JP2017025087A - アントラサイクリン系化学療法剤を含有しているerbb2標的免疫リポソームによる治療における心臓毒性を抑制するための用量及び投与 - Google Patents
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Abstract
【課題】ドキソルビシンHClリポソーム注射(DOXIL(登録商標))と比べて心臓毒性の危険性が増大することなく、HER2発現癌を治療するための、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの安全な投与量及び使用方法を確認する方法の提供。
【解決手段】HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有すると診断された患者に対する、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの安全かつ有効な投与量及び投与間隔を決定する方法であって、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の安全かつ有効な一回投与量及び投与間隔を決定する工程を含む方法;並びに前記方法によって得られた結果に基づいて、HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を治療する方法。
【選択図】なし
【解決手段】HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有すると診断された患者に対する、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの安全かつ有効な投与量及び投与間隔を決定する方法であって、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の安全かつ有効な一回投与量及び投与間隔を決定する工程を含む方法;並びに前記方法によって得られた結果に基づいて、HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を治療する方法。
【選択図】なし
Description
(関連出願との相互参照)
本出願は、2010年12月6日に出願された米国仮特許出願第61/420,225号、2010年12月7日に出願された同第61/420,688号、及び2011年3月4日に出願された同61/449,602号の優先権を主張する。前記各出願の内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
本出願は、2010年12月6日に出願された米国仮特許出願第61/420,225号、2010年12月7日に出願された同第61/420,688号、及び2011年3月4日に出願された同61/449,602号の優先権を主張する。前記各出願の内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。
(連邦政府支援研究及び開発によってなされた発明に対する権利に関する供述)
適用されない
適用されない
(コンパクトディスク上で提出される「配列表」、表、又はコンピュータプログラムリスト添付資料の参照)
適用されない
適用されない
アントラサイクリンは、数十年に渡り、癌治療の有効な重要要素である。乳癌におけるアントラサイクリンによる治療で観察される着実な臨床的有益性にもかかわらず、このような治療に関連する急性及び/又は慢性の心不全などの重大な毒性がより広い適応症を限定している。リポソームドキソルビシン製剤は心臓毒性をある程度減少させるのに成功したにもかかわらず、これらは明確に有効な利点を示すことができず、及び掌蹠の発赤知覚異常(手足症候群)のような別の毒性を伴う可能性がある。現在入手可能であるアントラサイクリンの有効性を向上させる目的で、HER2(ErbB2)を過剰発現する腫瘍細胞にドキソルビシンを標的化する新規な免疫リポソーム製剤であるMM−302が製造された。HER2介在性のシグナル伝達を阻害せずにHER2と結合する抗体断片がペグ化リポソームドキソルビシンの外表面に結合している。
ドキソルビシン(dox)は、各種の癌を治療するために用いられるアントラサイクリン系化学療法剤である。ドキソルビシンの使用は、薬剤の心臓毒性によって用量規制されている。この問題に対処するために、ドキソルビシンはペグ化リポソーム製剤として製剤
化されている。薬剤のリポソームによるカプセル化は、改善された治療指標又は治療域を伴って強力な細胞毒性薬の送達を可能にする。ドキソルビシンHClリポソーム注射(DOXIL(登録商標))は、ドキソルビシンのペグ化リポソームカプセル(リポソーム化)形態である。DOXILはペグ化リポソームドキソルビシン(PLD)の市販形態である。DOXILはドキソルビシンの組織分布及び薬物動態プロファイルを変化させる。DOXILの使用は、アントラサイクリンを投与されていない患者及び以前にこれで治療された患者において、単独又はトラスツズマブとの併用の両方で、遊離ドキソルビシン治療と比べて、左心室心機能障害及び症候性鬱血性心不全の比率を有意に低下させる。DOXIL(登録商標)は、カポジ肉腫、卵巣癌、及び多発性骨髄腫の治療に用いることが承認されている。ドキソルビシンHClリポソーム注射はCAELYX(登録商標)としても販売されている。
化されている。薬剤のリポソームによるカプセル化は、改善された治療指標又は治療域を伴って強力な細胞毒性薬の送達を可能にする。ドキソルビシンHClリポソーム注射(DOXIL(登録商標))は、ドキソルビシンのペグ化リポソームカプセル(リポソーム化)形態である。DOXILはペグ化リポソームドキソルビシン(PLD)の市販形態である。DOXILはドキソルビシンの組織分布及び薬物動態プロファイルを変化させる。DOXILの使用は、アントラサイクリンを投与されていない患者及び以前にこれで治療された患者において、単独又はトラスツズマブとの併用の両方で、遊離ドキソルビシン治療と比べて、左心室心機能障害及び症候性鬱血性心不全の比率を有意に低下させる。DOXIL(登録商標)は、カポジ肉腫、卵巣癌、及び多発性骨髄腫の治療に用いることが承認されている。ドキソルビシンHClリポソーム注射はCAELYX(登録商標)としても販売されている。
免疫リポソームは、抗体が標的にする細胞表面抗原を担持している細胞によって選択的に内部移行されるので、非免疫リポソーム製剤を超える利点をもたらす、抗体(通常は、抗体断片)標的化リポソームである。このような抗体及びリポソームは、例えば、下記の米国特許及び特許出願に記載されている:米国特許出願公開第2010−0068255号、米国特許第6,214,388号、同第7,135,177号、及び同第7,507,407号 (“Immunoliposomes that optimize internalization into target cells”);米国特許第6,210,707号 (“Methods of forming protein-linked lipidic microparticles and compositions thereof”);米国特許第7,022,336号 (“Methods for attaching protein to lipidic microparticles with high efficiency”) 並びに米国特許出願公開第2008−0108135号、及び米国特許第7,244,826号 (“Internalizing ErbB2 antibodies.”)。下記の米国及び国際特許及び特許出願は、本開示に関連しているアッセイ、細胞株、及び関連技術を記載している:米国特許第7,846,440号 (“Antibodies against ErbB3 and uses thereof”)、並びに米国特許出願第12/757,801号、国際特許出願第PCT/US2009/040259号、及び同第PCT/US2009/60721号 (“Human Serum Albumin Linkers and Conjugates Thereof”)。
ErbB2(HER2)を標的とする免疫リポソームは前記特許の開示に従って製造できる。このようなHER2標的化免疫リポソームは、F5抗HER2抗体断片を含みドキソルビシンを含む、MM−302を含有している。MM−302はリポソーム当り哺乳動物に由来するF5−scFV(抗HER−2)の45コピーを含有している。F5−scFVは、HER2シグナル伝達に影響を及ぼさずに内部移行する能力について選択された。F5−scFVの特徴付けは、それがマウス、ラット又はウサギHER2と交差反応せず、そして遊離scFV形態においてHER2シグナル伝達を妨害しないことを示している。心筋細胞がHER2を発現することは公知であるので、MM−302の潜在的な心臓毒性及び関連するHER2標的化免疫リポソームに関する懸念が示されている。
市販されているリポソーム化ドキソルビシンの用量及び用法:
DOXIL(登録商標)(ドキソルビシンHClリポソーム注射)は典型的なリポソームアントラサイクリン系化学療法剤である。DOXILは通常、mg/m2で示され、ドキソルビシンHCL当量(dox equiv.、各用量中のドキソルビシンの全質量を意味する)として特徴付けられている用量で静脈内に投与される。各用量は通常、y週間毎にxmg/m2(dox equiv.)の用量を生ずるように、週単位で測られる間隔で投与される。最初のリポソームドキソルビシン用量は一般に、注入に関連する反応の危険性を最小化するために1mg/分の初期速度で投与される。注入に関連する副作用が観察されなかったら、注入速度を上昇させて1時間以上かけて薬剤の投与を完遂する。
DOXIL(登録商標)(ドキソルビシンHClリポソーム注射)は典型的なリポソームアントラサイクリン系化学療法剤である。DOXILは通常、mg/m2で示され、ドキソルビシンHCL当量(dox equiv.、各用量中のドキソルビシンの全質量を意味する)として特徴付けられている用量で静脈内に投与される。各用量は通常、y週間毎にxmg/m2(dox equiv.)の用量を生ずるように、週単位で測られる間隔で投与される。最初のリポソームドキソルビシン用量は一般に、注入に関連する反応の危険性を最小化するために1mg/分の初期速度で投与される。注入に関連する副作用が観察されなかったら、注入速度を上昇させて1時間以上かけて薬剤の投与を完遂する。
卵巣癌の患者:
DOXILは一般に、50mg/m2 dox equiv.の用量で卵巣癌患者に静脈内投与される。患者が疾患を進行させず、心臓毒性の兆候を示さず、そして治療に耐え続けている限り、患者は通常、4週間に1度投与される。臨床試験における応答時間の中央値は4ヶ月であったので、最低4治療単位が推奨されている。手足症候群(HFS)、口内炎、又は血液毒性のような副作用を管理するために、服用を遅延及び減少させてもよい。制吐剤による前治療又はこれとの併用は考慮に値する。
DOXILは一般に、50mg/m2 dox equiv.の用量で卵巣癌患者に静脈内投与される。患者が疾患を進行させず、心臓毒性の兆候を示さず、そして治療に耐え続けている限り、患者は通常、4週間に1度投与される。臨床試験における応答時間の中央値は4ヶ月であったので、最低4治療単位が推奨されている。手足症候群(HFS)、口内炎、又は血液毒性のような副作用を管理するために、服用を遅延及び減少させてもよい。制吐剤による前治療又はこれとの併用は考慮に値する。
AIDS関連カポジ肉腫(KS)の患者:
DOXILは通常、KS患者に20mg/m2(dox equiv.)の用量で静脈内に投与される。患者が治療に対して十分に応答してこれを許容する限り、KS患者における服用は通常3週間に1度繰り返される。
DOXILは通常、KS患者に20mg/m2(dox equiv.)の用量で静脈内に投与される。患者が治療に対して十分に応答してこれを許容する限り、KS患者における服用は通常3週間に1度繰り返される。
多発性骨肉腫の患者:
多発性骨肉腫の患者を治療するために、DOXILをVELCADE(登録商標)(ボルテゾミブ(bortezomib))と共に投与する。ボルテゾミブを、1.3mg/m2の用量で静脈内ボーラス投与法で、3週間毎に、1、4、8及び11日目に投与する。DOXILは通常これらの患者に30mg/m2の用量で各4日目のボルテゾミブ投与に続いて1時間かけて静脈内注入する。疾患が進行するまで又は許容できない毒性が発生するまで、通常患者は最大8治療単位まで治療される。
多発性骨肉腫の患者を治療するために、DOXILをVELCADE(登録商標)(ボルテゾミブ(bortezomib))と共に投与する。ボルテゾミブを、1.3mg/m2の用量で静脈内ボーラス投与法で、3週間毎に、1、4、8及び11日目に投与する。DOXILは通常これらの患者に30mg/m2の用量で各4日目のボルテゾミブ投与に続いて1時間かけて静脈内注入する。疾患が進行するまで又は許容できない毒性が発生するまで、通常患者は最大8治療単位まで治療される。
HERCEPTIN(登録商標)(トラスツズマブ)は、HER2を過剰に発現する腫瘍を治療するために非常に広く用いられている治療用抗HER2抗体である。トラスツズマブの用量を制限する重要な作用は心臓毒性である。心筋細胞はHER2を発現することが公知であって、トラスツズマブが介在する心臓毒性は一般に、心筋細胞で発現したHER2と結合しているトラスツズマブに起因するHER2発現心筋細胞に対する損傷によって生じると認められている。例えば、Hysing J and Wist E, “Cardiotoxic Effects of Trastuzumab,” Tidsskr Nor Laegeforen, 2011 Nov 15;131(22):2239-2241 を参照されたい。ドキソルビシンのようなアントラサイクリン系薬剤は、その用量を制限する心臓毒性作用をもたらすことが知られていて、この作用がアントラサイクリン系薬剤の使用における重大な制約であると考えられる。例えば、Sawyer et al., “Mechanisms of Anthracycline Cardiac Injury: Can we identify strategies for cardio-protection?” Prog Cardiovasc Dis., 2010 Sep-Oct;53(2):105-13 を参照されたい)。
ドキソルビシンに誘発される心臓障害は不可逆的であって、急性の損傷及び治療の数年後に現れる可能性のある損傷も引き起こす。550mg/m2を越えるドキソルビシンの蓄積濃度への暴露は心筋症及び心不全の可能性を増大させる。HER2陽性乳癌の治療のためのHER2指向性の治療の開発は、ドキソルビシンとトラスツズマブの併用についての臨床的有益性の検討へと導いた。ドキソルビシン+トラスツズマブの臨床効果はパシリタキセル+トラスツズマブのそれより優れていた;しかしながら、ドキソルビシン+トラスツズマブの検討群において観察される心毒性の増加した発生率が存在し、併用の上市は承認されなかった。アントラサイクリンによる治療、特にHER2陽性乳癌の治療における臨床効果は未だ議論の余地がある。
薬剤のリポソームによるカプセル化は、向上した治療指数を伴う強力な細胞毒性薬物の送達を可能にしている。ペグ化リポソームドキソルビシン(PLD)はドキソルビシンの組織分布及び薬物動態プロファイルを変化させる。PLDは、アントラサイクリンを投与されていない患者及び以前にこれで治療された患者において、単独で又はトラスツズマブとの併用の両方で、遊離ドキソルビシンによる治療と比べて、左心室心機能障害及び症候性鬱血性心不全の比率を有意に低下させる。PLDの心臓毒性の減少について提案されるメカニズムは、従来のドキソルビシンと比べてより大きいそのサイズにより、それが心臓の内皮細胞壁を通過することが阻害されて、それによりドキソルビシンの心臓組織への曝露が最小限化されたということである。
MM−302は、ドキソルビシンを、HER2を過剰発現している癌に直接送達するように設計されたHER2を標的とするペグ化リポゾームである。HER2標的化PLDは、浸透性の増大及びPLDと類似する保持効果によって腫瘍内に蓄積する。腫瘍微小環境内で標的のHER2過剰発現細胞は、HER2標的化PLDと共に前臨床モデルにおけるPLDと比べて優れた効果をもたらした。MM−302の開発段階で、そのHER2標的化により、MM−302が心臓毒性のあるドキソルビシンを心筋細胞に直接送達して、ドキソルビシンHClリポソーム注射に比べて心臓毒性の増大を生じるだろうという懸念を規制当局が示しており、そして、MM−302の用量の減少によりこのような命を脅かす毒性を避けることが示唆された。
本発明は、例えば、ドキソルビシンHClリポソーム注射(DOXIL(登録商標))と比べて心臓毒性の危険性が増大することなく、その他の長所をもたらして、HER2を発現している癌を治療するための、抗HER2免疫リポソームアントラサイクリンの安全な用量及び安全な使用を確認する方法を提供する。
抗ErbB2を標的とする、アントラサイクリン含有免疫リポソーム、例えば、MM−302もまた、ドキソルビシンHClリポソーム注射と同じく心臓毒性がないこと、及び、心臓毒性の危険性を何ら増大させることなく又は有効性を低下させることなく、ドキソルビシンHClリポソーム注射で用いるのと全く同じ用量(すなわち、用量及び投与量並びにスケジュール)を用いて投与できることが今見出された。さらに、MM−302はインビトロ又はインビボで細胞当り200,000又はそれ以上のErbB2(HER2)受容体を発現している細胞を有効に標的にできることが今明らかにされて、HER2“3+”(例えば、HERCEPTEST(登録商標)による)、HER2 FISH+(HER2遺伝子増幅用蛍光in situハイブリダイゼーション)、又はHER2“2+”(例えば、HERCEPTESTによる)の何れかであるHER2過剰発現腫瘍を有する患者を治療するために用いることができることを示唆している。
従って、本明細書には、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によってヒト癌患者の治療に用いるための安全で有効な用量を決定する方法が開示されており、該患者は、HER2受容体の発現によって特徴づけられる癌を有していると診断されており、方法は、HER2受容体の発現を特徴とする癌を有していると診断された患者に対する用量の規模と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は、免疫リポソームを含んでいないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤に関する用量であり、この用量はリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の安全で有効な量を患者にもたらすよう決定される;及び、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与についての用量を確定すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持しており、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有しており、ここで、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与の安全で有効な用量は第1用量であること、を含んでいる。
アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によってヒト癌患者を治療する方法も開示されていて、方法は、HER2受容体の発現を特徴とする癌を有していると診断された患者に対して、用量の規模と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤に関するものであって、この用量はリポソーム製剤の安全で有効な量を患者にもたらすように決定される、及び、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームを投与すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持しており、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有しており、ここで、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームは第1用量を患者に投与される、を含んでいる。
ある特定の態様では、アントラサイクリンはドキソルビシンである。別の態様では、免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤はドキソルビシンHClリポソーム注射であり、及びHER2を標的とする免疫リポソームはMM−302である。他には、癌は乳癌、カポジ肉腫、卵巣癌、又は多発性骨髄腫である。さらに別の態様では、第1用量が、2週間毎又は3週間毎又は4週間毎に、50mg/m2、40mg/m2、30mg/m2、20mg/m2、又は10mg/m2である。別の態様では、HER2受容体の発現を特徴とする癌はさらに、HER22+、HER23+、又はHER2 FISH陽性であることを特徴としている。他には、ErbB2受容体の発現を特徴とする癌はさらに、細胞当り平均で少なくとも200,000の細胞表面ErbB2受容体を発現することを特徴としている。さらにまた、第1用量での免疫リポソームの投与は癌の治療に有効であり、及び他には、第1用量での免疫リポソームの投与は、免疫リポソームを含有していないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の第1用量での投与と比べて心臓毒性の増大を生じさせない。別の態様では、患者へ第1用量での免疫リポソームの投与は、患者の血流中において免疫リポソームのピーク濃度をもたらし、及びほぼピーク濃度の免疫リポソームを含有している培地中で培養することによるインビトロでのヒト心筋の治療が、免疫リポソームを含んでいない培地中で培養したコントロールのヒト心筋細胞と比べて、培養した心筋細胞中のpERK又はpAKTのヘレグリン刺激による増大を減少させないか又は5%未満だけ減少させる。別の態様では、患者の血流中の免疫リポソーム濃度は血清免疫リポソーム濃度として測定される。さらに別の態様では、それぞれのHER2免疫リポソームはその表面に、平均45の抗HER2抗体分子を担持している。
MM−302リポソームは、ドキソルビシンをゲル化又は沈降状態で含有している水性スペースを封入している直径が約75〜110nmの単層脂質二重層ベシクルである。脂質膜は、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンからなり、該ポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンはリン脂質分子200に対してPEG分子約1つの量を有しており、ここで、それぞれ1780のリン脂質分子に対する約1個のPEG鎖はその末端にHER2と結合する単鎖Fv抗体断片を有している。MM−302リポソームは、HSPC(水素化大豆ホスファチジルコリン):コレステロール(植物由来):PEG−DSPE(ポリエチレングリコール−ジステロイルホスフォエタノールアミン)のモル比3:2:0.3から製造される。MM−302の総HSPC脂質濃度は約40ミリモル/Lである。MM−302は約10ミリモル/Lの脂質、及び約2mg/mLのドキソルビシンを含有している。MM−302は、0.16〜0.30mg/mLのDSPE−PEG−F5(米国特許第6,210,707号に記載のようにして製造される)を含有しているリポソーム中に1.8〜2.2mg/mLのドキソルビシンを含有している。F5は抗ErbB2(HER2)scFv抗体断片(ATCCプラスミド受託番号PTA−7843によってコードされる)である。MM−302リポソームは、130〜170gのドキソルビシン/モルリン脂質及び12〜25gF5−PEG−DSPE/モルリン脂質を含有している。MM−302は緩衝液(pH6.5)として滅菌した10mM/Lのヒスチジン−HCl、及び等張性を保持するために10%のスクロース中に製剤化される。MM−302リポソームは予め組み込まれている硫酸アンモニウムを用いて組み込まれる。
MM−302の投与
用量1 用量2 用量3 用量4 用量5
1週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
2週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
3週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
4週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
5週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
用量1 用量2 用量3 用量4 用量5
1週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
2週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
3週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
4週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
5週間に1度 10mg/m 2 20mg/m 2 30mg/m 2 40mg/m 2 50mg/m 2
「mg/m2」は、患者の体表面積の平方メートル当りのドキソルビシン(MM−302として製剤化された)のmgを示す。乳癌に対しては、用量3、4、又は5が望ましい。カポジ肉腫に対しては用量1、2、又は3が望ましく、卵巣癌に対しては用量3、4、又は5が望ましく、そして多発性骨肉腫に対しては用量2、3、4、又は5が望ましい。投与計画は「進行性」(転移性腫瘍)と比べて「早期」である(転移前、例えば、アジュバント乳癌)固形腫瘍を有する患者において変えることができる。好ましい腫瘍は腫瘍細胞がHER2を過剰発現するものである。HER2を過剰発現している腫瘍は、HercepTest(登録商標)によってHER2「3+」又はHER2「2+」であると、或いは蛍光in situハイブリダイゼーションによってHER2 FISH+であると同定されるものである。或いは、HER2を過剰発現する好ましい腫瘍は、実施例に記載されている方法で定量して、細胞当り平均200,000又はそれ以上の受容体を発現するものである。
進行性乳癌のMM−302による治療
FISHによって若しくはIHCによって又は細胞当りのHER2受容体の平均数を決定することによって確認されるように、HER2を過剰に発現している局所進行性/切除不能の又は転移性進行性乳癌を有する患者に、MM−302を4週間に1度、8、16、30、40、又は50mg/m2を、60分かけて静脈内(IV)注入により投与する。1)絶対好中球数(ANC)≧1,500/μL;2)血小板数≧100,000/μL;及び3)ヘモグロビン≧9g/dL(輸血許容)から明らかなように、患者は適切な骨髄予備能を有していなければならない。1)血清総ビリルビン≦ULNの1.5倍;並びに2)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)及びアルカリホスファターゼ(ALP)が正常であるか又は正常上限の2.5倍まで(ULN;肝転移及び/又は骨転移がある場合はALPに関して5倍のULNは許容される)から明らかなように、患者は適切な肝機能を有していなければならない。血清クレアチニン≦ULNの1.5倍から明らかなように、患者は適切な腎機能を有していなければならない。患者は、以前の手術、放射線治療又は乳癌の治療を意図するその他の治療の何れかの臨床関連毒性作用から回復していなければならない。生殖能力のある男性と同様に妊娠の可能性がある女性及び彼らのパートナーにも、治療中及びMM−302の最終投与から90日間、性行為を慎むか又は避妊の効果的な形態を用いるように警告しなければならない。治療の約30日以内にECHO又はMUGAで測定された≧50の左心室駆出分画率から明らかなように、患者は適切な心臓機能を有していなければならない。妊娠中又は授乳中の患者及びNYHAクラスIII又はIVの鬱血性心不全、或いは<50%の左心室駆出分画率(LVEF)、或いは延長したQTC間隔(≧460ms)を有する患者は、MM−302で治療しないことが好ましい。
FISHによって若しくはIHCによって又は細胞当りのHER2受容体の平均数を決定することによって確認されるように、HER2を過剰に発現している局所進行性/切除不能の又は転移性進行性乳癌を有する患者に、MM−302を4週間に1度、8、16、30、40、又は50mg/m2を、60分かけて静脈内(IV)注入により投与する。1)絶対好中球数(ANC)≧1,500/μL;2)血小板数≧100,000/μL;及び3)ヘモグロビン≧9g/dL(輸血許容)から明らかなように、患者は適切な骨髄予備能を有していなければならない。1)血清総ビリルビン≦ULNの1.5倍;並びに2)アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)及びアルカリホスファターゼ(ALP)が正常であるか又は正常上限の2.5倍まで(ULN;肝転移及び/又は骨転移がある場合はALPに関して5倍のULNは許容される)から明らかなように、患者は適切な肝機能を有していなければならない。血清クレアチニン≦ULNの1.5倍から明らかなように、患者は適切な腎機能を有していなければならない。患者は、以前の手術、放射線治療又は乳癌の治療を意図するその他の治療の何れかの臨床関連毒性作用から回復していなければならない。生殖能力のある男性と同様に妊娠の可能性がある女性及び彼らのパートナーにも、治療中及びMM−302の最終投与から90日間、性行為を慎むか又は避妊の効果的な形態を用いるように警告しなければならない。治療の約30日以内にECHO又はMUGAで測定された≧50の左心室駆出分画率から明らかなように、患者は適切な心臓機能を有していなければならない。妊娠中又は授乳中の患者及びNYHAクラスIII又はIVの鬱血性心不全、或いは<50%の左心室駆出分画率(LVEF)、或いは延長したQTC間隔(≧460ms)を有する患者は、MM−302で治療しないことが好ましい。
以下の実施例は単なる説明であって、本開示を目にした当業者には多くの改変及び均等物が明らかであるように、本開示の範囲は限定して解釈されるべきではない。
これらの実施例で用いられる材料及び方法:
材料:
ドキソルビシンは SIGMA-ALDRICH, Inc. (St. Louis, MO) 製である。FITC結合レクチン(lycopersicon esculentum(トマト)レクチン、Cat#FL−1171)は Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) から入手した。酢酸、メタノール、及びアセトニトリルは EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ) 製である。水及びトリフルオロ酢酸(TFA)はJ. T. Baker (Phillipsburg, NJ) 製である。HOECHST33342・三塩酸塩・三水和物、ProLong Gold(登録商標)、及びDiIC18(5)−DS(DiI5)は、Invitrogen (Carlsbad, CA) 製である。コレステロール及び1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスフォエタノールアミン−N−[アミノ(ポリエチレングリコール)−2000](アンモニウム塩)(PEG−DSPE)は、Avanti Polar Lipids Inc.製である。水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)はLipoid (Newark, NJ) 製である。RPMIはLonza (Walkersville, MD) 製であり、ウシ胎仔血清(FBS)はTissue Culture Biologicals製であり、そしてペニシリンG/硫酸ストレプトマイシン混合物はGIBCO (Invitrogen)製である。
材料:
ドキソルビシンは SIGMA-ALDRICH, Inc. (St. Louis, MO) 製である。FITC結合レクチン(lycopersicon esculentum(トマト)レクチン、Cat#FL−1171)は Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) から入手した。酢酸、メタノール、及びアセトニトリルは EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ) 製である。水及びトリフルオロ酢酸(TFA)はJ. T. Baker (Phillipsburg, NJ) 製である。HOECHST33342・三塩酸塩・三水和物、ProLong Gold(登録商標)、及びDiIC18(5)−DS(DiI5)は、Invitrogen (Carlsbad, CA) 製である。コレステロール及び1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスフォエタノールアミン−N−[アミノ(ポリエチレングリコール)−2000](アンモニウム塩)(PEG−DSPE)は、Avanti Polar Lipids Inc.製である。水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)はLipoid (Newark, NJ) 製である。RPMIはLonza (Walkersville, MD) 製であり、ウシ胎仔血清(FBS)はTissue Culture Biologicals製であり、そしてペニシリンG/硫酸ストレプトマイシン混合物はGIBCO (Invitrogen)製である。
免疫リポソームの製造:
既述のようにして(Kirpotin et. al., Cancer Res. 2006;66:6732-40; Park et al., Clin Cancer Res. 2002;8:1172-81)、硫酸アンモニウム勾配を用いてリポソームを製造しドキソルビシンを取り込ませた。脂質成分はHSPC、コレステロール、及びPEG−DSPE(3:2:0.3、モル:モル:モル)である。Nellis et al.,(Biotechnol Prog. 2005; 21:205-20; Biotechnol Prog. 2005; 21:221-32)によって報告されているように、抗ErbB2(F5)−PEG−DSPE結合物を製造し、そしてリポソームに組み込んで免疫リポソームを形成する。DiIC18(5)−DS(DiI5)染色剤を総リン脂質の0.3モル%の濃度で、脂質成分と可溶化した以外は、上記のようにしてDiI−5−標識化リポソーム、MM−302−DiI5及びPLD−DiI5を製造する。全ての場合に、取り込まれなかった遊離ドキソルビシンを、Sephadex(登録商標)G−75サイズ排除カラムを用いHepes緩衝食塩水(pH6.5)で溶出して除去する。F5−リポ−DiI5を、ドキソルビシンを用いずに上記と同様な方法で製造して、HEPES緩衝食塩水(pH6.5)の水性溶液を取り込む。
既述のようにして(Kirpotin et. al., Cancer Res. 2006;66:6732-40; Park et al., Clin Cancer Res. 2002;8:1172-81)、硫酸アンモニウム勾配を用いてリポソームを製造しドキソルビシンを取り込ませた。脂質成分はHSPC、コレステロール、及びPEG−DSPE(3:2:0.3、モル:モル:モル)である。Nellis et al.,(Biotechnol Prog. 2005; 21:205-20; Biotechnol Prog. 2005; 21:221-32)によって報告されているように、抗ErbB2(F5)−PEG−DSPE結合物を製造し、そしてリポソームに組み込んで免疫リポソームを形成する。DiIC18(5)−DS(DiI5)染色剤を総リン脂質の0.3モル%の濃度で、脂質成分と可溶化した以外は、上記のようにしてDiI−5−標識化リポソーム、MM−302−DiI5及びPLD−DiI5を製造する。全ての場合に、取り込まれなかった遊離ドキソルビシンを、Sephadex(登録商標)G−75サイズ排除カラムを用いHepes緩衝食塩水(pH6.5)で溶出して除去する。F5−リポ−DiI5を、ドキソルビシンを用いずに上記と同様な方法で製造して、HEPES緩衝食塩水(pH6.5)の水性溶液を取り込む。
腫瘍細胞の培養:
BT474−M3細胞(Noble, Cancer Chemother. Pharmacol. 2009 64:741-51 を参照されたい)は、HER2過剰発現ヒト乳癌細胞である。BT474−M3細胞は10%FBS及び1%ペニシリンG/硫酸ストレプトマイシンを含有しているRPMI培地で培養される。胚幹細胞由来(ESCd)心筋細胞を、 P.W. Zandstra, Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada; (Bauwens et al., Tissue Eng Part A. 2011 Apr 25, PMID 21417693;)から入手した。これらの細胞は、LIMドメインホメオボックス遺伝子Isl−1、トロポニンT、及びミオシン軽鎖2cのような心筋細胞の適切な細胞マーカーを発現することが示されている。トロポニン陽性細胞のパーセントを分化後に確認する。トロポニンTについて70%未満の陽性を含有しているバッチを廃棄する。誘導多能性幹細胞由来(iPSd)細胞をCell Dynamics Internationalから入手して製造会社のプロトコルに従って取り扱う。
BT474−M3細胞(Noble, Cancer Chemother. Pharmacol. 2009 64:741-51 を参照されたい)は、HER2過剰発現ヒト乳癌細胞である。BT474−M3細胞は10%FBS及び1%ペニシリンG/硫酸ストレプトマイシンを含有しているRPMI培地で培養される。胚幹細胞由来(ESCd)心筋細胞を、 P.W. Zandstra, Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada; (Bauwens et al., Tissue Eng Part A. 2011 Apr 25, PMID 21417693;)から入手した。これらの細胞は、LIMドメインホメオボックス遺伝子Isl−1、トロポニンT、及びミオシン軽鎖2cのような心筋細胞の適切な細胞マーカーを発現することが示されている。トロポニン陽性細胞のパーセントを分化後に確認する。トロポニンTについて70%未満の陽性を含有しているバッチを廃棄する。誘導多能性幹細胞由来(iPSd)細胞をCell Dynamics Internationalから入手して製造会社のプロトコルに従って取り扱う。
異種移植の検討:
5〜7週齢の雌性ヌードマウスをCharles River Laboratories 又は Taconic Farms, Inc.から購入する(NCrヌードマウス)。別段に指示されない限り、マウスはマウスの背部右脇腹内に(皮下注射で、s.c.)BT474−M3乳癌細胞又はNCI−N87胃癌細胞(NCI−DPT、RPMI100μL中10×106細胞)を接種される。腫瘍が平均体積〜200mm3に達したときに、以下に記載のような検討を行った。
5〜7週齢の雌性ヌードマウスをCharles River Laboratories 又は Taconic Farms, Inc.から購入する(NCrヌードマウス)。別段に指示されない限り、マウスはマウスの背部右脇腹内に(皮下注射で、s.c.)BT474−M3乳癌細胞又はNCI−N87胃癌細胞(NCI−DPT、RPMI100μL中10×106細胞)を接種される。腫瘍が平均体積〜200mm3に達したときに、以下に記載のような検討を行った。
腫瘍HER2レベルの検査:
ホモ接合型NCrヌードマウスの右上側から二番目の乳房脂肪体に15×106個のBT474−M3細胞を接種する。BT474−M3腫瘍を、ドキソルビシンを有さない蛍光標識された(以下に記載されるようにDiI5で)、HER2標的化又は非標的化リポソーム4mg/mlの単回用量で注射した。24時間後に、腫瘍を摘出して機械的又は酵素的手段で解離する。抗HER2による表面染色の後、細胞をFACSCalibur(登録商標)装置(BD Biosciences)上でのフローサイトメトリーによって分析する。HER2のシグナルが増大することによって定義された狭く囲われた細胞サブセットにおいて、上昇したリポソーム含有量を有する細胞の全てを含めたパーセントをプロットすることによって、フローサイトメトリーのデータセットを所定の閾値を上回るHER2の表面発現レベルとリポソームの取り込みとの間の関係について分析する。
ホモ接合型NCrヌードマウスの右上側から二番目の乳房脂肪体に15×106個のBT474−M3細胞を接種する。BT474−M3腫瘍を、ドキソルビシンを有さない蛍光標識された(以下に記載されるようにDiI5で)、HER2標的化又は非標的化リポソーム4mg/mlの単回用量で注射した。24時間後に、腫瘍を摘出して機械的又は酵素的手段で解離する。抗HER2による表面染色の後、細胞をFACSCalibur(登録商標)装置(BD Biosciences)上でのフローサイトメトリーによって分析する。HER2のシグナルが増大することによって定義された狭く囲われた細胞サブセットにおいて、上昇したリポソーム含有量を有する細胞の全てを含めたパーセントをプロットすることによって、フローサイトメトリーのデータセットを所定の閾値を上回るHER2の表面発現レベルとリポソームの取り込みとの間の関係について分析する。
細胞表面HER2の単一細胞における分布:
BT474−M3腫瘍異種移植組織を抗HER2抗体で染色してDAPIで対比染色する。スライドを、Aperio(登録商標)Scanscope(登録商標)を用いて倍率20倍で画像化して、画像を分析する。HER2膜染色の強度を、(HER2層の内縁の平均値)+(HER2層の外縁の平均値)として単一細胞を基準として定量する。
BT474−M3腫瘍異種移植組織を抗HER2抗体で染色してDAPIで対比染色する。スライドを、Aperio(登録商標)Scanscope(登録商標)を用いて倍率20倍で画像化して、画像を分析する。HER2膜染色の強度を、(HER2層の内縁の平均値)+(HER2層の外縁の平均値)として単一細胞を基準として定量する。
有効性の検討:
3mg/kg(q7d、n=3、総用量)で、PBS(コントロール)、MM−302又はPLDを投与されたマウス由来の平均腫瘍体積に基づいて、マウスを3つの処置群(n=7/群)に無作為に分ける。1週間に2回腫瘍をノギスで測定する。式:幅2×長さ×0.52、を用いて腫瘍体積を計算する。1週間に2回マウスの体重を測定して体重減少を観察する。
3mg/kg(q7d、n=3、総用量)で、PBS(コントロール)、MM−302又はPLDを投与されたマウス由来の平均腫瘍体積に基づいて、マウスを3つの処置群(n=7/群)に無作為に分ける。1週間に2回腫瘍をノギスで測定する。式:幅2×長さ×0.52、を用いて腫瘍体積を計算する。1週間に2回マウスの体重を測定して体重減少を観察する。
HER2を発現している細胞株のリポソームの取り込み:
各種レベルのHER2を発現している複数の細胞株を15μg/mlのMM−302又はPLDで2時間処置して、細胞内ドキソルビシンをHPLCで定量する。マウス4T1乳癌細胞及びヒトHeLa子宮頸癌細胞をATCCから得て、ATCCのアドバイスに従って増殖させる。市販の抗HER2抗体(BD Biosciences #340552)を用いるフローサイトメトリーで、細胞をヒトHER2発現について特徴付ける。この抗体はマウスHER2とは交差反応しないがヒトHER2を検出する。ヒトHER2をコードするネオマイシン選択可能な発現ベクターをGeneCopeia(Z2866) から入手する。4T1及びHeLa細胞をこの構築物で、非脂質ポリマートランスフェクション試薬 MegaTran(登録商標)1.0(Origene)を用い製造会社の使用説明書に従って、トランスフェクトした。400〜500μg/mlのジェネテシン/ネオマイシン(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした細胞を選択する。生存細胞を減少したジェネテシン/ネオマイシン(100μg/ml)の下で増殖させ、BD Biosciences FACSAria(登録商標)装置でふるい分けして、親のHeLa細胞で観察されるものを上回るヒトHER2の発現を有する濃縮された細胞集団を得る。次いで選別により濃縮された細胞を限定希釈によってサブクローン化し、コロニーをHER2表面レベルによってランク付けし、HER2を異なった範囲で発現する4T1及びHeLa細胞の代表的な集団を得る。フローサイトメトリーで測定されるHER2による表面染色の蛍光強度を、製造会社の使用説明書に従ってQuantum(登録商標)Simply Cellular(登録商標)抗マウスIgGミクロスフェア(Bangs Laboratories #815)に結合する同じ抗体を用いた染色と比較して、細胞のHER2表面受容体の数を計算する。
各種レベルのHER2を発現している複数の細胞株を15μg/mlのMM−302又はPLDで2時間処置して、細胞内ドキソルビシンをHPLCで定量する。マウス4T1乳癌細胞及びヒトHeLa子宮頸癌細胞をATCCから得て、ATCCのアドバイスに従って増殖させる。市販の抗HER2抗体(BD Biosciences #340552)を用いるフローサイトメトリーで、細胞をヒトHER2発現について特徴付ける。この抗体はマウスHER2とは交差反応しないがヒトHER2を検出する。ヒトHER2をコードするネオマイシン選択可能な発現ベクターをGeneCopeia(Z2866) から入手する。4T1及びHeLa細胞をこの構築物で、非脂質ポリマートランスフェクション試薬 MegaTran(登録商標)1.0(Origene)を用い製造会社の使用説明書に従って、トランスフェクトした。400〜500μg/mlのジェネテシン/ネオマイシン(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした細胞を選択する。生存細胞を減少したジェネテシン/ネオマイシン(100μg/ml)の下で増殖させ、BD Biosciences FACSAria(登録商標)装置でふるい分けして、親のHeLa細胞で観察されるものを上回るヒトHER2の発現を有する濃縮された細胞集団を得る。次いで選別により濃縮された細胞を限定希釈によってサブクローン化し、コロニーをHER2表面レベルによってランク付けし、HER2を異なった範囲で発現する4T1及びHeLa細胞の代表的な集団を得る。フローサイトメトリーで測定されるHER2による表面染色の蛍光強度を、製造会社の使用説明書に従ってQuantum(登録商標)Simply Cellular(登録商標)抗マウスIgGミクロスフェア(Bangs Laboratories #815)に結合する同じ抗体を用いた染色と比較して、細胞のHER2表面受容体の数を計算する。
心筋細胞におけるリポソームの取り込み:
iPSd心筋細胞(Cell Dynamics International Cat# CMC-100-110-001)を、製造会社の説明書に従って、24ウェルの組織培養プレートに250,000細胞/ウェルで蒔く。2日後に、ウェル中の培地を0.5ml除去して、MM−302、PLD又は遊離ドキソルビシンを15.0μg/ml(dox equiv.)で含む0.5mlと置き換える。プレートを「8の字様」に20回回転させて細胞のリポソームへの曝露を最大にする。細胞をMM−302、PLD、又は遊離ドキソルビシンと示された期間培養して、その後培地を除去し、細胞を0.5mlのPBSで一回洗浄する。PBSを除去して、0.5mlの0.05%トリプシンを各ウェルに添加する。細胞を観察して、細胞の剥離が始まったら、FBSを含有している0.5mlの培地を各ウェルに添加してトリプシンを不活性化する。細胞を採取してマイクロ遠心分離管に入れる。細胞を1,500rpmで4℃、5分間回転させる。細胞ペレットを1.0%酢酸のメタノール溶液0.5ml中にボルテックス及びピペッティングすることによって再懸濁し、−80℃で1時間放置してドキソルビシンを抽出する。再懸濁した細胞ペレットを含有しているマイクロ遠心分離管を低温室で10分間10,000rpmで回転させて、450μlの上澄液をHPLC管に移す。サンプルをHPLC機械上で操作してサンプル当りの濃度をドキソルビシンの標準曲線に関連する値によって決定する。
iPSd心筋細胞(Cell Dynamics International Cat# CMC-100-110-001)を、製造会社の説明書に従って、24ウェルの組織培養プレートに250,000細胞/ウェルで蒔く。2日後に、ウェル中の培地を0.5ml除去して、MM−302、PLD又は遊離ドキソルビシンを15.0μg/ml(dox equiv.)で含む0.5mlと置き換える。プレートを「8の字様」に20回回転させて細胞のリポソームへの曝露を最大にする。細胞をMM−302、PLD、又は遊離ドキソルビシンと示された期間培養して、その後培地を除去し、細胞を0.5mlのPBSで一回洗浄する。PBSを除去して、0.5mlの0.05%トリプシンを各ウェルに添加する。細胞を観察して、細胞の剥離が始まったら、FBSを含有している0.5mlの培地を各ウェルに添加してトリプシンを不活性化する。細胞を採取してマイクロ遠心分離管に入れる。細胞を1,500rpmで4℃、5分間回転させる。細胞ペレットを1.0%酢酸のメタノール溶液0.5ml中にボルテックス及びピペッティングすることによって再懸濁し、−80℃で1時間放置してドキソルビシンを抽出する。再懸濁した細胞ペレットを含有しているマイクロ遠心分離管を低温室で10分間10,000rpmで回転させて、450μlの上澄液をHPLC管に移す。サンプルをHPLC機械上で操作してサンプル当りの濃度をドキソルビシンの標準曲線に関連する値によって決定する。
リポソームの生体内分布:
PBS、ドキソルビシン、MM−302−DiI5、又はPLD−DiI5の何れかを単回静脈内(i.v.)用量(全て3mg/kg)で投与されたマウスを、それぞれ4群に無作為に分ける。マウス(n=4/時点/群)を、単回投与後0.5、4、24、及び96時間(ドキソルビシン)又は168時間(MM−302−DiI5及びPLD−DiI5)に屠殺する。屠殺の5分前に、血管系を標識化するために100μlのFITC−レクチンをマウスに注射する。
PBS、ドキソルビシン、MM−302−DiI5、又はPLD−DiI5の何れかを単回静脈内(i.v.)用量(全て3mg/kg)で投与されたマウスを、それぞれ4群に無作為に分ける。マウス(n=4/時点/群)を、単回投与後0.5、4、24、及び96時間(ドキソルビシン)又は168時間(MM−302−DiI5及びPLD−DiI5)に屠殺する。屠殺の5分前に、血管系を標識化するために100μlのFITC−レクチンをマウスに注射する。
ドキソルビシンのHPLCによる定量化:
心臓組織の重さを量り、3分間TissueLyser(登録商標)(Qiagen)を用いて1mlの水で分離させる。次いで、100μlのホモジネートを新しい管に移して1%酢酸/メタノールを900μl添加する。培養細胞に関しては、細胞を、上記のように薬剤で処置し、トリプシン処置して、1.0%酢酸のメタノール溶液を用いて溶解する。溶解物を10秒間ボルテックスして、−80℃で1時間放置する。サンプルを室温(RT)で10分間、10,000RPMで回転させる。上澄液及びドキソルビシン標準品をC18逆相カラム(Synergi(登録商標)POLAR−RP(登録商標)80Å250x4.60mm 4μm カラム)を用いるHPLC(Dionex)で分析する。ドキソルビシンは、30%アセトニトリル;70%0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)/H2Oから55%アセトニトリル;45%0.1%TFA/H2Oの濃度勾配を流速1.0ml/分、7分間で走らせて溶出する。ドキソルビシンのピークは、485nmで励起され、590nmで発光し、インライン蛍光検出器を用いて6.5分に検出される。心臓組織からのドキソルビシンの抽出効率は、既知量のドキソルビシンでスパイクしたコントロールの心臓で測定されるように、83%であった。
心臓組織の重さを量り、3分間TissueLyser(登録商標)(Qiagen)を用いて1mlの水で分離させる。次いで、100μlのホモジネートを新しい管に移して1%酢酸/メタノールを900μl添加する。培養細胞に関しては、細胞を、上記のように薬剤で処置し、トリプシン処置して、1.0%酢酸のメタノール溶液を用いて溶解する。溶解物を10秒間ボルテックスして、−80℃で1時間放置する。サンプルを室温(RT)で10分間、10,000RPMで回転させる。上澄液及びドキソルビシン標準品をC18逆相カラム(Synergi(登録商標)POLAR−RP(登録商標)80Å250x4.60mm 4μm カラム)を用いるHPLC(Dionex)で分析する。ドキソルビシンは、30%アセトニトリル;70%0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)/H2Oから55%アセトニトリル;45%0.1%TFA/H2Oの濃度勾配を流速1.0ml/分、7分間で走らせて溶出する。ドキソルビシンのピークは、485nmで励起され、590nmで発光し、インライン蛍光検出器を用いて6.5分に検出される。心臓組織からのドキソルビシンの抽出効率は、既知量のドキソルビシンでスパイクしたコントロールの心臓で測定されるように、83%であった。
心臓スナップ凍結切片の共焦点顕微鏡及び画像分析:
厚さ10μmの心臓切片を室温で30分間風乾し、封入剤(ProLong(登録商標)Gold、Invitrogen)で1:10,000に希釈したHoechst(登録商標)33342で対比染色して、封入する。スライドを、Plan−Neofluar(登録商標)40x/1.3油DIC対物レンズを有し、Enterprise(351、364nm)、Argon(458、477、488、514nm)、HeNel(543nm)及びHeNe2(594)レーザーを備えるLSM510Zeiss(登録商標)共焦点顕微鏡上で画像化する。画像分析及び核ドキソルビシンの定量化はDefiniens(登録商標)Developer XD(登録商標)(Definiens, Parsippany, NJ)を用いて実施する。核をHoechstチャンネルに区分する。ドキソルビシン陽性の核をドキソルビシンチャンネルに区分する。ドキソルビシン陽性の核のパーセントを、Hoechstチャンネル中の総核対象物で割ったドキソルビシンチャンネル中の対象物の数の比として定量する。
厚さ10μmの心臓切片を室温で30分間風乾し、封入剤(ProLong(登録商標)Gold、Invitrogen)で1:10,000に希釈したHoechst(登録商標)33342で対比染色して、封入する。スライドを、Plan−Neofluar(登録商標)40x/1.3油DIC対物レンズを有し、Enterprise(351、364nm)、Argon(458、477、488、514nm)、HeNel(543nm)及びHeNe2(594)レーザーを備えるLSM510Zeiss(登録商標)共焦点顕微鏡上で画像化する。画像分析及び核ドキソルビシンの定量化はDefiniens(登録商標)Developer XD(登録商標)(Definiens, Parsippany, NJ)を用いて実施する。核をHoechstチャンネルに区分する。ドキソルビシン陽性の核をドキソルビシンチャンネルに区分する。ドキソルビシン陽性の核のパーセントを、Hoechstチャンネル中の総核対象物で割ったドキソルビシンチャンネル中の対象物の数の比として定量する。
受容体の定量化:
幹細胞由来の心筋細胞をトリプシン処置し、洗浄して、HER2レベルを上記「HER2を発現している細胞株のリポソームの取り込み」に記載されているようにして測定する。
幹細胞由来の心筋細胞をトリプシン処置し、洗浄して、HER2レベルを上記「HER2を発現している細胞株のリポソームの取り込み」に記載されているようにして測定する。
生存能:
ESCd心筋細胞を3時間指示された濃度のMM302、PLD及びドキソルビシンで処置する。細胞をPBSで2回洗浄し、新鮮な培地を加えて、細胞を更に24時間培養する。細胞の生存能を、Promega(Madison, WI)のCellTiter−Glo(登録商標)を用いて評価して生存細胞のパーセントを未処置群と比較して決定する。
ESCd心筋細胞を3時間指示された濃度のMM302、PLD及びドキソルビシンで処置する。細胞をPBSで2回洗浄し、新鮮な培地を加えて、細胞を更に24時間培養する。細胞の生存能を、Promega(Madison, WI)のCellTiter−Glo(登録商標)を用いて評価して生存細胞のパーセントを未処置群と比較して決定する。
トロポニンIのELISA:
15,000iPSd(iCELL(登録商標))心筋細胞(Cellular Dynamics International, Madison WI)を製造会社のプロトコルに従ってプレートに蒔く。細胞を24時間指示されている濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM−302で処置する。上澄液を採取して、製造会社のプロトコルに従ってヒトトロポニンI ELISA(カタログ番号:GWB−83A61F、Genway Biotech, San Diego CA)を用いて分析する。PrestoBlue(登録商標)Cell Viability Assay(カタログ番号:A−13261、Invitrogen, Grand Island, NY)が、製造会社のプロトコルに従って100μl中で残っている細胞に対して実施される。
15,000iPSd(iCELL(登録商標))心筋細胞(Cellular Dynamics International, Madison WI)を製造会社のプロトコルに従ってプレートに蒔く。細胞を24時間指示されている濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM−302で処置する。上澄液を採取して、製造会社のプロトコルに従ってヒトトロポニンI ELISA(カタログ番号:GWB−83A61F、Genway Biotech, San Diego CA)を用いて分析する。PrestoBlue(登録商標)Cell Viability Assay(カタログ番号:A−13261、Invitrogen, Grand Island, NY)が、製造会社のプロトコルに従って100μl中で残っている細胞に対して実施される。
ハイコンテント解析:
心筋細胞を上記のように処置する。3.7%のホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、0.1%のTween−20(PBS−T)を含有しているPBSで2回洗浄して、メタノールで透過処理する。LI−COR(登録商標)Odyssey(登録商標)Blocking Buffer(Lincoln, NE)とPBS−Tの1:1混合物を用いて細胞を室温(RT)で1時間ブロックする。Cell Signaling Technology(Berverly, MA)から得られる指示されている一次抗体の1:400希釈液で細胞を染色して、4℃で1晩振とう培養する。細胞を洗浄して、蛍光標識した二次抗体の1:2,000希釈液で1時間RTにて培養する。細胞を、Hoechst33342の1:10,000希釈液及びPierce Protein Research Products(Rockford, IL)から得られるWole Cell Stainの1:1,000希釈液でRTにて30分間染色して、DNAと全細胞をそれぞれ可視化する。10倍対物レンズを有するApplied Precision Instruments ArrayWorx (登録商標)High Content Scanner(Issaquah, WA)を用いてHoechst33342/Whole Cell Stain(460nm)、ドキソルビシン(595nm)、及びAPC/DiI5(657nm)についてプレートを走査する。ソフトウェアImageRailを用いて画像を分析する(Millard et al., Nat Methods. 2011;8:487-92 に記載されているように)。核及び全細胞シグナルについて強度閾値を確立する。次いで、この閾値を全画像に適用して区分した個々の細胞に用いる。データは、指示されたチャンネルについて所定のウェル中の全細胞に関する平均画素強度として表わされる。
心筋細胞を上記のように処置する。3.7%のホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、0.1%のTween−20(PBS−T)を含有しているPBSで2回洗浄して、メタノールで透過処理する。LI−COR(登録商標)Odyssey(登録商標)Blocking Buffer(Lincoln, NE)とPBS−Tの1:1混合物を用いて細胞を室温(RT)で1時間ブロックする。Cell Signaling Technology(Berverly, MA)から得られる指示されている一次抗体の1:400希釈液で細胞を染色して、4℃で1晩振とう培養する。細胞を洗浄して、蛍光標識した二次抗体の1:2,000希釈液で1時間RTにて培養する。細胞を、Hoechst33342の1:10,000希釈液及びPierce Protein Research Products(Rockford, IL)から得られるWole Cell Stainの1:1,000希釈液でRTにて30分間染色して、DNAと全細胞をそれぞれ可視化する。10倍対物レンズを有するApplied Precision Instruments ArrayWorx (登録商標)High Content Scanner(Issaquah, WA)を用いてHoechst33342/Whole Cell Stain(460nm)、ドキソルビシン(595nm)、及びAPC/DiI5(657nm)についてプレートを走査する。ソフトウェアImageRailを用いて画像を分析する(Millard et al., Nat Methods. 2011;8:487-92 に記載されているように)。核及び全細胞シグナルについて強度閾値を確立する。次いで、この閾値を全画像に適用して区分した個々の細胞に用いる。データは、指示されたチャンネルについて所定のウェル中の全細胞に関する平均画素強度として表わされる。
心筋細胞におけるシグナル伝達:
iPS由来心筋細胞(iCell(登録商標)iPS由来ヒト心筋細胞−Cellular Dynamics International (CDI), Madison, Wisconsin - CDI # CMC-100-010-001, Lot 1258680)を、iCell(登録商標)Plating Medium (CDI # CMM-100-110-005, Lot 1013740 )及び iCell(登録商標) Maintenance Medium (CDI # CMM-100-120-005, Lot 1000305) を用いて培養して、MM−302の成分に曝露する。次いで、心筋細胞中のリン酸化AKT(pAKT)及びリン酸化ERK(pERK)のレベルを免疫染色及びハイコンテント顕微鏡法を用いて測定する。細胞を、トラスツズマブ、ラパチニブ、又はMM−302抗体(F5−scFv)のいずれかで、及びドキソルビシンを含有していないMM−302の5.0μg/mlと等価な濃度のMM−302分子(リポソーム)(F5−リポ)で前処置する。10nM及び5nMのヘレグリンでの10分間の刺激に続いて、(A)pAKT及び(B)pERKのそれぞれについて上に記載したように細胞を染色し、そしてハイコンテント顕微鏡法を用いて画像化する。以下の一次抗体をブロッキングバッファーで1:400に希釈して用いる:pERK抗体−Cell Signaling Technology (CST - Danvers Massachusetts)−Catalog 9106L (Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (E10) Mouse mAb #9106);pAKT抗体−CST−Catalog 4060L (Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP(登録商標)Rabbit mAb #4060)。二次抗体は、抗マウスIgG(H+L)、F(ab’)2断片(Alexa Fluor(登録商標)647 Conjugate)−CST−Catalog 4410;抗ウサギIgG(H+L)、F(ab’)2断片(Alexa Fluor(登録商標)647 Conjugate)−CST−Catalog 4414 である。全細胞染色及びDNA染色(Hoechst33342)を上記のように用いる。画像を分析して個々の細胞をHoechst33342核染色に基づいて区分する。単一細胞のシグナル伝達強度をそれぞれの染色について定量して個々の細胞の平均相対強度として表わす。
iPS由来心筋細胞(iCell(登録商標)iPS由来ヒト心筋細胞−Cellular Dynamics International (CDI), Madison, Wisconsin - CDI # CMC-100-010-001, Lot 1258680)を、iCell(登録商標)Plating Medium (CDI # CMM-100-110-005, Lot 1013740 )及び iCell(登録商標) Maintenance Medium (CDI # CMM-100-120-005, Lot 1000305) を用いて培養して、MM−302の成分に曝露する。次いで、心筋細胞中のリン酸化AKT(pAKT)及びリン酸化ERK(pERK)のレベルを免疫染色及びハイコンテント顕微鏡法を用いて測定する。細胞を、トラスツズマブ、ラパチニブ、又はMM−302抗体(F5−scFv)のいずれかで、及びドキソルビシンを含有していないMM−302の5.0μg/mlと等価な濃度のMM−302分子(リポソーム)(F5−リポ)で前処置する。10nM及び5nMのヘレグリンでの10分間の刺激に続いて、(A)pAKT及び(B)pERKのそれぞれについて上に記載したように細胞を染色し、そしてハイコンテント顕微鏡法を用いて画像化する。以下の一次抗体をブロッキングバッファーで1:400に希釈して用いる:pERK抗体−Cell Signaling Technology (CST - Danvers Massachusetts)−Catalog 9106L (Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (E10) Mouse mAb #9106);pAKT抗体−CST−Catalog 4060L (Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP(登録商標)Rabbit mAb #4060)。二次抗体は、抗マウスIgG(H+L)、F(ab’)2断片(Alexa Fluor(登録商標)647 Conjugate)−CST−Catalog 4410;抗ウサギIgG(H+L)、F(ab’)2断片(Alexa Fluor(登録商標)647 Conjugate)−CST−Catalog 4414 である。全細胞染色及びDNA染色(Hoechst33342)を上記のように用いる。画像を分析して個々の細胞をHoechst33342核染色に基づいて区分する。単一細胞のシグナル伝達強度をそれぞれの染色について定量して個々の細胞の平均相対強度として表わす。
以下の実施例の結果は上記の方法又はそれに些細な変更を有する方法を用いて得られた。HER2を種々のレベルで発現する腫瘍細胞株での細胞取り込み試験は、MM−302がHER2を過剰に発現している腫瘍細胞にPLDと比べて著しく高いレベルでドキソルビシンを送達すること、高い透過性を有する遊離ドキソルビシンと比べて同等又はより高いレベルで送達することを明らかにしている。しかしながら、ヒト心筋細胞では、遊離のドキソルビシンが高いレベルで再び取り込まれたのに対して、MM−302及びPLDの両方でのドキソルビシンの取り込みは劇的に低かった。マウスにおける薬物動態試験は、MM−302が、PLDと比較して類似の半減期、クリアランス、及び臓器分布を有していることを明らかにしている。HER2を過剰発現しているBT474乳癌及びNCI−N87胃癌異種移植片において、MM−302は遊離アントラサイクリン及びPLDの両方よりも優れた抗腫瘍活性を示す。腫瘍微小分布研究はさらに、腫瘍におけるドキソルビシンの局在性の差が遊離ドキソルビシン及びPLDと比べたMM−302の活性の増大の要因であることを示唆している。
実施例1:インビトロにおけるHER2発現とMM−302の取り込みの間の相関関係: 多数の細胞株における細胞表面HER2発現のレベルを上記のように確認した。次いでこれらの同じ細胞株を15μg/mlのMM302(図1A、表1)又はPLD(図1B、表2)で180分処置し、その後細胞を採取して細胞に結合しているドキソルビシンの量をHPLCで定量した。処置後にそれぞれの細胞株について細胞当りのHER2受容体の数 対 同一細胞株における細胞当りのドキソルビシンの量をプロッティングすることによって、増大するHER2レベルと増大するドキソルビシンの間の関係が明らかになる。この提示により、細胞当り約200,000のHER2受容体に変曲点があると考えられ、ここでこの数より多くを発現している細胞は一貫してより高いレベルの細胞に結合したドキソルビシン有していると考えられる。纏めると、これらの結果は、変曲点以上のレベルのHER2を発現している細胞(HER2過剰発現癌のような)による高い取り込み、及び変曲点以下のレベルのHER2を発現している細胞(正常組織の細胞、例えば、心筋細胞のような)には取り込まれないか最小限取り込まれるという、MM−302の特異性を裏付けている。
異なった細胞集団内への取り込みを定量するために、赤色蛍光性カルボシアニンのトレーサーであるDiIC18(5)−DS(Invitrogen D12730−DiI5と省略される)を含有するようにMM−302を製造した。DiI5は押出し工程中にリポソームの脂質二重層内に挿入する脂溶性の蛍光染料である。異なった範囲のヒトHER2を発現している4T1−Her2細胞集団を10μg/mlの蛍光標識したMM302と3時間培養し、洗浄して、更に21時間培養した。細胞を採取し、細胞表面ヒトHER2を染色して、フローサイトメトリーによってHER2レベル及びリポソーム結合の両方を分析した。4T1細胞株はネズミHER2を発現するのに対して、MM−302はネズミ受容体と結合しない。図は、これらのリポソームの4T1への取り込みがヒトHER2発現に強く依存していたことを示す(図1C)。異なった範囲のHER2を発現しているHeLa細胞株の集団について同様な結果が得られた(図1D)。これらの結果は更に、MM−302は高レベルのHER2を有している細胞を非常に有効に結合するが比較的低いHER2タンパク質発現を有する細胞とは殆ど結合しないことを明らかにしている。
実施例2:MM−302はHER2過剰発現腫瘍細胞内に効率的に内部移行し、そして異種移植モデルにおいて腫瘍の生育を有意に阻害する:
MM−302のHER2過剰発現腫瘍細胞への結合及び内部移行のレベルを測定するために、BT474−M3細胞(1.7×106HER2/細胞)を15μg/mlのMM−302、PLD又は遊離ドキソルビシンと最大3時間培養した(図2A)。総細胞結合(図2A)及び核内ドキソルビシン蓄積(図2B)から分かるように、MM−302は効果的に腫瘍細胞内に取り込まれた。対照的に、標的化されていない類似物であるPLDは、感知できるほどのいかなる蓄積も示さず、このことはインビトロでリポソームドキソルビシンを効果的に送達するために標的化の必要性を示している。コントロールとしての、遊離ドキソルビシンは自由に細胞に入って核内に蓄積することが示された。結果は、HER2過剰発現腫瘍細胞へのMM−302の効果的な結合及び内部移行を示した。
MM−302のHER2過剰発現腫瘍細胞への結合及び内部移行のレベルを測定するために、BT474−M3細胞(1.7×106HER2/細胞)を15μg/mlのMM−302、PLD又は遊離ドキソルビシンと最大3時間培養した(図2A)。総細胞結合(図2A)及び核内ドキソルビシン蓄積(図2B)から分かるように、MM−302は効果的に腫瘍細胞内に取り込まれた。対照的に、標的化されていない類似物であるPLDは、感知できるほどのいかなる蓄積も示さず、このことはインビトロでリポソームドキソルビシンを効果的に送達するために標的化の必要性を示している。コントロールとしての、遊離ドキソルビシンは自由に細胞に入って核内に蓄積することが示された。結果は、HER2過剰発現腫瘍細胞へのMM−302の効果的な結合及び内部移行を示した。
乳癌の異種移植モデルにおいてMM−302の抗腫瘍活性を評価した。マウスにBT474−M3細胞を接種して、腫瘍体積が平均250mm3に達したときに、PBS(コントロール)、MM−302又はPLD(両方とも6mg/kg dox equiv.)による処置を開始した(q7d、n=3、用量)。MM−302とPLDの両方はコントロールと比較して有意に腫瘍の生育を阻害した(55日目のt検定;p<0.0001)。MM−302はPLDと比較して腫瘍生育のより強い阻害をもたらした(55日目のt検定;p=0.0310)(図2C)。検討終了時に、3例の完全退行がMM−302で観察されたが、PLDではたった1例であった。MM−302及びPLDは同様な薬物動態プロファイルを有していて(図2D)、改善された効果は、長期に渡る曝露ではなく、HER2標的化の結果であることを示唆している。
実施例3:インビボにおけるMM−302の取り込みに対するHER2レベルの影響:
異種移植モデル由来の標的腫瘍細胞内へのMM−302のHER2介在取り込みを、非標的化リポソームドキソルビシンと比較して明らかにするための実験を行った。乳房脂肪体にBT474−M3異種移植腫瘍を担持しているマウスにDiI5で標識したMM−302(DiI5−F5−PLD)又はUT−PLD(DiI5−UT−PL)を注射した。腫瘍の単一細胞懸濁液を調製してFITC−HER2抗体で染色した。DiI5陽性−HER2陽性細胞をFACSで測定した。上昇したドキソルビシンレベルを有する特徴的な細胞集団が確認され、リポソームは腫瘍間質腔内に蓄積されているばかりではなく、細胞自体の中にも取り込まれていることが示された(図3A)。これはHER2標的化リポソームで処置した腫瘍に由来する細胞サンプルにおいて特に明らかだった。上昇したリポソーム含量を有する細胞のパーセントは細胞当り平均100,000及び200,000のHER2受容体を発現する細胞サブセットで上昇し始めた。非標的化リポソームはHER2陽性細胞への優先的な取り込みを示さなかった。これらの結果は、インビボにおける腫瘍細胞へのMM−302の取り込みがHER2依存性であることを明らかにし、さらに細胞当り少なくとも100,000〜200,000のHER2受容体がMM−302の有意な結合及び内部移行を可能にするために必要であることを裏付けている。
異種移植モデル由来の標的腫瘍細胞内へのMM−302のHER2介在取り込みを、非標的化リポソームドキソルビシンと比較して明らかにするための実験を行った。乳房脂肪体にBT474−M3異種移植腫瘍を担持しているマウスにDiI5で標識したMM−302(DiI5−F5−PLD)又はUT−PLD(DiI5−UT−PL)を注射した。腫瘍の単一細胞懸濁液を調製してFITC−HER2抗体で染色した。DiI5陽性−HER2陽性細胞をFACSで測定した。上昇したドキソルビシンレベルを有する特徴的な細胞集団が確認され、リポソームは腫瘍間質腔内に蓄積されているばかりではなく、細胞自体の中にも取り込まれていることが示された(図3A)。これはHER2標的化リポソームで処置した腫瘍に由来する細胞サンプルにおいて特に明らかだった。上昇したリポソーム含量を有する細胞のパーセントは細胞当り平均100,000及び200,000のHER2受容体を発現する細胞サブセットで上昇し始めた。非標的化リポソームはHER2陽性細胞への優先的な取り込みを示さなかった。これらの結果は、インビボにおける腫瘍細胞へのMM−302の取り込みがHER2依存性であることを明らかにし、さらに細胞当り少なくとも100,000〜200,000のHER2受容体がMM−302の有意な結合及び内部移行を可能にするために必要であることを裏付けている。
HER2の膜での強度分布が、全組織切片において単一細胞を基準として測定され、図3Bに示されており、これは組織における発現のばらつきを表わしている。
実施例4:ヒト心筋細胞はMM−302を活発に取り込むのに十分なレベルのHER2を発現しない:
ヒト心筋細胞は低レベルのHER2を発現することが報告されているので、MM−302を取り込む可能性を有していると考えられていた。インビトロにおいてヒト心臓細胞に対するMM−302の効果を検討するために、ESCd及びiPSdヒト心筋細胞を入手した。心筋細胞上のHER2受容体レベルは、qFACSによって、ESCd及びiPSdヒト心筋細胞において、それぞれ細胞当り約70,000及び200,000受容体であると確認した。これらの結果は、報告されているヒト心臓組織における低いHER2発現と一致している(Fuchs et al., Breast Cancer Res Treat. 2003;82:23-8)。
ヒト心筋細胞は低レベルのHER2を発現することが報告されているので、MM−302を取り込む可能性を有していると考えられていた。インビトロにおいてヒト心臓細胞に対するMM−302の効果を検討するために、ESCd及びiPSdヒト心筋細胞を入手した。心筋細胞上のHER2受容体レベルは、qFACSによって、ESCd及びiPSdヒト心筋細胞において、それぞれ細胞当り約70,000及び200,000受容体であると確認した。これらの結果は、報告されているヒト心臓組織における低いHER2発現と一致している(Fuchs et al., Breast Cancer Res Treat. 2003;82:23-8)。
正常及び病変ヒト心臓組織におけるHER2の発現レベルを定量的免疫組織化学によって測定した。ヒト心臓組織マイクロアレイ(TMA)をHER2に対して及びDAPIで染色して、(平均HER2強度)/コアをDefiniens(登録商標)ソフトウェアを用いて定量した。異なったHER2発現レベルの細胞株を用いて細胞ペレットアレイを上記のように染色し、(平均HER2強度)/コアを定量し、対応するLOG(HER2受容対数)に対してプロットして標準を作成した。作成した標準に基づいて、異なったヒト心臓TMAコアについて平均HER2受容対数/コアを内挿した(表3)。
心筋細胞におけるHER2発現のレベルがMM−302の取り込みを誘発するのに十分であるかを確認するために、ESCd(図4A)及びiPSd(図4B)心筋細胞の処置に続いて、総細胞内ドキソルビシンをHPLCで定量した。遊離のドキソルビシンで処置した心筋細胞(及び癌細胞)は全ての細胞にドキソルビシン蓄積をもたらした。PLDによる処置は、何れの心筋細胞の細胞型にもドキソルビシンの送達の増大をもたらさなかった。HER2過剰発現癌細胞と対照的に、心筋細胞におけるHER2発現レベルはMM−302の活発な取り込みを促進するのに十分ではなかった。纏めると、これらの結果は、MM−302によるドキソルビシンの送達が、PLDと比べて、心筋細胞のような低いレベルのHER2を発現する非標的細胞へのドキソルビシン曝露を増強しないことを明らかにしている。
実施例5:MM−302はヒト心筋細胞の生存能を減少させないか又はアポトーシス応答を刺激しない:
低レベルのドキソルビシンへの曝露は細胞毒性になることがある。MM−302又はPLDによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかどうかを確認するために、ESCd心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM−302と3時間培養した後、洗浄して、新鮮な培地と24時間培養した。遊離のドキソルビシンによる処置は0.2μg/ml程度の低い濃度で生存能の損失をもたらした(図4C)。反対に、MM−302及びPLDによる処置は、最大45μg/mlの非常に優れた治療濃度を含む、試験した何れの濃度でも生存能の減少をもたらさなかった。MM−302又はPLDによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかを更に試験するために、iPSd心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM−302で24時間処置した。ドキソルビシンによる処置はPLD及びMM−302による処置と比べて生存能の顕著な減少をもたらした(図4D)。上昇したレベルの心臓トロポニンの存在は心臓障害の臨床指標である。(D)におけるiPSd心筋細胞由来の上澄液をトロポニンIのレベルについて分析した。図4Eに示されるように、ドキソルビシン処置はPLD又はMM−302による処置と比べてトロポニンIの顕著な増大をもたらした。これらの結果は、ESCd及びiPSd心筋細胞がドキソルビシンに対して感受性があること、及びMM−302及びPLDによる処置は心筋細胞の生存能に影響を与えるのに十分なドキソルビシン曝露をもたらさないことを明らかにしている。
低レベルのドキソルビシンへの曝露は細胞毒性になることがある。MM−302又はPLDによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかどうかを確認するために、ESCd心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM−302と3時間培養した後、洗浄して、新鮮な培地と24時間培養した。遊離のドキソルビシンによる処置は0.2μg/ml程度の低い濃度で生存能の損失をもたらした(図4C)。反対に、MM−302及びPLDによる処置は、最大45μg/mlの非常に優れた治療濃度を含む、試験した何れの濃度でも生存能の減少をもたらさなかった。MM−302又はPLDによる処置が心筋細胞の生存能に影響するかを更に試験するために、iPSd心筋細胞を指示された濃度の遊離ドキソルビシン、PLD又はMM−302で24時間処置した。ドキソルビシンによる処置はPLD及びMM−302による処置と比べて生存能の顕著な減少をもたらした(図4D)。上昇したレベルの心臓トロポニンの存在は心臓障害の臨床指標である。(D)におけるiPSd心筋細胞由来の上澄液をトロポニンIのレベルについて分析した。図4Eに示されるように、ドキソルビシン処置はPLD又はMM−302による処置と比べてトロポニンIの顕著な増大をもたらした。これらの結果は、ESCd及びiPSd心筋細胞がドキソルビシンに対して感受性があること、及びMM−302及びPLDによる処置は心筋細胞の生存能に影響を与えるのに十分なドキソルビシン曝露をもたらさないことを明らかにしている。
細胞の低レベルのドキソルビシンへの曝露は、DNA損傷、細胞ストレス及び初期アポトーシスを含む、細胞生存能測定では明らかにできない僅かな細胞変化を誘発する可能性がある。MM−302、PLD及び遊離ドキソルビシンによる処置に続いて、それらの応答経路のそれぞれにおいてタンパク質で染色して、ハイコンテント顕微鏡を用いて画像化した。ImageRailを用いて得られた画像を分析して単一細胞のデータを作成した。
二本鎖DNA損傷に応答して、ヒストンH2AXはリン酸化されて、γ−H2AXを形成する。心筋細胞の遊離ドキソルビシンによる処置は、核γ−H2AXの用量依存性増大をもたらした(図5A)。しかしながら、MM−302及びPLDによる処置は試験した何れの濃度においても核γ−H2AXシグナルを増大させず、リポソームカプセル化がインビトロにおいて心筋細胞のDNA損傷を阻害したことを示唆している。
細胞ストレスに応答して、HSP27及びp53はリン酸化されて、損傷の程度に応じて細胞周期停止、続いてDNA修復又はアポトーシスを引き起こす。遊離ドキソルビシンに曝露された心臓細胞は、処置に続く細胞ストレスの誘発を示唆しているリン酸化HSP27及びリン酸化p53の用量依存性増大を明らかにしている(図5B及び5C)。しかしながら、濃度に関わらずMM−302又はPLDの何れかで処置した細胞ではリン酸化HSP27の増大は観察されなかった。多くの場合、MM−302又はPLDで処置した細胞においては、5.0μg/mlのMM−302による処置に続くリン酸化p53の僅かな増大を除いて、リン酸化p53に対する影響はないと考えられた。しかしながら、この濃度及びより高い濃度での処置は細胞死を引き起こさなかった。
重度のDNA損傷及び細胞ストレスの場合は、細胞はカスパーゼカスケードの活性化を含むアポトーシス経路を開始して、最終的にはDNA修復タンパク質PARPの切断を引き起こす。遊離ドキソルビシン5.0μg/mlによる処置は、観察された細胞死の増大と相関する、核の切断された(cleaved)PARP(cPARP)の増大を引き起こした(図5D)。しかしながら、MM−302及びPLDによる処置は核cPARPの増大を引き起こさず、これらの条件下での処置がアポトーシスを誘発するのには十分ではないことを示唆した。
実施例6:心筋細胞の細胞内シグナル伝達に対するHER2標的化薬剤の影響:
ドキソルビシンとトラスツズマブの併用は、この組み合わせで治療された患者で観察された心臓事象の受入れ難い高発生率により禁忌である。この組み合わせに関連する心臓毒性の作用メカニズムは、ドキソルビシンによる細胞ストレスの誘発と、ドキソルビシンによって誘発された細胞ストレスへの応答に必要とされるHER2シグナル伝達経路のトラスツズマブ介在性の阻害による細胞ストレスの誘発とが、同時に起こることであると考えられる。
ドキソルビシンとトラスツズマブの併用は、この組み合わせで治療された患者で観察された心臓事象の受入れ難い高発生率により禁忌である。この組み合わせに関連する心臓毒性の作用メカニズムは、ドキソルビシンによる細胞ストレスの誘発と、ドキソルビシンによって誘発された細胞ストレスへの応答に必要とされるHER2シグナル伝達経路のトラスツズマブ介在性の阻害による細胞ストレスの誘発とが、同時に起こることであると考えられる。
MM−302による前処置がHER2の介在するシグナル伝達(心筋細胞における必須経路)を変化させるか否かを確認するために、iPDd心筋細胞をトラスツズマブ、ラパチニブ(小分子のHER2チロシンキナーゼ阻害剤)、又はMM−302抗体(F5−scFv)及びドキソルビシンを含有していないことを除いてMM−302と同一の空リポソーム(F5−lipo)で24時間前処置した。10nM(図6A)及び5nM(図6B)のヘレグリン(HRG)で10分間刺激した後、リン酸化AKT(pAKT、図6A)及びリン酸化ERK(pERK、図6B)のレベルを上記のようにハイコンテント顕微鏡法で測定した。トラスツズマブによる24時間の前処置は両タンパク質のHRG介在性のリン酸化の減少をもたらした。ラパチニブによる前処置はAKTとERKの基礎リン酸化の減少、さらにはこれらタンパク質のHRG誘発性のリン酸化の完全阻害をもたらした。F5−lipoでの前処置はAKT又はERKのHRG誘発性のリン酸化を阻害しなかった。これらの結果は、HER2を標的にしているのにも関わらず、MM−302は、心筋細胞におけるリガンドによって誘発されるリン酸化AKT及びリン酸化ERKのシグナル伝達を阻害せず、これらの重要な意味をもつシグナル伝達経路を機能的なままにしておくことを示唆している。
これらの結果は、トラスツズマブ及びラパチニブが、F5scFv又はF5lipoよりも、心筋細胞におけるこのシグナル伝達経路に対して有意に大きな悪影響を有していることも示している。これは同様に、MM−302の抗HER2抗体成分が、抗HER2抗体トラスツズマブより心臓毒性が低いことを示している。この結果は、単独の又はMM−302リポソームの外側に結合しているF5が、必須の細胞内シグナル伝達様式であり、その阻害はトラスツズマブ誘発性の心臓毒性を仲介する主要なメカニズムであると考えられている、ヘレグリン(リガンド)によって刺激されるHER2/HER3ヘテロ二量体が介在するシグナル伝達を心筋細胞において妨害しないことを示している。
実施例7:MM−302はマウス心臓組織内に、遊離ドキソルビシンと比べてより低い蓄積を有している:
F5のような特異性の高い抗体断片を有するリポソームの標的化は、一般に、リポソームの総組織沈着を変化させず、むしろ血管外溢出に続くそれらの微小分布を変化させる。MM−302(四角)、PLD(UT−PLD、三角)及びドキソルビシン(遊離dox、丸)のマクロレベル生体内分布を、上記のように接種したNCI−N87腫瘍担持マウスのマウス心臓組織(図7A)、ヒト異種移植腫瘍組織(図7B)及び足組織(図7C)において比較した。マウス(n=4/時点/群)にMM−302、PLD、又は遊離ドキソルビシン(全て、3mg/kg、dox equiv.)を静脈内注射して、注射後0.5、4、24、及び96時間(ドキソルビシンに関して)又は168時間(MM−302及びPLDに関して)に心臓を採取して、ドキソルビシンをHPLCで定量した(図7A)。遊離ドキソルビシンの注射は2つのリポソーム製剤と比べて0.5時間目に心臓に高いピークの曝露をもたらした(注射した用量(i.d.)/組織gの10%)。遊離ドキソルビシン注射後の心臓組織からのドキソルビシンのクリアランスはMM−302及びPLDと比べてより速く、そして24時間におけるドキソルビシンの検出量(i.d./組織gの0.77%)はバックグラウンドに接近していた。MM−302とPLDの両方は24時間がピーク(MM−302とPLDがそれぞれ2.8%と2.6%)である持続した蓄積プロファイルを有したが、168時間目に値はバックグラウンドに戻った。これらの結果は別のPLD製剤の心臓生体内分布について先に報告されたデータのそれと類似の範囲内であった。MM−302とPLDの心臓生体内分布の間に有意な差異は観察されなかった。
F5のような特異性の高い抗体断片を有するリポソームの標的化は、一般に、リポソームの総組織沈着を変化させず、むしろ血管外溢出に続くそれらの微小分布を変化させる。MM−302(四角)、PLD(UT−PLD、三角)及びドキソルビシン(遊離dox、丸)のマクロレベル生体内分布を、上記のように接種したNCI−N87腫瘍担持マウスのマウス心臓組織(図7A)、ヒト異種移植腫瘍組織(図7B)及び足組織(図7C)において比較した。マウス(n=4/時点/群)にMM−302、PLD、又は遊離ドキソルビシン(全て、3mg/kg、dox equiv.)を静脈内注射して、注射後0.5、4、24、及び96時間(ドキソルビシンに関して)又は168時間(MM−302及びPLDに関して)に心臓を採取して、ドキソルビシンをHPLCで定量した(図7A)。遊離ドキソルビシンの注射は2つのリポソーム製剤と比べて0.5時間目に心臓に高いピークの曝露をもたらした(注射した用量(i.d.)/組織gの10%)。遊離ドキソルビシン注射後の心臓組織からのドキソルビシンのクリアランスはMM−302及びPLDと比べてより速く、そして24時間におけるドキソルビシンの検出量(i.d./組織gの0.77%)はバックグラウンドに接近していた。MM−302とPLDの両方は24時間がピーク(MM−302とPLDがそれぞれ2.8%と2.6%)である持続した蓄積プロファイルを有したが、168時間目に値はバックグラウンドに戻った。これらの結果は別のPLD製剤の心臓生体内分布について先に報告されたデータのそれと類似の範囲内であった。MM−302とPLDの心臓生体内分布の間に有意な差異は観察されなかった。
実施例8:MM−302はマウス組織において遊離ドキソルビシンと比べてより低い核内ドキソルビシン蓄積をもたらす:
遊離ドキソルビシン、MM−302−DiI5又はPLD−DiI5の何れか(全て3mg/kg dox equiv.)を注射したマウスの注射後0.5、4及び24時間の心臓組織から作成した凍結切片において、ドキソルビシン(自然蛍光性)及びリポソーム(DiI5標識化)の微小分布を分析した。心臓血管を可視化するために、屠殺前5分にマウスにFITCレクチンを静脈内注射した。心臓切片を蛍光共焦点顕微鏡で画像化した。3時点で分析した(0.5、4及び24時間)異なる処置群の代表的な領域を図7Dに示す。非処置心臓も画像化して、代表的な画像を図7D(左図)に示す。ドキソルビシンと核シグナルとの共局在化を図7Dの下図に示す。0.5時間時点におけるドキソルビシンとMM−302の両方についての、核ドキソルビシンシグナルの高倍率画像を図7Eに示す。MM−302では核内にドキソルビシンシグナルが見えないのに対して、遊離ドキソルビシンでは大部分の核がドキソルビシン陽性である。画像を上記のように分析して、ドキソルビシン陽性核のパーセントを確認した。遊離ドキソルビシンの注射は0.5時間時点で、約50%の核がドキソルビシンに陽性を示し、ドキソルビシンの顕著な核内蓄積をもたらした。しかしながら、4時間までにはわずか23%の核がドキソルビシンに対して陽性であって、24時間時点でシグナルは基底レベル内に戻った。
遊離ドキソルビシン、MM−302−DiI5又はPLD−DiI5の何れか(全て3mg/kg dox equiv.)を注射したマウスの注射後0.5、4及び24時間の心臓組織から作成した凍結切片において、ドキソルビシン(自然蛍光性)及びリポソーム(DiI5標識化)の微小分布を分析した。心臓血管を可視化するために、屠殺前5分にマウスにFITCレクチンを静脈内注射した。心臓切片を蛍光共焦点顕微鏡で画像化した。3時点で分析した(0.5、4及び24時間)異なる処置群の代表的な領域を図7Dに示す。非処置心臓も画像化して、代表的な画像を図7D(左図)に示す。ドキソルビシンと核シグナルとの共局在化を図7Dの下図に示す。0.5時間時点におけるドキソルビシンとMM−302の両方についての、核ドキソルビシンシグナルの高倍率画像を図7Eに示す。MM−302では核内にドキソルビシンシグナルが見えないのに対して、遊離ドキソルビシンでは大部分の核がドキソルビシン陽性である。画像を上記のように分析して、ドキソルビシン陽性核のパーセントを確認した。遊離ドキソルビシンの注射は0.5時間時点で、約50%の核がドキソルビシンに陽性を示し、ドキソルビシンの顕著な核内蓄積をもたらした。しかしながら、4時間までにはわずか23%の核がドキソルビシンに対して陽性であって、24時間時点でシグナルは基底レベル内に戻った。
リポソーム製剤では、多くの視野でシグナルが殆ど又は全く検出されなかった。DiI5チャンネル(リポソーム)でシグナルがたまに検出された。これらの場合は、リポソームのシグナルは大部分がFITCレクチンシグナルと共局在化していて、リポソームが心臓組織内に侵出していないが血管成分に保持されていることを示している。MM−302−DiI5又はPLD−DiI5で処置すると、時点に関係なく、分析した大部分の心臓領域の核内にドキソルビシンは検出されなかった。0.5時間時点に採取した4つのMM−302−DiI5心臓のうちの1つにおいて及び4時間時点に採取した4つのMM−302−DiI5心臓のうちの1つにおいて、血管外スペースにリポソームシグナルが検出され、そしてわずかな割合の核にドキソルビシンが見出された。同様に、0.5時間時点に採取した4つのPLD心臓のうちの1つにおいて及び24時間時点に採取した4つのPLD心臓のうちの2つにおいて、画像が血管外リポソームシグナル及び核ドキソルビシンの存在を明らかにした。これらの領域は代表的な画像として表わされていないが、これらの値は図7Fに示される定量化に関して考慮されている。MM−302とPLDの両方の曲線下領域は遊離ドキソルビシンAUCより統計的有意に低かった(p<0.001)。MM−302とPLDのAUCの間に有意な差異は観察されなかった。
心臓組織におけるドキソルビシン及びリポソームの分布の広範な可視化を得るために、全心臓切片のスキャンを行った。全心臓切片スキャンは、共焦点顕微鏡の結果を可視的に確認して、遊離ドキソルビシン注射による核局在化を有する広範なドキソルビシン分布を示し、DiI5MM−302又はDiI5PLDの何れかを注射したマウスの心臓内に極めてまれにリポソーム及びドキソルビシンシグナルを示している。
要約すると、MM−302又はPLDの何れかでの処置は、遊離ドキソルビシンによる処置後に見られるものより有意に低い核内ドキソルビシン蓄積を示す一方で、これはMM−302とPLDの間では有意に異なっていなかった。
(均等物)
当業者は、本明細書に記載されている特定の実施態様の多くの均等物を確認するか、通常の実験以上のものを用いずに評価及び実施できるだろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。従属クレームに開示されている実施態様の何れかの組み合わせは本開示の範囲内であることが意図されている。
当業者は、本明細書に記載されている特定の実施態様の多くの均等物を確認するか、通常の実験以上のものを用いずに評価及び実施できるだろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。従属クレームに開示されている実施態様の何れかの組み合わせは本開示の範囲内であることが意図されている。
(参照による取り込み)
本明細書中に言及されている米国及び外国の特許及び係属中の特許出願、並びに刊行物はその全てが参照により本明細書に明確に取り込まれている。
本明細書中に言及されている米国及び外国の特許及び係属中の特許出願、並びに刊行物はその全てが参照により本明細書に明確に取り込まれている。
Claims (13)
- HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有すると診断された患者に対して、一回分の量と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤についての用量であり、該用量は、該リポソームアントラサイクリン系化学療法剤の安全で有効な量を患者に提供するために決定される、及び、
アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与のための用量を決定すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持し、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有する、
ここで、該アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与のための安全で有効な用量は、前記第1用量である、
を含んでなる、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によるHER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有していると診断されているヒト癌患者の治療に用いるための、安全で有効な用量を決定する方法。 - HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌を有すると診断された患者に対して、一回分の量と投薬頻度で示される第1用量を決定すること、該第1用量は、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤についての用量であり、該用量は、該リポソーム剤の安全で有効な量を患者に提供するために決定される、及び、
アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームを投与すること、複数の該免疫リポソームは、それぞれがその表面に複数の抗HER2抗体分子を担持し、それぞれがアントラサイクリン系化学療法剤を含有する、
ここで、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームは、前記第1用量で患者に投与される、
を含んでなる、アントラサイクリン含有抗HER2免疫リポソームの投与によってヒト癌患者を治療する方法。 - アントラサイクリンがドキソルビシンである、請求項1又は2に記載の方法。
- 免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤がドキソルビシンHClリポソーム注射であり、及び、HER2標的免疫リポソームがMM−302である、請求項3に記載の方法。
- 癌が乳癌、カポジ肉腫、卵巣癌、又は多発性骨髄腫である、請求項1〜4の何れか一項に記載の方法。
- 第1用量が、2週間毎、3週間毎又は4週間毎に、50mg/m2、40mg/m2、30mg/m2、20mg/m2又は10mg/m2である、請求項1〜5の何れか一項に記載の方法。
- HER2受容体の発現によって特徴付けられる癌が更に、HER22+、HER23+又はHER2 FISH陽性であると特徴付けられる、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- ErbB2受容体の発現によって特徴付けられる癌が更に、平均して細胞当り少なくとも200,000個の細胞表面ErbB2受容体を発現するとして特徴付けられる、請求項1〜7の何れか一項に記載の方法。
- 第1用量で免疫リポソームを投与することが、癌を治療するのに有効である、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。
- 第1用量で免疫リポソームを投与することが、免疫リポソームを含まないリポソームアントラサイクリン系化学療法剤の第1用量での投与と比較して、心臓毒性の増大を引き起こさない、請求項1〜9の何れか一項に記載の方法。
- 第1用量で患者に免疫リポソームを投与することが、患者の血流中に免疫リポソームのピーク濃度をもたらし、及び、ここで、ほぼ該ピーク濃度で免疫リポソームを含有する培地中で培養することによりインビトロでヒト心筋細胞を処置することが、免疫リポソームを含有しない培地で培養したコントロールのヒト心筋細胞と比較して、培養された心筋細胞中のpERK又はpAKTのヘレグリン刺激による増大を減少させないか、又は5%未満減少させる、請求項1〜10の何れか一項に記載の方法。
- 患者の血流中の免疫リポソーム濃度が、血清の免疫リポソーム濃度として測定される、請求項11に記載の方法。
- HER2免疫リポソームのそれぞれが、その表面に平均して45個の抗HER2抗体分子を担持している、請求項1〜12の何れか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US42022510P | 2010-12-06 | 2010-12-06 | |
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