MX2013006430A - Dosis y administracion para prevenir cardiotoxicidad en el tratamiento con inmunoliposomas erbb2-focalizados comprendiendo agentes quimioterapeuticos de antraciclina. - Google Patents

Dosis y administracion para prevenir cardiotoxicidad en el tratamiento con inmunoliposomas erbb2-focalizados comprendiendo agentes quimioterapeuticos de antraciclina.

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Kenneth J Olivier
Bart S Hendriks
Thomas Wickham
Stephan Klinz
Elena Geretti
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Abstract

Se describen métodos para determinar la dosis de inmunoliposomas conteniendo antraciclina HER2-focalizados, como métodos para tratar pacientes con cáncer con tumores HER2-positivos utilizando dosis así determinadas. Después de administración, las dosis comparten el bajo perfil de cardiotoxicidad de dosis estándares de liposomas conteniendo antraciclina no inmunoliposomales (no focalizados).

Description

DOSIS Y ADMINISTRACION PARA PREVENIR CARDIOTOXICIDAD EN EL TRATAMIENTO CON IN M U NOLIPOSOM AS ERBB2- FOCALIZADOS COMPRENDIENDO AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS DE ANTRACICLINA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de y prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. Nos. 61/420,225, presentada el 6 de diciembre, 2010; 61/420,688, presentada el 7 de diciembre, 2010; y 61/449,602, presentada el 4 de marzo, 2011. Los contenidos de cada una de las solicitudes anteriores se incorporan aquí para referencia en su totalidad.
DECLARACION A LOS DERECHOS A LAS INVENCIONES HECHAS DE ACUERDO CON LA INVESTIGACION Y DESARROLLO FEDERALMENTE PATROCINADO NO APLICABLE REFERENCIA A UNA ANEXO DE "LISTA DE SECUENCIAS". UN CUADRO. O UN PROGRAMA DE COMPUTADORA PRESENTADO EN UN DISCO COMPACTO NO APLICABLE ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las antraciclinas han sido una estructura de base efectiva de técnicas para cáncer durante décadas. A pesar del consistente beneficio clínico observado con regímenes a base de antraciclina en cáncer de mama, toxicidades importantes tales como disfunción cardiaca aguda y/o crónica asociadas con dicho tratamiento tienen un uso terapéutico más expansivo. Aunque las formulaciones de doxorubicina liposomales han tenido éxito para reducir la cardiotoxicidad a cierto grado, han fallado para demostrar ventajas de eficacia de corte claro y pueden involucrar otras toxicidades tales como eritrodisestesia palmo-plantar (síndrome de mano-pie). En un esfuerzo para mejorar la eficacia antraciclinas actualmente disponibles, una nueva preparación inmunoliposomal, MM-302, ha sido preparada que focaliza la antraciclina a células tumorales que sobre-expresan HER2 (ErbB2). Los fragmentos de anticuerpo que se unen a HER2 sin bloquear la señalización mediada por HER2 se acoplan a la superficie externa de doxorubicina liposomal pegilada.
La doxorubicina (dox) es un agente quimioterapéutico de antraciclina usado para tratar una variedad de cánceres. El uso de doxorubicina es de dosis limitada por la cardiotoxicidad del fármaco. Con el fin dirigir este problema, la doxorubicina ha sido formulada como una preparación liposomal pegilada. La encapsulación liposomal de fármacos permite el suministro de potentes fármacos citotóxicos con un índice terapéutico mejorado o ventana terapéutica.
La inyección de liposoma de HCI de doxorubicina (DOXIL®) es una forma de doxorubicina encapsulada en liposoma pegilado (liposomal). DOXIL es una forma comercial de doxorubicina liposomal pegilada (PLD). DOXIL altera la distribución de tejido y el perfil farmacocinético de doxorubicina. El uso de DOXIL da como resultado una escala significativamente más baja de disfunción cardiaca ventricular izquierda y falla cardiaca congestiva sintomática según comparado con la terapia con doxorubicina libre, tanto sola como en combinación con trastuzumab en pacientes no afectados por antraciclina o previamente tratados. DOXIL® está aprobado para usarse para tratar sarcoma de Kaposi, cáncer de ovario, y mieloma múltiple. La inyección de liposoma de HCI de doxorubicina también se vende como CAELYX®.
Los inmunoliposomas son liposomas focalizados en anticuerpo (típicamente fragmento de anticuerpo) que proporcionan ventajas sobre preparaciones no inmunoliposomales ya que son selectivamente internalizados por células que llevan antígenos de superficie celular focalizados por el anticuerpo. Dichos anticuerpos e inmunoliposomas se describen en, por ejemplo, las siguientes patentes de E.U.A. y solicitudes de patente: US 2010-0068255, 6,214,388, 7,135,177, y 7,507,407 ("Immunoliposomes that optimize internalizaron into target cells"); 6,210,707 ("Methods of forming protein-linked lipidie microparticles and compositions thereof); 7,022,336 ("Methods for attaching protein to lipidie microparticles with high efficieney") y US 2008-0108135 y 7,244,826 ("Internalizing ErbB2 antibodies."). Las siguientes patentes de E.U.A. e internacionales y solicitudes de patente describen ensayos, líneas de célula, y tecnologías relacionadas que son relevantes a esta descripción: US 7,846,440 ("Antibodies against ErbB3 and uses thereof) y US 12/757,801, PCT/US2009/040259, y PCT/US2009/60721 ("Human Serum Albumin Linkers and Conjugates Thereof).
Los inmunoliposomas que focalizan ErbB2 (HER2) pueden ser preparados de acuerdo con las descripciones de patente anteriores. Dichos inmunoliposomas focalizados en HER2 incluyen MM-302, el cual comprende el fragmento de anticuerpo F5 anti-HER2 y contiene doxorubícina. MM-302 contiene 45 copias de F5-scFv derivado de mamífero por liposoma (anti-HER2). El F5-scFv se seleccionó por su habilidad para internalizar mientras no afecta la señalización de HER2. La caracterización de F5-scFv indica que no reacciona de manera cruzada con HER2 de ratón, de rata o de conejo y no interfiere con la señalización de HER2 en la forma libre de scFv. Ya que se sabe que los cardiomiocitos expresan HER2, se han expresado preocupaciones con respecto a la citotoxicidad potencial de MM-302 e inmunoliposomas focalizados en HER2 relacionados.
Dosis y administración de doxorubícina liposomal comercialmente disponible: DOXIL® (inyección de liposoma de HCI de doxorubícina) es un fármaco químioterapéutico de antraciclina liposomal ilustrativa. DOXIL se administra típicamente en forma intravenosa a una dosis indicada en mg/m2 y se caracteriza como equivalente de HCI de doxorubicina (equiv. dox es la masa total de doxorubicina en cada dosis). Cada dosis típicamente se administra a un intervalo medido en semanas, para producir una dosis de x mg/m2 (equiv. dox) cada y semanas. La primera dosis de doxorubicina liposomal típicamente se administra a una velocidad inicial de 1 mg/minuto para reducir al mínimo el riesgo de reacciones relacionadas con infusión. Si no se observan reacciones adversas relacionadas con infusión, la velocidad de infusión típicamente se incrementó para completar la administración del fármaco durante una hora.
Pacientes con Cáncer de Ovario: DOXIL típicamente se administra a pacientes con cáncer de ovario intravenosamente a una dosis de 50 mg/m2 equiv. dox. Al paciente se le da una dosis una vez cada 4 semanas, durante al menos el paciente no progresa, no muestra evidencia de cardiotoxicidad y continua tolerando el tratamiento. Se recomienda un mínimo de 4 cursos ya que el tiempo medio para respuesta en ensayos clínicos fue de 4 meses. Para manejar las reacciones adversas tales como síndrome de mano-pie (HFS), estomatitis, o toxicidad hematológica, las dosis pueden ser retrasadas o reducidas. Se debe considerar el pre-tratamiento o uso concomitante de antieméticos.
Pacientes con Sarcoma de Kaposi (KS) relacionado con SIDA: DOXIL típicamente se administra a pacientes con KS intravenosamente a una dosis de 20 mg/m2 ((equiv. dox). En pacientes con KS, la dosis típicamente es repetida una vez cada tres semanas, durante al menos los pacientes respondan satisfactoriamente y toleren el tratamiento.
Pacientes con Mieloma Múltiple: Para tratar pacientes con mieloma múltiple, DOXIL se administra con VELCADE® (bortezomib). Bortezomib se administra a una dosis de 1.3 mg/m2 como bolo intravenoso en los días 1, 4, 8, y 11, cada tres semanas. DOXIL típicamente se administra a estos pacientes a una dosis de 30 mg/m2 como una infusión intravenosa de 1 hora después de cada día 4 de la administración de bortezomib. Los pacientes típicamente son tratados durante hasta 8 ciclos hasta la progresión de la enfermedad o la ocurrencia de toxicidad inaceptable.
HERCEPTIN® (trastuzumab) es un anticuerpo anti-HER2 terapéutico que es muy ampliamente utilizado para tratar tumores de sobre-expresión de HER2. Un efecto clave limitante de dosis de trastuzumab es la cardiotoxicidad. Se sabe que los cardiomiocitos expresan HER2, y la cardiotoxicidad mediada por trastuzumab generalmente es aceptada como siendo causada por el daño a cardiomiocitos de expresión de HER2 que resulta de la unión de trastuzumab al HER2 expresado por cadriomiocito, ver, por ejemplo, Hysing J and Wist E, "Cardiotoxic Effects of Trastuzumab," . Tidsskr Ñor Laegeforen, 2011 Nov 15;131 (22):2239-2241. Se sabe que los fármacos de antraciclina, tales como doxorubicina, ejercen efectos cardiotóxicos limitantes de dosis, los cuales se consideran una limitación principal en su uso, ver, por ejemplo, Sawyer et al., "Mechanisms of Anthracycline Cardiac Injury: Can we identify strategies for cardio-protection?" Prog Cardiovasc Dis., 2010 Sep-Oct;53(2): 105-13.
El daño cardiaco inducido por doxorubicina es irreversible, dando como resultado un daño agudo y también daño que puede ser manifestado por si mismo años después del tratamiento. La exposición a concentraciones acumulativas de doxorubicina por arriba de 550 mg/m2 incrementa el potencial para cardiomiopatía y falla cardiaca. El desarrollo de terapia dirigida a HER2 para el tratamiento de cáncer de mama H ER2-positivo ha conducido a la investigación del beneficio clínico de la combinación de doxorubicina y trastuzumab. La eficacia clínica de doxorubicina más trastuzumab fue superior a aquella de paclitaxel más trastuzumab; sin embargo, hubo una incidencia incrementada de toxicidad cardiaca observada en el brazo de estudio de doxorubicina más trastuzumab, y la combinación no fue aprobada para venta. El beneficio clínico de terapia a base de antraciclina, específicamente en cáncer de mama HER2-positivo, permanece controversial.
La encapsulación liposomal de fármacos ha permitido el suministro de fármacos citotóxicos potenciales con un índice terapéutico mejorado. La doxorubicina liposomal pegilada (PLD) altera la distribución de tejido y perfil farmacocinético de doxorubicina. La PLDha demostrado una escala significativamente más baja de disfunción cardiaca ventricuiar izquierda y falla cardiaca congestiva sintomática según comparado a terapia con doxorubicina convencional, sola o en combinación con trastuzumab en pacientes no afectados por antraciclina y previamente tratados. Un mecanismo propuesto para la cardiotoxicidad reducida de PLD es que su gran tamaño con relación a doxorubicina convencional evita que ésta cruce la barrera endotelial en el corazón, minimizando así la exposición de doxorubicina al tejido del corazón.
MM-302 es un liposoma pegilado, HER2-focalizado diseñado para suministrar doxorubicina directamente a cánceres que sobre-expresan HER2. La PLD HER2-focalizada se deposita en tumores a través de la permeabilidad mejorada y efecto de retención similar a la PLD. En el micro-ambiente del tumor, la focalización de células que sobre-expresan HER2 con PLD HER2-focalizada da como resultado una eficacia superior son relación a PLD en modelos pre-clínicos. Durante el desarrollo de MM-302, se expresó preocupación por parte de las autoridades reguladoras de que debido a su focalización de HER2, MM-302 podría suministrar doxorubicina cardiotóxica directamente a cardiomiocitos, dando como resultado una cardiotoxicidad incrementada comparado con la inyección de liposoma de HCI de doxorubicina, y se sugirieron dosis reducidas de MM-302 para evitar dichas toxicidades amenazadoras de la vida.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos para determinar dosis seguras y para utilizar con seguridad antraciclinas inmunoliposomales anti-HER2 para tratar cánceres que expresan HER2, por ejemplo, sin el riesgo incrementado de cardiotoxicidad según comparado con la inyección de liposoma de HCI de doxorubicina (DOXIL), y proporciona otras ventajas.
Ahora se ha descubierto que los ¡nmunoliposomas que contienen antraciclina, anti-ErbB2-focalizados, por ejemplo, MM-302, no son más cardiotóxicos que la inyección de liposoma de HCI de doxorubicina (DOXIL®), y pueden ser dosificados utilizando exactamente las mismas dosis (es decir, cantidades y horarios de dosis y administración) como las usadas para la inyección de liposoma de HCI de doxorubicina sin ningún incremento en el riesgo de cardiotoxicidad o reducción en eficacia. Además, ahora se ha demostrado que MM-302 puede ser efectivamente focalizado a células que expresan 200,000 o más receptores de ErbB2 (HER2) por célula in vitro e in vivo, indicando que pueden ser utilizados para tratar pacientes con tumores que sobre-expresan HER2 que son ya sea HER2 "3 + M (por ejemplo, por HERCEPTEST®), HER2 FISH + (fluorescencia in situ hibridación para la amplificación del gen HER2) o HER2 "2 + " (por ejemplo, por HERCEPTEST).
Por lo tanto, aquí se describen métodos para determinar una dosis segura y efectiva para usarse en el tratamiento de un paciente humano con cáncer a través de la administración de ¡nmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina, el paciente siendo diagnosticado con un cáncer caracterizado por la expresión del receptor de HER2, los métodos comprendiendo determinar una primera dosis, tal como una dosis que indica una magnitud de dosis y frecuencia de dosificación, para un paciente diagnosticado con un cáncer caracterizado por la expresión del receptor de HER2, la primera dosis siendo para una agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un inmunoliposoma, dicha dosis se determina para proporcionar a paciente una cantidad segura y efectiva del agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal; y determinar una dosis para la administración de los inmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina, una pluralidad de dichos inmunoliposomas llevando una pluralidad de moléculas de anticuerpo anti-HER2 sobre su superficie y cada uno conteniendo el agente quimioterapéutico de antraciclina, en donde la dosis segura y efectiva para la administración de los inmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina es la primera dosis.
También se describen métodos para tratar a un paciente humano con cáncer mediante la administración de inmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina, los métodos comprendiendo determinar una primera dosis, dicha dosis indica una magnitud de dosis y frecuencia de dosificación, para un paciente diagnosticado con un cáncer caracterizado por la expresión del receptor HER2, la primera dosificación siendo para un agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un inmunoliposoma, se determina que dicha dosis proporcione al paciente una cantidad segura y efectiva de la formulación liposomal, y administre ¡nmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina, una pluralidad de dichos ¡nmunoliposomas que cada uno lleva una pluralidad de moléculas de anticuerpo anti-HER2 sobre su superficie y cada una conteniendo el agente quimioterapéutico de antraciclina, en donde los ¡nmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina se administran al paciente a la primera dosis.
En ciertos aspectos, la antraciclina es doxorubicina. En otros aspectos, el agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un inmunoliposoma es una inyección de liposoma de HCI de doxorubicina y los ¡nmunoliposomas HER2-focalizados son MM-302. En otros, el cáncer es cáncer de mama, sarcoma de Kaposi, cáncer de ovario, o mieloma múltiple. En otros aspectos más, la primera dosis es 50 mg/m2, 40 mg/m2, 30 mg/m2, 20 mg/m2, o 10 mg/m2 cada dos semanas o cada tres semanas o cada cuatro semanas. En otros aspectos, el cáncer caracterizado por la expresión del receptor HER2 además se caracteriza como siendo HER22 + , HER23 + , o HER2 FISH positivo. En otros, el cáncer caracterizado por la expresión del receptor ErbB2 se caracteriza además como expresando un promedio de al menos 200,000 receptores ErbB2 de superficie celular por célula. En otros más, la administración de los ¡nmunoliposomas a la primera dosis es efectiva para tratar el cáncer y en otros, la administración de los ¡nmunoliposomas a la primera dosis no da como resultado una cardiotoxicidad incrementada según comparado con la administración a la primera dosis del agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un ¡nmunoliposoma. En otros aspectos, la administración de los inmunoliposomas al paciente a la primera dosis da como resultado en una concentración pico de los inmunoliposomas en la corriente sanguínea del paciente, y el tratamiento de cardiomiocitos humanos in vitro al cultivar en un medio que comprende los inmunoliposomas a aproximadamente la concentración pico no reduce, o reduce por no más de 5%, el incremento, estimulado por heregulina, de pERK o pAKT en los cardiomiocitos cultivados según comparado con cardiomiocitos humanos de control cultivados en un medio libre de los inmunoliposomas. En otros aspectos, la concentración de inmunoliposoma en la corriente sanguínea del paciente se mide como una concentración de inmunoliposoma en suero. En otros aspectos más, cada uno de los inmunoliposomas HER2 lleva en su superficie, en promedio, 45 moléculas de anticuerpo anti-HER2.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1. Efecto de Niveles de Her2 en absorción. Se trataron múltiples líneas de célula expresando varios niveles de HER2 con 15 µg ml de MM-302 (A) y dox liposomal pegilado no focalizado (UT-PLD) (B) durante 2 horas y se cuantificó doxorubicina celular total a través de HPLC. Los ejes "y" representan dox por célula (izquierda) y liposomas por célula (derecha) y los ejes "x" representan el número de receptores HER2 por célula (escala de registro). Se transfectaron células 4T1 tumorales de ratón (C) y células HeLa expresando HER2, endógenamente bajo (D) con HER2 humano para generar clones estables con niveles variables de expresión. Los clones individuales (representados por triángulos, círculos, o cuadrados) se trataron con liposomas F5-focal¡zados conteniendo un marcador fluorescente (DH5-F5-PL), y se determinó la unión/absorción totales a través de FACS.
Figura 2. Se trataron células BT474-M3 sobre-expresando HER2, con 15 µ?/??? de MM-302 (círculo), PLD (cuadrado), y doxorubicina libre (triángulo) durante los tiempos indicados (eje x, en minutos). Se cuantificó la doxorubicina celular total a través de HPLC (eje y, femtogramos/célula). (B) Se cuantificó el suministro de doxorubicina nuclear a través de microscopía de alto contenido (eje "y", señal por célula por arriba del antecedente) 24 horas después de los tiempos de incubación indicados (eje x, en minutos). (C) La actividad anti-tumoral de MM-302 y PLD se comparó en un modelo de cáncer de mama ortotópico BT474-M3. Tanto MM-302 (cuadrado) como PLD (triángulo) significativamente inhibieron el crecimiento del tumor comparado con el control (círculo) (prueba t en el día 55; p<0.0001). MM-302 dio como resultado una inhibición más fuerte del crecimiento de tumor con relación a PLD (prueba t en el día 55; p = 0.0310). El eje "y" indica el volumen de tumor en mm3 y el eje "x" indica los días después de la inoculación. La Figura 2D muestra la farmacocinética de MM-302 y UT-PLD en xenoinjertos BT474-M3 administrada con 3 mg/kg o 6 mg/kg (equiv. dox) a q7d. El eje "y" es µg/ml de dox en plasma y el eje "x" es tiempo en horas.
Figura 3. Papel de Niveles de HER2 in vivo: Se inyectaron ratones llevando tumores de xenoinjerto BT474-M3 en la almohadilla grasa mamaria con MM-302 marcado con D¡I5 (DU5-F5-PLD) o UT-PLD (DM5-UT-PL). Se preparó una suspensión de célula tumoral individual y se tiñó con anticuerpos FITC-HER2. Mediante FACS se determinaron células Dil5-positivas-HER2-positivas. (A) Una gráfica que muestra el nivel de HER2 (receptores por célula, eje "x") como una función de la unión de liposoma a células tumorales (porcentaje de células positivas, eje "y"). (B) Una gráfica que demuestra la heterogeneidad de la expresión de HER2 en una base de célula individual según medido en secciones de tejido tumoral.
Figura 4. La absorción de MM-302 (círculo), PLD (cuadrado) y doxorubicina (triángulo se midió en cardiomiocitos humanos. Se trataron cardiomiocitos derivados de célula madre embriónica (ESCd) (A) y derivados de célula madre pluripotente inducida (iPSd) (B) con 15 µg/ml de MM-302, PLD y doxorubicina libre durante los tiempos indicados. Se cuantificó la doxorubicina celular total a través de HPLC. Los ejes "y" representan la absorción en femtogramos/célula y los ejes "x" representan el tiempo de incubación en minutos. (C) Viabilidad de célula: se trataron cardiomiocitos ESCd durante 3 horas con fármaco a las concentraciones indicadas y se incubaron durante 24 horas adicionales con un medio fresco y se analizó la viabilidad de célula. El je "y" representan la viabilidad de célula como % comparado con el control y el eje "x" representa la concentración en µg/ml. (D) Viabilidad de célula: se trataron cardiomiocitos iPSd con la concentración indicada de la doxorubicina libre (círculo), PLD (cuadrado) o MM-302 (triángulo) durante 24 horas. El sobrenadante se recolectó y se realizó el ensayo de viabilidad de célula PrestoBlue® en las células restantes. Todos los valores fueron normalizados a la población no tratada. (E) Se realizó ELISA de Troponina I humana en el sobrenadante recolectado en (D). La línea no tratada (línea punteada) representa el valor de Troponina I soluble detectable en cavidades no tratadas. Todos los valores se normalizaron contra diluciones de un estándar suministrado.
Figura 5. Se trataron cardiomiocitos ESCd durante 3 horas con MM-302 (círculo), PLD (cuadrado), y doxorubicina libre (triángulo) a las concentraciones indicadas y después se incubaron durante 24 horas adicionales con un medio fresco. Las células se tiñeron y se formaron en imágenes utilizando microscopía de alto contenido. La intensidad de célula individual para cada tinción se cuantifícó y representó como la intensidad relativa media de células individuales. Las células se tiñeron para daño de ADN, con el marcador gamma-H2AX (A). Además, las células fueron teñidas para las proteínas de estrés de célula, fosfo-p53 (B) y fosfo-HSP27 (C), y la forma dividida de la proteína de apoptosis PARP (cPARP) (D). Los ejes "y" representan la intensidad relativa y los ejes "x" representan la concentración en µg ml.
Figura 6. (A) F5scFv solo, o F5 scFv unido para vaciar (es decir, sin dox encapsulado) liposomas ("F5 lipo" - liposomas equivalentes a MM-302 pero no contienen doxorubicina) de manera mínima redujo los niveles básales de pERK y no redujeron los niveles de pERK estimulados por heregulina en cardiomiocitos humanos derivados de iPS, mientras que Herceptin® (trastuzumab) redujo los niveles básales a un grado mayor y tanto trastuzumab como lapatinib redujeron los niveles estimulados por heregulina a un grado mayor que lo hace F5 scFv o F5 Upo. (B) Ninguno de los agentes probados cambiaron los niveles básales de pAKT en estas células y tanto trastuzumab como lapatinib ambos redujeron los niveles estimulados por heregulina un grado significativamente mayor que los hace F5 scFv o F5 Upo.
Figura 7. (A) Se midió la bio-distribución de MM-302 (cuadrado), PLD (triángulo) y doxorubicina libre (círculo). A ratones llevando tumor NCI-N87 (n=4/punto de tiempo/grupo) se les dio una dosis individual (3 mg/kg) ya sea de doxorubicina, MM-302 o PLD. Los ratones fueron sacrificados a la 0.5, 4 y 24 horas después de la inyección y la acumulación de doxorubicina en tejido cardiaco (A), tejido tumoral (B) y pata (C) se cuantificó a través de HPLC. (D) MM-302 indujo una acumulación inferior de doxorubicina nuclear en tejido cardiaco comparado con la doxorubicina libre, y comparable con PLD. Los ratones nu/nu fueron inyectados intravenosamente con MM-302 - Di 15 , PLD-DÜ5, y doxorubicina libre a 3 mg/kg (equiv. dox). A los puntos de tiempo designados, los corazones se recolectaron para la preparación de crio-secciones para analizar la micro-distribución de liposomas y doxorubicina. Se inyectó FITC-lectina para visualizar vasos sanguíneos funcionales/con perfusión. Las secciones de corazón fue contra-teñida con Hoechst y se formaron imágenes a través de microscopía de fluorescencia confocal (amplificación de 40X). Se muestran núcleos positivos a doxorubicina. Los núcleos positivos a doxorubicina son visibles en las muestras tratadas con doxorubicina libre a las 0.5 horas y 4 horas y no en muestras tratadas con MM-302 (ver "paneles unidos"). (E) Se muestra una amplificación mayor (2x) de la cubierta de los núcleos y la señal de doxorubicina de los campos anteriores para los puntos de tiempo de 0.5 horas para doxorubicina y MM-302. (F) El porcentaje de núcleos positivos a doxorubicina se cuantificó utilizando Definiens® Developer XD™ (F).
Figura 8. Modelación: Se desarrolló un modelo computacional y se calibró en la literatura y datos en casa para doxorubicina libre y Mposomal. Se aplica para entender los procedimientos cinéticos de competencia que determinan la concentración de fármaco y exposición para doxorubicina Mposomal contra libre en varios tejidos. (A) PK y Bio-distribución: En contraste con doxorubicina libre, el suministro Mposomal dio como resultado un tiempo de circulación mucho más largo. (B) Deposición de Tejido: El modelo es capaz de capturar datos de deposición de liposoma típicos en ratones. (C) Micro-distribución: la modelación cinética es capaz de proporcionar un marco de trabajo para entender el papel de la expresión de HER2 en la absorción de MM-302 y tráfico celular de doxorubicina.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un liposoma MM-302 es una vesícula de dos capas de lípido unilamenar con un diámetro de aproximadamente 75-110 mm que encapsula un especio acuoso que contiene doxorubicina en un estado gelificado o precipitado. La membrana de lípido está compuesta de fosfatidilcolina, colesterol, y una fosfatidiletanolamina derivatizada de polietiien glicol en la cantidad de aproximadamente una molécula de PEG para 200 moléculas de fosfolípido, de las cuales aproximadamente una cadena de PEG para cada 1780 moléculas de fosfolípido lleva en su extremo un fragmento de anticuerpo Fv de cadena individual de F5 que se une a HER2. Se prepararon liposomas MM-306 a partir de HSPC (fosfatidilcolina de soya hidrogenada):Colesterol (derivado de planta): PEG-DSPE (polietiien glicol - diesteroilfosfoetanolamina) a una relación molar de 3:2:0.3, La concentración de lípido de HSPC de MM-302 es aproximadamente 40 mmoles/l. MM-302 contiene aproximadamente 10 mmoles/l de lípido, y aproximadamente 2 mg/ml de doxorubicina. MM-302 comprende 1.8-2.2 mg/ml de doxorubicina en liposomas que contienen 0.16-0.30 mg/ml de DSPE-PEG-F5 (preparado como se describió en US 6,120,707). F5 es un fragmento de anticuerpo (HER2) scFv anti-ErbB2 (codificado por la designación de depósito de plásmido de ATCC, PTA-7843). Los liposomas de MM-302 comprenden 130-170 g de doxorubicina/mol de fosfolípido y 12-22 g de F5-PEG-DSPE / mol de fosfolípido. MM-302 se formula en 10 mM/l de HCI de histidina estéril como un regulador de pH (pH 6.5), y 10% de sacarosa para mantener la isotonicidad. Los liposomas de MM-302 se cargan utilizando sulfato de amonio pre-cargado.
Dosificación de MM-302 "mg/m2" indica miligramos de doxorubicina (formulada como MM-302) por metro cuadrado de área de superficie de cuerpo del paciente. Para cáncer de mama, se prefieren las dosis 3, 4 o 5. Para sarcoma de Kaposi, se prefieren las dosis 1, 2 o 3, para cáncer de ovario, se prefieren las dosis 3, 4, o 5, y para mieloma múltiple, se prefieren las dosis 2, 3, 4 o 5. Los regímenes de dosificación pueden variar en pacientes con tumores sólidos que son de "fase inicial" (pre-metastático, por ejemplo, cáncer de mama adyuvante) según comparado con los "avanzados" (tumores metastáticos). Los tumores preferidos son aquellos en donde las células tumorales sobre-expresan HER2. Un tumo que sobre-expresa HER2 es uno que se identifica por ser HER2 "3 + " o HER2 "2 + " por HercepTest™, HER2 FISH+ mediante fluorescencia en hibridación in situ. Alternativamente, un tumor preferido que sobre-expresa HER2 es uno que expresa un promedio de 200,000 o más receptores por célula, según cuantificado mediante los métodos descritos en los Ejemplos.
Terapia con MM-302 de cáncer de mama avanzado Se administró MM-302 una vez cada 4 semanas a través de infusión intravenosa (IV) durante 60 minutos a 8, 16, 30, 40 o 50 mg/m2 a pacientes con cáncer de mama localmente avanzado/no resecable o metastático avanzado que sobre-expresa HER2 según determinado mediante FISH o mediante IHC o mediante la determinación del número promedio de receptores de HER2 por célula. Los pacientes deben tener reservas adecuadas de médula ósea según evidenciado por: 1) cuenta absoluta de neutrófilos (ANC) > 1,500/µ?; 2) cuenta de plaquetas > 100,000/µ?; y 3) hemoglobina > 9 g/dL. (Transfusión permitida). Los pacientes deben tener una adecuada función hepática según evidenciado por: 1) bilirrubina total en suero < 1.5x ULN, y 2) Aspartato aminotransferasa (AST), Alanina aminotransferasa (ALT) y Fosfatasa Alcalina (ALP) normal o hasta 2.5 x límite superior de lo normal (ULN; 5 x ULN es aceptable para ALP sí están presentes metástasis de hígado y/o metástasis ósea). Los pacientes deben tener una adecuada función renal según evidenciado por: un nivel de creatinina en suero de < 1.5 x ULN. Los pacientes deben recuperarse de cualquier efecto tóxico clínicamente relevante de cualquier cirugía, radioterapia u otra terapia destinada para el tratamiento de cáncer de mama. Las mujeres de maternidad potencial así como hombres fértiles y sus patrones deben ser prevenidos de abstenerse de relaciones sexuales o de utilizar una forma efectiva de anticoncepción durante el tratamiento y durante 90 días después de la última dosis de MM-302. Los pacientes deben tener una adecuada función cardiaca según evidenciado por una fracción de expulsión ventricular izquierda medida de >50% mediante ECHO o MUGA dentro de aproximadamente 30 días de tratamiento. Las pacientes que estén embarazadas o lactando y aquellas con falla cardiaca congestiva Clase III o IV NYHA o fracción de expulsión ventricular izquierda (LVEF) < 50%, o un intervalo QTc prolongado (> 460 ms), de preferencia no son tratadas con MM-302.
Los siguientes Ejemplos son meramente ilustrativos y no deben ser construidos como limitantes del alcance de esta descripción en cualquier forma ya que muchas variaciones y equivalentes serán evidentes para aquellos expertos en la técnica después de leer la presente descripción.
EJEMPLOS Materiales y Métodos Usados en estos Ejemplos: Materiales: La doxorubicina es de SIGMA-ALDRICH, Inc. (St. Louis, MO). La lectina conjugada con FITC (lectina de lycopersicon esculentum (tomate), # Cat. FL-1171) se compró en Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA). El ácido acético, metanol y acetonitrilo son de EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ). El agua y ácido trifluoroacético (TFA) son de J. T. Baker (Phillipsburg, NJ).
HOECHST 33342 tricl orh id rato trihidrato, ProLong Gold®, y DilC18(5)-DS (DM5) son de Invitrogen (Carlsbad, CA). El colesterol y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilen gl¡col)-2000] (sal de amonio) (PEG-DSPE) son de Avanti Polar Lipids Inc. la fosfatidilcolina de soya hidrogenada (HSPC) es de Lonza (Walkersville, MD), Suero de Bovino Fetal (FBS) es de Tissue Culture Biologicals y la mezcla de penicilina G/sulfato de estreptomicina es de GIBCO (Invitrogen).
Preparación de inmunoliposomas: Los liposomas se prepararon y se cargaron con doxorubicina utilizando un gradiente de sulfato de amonio como se describió previamente (Kirpoti n et. al., Cáncer Res. 2006;66:6732-40; Park et al., Clin Cáncer Res. 2002;8: 1172-81). Los componentes de lípido son HSPC, colesterol, y PEG-DSPE (3:2:0.3, mol:mol:mol). El conjugado de (F5)-PEG-DSPE anti-ErbB2 se preparó y se insertó en el liposoma para formar inmunoliposomas según reportado por Nellis et al., (Biotechnol Prog. 2005;21:205-20; Biotechnol Prog. 2005;21 :221-32). Los liposomas marcados con Dil-5, M -302 y PLD-DM5, se prepararon como se hizo antes con la diferencia de que el colorante DilC18(5)-DS ( D i 15 ) se solubilizó con los componentes de lípido a una concentración de 0.3% molar de fosfolípido total. En todos los casos la doxorubicina libre no cargada se removió utilizando una columna de exclusión de tamaño Sephadex® G-75 eluída con salina regulada en su pH de Hepes (pH 6.5). Se preparó F5-lipo-Dil5 en una forma similar como la anterior, pero sin doxorubicina, e incorporando una solución acuosa de salina regulada en su pH de HEPES (pH 6.5).
Cultivo de célula tumoral: Las células BT474-M3 (ver, Noble, Cáncer Chemother. Pharmacol. 2009 64:741-51), son células de cáncer de mama humano que sobre-expresan HER2. Las Células BT474-M3 se desarrollaron en un medio RPMI conteniendo 10% de FBS y 1% de penicilina G/sulfato de estreptomicina. Los cardiomiocitos derivados de célula madre embriónica (ESCd) se obtuvieron de P.W. Zandstra, Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canadá; (Bauwens et al., Tissue Eng Part A. 2011 Abr 25, PMID 21417593;). Se mostró que estas células expresan marcadores celulares apropiados de cardiomiocitos tales como el gen "homeobox" de dominio LIM, lsl-1, Troponina T, y Miosina de cadena ligera 2c. El porcentaje de células positivas a Troponina T se determinó después de diferenciación. Se desecharon los lotes conteniendo menos de 70% de positivo para Troponina T. Las células derivadas de célula madre pluripotente inducida (iPSd) se obtuvieron de Cell Dynamics International y se manejaron mediante el protocolo del fabricante.
Estudios de Xenoinjerto: Ratones desnudos hembra con una edad de 5-7 semanas se compraron de Charles River Laboratories o Taconic Farms, Inc. (ratones desnudos NCr). A menos que se indique otra cosa, los ratones fueron inoculados con células de cáncer de mama BT474-M3 o células de cáncer gástrico NCI-N87 (NCI-DTP, 10x10s células en 100 µ? RPMI) en el flanco dorsal derecho de los ratones (inyección subcutánea, s.c). Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de -200 mm3, se realizaron estudios como se describe más adelante.
Prueba de niveles de HER2 en tumor: Se inocularon ratones desnudos NCr homocigotos con 15 x 106 células BT474-M3 en la almohadilla grasa mamaria segunda desde el lado a mano derecha superior. Se inyectaron tumores BT474-M3 con una sola dosis de 4 mg/ml de liposomas HER2-focalizados o no focalizados fluorescentemente marcados (con D i 15 como se describe más adelante) sin doxorubicina. Después de 24 horas, los tumores fueron extirpados y se disociaron a través de medios mecánicos y enzimáticos. Después de la tinción de superficie anti-HER2, las células se analizaron a través de citometría de flujo en un instrumento FACSCalibur™ (BD Biosciences) . El grupo de datos de la citometría de flujo se analizó para la relación entre los niveles e expresión en superficie de HER2 y la absorción de liposomas por arriba de un umbral dado al graficar el porcentaje total de células con con un contenido elevado de liposomas en sub-grupos de célula estrechamente controlados definidos al incrementar las señales de HER2.
Distribución de célula individual de HER2 de superficie celular: Se tiñó tejido de xenoinjerto de tumor BT474-M3 con anticuerpo anti-HER2 y contra-teñido con DAPI. Se formaron Imágenes en el portaobjetos con un aparato Aperio® Scanscope® a una amplificación de 20X en la imagen se analizó. La intensidad de la tinción de membrana HER2 se cuantificó en una base de célula individual como la (media del límite interior de la capa de HER2) + (media del límite exterior de la capa HER2).
Estudio de eficacia: Se aleatorizaron ratones en tres grupos de tratamiento (n = 7/grupo) basándose en un volumen de tumor promedio de los ratones que recibieron PBS (control), MM-302 o PLD, dosificados a 3 mg/kg (q7d, n = 3 dosis en total). Los tumores se midieron dos veces/semana con un calibrador. Se calcularon los volúmenes de tumor utilizando la fórmula: ancho2 x longitud x 0.52. Los ratones se pesaron dos veces/semana para verificar la pérdida de peso.
Absorción de liposomas en líneas de células que expresan HER2: Se trataron múltiples líneas de célula expresando varios niveles de HER2 con 15 µg/ml de MM-302 o PLD durante 2 horas y se cuantificó la doxorubicina celular total a través de HPLC. Las células de cáncer de mama 4T1 de murino y células de cáncer cervical HeLa humanas se obtuvieron de ATCC y se propagaron de acuerdo con las recomendaciones de ATCC. Las células se caracterizaron para la expresión de HER2 humano a través de citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-HER2 comercial (BD Biosciences #340552). Este anticuerpo no reacciona de manera cruzada con HER2 de murino pero detecta HER2 humano. Un vector de expresión seleccionable por neomicina que codifica HER2 humano se obtuvo de GeneCopeia (Z2866). Se transfectaron células 4?? y HeLa con esta construcción utilizando el reactivo de transfección de polímero sin lípido MegaTran® 1.0 (Origene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron con 400-500 µ/ml Geneticina/Neomicina (Invitrogen). Las células sobrevivientes se dejaron expandir bajo concentraciones reducidas de Geneticina/Neomicina (100 y se clasificaron en un instrumento FACSAria™ de BD Biosciences para obtener poblaciones celulares enriquecidas con expresión de HER2 humano excediendo a aquella observada en células HeLa parental. Las células enriquecidas de clasificación después se sub-clonaron a través de diluciones limitadas, y las colonias se clasificaron a través de los niveles de superficie de HER2 para obtener poblaciones representativas de células 4T1 y HeLa que expresan diferentes escalas de HER2. La intensidad de fluorescencia de la tinción de la superficie de HER2 medida a través de citometría de flujo se comparó con la tinción con el mismo anticuerpo unido a microesferas de IgG anti-ratón Quantum™ Simply Cellular® (Bangs Laboratories #815) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para calcular el número de receptores de superficie de HER2 de las células.
Absorción de liposomas en cardiomiocitos: Se colocaron en placas cardiomiocitos iPSd de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cell Dynamics International # Catálogo CMC-100-110-001) en una placa de cultivo de tejido de 24 cavidades a 250,000 células/cavidad. Después de dos días, los 0.5 mi del medio en las cavidades se removieron y reemplazaron con 0.5 mi de 15.0 glm\ (equiv. dox) de MM-302, PLD o doxorubicina libre Las placas se agitaron en una "forma de la Figura 8" 20 veces para incrementar al máximo la exposición de las células a los liposomas. Las células se incubaron con MM-302, PLD o doxorubicina Ubre durante el período indicado de tiempo después del cual los medios se removieron y las células se lavaron una vez con 0.5 mi de PBS. La PBS se removió y se agregaron 0.5 mi de 0.05% de tripsina a cada cavidad. Las células se verificaron, y una vez que comenzó la separación, se agregaron 0.5 mi de medio conteniendo FBS a cada cavidad para inactivar la tripsina. Las células se recolectaron y se colocaron en tubos de microcentrífuga. Las células se hicieron girar a 1,500 rpm durante 5 minutos a 4°C. La pella de célula se volvió a suspender al agitar como remolino y poner en pipeta en 0.5 mi de 1.0% de ácido acético en metanol y se colocó a -80°C durante 1 hora para extraer la doxorubicina. El tubo de microcentrífuga conteniendo la pella de célula re-suspendida se hizo girar a 10,000 rpm durante 10 minutos en el cuarto frío, y se transfirieron 450 µ? del sobrenadante a un tubo de HPLC. Las muestras se corrieron en la máquina de HPLC y se determinó la concentración por muestra al relacionar valores con una curva estándar de doxorubicina.
Bio-distribución de liposomas: Se aleatorizaron ratones en 4 grupos que recibieron una dosis intravenosa (i.v.) individual ya sea de PBS, doxorubicina, MM-302-DM5 o PLD-DÍL5 (todas a 3 mg/kg). Los ratones (n=4/punto de tiempo/grupo) se sacrificaron a 0.5, 4, 24 y 96 horas (doxorubicina) o 168 horas (MM-302-DÍI5 y PLD-DM5) después de la dosis individual. Antes de 5 minutos del sacrificio, los ratones se inyectaron, i.v., con 100 µ? de FITC-lectina, para marcar la vasculatura.
Cuantif icación de doxorubicina mediante HPLC: Se pesaron y desagregaron tejidos del corazón con 1 mi de H20 utilizando un TissueLyser® (Qiagen) durante 3 minutos. Después se transfirieron 100 µ? del homogeneizado a un tubo nuevo y se agregaron 900 µ? de 1% de ácido acético/metanol. Para las células cultivadas, las células se trataron con fármaco, como se describió anteriormente, se tripsinizaron y Usaron utilizando 1.0% de ácido acético en metanol. Los lisados se agitaron durante 10 segundos y se colocaron a -80°C durante 1 hora. Las muestras se hicieron girar a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos a 10,000 RPM. Los sobrenadantes y los estañares de doxorubicina se analizaron a través de HPLC (Dionex) utilizando una columna de fase inversa C18 (Synergi™ POLAR-RP® 80A, 250x4.60 mm columna 4µ??). La doxorubicina se eluyó corriendo un gradiente de 30% de acetonitrilo; 70% de ácido trifluoroacético (TFA)/H20 a 55% de acetonitrilo; 45%-0.1% TFA/H20 durante un tiempo de 7 minutos a una velocidad de flujo de 1.0 mi/ minuto. El pico de doxorubicina se detecta a 6.5 minutos utilizando un detector de fluorescencia en línea excitado a 485 nm, y emitiendo a 590 nm. La eficiencia de extracción de doxorubicina del tejido de corazón fue 83% según determinado por un corazón de control salpicado con una cantidad conocida de doxorubicina.
Microscopía confocal y análisis de imagen de secciones de corazón congeladas en forma rápida: Se secaron con aire secciones de corazón con un espesor de 10 µ?t? durante 30 minutos a temperatura ambiente, se contra-tiñeron con Hoechst® 33342 diluido 1:10,000 en un medio de montaje (ProLong® Gold, Invitrogen) y se montaron. Se formaron imágenes de portaobjetos en un microscopio confocal LSM 510 Zeiss® equipado con láseres Enterprise (351, 364 nm), Argón (458, 477, 488, 514 nm), HeNel (543 nm) y HeNe2 (594 nm) con un objetivo DIC 40x/1.3 de aceite de Plan-Neofluar®. El análisis de imagen y cuantiflcación de doxorubicina nuclear se realizaron utilizando Definiens® Developer XD™ (Definiens, Parsippany, NJ). Los núcleos se segmentaron en el canal de Hoechst. Los núcleos positivos a doxorubicina se segmentaron en el canal de doxorubicina. El porcentaje de núcleos positivos a doxorubicina se cuantificó como una relación del número de objetos en el canal de doxorubicina dividido entre el total de objetos de núcleos en el canal de Hoechst.
Cuantif icación de receptor: Los cardiomiocitos derivados de célula madre fueron tripsinizados, lavados, y se determinaron los niveles de HER2 como se describió anteriormente bajo en subtítulo "Absorción de liposomas en líneas de células que expresan HER2".
Viabilidad: Se trataron cardiomiocitos ESCd durante 3 horas a las concentraciones indicadas de M -302, PLD y doxorubicina. Las células se lavaron dos veces con PBS, se agregó medio frasco y las células se incubaron durante 24 horas adicionales. Se valoró la viabilidad de célula utilizando CelITiter-Glo® de Promega (Madison, Wl) y el porcentaje de células viables se determinó con relación a la población no tratada.
ELISA de Troponina I: 15,000 cardiomiocitos iPSd (iCELL®) y células (Cellular Dynamics International, Madison Wl) se colocaron en placas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se trataron durante 24 horas con las concentraciones indicadas de doxorubicina libre, PLD o MM-302. El sobrenadante se recolectó a se analizó utilizando ELISA de Troponina I humana (# catálogo: GWB-83A61F, Genway Biotech, San Diego CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un ensayo de Viabilidad de Célula PrestoBlue® (# catálogo: A-13261, Invitrogen, Grand Island, NY) se realizó en las células restantes en 100 µ? de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Análisis de Alto Contenido: Se trataron cardiomiocitos como se describió anteriormente. Las células se fijaron utilizando 3.7% de formaldehído, se lavaron dos veces con PBS conteniendo 0.1% de Tween-20 (PBS-T), y se permeabilizaron con metanol. Las células se bloquearon utilizando una mezcla de 1:1 de Regulador de pH de Bloqueo LI-COR® Odyssey® (Lincoln, NE) y PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las células se tiñeron con una dilución de 1:400 del anticuerpo primario indicado de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) y se incubaron agitando a 4°C durante la noche. Las células se lavaron y se incubaron con una dilución de 1:2,000 del anticuerpo secundario fluorescentemente marcado durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se tiñeron con una dilución de 1:10,000 de Hoechst 33342 y una dilución de 1:1,000 de Tinción de Célula entera de Pierce Protein Research Products (Rockford, IL) durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la visualización de ADN y la célula entera, respectivamente. Las placas se escanearon utilizando el Escáner de Alto Contenido Array Worx® de Applied Precisión Instruments (Issaquah, WA) con un objetivo 10x para Hoechst 33342/Tinción de Célula Enera (460 nm), doxorubicina (595 nm), y APC/DM5 (657 nm). Las imágenes se analizaron utilizando el software ImageRail (como se describió por Millard et al., Nat Methods, 2011;8:487-92). Se estableció un umbral de intensidad para señales nucleares y de célula entera. Este umbral después se aplicó a todas las imágenes y se utilizó para segmentar células individuales. Los datos se presentan como la intensidad media de pixel para todas las células en una cavidad dada para el canal indicado.
Señalización en cardiomiocitos: Se cultivaron cardiomiocitos derivados de iPS (iCell™ cardiomiocitos derivados de iPS humanos -Cellular Dynamics International (CD I), Madison, Wisconsin - CDI # CMC-100-010-001 , Lote 1258680) utilizando un medio de placa ¡Cell™ Plating Médium (CDI # CMM-100-110-005, Lote 1013740 y un medio de mantenimiento ¡Cell™ (CDI # CMM- 100- 120-005, Lote 1000305) y se expusieron a componentes de MM-302. Después, los niveles de fosfo-AKT (pAKT) y fosfo-ERK (pERK) en cardiomiocitos se midieron utilizando inmunotinción y microscopía de alto contenido. Las células se pre-trataron durante 24 horas ya sea con trastuzumab, lapatinib, o el anticuerpo MM-302 (F5-scFv) y MM-302 (liposoma) no conteniendo doxorubicina ( F 5- 1 i p o) a una concentración equivalente a 5.0 ug/ml de MM-302. Las células se tiñeron y se formaron en imágenes utilizando microscopía de alto contenido como se describió anteriormente para (A) pAKT y (B) pERK siguiendo una estimulación de 10 minutos con 10 nM y 5 nM de heregulina, respectivamente, se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios a una dilución de 1:400 en regulador de pH de bloqueo:anticuerpo pERK - Cell Signaling Technology (CST - Dan vers Massachusetts) - Catálogo 9106L (Phospho-p44/42 MAPK (Erkl/2) (Thr202/Tyr204) (E10) mAb de ratón #9106); anticuerpo pAKT - CST - Catálogo 4060L (Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP™ mAb de conejo #4060). Los anticuerpos secundarios son IgG (H + L) anti-ratón, Fragmento F(ab')2 (Conjugado Alexa Fluor® 647) - CST - Catálogo 4410; IgG anti-conejo (H + L), Fragmento F(ab')2 (Conjugado Alexa Fluor® 647) - CST - Catálogo 4414. Se utilizaron tinción de célula entera y tinción de ADN (Hoechst 33342) como se describió anteriormente. Las imágenes se analizaron y las células individuales se segmentaron con base en la tinción nuclear de Hoechst 33342. Se cuantificó la intensidad de señal de célula individual para cada tinción y se representó como la intensidad media relativa de células individuales.
Los resultados en los siguientes Ejemplos se obtuvieron utilizando los métodos anteriores o variaciones menores de los mismos. Los estudios de absorción celular en líneas de célula tumoral expresando varios niveles de HER2 demuestran que MM-302 suministra niveles de doxorubicina significativamente más altos a células tumorales que sobre-expresan HER2 comparado con PLD así como niveles similares o más altos que la doxorubicina libre altamente permeable. Sin embargo, en cardiomiocitos humanos, aunque la doxorubicina libre otra vez se tomó a altos niveles, la absorción de doxorubicina fue dramáticamente más baja con MM-302 y PLD. Los estudios farmacocínéticos en ratones demuestran que MM-302 tiene una vida media similar, eliminación y distribución de órgano comparado con PLD. En xenoinjertos de tumor de mama BT474 y gástrico NCI-N87, MM-302 exhibe una actividad antí-tumoral superior tanto para doxorubicina libre como para PLD. Los estudios de micro-distribución de tumor además sugieren que las diferencias en la ubicación de doxorubicina en el tumor pueden ser responsables de la actividad mejorada de MM-302 comparado con doxorubicina libre y PLD.
Ejemplo 1: Correlación entre la expresión de HER2 y la absorción de MM-302 in vitro El nivel de expresión de HER2 de superficie celular en múltiples líneas de célula se determinó como se describió anteriormente. Estas mismas líneas de célula después se trataron con 15 µ?/??? de MM-302 (Figura 1A, Cuadro 1) o PLD (Figura 1B, Cuadro 2) durante 180 minutos, después de lo cual las células se recolectaron y la cantidad de doxorubicina asociada con célula se cuantificó mediante HPLC. Al graficar el número de receptores HET2 por célula cada línea de célula contra la cantidad de doxorubicina presenten en por célula en esa misma línea de célula después de tratamiento, una relación entre los niveles en incremento de HER2 y doxorubicina en aumento se volvió evidente. A través de esta representación, pareció haber un punto de inflexión a aproximadamente 200,000 receptores HER2 por célula, en donde las células que expresan más de este número parecen tener niveles consistentemente más altos de célula asociada con doxorubicina. En conjunto, estos resultados soportan la especificidad de MM-302, con alta absorción mediante niveles de expresión de célula de HER2 por arriba del punto de inflexión (tal como cánceres que sobre-expresan HER2) y absorción de nada a mínima en células que expresan niveles de HER2 por abajo del punto de inflexión (tal como células en tejidos normales, por ejemplo, cardiomiocitos).
Cuadro 1 Niveles de HER2 contra absorción de MM-302 (Los resultados para células MKN-45 estuvieron por abajo del nivel de detección) Cuadro 2 Niveles de HER2 contra Absorción de PLD (Los resultados para células AdRr.Her2, HCC1954, y MDA-MB-361 estuvieron por abajo del nivel de detección) Con el fin de cuantificar la absorción en las diferentes poblaciones de células, se preparó MM-302 para contener un rastreador de carbocianina rojo fluorescente, DilC18(5)-DS (Invitrogen D12730 - abreviado como Dil5). D i 1 es un colorante fluorescente lipofílico que se intercala en la bicapa de lípido del liposoma durante el procedimiento de extrusión. Se incubaron poblaciones de célula 4T1-Her2, expresando diferentes escalas de HER2 humano, con 10 µ?/?t?? de MM-302 fluorescentemente marcado durante 3 horas, se lavaron y se incubaron durante 21 horas adicionales. Las células se cosecharon, se tiñeron para HER2 humano de superficie celular y se analizaron para niveles tanto de HER2 como de unión de liposoma a través de citometría de flujo. Aunque la línea de célula 4T1 expresa HER2 de murino, MM-302 no se une al receptor de murino. La figura muestra que la absorción de estos liposomas en células 4T1 fue fuertemente dependiente de la expresión de HER2 humano (Figura 1C). Se obtuvieron resultados similares para poblaciones de las líneas de célula HeLa expresando diferentes escalas de HER2 (Figura 1D). Estos resultados además demuestran MM-302 es altamente efectivo en la unión de células con altos niveles de HER2 pero tiene poca o nada de unión a células con expresión de proteína de HER2 relativamente baja.
Ejemplo 2: MM-302 efectivamente es internalizado en células tumorales que sobre-expresan HER2 y significativamente inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto: Para determinar los niveles de unión e internalización de MM-302 en células tumorales que sobre-expresan MM-302, se incubaron células BT474-M3 (1.7 x 106 HER2/célula) con MM-302, PLD o doxorubicina libre a 15 µg/ml durante hasta 3 horas (Figura 2A). MM-302 fue eficientemente tomado en células tumorales, según evidenciado por la unión total de célula (Figura 2A) y acumulación de doxorubicina nuclea (Figura 2B). En contraste, el análogo no focalizado, PLD, no mostró ninguna acumulación apreciable demostrando el requerimiento de focalización para suministrar efectivamente doxorubicina liposomal in vitro. Como un control, se mostró que la doxorubicina libre entra libremente a las células y se acumula en el núcleo. Los resultados mostraron una unión e internalización efectivas de MM-302 (pero no de PLD) en células tumorales que sobre-expresan HER2.
La actividad anti-tumoral de MM-302 se evaluó en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama. Los ratones se inocularon con células BT474-M3 y cuando los volúmenes de tumor alcanzaron un promedio de 250 mm3, se inició el tratamiento con PBS (control), MM-302 o PLD (ambos a 6 mg/kg equiv. dox) (q7d, n = 3 dosis). Tanto MM-302 como PLD inhibieron significativamente el crecimiento del tumor con relación al control (prueba t en el día 55; p<0.0001). MM-302 dio como resultado una inhibición más fuerte del crecimiento tumoral con relación a PLD (prueba t en el día 55; p = 0.0310) (Figura 2C). Al término del estudio. Se observaron 3 regresiones completas con MM-302 y solo 1 con PLD. MM-302 y PLD tuvieron perfiles farmacocinéticos similares (Figura 2D) indicando que la eficacia mejoradas fue como resultado de la focalización de HER2, en lugar de exposición prolongada.
Ejemplo 3: Impacto de niveles de HER2 en la absorción de MM-302 ¡n vivo: Se condujeron experimentos para demostrar la absorción de M -302 mediada por HER2 en células tumorales focalizadas de modelos de xenoinjerto comparado con doxorubicina liposomal no focalizada. Los ratones llevando tumores de xenoinjerto BT474-M3 en la almohadilla grasa mamaria fueron inyectados con MM-302 marcado con Di 15 (Dil 5-F5-PLD) o UT-PLD (DM5-UT-PL). Se preparó una suspensión de células tumoral individual y se tiñó con anticuerpos FITC-HER2. Las células positivas a Dil5 y positivas a HER2 se determinaron a través de FACS. Se identificó una población distinta de células con niveles elevados de doxorubicina, indicando que tos liposomas no fueron depositados en el espacio intersticial del tumor, pero fueron absorbidas en las mismas células (Figura 3A). Esto fue particularmente evidente en muestras de célula derivadas de tumores tratados con liposomas HER2-focalizados. El porcentaje de células con un contenido elevado de liposoma comenzó en sub-grupos de célula expresando un promedio de 100,000 y 200,000 receptores HER2 por célula. Los liposomas no focalizados no mostraron ninguna absorción preferencial en células HER2-positivas. Estos resultados demuestran que la absorción de MM-302 en células tumorales in vivo es dependiente de HER2 y además soportan un nivel de al menos 100,000-200,000 receptores HER2 por célula necesarios para permitir la unión e internalización significativas de MM-302.
La distribución de intensidad de membrana de HER2 se determinó en una base de célula individual en secciones completas de tejido y se muestra en la Figura 1B, representando la variabilidad de expresión en el tejido.
Ejemplo 4: Cardiomiocitos humanos no expresan niveles suficientes de HER2 para activamente tomar MM-302: Se ha reportado que los cardiomiocitos humanos expresan bajos niveles de HER2, y, por lo tanto, se cree que tienen potencial para la absorción de MM-302. Se obtuvieron cardiomiocitos humanos ESCd e iPSd para estudiar el efecto de MM-302 en células cardiacas humanas in vitro. Se determinaron los niveles del receptor HER2 en cardiomiocitos a través de qFACS para ser aproximadamente 70,000 y 200,000 receptores por célula en cardiomiocitos ESCd e iPSd humanos, respectivamente. Estos resultados son consistentes con la baja expresión de HER2 en tejido cardiaco humano (Fuchs et al., Breast Cáncer Res Treat. 2003;82:23-8).
Se midieron los niveles de expresión de HER2 en tejido cardiaco humano normal y enfermo a raves de inmunohistoquímica cuantitativa. Una Micro Disposición de Tejido Cardiaco Humano (TMA) se tiñó para HER2 y DAPI en la (intensidad media de HER2)/ núcleo se cuantificó con el software Definiens®. Una disposición de pella de célula con líneas de célula a diferentes niveles de expresión de HER2 se tiñó como se hizo anteriormente e la (intensidad media de HER2)/núcleo se cuantificó y se gráfico contra el REGISTRO (LOG) correspondiente (receptor HER2 #) para generar un estándar.
Con base en el estándar, el receptor HER2 # promedio/núcleo para los diferentes núcleos de TMA humanos se interpoló (Cuadro 3).
Cuadro 3 Número de Receptor HER2 Interpolado Para determinar si el nivel de expresión de HER2 en cardiomiocitos es suficiente para inducir la absorción de MM-302, se cuantifico la doxorubicina celular total a través de HPLC después del tratamiento de cardiomiocitos ESCd (Figura 4A) e iPSd (Figura 4B). Los cardiomiocitos (y células de cáncer) tratados con doxorubicina libre dieron como resultado la acumulación de doxorubicina en todas las células. El tratamiento con PLD no dio como resultado un incremento en el suministro de doxorubicina en ningún tipo de célula de cardiomiocito. En contraste con células cancerosas que sobre-expresan HER2, el nivel de expresión de HER2 en cardiomiocitos no fue suficiente para promover la absorción activa de MM-302. En conjunto, estos resultados demuestran que el suministro de doxorubicina a través de MM-302 no mejora la exposición de doxorubicina a células no focalizadas que expresan un bajo nivel de HER2, tales como cardiomiocitos, según comparado con PLD.
Ejemplo 5: MM-302 no reduce la viabilidad de cardiomiocito humano o estimula respuestas apoptóticas: La exposición a niveles bajos de doxorubicina puede ser citotóxica. Para determinar si el tratamiento con MM-302 o PLD afectó la viabilidad de cardiomiocito, se incubaron cardiomiocitos ESCd con doxorubicina libre, PLD o MM-302 durante 3 horas a la concentración indicada seguido por lavado e incubación en un medio fresco durante 24 horas. El tratamiento con doxorubicina libre dio como resultado una pérdida de viabilidad a concentraciones tan bajas como 0.2 µ9/??? (Figura 4C). De forma inversa, el tratamiento con MM-302 y PLD no condujo a reducciones en la viabilidad a ninguna concentración probada, incluyendo concentraciones súper-terapéuticas de hasta 45 µg ml. Para probar más si el tratamiento con MM-302 o PLD afectó la viabilidad de cardiomiocito, los cardiomiocitos iPSd se trataron con la concentración indicada de doxorubicina libre, PLD o MM-302 durante 24 horas. El tratamiento con doxorubicina dio como resultado una marcada reducción en la viabilidad según comparado con el tratamiento con PLD y MM-302 (Figura 4D). La presencia de niveles elevados de troponinas cardiacas es un indicador clínico de daño cardiaco. El sobrenadante de los cardiomiocitos iPSd en (D) se analizó para niveles de troponina I. Como se muestra en la Figura 4E, el tratamiento con doxorubicina dio como resultado un marcado incremento de Troponina I comparado con el tratamiento con PLD p MM-302. Estos resultados demuestran que los cardiomiocitos ESCd e iPSd son sensibles a doxorubicina, y ese tratamiento con MM-302 y PLD no proporcionó una suficiente exposición de doxorubicina para afectar la viabilidad de cardiomiocitos.
La exposición de células a bajos niveles de doxorubicina puede inducir cambios celulares sutiles no revelados por las mediciones de viabilidad de célula, incluyendo el daño de ADN, estrés celular y apoptosis incipiente. Después del tratamiento con MM-302, PLD y doxorubicina libre, los cardiomiocitos se tiñeron para proteínas en cada una de estas trayectorias de respuesta e imagen utilizando microscopía de alto contenido. Se generaron datos de célula individual analizando las imágenes resultantes utilizando ImageRail.
En respuesta al daño de ADN de estructura de cadena doble, la histona H2AX se fosforlló, formando gamma-H2AX. El tratamiento con doxorubicina libre dio como resultado un incremento dependiente de dosis en gamma-H2AX nuclear (Figura 5A). Sin embargo, el tratamiento con MM-302 y PLD no incrementó la señal gamma-H2AX nuclear a ninguna concentración probada, indicando que la encapsulacion liposomal evitó el daño a ADN para cardiomiocitos in vitro.
En respuesta al estrés celular, HSP27 y p53 pueden ser f osforilados, conduciendo a la detención del ciclo celular, seguido por reparación de ADN o apoptosis dependiendo del grado de daño. Las células cardiacas expuestas a doxorubicina libre demuestran un incremento dependiente de dosis en fosfo-HSP27 y fosfo-p53 indicando una inducción de estrés celular después de tratamiento (Figura 5B y 5C). Sin embargo, no se observó un incremento en fosfo-HSP27 en las células tratadas ya sea con MM-302 o PLD sin considerar la concentración. En la mayoría de los casos, no pareció existir un efecto en fosfo-p53 en células tratadas con MM-302 o PLD, con la excepción de un ligero incremento en fosfo-p53 después del tratamiento con 5.0 µg ml de MM-302. Sin embargo, el tratamiento a esta concentración o concentraciones más altas no dio como resultado la muerte celular incrementada.
En casos de daño severo de ADN y estrés celular, la célula puede iniciar la trayectoria apoptótica incluyendo la activación de una cascada de caspasa, dando como resultado finalmente la escisión de la proteína de reparación de ADN, PARP. El tratamiento con 5.0 µg/ml de doxorubicina libre condujo a un aumento en PARP dividido nuclear (cPARP) (Figura 5D), correlacionando con el incremento observado en la muerte celular. Sin embargo, el tratamiento con MM-302 o PLD no dio como resultado un cPARP nuclear incrementado sugiriendo que el tratamiento bajo estas condiciones no es suficiente para inducir apoptosis.
Ejemplo 6: Impactos de agentes HER2 focalizados en señalización intracelular en cardiomiocitos: El uso concurrente de doxorubicina y trastuzumab está contraindicado debido a una incidencia inaceptablemente alta de eventos cardiacos observados en pacientes tratados con la combinación. El mecanismo de acción para la cardiotoxicidad asociada con esta combinación se cree que es la inducción simultánea de estrés celular a través de doxorubicina y a través de la inhibición mediada por trastuzumab de trayectorias de señalización de HER2 que es necesaria para responder ai estrés celular inducido por la doxorubicina.
Para determinar si el pre-tratamiento con MM-302 altera la señalización mediada por HER2 (una trayectoria esencial en cardiomiocitos), los cardiomiocitos iPDd fueron pre-tratados durante 24 horas con trastuzumab, lapatinib (un inhibidor de HER2 tirosina cinasa de molécula pequeña), o el anticuerpo MM-302 (F5-scFv) y un liposoma vacío idéntico a MM-302 excepto que no contiene doxorubicina ( F5-M po) . Después de la estimulación con 10 nM (Figura 6A) y 5 nM (Figura 6B) de heregulina (HRG) durante 10 minutos, se midieron los niveles de fosfo-AKT (pAKT, Figura 6A) y fosfo-ERK (pERK, Figura 6B) a través de microscopía de alto contenido como se describió anteriormente. El pre-tratamiento con trastuzumab durante 24 horas dio como resultado una reducción en la fosforilación mediada por HRG de ambas proteínas. El pre-tratamiento con lapatinib condujo a una reducción en la fosforilación basal de AKT y ERK así como una completa inhibición de fosforilación inducida por HRG de estas proteínas. El pre-tratamiento con F5-l¡po no inhibió la fosforilación inducida por HRG de AKT o ERK. Estos resultados sugiere que, a pesar de la focalización de HER2, MM-302 no inhibe la señalización de fosfo-AKT y fosfo-ERK inducida por ligando en cardiomiocitos, dejando estas trayectorias de señalización críticas funcionales.
Estos resultados también muestran que trastuzumab y lapatinib tienen un impacto negativo significativamente superior en cardiomiocitos que en F5 scFv o F5 lipo. Esto a su vez es una indicación de que el componente de anticuerpo anti-HER2 de MM-302 es menos cardiotóxico que el trastuzumab de anticuerpo anti-HER2. Los resultados muestran que F5, ya sea solo o enlazado al exterior de un liposoma MM-302, no interfiere con la señalización de HER2/HER3 estimulada con heregulina (ligando) - mediada por heterod ímero en cardiomiocitos que es una modalidad de señalización intracelular esencial, la inhibición de la cual se cree que es un mecanismo clave que media la cardiotoxicidad inducida por trastuzumab.
Ejemplo 7: MM-302 tiene una acumulación menor en tejido cardiaco de ratón comparado con doxorubicina libre: La focalización de liposoma con un fragmento de anticuerpo altamente específico tal como F5, generalmente no altera la deposición total de tejido de liposomas, sino que más bien altera su micro distribución después de la extravasación. Las bio-distribuciones de macro nivel de MM-302 (cuadrado), PLD (UT-PLD, triángulo) y doxorubicina (doxorubicina libre, círculo) se compararon en tejido cardiaco de ratón (Figura 7A), tejido de tumor de xenoinjerto humano (Figura 7B) y tejido de pata (Figura 7C) en ratones llevando tumor NCI-N87 inoculados como se describió anteriormente. Los ratones (n=4/punto de tiempo/grupo) se inyectaron, i.v., con MM-302, PLD, o doxorubicina libre (todos a 3 mg/kg equiv. dox) y se recolectaron los corazones a 0.5, 4. 24 y 96 horas (para doxorubicina) o 168 horas (para MM-302 y PLD) después de inyección y doxorubicina cuantificada mediante HPLC (Figura 7A). La inyección de doxorubicina libre dio como resultado una exposición de pico alto en el corazón a 0.5 horas (10% de dosis inyectada (i.d.)/g tejido) comparado con las dos formulaciones liposomales. La eliminación de doxorubicina del tejido cardiaco después de inyección de doxorubicina libre fue más rápida comparada con MM-302 y PLD y a las 24 horas, la cantidad de doxorubicina detectada (0.77% de i.d./g tejido) estuvo más cerca al del principio. Tanto MM-302 como PLD tuvieron un perfil de acumulación sostenida que llegó a un pico a las 24 horas (2.8% y 2.6% para MM-302 y PLD, respectivamente), mientras los valores regresaron a los iniciales a las 168 horas. Estos resultados están a una escala similar a aquella de datos previamente reportados en la bio-distribución cardiaca de otras formulaciones de PLD. No se observaron diferencias significativas entre la bio-distribución cardiaca de MM-302 y PLD.
Ejemplo 8: M -302 da como resultado una acumulación inferior de doxorubicina nuclear en tejido de ratón comparado con doxorubicina libre: La micro-distribución de doxorubicina (naturalmente fluorescente) y liposomas (marcados con DM5) se analizó en crio-secciones generadas de tejidos cardiacos de ratones inyectados ya sea con doxorubicina, MM-302-DÍI5 o PLD-DÍI5 (todos a 3 mg/kg equiv. dox) a las 0.5, 4 y 24 horas después de inyección. Con el fin de visualizar la vasculatura del corazón, los ratones fueron inyectados, i.v., con FITC-lecitina 5 minutos después del sacrificio. Se formaron imágenes de las rebanadas de corazón a través de microscopía confocal de fluorescencia. En la Figura 7D se muestran campos representativos para los diferentes grupos de tratamiento a los tres puntos de tiempo analizados (0.5, 4 y 24). También se formaron imágenes de corazones no tratados y en la Figura 7D se muestra una imagen representativa (paneles izquierdos). La co-localización de doxorubicina con la señal nuclear se muestra en los paneles inferiores de la Figura 7D. Las imágenes de ampliación superior de la señal de doxorubicina nuclear se muestran en la Figura 7E, tanto para doxorubicina como MM-302 al punto de tiempo de 0.5 horas. Aunque con MM-302, no es visible ninguna señal de doxorubicina en los núcleos, con la doxorubicina libre, la mayoría de los núcleos son positivos a doxorubicina. Las imágenes fueron analizadas como se describió anteriormente y se determinó en porcentaje de núcleos positivos a doxorubicina, la inyección de doxorubicina libre dio como resultado una prominente acumulación nuclear de doxorubicina a las 0.5 horas, con aproximadamente 50% de los núcleos positivos para doxorubicina. A las 4 horas, sin embargo, solo un 23% de los núcleos fueron positivos para doxorubicina y la señal regresó a los niveles básales a las 24 horas.
Con las formulaciones liposomales, se detectó de poca a nada de señal para la mayoría de los campos de visión. Se detectó una señal ocasional en el canal D i 15 (liposoma). En estos casos, la señal de liposoma predominantemente se co-localizó con la señal de FITC-lectina, indicando que los liposomas no fueron extravasados en el tejido cardiaco pero siguieron permaneciendo en el compartimento vascular. Después del tratamiento con MM-302-DM5 o PLD-DM5, no se detectó doxorubicina en el núcleo en la mayoría de los campos del corazón analizados, independiente del punto de tiempo. En uno de los cuatro corazones con MM-302-DÍI5 recolectados a las 0.5 horas en uno de los cuatro corazones con MM-302-DÍI5 recolectados a las 4 horas, se detectó una señal liposomal en el espacio extravascular y se encontró doxorubicina en un pequeño porcentaje de los núcleos. Similarmente, en uno de los cuatro corazones de PLD recolectados a las 0.5 horas y en dos de los cuatro corazones de PLD recolectados a las 24 horas, las imágenes revelaron la señal liposomal extravascular y la presencia de doxorubicina nuclear. Estos campos no están presentados como imágenes representativas, sin embargo, sus valores fueron considerados para la cuantificacion mostrada en la Figura 7F. El área bajo las curvas tanto de MM-302 como de PLD fue estadísticamente más baja que para AUC de doxorubicina libre (p<0.001). No se observaron diferencias significativas entre las AUCs de MM-302 y PLD.
Con el fin de obtener una visualización más amplia de la distribución de doxorubicina y de los liposomas en el tejido cardiaco, se tomaron escaneos de la sección cardiaca completa. Los escaneos de la sección cardiaca completa visualmente confirmaron los resultados de la microscopía confocal, mostrando una amplia distribución de doxorubicina con localización nuclear después de la inyección de doxorubicina libre, y solo señales raras de Mposoma y doxorubicina en los corazones de ratones inyectados ya sea con MM-302 o Dil5 PLD.
En resumen, el tratamiento ya sea con MM-302 o PLD mostró una acumulación de doxorubicina nuclear significativamente más baja que la vista después de tratamiento con doxorubicina libre, mientras esto no difirió significativamente entre MM-302 y PLD.
Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar e implementar sin más de una experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas descritas aquí. Dichos equivalentes están destinados a ser abarcados por las siguientes reivindicaciones. Cualquier combinación de las modalidades descritas en las reivindicaciones dependientes se contempla como dentro del alcance de la descripción.
Incorporación para referencia La descripción de cada patente de E.U.A. y extranjera solicitud de patente pendiente y publicación denominada aquí incorpora específicamente para referencia aquí en su totalidad.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar una dosificación segura y efectiva para usarse en el tratamiento de un paciente ser humano con cáncer, mediante la administración de inmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina, el paciente siendo diagnosticado con un cáncer caracterizado por la expresión del receptor HER2, el método comprende: determinar una primera dosificación, tal como una dosificación que indica una magnitud de dosis y frecuencia de dosificación, para un paciente diagnosticado con un cáncer caracterizado por la expresión del receptor HER2, la primera dosificación siendo para un agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un inmunoliposoma, se determina que dicha dosificación proporciona al paciente una cantidad segura y efectiva del agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal; y determinar una dosificación para la administración de los inmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina, una pluralidad de dichos inmunoliposomas cada uno llevando una pluralidad de moléculas de anticuerpo anti-HER2 sobre su superficie y cada uno conteniendo el agente quimioterapéutico de antraciclina, en donde la dosificación segura y efectiva para la administración de los inmunoliposomas anti-HER2 que comprenden antraciclina es la primera dosificación.
2. Un método para tratar a un paciente ser humano con cáncer a través de la administración de inmunoliposomas anti-HER2 comprendiendo antraciclina, el método comprende: determinar una primera dosificación, dicha dosificación indicando una magnitud de dosis y frecuencia de dosificación, para un paciente que ha sido diagnosticado con un cáncer c aracterizado por la expresión del receptor HER2, la primera dosificación siendo para un agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un inmunoliposoma, se determina que dicha dosificación proporciona al paciente una cantidad segura y efectiva de la formulación liposomal, y administrar los inmunoliposomas anti-HER2 comprendiendo antraciclina, una pluralidad de dichos inmunoliposomas cada uno llevando una pluralidad de moléculas de anticuerpo anti-HER2 sobre su superficie y cada una conteniendo el agente quimioterapéutico de antraciclina, en donde los inmunoliposomas anti-HER2 comprendiendo antraciclina se administran al paciente a la primera dosificación.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la antraciclina es doxorubicina.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agente quimioterapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un inmunoliposoma es una inyección de liposoma de HCI de doxorubicina y los inmunoliposomas HER2-focalizados son MM-302.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el cáncer es cáncer de mama, sarcoma de Kaposi, cáncer de ovario, o mieloma múltiple.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la primera dosificación es de 50 mg/m2, 40 mg/m2, 30 mg/m2, 20 mg/m2, o 10 mg/m2, cada dos semanas o cada tres semanas o cada cuatro semanas.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el cáncer caracterizado por la expresión del receptor HER2 además se caracteriza por ser HER22+-, HER23+-, o HER2 FISH-positivo.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el cáncer se caracteriza por la expresión del receptor ErbB2 además caracterizado por expresar un promedio de al menos 200,000 receptores ErbB2 de superficie celular por célula.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la administración de los inmunoliposomas a la primera dosificación es efectiva para tratar el cáncer.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la administración de los inmunoliposomas a la primera dosificación no da como resultado una citotoxicidad incrementada según comparado con la administración a la primera dosificación del agente terapéutico de antraciclina liposomal que no comprende un inmunoliposoma.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la administración de los inmunoliposomas al paciente a la primera dosificación da como resultado una concentración pico del inmunoliposoma en la corriente sanguínea del paciente y en donde el tratamiento de cardiomiocitos humanos in vitro al cultivar en un medio que comprende los inmunoliposomas a aproximadamente la concentración pico no se reduce, o se reduce por no más de 5%, incremento de pERK o pAKT estimulado por heregulina en cardiomiocitos cultivados según comparado con cardiomiocitos humanos de control cultivados en un medio libre de los inmunoliposomas.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la concentración de inmunoliposoma en la corriente sanguínea del paciente se mide como una concentración de inmunoliposoma en suero.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde cada uno de los inmunoliposomas HER2 lleva en su superficie, en promedio, 45 moléculas de anticuerpo anti-HER2.
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