JP6208582B2 - アントラサイクリン系化学療法剤を含有しているｅｒｂｂ２標的免疫リポソームによる治療における心臓毒性を抑制するための用量及び投与 - Google Patents

アントラサイクリン系化学療法剤を含有しているｅｒｂｂ２標的免疫リポソームによる治療における心臓毒性を抑制するための用量及び投与 Download PDF

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Description

（関連出願との相互参照）
本出願は、２０１０年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６１／４２０，２２５号、２０１０年１２月７日に出願された同第６１／４２０，６８８号、及び２０１１年３月４日に出願された同６１／４４９，６０２号の優先権を主張する。前記各出願の内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
（連邦政府支援研究及び開発によってなされた発明に対する権利に関する供述）
適用されない
（コンパクトディスク上で提出される「配列表」、表、又はコンピュータプログラムリスト添付資料の参照）
適用されない
アントラサイクリンは、数十年に渡り、癌治療の有効な重要要素である。乳癌におけるアントラサイクリンによる治療で観察される着実な臨床的有益性にもかかわらず、このような治療に関連する急性及び／又は慢性の心不全などの重大な毒性がより広い適応症を限定している。リポソームドキソルビシン製剤は心臓毒性をある程度減少させるのに成功したにもかかわらず、これらは明確に有効な利点を示すことができず、及び掌蹠の発赤知覚異常（手足症候群）のような別の毒性を伴う可能性がある。現在入手可能であるアントラサイクリンの有効性を向上させる目的で、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）を過剰発現する腫瘍細胞にドキソルビシンを標的化する新規な免疫リポソーム製剤であるＭＭ−３０２が製造された。ＨＥＲ２介在性のシグナル伝達を阻害せずにＨＥＲ２と結合する抗体断片がペグ化リポソームドキソルビシンの外表面に結合している。
ドキソルビシン（ｄｏｘ）は、各種の癌を治療するために用いられるアントラサイクリン系化学療法剤である。ドキソルビシンの使用は、薬剤の心臓毒性によって用量規制されている。この問題に対処するために、ドキソルビシンはペグ化リポソーム製剤として製剤化されている。薬剤のリポソームによるカプセル化は、改善された治療指標又は治療域を伴って強力な細胞毒性薬の送達を可能にする。ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））は、ドキソルビシンのペグ化リポソームカプセル（リポソーム化）形態である。ＤＯＸＩＬはペグ化リポソームドキソルビシン（ＰＬＤ）の市販形態である。ＤＯＸＩＬはドキソルビシンの組織分布及び薬物動態プロファイルを変化させる。ＤＯＸＩＬの使用は、アントラサイクリンを投与されていない患者及び以前にこれで治療された患者において、単独又はトラスツズマブとの併用の両方で、遊離ドキソルビシン治療と比べて、左心室心機能障害及び症候性鬱血性心不全の比率を有意に低下させる。ＤＯＸＩＬ（登録商標）は、カポジ肉腫、卵巣癌、及び多発性骨髄腫の治療に用いることが承認されている。ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射はＣＡＥＬＹＸ（登録商標）としても販売されている。
免疫リポソームは、抗体が標的にする細胞表面抗原を担持している細胞によって選択的に内部移行されるので、非免疫リポソーム製剤を超える利点をもたらす、抗体（通常は、抗体断片）標的化リポソームである。このような抗体及びリポソームは、例えば、下記の米国特許及び特許出願に記載されている：米国特許出願公開第２０１０−００６８２５５号、米国特許第６，２１４，３８８号、同第７，１３５，１７７号、及び同第７，５０７，４０７号 (“Immunoliposomes that optimize internalization into target cells”)；米国特許第６，２１０，７０７号 (“Methods of forming protein-linked lipidic microparticles and compositions thereof”)；米国特許第７，０２２，３３６号 (“Methods for attaching protein to lipidic microparticles with high efficiency”) 並びに米国特許出願公開第２００８−０１０８１３５号、及び米国特許第７，２４４，８２６号 (“Internalizing ErbB2 antibodies.”)。下記の米国及び国際特許及び特許出願は、本開示に関連しているアッセイ、細胞株、及び関連技術を記載している：米国特許第７，８４６，４４０号 (“Antibodies against ErbB3 and uses thereof”)、並びに米国特許出願第１２／７５７，８０１号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４０２５９号、及び同第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６０７２１号 (“Human Serum Albumin Linkers and Conjugates Thereof”)。
ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を標的とする免疫リポソームは前記特許の開示に従って製造できる。このようなＨＥＲ２標的化免疫リポソームは、Ｆ５抗ＨＥＲ２抗体断片を含みドキソルビシンを含む、ＭＭ−３０２を含有している。ＭＭ−３０２はリポソーム当り哺乳動物に由来するＦ５−ｓｃＦＶ（抗ＨＥＲ−２）の４５コピーを含有している。Ｆ５−ｓｃＦＶは、ＨＥＲ２シグナル伝達に影響を及ぼさずに内部移行する能力について選択された。Ｆ５−ｓｃＦＶの特徴付けは、それがマウス、ラット又はウサギＨＥＲ２と交差反応せず、そして遊離ｓｃＦＶ形態においてＨＥＲ２シグナル伝達を妨害しないことを示している。心筋細胞がＨＥＲ２を発現することは公知であるので、ＭＭ−３０２の潜在的な心臓毒性及び関連するＨＥＲ２標的化免疫リポソームに関する懸念が示されている。
市販されているリポソーム化ドキソルビシンの用量及び用法：
ＤＯＸＩＬ（登録商標）（ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射）は典型的なリポソームアントラサイクリン系化学療法剤である。ＤＯＸＩＬは通常、ｍｇ／ｍ２で示され、ドキソルビシンＨＣＬ当量（ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．、各用量中のドキソルビシンの全質量を意味する）として特徴付けられている用量で静脈内に投与される。各用量は通常、ｙ週間毎にｘｍｇ／ｍ２（ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）の用量を生ずるように、週単位で測られる間隔で投与される。最初のリポソームドキソルビシン用量は一般に、注入に関連する反応の危険性を最小化するために１ｍｇ／分の初期速度で投与される。注入に関連する副作用が観察されなかったら、注入速度を上昇させて１時間以上かけて薬剤の投与を完遂する。
卵巣癌の患者：
ＤＯＸＩＬは一般に、５０ｍｇ／ｍ２ ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．の用量で卵巣癌患者に静脈内投与される。患者が疾患を進行させず、心臓毒性の兆候を示さず、そして治療に耐え続けている限り、患者は通常、４週間に１度投与される。臨床試験における応答時間の中央値は４ヶ月であったので、最低４治療単位が推奨されている。手足症候群（ＨＦＳ）、口内炎、又は血液毒性のような副作用を管理するために、服用を遅延及び減少させてもよい。制吐剤による前治療又はこれとの併用は考慮に値する。
ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫（ＫＳ）の患者：
ＤＯＸＩＬは通常、ＫＳ患者に２０ｍｇ／ｍ２（ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）の用量で静脈内に投与される。患者が治療に対して十分に応答してこれを許容する限り、ＫＳ患者における服用は通常３週間に１度繰り返される。
多発性骨肉腫の患者：
多発性骨肉腫の患者を治療するために、ＤＯＸＩＬをＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）（ボルテゾミブ（bortezomib））と共に投与する。ボルテゾミブを、１．３ｍｇ／ｍ２の用量で静脈内ボーラス投与法で、３週間毎に、１、４、８及び１１日目に投与する。ＤＯＸＩＬは通常これらの患者に３０ｍｇ／ｍ２の用量で各４日目のボルテゾミブ投与に続いて１時間かけて静脈内注入する。疾患が進行するまで又は許容できない毒性が発生するまで、通常患者は最大８治療単位まで治療される。
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２を過剰に発現する腫瘍を治療するために非常に広く用いられている治療用抗ＨＥＲ２抗体である。トラスツズマブの用量を制限する重要な作用は心臓毒性である。心筋細胞はＨＥＲ２を発現することが公知であって、トラスツズマブが介在する心臓毒性は一般に、心筋細胞で発現したＨＥＲ２と結合しているトラスツズマブに起因するＨＥＲ２発現心筋細胞に対する損傷によって生じると認められている。例えば、Hysing J and Wist E, “Cardiotoxic Effects of Trastuzumab,” Tidsskr Nor Laegeforen, 2011 Nov 15;131(22):2239-2241 を参照されたい。ドキソルビシンのようなアントラサイクリン系薬剤は、その用量を制限する心臓毒性作用をもたらすことが知られていて、この作用がアントラサイクリン系薬剤の使用における重大な制約であると考えられる。例えば、Sawyer et al., “Mechanisms of Anthracycline Cardiac Injury: Can we identify strategies for cardio-protection?” Prog Cardiovasc Dis., 2010 Sep-Oct;53(2):105-13 を参照されたい）。
ドキソルビシンに誘発される心臓障害は不可逆的であって、急性の損傷及び治療の数年後に現れる可能性のある損傷も引き起こす。５５０ｍｇ／ｍ２を越えるドキソルビシンの蓄積濃度への暴露は心筋症及び心不全の可能性を増大させる。ＨＥＲ２陽性乳癌の治療のためのＨＥＲ２指向性の治療の開発は、ドキソルビシンとトラスツズマブの併用についての臨床的有益性の検討へと導いた。ドキソルビシン＋トラスツズマブの臨床効果はパシリタキセル＋トラスツズマブのそれより優れていた；しかしながら、ドキソルビシン＋トラスツズマブの検討群において観察される心毒性の増加した発生率が存在し、併用の上市は承認されなかった。アントラサイクリンによる治療、特にＨＥＲ２陽性乳癌の治療における臨床効果は未だ議論の余地がある。
薬剤のリポソームによるカプセル化は、向上した治療指数を伴う強力な細胞毒性薬物の送達を可能にしている。ペグ化リポソームドキソルビシン（ＰＬＤ）はドキソルビシンの組織分布及び薬物動態プロファイルを変化させる。ＰＬＤは、アントラサイクリンを投与されていない患者及び以前にこれで治療された患者において、単独で又はトラスツズマブとの併用の両方で、遊離ドキソルビシンによる治療と比べて、左心室心機能障害及び症候性鬱血性心不全の比率を有意に低下させる。ＰＬＤの心臓毒性の減少について提案されるメカニズムは、従来のドキソルビシンと比べてより大きいそのサイズにより、それが心臓の内皮細胞壁を通過することが阻害されて、それによりドキソルビシンの心臓組織への曝露が最小限化されたということである。
ＭＭ−３０２は、ドキソルビシンを、ＨＥＲ２を過剰発現している癌に直接送達するように設計されたＨＥＲ２を標的とするペグ化リポゾームである。ＨＥＲ２標的化ＰＬＤは、浸透性の増大及びＰＬＤと類似する保持効果によって腫瘍内に蓄積する。腫瘍微小環境内で標的のＨＥＲ２過剰発現細胞は、ＨＥＲ２標的化ＰＬＤと共に前臨床モデルにおけるＰＬＤと比べて優れた効果をもたらした。ＭＭ−３０２の開発段階で、そのＨＥＲ２標的化により、ＭＭ−３０２が心臓毒性のあるドキソルビシンを心筋細胞に直接送達して、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射に比べて心臓毒性の増大を生じるだろうという懸念を規制当局が示しており、そして、ＭＭ−３０２の用量の減少によりこのような命を脅かす毒性を避けることが示唆された。
本発明は、例えば、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））と比べて心臓毒性の危険性が増大することなく、その他の長所をもたらして、ＨＥＲ２を発現している癌を治療するための、抗ＨＥＲ２免疫リポソームアントラサイクリンの安全な用量及び安全な使用を確認する方法を提供する。
抗ＥｒｂＢ２を標的とする、アントラサイクリン含有免疫リポソーム、例えば、ＭＭ−３０２もまた、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射と同じく心臓毒性がないこと、及び、心臓毒性の危険性を何ら増大させることなく又は有効性を低下させることなく、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射で用いるのと全く同じ用量（すなわち、用量及び投与量並びにスケジュール）を用いて投与できることが今見出された。さらに、ＭＭ−３０２はインビトロ又はインビボで細胞当り２００，０００又はそれ以上のＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）受容体を発現している細胞を有効に標的にできることが今明らかにされて、ＨＥＲ２“３＋”（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）による）、ＨＥＲ２ ＦＩＳＨ＋（ＨＥＲ２遺伝子増幅用蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、又はＨＥＲ２“２＋”（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴによる）の何れかであるＨＥＲ２過剰発現腫瘍を有する患者を治療するために用いることができることを示唆している。
従って、本明細書には、アントラサイクリン含有抗ＨＥＲ２免疫リポソームの投与によってヒト癌患者の治療に用いるための安全で有効な用量を決定する方法が開示されており、該患者は、ＨＥＲ２受容体の発現によって特徴づけられる癌を有していると診断されており、方法は、ＨＥＲ２受容体の発現を特徴とする癌を有していると診断された患者に対する用量の規模と投薬頻度で示される第１用量を決定すること、該第１用量は、免疫リポソームを含んでいないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤に関する用量であり、この用量はリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の安全で有効な量を患者にもたらすよう決定される；及び、アントラサイクリン含有抗ＨＥＲ２免疫リポソームの投与についての用量を確定すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗ＨＥＲ２抗体分子を担持しており、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有しており、ここで、アントラサイクリン含有抗ＨＥＲ２免疫リポソームの投与の安全で有効な用量は第１用量であること、を含んでいる。
アントラサイクリン含有抗ＨＥＲ２免疫リポソームの投与によってヒト癌患者を治療する方法も開示されていて、方法は、ＨＥＲ２受容体の発現を特徴とする癌を有していると診断された患者に対して、用量の規模と投薬頻度で示される第１用量を決定すること、該第１用量は免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤に関するものであって、この用量はリポソーム製剤の安全で有効な量を患者にもたらすように決定される、及び、アントラサイクリン含有抗ＨＥＲ２免疫リポソームを投与すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗ＨＥＲ２抗体分子を担持しており、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有しており、ここで、アントラサイクリン含有抗ＨＥＲ２免疫リポソームは第１用量を患者に投与される、を含んでいる。
ある特定の態様では、アントラサイクリンはドキソルビシンである。別の態様では、免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤はドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射であり、及びＨＥＲ２を標的とする免疫リポソームはＭＭ−３０２である。他には、癌は乳癌、カポジ肉腫、卵巣癌、又は多発性骨髄腫である。さらに別の態様では、第１用量が、２週間毎又は３週間毎又は４週間毎に、５０ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、又は１０ｍｇ／ｍ２である。別の態様では、ＨＥＲ２受容体の発現を特徴とする癌はさらに、ＨＥＲ２２＋、ＨＥＲ２３＋、又はＨＥＲ２ ＦＩＳＨ陽性であることを特徴としている。他には、ＥｒｂＢ２受容体の発現を特徴とする癌はさらに、細胞当り平均で少なくとも２００，０００の細胞表面ＥｒｂＢ２受容体を発現することを特徴としている。さらにまた、第１用量での免疫リポソームの投与は癌の治療に有効であり、及び他には、第１用量での免疫リポソームの投与は、免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の第１用量での投与と比べて心臓毒性の増大を生じさせない。別の態様では、患者へ第１用量での免疫リポソームの投与は、患者の血流中において免疫リポソームのピーク濃度をもたらし、及びほぼピーク濃度の免疫リポソームを含有している培地中で培養することによるインビトロでのヒト心筋の治療が、免疫リポソームを含んでいない培地中で培養したコントロールのヒト心筋細胞と比べて、培養した心筋細胞中のｐＥＲＫ又はｐＡＫＴのヘレグリン刺激による増大を減少させないか又は５％未満だけ減少させる。別の態様では、患者の血流中の免疫リポソーム濃度は血清免疫リポソーム濃度として測定される。さらに別の態様では、それぞれのＨＥＲ２免疫リポソームはその表面に、平均４５の抗ＨＥＲ２抗体分子を担持している。
図１は、取り込みに対するＨｅｒ２レベルの効果である。各種レベルのＨＥＲ２を発現している多数の細胞株を１５μｇ／ｍｌのＭＭ−３０２（Ａ）及び非標的化ペグ化リポソームｄｏｘ（ＵＴ−ＰＬＤ）（Ｂ）で２時間処置して細胞内の総ドキソルビシンをＨＰＬＣで定量した。ｙ軸は細胞当りのフェムトグラムｄｏｘ（左）及び細胞当りのリポソーム（右）を表わし、ｘ軸は細胞当りのＨＥＲ２受容体の数（ログスケール）を表わす。マウス腫瘍４Ｔ１細胞（Ｃ）及び内因性の低ＨＥＲ２発現ＨＥＬＡ細胞（Ｄ）をトランスフェクトしてヒトＨＥＲ２を種々のレベルで発現する安定なクローンを作製した。個々のクローン（三角、丸、又は四角で表す）を、蛍光マーカー（ＤｉＩ５−Ｆ５−ＰＬ）を含有しているＦ５標的化リポソームで処置して、全体の結合／取り込みをＦＡＣＳで確認した。 図２Ａ：ＨＥＲ２過剰発現ＢＴ４７４−Ｍ３細胞を１５μｇ／ｍｌのＭＭ−３０２（丸）、ＰＬＤ（四角）、及びドキソルビシン（三角）で、示された時間（ｘ軸、分）処置した。細胞内の総ドキソルビシンをＨＰＬＣで定量した（ｙ軸、フェムトグラム／細胞）。図２Ｂ：核へのドキソルビシン送達を、示された培養時間（ｘ軸、分）に続いて２４時間ハイコンテント顕微鏡で定量した（ｙ軸、バックグラウンド以上の細胞当りシグナル）図２Ｃ：ＭＭ−３０２及びＰＬＤの抗腫瘍活性をＢＴ４７４−Ｍ３同所性乳癌モデルにおいて比較した。ＭＭ−３０２（四角）及びＰＬＤ（三角）の両方はコントロール（丸）と比較して有意に腫瘍の生育を阻害した（５５日目のｔ−検定；ｐ＜０．０００１）。ＭＭ−３０２はＰＬＤと比較してより強い腫瘍生育の阻害をもたらした（５５日目のｔ−検定；ｐ＝０．０３１０）。ｙ軸は腫瘍の体積（ｍｍ３）を表わし、及びｘ軸は接種後の日数を表わす。図２Ｄは、３ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇ（ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）を移植７日目に投与した、ＢＴ４７４−Ｍ３異種移植におけるＭＭ−３０２及びＵＴ−ＰＬＤの薬物動態を示す。ｙ軸は血清中のｄｏｘ（μｇ／ｍｌ）であり、そしてｘ軸は時間（時）である。 図３は、インビボにおけるＨＥＲ２レベルの役割を示す。乳房脂肪体中にＢＴ４７４−Ｍ３異種移植腫瘍を担持しているマウスにＤｉＩ５標識化ＭＭ−３０２（Ｄｉｌ５−Ｆ５−ＰＬＤ）又はＵＴ−ＰＬＤ（Ｄｉｌ５−ＵＴ−ＰＬ）を注射した。腫瘍の単一細胞浮遊液を調製してＦＩＴＣ−ＨＥＲ２抗体で染色した。Ｄｉｌ５陽性−ＨＥＲ２陽性細胞をＦＡＣＳで確認した。図３Ａは、腫瘍細胞に結合したリポソーム（陽性細胞のパーセント、ｙ軸）の関数としてＨＥＲ２レベル（細胞当りの受容体、ｘ軸）を示すグラフである。図３Ｂは、腫瘍組織切片中で測定した単一細胞を基準としたＨＥＲ２発現の不均一性を示すグラフである。 図４は、ヒト心筋細胞中で測定したＭＭ−３０２（丸）、ＰＬＤ（四角）及びドキソルビシン（三角）の取り込みを示す。胚幹細胞由来（ＥＳＣｄ）（Ａ）及び誘導多能性幹細胞由来（ｉＰＳｄ）（Ｂ）の心筋細胞を１５μｇ／ｍｌのＭＭ−３０２、ＰＬＤ及び遊離ドキソルビシンで示される時間処置した。細胞内の総ドキソルビシンをＨＰＬＣで定量した。ｙ軸は取り込み（ｆｇ／細胞）を表わし、そしてｘ軸は培養時間（分）を表わす。図４Ｃは細胞の生存能を示す。ＥＳＣｄ心筋細胞を示される濃度の薬剤で３時間処置し、新鮮な培地でさらに２４時間培養して、細胞生存能を評価した。ｙ軸はコントロールと比較した細胞生存率（％）を表わし、そしてｘ軸は濃度（μｇ／ｍｌ）を表わす。図４Ｄは細胞の生存能を示す。ｉＰＳｄ心筋細胞を示される濃度の遊離ドキソルビシン（丸）、ＰＬＤ（四角）又はＭＭ−３０２（三角）で２４時間処置した。上澄液を採取して、残された細胞上でＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存能アッセイを実施した。全ての値を非処置群と正規化した。図４Ｅは、図４Ｄにおいて採取した上澄液で実施したヒトトロポニンＩ ＥＬＩＳＡを示す。非処置の線（点線）は非処置ウェル中で検出可能な可溶性トロポニンＩの値を表わす。全ての値を供給された標準品の希釈物に対して正規化した。 ＥＳＣｄ心筋細胞を示される濃度のＭＭ−３０２（丸）、ＰＬＤ（四角）、及び遊離のドキソルビシン（三角）で３時間処置し、次いで新鮮な培地でさらに２４時間培養した。細胞を染色してハイコンテント顕微鏡を用いて画像化した。各染色について単一細胞の強度を定量化して、個々の細胞の平均相対強度として示した。細胞をＤＮＡ損傷マーカーであるγＨ２ＡＸで染色した（図５Ａ）。さらに、細胞を細胞ストレスタンパク質であるリン酸化ｐ５３（図５Ｂ）及びリン酸化ＨＳＰ２７（図５Ｃ）、並びにアポトーシスタンパク質ＰＡＲＰの切断形態（ｃＰＡＲＰ）（図５Ｄ）で染色した。ｙ軸は相対強度を表わし、そしてｘ軸は濃度（μｇ／ｍｌ）を表わす。 図６Ａ：Ｆ５ｓｃＦｖ単独、又は空の（即ち、カプセル化されたｄｏｘを伴わない）リポソームと結合しているＦ５ｓｃＦＶ（「Ｆ５ｌｉｐｏ」−ＭＭ３０２と等価であるが、ドキソルビシンを含有していないリポソーム）は、ｉＰＳ由来ヒト心筋細胞において、基礎ｐＥＲＫレベルをごく僅かに減少させて、ヘレグリン刺激ｐＥＲＫレベルを減少させないのに対して、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標：トラスツズマブ）は基礎レベルをかなりの程度まで減少させて、トラスツズマブ及びラパチニブの両方はヘレグリン刺激レベルをＦ５ｓｃＦｖ又はＦ５ｌｉｐｏよりもかなりの程度まで減少させる。図６Ｂ：試験した薬剤はどれもこれらの細胞において基礎ｐＡＫＴレベルを変えず、そしてトラスツズマブ及びラパチニブの両方がヘレグリンで刺激レベルをＦ５ｓｃＦｖ又はＦ５ｌｉｐｏよりも有意に大きく変化させた。 図７Ａ：ＭＭ−３０２（四角）、ＰＬＤ（三角）及び遊離のドキソルビシン（丸）の生体内分布を検討した。ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍を担持しているマウス（ｎ＝４／時点／群）に単回用量（３ｍｇ／ｋｇ）のドキソルビシン、ＭＭ−３０２又はＰＬＤの何れかを投与した。注射後０．５、４及び２４時間後に屠殺して、心臓組織（図７Ａ）、腫瘍組織（図７Ｂ）及び足（図７Ｃ）中のドキソルビシン蓄積をＨＰＬＣで定量化した。図７Ｄ：ＭＭ−３０２は遊離のドキソルビシンと比較してより低い核内ドキソルビシン蓄積を誘発し、ＰＬＤに匹敵する。ｎｕ／ｎｕマウスに３ｍｇ／ｋｇ（ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）のＭＭ−３０２−ＤｉＩ５、ＰＬＤ−ＤｉＩ５、及び遊離のドキソルビシンを静脈内投与した。指定された時点に、心臓を採取し、低温切片を製造して、リポソームとドキソルビシンの微小分布を分析した。機能的で／潅流された血管を可視化するためにＦＩＴＣレクチンを注入した。心臓切片をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色して共焦点蛍光顕微鏡（４０倍）で画像化した。ドキソルビシン陽性核が示されている。ドキソルビシン陽性の核は遊離のドキソルビシンで処置したサンプルで０．５時間、及び４時間に目で見え、ＭＭ−３０２処置サンプルでは見えない（「統合パネル」を参照されたい）。図７Ｅは、ドキソルビシン及びＭＭ−３０２に関して０．５時間時点における上記視野の高倍率（２倍）の核及びドキソルビシンシグナルの重なりを示している。図７Ｆは、ドキソルビシン陽性の核のパーセントをＤｅｆｉｎｉｅｎｓ（登録商標）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＸＤ（登録商標）を用いて定量化した。 図８はモデル化である。遊離及びリポソーム化ドキソルビシンについてのコンピュータモデルを開発して文献又は自家データ上で校正した。これは、多種組織におけるリポソーム対遊離のドキソルビシンに関する薬剤濃度及び暴露を確定する競合動態経路を理解するために適用できる。図８ＡはＰＫ及び生体分布である。遊離のドキソルビシンと対照的に、リポソーム送達はより長い循環時間をもたらす。図８Ｂは組織沈着である。このモデルはマウスにおける典型的なリポソーム沈着データを捕えることができる。図８Ｃは微小分布である。動態モデリングはＭＭ−３０２の取り込み及びドキソルビシンの細胞輸送におけるＨＥＲ２発現の役割を理解するための枠組みを提供できる。
ＭＭ−３０２リポソームは、ドキソルビシンをゲル化又は沈降状態で含有している水性スペースを封入している直径が約７５〜１１０ｎｍの単層脂質二重層ベシクルである。脂質膜は、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンからなり、該ポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンはリン脂質分子２００に対してＰＥＧ分子約１つの量を有しており、ここで、それぞれ１７８０のリン脂質分子に対する約１個のＰＥＧ鎖はその末端にＨＥＲ２と結合する単鎖Ｆｖ抗体断片を有している。ＭＭ−３０２リポソームは、ＨＳＰＣ（水素化大豆ホスファチジルコリン）：コレステロール（植物由来）：ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ポリエチレングリコール−ジステロイルホスフォエタノールアミン）のモル比３：２：０．３から製造される。ＭＭ−３０２の総ＨＳＰＣ脂質濃度は約４０ミリモル／Ｌである。ＭＭ−３０２は約１０ミリモル／Ｌの脂質、及び約２ｍｇ／ｍＬのドキソルビシンを含有している。ＭＭ−３０２は、０．１６〜０．３０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＥ−ＰＥＧ−Ｆ５（米国特許第６，２１０，７０７号に記載のようにして製造される）を含有しているリポソーム中に１．８〜２．２ｍｇ／ｍＬのドキソルビシンを含有している。Ｆ５は抗ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）ｓｃＦｖ抗体断片（ＡＴＣＣプラスミド受託番号ＰＴＡ−７８４３によってコードされる）である。ＭＭ−３０２リポソームは、１３０〜１７０ｇのドキソルビシン／モルリン脂質及び１２〜２５ｇＦ５−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ／モルリン脂質を含有している。ＭＭ−３０２は緩衝液（ｐＨ６．５）として滅菌した１０ｍＭ／Ｌのヒスチジン−ＨＣｌ、及び等張性を保持するために１０％のスクロース中に製剤化される。ＭＭ−３０２リポソームは予め組み込まれている硫酸アンモニウムを用いて組み込まれる。
ＭＭ−３０２の投与


用量１ 用量２ 用量３ 用量４ 用量５

１週間に１度 １０mg/m 2 ２０mg/m 2 ３０mg/m 2 ４０ｍg/m 2 ５０mg/m 2

２週間に１度 １０mg/m 2 ２０mg/m 2 ３０mg/m 2 ４０ｍg/m 2 ５０mg/m 2

３週間に１度 １０mg/m 2 ２０mg/m 2 ３０mg/m 2 ４０ｍg/m 2 ５０mg/m 2

４週間に１度 １０mg/m 2 ２０mg/m 2 ３０mg/m 2 ４０ｍg/m 2 ５０mg/m 2

５週間に１度 １０mg/m 2 ２０mg/m 2 ３０mg/m 2 ４０ｍg/m 2 ５０mg/m 2
「ｍｇ／ｍ２」は、患者の体表面積の平方メートル当りのドキソルビシン（ＭＭ−３０２として製剤化された）のｍｇを示す。乳癌に対しては、用量３、４、又は５が望ましい。カポジ肉腫に対しては用量１、２、又は３が望ましく、卵巣癌に対しては用量３、４、又は５が望ましく、そして多発性骨肉腫に対しては用量２、３、４、又は５が望ましい。投与計画は「進行性」（転移性腫瘍）と比べて「早期」である（転移前、例えば、アジュバント乳癌）固形腫瘍を有する患者において変えることができる。好ましい腫瘍は腫瘍細胞がＨＥＲ２を過剰発現するものである。ＨＥＲ２を過剰発現している腫瘍は、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）によってＨＥＲ２「３＋」又はＨＥＲ２「２＋」であると、或いは蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってＨＥＲ２ ＦＩＳＨ＋であると同定されるものである。或いは、ＨＥＲ２を過剰発現する好ましい腫瘍は、実施例に記載されている方法で定量して、細胞当り平均２００，０００又はそれ以上の受容体を発現するものである。
進行性乳癌のＭＭ−３０２による治療
ＦＩＳＨによって若しくはＩＨＣによって又は細胞当りのＨＥＲ２受容体の平均数を決定することによって確認されるように、ＨＥＲ２を過剰に発現している局所進行性／切除不能の又は転移性進行性乳癌を有する患者に、ＭＭ−３０２を４週間に１度、８、１６、３０、４０、又は５０ｍｇ／ｍ２を、６０分かけて静脈内（ＩＶ）注入により投与する。１）絶対好中球数（ＡＮＣ）≧１，５００／μＬ；２）血小板数≧１００，０００／μＬ；及び３）ヘモグロビン≧９ｇ／ｄＬ（輸血許容）から明らかなように、患者は適切な骨髄予備能を有していなければならない。１）血清総ビリルビン≦ＵＬＮの１．５倍；並びに２）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）が正常であるか又は正常上限の２．５倍まで（ＵＬＮ；肝転移及び／又は骨転移がある場合はＡＬＰに関して５倍のＵＬＮは許容される）から明らかなように、患者は適切な肝機能を有していなければならない。血清クレアチニン≦ＵＬＮの１．５倍から明らかなように、患者は適切な腎機能を有していなければならない。患者は、以前の手術、放射線治療又は乳癌の治療を意図するその他の治療の何れかの臨床関連毒性作用から回復していなければならない。生殖能力のある 男性と同様に妊娠の可能性がある女性及び彼らのパートナーにも、治療中及びＭＭ−３０２の最終投与から９０日間、性行為を慎むか又は避妊の効果的な形態を用いるように警告しなければならない。治療の約３０日以内にＥＣＨＯ又はＭＵＧＡで測定された≧５０の左心室駆出分画率から明らかなように、患者は適切な心臓機能を有していなければならない。妊娠中又は授乳中の患者及びＮＹＨＡクラスＩＩＩ又はＩＶの鬱血性心不全、或いは＜５０％の左心室駆出分画率（ＬＶＥＦ）、或いは延長したＱＴＣ間隔（≧４６０ｍｓ）を有する患者は、ＭＭ−３０２で治療しないことが好ましい。
以下の実施例は単なる説明であって、本開示を目にした当業者には多くの改変及び均等物が明らかであるように、本開示の範囲は限定して解釈されるべきではない。
これらの実施例で用いられる材料及び方法：
材料：
ドキソルビシンは SIGMA-ALDRICH, Inc. (St. Louis, MO) 製である。ＦＩＴＣ結合レクチン（lycopersicon esculentum（トマト）レクチン、Ｃａｔ＃ＦＬ−１１７１）は Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) から入手した。酢酸、メタノール、及びアセトニトリルは EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ) 製である。水及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はJ. T. Baker (Phillipsburg, NJ) 製である。ＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２・三塩酸塩・三水和物、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（登録商標）、及びＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳ（ＤｉＩ５）は、Invitrogen (Carlsbad, CA) 製である。コレステロール及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、Avanti Polar Lipids Inc．製である。水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）はLipoid (Newark, NJ) 製である。ＲＰＭＩはLonza (Walkersville, MD) 製であり、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はTissue Culture Biologicals製であり、そしてペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン混合物はGIBCO (Invitrogen）製である。
免疫リポソームの製造：
既述のようにして（Kirpotin et. al., Cancer Res. 2006;66:6732-40; Park et al., Clin Cancer Res. 2002;8:1172-81）、硫酸アンモニウム勾配を用いてリポソームを製造しドキソルビシンを取り込ませた。脂質成分はＨＳＰＣ、コレステロール、及びPEG−DSPE（３：２：０．３、モル：モル：モル）である。Nellis et al.,（Biotechnol Prog. 2005; 21:205-20; Biotechnol Prog. 2005; 21:221-32）によって報告されているように、抗ＥｒｂＢ２（Ｆ５）−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合物を製造し、そしてリポソームに組み込んで免疫リポソームを形成する。ＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳ（ＤｉＩ５）染色剤を総リン脂質の０．３モル％の濃度で、脂質成分と可溶化した以外は、上記のようにしてＤｉＩ−５−標識化リポソーム、ＭＭ−３０２−ＤｉＩ５及びＰＬＤ−ＤｉＩ５を製造する。全ての場合に、取り込まれなかった遊離ドキソルビシンを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−７５サイズ排除カラムを用いＨｅｐｅｓ緩衝食塩水（ｐＨ６．５）で溶出して除去する。Ｆ５−リポ−ＤｉＩ５を、ドキソルビシンを用いずに上記と同様な方法で製造して、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ６．５）の水性溶液を取り込む。
腫瘍細胞の培養：
ＢＴ４７４−Ｍ３細胞（Noble, Cancer Chemother. Pharmacol. 2009 64:741-51 を参照されたい）は、ＨＥＲ２過剰発現ヒト乳癌細胞である。ＢＴ４７４−Ｍ３細胞は１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシンを含有しているＲＰＭＩ培地で培養される。胚幹細胞由来（ＥＳＣｄ）心筋細胞を、 P.W. Zandstra, Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada; (Bauwens et al., Tissue Eng Part A. 2011 Apr 25, PMID 21417693;)から入手した。これらの細胞は、ＬＩＭドメインホメオボックス遺伝子Ｉｓｌ−１、トロポニンＴ、及びミオシン軽鎖２ｃのような心筋細胞の適切な細胞マーカーを発現することが示されている。トロポニン陽性細胞のパーセントを分化後に確認する。トロポニンＴについて７０％未満の陽性を含有しているバッチを廃棄する。誘導多能性幹細胞由来（ｉＰＳｄ）細胞をCell Dynamics Internationalから入手して製造会社のプロトコルに従って取り扱う。
異種移植の検討：
５〜７週齢の雌性ヌードマウスをCharles River Laboratories 又は Taconic Farms, Inc．から購入する（ＮＣｒヌードマウス)。別段に指示されない限り、マウスはマウスの背部右脇腹内に（皮下注射で、ｓ．ｃ．）ＢＴ４７４−Ｍ３乳癌細胞又はＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞（ＮＣＩ−ＤＰＴ、ＲＰＭＩ１００μＬ中１０×１０６細胞）を接種される。腫瘍が平均体積〜２００ｍｍ３に達したときに、以下に記載のような検討を行った。
腫瘍ＨＥＲ２レベルの検査：
ホモ接合型ＮＣｒヌードマウスの右上側から二番目の乳房脂肪体に１５×１０６個のＢＴ４７４−Ｍ３細胞を接種する。ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍を、ドキソルビシンを有さない蛍光標識された（以下に記載されるようにＤｉＩ５で）、ＨＥＲ２標的化又は非標的化リポソーム４ｍｇ／ｍｌの単回用量で注射した。２４時間後に、腫瘍を摘出して機械的又は酵素的手段で解離する。抗ＨＥＲ２による表面染色の後、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）装置（BD Biosciences）上でのフローサイトメトリーによって分析する。ＨＥＲ２のシグナルが増大することによって定義された狭く囲われた細胞サブセットにおいて、上昇したリポソーム含有量を有する細胞の全てを含めたパーセントをプロットすることによって、フローサイトメトリーのデータセットを所定の閾値を上回るＨＥＲ２の表面発現レベルとリポソームの取り込みとの間の関係について分析する。
細胞表面ＨＥＲ２の単一細胞における分布：
ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍異種移植組織を抗ＨＥＲ２抗体で染色してＤＡＰＩで対比染色する。スライドを、Ａｐｅｒｉｏ（登録商標）Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ（登録商標）を用いて倍率２０倍で画像化して、画像を分析する。ＨＥＲ２膜染色の強度を、（ＨＥＲ２層の内縁の平均値）＋（ＨＥＲ２層の外縁の平均値）として単一細胞を基準として定量する。
有効性の検討：
３ｍｇ／ｋｇ（ｑ７ｄ、ｎ＝３、総用量）で、ＰＢＳ（コントロール）、ＭＭ−３０２又はＰＬＤを投与されたマウス由来の平均腫瘍体積に基づいて、マウスを３つの処置群（ｎ＝７／群）に無作為に分ける。１週間に２回腫瘍をノギスで測定する。式：幅２×長さ×０．５２、を用いて腫瘍体積を計算する。１週間に２回マウスの体重を測定して体重減少を観察する。
ＨＥＲ２を発現している細胞株のリポソームの取り込み：
各種レベルのＨＥＲ２を発現している複数の細胞株を１５μｇ／ｍｌのＭＭ−３０２又はＰＬＤで２時間処置して、細胞内ドキソルビシンをＨＰＬＣで定量する。マウス４Ｔ１乳癌細胞及びヒトＨｅＬａ子宮頸癌細胞をＡＴＣＣから得て、ＡＴＣＣのアドバイスに従って増殖させる。市販の抗ＨＥＲ２抗体（BD Biosciences #340552）を用いるフローサイトメトリーで、細胞をヒトＨＥＲ２発現について特徴付ける。この抗体はマウスＨＥＲ２とは交差反応しないがヒトＨＥＲ２を検出する。ヒトＨＥＲ２をコードするネオマイシン選択可能な発現ベクターをGeneCopeia(Z2866) から入手する。４Ｔ１及びＨｅＬａ細胞をこの構築物で、非脂質ポリマートランスフェクション試薬 ＭｅｇａＴｒａｎ（登録商標）１．０（Origene）を用い製造会社の使用説明書に従って、トランスフェクトした。４００〜５００μｇ／ｍｌのジェネテシン／ネオマイシン（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした細胞を選択する。生存細胞を減少したジェネテシン／ネオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）の下で増殖させ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）装置でふるい分けして、親のＨｅＬａ細胞で観察されるものを上回るヒトＨＥＲ２の発現を有する濃縮された細胞集団を得る。次いで選別により濃縮された細胞を限定希釈によってサブクローン化し、コロニーをＨＥＲ２表面レベルによってランク付けし、ＨＥＲ２を異なった範囲で発現する４Ｔ１及びＨｅＬａ細胞の代表的な集団を得る。フローサイトメトリーで測定されるＨＥＲ２による表面染色の蛍光強度を、製造会社の使用説明書に従ってＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）抗マウスＩｇＧミクロスフェア（Bangs Laboratories #815）に結合する同じ抗体を用いた染色と比較して、細胞のＨＥＲ２表面受容体の数を計算する。
心筋細胞におけるリポソームの取り込み：
ｉＰＳｄ心筋細胞（Cell Dynamics International Cat# CMC-100-110-001）を、製造会社の説明書に従って、２４ウェルの組織培養プレートに２５０，０００細胞／ウェルで蒔く。２日後に、ウェル中の培地を０．５ｍｌ除去して、ＭＭ−３０２、ＰＬＤ又は遊離ドキソルビシンを１５．０μｇ／ｍｌ（ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）で含む０．５ｍｌと置き換える。プレートを「８の字様」に２０回回転させて細胞のリポソームへの曝露を最大にする。細胞をＭＭ−３０２、ＰＬＤ、又は遊離ドキソルビシンと示された期間培養して、その後培地を除去し、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで一回洗浄する。ＰＢＳを除去して、０．５ｍｌの０．０５％トリプシンを各ウェルに添加する。細胞を観察して、細胞の剥離が始まったら、ＦＢＳを含有している０．５ｍｌの培地を各ウェルに添加してトリプシンを不活性化する。細胞を採取してマイクロ遠心分離管に入れる。細胞を１，５００ｒｐｍで４℃、５分間回転させる。細胞ペレットを１．０％酢酸のメタノール溶液０．５ｍｌ中にボルテックス及びピペッティングすることによって再懸濁し、−８０℃で１時間放置してドキソルビシンを抽出する。再懸濁した細胞ペレットを含有しているマイクロ遠心分離管を低温室で１０分間１０，０００ｒｐｍで回転させて、４５０μｌの上澄液をＨＰＬＣ管に移す。サンプルをＨＰＬＣ機械上で操作してサンプル当りの濃度をドキソルビシンの標準曲線に関連する値によって決定する。
リポソームの生体内分布：
ＰＢＳ、ドキソルビシン、ＭＭ−３０２−ＤｉＩ５、又はＰＬＤ−ＤｉＩ５の何れかを単回静脈内（ｉ．ｖ．）用量（全て３ｍｇ／ｋｇ）で投与されたマウスを、それぞれ４群に無作為に分ける。マウス（ｎ＝４／時点／群）を、単回投与後０．５、４、２４、及び９６時間（ドキソルビシン）又は１６８時間（ＭＭ−３０２−ＤｉＩ５及びＰＬＤ−ＤｉＩ５）に屠殺する。屠殺の５分前に、血管系を標識化するために１００μｌのＦＩＴＣ−レクチンをマウスに注射する。
ドキソルビシンのＨＰＬＣによる定量化：
心臓組織の重さを量り、３分間ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（登録商標）（Ｑiagen）を用いて１ｍｌの水で分離させる。次いで、１００μｌのホモジネートを新しい管に移して１％酢酸／メタノールを９００μｌ添加する。培養細胞に関しては、細胞を、上記のように薬剤で処置し、トリプシン処置して、１．０％酢酸のメタノール溶液を用いて溶解する。溶解物を１０秒間ボルテックスして、−８０℃で１時間放置する。サンプルを室温（ＲＴ）で１０分間、１０，０００ＲＰＭで回転させる。上澄液及びドキソルビシン標準品をＣ１８逆相カラム（Ｓｙｎｅｒｇｉ（登録商標）ＰＯＬＡＲ−ＲＰ（登録商標）８０Å２５０ｘ４．６０ｍｍ ４μｍ カラム）を用いるＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）で分析する。ドキソルビシンは、３０％アセトニトリル；７０％０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏから５５％アセトニトリル；４５％０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏの濃度勾配を流速１．０ｍｌ／分、７分間で走らせて溶出する。ドキソルビシンのピークは、４８５ｎｍで励起され、５９０ｎｍで発光し、インライン蛍光検出器を用いて６．５分に検出される。心臓組織からのドキソルビシンの抽出効率は、既知量のドキソルビシンでスパイクしたコントロールの心臓で測定されるように、８３％であった。
心臓スナップ凍結切片の共焦点顕微鏡及び画像分析：
厚さ１０μｍの心臓切片を室温で３０分間風乾し、封入剤（ＰｒｏＬｏｎｇ(登録商標）Ｇｏｌｄ、Invitrogen）で１：１０，０００に希釈したＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）３３３４２で対比染色して、封入する。スライドを、Ｐｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ（登録商標）４０ｘ／１．３油ＤＩＣ対物レンズを有し、Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ（３５１、３６４ｎｍ）、Ａｒｇｏｎ（４５８、４７７、４８８、５１４ｎｍ）、ＨｅＮｅｌ（５４３ｎｍ）及びＨｅＮｅ２（５９４）レーザーを備えるＬＳＭ５１０Ｚｅｉｓｓ（登録商標）共焦点顕微鏡上で画像化する。画像分析及び核ドキソルビシンの定量化はＤｅｆｉｎｉｅｎｓ（登録商標）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ＸＤ（登録商標）（Definiens, Parsippany, NJ）を用いて実施する。核をＨｏｅｃｈｓｔチャンネルに区分する。ドキソルビシン陽性の核をドキソルビシンチャンネルに区分する。ドキソルビシン陽性の核のパーセントを、Ｈｏｅｃｈｓｔチャンネル中の総核対象物で割ったドキソルビシンチャンネル中の対象物の数の比として定量する。
受容体の定量化：
幹細胞由来の心筋細胞をトリプシン処置し、洗浄して、ＨＥＲ２レベルを上記「ＨＥＲ２を発現している細胞株のリポソームの取り込み」に記載されているようにして測定する。
生存能：
ＥＳＣｄ心筋細胞を３時間指示された濃度のＭＭ３０２、ＰＬＤ及びドキソルビシンで処置する。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新鮮な培地を加えて、細胞を更に２４時間培養する。細胞の生存能を、Promega(Madison, WI）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を用いて評価して生存細胞のパーセントを未処置群と比較して決定する。
トロポニンＩのＥＬＩＳＡ：
１５，０００ｉＰＳｄ（ｉＣＥＬＬ（登録商標））心筋細胞（Cellular Dynamics International, Madison WI）を製造会社のプロトコルに従ってプレートに蒔く。細胞を２４時間指示されている濃度の遊離ドキソルビシン、ＰＬＤ又はＭＭ−３０２で処置する。上澄液を採取して、製造会社のプロトコルに従ってヒトトロポニンＩ ＥＬＩＳＡ（カタログ番号：ＧＷＢ−８３Ａ６１Ｆ、Genway Biotech, San Diego CA）を用いて分析する。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（カタログ番号：Ａ−１３２６１、Invitrogen, Grand Island, NY）が、製造会社のプロトコルに従って１００μｌ中で残っている細胞に対して実施される。
ハイコンテント解析：
心筋細胞を上記のように処置する。３．７％のホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有しているＰＢＳで２回洗浄して、メタノールで透過処理する。ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標）Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Lincoln, NE）とＰＢＳ−Ｔの１：１混合物を用いて細胞を室温（ＲＴ）で１時間ブロックする。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(Berverly, MA）から得られる指示されている一次抗体の１：４００希釈液で細胞を染色して、４℃で１晩振とう培養する。細胞を洗浄して、蛍光標識した二次抗体の１：２，０００希釈液で１時間ＲＴにて培養する。細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の１：１０，０００希釈液及びPierce Protein Research Products（Rockford, IL）から得られるＷｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎの１：１，０００希釈液でＲＴにて３０分間染色して、ＤＮＡと全細胞をそれぞれ可視化する。１０倍対物レンズを有するＡｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡｒｒａｙＷｏｒｘ (登録商標）Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒ（Issaquah, WA）を用いてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２／Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（４６０ｎｍ）、ドキソルビシン（５９５ｎｍ）、及びＡＰＣ／ＤｉＩ５（６５７ｎｍ）についてプレートを走査する。ソフトウェアＩｍａｇｅＲａｉｌを用いて画像を分析する（Millard et al., Nat Methods. 2011;8:487-92 に記載されているように）。核及び全細胞シグナルについて強度閾値を確立する。次いで、この閾値を全画像に適用して区分した個々の細胞に用いる。データは、指示されたチャンネルについて所定のウェル中の全細胞に関する平均画素強度として表わされる。
心筋細胞におけるシグナル伝達：
ｉＰＳ由来心筋細胞（ｉＣｅｌｌ（登録商標）ｉＰＳ由来ヒト心筋細胞−Cellular Dynamics International (CDI), Madison, Wisconsin - CDI # CMC-100-010-001, Lot 1258680）を、ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ｐｌａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ (CDI # CMM-100-110-005, Lot 1013740 ）及び ｉＣｅｌｌ（登録商標） Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍ (CDI # CMM-100-120-005, Lot 1000305) を用いて培養して、ＭＭ−３０２の成分に曝露する。次いで、心筋細胞中のリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）及びリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルを免疫染色及びハイコンテント顕微鏡法を用いて測定する。細胞を、トラスツズマブ、ラパチニブ、又はＭＭ−３０２抗体（Ｆ５−ｓｃＦｖ）のいずれかで、及びドキソルビシンを含有していないＭＭ−３０２の５．０μｇ／ｍｌと等価な濃度のＭＭ−３０２分子（リポソーム）（Ｆ５−リポ）で前処置する。１０ｎＭ及び５ｎＭのヘレグリンでの１０分間の刺激に続いて、（Ａ）ｐＡＫＴ及び（Ｂ）ｐＥＲＫのそれぞれについて上に記載したように細胞を染色し、そしてハイコンテント顕微鏡法を用いて画像化する。以下の一次抗体をブロッキングバッファーで１：４００に希釈して用いる：ｐＥＲＫ抗体−Cell Signaling Technology (CST - Danvers Massachusetts)−Catalog 9106L (Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (E10) Mouse mAb #9106）；ｐＡＫＴ抗体−ＣＳＴ−Catalog 4060L (Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP（登録商標）Rabbit mAb #4060）。二次抗体は、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２断片（Alexa Fluor（登録商標）６４７ Conjugate）−ＣＳＴ−Catalog 4410；抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２断片（Alexa Fluor（登録商標）６４７ Conjugate）−ＣＳＴ−Catalog 4414 である。全細胞染色及びＤＮＡ染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を上記のように用いる。画像を分析して個々の細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２核染色に基づいて区分する。単一細胞のシグナル伝達強度をそれぞれの染色について定量して個々の細胞の平均相対強度として表わす。
以下の実施例の結果は上記の方法又はそれに些細な変更を有する方法を用いて得られた。ＨＥＲ２を種々のレベルで発現する腫瘍細胞株での細胞取り込み試験は、ＭＭ−３０２がＨＥＲ２を過剰に発現している腫瘍細胞にＰＬＤと比べて著しく高いレベルでドキソルビシンを送達すること、高い透過性を有する遊離ドキソルビシンと比べて同等又はより高いレベルで送達することを明らかにしている。しかしながら、ヒト心筋細胞では、遊離のドキソルビシンが高いレベルで再び取り込まれたのに対して、ＭＭ−３０２及びＰＬＤの両方でのドキソルビシンの取り込みは劇的に低かった。マウスにおける薬物動態試験は、ＭＭ−３０２が、ＰＬＤと比較して類似の半減期、クリアランス、及び臓器分布を有していることを明らかにしている。ＨＥＲ２を過剰発現しているＢＴ４７４乳癌及びＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植片において、ＭＭ−３０２は遊離アントラサイクリン及びＰＬＤの両方よりも優れた抗腫瘍活性を示す。腫瘍微小分布研究はさらに、腫瘍におけるドキソルビシンの局在性の差が遊離ドキソルビシン及びＰＬＤと比べたＭＭ−３０２の活性の増大の要因であることを示唆している。
実施例１：インビトロにおけるＨＥＲ２発現とＭＭ−３０２の取り込みの間の相関関係：
多数の細胞株における細胞表面ＨＥＲ２発現のレベルを上記のように確認した。次いでこれらの同じ細胞株を１５μｇ／ｍｌのＭＭ３０２（図１Ａ、表１）又はＰＬＤ（図１Ｂ、表２）で１８０分処置し、その後細胞を採取して細胞に結合しているドキソルビシンの量をＨＰＬＣで定量した。処置後にそれぞれの細胞株について細胞当りのＨＥＲ２受容体の数 対 同一細胞株における細胞当りのドキソルビシンの量をプロッティングすることによって、増大するＨＥＲ２レベルと増大するドキソルビシンの間の関係が明らかになる。この提示により、細胞当り約２００，０００のＨＥＲ２受容体に変曲点があると考えられ、ここでこの数より多くを発現している細胞は一貫してより高いレベルの細胞に結合したドキソルビシン有していると考えられる。纏めると、これらの結果は、変曲点以上のレベルのＨＥＲ２を発現している細胞（ＨＥＲ２過剰発現癌のような）による高い取り込み、及び変曲点以下のレベルのＨＥＲ２を発現している細胞（正常組織の細胞、例えば、心筋細胞のような）には取り込まれないか最小限取り込まれるという、ＭＭ−３０２の特異性を裏付けている。
Figure 0006208582
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異なった細胞集団内への取り込みを定量するために、赤色蛍光性カルボシアニンのトレーサーであるＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳ（Invitrogen D12730−ＤｉＩ５と省略される）を含有するようにＭＭ−３０２を製造した。ＤｉＩ５は押出し工程中にリポソームの脂質二重層内に挿入する脂溶性の蛍光染料である。異なった範囲のヒトＨＥＲ２を発現している４Ｔ１−Ｈｅｒ２細胞集団を１０μｇ／ｍｌの蛍光標識したＭＭ３０２と３時間培養し、洗浄して、更に２１時間培養した。細胞を採取し、細胞表面ヒトＨＥＲ２を染色して、フローサイトメトリーによってＨＥＲ２レベル及びリポソーム結合の両方を分析した。４Ｔ１細胞株はネズミＨＥＲ２を発現するのに対して、ＭＭ−３０２はネズミ受容体と結合しない。図は、これらのリポソームの４Ｔ１への取り込みがヒトＨＥＲ２発現に強く依存していたことを示す（図１Ｃ）。異なった範囲のＨＥＲ２を発現しているＨｅＬａ細胞株の集団について同様な結果が得られた（図１Ｄ）。これらの結果は更に、ＭＭ−３０２は高レベルのＨＥＲ２を有している細胞を非常に有効に結合するが比較的低いＨＥＲ２タンパク質発現を有する細胞とは殆ど結合しないことを明らかにしている。
実施例２：ＭＭ−３０２はＨＥＲ２過剰発現腫瘍細胞内に効率的に内部移行し、そして異種移植モデルにおいて腫瘍の生育を有意に阻害する：
ＭＭ−３０２のＨＥＲ２過剰発現腫瘍細胞への結合及び内部移行のレベルを測定するために、ＢＴ４７４−Ｍ３細胞（１．７×１０６ＨＥＲ２／細胞）を１５μｇ／ｍｌのＭＭ−３０２、ＰＬＤ又は遊離ドキソルビシンと最大３時間培養した（図２Ａ）。総細胞結合（図２Ａ）及び核内ドキソルビシン蓄積（図２Ｂ）から分かるように、ＭＭ−３０２は効果的に腫瘍細胞内に取り込まれた。対照的に、標的化されていない類似物であるＰＬＤは、感知できるほどのいかなる蓄積も示さず、このことはインビトロでリポソームドキソルビシンを効果的に送達するために標的化の必要性を示している。コントロールとしての、遊離ドキソルビシンは自由に細胞に入って核内に蓄積することが示された。結果は、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍細胞へのＭＭ−３０２の効果的な結合及び内部移行を示した。
乳癌の異種移植モデルにおいてＭＭ−３０２の抗腫瘍活性を評価した。マウスにＢＴ４７４−Ｍ３細胞を接種して、腫瘍体積が平均２５０ｍｍ３に達したときに、ＰＢＳ（コントロール）、ＭＭ−３０２又はＰＬＤ（両方とも６ｍｇ／ｋｇ ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）による処置を開始した（ｑ７ｄ、ｎ＝３、用量）。ＭＭ−３０２とＰＬＤの両方はコントロールと比較して有意に腫瘍の生育を阻害した（５５日目のｔ検定；ｐ＜０．０００１）。ＭＭ−３０２はＰＬＤと比較して腫瘍生育のより強い阻害をもたらした（５５日目のｔ検定；ｐ＝０．０３１０）（図２Ｃ）。検討終了時に、３例の完全退行がＭＭ−３０２で観察されたが、ＰＬＤではたった１例であった。ＭＭ−３０２及びＰＬＤは同様な薬物動態プロファイルを有していて（図２Ｄ）、改善された効果は、長期に渡る曝露ではなく、ＨＥＲ２標的化の結果であることを示唆している。
実施例３：インビボにおけるＭＭ−３０２の取り込みに対するＨＥＲ２レベルの影響：
異種移植モデル由来の標的腫瘍細胞内へのＭＭ−３０２のＨＥＲ２介在取り込みを、非標的化リポソームドキソルビシンと比較して明らかにするための実験を行った。乳房脂肪体にＢＴ４７４−Ｍ３異種移植腫瘍を担持しているマウスにＤｉＩ５で標識したＭＭ−３０２（ＤｉＩ５−Ｆ５−ＰＬＤ）又はＵＴ−ＰＬＤ（ＤｉＩ５−ＵＴ−ＰＬ）を注射した。腫瘍の単一細胞懸濁液を調製してＦＩＴＣ−ＨＥＲ２抗体で染色した。ＤｉＩ５陽性−ＨＥＲ２陽性細胞をＦＡＣＳで測定した。上昇したドキソルビシンレベルを有する特徴的な細胞集団が確認され、リポソームは腫瘍間質腔内に蓄積されているばかりではなく、細胞自体の中にも取り込まれていることが示された（図３Ａ）。これはＨＥＲ２標的化リポソームで処置した腫瘍に由来する細胞サンプルにおいて特に明らかだった。上昇したリポソーム含量を有する細胞のパーセントは細胞当り平均１００，０００及び２００，０００のＨＥＲ２受容体を発現する細胞サブセットで上昇し始めた。非標的化リポソームはＨＥＲ２陽性細胞への優先的な取り込みを示さなかった。これらの結果は、インビボにおける腫瘍細胞へのＭＭ−３０２の取り込みがＨＥＲ２依存性であることを明らかにし、さらに細胞当り少なくとも１００，０００〜２００，０００のＨＥＲ２受容体がＭＭ−３０２の有意な結合及び内部移行を可能にするために必要であることを裏付けている。
ＨＥＲ２の膜での強度分布が、全組織切片において単一細胞を基準として測定され、図３Ｂに示されており、これは組織における発現のばらつきを表わしている。
実施例４：ヒト心筋細胞はＭＭ−３０２を活発に取り込むのに十分なレベルのＨＥＲ２を発現しない：
ヒト心筋細胞は低レベルのＨＥＲ２を発現することが報告されているので、ＭＭ−３０２を取り込む可能性を有していると考えられていた。インビトロにおいてヒト心臓細胞に対するＭＭ−３０２の効果を検討するために、ＥＳＣｄ及びｉＰＳｄヒト心筋細胞を入手した。心筋細胞上のＨＥＲ２受容体レベルは、ｑＦＡＣＳによって、ＥＳＣｄ及びｉＰＳｄヒト心筋細胞において、それぞれ細胞当り約７０，０００及び２００，０００受容体であると確認した。これらの結果は、報告されているヒト心臓組織における低いＨＥＲ２発現と一致している（Fuchs et al., Breast Cancer Res Treat. 2003;82:23-8）。
正常及び病変ヒト心臓組織におけるＨＥＲ２の発現レベルを定量的免疫組織化学によって測定した。ヒト心臓組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）をＨＥＲ２に対して及びＤＡＰＩで染色して、（平均ＨＥＲ２強度）／コアをＤｅｆｉｎｉｅｎｓ（登録商標）ソフトウェアを用いて定量した。異なったＨＥＲ２発現レベルの細胞株を用いて細胞ペレットアレイを上記のように染色し、（平均ＨＥＲ２強度）／コアを定量し、対応するＬＯＧ（ＨＥＲ２受容対数）に対してプロットして標準を作成した。作成した標準に基づいて、異なったヒト心臓ＴＭＡコアについて平均ＨＥＲ２受容対数／コアを内挿した（表３）。
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心筋細胞におけるＨＥＲ２発現のレベルがＭＭ−３０２の取り込みを誘発するのに十分であるかを確認するために、ＥＳＣｄ（図４Ａ）及びｉＰＳｄ（図４Ｂ）心筋細胞の処置に続いて、総細胞内ドキソルビシンをＨＰＬＣで定量した。遊離のドキソルビシンで処置した心筋細胞（及び癌細胞）は全ての細胞にドキソルビシン蓄積をもたらした。ＰＬＤによる処置は、何れの心筋細胞の細胞型にもドキソルビシンの送達の増大をもたらさなかった。ＨＥＲ２過剰発現癌細胞と対照的に、心筋細胞におけるＨＥＲ２発現レベルはＭＭ−３０２の活発な取り込みを促進するのに十分ではなかった。纏めると、これらの結果は、ＭＭ−３０２によるドキソルビシンの送達が、ＰＬＤと比べて、心筋細胞のような低いレベルのＨＥＲ２を発現する非標的細胞へのドキソルビシン曝露を増強しないことを明らかにしている。
実施例５：ＭＭ−３０２はヒト心筋細胞の生存能を減少させないか又はアポトーシス応答を刺激しない：
低レベルのドキソルビシンへの曝露は細胞毒性になることがある。ＭＭ−３０２又はＰＬＤによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかどうかを確認するために、ＥＳＣｄ心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、ＰＬＤ又はＭＭ−３０２と３時間培養した後、洗浄して、新鮮な培地と２４時間培養した。遊離のドキソルビシンによる処置は０．２μｇ／ｍｌ程度の低い濃度で生存能の損失をもたらした（図４Ｃ）。反対に、ＭＭ−３０２及びＰＬＤによる処置は、最大４５μｇ／ｍｌの非常に優れた治療濃度を含む、試験した何れの濃度でも生存能の減少をもたらさなかった。ＭＭ−３０２又はＰＬＤによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかを更に試験するために、ｉＰＳｄ心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、ＰＬＤ又はＭＭ−３０２で２４時間処置した。ドキソルビシンによる処置はＰＬＤ及びＭＭ−３０２による処置と比べて生存能の顕著な減少をもたらした（図４Ｄ）。上昇したレベルの心臓トロポニンの存在は心臓障害の臨床指標である。（Ｄ）におけるｉＰＳｄ心筋細胞由来の上澄液をトロポニンＩのレベルについて分析した。図４Ｅに示されるように、ドキソルビシン処置はＰＬＤ又はＭＭ−３０２による処置と比べてトロポニンＩの顕著な増大をもたらした。これらの結果は、ＥＳＣｄ及びｉＰＳｄ心筋細胞がドキソルビシンに対して感受性があること、及びＭＭ−３０２及びＰＬＤによる処置は心筋細胞の生存能に影響を与えるのに十分なドキソルビシン曝露をもたらさないことを明らかにしている。
細胞の低レベルのドキソルビシンへの曝露は、ＤＮＡ損傷、細胞ストレス及び初期アポトーシスを含む、細胞生存能測定では明らかにできない僅かな細胞変化を誘発する可能性がある。ＭＭ−３０２、ＰＬＤ及び遊離ドキソルビシンによる処置に続いて、それらの応答経路のそれぞれにおいてタンパク質で染色して、ハイコンテント顕微鏡を用いて画像化した。ＩｍａｇｅＲａｉｌを用いて得られた画像を分析して単一細胞のデータを作成した。
二本鎖ＤＮＡ損傷に応答して、ヒストンＨ２ＡＸはリン酸化されて、γ−Ｈ２ＡＸを形成する。心筋細胞の遊離ドキソルビシンによる処置は、核γ−Ｈ２ＡＸの用量依存性増大をもたらした（図５Ａ）。しかしながら、ＭＭ−３０２及びＰＬＤによる処置は試験した何れの濃度においても核γ−Ｈ２ＡＸシグナルを増大させず、リポソームカプセル化がインビトロにおいて心筋細胞のＤＮＡ損傷を阻害したことを示唆している。
細胞ストレスに応答して、ＨＳＰ２７及びｐ５３はリン酸化されて、損傷の程度に応じて細胞周期停止、続いてＤＮＡ修復又はアポトーシスを引き起こす。遊離ドキソルビシンに曝露された心臓細胞は、処置に続く細胞ストレスの誘発を示唆しているリン酸化ＨＳＰ２７及びリン酸化ｐ５３の用量依存性増大を明らかにしている（図５Ｂ及び５Ｃ）。しかしながら、濃度に関わらずＭＭ−３０２又はＰＬＤの何れかで処置した細胞ではリン酸化ＨＳＰ２７の増大は観察されなかった。多くの場合、ＭＭ−３０２又はＰＬＤで処置した細胞においては、５．０μｇ／ｍｌのＭＭ−３０２による処置に続くリン酸化ｐ５３の僅かな増大を除いて、リン酸化ｐ５３に対する影響はないと考えられた。しかしながら、この濃度及びより高い濃度での処置は細胞死を引き起こさなかった。
重度のＤＮＡ損傷及び細胞ストレスの場合は、細胞はカスパーゼカスケードの活性化を含むアポトーシス経路を開始して、最終的にはＤＮＡ修復タンパク質ＰＡＲＰの切断を引き起こす。遊離ドキソルビシン５．０μｇ／ｍｌによる処置は、観察された細胞死の増大と相関する、核の切断された（cleaved）ＰＡＲＰ（ｃＰＡＲＰ）の増大を引き起こした（図５Ｄ）。しかしながら、ＭＭ−３０２及びＰＬＤによる処置は核ｃＰＡＲＰの増大を引き起こさず、これらの条件下での処置がアポトーシスを誘発するのには十分ではないことを示唆した。
実施例６：心筋細胞の細胞内シグナル伝達に対するＨＥＲ２標的化薬剤の影響：
ドキソルビシンとトラスツズマブの併用は、この組み合わせで治療された患者で観察された心臓事象の受入れ難い高発生率により禁忌である。この組み合わせに関連する心臓毒性の作用メカニズムは、ドキソルビシンによる細胞ストレスの誘発と、ドキソルビシンによって誘発された細胞ストレスへの応答に必要とされるＨＥＲ２シグナル伝達経路のトラスツズマブ介在性の阻害による細胞ストレスの誘発とが、同時に起こることであると考えられる。
ＭＭ−３０２による前処置がＨＥＲ２の介在するシグナル伝達（心筋細胞における必須経路）を変化させるか否かを確認するために、ｉＰＤｄ心筋細胞をトラスツズマブ、ラパチニブ（小分子のＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤）、又はＭＭ−３０２抗体（Ｆ５−ｓｃＦｖ）及びドキソルビシンを含有していないことを除いてＭＭ−３０２と同一の空リポソーム（Ｆ５−ｌｉｐｏ）で２４時間前処置した。１０ｎＭ（図６Ａ）及び５ｎＭ（図６Ｂ）のヘレグリン（ＨＲＧ）で１０分間刺激した後、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ、図６Ａ）及びリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ、図６Ｂ）のレベルを上記のようにハイコンテント顕微鏡法で測定した。トラスツズマブによる２４時間の前処置は両タンパク質のＨＲＧ介在性のリン酸化の減少をもたらした。ラパチニブによる前処置はＡＫＴとＥＲＫの基礎リン酸化の減少、さらにはこれらタンパク質のＨＲＧ誘発性のリン酸化の完全阻害をもたらした。Ｆ５−ｌｉｐｏでの前処置はＡＫＴ又はＥＲＫのＨＲＧ誘発性のリン酸化を阻害しなかった。これらの結果は、ＨＥＲ２を標的にしているのにも関わらず、ＭＭ−３０２は、心筋細胞におけるリガンドによって誘発されるリン酸化ＡＫＴ及びリン酸化ＥＲＫのシグナル伝達を阻害せず、これらの重要な意味をもつシグナル伝達経路を機能的なままにしておくことを示唆している。
これらの結果は、トラスツズマブ及びラパチニブが、Ｆ５ｓｃＦｖ又はＦ５ｌｉｐｏよりも、心筋細胞におけるこのシグナル伝達経路に対して有意に大きな悪影響を有していることも示している。これは同様に、ＭＭ−３０２の抗ＨＥＲ２抗体成分が、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブより心臓毒性が低いことを示している。この結果は、単独の又はＭＭ−３０２リポソームの外側に結合しているＦ５が、必須の細胞内シグナル伝達様式であり、その阻害はトラスツズマブ誘発性の心臓毒性を仲介する主要なメカニズムであると考えられている、ヘレグリン（リガンド）によって刺激されるＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体が介在するシグナル伝達を心筋細胞において妨害しないことを示している。
実施例７：ＭＭ−３０２はマウス心臓組織内に、遊離ドキソルビシンと比べてより低い蓄積を有している：
Ｆ５のような特異性の高い抗体断片を有するリポソームの標的化は、一般に、リポソームの総組織沈着を変化させず、むしろ血管外溢出に続くそれらの微小分布を変化させる。ＭＭ−３０２（四角）、ＰＬＤ（ＵＴ−ＰＬＤ、三角）及びドキソルビシン（遊離ｄｏｘ、丸）のマクロレベル生体内分布を、上記のように接種したＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍担持マウスのマウス心臓組織（図７Ａ）、ヒト異種移植腫瘍組織（図７Ｂ）及び足組織（図７Ｃ）において比較した。マウス（ｎ＝４／時点／群）にＭＭ−３０２、ＰＬＤ、又は遊離ドキソルビシン（全て、３ｍｇ／ｋｇ、ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）を静脈内注射して、注射後０．５、４、２４、及び９６時間（ドキソルビシンに関して）又は１６８時間（ＭＭ−３０２及びＰＬＤに関して）に心臓を採取して、ドキソルビシンをＨＰＬＣで定量した（図７Ａ）。遊離ドキソルビシンの注射は２つのリポソーム製剤と比べて０．５時間目に心臓に高いピークの曝露をもたらした（注射した用量（ｉ．ｄ．）／組織ｇの１０％）。遊離ドキソルビシン注射後の心臓組織からのドキソルビシンのクリアランスはＭＭ−３０２及びＰＬＤと比べてより速く、そして２４時間におけるドキソルビシンの検出量（ｉ．ｄ．／組織ｇの０．７７％）はバックグラウンドに接近していた。ＭＭ−３０２とＰＬＤの両方は２４時間がピーク（ＭＭ−３０２とＰＬＤがそれぞれ２．８％と２．６％）である持続した蓄積プロファイルを有したが、１６８時間目に値はバックグラウンドに戻った。これらの結果は別のＰＬＤ製剤の心臓生体内分布について先に報告されたデータのそれと類似の範囲内であった。ＭＭ−３０２とＰＬＤの心臓生体内分布の間に有意な差異は観察されなかった。
実施例８：ＭＭ−３０２はマウス組織において遊離ドキソルビシンと比べてより低い核内ドキソルビシン蓄積をもたらす：
遊離ドキソルビシン、ＭＭ−３０２−ＤｉＩ５又はＰＬＤ−ＤｉＩ５の何れか（全て３ｍｇ／ｋｇ ｄｏｘ ｅｑｕｉｖ．）を注射したマウスの注射後０．５、４及び２４時間の心臓組織から作成した凍結切片において、ドキソルビシン（自然蛍光性）及びリポソーム（ＤｉＩ５標識化）の微小分布を分析した。心臓血管を可視化するために、屠殺前５分にマウスにＦＩＴＣレクチンを静脈内注射した。心臓切片を蛍光共焦点顕微鏡で画像化した。３時点で分析した（０．５、４及び２４時間）異なる処置群の代表的な領域を図７Ｄに示す。非処置心臓も画像化して、代表的な画像を図７Ｄ（左図）に示す。ドキソルビシンと核シグナルとの共局在化を図７Ｄの下図に示す。０．５時間時点におけるドキソルビシンとＭＭ−３０２の両方についての、核ドキソルビシンシグナルの高倍率画像を図７Ｅに示す。ＭＭ−３０２では核内にドキソルビシンシグナルが見えないのに対して、遊離ドキソルビシンでは大部分の核がドキソルビシン陽性である。画像を上記のように分析して、ドキソルビシン陽性核のパーセントを確認した。遊離ドキソルビシンの注射は０．５時間時点で、約５０％の核がドキソルビシンに陽性を示し、ドキソルビシンの顕著な核内蓄積をもたらした。しかしながら、４時間までにはわずか２３％の核がドキソルビシンに対して陽性であって、２４時間時点でシグナルは基底レベル内に戻った。
リポソーム製剤では、多くの視野でシグナルが殆ど又は全く検出されなかった。ＤｉＩ５チャンネル（リポソーム）でシグナルがたまに検出された。これらの場合は、リポソームのシグナルは大部分がＦＩＴＣレクチンシグナルと共局在化していて、リポソームが心臓組織内に侵出していないが血管成分に保持されていることを示している。ＭＭ−３０２−ＤｉＩ５又はＰＬＤ−ＤｉＩ５で処置すると、時点に関係なく、分析した大部分の心臓領域の核内にドキソルビシンは検出されなかった。０．５時間時点に採取した４つのＭＭ−３０２−ＤｉＩ５心臓のうちの１つにおいて及び４時間時点に採取した４つのＭＭ−３０２−ＤｉＩ５心臓のうちの１つにおいて、血管外スペースにリポソームシグナルが検出され、そしてわずかな割合の核にドキソルビシンが見出された。同様に、０．５時間時点に採取した４つのＰＬＤ心臓のうちの１つにおいて及び２４時間時点に採取した４つのＰＬＤ心臓のうちの２つにおいて、画像が血管外リポソームシグナル及び核ドキソルビシンの存在を明らかにした。これらの領域は代表的な画像として表わされていないが、これらの値は図７Ｆに示される定量化に関して考慮されている。ＭＭ−３０２とＰＬＤの両方の曲線下領域は遊離ドキソルビシンＡＵＣより統計的有意に低かった（ｐ＜０．００１）。ＭＭ−３０２とＰＬＤのＡＵＣの間に有意な差異は観察されなかった。
心臓組織におけるドキソルビシン及びリポソームの分布の広範な可視化を得るために、全心臓切片のスキャンを行った。全心臓切片スキャンは、共焦点顕微鏡の結果を可視的に確認して、遊離ドキソルビシン注射による核局在化を有する広範なドキソルビシン分布を示し、ＤｉＩ５ＭＭ−３０２又はＤｉＩ５ＰＬＤの何れかを注射したマウスの心臓内に極めてまれにリポソーム及びドキソルビシンシグナルを示している。
要約すると、ＭＭ−３０２又はＰＬＤの何れかでの処置は、遊離ドキソルビシンによる処置後に見られるものより有意に低い核内ドキソルビシン蓄積を示す一方で、これはＭＭ−３０２とＰＬＤの間では有意に異なっていなかった。
（均等物）
当業者は、本明細書に記載されている特定の実施態様の多くの均等物を確認するか、通常の実験以上のものを用いずに評価及び実施できるだろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。従属クレームに開示されている実施態様の何れかの組み合わせは本開示の範囲内であることが意図されている。
（参照による取り込み）
本明細書中に言及されている米国及び外国の特許及び係属中の特許出願、並びに刊行物はその全てが参照により本明細書に明確に取り込まれている。

Claims (7)

  1. ＨＥＲ２標的化免疫リポソームとして製剤化されるドキソルビシンを１回分の量である３０ｍｇ／ｍ ２ で提供するように製剤化された、封入されたドキソルビシンを含有するＨＥＲ２標的化免疫リポソームを含有してなる医薬組成物であり、
    ここで、ドキソルビシンを封入するＨＥＲ２標的化免疫リポソーム組成物は、滅菌した１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）及び１０％スクロース中で製剤化され、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミンからなる脂質膜を含有してなり、該ＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミンはリン脂質分子２００に対してＰＥＧ分子約１つの量を有しており、
    脂質膜のリン脂質分子１７８０につき約１つのＰＥＧ鎖が、その末端にＨＥＲ２に結合するＦ５単鎖Ｆｖ抗体断片を有し、
    膜によって封入される水性スペースが、リン脂質１モルあたりドキソルビシン１３０〜１７０ｇを含み、
    それぞれのリポソームが、その表面にＨＥＲ２に対するＦ５単鎖Ｆｖ抗体を平均で４５コピー担持し、
    該医薬組成物が、ヒトの癌を治療するために３週間に１回投与される、
    細胞あたり約２００，０００個以上のＨＥＲ２受容体の発現によって特徴付けられるヒトの癌を治療するための医薬組成物。
  2. ＨＥＲ２標的化免疫リポソームに封入されたドキソルビシンが、ドキソルビシン硫酸塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 癌が、乳癌、カポジ肉腫、卵巣癌、又は多発性骨髄腫である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. ＨＥＲ２受容体の発現によって特徴付けられる癌が、更にＨＥＲ２２＋、ＨＥＲ２３＋又はＨＥＲ２ ＦＩＳＨ陽性であると特徴付けられる、請求項１〜３の何れか一項に記載の医薬組成物。
  5. ドキソルビシンを封入するＨＥＲ２標的化リポソームとして製剤化された３０ｍｇ／ｍ ２ のドキソルビシンの投与が、非標的化リポソ−ム組成物として製剤化された３０ｍｇ／ｍ ２ のドキソルビシンの投与と比較して、心臓毒性の増大を引き起こさない、請求項１〜４の何れか一項に記載の医薬組成物。
  6. ドキソルビシンを封入するＨＥＲ２標的化リポソームとして製剤化された３０ｍｇ／ｍ ２ のドキソルビシンの患者への投与が、患者の血流中に免疫リポソームのピーク濃度をもたらし、
    ここで、ほぼ該ピーク濃度で免疫リポソームを含有する培地中で培養することによりインビトロでヒト心筋細胞を処置することが、免疫リポソームを含有しない培地で培養したコントロールのヒト心筋細胞と比較して、培養された心筋細胞中のｐＥＲＫ又はｐＡＫＴのヘレグリン刺激による増大を減少させないか、又は５％未満減少させる、
    請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
  7. ドキソルビシンを封入するＨＥＲ２標的化リポソームを投与されたときの患者の血流中の免疫リポソーム濃度が、血清の免疫リポソーム濃度として測定される、請求項６に記載の医薬組成物。
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