KR20140041396A - 안트라사이클린 화학요법제를 포함하는 erbb2-표적 면역리포좀으로의 치료에서 심장독성을 예방하기 위한 용량 및 투여 - Google Patents

안트라사이클린 화학요법제를 포함하는 erbb2-표적 면역리포좀으로의 치료에서 심장독성을 예방하기 위한 용량 및 투여 Download PDF

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조셉 쥐. 레이놀즈
케니쓰 제이. 올리비에
바트 에스. 헨드릭스
토마스 위컴
슈테판 클린츠
엘레나 게레티
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메리맥 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 HER2 표적 안트라사이클린 함유 면역리포좀의 용량을 결정하는 방법을 기술하였으며, 이렇게 결정된 용량을 사용하여 HER2 양성 종양을 갖는 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 투여시, 이 용량은 비면역리포좀(비표적화) 안트라사이클린 함유 리포좀 표준 용량의 저심근독성 프로필을 갖는다.

Description

안트라사이클린 화학요법제를 포함하는 ERBB2-표적 면역리포좀으로의 치료에서 심장독성을 예방하기 위한 용량 및 투여{DOSAGE AND ADMINISTRATION FOR PREVENTING CARDIOTOXICITY IN TREATMENT WITH ERBB2-TARGETED IMMUNOLIPOSOMES COMPRISING ANTHRACYCLIN CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2010년 12월 6일 출원된 미국 가출원 제61/420,225호, 2010년 12월 7일 출원된 미국 가출원 제61/420,688호 및 2011년 3월 4일 출원된 미국 가출원 제61/449,602호에 대한 우선권 및 혜택을 주장한다. 이들 각 출원들의 내용은 본 명세서에 전체로 참조로서 포함된다.
연방 지원 연구 및 개발 하의 발명에 대한 권리와 관련한 진술
적용되는 바 없음
"서열목록", 표, 또는 컴팩트 디스크로 제출된 컴퓨터 프로그램 리스팅 부속물에 대한 참조
적용되는 바 없음
안트라사이클린은 수십년간 유효한 주력 암 치료제로 사용되어 왔다. 유방암에 있어 안트라사이클린-기초 치료 요법은 일관된 임상적인 이점이 관찰되어 왔음에도 불구하고, 이러한 치료에 수반되는 급성 및/또는 만성 심장 부전과 같은 심각한 부작용으로 인해 더욱 광범위하게 치료학적으로 사용되는 것이 제한되어 왔다. 리포좀 독소루빈신 제형들이 어느 정도 심장독성을 감소시키는데 성공하였으나, 이들 제형들은 명쾌한 효능 이점을 입증하는데 실패하였고 손-발바닥 홍반성 이상증후군(palmar-plantar erythrodysesthesia; hand foot syndrome)과 같은 다른 독성을 나타낼 수 있다. 현재 입수가능한 안트라사이클린의 효능을 개선하려는 노력으로, 독소루비신을 HER2 (ErbB2)-과발현 암 세포에 표적하는 새로운 면역리포좀 제형, MM-302가 제조되었다. HER2-매개 시그널링의 차단없이 HER2에 결합하는 항체 단편이 페질화된(pegylated) 리포좀 독소루비신의 외부 표면에 커플링된다.
독소루비신(dox)은 다양한 암치료에 사용되는 안트라사이클린 화학요법제이다. 독소루비신의 사용은 약물의 심장독성에 의해 용량-제한적이다. 이 문제를 해결하기 위해, 독소루비신은 페질화된 리포좀 제제로 제형화되었다. 약물의 리포좀 캡슐화는 강력한 심장독성약물을 개선된 치료계수 또는 치료적 창으로 송달하는 것을 가능하게 한다. 독소루비신 HCl 리포좀 주사(독실(DOXIL)®)는 독소루비신의 페질화된 리포좀-캡슐화 (리포좀) 형태이다. 독실은 페질화된 리포좀 독소루비신(PLD)의 상업화 형태이다. 독실은 독소루비신의 조직 분포 및 파마코키네틱 프로파일을 변경시킨다. 독실의 사용은 안트라사이클린 치료경험이 없고 기치료된 환자에 있어서 양 약물 단독 및 트라스투주맵(trastuzumab)과의 병용시, 자유 독소루비신에 의한 치료에 비교하여 상당히 더 낮은 비율의 좌심실 심장 부전 및 증상적 울혈심부전을 결과한다. 독실®은 카포시 육종, 난소암 및 다발성 골수종의 치료에 승인되었다. 독소루비신HCl 리포좀 주사는 또한 케릭스(CAELYX)®로 시판되고 있다.
면역리포좀은 항체(통상 항체 단편) 표적 리포좀이며, 이들은 비-면역리포좀 제제에 대해 이점을 제공하는데 항체에 의해 표적되는 세포 표면항원을 갖는 세포에 의해 선택적으로 내재화되기 때문이다. 이러한 항체 및 면역리포좀은 예를 들어, 하기 미국 특허 및 특허출원: US 제2010-0068255호, 제6,214,388호, 제7,135,177호, 및 제7,507,407호 ("Immunoliposomes that optimize internalization into target cells"); 제6,210,707호 ("Methods of forming protein-linked lipidic microparticles and compositions thereof"); 제7,022,336호 ("Methods for attaching protein to lipidic microparticles with high efficiency") 및 US 제2008-0108135호 및 제7,244,826호 ("Internalizing ErbB2 antibodies")에 기술되어 있다. 후술하는 US 및 국제특허 및 특허출원은 이 개시와 관련된 어세이, 세포주 및 관련된 기술을 기술한다: US 제7,846,440호 ("Antibodies against ErbB3 and uses thereof") 및 US 제12/757,801호, PCT/US2009/040259, 및 PCT/US2009/60721 ("Human Serum Albumin Linkers and Conjugates Thereof").
면역리포좀 표적 ErbB2 (HER2)는 전술한 특허 개시내용에 따라 제조될 수 있다. 이러한 HER2 표적 면역리포좀은 F5 항-HER2 항체 단편을 포함하고 독소루비신을 함유하는 MM-302를 포함한다. MM-302는 리포좀당 45 카피의 포유류-유래 F5-scFv(항-HER2)를 함유한다. F5-scFv는 HER2 시그널링에 영향을 미치지 않으면서 내재화되는 능력으로 인해 선택되었다. F5-scFv의 특성화 결과, 이는 마우스, 래트 또는 토끼 HER2와 교차 반응하지 않으며, 자유 scFv 형태에서 HER2 시그널링을 저해하지 않는다. 심근세포는 HER2를 발현하는 것으로 알려져 있기 때문에, MM-302 및 관련된 HER2-표적 면역리포좀의 잠재적 심장독성에 관해 우려가 표명되어 왔다.
상업적 시판 리포좀 독소루비신의 용량 및 투여:
독실®(독소루비신 HCl 리포좀 주사)은 예시적인 리포좀 안트라사이클린 화학요법제이다. 독실은 통상 mg/m2로 표시되고 독소루비신 HCl 당량(독소루비신 당량(dox equiv.), 즉 각 용량에서 독소루비신의 총 질량을 의미함)으로 특징화된 용량으로 정맥 투여된다. 각 용량은 통상 수주로 측정된 간격으로 투여되어, 매 y 주 마다 x mg/m2 (독소루비신 당량)의 용량이 된다. 제1 리포좀 독소루비신 용량은 통상 주입-관련된 반응의 위험을 최소화하기 위해 1 mg/min의 초기속도로 투여된다. 만약 주입-관련된 부작용이 관찰되지 않으면, 통상 주입속도를 증가시켜 한시간에 걸쳐 약물 투여가 완료되게 한다.
난소암 환자:
독실은 통상 난소암 환자에 50 mg/m2 독소루비신 당량의 용량으로 정맥 투여된다. 환자가 진전되지 않고 심장독성의 증거를 나타내지 않으며 치료를 견딜수 있는 한, 통상 매 4주에 한번씩 투여된다. 최소한 4 코스가 추천되는데, 임상 시험에서 반응에 대한 중간 시간이 4개월이었기 때문이다. 손-발 증후군(HFS), 구내염 또는 혈액학적 독성과 같은 부작용을 관리하기 위해, 상기 용량은 지연되거나 감소될 수 있다. 진토제의 전처리 또는 동시사용도 고려되어야 한다.
AIDS-관련 카포시 육종(KS) 환자:
독실은 통상 KS 환자에 20 mg/m2(독소루비신 당량)의 용량으로 정맥 투여된다. KS 환자에 있어 이 용량은 통상 환자반응이 만족스럽고 치료를 견딜수 있는 한, 매 3주에 한번씩 반복된다.
다발성 골수종 환자:
다발성 골수종 환자를 치료하기 위해, 독실은 벨케이드®(보르테조밉)과 함께 투여된다. 보르테조밉은 매 3주마다 1, 4, 8 및 11일에 1.3 mg/m2의 용량으로 정맥내 대량주사(intravenous bolus)로 투여된다. 독실은 통상 이들 환자에 각 4일 보르테조밉 투여에 후속하여 1-hr 정맥 주입으로 30 mg/m2의 용량으로 투여된다. 환자는 통상 질병 진전이나 허용할 수 없는 독성 발현이 있을 때까지 8 사이클까지 처치된다.
허셉틴®(트라스투주맵)은 HER2 과발현 암을 치료하는데 광범위하게 사용되는 치료적 항-HER2 항체이다. 트라스투주맵의 중요한 용량-제한 효과는 심장독성이다. 심근세포는 HER2를 발현하는 것으로 알려져 있으며, 트라스투주맵-매개 심장독성은 일반적으로 트라스투주맵의 심근세포-발현 HER2에의 결합에 기인되는 HER2-발현 심근세포의 손상으로 유발되는 것으로 받아들여지고 있다(예를 들면, Hysing J and Wist E, "Cardiotoxic Effects of Trastuzumab," Tidsskr Nor Laegeforen, 2011 Nov 15;131(22):2239-2241 참조). 독소루비신과 같은 안트라사이클린은 용량-제한적인 심장독성 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 이는 이들의 사용에 있어 중요한 제한으로 간주된다(예를 들어, Sawyer et al., "Mechanisms of Anthracycline Cardiac Injury: Can we identify strategies for cardio-protection?" Prog Cardiovasc Dis., 2010 Sep-Oct;53(2): 105-13 참조).
독소루비신-유도 심장 손상은 비가역적이며, 급성 손상 및 치료후 몇년 후에 발현되는 손상을 일으킨다. 550 mg/m2 을 초과하는 독소루비신의 누적 농도에 노출되는 경우 심근병 및 심부전의 위험성이 증가한다. HER2-양성 유방암의 치료를 위한 HER2-관련 치료의 발전은 독소루비신 및 트라스투주맵 조합의 임상적 혜택의 연구로 이끌었다. 독소루비신 플러스 트라스투주맵의 임상적 효능은 파클리탁셀 플러스 트라스투주맵의 임상적 효과에 비해 우월하였다; 그러나, 연구의 독소루비신 암(arm) 플러스 트라스투주맵에 관찰되는 심장 독성 빈도의 증가가 있었으며, 이 조합은 시판 허가되지 않았다. 안트라사이클린-기초 치료의 특히 HER2-양성 유방암 치료에 있어 임상적 혜택은 여전히 논쟁이 되고 있다.
약물의 리포좀 캡슐화는 강력한 심장독성 약물을 개선된 치료계수로 송달하는 것을 가능하게 한다. 페질화된 리포좀 독소루비신(PLD)은 독소루비신의 조직 분포 및 약물동력학적 프로파일을 변경시킨다. PLD는 안트라사이클린 치료경험이 없고 기치료된 환자에 있어서 양 약물 단독 및 트라스투주맵과의 병용시, 종래의 독소루비신에 의한 치료에 비교하여 상당히 더 낮은 좌심실 심장 부전 및 증상적 울혈심부전을 나타내었다. PLD의 감소된 심장독성에 대한 제안된 기전은 종래의 독소루비신에 비해 더 큰 크기가 심장의 내피 장벽을 건너는 것을 방지함으로써 심장조직에 대한 독소루비신 노출을 최소화하는 것이다.
MM-302는 HER2-과발현 암에 직접 독소루비신을 송달하도록 디자인된 HER2-표적 페질화된 리포좀이다. HER2-표적 PLD는 PLD와 유사한 증강된 침투성 및 보유 효과를 통해 암에 침착한다. 암 미세환경에서, HER2-표적 PLD로 HER2-과발현 세포를 표적하는 것은 전임상 모델에서 PLD에 비해 우수한 효능을 나타낸다. MM-302 개발 동안 HER2-표적화로 인해 MM-302가 심장독성인 독소루비신을 직접 심근세포에 송달하여 독소루비신 HCl 리포좀 주사에 비교하여 심장독성이 증가될 것이라는 우려가 허가 기관에 의해 표명되었고 이러한 생명을 위협하는 독성을 피하기 위해 MM-302의 용량 감소가 제안되었다.
본 발명은 항-HER2 면역리포좀 안트라사이클린을 HER2-발현 암들의 치료에 안전하게, 예를 들어 독소루비신 HCl 리포좀 주사(독실)에 비해 심장독성 위험의 증가없이, 사용하는 방법 및 안전한 용량을 결정하는 방법 및 기타 이점을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이제 항-ErbB2 표적화된 안트라사이클린-함유 면역리포좀, 예를 들어 MM-302는 더이상 독소루비신 HCl 리포좀 주사(독실®)보다 더 심장독성이 아니며, 심장독성의 위험 증가나 효능의 감소없이 독소루비신 HCl 리포좀 주사에 사용된 것과 정확히 같은 용법(즉, 용량 및 투여량 및 스케쥴)을 사용하여 투여될 수 있음을 발견하였다. 나아가, 이제 MM-302는 시험관 내 및 생체 내에서 세포당 200,000 이상의 ErbB2 (HER2) 리셉터를 발현하는 세포에 효과적으로 표적화될 수 있으며, 이는 HER2 "3+"(예를 들면 HERCEPTEST®에 의해), HER2 FISH+ (HER2 유전자 증폭을 위한 제위치 혼성화에서의 형광) 또는 HER2 "2+" (예를 들면, HERCEPTEST에 의해)인 HER2-과발현 암 환자를 치료하는데 사용될 수 있음을 가리킨다.
따라서, 본 명세서에서 개시된 것은 안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀의 투여에 의해 HER2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암으로 진단된 인간 암환자를 치료하는데 사용되는 안전하고 효과적인 용량을 결정하는 방법이며, 이 방법은 HER2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암으로 진단된 환자에 대한 투여량 및 투여 빈도를 나타내는 제1 용량을 결정하고(여기에서 제1 용량은 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제에 대한 것으로, 이것은 리포좀 안트라사이클린 화학요법제의 안전하고 유효한 양을 환자에게 제공하도록 결정된다); 안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀의 투여를 위한 용량을 결정하는 단계를 포함하며, 이 면역리포좀의 다수는 각각 그 표면에 다수의 항-HER2 항체 분자를 가지며 각각 안트라사이클린 화학요법제를 함유하고, 안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀 투여를 위한 안전하고 유효한 용량은 제1 용량이다.
또한 안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀의 투여에 의해 인간 암환자를 치료하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 HER2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암으로 진단된 환자에 대한 투여량 및 투여 빈도를 나타내는 제1 용량을 결정하고, 여기에서 제1 용량은 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제을 위한 것으로, 리포좀 제제의 안전하고 유효한 함량을 환자에게 제공하도록 결정되며; 안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀을 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 이 면역리포좀의 다수는 각각 그 표면에 다수의 항-HER2 항체 분자를 가지며 각각 안트라사이클린 화학요법제를 함유하고, 안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀은 환자에게 제1 용량으로 투여된다.
일부 양태에서 안트라사이클린은 독소루비신이다. 다른 양태에서 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제는 독소루비신 HCl 리포좀 주사이며 HER2-표적 면역리포좀은 MM-302이다. 다른 양태에서, 암은 유방암, 카포시 육종, 난소암 또는 다발성 골수종이다. 또 다른 양태에서, 제1 용량은 매 2주 또는 매 3주 또는 매 4주마다 50 mg/m2, 40 mg/m2, 30 mg/m2, 20 mg/m2, 또는 10 mg/m2이다. 다른 양태에서 HER2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암은 추가로 HER22 +, HER23 +, 또는 HER2 FISH 양성인 것을 특징으로 한다. 다른 양태에서 ErbB2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암은 추가로 세포당 평균 적어도 200,000 세포 표면 ErbB2 리셉터를 발현하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 제1 용량에서의 면역리포좀의 투여는 암 치료에 효과적이며, 다른 양태에서 제1 용량에서의 면역리포좀의 투여는 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제의 제1 용량에서의 투여와 비교시 증가된 심장독성을 초래하지 않는다. 다른 양태에서, 제1 투여량에서의 면역리포좀의 환자에의 투여는 환자의 혈류에서 면역리포좀의 피크 농도를 나타내며, 이러한 약 피크 농도의 면역리포좀을 함유하는 배지에서 시험관 내 배양에 의해 인간 심근세포를 처리하는 것은 면역리포좀이 없는 배지에서 배양된 대조 인간 심근세포와 비교시 배양된 심근세포에서 헤레굴린-자극 pERK 또는 pAKT의 증가를 감소시키지 않거나 또는 5% 이하로 감소시킨다. 다른 양태에서 환자 혈류내 면역리포좀 농도는 혈청 면역리포좀 농도로서 측정된다. 다른 양태에서 각 HER2 면역리포좀은 그 표면에 평균 45개의 항-HER2 항체 분자를 갖는다.
도 1은 흡수에 대한 Her2 수준의 효과를 도시한 것이다: 다양한 수준의 HER2를 발현하는 다중 세포주들을 15 μg/ml의 MM-302 (도 1a) 및 비표적 페질화된 리포좀 독소루비신(UT-PLD) (도 1b)로 2시간동안 처리하고 전체 세포 독소루비신을 HPLC로 정량하였다. y축은 세포당 펨토그램 독소루비신(좌측) 및 세포당 리포좀(우측)을 나타내고 x축은 세포당 HER2 리셉터수(로그 스케일)를 나타낸다. 마우스 암 4T1 세포(도 1c) 및 내인적으로 낮은 HER2 발현 HeLa 세포(도 1d)를 인간 HER2로 트랜스펙션하여 다양한 발현 수준을 갖는 안정한 클론을 생성하였다. 각 클론(삼각형, 원 또는 사각형으로 표시)들은 형광 마커를 함유하는 F5-표적화 리포좀(DiI5-F5-PL)으로 처리하고, 전체 결합/흡수를 FACS로 측정하였다.
도 2a는 HER2-과발현 BT474-M3 세포를 15 μg/ml의 MM-302 (원), PLD (사각형), 및 자유 독소루비신(삼각형)으로 지시된 시간(x-축, 분)동안 처리하고, 전체 세포 독소루비신을 HPLC로 정량하여 나타낸 것이다(y-축, 펨토그램/세포). 도 2b는 표시된 인큐베이션 시간(x-축, 분)에 24 h 후속하여 핵 독소루비신 송달을 하이콘텐트 현미경으로 정량하여 나타낸 것이다 (y-축, 배경을 초과하는 세포당 시그널). 도 2c는 BT474-M3 동소 유방암 모델에서 MM-302 및 PLD의 항암 활성을 비교하여 도시한 것이다. MM-302 (사각형) 및 PLD (삼각형)는 모두 대조(원)에 비해 상당히 암 성장을 저해하였다 (55일의 t-test; p<0.0001). MM-302는 PLD에 비해 더 강한 암성장 저해를 나타내었다(55일의 t-test; p=0.0310). y축은 종양 부피(mm3)를 나타내며 x축은 접종후 일수를 가리킨다. 도 2d는 매7일마다 3 mg/kg 또는 6 mg/kg (독소루비신 당량)을 투여한 BT474-M3 이종이식에서 MM-302 및 UT-PLD의 약물동력학을 나타낸 것이다. y축은 혈장 내 독소루비신 μg/ml이며 x축은 시간(단위:시)이다.
도 3은 생체 내 HER2 수준의 역할을 나타낸 것으로, 유방지방패드내 BT474-M3 이종이식암을 갖는 마우스에 Dil5-표지 MM-302(Dil5-F5-PLD) 또는 UT-PLD(Dil5-UT-PL)를 주입하였다. 암 단일 세포 현탁액을 준비하고 FITC-HER2 항체로 염색하였다. Dil5-양성-HER2-양성 세포를 FACS로 측정하였다. 도 3a는 HER2 농도(세포당 리셉터, x축)를 암세포에 결합하는 리포좀 함수(양성 세포 퍼센트, y축)로 나타낸 그래프이다. 도 3b는 암 조직 섹션에서 측정된 단일 세포 기초에서 HER2 발현의 이종성을 입증하는 그래프이다.
도 4는 인간 심근세포에서 측정된 MM-302 (원), PLD (사각형) 및 독소루비신(삼각형)의 흡수를 나타낸 것이다. 배아줄기세포-유래(ESCd) (도 4a) 및 유도된 다능성 줄기세포-유래(iPSd) (도 4b) 심근세포를 표시된 시간 동안 15 μg/ml의 MM-302, PLD 및 자유 독소루비신으로 처리하고, 전체 세포 독소루비신을 HPLC로 정량하였다. y축은 흡수(펨토그램/세포)를 나타내고 x축은 인큐베이션 시간(분)을 나타낸다. 도 4c는 ESCd 심근세포를 3시간 동안 표시된 농도의 약물로 처리하고 신선한 배지로 24시간 더 인큐베이션한 후 세포 생존율을 도시한 것이다. y축은 대조에 비교한 %로 세포 생존성을 나타내며, x축은 농도(μg/ml)이다. 도 4d는 iPSd 심근세포를 표시된 농도의 자유 독소루비신(원), PLD (사각형) 또는 MM-302 (삼각형)로 24시간 처리한 후, 상징액을 수거하여 잔존 세포에 PrestoBlue®세포 생존성 어세이를 수행한 결과를 도시한 것이다. 모든 값은 미처리 개체군에 대해 표준화하였다. 도 4e는 도 4d 설명에서의 수거된 상징액상에서 인간 트로포닌 I ELISA를 수행한 것을 도시한 것이다. 미처리 선(점선)은 미처리 웰에서 검출가능한 가용성 트로포닌 I의 값을 나타낸다. 모든 값은 공급된 표준의 희석액들에 대해 표준화되었다.
도 5는 ESCd 심근세포를 3시간 동안 표시된 농도의 MM-302 (원), PLD (사각형) 및 자유 독소루비신 (삼각형)으로 처리하고, 신선한 매질과 함께 24시간 더 인큐베이션한 후, 세포를 염색하고 하이콘텐트 현미경을 사용하여 이미지화한 것을 나타낸 것이다. 각 염색에 대한 단일 세포 강도를 정량하고 각 세포의 평균 상대 강도로 나타내었다. 세포는 DNA 손상 마커 감마-H2AX에 대해 염색되었다(도 5a). 또한, 세포들은 세포 스트레스 단백질 포스포-p53 (도 5b) 및 포스포-HSP27 (도 5c) 및 세포사멸 단백질 PARP의 분해 형태(cPARP) (도 5d)에 대해 염색하였다. y축은 상대 강도를 나타내고 x축은 농도(μg/ml)를 나타낸다.
도 6a는 F5 scFv 단독, 또는 공(즉, 캡슐내 독소루비신이 없음) 리포좀("F5 lipo" - MM-302에 동등하나 독소루비신을 함유하고 있지 않은 리포좀)에 결합된 F5 scFv는 기저 pERK 수준을 최소한으로 감소시키고 iPS-유래 인간 심근세포에서는 헤레굴린 자극된 pERK 수준을 감소시키지 않음을 보여준다. 반면, 헤셉틴®(트라스투주맵)은 큰 정도로 기저 수준을 감소시키며 트라스투주맵 및 라파티닙 모두 F5 scFv 또는 F5 lipo보다 더 많이 헤레굴린 자극된 수준을 감소시켰다. 도 6b는 테스트된 약물 중 어느 것도 이들 세포에서의 기저 pAKT 수준을 변화시키지 않았고 트라스투주맵 및 라파티닙 모두 F5 scFv 또는 F5 lipo보다 상당히 큰 정도로 헤레굴린 자극된 수준을 감소시킴을 보여준다.
도 7은 MM-302 (사각형), PLD (삼각형) 및 자유 독소루비신(원)의 생체 분포 연구결과를 나타낸 것이다. NCI-N87 암세포를 갖는 마우스(n=4/시점/그룹)들에 독소루비신, MM-302 또는 PLD의 단일 용량(3 mg/kg)을 투여하였다. 주사후 0.5, 4 및 24 h에 마우스를 치사시켜 심장조직(도 7a), 암 조직(도 7b) 및 발(도 7c)내 독소루비신 축적을 HPLC로 정량하여 나타내었다. 도 7d는 MM-302가 자유 독소루비신에 비해 심장 근육에서 더 낮은 핵 독소루비신 축적을 유도하고, PLD와 유사한 것을 보여준다. Nu/nu 마우스에 MM-302 -DiI5, PLD-DiI5, 및 자유 독소루비신을 3 mg/kg (독소루비신 당량)으로 정맥주사하고, 표시된 시점에 심장을 수거하여 냉동섹션을 제조하여 리포좀과 독소루비신의 미세분포를 분석하였다. FITC-렉틴을 주사하여 기능적/관류된 혈관을 가시화하였다. 심장섹션을 Hoechst로 카운터염색하고 공초점 형광현미경(40X 배율)로 이미지화하였다. 독소루비신양성핵을 도시한다. 독소루비신양성핵은 자유 독소루비신 처리 샘플에서 0.5 h 및 4 h에 보였으며, MM-302 처리 샘플에서는 보이지 않았다("머져 패널" 참조). 도 7e는 독소루비신 및 MM-302에 대해 0.5 h 시점에 대한 상기 필드의 독소루비신 시그널 및 핵 오버레이를 더 높은 배율(2x)로 도시한 것이다. 도 7f는 Definiens® 전개제 XD™를 사용하여 정량된 독소루비신 양성 핵의 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 8: 모델링: 컴퓨터 모델을 개발하여 자유 및 리포좀 독소루비신에 대한 문헌 및 인-하우스 데이터에 대해 보정하였다. 이는 다양한 조직내 리포좀 대 자유 독소루비신에 대한 약물 농도 및 노출을 결정하는 경쟁 키네틱 과정을 이해하기 위해 적용된다. 도 8a는 PK 및 생체분포를 나타낸 것으로, 자유 독소루비신과 상반되게, 리포좀 송달은 더 긴 순환 시간을 초래한다. 도 8b는 조직 침전을 나타낸 것으로, 이 모델은 마우스내 전형적인 리포좀 침착 데이타를 캡쳐할 수 있다. 도 8c는 미세분포를 나타낸 것으로, 키네틱 모델링은 HER2 발현의 MM-302 흡수 및 독소루비신 세포 트래픽킹(trafficking)에서의 역할을 이해하기 위한 프레임워크를 제공할 수 있다.
MM-302 리포좀은 직경 약 75-110 nm의 단일라멜라 지질 이중층 소포이며 겔화 또는 침전 상태로 독소루비신을 함유하는 수성 공간을 캡슐화하고 있다. 지질 멤브레인은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 200개의 인지질 분자에 대해 1개의 PEG 분자의 함량의 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민으로 구성되며, 각 1780개의 인지질 분자에 대해 약 1개의 PEG 사슬이 그 말단에 HER2와 결합하는 F5 단일-사슬 Fv 항체 단편을 갖는다. MM-302 리포좀은 3:2:0.3 몰 비율의 HSPC (수소화 콩 포스파티딜콜린):콜레스테롤(식물-유래):PEG-DSPE (폴리에틸렌 글리콜-디스테로일포스포에탄올아민)으로부터 제조된다. MM-302의 전체 HSPC 지질 농도는 약 40 mmol/L이다. MM-302는 약 10 mmol/L의 지질, 및 약 2 mg/mL의 독소루비신을 함유한다. MM-302는 리포좀내 1.8-2.2 mg/mL의 독소루비신을 포함하며, 리포좀은 0.16-0.30 mg/mL DSPE-PEG-F5 (US 제6,210,707호에 기술된 바와 같이 제조됨)을 함유한다. F5는 항-ErbB2 (HER2) scFv 항체단편 (ATCC 플라즈미드 기탁번호 PTA-7843로 코딩)이다. MM-302 리포좀은 130-170g 독소루비신/인지질 mol 및 12-22g F5-PEG-DSPE/인지질 mol을 포함한다. MM-302는 등장성을 유지하기 위해 10% 슈크로스 및 버퍼(pH 6.5)로서 멸균 10 mM/L 히스티딘-HCl 내에 제형화된다. MM-302 리포좀은 미리 로딩된 암모늄 설페이트를 사용하여 로딩된다.
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"mg/m2"는 환자의 체표면적의 평방미터 당 독소루비신의 mg(MM-302로 제제화된)을 가리킨다. 유방암에 대해 용량 3, 4, 또는 5가 바람직하다. 카포시 육종에 대해 용량 1, 2, 또는 3이 바람직하며, 난소암에 대해서는 용량 3, 4, 또는 5가 바람직하며 다발성 골수암에 대하여는 용량 2, 3, 4, 또는 5가 바람직하다. 용량 계획은 "진전된"(전이암) 것과 비교하여, "조기"(전이 전, 예컨대 애쥬번트 유방암(adjuvant breast cancer))인 고형암 환자에서 달라질 수 있다. 바람직한 암은 암 세포가 HER2를 과발현하는 암이다. HER2를 과발현하는 암은 HercepTest™에 의해 HER2 "3+" 또는 HER2 "2+"이거나 원위치 하이브리드화에서 형광에 의해 HER2 FISH+인 것으로 확인된 것이다.
선택적으로, HER2를 과발현하는 바람직한 종양은 실시예에 기술된 방법으로 정량된 바와 같이 세포 당 평균 200,000 이상의 리셉터를 발현하는 종양이다.
진행성 유방암의 MM -302 치료요법
MM-302는 FISH에 의해 또는 IHC에 의해 또는 세포당 HER2 리셉터의 평균 수의 측정에 의해 결정되는 HER2를 과발현하는 국소 진행성/절제 불가능 또는 전이성 진행성 유방암을 갖는 환자에게 8, 16, 30, 40 또는 50 mg/m2 씩 60분간 정맥 내(IV) 주입에 의해 매 4주마다 1회 투여된다. 환자는 1) 절대 호중구 수치(ANC) ≥ 1,500/㎕; 2) 혈소판 수치 ≥ 100,000/㎕; 및 3) 헤모글로빈 ≥ 9 g/㎗에 의해 입증되는 적절한 골수를 가져야만 한다(수혈 허용됨). 환자는 1) 혈청 총 빌리루빈 ≤ 1.5 x ULN; 및 2) 정상 내지 2.5 x 정상의 상한 범위의 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT) 및 알칼린 포스파타아제(ALP)에 의해 입증되는 적절한 간 기능을 가져야만 한다(ULN; 간 전이 및/또는 뼈 전이가 존재하는 경우, ALP에 대해 5 x ULN이 허용가능하다). 환자는 혈청 크레아티닌 ≤ 1.5 x ULN에 의해 입증되는 적절한 신장 기능을 가져야만 한다. 환자는 유방암 치료를 목적으로 하는 임의의 사전 수술, 방사선 치료요법 또는 다른 치료요법의 임의의 임상적으로 관련된 독성 효과로부터 회복되어야만 한다. 임신 가능한 여성뿐만 아니라 생식력 있는 남성 및 배우자는 치료 중 및 MM-302 최후 투여 후 90일 동안 성교를 삼갈 것 또는 효과적인 피임 형태를 사용할 것을 경고를 받아야만 한다. 환자는 대략 30일의 치료 중 ECHO 또는 MUGA에 의해 측정된 좌심실 박출율 ≥ 50%에 의해 입증되는 적절한 심장 기능을 가져야만 한다. 임신 또는 수유 중 환자 및 NYHA 클래스 III 또는 IV 울혈성 심부전 또는 좌심실 박출율(LVEF) < 50%, 또는 장기간 QTc 간격(≥ 460 ms)을 갖는 환자는 바람직하게 MM-302로 치료되지 않는다.
다음의 실시예는 단지 설명을 위한 것이고 많은 변형과 등가물이 본 명세서에 의해 당업자에게 명확하기 때문에 임의의 방식으로 여기에 개시된 범위를 제한하지 않아야 한다.
실시예
본 실시예에서 사용되는 재료 및 방법:
재료: 독소루비신은 SIGMA-ALDRICH, Inc.(St. Louis, MO)로부터 입수하였다. FITC-컨쥬게이트 렉틴(라이코퍼시콘 에스큘렌튬(lycopersicon esculentum)(토마토) 렉틴, Cat # FL-1171)을 Vector Laboratories, Inc.(Burlingame, CA)로부터 구입하였다. 아세트산, 메탄올 및 아세토니트릴을 EMD Chemicals Inc.(Gibbstown, NJ)로부터 입수하였다. 물 및 트리플루오로아세트산(TFA)을 J. T. Baker(Phillipsburg, NJ)로부터 입수하였다. HOECHST 33342 트리하이드로클로라이드 트리하이드레이트, ProLong Gold® 및 DiIC18(5)-DS(DiI5)를 Invitrogen(Carlsbad, CA)사로부터 입수하였다. 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염)(PEG-DSPE)을 Avanti Polar Lipids Inc.로부터 입수하였다. 수소화된 콩 포스파티딜콜린(HSPC)을 Lipoid(Newark, NJ)사로부터 입수하였다. RPMI는 Lonza(Walkersville, MD)사로부터 입수하였고, 소태아혈청(FBS)은 Tissue Culture Biologicals로부터 입수하였으며, 페니실린 G/스트렙토마이신 설페이트 혼합물을 GIBCO(Invitrogen)사로부터 입수하였다.
면역리포좀의 제조: 이미 기술된 바와 같이 리포좀을 제조하고 암모늄 설페이트 그라디언트를 사용하여 독소루비신을 로딩하였다(Kirpotin et. al., Cancer Res. 2006;66:6732-40; Park et al., Clin Cancer Res. 2002;8: 1172-81). 지질 성분은 HSPC, 콜레스테롤 및 PEG-DSPE(3:2:0.3, 몰:몰:몰)이다. Nellis et al.,(Biotechnol Prog. 2005;21:205-20; Biotechnol Prog. 2005;21 :221-32)에 의해 보고된 바와 같이 항-ErbB2(F5)-PEG-DSPE 컨쥬게이트를 제조하고 리포좀에 삽입하여 면역리포좀을 형성하였다. DiIC18(5)-DS(DiI5) 염료가 총 인지질 0.3 몰 % 농도의 지질 성분으로 가용화된 차이에 의해 상기와 같이 Dil-5-표지된 리포좀, MM-302-DiI5 및 PLD-DiI5를 제조하였다. HEPES 완충 식염수(Hepes buffered saline)(pH 6.5)로 용리된 Sephadex® G-75 크기 배제 칼럼을 사용하여 모든 경우에서 로딩되지 않은 자유 독소루비신을 제거하였다. 독소루비신을 제외하고 상기와 같은 유사한 방식으로 F5-lipo-DiI5를 제조하였고, HEPES 완충 식염수 수용액(pH 6.5)을 포함시켰다.
종양 세포 배양: BT474-M3 세포(Noble, Cancer Chemother. Pharmacol. 2009 64:741-51 참조)는 HER2-과발현 인간 유방암 세포이다. 10% FBS 및 1% 페니실린 G/스트렙토마이신 설페이트 함유 RPMI 배지에서 BT474-M3 세포를 배양하였다. 배아 줄기 세포-유도(ESCd) 심근세포를 P.W. Zandstra(Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada;(Bauwens et al., Tissue Eng Part A. 2011 Apr 25, PMID 21417693;))로부터 입수하였다. 이 세포는 LIM 도메인 호메오박스 유전자 Isl-1, 트로포닌 T 및 미오신 경쇄 2c와 같은 심근세포의 적절한 세포 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 트로포닌 T 양성 세포의 퍼센트는 다음의 판별법에 의해 결정하였다. 트로포닌 T에 대한 양성 70% 미만을 함유하는 뱃치는 폐기하였다. 유발된 다분화능 줄기 세포-유도(iPSd) 세포를 Cell Dynamics International로부터 입수하였고 제조자의 프로토콜에 따라 취급하였다.
이종이식 시험: 5 내지 7주령 암컷 누드 마우스를 Charles River Laboratories 또는 Taconic Farms, Inc(NCr 누드 마우수)로부터 구입하였다. 별도의 지시가 없는 한, BT474-M3 유방암 세포 또는 NCI-N87 위암 세포(NCI-DTP, 100 ㎕ RPMI 중 lOxlO6개의 세포)를 마우스의 우측 등 옆구리(피하 주사, s.c) 내로 마우스에 접종하였다. 종양이 ~200 mm3의 평균 부피에 도달했을 때, 하기와 같이 연구를 수행하였다.
종양 HER2 농도의 시험: 동형 NCr 누드 마우스의 윗쪽 우측 두 번째 유방 지방 패드에 15 x 106 BT474-M3 세포를 접종하였다. 독소루비신을 제외하고 단일 투여량의 4 mg/ml (하기 기술된 바와 같은 DiI5로)형광-표지된 HER2-표적 또는 비표적 리포좀으로 BT474-M3 종양을 주입하였다. 24시간 후, 기계 및 효소 수단에 의해 종양을 제거하고 분리하였다. 항-HER2로 표면 염색 후, FACSCalibur™ 장치(BD Biosciences) 상에서 유동 세포분석법에 의해 세포를 분석하였다. 증가하는 HER2 시그널에 의해 정의되는 좁은 게이트 세포 서브세트(narrowly gated cell subset) 내에 높은 리포좀 함량을 갖는 세포의 총 퍼센트를 플롯팅(plotting)함으로써 주어진 한계점을 초과하는 리포좀의 흡수 및 HER2 표면 발현 농도 간의 상관관계에 대하여 유동 분석법 데이타세트를 분석하였다 .
세포 표면 HER2 의 단일 세포 분포: BT474-M3 종양 이종이식 조직을 항-HER2 항체로 염색하였고 DAPI로 대비염색하였다. 슬라이드(slide)를 20X 배율의 Aperio® Scanscope®로 이미지화하였고 이미지를 분석하였다. HER2 멤브레인 염색의 강도를(HER2 층의 내부 경계의 평균) +(HER2 층의 외부 경계의 평균)으로서 단일-세포 기초로 정량하였다.
효율 시험: 3 mg/kg(q7d, n=3 총 투여량)로 투여되는 PBS(대조군), MM-302 또는 PLD를 제공받는 마우스로부터의 평균 종양 부피를 기초로 마우스를 3개의 치료 그룹(n=7/그룹)으로 무작위화하였다. 캘리퍼로 주당 2회 종양을 측정하였다. 폭2 x 길이 x 0.52를 사용하여 종양 부피를 계산하였다. 주당 2회 마우스의 무게를 측정하여 무게 감소를 모니터하였다.
HER2 -발현 세포주에서 리포좀의 흡수: 다양한 농도의 HER2를 발현하는 복수의 세포주를 15 μg/ml의 MM-302 또는 PLD로 2시간 동안 처리하였고 총 세포의 독소루비신을 HPLC에 의해 정량하였다. 뮤린 4T1 유방암 세포 및 인간 HeLa 자궁경부암 세포를 ATCC로부터 획득하여 ATCC 권고에 따라 증식시켰다. 세포를 시중에서 이용가능한 항-HER2 항체(BD Biosciences #340552)를 사용하여 유동 세포분석법에 의해 인간 HER2 발현을 특징화하였다. 이러한 항체는 뮤린 HER2와 교차 반응하지 않지만 인간 HER2를 검출한다. 인간 HER2를 코딩하는 네오마이신-선택성 발현 벡터를 GeneCopeia(Z2866)사로부터 입수하였다. 제조자의 지시에 따라 비-지질 폴리머 형질감염 시약 MegaTran® 1.0(Origene)을 사용하여 4T1 및 HeLa 세포를 이러한 구성으로 형질감염시켰다. 400-500μg/ml의 제네틱신/네오마이신(Invitrogen)으로 형질감염된 세포를 선택하였다. 감소된 제네틱신/네오마이신 농도(100 μg/ml)하에서 생존 세포가 팽창하도록 하였고 BD Biosciences FACSAria™ 장치상에서 분류하여 부모 HeLa 세포 내에서 관찰되는 것을 초과하는 인간의 HER2 발현을 갖는 농축된 세포 개체군을 얻었다. 그 다음, 분류-농축된 세포를 제한적 희석에 의해 서브-클로닝하였고, HER2 표면 수준에 의해 콜로니를 랭킹하여 다양한 범위의 HER2를 발현하는 4T1 및 HeLa 세포의 대표적인 개체군을 얻었다. 제조자의 지시에 따라 유동 세포분석법에 의해 측정된 HER2 표면 염색의 형광 강도를 Quantum™ Simply Cellular® 항-마우스 IgG 마이크로스피어(Bangs Laboratories #815)에 결합된 동일한 항체에 의한 염색과 비교하여 세포의 HER2 표면 리셉터 수를 계산하였다.
심근세포 내 리포좀의 흡수: iPSd 심근세포를 250,000 세포/웰로 24-웰 조직 배양 플레이트에 제조자의 지시(Cell Dynamics International Cat# CMC-100-110-001)에 따라 도말하였다. 2일 후, 웰 내의 배지 0.5 ml를 제거하고 15.0 μg/ml (dox equiv.)의 MM-302, PLD 또는 자유 독소루비신 0.5 ml로 대체하였다. 플레이트를 "피겨 8 패션(figure 8 fashion)" 내 20 회 스월링(swirling)하여 리포좀에 대한 세포의 노출을 최대화하였다. 배지를 제거한 후 표시된 시간 동안 세포를 MM-302, PLD 또는 자유 독소루비신과 인큐베이션하였고 세포를 PBS 0.5 ml로 1회 세척하였다. PBS를 제거하고 0.05% 트립신 0.5 ml를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 모니터하였고, 일단 박리가 시작되면, FBS를 함유하는 배지 0.5 ml를 각각의 웰에 첨가하여 트립신을 불활성화하였다. 세포를 수집하고 마이크로원심분리기 튜브 내에 위치시켰다. 4℃에서 5분 동안 1,500 rpm으로 세포를 회전시켰다. 세포 펠릿을 메탄올 중 1.0% 아세트산 0.5 ml에서 볼텍싱(vortexing) 및 피펫팅(pipetting)에 의해 재현탁하였고 1시간 동안 -80℃에 위치시켜 독소루비신을 추출하였다. 재현탁된 세포 펠릿을 함유하는 마이크로원심분리기 튜브를 10,000rpm으로 10분간 냉동룸에서 회전시켰고, 상징액 450 μl를 HPLC 큐브로 옮겼다. HPLC 장치상에 샘플을 실시하였고 샘플당 농도를 독소루비신 표준 곡선에 상대적인 값에 의해 결정하였다.
리포좀의 생물학적 분포: PBS, 독소루비신, MM-302-DiI5 또는 PLD-DiI5(모두 3 mg/kg) 중 어느 하나가 단일 정맥 내(i.v.) 투여되는 4개의 그룹으로 마우스를 무작위화하였다. 마우스(n=4/시점/그룹)를 단일 투여 후 0.5, 4, 24 및 96시간(독소루비신) 또는 168시간(MM-302 -DiI5 및 PLD-DiI5)에 투입하였다. 치사 5분 전에, FITC-렉틴 100 μl를 마우스 정맥 내 주사하여 혈관계를 표지하였다.
독소루비신의 HPLC 정량: 심장조직의 무게를 측정하였고 3분 동안 TissueLyser™(Qiagen)를 사용하여 H20 1 mL로 분해하였다. 그 다음, 균질액 100 μl를 새 튜브 내로 옮기고 1 % 아세트산/메탄올 900 μl를 첨가하였다. 배양된 세포에 대하여, 상기 기술된 바와 같이 약물로 세포를 처리하였고, 트립신화하였으며, 메탄올 중의 1.0% 아세트산을 사용하여 용균시켰다. 용균물을 10초간 볼텍싱하였고 1시간 동안 -80℃에 위치시켰다. 10,000 RPM으로 10분간 실온(RT)에서 샘플을 회전시켰다. 상징액 및 독소루비신 표준물을 CI 8 역상 칼럼(Synergi™ POLAR-RP® 80Å, 250x4.60 mm 4 μm 칼럼)을 사용하여 HPLC(Dionex)에 의해 분석하였다. 1.0 ml/분의 유동 속도로 7 분간 회전하는 동안 30% 아세토니트릴; 70% 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)/H20 대 55% 아세토니트릴; 45% 0.1% TFA/H20의 그라디언트를 실시하여 독소루비신을 용출시켰다. 485 nm에서 들뜨고 590 nm를 방출하는 인-라인(in-line) 형광 검출기를 사용하여 6.5분에 독소루비신 피크를 검출하였다. 공지된 양의 독소루비신으로 스파이크(spike)된 대조군 심장에 의해 결정된 것으로 심장조직으로부터 독소루비신을 추출하는 효율은 83%였다.
심장 스냅-결빙( snap - frozen ) 부분의 공초점형 현미경관찰 및 이미지 분석: 10 μm-두께 심장 부분을 실온에서 30분간 공기 건조하였고, 마운팅 배지(ProLong® Gold, Invitrogen)로 1:10,000으로 희석된 Hoechst® 33342로 대비염색하였고, 마운트하였다. Plan-Neofluar® 40x/1.3 오일 DIC 대물렌즈를 갖는 Enterprise(351, 364 nm), Argon(458, 477, 488, 514 nm), HeNel(543 nm) 및 HeNe2(594 nm) 레이저가 장착된 LSM 510 Zeiss® 공초점 현미경 상에서 슬라이드를 이미지화하였다. Definiens® Developer XD™(Definiens, Parsippany, NJ)를 사용하여 핵 독소루비신의 이미지 분석 및 정량하였다. Hoechst 채널에서 핵을 분할하였다. 독소루비신 양성 핵을 독소루비신 채널에서 분할하였다. 독소루비신 양성 핵의 퍼센트는 채널 내의 총 핵 시험체로 나눈 독소루비신 채널 내의 시험체 수의 비율로서 정량하였다.
리셉터 정량: 줄기 세포-유도 심근세포를 트립신화하였고, 세척하였으며, HER2 농도를 "HER2-발현 세포주 내 리포좀 흡수"에서 상기 기술된 바와 같이 측정하였다.
생존율: MM-302, PLD 및 독소루비신의 지시된 농도로 ESCd 심근세포를 3시간 동안 처리하였다. PBS로 세포를 2회 세척하였고, 신선한 배지를 첨가하였으며 세포를 추가로 24시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 Promega(Madison, WI)사의 CellTiter-Glo®를 사용하여 평가하였고 비처리 대조군에 대한 생존 세포의 퍼센트를 결정하였다.
트로포닌 I ELISA : 15,000 iPSd(iCELL®) 심근세포(Cellular Dynamics International, Madison WI) 세포를 제조자의 프로토콜에 따라 도말하였다. 자유 독소루비신, PLD 또는 MM-302의 지시된 농도로 24시간 동안 세포를 처리하였다. 상징액을 수집하였고 제조자의 프로토콜에 따라 인간 트로포닌 I ELISA(카탈로그 #: GWB-83A61F, Genway Biotech, San Diego CA)를 사용하여 분석하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 100 μl 내의 잔여 세포에 PrestoBlue® Cell 생존 어세이(카탈로그 #: A-13261, Invitrogen, Grand Island, NY)를 수행하였다.
하이컨텐트 분석: 심근세포를 상기 기술된 바와 같이 처리하였다. 3.7% 포름알데하이드를 사용하여 세포를 고정하였고, 0.1% Tween-20(PBS-T)를 함유하는 PBS로 2회 세척하였으며, 메탄올로 투과시켰다. 실온에서 1시간 동안 LI-COR® Odyssey® 블록킹 버퍼(Lincoln, NE) 및 PBS-T의 1 :1 혼합물을 사용하여 세포를 블록킹하였다. Cell Signaling Technology(Beverly, MA)사의 지시된 1차 항체의 1:400 희석액으로 세포를 염색하였고 하룻밤 동안 진탕하면서 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하였고 실온에서 1시간 동안 형광으로 표지된 2차 항체의 1 : 2,000 희석액과 배양하였다. 실온에서 30분 동안 Hoechst 33342의 1 : 10,000 희석액 및 Pierce Protein Research Products(Rockford, IL)사의 Whole Cell Stain 1 : 1,000 희석액으로 세포를 염색하여 DNA 및 전체 세포 각각이 시각화되도록 하였다. Hoechst 33342/Whole Cell Stain(460 nm), 독소루비신(595 nm) 및 APC/DiI5(657 nm)에 대하여 lOx 대물렌즈를 갖는 Applied Precision Instruments ArrayWorx® 하이컨텐트 스캐너(Issaquah, WA)를 사용하여 플레이트를 스캐닝하였다. 소프트웨어 ImageRail(Millard et al., Nat Methods. 2011;8:487-92에 기술된 바와 같음)을 사용하여 이미지를 분석하였다. 핵 및 전체 세포 시그널에 대한 강도 한계점을 설정하였다. 그 다음, 이러한 한계점을 모든 이미지에 적용하였고 개개의 세포를 분할하는데 사용하였다. 지시된 채널에 대해 주어진 웰 내의 모든 세포에 대한 평균 픽셀 강도로서 데이터를 나타내었다.
심근세포 내 시그널링: iPS-유도 심근세포(iCell™ iPS-유도 인간 심근세포-Cellular Dynamics International(CDI), Madison, Wisconsin-CDI # CMC-100-010-001, Lot 1258680)를 iCell™ 플레이팅 배지(CDI # CMM-100-110-005, Lot 1013740) 및 iCell™ 보존 배지(CDI # CMM-100-120-005, Lot 1000305)를 사용하여 배양하였고 MM-302의 성분에 노출시켰다. 그 다음, 심근세포 내의 포스포-AKT(pAKT) 및 포스포-ERK(pERK) 농도를 면역염색 및 하이컨텐트 현미경관찰을 사용하여 측정하였다. 트라스투주맵(trastuzumab), 라파티닙(lapatinib) 또는 MM-302 항체(F5-scFv) 및 MM-302 5.0 μg/ml와 동등한 농도에서 독소루비신(F5-lipo)을 함유하지 않는 MM-302 분자(리포좀) 중 어느 하나로 24시간 동안 세포를 전처리하였다. 세포를 염색하였고 (A) pAKT 및 (B) pERK에 대하여 상기 기술된 바와 같은 하이컨텐트 현미경관찰을 사용하여 이미지화하기 전에 헤레굴린 10 nΜ 및 5 nM 각각으로 10분간 자극하였다. 다음의 1차 항체를 블록킹 버퍼 중에서의 1:400 희석에 사용하였다: pERK 항체-Cell Signaling Technology(CST-Danvers Massachusetts)-카탈로그 9106L(포스포-p44/42 MAPK(Erkl/2)(Thr202/Tyr204)(E10) Mouse mAb #9106); pAKT 항체-CST-카탈로그 4060L(Phospho-Akt(Ser473)(D9E) XP™ Rabbit mAb #4060). 2차 항체는 항-마우스 IgG(H+L), F(ab')2 단편(Alexa Fluor® 647 Conjugate)-CST-카탈로그 4410; 항-래빗 IgG(H+L), F(ab')2 단편(Alexa Fluor® 647 Conjugate) -CST-카탈로그 4414였다. 전체 세포 염색 및 DNA 염색(Hoechst 33342 )을 상기 기술된 바와 같이 사용하였다. 이미지를 분석하였고 각각의 세포를 Hoechst 33342 핵 염색을 기초로 분할하였다. 각 염색에 대한 단일 세포 시그널 강도를 정량하였고 각각의 세포의 평균 상대 강도로서 나타내었다.
상기 방법 또는 이의 작은 변형을 사용하여 다음 실시예의 결과를 얻었다. 다양한 농도의 HER2를 발현하는 종양 세포주에서의 세포 흡수 시험은 MM-302가 매우 투과성인 자유 독소루비신과 유사하게 또는 더 높은 수준으로뿐만 아니라, PLD에 비하여 HER2 과-발현 종양 세포에 상당히 더 높은 독소루비신 수준을 전달한다는 것을 증명한다. 그러나, 인간의 심근세포에서, 높은 레벨로 자유 독소루비신이 재흡수되는 반면, 독소루비신 흡수는 MM-302 및 PLD 모두에서 매우 낮았다. 마우스에서 약동학 연구는 MM-302가 PLD와 비교하여 유사한 반감기, 클리어런스(clearance) 및 기관 분포를 갖는다는 것을 증명한다. HER2-과발현 BT474 유방암 및 NCI-N87 위암 이종이식에서, MM-302는 자유 안트라사이클린 및 PLD 둘 다에 대해 현저한 항-종양 활성을 보였다. 또한, 종양 마이크로분포 시험은 종양 내 독소루비신의 국소화 차이가 자유 독소루비신 및 PLD와 비해 강화된 MM-302 활성의 원인일 것이라는 것을 시사한다.
실시예 1 : 시험관 내 HER2 발현 및 MM -302 흡수 간의 상관관계:
복수의 세포주 상에 세포 표면 HER2 발현의 수준을 상기 기술된 바와 같이 결정하였다. 그 다음, 이 동일한 세포주를 180분간 MM-302(도 1a, 표 1) 또는 PLD(도 1b, 표 2) 15 μg/ml으로 처리하였고 이 후 세포를 수집하여 HPLC에 의해 독소루비신과 결합된 세포의 양을 정량하였다. 처리 후 각각의 세포주에 대한 세포당 HER2 리셉터의 수 대 동일한 세포주 내의 세포당 존재하는 독소루비신의 양을 플로팅함으로써, 증가하는 HER2 레벨 및 증가하는 독소루비신 사이의 관계가 분명해졌다. 이러한 재현을 통해, 세포당 대략 200,000개보다 더 많은 수를 발현하는 세포가 일관되게 더 높은 수준의 독소루비신에 연결된 세포를 갖는 것을 나타내는 경우, 세포당 대략 200,000개의 HER2 리셉터에서 변곡점이 있는 것으로 나타났다. 종합하면, 이러한 결과는 변곡점을 초과하는 HER2 농도를 발현하는 세포에 의한 고 흡수(예를 들면, HER2 과발현 암) 및 변곡점 미만의 HER2 수준을 발현하는 세포 내의 무(無) 내지 최소(no-to-minimal) 흡수(예컨대, 정상 조직 내의 세포, 예를 들어 심근세포)를 갖는 MM-302의 특이성을 뒷받침한다.
Figure pct00002

Figure pct00003

다른 세포 개체군 내로의 흡수를 정량하기 위해, 적색-형광 카르보시아닌 트레이서 DiIC18(5)-DS(Invitrogen D12730-약어로 DiI5)를 함유하도록 MM-302를 제조하였다. DiI5는 압출 과정 중 리포좀의 지질 이중층 내로 삽입되는 지질친화성 형광 염료이다. 다른 범위의 HER2를 발현하는 4T1-Her2 세포 개체군을 3시간 동안 형광 표지된 MM-302 10μg/ml와 인큐베이션하였고, 세척하였으며, 추가 21시간 동안 배양하였다. 세포를 수집하였고, 세포 표면 인간 HER2를 염색하였으며, 유동 세포분석법을 통해 HER2 농도 및 리포좀 결합 둘 다를 분석하였다. 4T1 세포주는 마우스 HER2를 발현하는 반면, MM-302는 마우스 리셉터에 결합하지 않는다. 이 도면은 4T1 세포 내로 이러한 리포좀의 흡수가 인간 HER2 발현에 매우 의존적이라는 것을 보여준다(도 1C). 다른 범위의 HER2를 발현하는 HeLa 세포주의 개체군에 대해 유사한 결과를 얻었다(도 1D). 이러한 결과들은 또한 MM-302가 고농도 HER2를 갖는 세포를 결합하는데 매우 효과적이지만 상대적으로 HER2 단백질 발현이 더 낮은 세포와는 결합하지 않거나 거의 결합하지 않는 것을 나타낸다.
실시예 2 : MM -302가 HER2 과발현 종양세포에 효과적으로 내부화되어 이종이식 모델에서 종양성장을 상당히 저해한다: HER2 과발현 종양세포 내로 MM-302의 결합 및 내부화 수준을 측정하기 위해 BT474-M3 세포(1.7xl06 HER2/세포)를 15 μg/ml의, MM-302, PLD 또는 자유 독소루비신과 최대 3시간 동안 인큐베이션하였다(도 2a). 전체 세포 결합(도 2a)과 핵의 독소루비신 축적(도 2b)에 의해 입증된 바와 같이, MM-302는 종양 세포에 효과적으로 흡수되었다(도 2a). 이에 비해, 비표적 (untargeted) 유사체인 PLD는 시험관 내에서 리포좀 독소루비신을 효과적으로 전달하기 위한 표적화의 요건을 입증하는 인식할만한 어떤 축적도 나타내지 않았다. 대조용으로, 자유 독소루비신은 세포에 자유롭게 유입되어 핵에 축적되는 것으로 나타났다. 결과들은 HER2 과발현 종양 세포 내에 (PLD가 아니라)MM-302의 효과적인 결합과 내부화를 나타내었다.
MM-302의 항종양 활성을 유방암 이종이식 모델에서 평가하였다. 마우스를 BT474-M3 세포로 접종시키고, 종양 크기가 250 mm3의 평균값에 이르렀을 때 PBS (대조용), MM-302 또는 PLD (둘다 6 mg/kg dox equiv.)로 처리를 개시하였다(q7d, n=3 투여). MM-302와 PLD는 모두 대조용과 비교하여 종양 성장을 상당히 저해하였다(55일에서의 t-테스트; p<0.0001). MM-302는 PLD와 비교하여 종양 성장에 대해 더 강력한 저해를 나타냈다(55일에서의 t-테스트; p=0.0310)(도 2c). 시험 종료시, MM-302로는 3개의 완전 퇴행(complete regression)이 관찰되었고, PLD로는 하나 만이 관찰되었다. MM-302와 PLD는 개선된 효능이 연장된 노출이라기보다는 HER2-표적화의 결과임을 나타내는 유사한 약동학적 프로필(도 2d)을 가졌다.
실시예 3 : 생체 내 MM -302 흡수에 대한 HER2 수준의 영향: 비표적화 리포좀 독소루비신과 비교하여 이종이식 모델로부터 표적 종양 세포 내 MM-302의 HER2 매개 흡수를 입증하기 위해 실험을 수행하였다. 유방 지방 패드(mammary fat pad) 내에 BT474-M3 이종이식 종양을 갖는 마우스에 Dil5-표지 MM-302 (Dil5-F5-PLD) 또는 UT-PLD (Dil5-UT-PL)를 주사하였다. 종양 단일세포 현탁액을 준비하여 FITC-HER2 항체로 염색하였다. Dil5-양성-HER2-양성 세포를 FACS로 측정하였다. 독소루비신 농도가 높은 세포의 분명한 개체군이 확인되었으며, 이것은 리포좀이 종양 간질공 (interstitial space) 내에 침착되지 않았으나 세포 자체에 흡수된 것을 나타낸다(도 3a). 이것은 HER2 표적화 리포좀으로 처리된 종양에서 유도된 세포 샘플에서 특히 분명하였다. 상승된 리포좀 함량을 갖는 세포의 백분율은 세포당 평균 100,000 내지 200,000 HER2 리셉터 상에서 발현하는 세포 서브세트(subset)가 증가하기 시작하였다. 비표적 리포좀은 HER2 양성 세포 내로의 어떠한 우선적 흡수도 나타내지 않았다. 이러한 결과는 생체 내에서 종양 세포 내 MM-302 흡수가 HER2 의존성이며, 게다가 MM-302의 유의한 결합과 내부화를 가능하게 하는데 필요한 세포당 적어도 100,000-200,000 HER2 리셉터 농도를 지원하는 것을 입증하는 것이다.
HER2 멤브레인 강도의 분포는 전체 조직 섹션 내에서 단세포 기준으로 측정하여 조직 내 발현의 가변성을 표시하는 도 3b에 나타내었다.
실시예 4 : 인간 심근세포는 충분한 HER2 농도를 발현하지 않아서 활성적으로 MM-302를 흡수한다: 인간 심근세포는 HER2를 낮은 수준으로 발현하는 것으로 보고되어 MM-302 흡수 가능성이 있는 것으로 생각되었다. ESCd 및 iPSd 인간 심근세포를 입수하여 시험관 내에서 인간 심장세포에 대한 MM-302의 효과를 시험하였다. 심근세포에서의 HER2 리셉터 농도를 qFACS로 측정한 결과, 인간 ESCd 및 iPSd 심근세포 각각에서 세포 당 약 70,000과 200,000 리셉터가 존재하였다. 이러한 결과는 보고된 인간 심장조직에서의 낮은 HER2 발현과 일치하였다(Fuchs et al., Breast Cancer Res Treat. 2003;82:23-8).
정상적 및 이병성(diseased) 인간 심장조직에서의 HER2 발현수준을 정량적 면역조직화학에 의해 측정하였다. 인간 심장조직 마이크로어레이(TMA)를 HER2 및 DAPI에 대해 염색하고 (평균 HER2 강도)/코어를 Definiens® 소프트웨어로 정량하였다. 상이한 HER2 발현농도의 세포주를 갖는 세포 펠릿 어레이를 상기한 바와 같이 염색하고 (평균 HER2 강도)/코어를 정량하여 대응 LOG (HER2 리셉터 #)에 대해 플롯하여 표준을 생성하였다. 생성된 표준을 기초하여 상이한 인간 심장 TMA 코어에 대한 평균 HER2 리셉터 #/코어를 보간하였다(표 3).
Figure pct00004
심근세포에서 HER2 발현의 수준이 MM-302 흡수를 유도하는데 충분한지를 측정하기 위해 전체 세포성 독소루비신을 ESCd(도 4a)와 iPSd(도 4b) 심근세포를 처리한 다음 HPLC로 정량하였다. 자유 독소루비신으로 처리된 심근세포(및 암 세포)는 모든 세포에서 독소루비신 축적을 유발하였다. PLD로의 처리에서는 양 심근세포 세포형에서 독소루비신 전달의 증가가 일어나지 않았다. HER2-과발현 암 세포와 대조하여 심근세포에서 HER2 발현수준은 MM-302의 활성적 흡수를 촉진하기에는 불충분하였다. 종합하면, 이러한 결과들은 MM-302에 의한 독소루비신의 전달이 PLD와 비교하여 심근세포 같은 저농도 HER2 발현 비표적 세포에 대한 독소루비신 노출을 향상시키지 않는 것을 입증하고 있다.
실시예 5 : MM -302는 인간 심근세포 생존율을 감소하거나 세포사멸 반응을 자극하지 않는다: 낮은 농도의 독소루비신에 대한 노출은 세포독성일 수 있다. MM-302 또는 PLD를 사용한 처리가 심근세포 생존율에 영향을 미치는지를 측정하기 위해 ESCd 심근세포를 자유 독소루비신, PLD 또는 MM-302와 3시간 동안 지시된 농도로 인큐베이션한 다음 세척하고 새로운 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 자유 독소루비신으로의 처리는 0.2 μg/ml 정도의 낮은 농도에서 생존율이 상실되었다(도 4c). 역으로, MM-302와 PLD로의 처리는 최대 45 μg/ml의 과치료 (super-therapeutic) 농도를 포함하여, 시험된 어떤 농도에서도 생존율의 감소를 유발하지 않았다. MM-302 또는 PLD로의 처리가 심근세포 생존율에 영향을 주는지를 추가로 시험하기 위해 iPSd 심근세포를 지시된 농도의 자유 독소루비신, PLD 또는MM-302로 24시간 동안 처리하였다. 독소루비신으로의 처리는 PLD와 MM-302로의 처리와 비교하여 생존율에서 현저한 감소를 유발하였다(도 4d). 증가된 농도의 심장 트로포닌(troponin)이 존재하는 것은 심장 손상의 임상적 지표이다. (d)에서 iPSd 심근세포의 상징액을 트로포닌 I 농도에 대해 분석하였다. 도 4e에서 보이는 바와 같이, 독소루비신 처리는 PLD 또는 MM-302로의 처리와 비교하여 트로포닌 I을 현저하게 증가시켰다. 이러한 결과는 ESCd 및 iPSd 심근세포가 독소루비신에 대해 민감하고, MM-302 및 PLD로의 처리가 심근세포 생존율에 영향을 미치는 충분한 독소루비신 노출을 제공하지 않는 것을 입증하는 것이다.
저농도 독소루비신에 대한 세포의 노출은 DNA 손상, 세포 스트레스 및 초기 세포사멸을 비롯한 세포 생존율 척도로 드러나지 않는 미묘한 세포 변화를 유도할 수 있다. MM-302, PLD 및 자유 독소루비신으로 처리한 후에 심근세포를 이러한 반응 경로 각각의 단백질에 대해 염색하고 하이컨텐트 현미경을 사용하여 이미지처리하였다. 단세포 데이터를 ImageRail로 얻어진 이미지를 분석하여 생성하였다.
2중가닥 DNA 손상에 대응하여, 히스톤 H2AX가 포스포릴레이트되어 감마 H2AX를 형성한다. 심근세포를 자유 독소루비신으로 처리하므로써 핵 감마-H2AX 내에서 용량 의존성 증가가 발생하였다(도 5a). 그러나, MM-302 및 PLD로의 처리는 어떠한 시험 농도에서도 핵 감마-H2AX 시그널이 증가되지 않아서 리포좀 캡슐화가 시험관 내에서 심근세포에 대한 DNA 손상을 방지하는 것을 시사하였다.
세포 스트레스에 대응하여 HSP27와 p53이 포스포릴레이트될 수 있고, 세포주기정지를 유발하고, 손상의 범위에 따라 DNA 복구 또는 세포사멸이 이어진다. 자유 독소루비신에 노출된 심장 세포는 치료 후 세포 스트레스의 유도를 표시하는 포스포-HSP27 및 포스포-p53의 용량 의존성 증가를 나타낸다(도 5b 및 도 5c). 그러나, 포스포-HSP27의 증가는 농도와 상관없이 MM-302 또는 PLD 중 하나로 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 5.0 μg/ml의 MM-302로 처리한 후 포스포-p53의 약간의 증가를 제외하고, 대부분의 경우에 MM-302 또는 PLD로 처리된 세포에서 포스포-p53에 대해 효과가 있는 것으로 나타나지 않았다. 그러나, 이 농도와 더 높은 농도에서의 처리가 세포사를 증가시키지는 않았다.
심각한 DNA 손상과 세포 스트레스의 경우에, 세포가 궁극적으로 DNA 복구 단백질 PARP의 분해를 일으키는 카스파제(caspase) 캐스캐이드의 활성화를 포함하는 세포사멸 경로를 개시할 수 있다. 5.0 μg/ml의 자유 독소루비신 처리로 관찰된 세포사 증가와 연관되어 있는 핵 분해 PARP (cPARP)의 증가를 유발하였다(도 5d). 그러나, MM-302 또는 PLD로의 처리는 증가된 핵 cPARP를 발생하지 않아서 이러한 조건 하의 처리가 세포사를 유도하는데 충분하지 않음을 시사하였다.
실시예 6 : 심근세포의 세포내 시그널링에 대한 HER2 표적화제의 영향: 독소루비신과 트라스투주맵(trastuzumab)의 동시사용은 병용치료된 환자에서 관찰된 심장 사건의 받아들이기 어려울 정도의 높은 발생율로 인하여 사용금지되었다. 이러한 병용과 결합된 심장독성의 작용 메카니즘은 독소루비신과, 독소루비신으로 유발된 세포 스트레스에 대응하는데 필요한 HER2 시그널링 경로의 트라스투주맵 매개 저해에 의한 세포 스트레스의 동시 발생 유도인 것으로 생각된다.
MM-302로의 사전처리가 HER2 매개 시그널링(심근세포내 필수 경로)을 변경하는지 측정하기 위해 iPDd 심근세포를 24시간 동안 트라스투주맵, 라파티닙(lapatinib)(소분자 HER2 티로신 키나제 저해제), 또는 MM-302 항체(F5-scFv) 및 독소루비신을 함유하지 않는 것을 제외하고 MM-302와 동일한 공(empty)리포좀(F5-lipo)으로 사전처리하였다. 헤레굴린(heregulin, HRG) 10 nM(도 6a) 및 5 nM(도 6b)로 10분 동안 자극한 후, 포스포-AKT (pAKT, 도 6a) 및 포스포-ERK (pERK, 도 6b)의 수준을 하이컨텐트 현미경으로 상기한 바와 같이 측정하였다. 트라스투주맵으로 24시간 동안 사전처리한 결과 양 단백질의 HRG 매개 인산화가 감소하였다. 라파티닙으로의 사전처리는 이러한 단백질들의 HRG 유도성 인산화의 완전 억제뿐만 아니라 AKT와 ERK의 기초 인산화의 감소를 유도하였다. 사전처리 F5-lipo는 AKT 또는 ERK의 HRG 유도성 인산화를 억제하지 않았다. 이러한 결과는, HER2의 표적화에도 불구하고, MM-302가 심근세포에서 리간드 유도 포스포-AKT 및 포스포-ERK 시그널링을 저해하지 않아서 이러한 주요 시그널링 경로를 작용성으로 남은 것을 시사한다.
이러한 결과들은 또한 트라스투주맵과 라파티닙이 심근세포에서 시그널링 경로에서 F5 scFv 또는 F5 lipo보다 훨씬 더 부정적 영향을 주는 것을 나타낸다. 이것은 결국 MM-302의 항-HER2 항체 성분이 항-HER2 항체 트라스투주맵보다 덜 심장독성이라는 증거이다. 이 결과는, F5가 단독으로 또는 MM-302 리포좀의 외부에 연결되어 필수적인 세포내 시그널링 양상인 심근세포 내의 헤레굴린 (리간드)-자극 HER2/HER3 헤테로다이머 매개 시그널링을 방해하지 않는 것을 나타내며, 그의 저해가 트라스투주맵 유도성 심장독성을 매개하는 주요 메카니즘인 것으로 보인다.
실시예 7 : MM -302는 자유 독소루비신과 비교하여 마우스 심장조직에서 낮은 축적을 가진다: F5 같은 매우 특이적인 항체 단편으로의 리포좀 표적화는 일반적으로 리포좀의 전체 조직 침착을 변경하는 것이 아니라 혈관외유출(extravasation) 후 이들의 미소분포를 변경한다. MM-302 (사각형), PLD (UT-PLD, 삼각형) 및 독소루비신 (free dox, 원형)의 마크로-수준 생물학적 분류를 마우스 심장조직(도 7a), 인간 이종이식 종양 조직(도 7b) 및 상기한 바와 같이 접종된 NCI-N87 종양을 갖는 마우스의 발 조직(도 7c)에서 비교하였다. MM-302, PLD, 또는 자유 독소루비신(모두 3 mg/kg dox equiv.)을 마우스(n=4/시점/그룹)에 i.v. 주입하고, 주입 후 0.5, 4, 24, 및 (dox에 대하여)96 h 또는 (MM-302와 PLD에 대하여)168 h에 심장을 수집하여 HPLC로 독소루비신 정량하였다(도 7a). 자유 독소루비신 주입은 2개의 리포좀 제제와 비교하여 0.5 h(10%의 주입 용량(i.d.)/조직 g)에 심장에서 고피크 노출을 나타내었다. 자유 독소루비신 주입 후 심장조직에서 독소루비신의 클리어런스는 MM-302 및 PLD와 비교하여 더 빨랐으며, 24 h에는 검출된 독소루비신의 양(0.77%의 i.d./조직 g)이 기준선에 근접하였다. MM-302와 PLD는 모두 24 h에서 최대(MM-302와 PLD 각각에 대하여 2.8%와 2.6%)였고 168 h일 때 그 값이 기준선으로 복귀하는 지속된 축적 프로필을 가졌다. 이러한 결과는 다른 PLD 제제의 심장 생물분류에 대해 이전에 보고된 데이터와 유사한 범위 내에 있는 것이다. MM-302와 PLD의 심장 생물분류 사이에서 유의차는 관찰되지 않았다.
실시예 8 : MM -302는 자유 독소루비신과 비교하여 마우스 조직에서 더 낮은 핵 독소루비신 축적을 유발한다.
독소루비신(천연 형광)과 리포좀(DiI5-표지)의 미소분포를 자유 독소루비신, MM-302-DiI5 또는 PLD-DiI5 (모두 3 mg/kg dox equiv)가 주입된 마우스 심장조직에서 생성된 저온절개편(cryosection)에서 주입 후 0.5, 4 및 24 h에 분석하였다. 심장 맥관구조를 가시화하기 위하여 치사하기 5분 전에 FITC-렉틴을 마우스에 i.v. 주사하였다. 심장 슬라이스를 형광 공초점 현미경으로 이미지화하였다. 분석된 3개 시점(0.5, 4 및 24 h)의 상이한 처리그룹에 대한 대표적 영역을 도 7d에 나타내었다. 미처리 심장도 이미지화하여 대표 이미지를 도 7d에 나타내었다(왼쪽 패널). 독소루비신과 핵 시그널의 동시 국소화(Co-localization)를 도 7d의 하부 패널에 나타내었다. 핵 독소루비신 시그널의 더 높은 배율 이미지를 도 7e에 나타내었으며 독소루비신과 MM-302 모두에 대해 0.5 h 시점에서이다. MM-302로는 독소루비신 시그널이 핵에서 보이지 않는 반면, 자유 독소루비신으로는 대부분의 핵이 독소루비신-양성이다. 이미지를 상기한 바와 같이 분석하였고, 독소루비신 양성 핵의 백분율을 측정하였다. 자유 독소루비신의 주입은 0.5 h에 독소루비신의 현저한 핵 축적을 나타내었으며, 약 50%의 핵이 독소루비신에 대해 양성이었다. 그러나, 4 h까지 단지 23%의 핵만이 독소루비신에 대해 양성이었고 시그널은 24 h에 기준선으로 회귀되었다.
리포좀 제제로는 관측 시야의 대부분에서 시그널이 없거나 거의 없었다. DiI5 채널(리포좀)에서 간헐적 시그널이 검출되었다. 이 경우에, 리포좀 시그널은 대개 FITC-렉틴 시그널과 동시 국소화되어 심장조직 내로 혈관외 유출되지 않았으나 혈관 구획 내에 여전히 남아있는 리포좀을 나타내고 있다. MM-302-DiI5 또는 PLD-DiI5 처리시, 독소루비신은 분석된 심장 필드 대부분의 핵에서 시점에 상관없이 검출되지 않았다. 0.5 h에 수집된 4개 MM-302-DiI5 심장 중 하나와 4 h에 수집된 4개 MM-302-DiI5 심장 중 하나에서 리포좀 시그널이 혈관외 공간에서 검출되었고 독소루비신이 소비율의 핵에서 발견되었다. 마찬가지로, 0.5 h에 수집된 4개 PLD 심장 중 하나와 24 h에 수집된 4개 PLD 심장 중 두 개에서 이미지가 혈관외 리포좀 시그널과 핵 독소루비신의 존재를 나타냈다. 이러한 필드들은 대표 이미지로 제공되지는 않았으나, 이들의 값은 도 7f에 나타낸 정량화에서 고려되었다. MM-302와 PLD의 곡선 하 면적은 통계적으로 자유 독소루비신 AUC 보다 훨씬 낮았다(p<0.001). MM-302와 PLD의 AUC 사이에서 유의차는 관찰되지 않았다.
독소루비신과 리포좀의 분포에 대한 더 넓은 가시화를 심장조직에서 얻기 위해, 전체 심장 섹션을 스캔하였다. 전체 섹션 심장 스캔에 의해 시각적으로 공초점 현미경의 결과가 확인되었으며, 자유 독소루비신 주입시 핵 국소화를 갖는 광범위 독소루비신 분포와 DiI5 MM-302 또는 DiI5 PLD가 주입된 마우스 심장에서 단지 드물게 리포좀과 독소루비신 시그널을 나타냈다.
요약하면, MM-302 또는 PLD로의 처리는 자유 독소루비신으로 처리한 후에 보이는 것보다 훨씬 더 낮은 핵 독소루비신 축적을 나타낸 반면, 이것은 MM-302와 PLD 간에 크게 다르지 않았다.
균등 범위
당업자는 통상의 실험을 통하여, 본원에 개시된 특정 구체예에 관한 다수의 균등물을 파악하거나 또는 확인 및 시행할 수 있을 것이다. 이와 같은 균등물은 이하 특허청구범위에 포함되는 것이다. 종속항에 개시된 구체예를 임의로 조합한 것도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주한다.
참고 문헌의 인용
본원에 언급된 각각 및 모든 미국 특허 및 외국 특허 및 계류중인 특허 출원과 간행물의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims (13)

  1. HER2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암으로 진단된 환자에 대한 투여량 및 투여 빈도를 나타내는 제1 용량을 결정하고(여기에서 제1 용량은 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제에 대한 것이며, 이것은 리포좀 안트라사이클린 화학요법제의 안전하고 유효한 양을 환자에게 제공하도록 결정된다);
    안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀의 투여를 위한 용량을 결정하는 단계를 포함하며, 면역리포좀 다수가 각각 그 표면에 다수의 항-HER2 항체 분자를 가지며 각각 안트라사이클린 화학요법제를 함유하고,
    여기에서 안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀 투여를 위한 안전하고 유효한 용량이 제1 용량인,
    안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀을 투여하여 HER2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암으로 진단된 인간 암환자를 치료하는데 사용하기 위한 안전하고 효과적인 용량을 결정하는 방법.
  2. HER2 리셉터 발현을 특징으로 하는 암으로 진단된 환자에 대한 투여량 및 투여 빈도를 나타내는 제1 용량을 결정하고(여기에서 제1 용량은 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제에 대한 것이며, 이것은 리포좀 제제의 안전하고 유효한 양을 환자에게 제공하도록 결정된다);
    안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀을 투여하는 단계를 포함하며, 면역리포좀 다수가 각각 그 표면에 다수의 항-HER2 항체 분자를 가지며 각각 안트라사이클린 화학요법제를 함유하고,
    안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀이 환자에게 제1 용량으로 투여되는,
    안트라사이클린-포함 항-HER2 면역리포좀을 투여하여 인간 암환자를 치료하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 안트라사이클린이 독소루비신인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제가 독소루비신 HCl 리포좀 주사이고 HER2-표적화 면역리포좀이 MM-302인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암이 유방암, 카포시(Kaposi) 육종, 난소암, 또는 다발성 골수종인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 용량이 매 2주 또는 매 3주 또는 매 4주마다 50 mg/m2, 40 mg/m2, 30 mg/m2, 20 mg/m2, 또는 10 mg/m2인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, HER2 리셉터의 발현을 특징으로 하는 암이 HER22 +, HER23 + 또는 HER2 FISH 양성인 것을 추가로 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, ErbB2 리셉터의 발현을 특징으로 하는 암이 평균 세포 당 적어도 200,000 세포 표면 ErbB2 리셉터를 발현하는 것을 추가로 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 용량의 면역리포좀의 투여가 암을 치료하는데 효과적인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 용량의 면역리포좀 투여가 면역리포좀을 포함하지 않는 리포좀 안트라사이클린 화학요법제를 제1 용량으로 투여하는 것과 비교하여 심장독성을 증가시키지 않는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역리포좀을 환자에게 제1 용량으로 투여하여 환자의 혈류에서 면역리포좀의 피크 농도를 발생하고, 면역리포좀을 약 피크 농도로 포함하는 배지에서 배양하는 시험관 내 인간 심근세포의 처리가 면역리포좀이 없는 배지에서 배양된 대조 인간 심근세포와 비교하여 배양된 심근세포에서 헤레굴린(heregulin)-자극 pERK 또는 pAKT의 증가를 감소시키지 않거나 5% 이하로 감소시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 환자 혈류 중의 면역리포좀 농도가 혈청 면역리포좀 농도로서 측정된 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 각각의 HER2 면역리포좀이 그의 표면에 평균적으로 45 항-HER2 항체 분자를 갖는 방법.
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