DE19605024A1

DE19605024A1 - Neue selektive Taxane, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Verwendung

Info

Publication number: DE19605024A1
Application number: DE19605024A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dr Klar; Hermann Dr Graf; Guenter Dr Neef
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1996-01-31
Publication date: 1997-08-07
Also published as: PL186796B1; HUP9901027A3; RU2163599C2; CZ292504B6; SK101198A3; KR19990082151A; WO1997028156A1; EP0896577A1; DE69719502T2; AU1598497A; PT896577E; CN1210535A; IL124951A; DE69719502D1; EP0896577B1; ATE233757T1; HUP9901027A2; CN1073108C; US6162920A; DK0896577T3

Description

Die Erfindung betrifft neue pharmakologisch wirksame Verbindungen, welche die Fähigkeit haben, die Tubulin-Polymerisation bzw. Tubulin-Depolymerisation zu beeinflussen.

Eine Reihe natürlicher Mitosegifte werden als Antitumormittel eingesetzt bzw. befinden sich in der klinischen Prüfung. Es existieren verschiedene Klassen dieser Mitosegifte, die ihre zytotoxische Wirkung entweder durch Inhibition der Polymerisation von Mikrotubuli im Spindelapparat entfalten (z. B. Vinka-Alkaloide, Colchicin) oder dies durch eine GTP-unabhängige Steigerung der Polymerisation des Tubulins und Verhinderung der Depolymerisation von Mikrotubuli erreichen (z. B. Taxol, Taxotere). Mitosegifte haben aufgrund bisher unverstandener physikochemischer Eigenschaften und durch die Besonderheiten neoplastischer Zellen eine gewisse Selektivität für Tumorzellen, es besteht jedoch auch eine nicht unerhebliche Zytotoxizität gegenüber nicht transformierten Zellen.

Die Suche nach selektiveren und einfacher herzustellenden Verbindungen die - wie die Stoffklasse der Taxane - in der Lage sind, die Depolymerisation von Microtubuli zu inhibieren, hatte überraschenderweise zur Entdeckung von Borneolestern geführt, wie sie in P 44 16 374.6 und 195 13 040.5 beschrieben sind. Strukturelle Modifikationen legten in dieser Verbindungsklasse ein beträchtliches Optimierungspotential hinsichtlich der Wirkung auf Microtubuli offen.

Herausragende Ergebnisse wurden u. a. erzielt durch formale Veresterung dieser Borneole mit einer Säure vom Typ Sk-H. Mit der Synthese der hier beschriebenen Taxolderivate, in denen die Isoserinkette des Taxols durch Sk ersetzt wurde, sollte untersucht werden, ob auch in dieser Stoffklasse eine verbesserte Stabilisierung von Microtubuli verglichen mit Taxol möglich ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I, verglichen mit Taxol, ein vorteilhaft verändertes Wirkprofil besitzen. Neben einer deutlich verbesserten Stabilisierung von Microtubuli zeigen die Verbindungen der Formel I eine zusätzliche Inhibierung der Tubulinpolymerisation. Die neuen Taxane sind gekennzeichnet durch die allgemeine Formel I

worin

R¹ Wasserstoff, C₁-C₁₀-Acyl,
R² α-OH oder β-OH,
R³ C₁-C₁₀-Alkyl, durch X substituiertes Phenyl, C₁-C₁₀-Alkoxy
X Wasserstoff, Halogen, -N₃, -CN

sein kann und freie Hydroxylgruppen in I durch Veretherung oder Veresterung weiter funktionell abgewandelt sein können, sowie die α-, β- oder γ-Cyclodextrinclathrate, sowie die mit Liposomen verkapselten Verbindungen der allgemeinen Formel I bedeuten.

Als Alkylgruppe R³ sind gerad- oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit 1-10 Kohlenstoffatomen zu betrachten, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Heptyl, Hexyl, Decyl. Bevorzugt sind solche Alkylgruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen.

Die in R¹ bzw. R³ der allgemeinen Formel I enthaltenen Acyl- bzw. Alkoxygruppen sollen 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wobei Formyl, Acetyl, Propionyl- und Isopropionylgruppen bzw. Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy- und t- Butyloxygruppen bevorzugt sind.

Halogen in der Definition für X bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Jod.

Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von Borneolderivaten der Formel I, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Alkohol der allgemeinen Formel II

in dem R¹ und R² die oben genannten Bedeutungen haben und in II enthaltene Hydroxylgruppen gegebenenfalls geschützt sind, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IIIa, IIIb oder IIIc,

in denen R³ die oben genannte Bedeutung hat und X′ Hydroxyl, O-Alkyl und Halogen sein kann und worin freie Hydroxylgruppen durch Veretherung oder Veresterung geschützt sind, zu Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen freie Hydroxylgruppen durch Veretherung oder Veresterung weiter funktionell abgewandelt werden können, umsetzt.

Zur Veresterung der Alkoholfunktion in II wird mit einer Base wie z. B. Metallhydriden (z. B. Natriumhydrid), Alkalialkoholaten (z. B. Natriummethanolat, Kalium-tert.- butanolat), Alkalihexamethyldisilazan (z. B. Natriumhexamethyldisilazan), 1,5- Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en (DBN), 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU), Triethylamin, 4-(dimethylamino)pyridin (DMAP), 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO) deprotoniert und mit Carbonsäurederivaten der allgemeinen Formel III in einem inerten Solvens wie z. B. Dichlormethan, Diethylether, Tetrahydrofuran bei -70°C bis +50°C umgesetzt. Bevorzugt wird die Umsetzung mit Natriumhydrid als Base, einem cyclischen Säureamid als Carbonsäurederivat, Tetrahydrofuran als Solvens bei Temperaturen von -10°C bis +25°C.

Freie Hydroxylgruppen in I können nach den, dem Fachmann bekannten Methoden beispielsweise durch Veretherung oder Veresterung weiter funktionell abgewandelt werden. Beispielsweise lassen sich freie Hydroxylgruppen in Pyridiniumsalze mit physiologisch verträglichen Säuren, in Phosphate bzw. deren Salze mit physiologisch verträglichen Basen oder in deren Ester, in Sulfate bzw. deren Salze mit physiologisch verträglichen Basen oder in deren Ester oder in Ester und Ether mit wasserlöslichen Polymeren überführen. Ebenfalls lassen sich Ether und Ester von Verbindungen, die ihrerseits in der Lage sind, tumorinhibierende Wirkung zu entfalten, herstellen.

Biologische Wirkungen und Anwendungsbereiche der neuen Taxolderivate:

Die neuen Verbindungen der Formel I sind wertvolle Pharmaka. Sie interagieren mit Tubulin, indem sie die Polymerisation von Tubulin hemmen und gebildete Microtubuli stabilisieren und sind somit in der Lage, die Zellteilung phasenspezifisch zu beeinflussen. Dies betrifft vor allem schnell wachsende, neoplastische Zellen, deren Wachstum durch interzelluläre Regelmechanismen weitgehend unbeeinflußt ist. Wirkstoffe dieser Art sind prinzipiell geeignet zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen die Beeinflussung der Zellteilung therapeutisch indiziert sein kann.

Exemplarisch genannt seien hier die Behandlung maligner Tumoren, der Malaria, die Therapie von Erkrankungen welche durch gram-negative Bakterien verursacht sind, sowie die Behandlung von Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems, die auf exzitotoxischen Mechanismen beruhen wie z. B. die Therapie akuter neurodegenerativer Erscheinungen, wie sie beispielsweise durch Schlaganfall oder traumatische Hirnverletzungen entstehen, die Therapie chronischer neurodegenerativer Erscheinungen einschließlich des Morbus Alzheimer sowie die Therapie der amyothrophen Lateralsklerose.

Als Anwendungsbereich für maligne Tumoren seien beispielsweise genannt die Therapie von Ovarial-, Magen-, Colon-, Adeno-, Brust-, Lungen-, Kopf- und Nacken- Karzinomen, dem malignen Melanom, der akuten lymphozytären und myelocytären Leukämie.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können generell alleine oder zur Erzielung additiver oder synergistischer Wirkungen in Kombination mit weiteren in den jeweiligen Therapiegebieten anwendbaren Prinzipien und Substanzklassen verwendet werden.

Am Beispiel der Tumortherapie seien genannt die Kombination mit

○ Platinkomplexen wie z. B. Cisplatin, Carboplatin,
○ interkalierenden Substanzen z. B. aus der Klasse der Anthracycline wie z. B. Doxorubicin oder aus der Klasse der Antrapyrazole wie z. B. CI-941,
○ mit Tubulin interagierenden Substanzen z. B. aus der Klasse der Vinka-Alkaloide wie z. B. Vincristin, Vinblastin oder aus der neuen Klasse der in P 44 16 374.6 und 195 13 040.5 beschriebenen Borneolester oder aus der Klasse der Makrolide wie z. B. Rhizoxin oder andere Verbindungen wie z. B. Colchicin, Combretastatin A-4,
○ DNA Topoisomeraseinhibitoren wie z. B. Camptothecin, Etoposid, Topotecan, Teniposid,
○ Folat- oder Pyrimidin-Antimetaboliten wie z. B. Lometrexol, Gemcitubin,
○ DNA alkylierenden Verbindungen wie z. B. Adozelesin, Dystamycin A,
○ Inhibitoren von Wachstumsfaktoren (z. B. von PDGF, EGF, TGFβ, EGF) wie z. B. Somatostatin, Suramin, Bombesin-Antagonisten,
○ Inhibitoren der Protein Tyrosin Kinase oder der Protein Kinasen A oder C wie z. B. Erbstatin, Genistein, Staurosporin, Ilmofosin, 8-Cl-cAMP,
○ Antihormonen aus der Klasse der Antigestagene wie z. B. Mifepriston, Onapriston oder aus der Klasse der Antiöstrogene wie z. B. Tamoxifen oder aus der Klasse der Antiandrogene wie z. B. Cyproteronacetat,
○ Metastasen inhibierenden Verbindungen z. B. aus der Klasse der Eicosanoide wie z. B. PGI₂, PGE₁, 6-Oxo-PGE₁ sowie deren stabile Derivate (z. B. Iloprost, Cicaprost, Beraprost),
○ Inhibitoren des transmembranären Ca²⁺-Influx wie z. B. Verapamil, Galopamil, Flunarizin, Diltiazem, Nifedipin, Nimodipin,
○ Neuroleptika wie z. B. Chlorpromazin, Trifuoperazin, Thioridazin, Perphenazin,
○ Lokalanästhetika wie z. B. Carbanilat-Ca7, Cinchocain, Carbanilat-Ca3, Articain, Carbanilat, Lidocain.
○ die Angiogenese inhibierende Substanzen wie z. B. anti-VEGF-Antikörpern, Endostatin B, Interferon α, AGM 1470,
○ Inhibitoren der Zellproliferation bei Psoriasis, Kaposisarcom, Neuroblastom.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel auf Basis der pharmazeutisch verträglichen, d. h. in den verwendeten Dosen nicht toxischen Verbindungen der allgemeinen Formel I, gegebenenfalls zusammen mit den üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach an sich bekannten Methoden der Galenik zu pharmazeutischen Präparaten für die enterale, percutane, parenterale oder lokale Applikation verarbeitet werden. Sie können in Form von Tabletten, Dragees, Gelkapseln, Granulaten, Suppositorien, Implantaten, injizierbaren sterilen wäßrigen oder öligen Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, Salben, Cremes und Gelen verabreicht werden.

Der oder die Wirkstoffe können dabei mit den in der Galenik üblichen Hilfsstoffen wie z. B. Gummiarabikum, Talk, Stärke, Mannit, Methylcellulose, Laktose, Tensiden wie Tweens oder Myrj, Magnesiumstearat, wäßrigen oder nicht wäßrigen Trägern, Paraffinderivaten, Netz-, Dispergier-, Emulgier-, Konservierungsmitteln und Aromastoffen zur Geschmackskorrektur (z. B. etherischen Ölen) gemischt werden.

Die Erfindung betrifft somit auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff zumindest eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten. Eine Dosiseinheit enthält etwa 0,1-100 mg Wirkstoff(e). Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen liegt beim Menschen bei etwa 0,1-1000 mg pro Tag.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1 3′-Desphenyl-3′-(4-pyridyl)-3′-N-debenzoyl-3′-N-methoxycarbonyl-taxol-

Die Lösung von 3,1 mg (2,9 µmol) der nach Beispiel 1a dargestellten Verbindung in 0,5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran versetzt man unter einer Atmosphäre aus trockenem Argon bei 3°C mit 8,6 µl einer 1M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran und rührt 30 Minuten. Man gießt in eine gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung, extrahiert mit Dichlormethan, engt den organischen Extrakt ein und reinigt den Rückstand durch Chromatographie an einer halben analytischen Dünnschichtplatte. Als Laufmittel dient Ethylacetat, als Elutionsmittel ein Gemisch aus Dichlormethan und Methanol. Isoliert werden 0,4 mg (0,5 µmol, 17%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (CDCl₃): δ=1,16 (3H), 1,25 (3H), 1,70 (3H), 1,75 (1H), 1,84 (3H), 1,90 (1H), 2,26 (3H), 2,25-2,38 (2H), 2,38 (3H), 2,48 (1H), 2,56 (1H), 3,62 (3H), 3,81 (1H), 4,19 (1H), 4,31 (1H), 4,40 (1H), 4,71 (1H) 4,95 (1H), 5,37 (1H), 5,66 (1H), 5,69 (1H), 6,28 (1H), 6,31 (1H), 7,40 (2H), 7,51 (2H), 7,61 (1H), 8,11 (2H), 8,66 (2H) ppm.

Beispiel 1a 2′-Triisopropylsilyl-3′-desphenyl-3′-(4-pyridyl)-3′-N-debenzoyl-3′-N--methoxycarbonyl-7-triethylsilyl-taxol

Die Lösung von 4,2 mg (6,0 µmol) und 11,4 mg der nach Beispiel 1b und 1c dargestellten Verbindungen in 0,1 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran versetzt man unter einer Atmosphäre aus trockenem Argon bei 3°C mit 12 mg einer ca. 60%igen Natriumhydrid-Dispersion, erwärmt auf 30°C und rührt 30 Minuten. Man kühlt erneut auf 3°C, versetzt mit einer 30% wäßrigen Essigsäure und extrahiert mehrfach mit Diethylether. Die vereinigten organischen Extrakte wäscht man mit einer gesättigten Natriumchloridlösung und trocknet über Magnesiumsulfat. Nach Filtration und Lösungsmittelabzug reinigt man den Rückstand durch Chromatographie an zwei analytischen Dünnschichtplatten. Als Laufmittel dient ein Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat, als Elutionsmittel ein Gemisch aus Dichlormethan und Methanol. Isoliert werden 3,7 mg (3,4 µmol, 57%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (CDCl₃): δ=0,60 (6H), 0,80-1,02 (30H), 1,25 (6H), 1,70 (3H), 1,91 (1H), 2,03 (3H), 2,14 (1H), 2,20 (3H), 2,36 (1H), 2,49 (3H), 2,53 (1H), 3,54 (3H), 3,84 (1H), 4,18 (1H), 4,30 (1H), 4,49 (1H), 4,85 (1H), 4,93 (1H), 5,30 (1H), 5,60 (1H), 5,70 (1H), 6,32 (1H), 6,47 (1H), 7,28 (2H), 7,49 (2H), 7,59 (1H), 8,13 (2H), 8,64 (2H) ppm.

Beispiel 1b 7-Triethylsilyl-baccatin III

Die Lösung von 3,7 mg (6,3 µmol) chromatographisch gereinigtes Baccatin III (Calbiochem Corp.) in 0,3 ml wasserfreiem Dimethylformamid versetzt man unter einer Atmosphäre aus trockenem Argon bei 3°C mit 21 µl Triethylchlorsilan, 10,3 mg Imidazol und rührt eine Stunde. Man gießt in eine gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung, extrahiert mehrfach mit Diethylether, wäscht mit einer gesättigten Natriumchloridlösung und engt die vereinigten organischen Extrakte ein. Den nach Filtration und Lösungsmittelabzug erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an einer halben analytischen Dünnschichtplatte. Als Laufmittel dient ein Gemisch aus n-Hexan und Ethylacetat, als Elutionsmittel ein Gemisch aus Dichlormethan und Methanol. Isoliert werden 3,0 mg (5,6 µmol, 88%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (CDCl₃): δ=0,59 (6H), 0,92 (9H), 1,06 (3H), 1,20 (3H), 1,62 (1H), 1,69 (3H), 1,88 (1H), 2,04 (1H), 2,19 (6H), 2,28 (2H), 2,29 (3H), 2,53 (1H), 3,88 (1H), 4,14 (1H), 4,31 (1H), 4,50 (1H), 4,83 (1H), 4,98 (1H), 5,63 (1H), 6,47 (1H), 7,49 (2H), 7,61 (1H), 8,11 (2H) ppm.

Beispiel 1c (3R,4S)-1-(Methoxycarbonyl)-3-triisopropylsilyloxy-4-(4-pyridyl)-2-a-zetidinon

Die Lösung von 250 mg (0,78 mmol) der nach Beispiel 1d dargestellten Verbindung in 10 ml wasserfreiem Dichlormethan versetzt man bei 3°C unter einer Atmosphäre aus trockenem Argon mit 573 mg 4-Dimethylaminopyridin, 193 µl Chlorameisensäuremethylester, läßt auf 23°C erwärmen und rührt noch 16 Stunden. Man gießt in eine gesättigte Ammoniumchloridlösung, extrahiert mehrfach mit Diethylether, wäscht mit einer gesättigten Natriumchloridlösung und engt die vereinigten organischen Extrakte ein. Den nach Filtration und Lösungsmittelabzug erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an ca. 150 ml feinem Kieselgel mit einem Laufmittelgemisch aus n-Hexan und Ethylacetat. Isoliert werden 251 mg (0,66 mmol, 85%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (CDCl₃): δ=0,82-1,07 (21H), 3,82 (3H), 5,11 (1H), 5,26 (1H), 7,23 (2H), 8,61 (2H) ppm.

Beispiel 1d (3R,4S)-3-Triisopropylsilyloxy-4-(4-pyridyl)-2-azetidinon

Die Lösung von 17,2 g (40,3 mmol) der nach Beispiel 1e dargestellten Verbindung in 384 ml Acetonitril versetzt man bei 3°C unter einer Atmosphäre aus Argon mit der Lösung von 67,3 g Cerammoniumnitrat in 700 ml Wasser und rührt 30 Minuten. Man gießt in eine gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung, extrahiert mehrfach mit Ethylacetat, wäscht die vereinigten organischen Extrakte mit einer 1%igen Natronlauge und trocknet über Magnesiumsulfat. Den nach Filtration und Lösungsmittelabzug erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an ca. 800 ml feinem Kieselgel mit einem Laufmittelgemisch aus n-Hexan und Ethylacetat. Isoliert werden 7,89 g (24,6 mmol, 61%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (CDCl₃): δ=0,78-1,07 (21H), 4,81 (1H), 5,23 (1H), 6,39 (1H), 7,28 (2H), 8,59 (2H) ppm.

Beispiel 1e (3R,4S)-1-(4-Methoxyphenyl)-3-triisopropylsilyloxy-4-(4-pyridyl)-2-a-zetidinon

Die Lösung von 12,6 ml frisch destilliertem Diisopropylamin in 70 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran kühlt man unter einer Atmosphäre aus trockenem Argon auf -30°C, versetzt mit 37,6 ml einer 2,4 M Lösung von n-Buthylliithium in n-Hexan und läßt auf 0°C erwärmen. Nach 30 Minuten kühlt man auf -78°C, tropft die Lösung von 22,1 g (56,6 mmol) (1R,2S)-2-Phenyl-1-Cyclohexyl-triisopropylsilyloxyacetat, das man in Analogie zu dem in Tetrahedron Vol. 48, No. 34, S. 6985-7012, 1992 beschriebenen Verfahren hergestellt hat, in 70 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran zu und rührt 3 Stunden. Anschließend versetzt man mit der Lösung von 15,6 g (73,5 mmol) des nach Beispiel 1f dargestellten Aldimins in 150 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran und läßt innerhalb 16 Stunden auf 23°C erwärmen. Man gießt in eine gesättigte Ammoniumchloridlösung, extrahiert mehrfach mit Ethylacetat, wäscht mit einer gesättigten Natriumchloridlösung und engt die vereinigten organischen Extrakte ein. Den nach Filtration und Lösungsmittelabzug erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an ca. 1,8 l feinem Kieselgel mit einem Laufmittelgemisch aus n-Hexan und Ethylacetat. Isoliert werden 17,2 g (40,3 mmol, 71%) der Titelverbindung.
6,80 (2H), 7,19-7,30 (4H), 8,60 (2H) ppm.

Beispiel 1f N-(4-Methoxyphenyl)-(4-pyridyl)aldimin

Die Lösung von 10 g (81,1 mmol) 4-Anisidin in 120 ml wasserfreiem Dichlormethan versetzt man unter einer Atmosphäre aus trockenem Argon mit 7,8 ml Pyridin-4-aldehyd, 8,4 g Magnesiumsulfat und rührt 4 Stunden bei 23°C. Den nach Filtration und Lösungsmittelabzug erhaltenen Rückstand kristallisiert man aus n-Hexan um. Isoliert werden 15,9 g (74,9 mmol, 92%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (CDCl₃): δ=3,83 (3H), 6,95 (2H), 7,29 (2H), 7,73 (2H), 8,47 (1H), 8,73 (2H) ppm.

Beispiel 2 3′-Desphenyl-3′-(4-pyridyl)-3′-N-debenzoyl-3′-N-methoxycarbonyl-7-ep-i-taxol (A) und 3′-Desphenyl-3′-(4-pyridyl)-2,3′-N-bisdebenzoyl-3′-N-methoxycarbonyl--taxol (B)

Die Lösung von 15 mg (13,9 µmol) der nach Beispiel 1a dargestellten Verbindung in 0,5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran versetzt man unter einer Atmosphäre aus trockenem Argon bei 3°C mit 42 µl einer 1M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran, rührt 30 Minuten bei 3°C, läßt auf 23°C erwärmen und weitere 30 Minuten rühren. Man gießt in eine gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung, extrahiert mit Dichlormethan, engt den organischen Extrakt ein und reinigt den Rückstand durch Chromatographie an zwei analytischen Dünnschichtplatten. Als Laufmittel dient ein Gemisch aus Ethylacetat und Methanol, als Elutionsmittel ein Gemisch aus Dichlormethan und Methanol. Isoliert werden 3,8 mg (4,7 µmol, 34%) der Titelverbindung A, 2,4 mg (3,4 µmol, 25%) der Titelverbindung B sowie 1,2 mg (1,5 µmol, 11%) der unter Beispiel 1 beschriebenen Verbindung.
¹H-NMR (CDCl₃) von A: δ=1,18 (3H), 1,23 (3H), 1,68 (3H), 1,71 (1H), 1,80 (1H), 1,83 (3H), 2,15-2,48 (4H), 2,21 (3H), 2,49 (3H), 3,56 (3H), 3,71 (1H), 3,92 (1H), 4,37 (2H), 4,63 (1H), 4,71 (1H), 4,91 (1H), 5,37 (1H), 5,67 (1H), 5,76 (1H), 6,34 (1H), 6,81 (1H), 7,33 (2H), 7,51 (2H), 7,61 (1H), 8,16 (2H), 8,63 (2H) ppm.

Beispiel 3 3′-Desphenyl-3′-(4-pyridyl)-3′-N-debenzoyl-3′-N-methoxycarbonyl-10-d-esacetyltaxol

Die Lösung von 9,0 mg (10,2 µmol) der nach Beispiel 3a dargestellten Verbindung A in 0,8 ml Ethanol und 0,2 ml Tetrahydrofuran versetzt man unter einer Atmosphäre aus Argon mit 20,4 µl einer 4N Salzsäure und rührt eine Stunde bei 23°C. Man wiederholt die Zugabe an Salzsäure noch zweimal nach jeweils einstündigem Rühren, versetzt mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung, extrahiert mit Dichlormethan, engt den organischen Extrakt ein und reinigt den Rückstand durch Chromatographie an zwei analytischen Dünnschichtplatten. Als Laufmittel dient ein Gemisch aus Ethylacetat und Ethanol, als Elutionsmittel ein Gemisch aus Dichlormethan und Methanol. Isoliert werden 6,5 mg (8,5 µmol, 83%) der Titelverbindung.
¹H-NMR (CDCl₃): δ=1,13 (3H), 1,24 (3H), 1,78 (3H), 1,83 (3H), 1,73-1,96 (3H), 2,25 (2H), 2,37 (3H), 2,60 (1H), 3,62 (3H), 3,92 (1H), 4,14-4,28 (2H), 4,20 (1H), 4,32 (1H), 4,69 (1H), 4,94 (1H), 5,21 (1H), 5,36 (1H), 5,68 (1H), 5,83 (1H), 6,30 (1H), 7,34 (2H), 7,50 (2H), 7,62 (1H), 8,10 (2H), 8,61 (2H) ppm.

Beispiel 3a 3′-Desphenyl-3′-(4-pyridyl)-3′-N-debenzoyl-3′-N-methoxycarbonyl-7-tr-iethylsilyl-10-desacetyl-taxol (A) und 3′-Desphenyl-3′-(4-pyridyl)-2,3′-N-bisdebenzoyl-3′-N-methoxycarbonyl-7--triethylsilyl-10-desacetyl-taxol (B)

25 mg (23 µmol) des nach Beispiel 3b dargestellten Rohproduktes setzt man bei -10°C in Analogie zu Beispiel 1 um und isoliert nach Aufarbeitung und Reinigung 9,0 mg (10,2 µmol, 44%) der Titelverbindung A, 2,5 mg (3,2 µmol, 14%) der Titelverbindung B sowie 2,2 mg (2,9 µmol, 12%) der Titelverbindung aus Beispiel 3.
¹H-NMR (CDCl₃) von A: δ=0,43-0,67 (6H), 0,94 (9H), 1,13 (3H), 1,24 (3H), 1,70 (1H), 1,76 (3H), 1,87 (3H), 1,93 (1H), 2,24 (2H), 2,36 (3H), 2,48 (1H), 3,62 (3H), 3,87 (1H), 4,18 (1H), 4,29 (1H), 4,34 (1H), 4,68 (1H), 4,91 (1H), 5,12 (1H), 5,36 (1H), 5,63 (1H), 5,77 (1H), 6,29 (1H), 7,33 (2H), 7,49 (2H), 7,60 (1H), 8,10 (2H), 8,60 (2H) ppm.
¹H-NMR (CDCl₃) von B: δ=0,45-0,64 (6H), 0,94 (9H), 1,02 (3H), 1,25 (4H), 1,67 (1H), 1,72 (3H), 1,82 (3H), 1,88-2,12 (2H), 2,18 (4H), 2,47 (1H), 3,50 (1H), 3,67 (1H), 3,70 (3H), 3,90 (1H), 4,26 (1H), 4,30 (1H), 4,59 (1H), 4,61 (1H), 4,66 (1H), 4,91 (1H), 5,03 (1H), 5,27 (1H), 5,65 (1H), 6,25 (1H), 7,32 (2H), 8,62 (2H) ppm.

Beispiel 3b 2′-Triisopropylsilyl-3′-desphenyl-3′-(4-pyridyl)-3′-N-d-ebenzoyl-3′-N-methoxycarbonyl-7-triethylsilyl-10-desacetyl-taxol

Die Lösung von 25 mg (23,2 µmol) der nach Beispiel 1a dargestellten Verbindung in 1,2 ml Ethanol versetzt man unter einer Atmosphäre aus Argon mit 0,23 ml Hydraziniumhydoxid und rührt bei 23°C 24 Stunden. Man gießt in eine gesättigte Natriumchloridlösung, extrahiert mehrfach mit Ethylacetat und trocknet über Magnesiumsulfat. Den nach Filtration und Lösungsmittelabzug erhaltenen Rückstand setzt man ohne Reinigung weiter um. Isoliert werden 22 mg (max. 21 µmol, max. 91%) der Titelverbindung, die noch geringe Mengen Ausgangsmaterial enthält.

Beispiel 4 Biologische Wirkung der Verbindung aus Beispiel 1 auf Tubulin

Die Messung der Polymerisation von Tubulin bzw. der Depolymerisation von Microtubuli erfolgt photometrisch. Vor der Messung wird das nach Beispiel 4a präparierte Tubulin aufgetaut und für 15 Minuten entgast. Das Photometer wird auf eine Wellenlänge von 350 nm eingestellt. In die trockenen und gereinigten Küvetten (10 mm) pipettiert man 3 µl Lösemittel/Probe, 6 µl GTP (0-25 µmol/l final.) und 291 µl Tubulin (2 mg Protein/ml). Die Probe wird vorsichtig gerührt (ohne Luftblasen dabei zu verursachen), sofort in den Küvettenschlitten gestellt und der Meßvorgang bei 37°C gestartet. Nach Erreichen des Polymerisationsmaximums (Lösemittelkontrolle und Taxol 1E-5 mol/l nach 20 Minuten) wird die Depolymerisation durch das Absenken der Temperatur auf 15°C eingeleitet. Der Meßvorgang wird am Ende der Depolymerisation gestoppt und der Verlauf der Absorptionsänderung als Funktion von Zeit und Temperatur graphisch dargestellt:

Es ist deutlich zu erkennen, daß die Polymerisation von Tubulin im Vergleich zur Kontrolle beschleunigt und die Depolymerisation inhibiert, während die erfindungsgemäße Verbindung aus Beispiel 1 die Polymerisation inhibiert und die gebildeten Microtubuli deutlich besser stabilisiert als Taxol.

Beispiel 4a Isolierung und Reinigung von Tubulin

Rinderhirne (je 330 g) werden aus frisch geöffneten Rinderköpfen entnommen und in eisgekühltem PM4-M Puffer transportiert. Das Gehirn wird von der Hirnhaut sowie von eventuellen Thromben befreit und mit ausreichendem PM4-M-Puffer im Kühlraum homogenisiert. Das Homogenisat aus 2 Rinderhirnen wird insgesamt mit 500 ml Puffer auf 1,0 l Gesamtvolumen aufgefüllt und einer ersten Zentrifugation unterzogen (GSA- Rotor, 15 Minuten, 4°C, 6500 g). Der Überstand wird von der Fetthaut an der Oberfläche befreit und über 4 Lagen Mull filtriert, in austarierte Zentrifugenröhrchen überführt (420 ml) und erneut zentrifugiert (Rotor Ti 45, 96 000 g, 75 Minuten, 4°C). Der Überstand wird über das Pellet abpipettiert, über 6 Lagen Mull filtriert und mit einer 50 mM GTP-Lösung in 0,01 M Bicarbonat/PBS zu einer finalen Konzentration von 1 mM versetzt. In austarierten Zentrifugenröhrchen erfolgt bei 45 Minuten in einem 37°C warmen Wasserbad eine erste Polymerisation. Die gebildeten Microtubuli werden abzentrifugiert (Rotor Ti 45, 27°C, 96 000 g, 60 Minuten), der Überstand vorsichtig abpipettiert und das sehr weiche, opalisierende Pellet mit einem Spatel vorsichtig von der Wand gelöst. Anschließend wird es mit 40 ml kaltem PM-Puffer versetzt, mit einem kleinen Glasmörser homogenisiert und über Nacht (12-16 Stunden) auf Eis in austarierten Zentrifugenröhrchen im Kühlraum inkubiert. Das Depolymerisat wird im Ti 60-Rotor abzentrifugiert (4°C; 96 000 g, 60 Minuten), der Überstand mit PM8-M-Puffer 1 : 1 verdünnt, in austarierten Zentrifugenröhrchen für 45 Minuten bei 37°C inkubiert und erneut zentrifugiert (Rotor Ti 45, 27°C, 96 000 g, 60 Minuten). Der Überstand wird vorsichtig abpipettiert und das sehr weiche, opaleszierende Pellet in 20 ml kaltem PM- Puffer aufgenommen, mit einem kleinen Glasmörser vorsichtig homogenisiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die erneute Zentrifugation (Rotor Ti 60, 4°C, 96 000 g, 60 Minuten) liefert Tubulin, dessen Proteingehalt nach Pierce oder einer photometrischen Messung bei 280 nm bestimmt wird.

Bei der Proteinbestimmung werden die Verdünnungen 1 : 10, 1 : 20; 1 : 40 vom Isolat und vom PM-Puffer eingesetzt. Der PM-Puffer hat eine Eigenextinktion und wird als Nullwert vom ermittelten Proteingehalt abgezogen. Das Isolat wird mit PM-Puffer auf die vorgesehene Proteinkonzentration verdünnt (2 mg/mL).

Claims

1. Taxane der allgemeinen Formel I worin R¹ Wasserstoff, C₁-C₁₀-Acyl,
R² α-OH oder β-OH,
R³ C₁-C₁₀-Alkyl, durch X substituiertes Phenyl, C₁-C₁₀-Alkoxy
X Wasserstoff, Halogen, -N₃, -CNsein kann und freie Hydroxylgruppen in I durch Veretherung oder Veresterung weiter funktionell abgewandelt sein können, sowie die α-, β- oder γ-Cyclodextrinclathrate, sowie die mit Liposomen verkapselten Verbindungen der allgemeinen Formel I bedeuten.

2. Arzneimittel, bestehend aus einer oder mehrerer Verbindungen des Anspruches 1 und üblicher Hilfs-, Träger- und Zusatzstoffe.

3. Verfahren zur Herstellung von Taxanderivaten der allgemeinen Formel I gemäß Patentanspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Alkohol der allgemeinen Formel II in dem R¹ und R² die oben genannten Bedeutungen haben und in II enthaltene Hydroxylgruppen gegebenenfalls geschützt sind, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IIIa, IIIb oder IIIc, in denen R³ die oben genannte Bedeutung hat und X′ Hydroxyl, O-Alkyl und Halogen sein kann und worin freie Hydroxylgruppen durch Veretherung oder Veresterung geschützt sind, zu Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen freie Hydroxylgruppen durch Veretherung oder Veresterung weiter funktionell abgewandelt werden können, umsetzt.