧ１／Ｓチェックポイント阻害剤又はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤であり、前記第二の薬剤がＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤が受容体キナーゼ阻害剤であり、前記第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がアポトーシス誘導剤であり、前記第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がアポトーシス誘導剤であり、前記第二の薬剤が細胞周期調節剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がテロメラーゼ阻害剤であり、前記第二の薬剤が細胞周期調節阻害剤であるか、又は
    前記第一及び第二の薬剤が代謝拮抗剤であるか、又は
    前記第一及び第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤が治療用脂質であり、前記第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、前記第二の薬剤がＤＮＡ修復阻害剤であるか、又は
    前記アポトーシス誘導剤がセリン含有脂質であることを特徴とする請求項１〜１０何れか記載のキット。
  13. 前記第一の薬剤がイリノテカンであり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がイダルビシンであり、前記第二の薬剤がＡｒａＣ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がオキサリプラチンであり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がイリノテカンであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がゲムシタビンであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がメトトレキセートであり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がパクリタキセルであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がエトポシドであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がドセタキセル若しくはパクリタキセルであり、前記第二の薬剤がドキソルビシンであるか、又は
    前記第一の薬剤がドキソルビシンであり、前記第二の薬剤がビノレルビンであるか、又は
    前記第一の薬剤がカルボプラチンであり、前記第二の薬剤がビノレルビンであるか、又は
    前記第一の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであり、前記第二の薬剤がゲムシタビンであることを特徴とする請求項１〜１０何れか記載のキット。
  14. 被験者の疾病状態を治療する方法であって、該方法はそのような治療を必要とする被験者に、治療有効量の少なくとも１つの第一の治療薬と安定に相互作用した送達媒体を含む第一の組成物と、少なくとも１つの第二の治療薬と安定に相互作用した送達媒体を含む第二の組成物とを投与することを含み、
    前記第一及び第二の組成物中の送達媒体は薬物動態学に関して協調し、
    前記投与は第一の治療薬が第二の治療薬に対して拮抗的でない割合でなされることを特徴とする方法。
  15. 前記非拮抗的効果は、細胞障害性又は細胞分裂停止のためのインビトロアッセイにおいて１％〜９９％の細胞が影響を受ける（ｆａ＝０．０１〜０．９９）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 前記非拮抗的効果は、細胞障害性又は細胞分裂停止のためのインビトロアッセイにおいて１０％〜９０％の細胞が影響を受ける（ｆａ＝０．１〜０．９）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 前記非拮抗的効果は、細胞障害性又は細胞分裂停止のためのインビトロアッセイにおいて２０％〜８０％の細胞が影響を受ける（ｆａ＝０．２〜０．８）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 前記非拮抗的効果は、細胞障害性又は細胞分裂停止のためのインビトロアッセイにおいて２０％〜８０％の細胞が影響を受けるような濃度範囲の少なくとも２０％にわたって示されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  19. 前記送達媒体は、４．５〜５００ｎｍの間の平均直径を有することを特徴とする請求項１４〜１８何れか記載の方法。
  20. 前記媒体は、２５０ｎｍより小さい平均直径を有することを特徴とする請求項１４〜１８何れか記載の方法。
  21. 前記送達媒体は、リポソーム、及び／又は脂質ミセル、及び／又はブロックコポリマーミセル、及び／又は微粒子、及び／又はナノ粒子（超微粒子）、及び／又はポリマー脂質ハイブリッドシステム、及び／又は誘導体化一本鎖ポリマーを含むことを特徴とする請求項１４〜１８何れか記載の方法。
  22. 前記薬剤の少なくとも１つが、ＤＮＡ損傷薬剤、ＤＮＡ修復阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、細胞チェックポイント阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、細胞障害性薬剤、アポトーシス誘導剤、代謝拮抗剤、細胞周期調節阻害剤、治療用脂質、テロメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤、ミトコンドリア毒、シグナル伝達阻害剤、及び免疫剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４〜２１何れか記載の方法。
  23. 前記第一の薬剤が細胞障害性薬剤であり、前記第二の薬剤が細胞周期阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がＤＮＡ障害性薬剤であり、前記第二の薬剤がＤＮＡ修復阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、前記第二の薬剤がＳ／Ｇ２又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がＧ１／Ｓチェックポイント阻害剤又はサイクリン依存性キナーゼ阻害剤であり、前記第二の薬剤がＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤であるか、又は
    前記第一の薬剤が受容体キナーゼ阻害剤であり、前記第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がアポトーシス誘導剤であり、前記第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がアポトーシス誘導剤であり、前記第二の薬剤が細胞周期調節剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がテロメラーゼ阻害剤であり、前記第二の薬剤が細胞周期調節阻害剤であるか、又は
    前記第一及び第二の薬剤が代謝拮抗剤であるか、又は
    前記第一及び第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤が治療用脂質であり、前記第二の薬剤が細胞障害性薬剤であるか、又は
    前記第一の薬剤がトポイソメラーゼＩ阻害剤であり、前記第二の薬剤がＤＮＡ修復阻害剤であるか、又は
    前記アポトーシス誘導剤がセリン含有脂質であることを特徴とする請求項１４〜２１何れか記載の方法。
  24. 前記第一の薬剤がイリノテカンであり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がイダルビシンであり、前記第二の薬剤がＡｒａＣ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がオキサリプラチンであり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がイリノテカンであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がゲムシタビンであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がメトトレキセートであり、前記第二の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであるか、又は
    前記第一の薬剤がパクリタキセルであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がエトポシドであり、前記第二の薬剤がシスプラチン（若しくはカルボプラチン）であるか、又は
    前記第一の薬剤がドセタキセル若しくはパクリタキセルであり、前記第二の薬剤がドキソルビシンであるか、又は
    前記第一の薬剤がドキソルビシンであり、前記第二の薬剤がビノレルビンであるか、又は
    前記第一の薬剤がカルボプラチンであり、前記第二の薬剤がビノレルビンであるか、又は
    前記第一の薬剤が５−ＦＵ若しくはＦＵＤＲであり、前記第二の薬剤がゲムシタビンであることを特徴とする請求項１４〜２１何れか記載の方法。
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