KR101573928B1 - 치료제 또는 진단제의 전신 투여를 위한 항체- 또는 항체 단편-표적화 면역리포좀 제제 및 그의 용도 - Google Patents

치료제 또는 진단제의 전신 투여를 위한 항체- 또는 항체 단편-표적화 면역리포좀 제제 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 또는 중합체 복합체를 제조하는 방법은 (a) 항체 또는 항체 단편을 제조하고, (b) 상기 항체 또는 항체 단편을 양이온성 리포좀과 혼합하여 양이온성 면역리포좀을 형성하거나 양이온성 중합체와 혼합하여 중합체 복합체를 형성하고, (c) 상기 양이온성 면역리포좀 또는 상기 중합체 복합체를 치료제 또는 진단제와 혼합하여 상기 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 또는 중합체 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.
Figure R1020087030321
항체, 항체 단편, 양이온성 면역리포좀, 중합체 복합체, 치료제, 표적

Description

치료제 또는 진단제의 전신 투여를 위한 항체- 또는 항체 단편-표적화 면역리포좀 제제 및 그의 용도 {PREPARATION OF ANTIBODY OR AN ANTIBODY FRAGMENT-TARGETED IMMUNOLIPOSOMES FOR SYSTEMIC ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC AGENTS AND USES THEREOF}
본 발명은 질병을 치료하기 위한 분자의 전신 전달에 유용한, 항체- 또는 항체 단편-표적화 면역리포좀, 및 항체- 또는 항체 단편-표적화 중합체를 제조하는 방법을 제공한다. 리포좀 및 중합체 복합체는 소분자의 전달, 및 표적화된 유전자 전달 및 전신 투여 후의 효율적인 유전자 발현의 수행을 위해 유용하다. 전달 시스템의 특이성은 표적화 항체 또는 항체 단편으로부터 유래한다.
암에 대한 이상적인 치료제는 종양 표현형을 유도하는 세포 경로를 선택적으로 표적화하고 정상 세포에 무독성인 것일 것이다. 지금까지 이상적인 치료제는 단지 이상으로만 남아있었다. 유전자 요법을 포함한 암 치료는 상당히 유망하지만, 이 유망성을 실현할 수 있기 전에 해결할 필요가 있는 문제가 많다. 거대분자 치료와 관련된 문제 중에서 중요한 문제는 아마도 치료 분자가 필요한 신체 부위(들)에 치료 분자를 효율적으로 전달하는 것일 것이다. 이상적인 전달 비히클은 전신 투여된 후, 발생할 수 있는 임의의 신체 부위의 종양 세포로 유도될 수 있는 것일 것이다. 바이러스 및 리포좀을 포함하여 다양한 전달 시스템 ("벡터")이 시도되었다. 바이러스를 전달 벡터로서 매력적으로 만드는 감염성은 동시에 가장 큰 결점이다. 잔류 바이러스 성분은 면역원성, 세포병변 또는 재조합원성 (recombinogenic)일 수 있다. 또한, 감염을 위한 새로운 표적을 갖는 신규한 바이러스의 생성은 환자 내에 도입된 후, 상기 바이러스가 유전자 변경을 통해 새로운 인간 병원체로 전환될 수 있다는 이론적인 가능성을 야기한다. 따라서, 분자 치료제의 전달을 위한 비-바이러스 벡터에 대한 관심이 지대하였다. 리포좀 방법은 유전자 전달을 위한 바이러스 방법보다 많은 잇점을 제안한다. 가장 의미있는 것은 리포좀에는 면역원성이 없다는 점이다. 또한, 리포좀은 자가-복제능이 있는 감염성 물질이 아니기 때문에, 새로운 종류의 감염성 인간 병원체로 진화할 위험을 제시하지 않는다.
리포좀을 통한 암 세포의 표적화는 그의 유효량을 종양 세포에 선택적으로 전달하도록 리포좀을 변형시켜 달성할 수 있다. 종양 세포의 외부를 장식하는 분자가 정상 세포와 상이하기 때문에, 표면 분자를 사용하여 리포좀이 종양 세포를 표적화하도록 할 수 있다. 예를 들어, 리포좀이 단백질 트랜스페린 (Tf) 또는 그 표면 상의 트랜스페린 수용체 (TfR)를 인식하는 항체를 가질 경우, 리포좀은 보다 높은 수준의 TfR이 존재하는 암 세포로 유도될 것이다. 종양으로 유도되도록 설계된 상기 리포좀은 그의 표적을 탐색할 수 있는 "스마트 (smart)" 폭탄에 비유되었다.
요법에 대한 반응 실패는 전립선암을 포함한 많은 종류의 암의 치료시에 아직 충족되지 않은 의료적 필요성이 존재함을 나타낸다. 암이 재발할 때 종양은 종종 방사선 또는 화학요법제에 대한 내성이 증가하였다. 현재 사용되는 암 치료제에 방사성 감작/화학감작 (chemosensitization)을 야기하는 새로운 성분을 추가하면 임상적으로 큰 유효성을 얻을 것이다. 상기 감작을 달성할 수 있는 한 방법은 유전자 요법 (즉, 그의 발현이 감작을 증가시키는 유전자의 전달)을 통해서이다. 본원에 참고로 포함된 PCT 특허 출원 WO 00/50008 (2000년 8월 31일 공개)에서, 본 발명자들은 항-트랜스페린 수용체 단일쇄 항체 (TfRscFv)가 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합될 수 있다는 원리 증명을 제시하였다. 또한, 상기 TfRscFv에 의해 유도되는 리포좀 전달 시스템은 유전자 및 다른 분자를 전신으로 및 종양에 특이적으로 전달할 수 있다.
유전자 전달 비히클로서의 면역리포좀 및 양이온성 중합체
상기한 바와 같이, 바이러스 벡터 사용과 관련된 일부 문제는 비-바이러스 유전자 전달 벡터에 의해 해결될 수 있다. 생체내 인간 요법을 위한 유전자의 비-바이러스 제약 제제, 특히 양이온성 리포좀-매개 유전자 전달 시스템 개발에 대한 진전이 이루어졌다 (31, 32). 양이온성 리포좀은 양 하전된 지질 이중층으로 이루어지고, 생성되는 복합체가 순 (net) 양 전하를 갖도록 지질과 DNA의 간단한 혼합에 의해 음 하전된 네이키드 (naked) DNA에 복합체화될 수 있다. 복합체는 중등도의 우수한 형질감염 효율로 배양 중인 세포에 의해 결합되어 흡수될 수 있다 (33). 양이온성 리포좀이 DNA 전달을 위해 관심을 끌고 다목적으로 사용되도록 만드는 양 이온성 리포좀의 특징은 간단한 제조; 다량의 DNA를 복합체화하는 능력; 임의의 종류 및 크기의 DNA 또는 RNA와 사용할 수 있는 다목적성; 비-분열성 세포를 포함하여 많은 상이한 종류의 세포를 형질감염시키는 능력; 및 면역원성 또는 생물 유해 활성의 결여를 포함한다 (34, 35에서 검토됨). 인간 암 요법의 전망에 비추어 보다 중요한 사실은 양이온성 리포좀이 생체내 유전자 전달을 위해 안전하고 효율적이라는 점이다 (33, 34, 36). 유전자 전달을 위해 양이온성 리포좀을 사용하는 적어도 99회의 임상 시험이 승인되었고 (37), 소분자 치료제 (예를 들어, 항진균제)의 전달을 위한 리포좀이 이미 시판되고 있다.
연구자들은 또한 양이온성 중합체의 생체 내에서 치료제 전달을 위한 벡터로서의 적합성도 고려하였다. 예를 들어, 폴리에틸렌이민 (PEI)은 최고 양이온 전하 밀도 전위를 갖는 유기 거대분자이고, 문헌 [Boussif et al. (66)]에서 처음 보고된 바와 같이 시험관 내에서 및 생체 내에서 유전자 및 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 다목적 벡터이다. 이후로, 상기 다가양이온 및 유전자 요법에서 그의 역할에 촛점을 맞춘 매우 많은 연구가 수행되었다 (73). 세포-결합 리간드는 1) 특정 세포 종류를 표적화하고 2) 표적 세포에 결합한 후에 세포내 흡수를 향상시키기 위해 다가양이온에 도입될 수 있다 (13). 문헌 [Erbacher et al. (67)]에서는 디술피드 다리를 통해 인테그린-결합 펩티드 9량체 RGD를 접합시키고, 전신 유전자 전달을 위해 목적하는 물리적 특성을 보여주었다.
양이온성 리포좀과 양이온성 중합체, 예를 들어 PEI 모두의 형질감염 효율은 이들이 세포 표면 수용체에 의해 인식되는 리간드를 보유할 때 획기적으로 증가될 수 있다. 수용체-매개 세포내이입 (endocytosis)은 진핵세포에 존재하는 고도로 효율적인 내재화 경로를 나타낸다 (38, 39). 리포좀 상의 리간드의 존재는 세포 표면 상의 그의 수용체에 의한 리간드의 초기 결합을 통한 DNA의 세포 내로의 도입, 이어서 결합된 복합체의 내재화를 용이하게 한다. 트랜스페린 수용체 (TfR) 수준은 유방, 췌장, 두경부, 및 전립선암을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 종류의 암 세포 (40), 심지어 인간 림프절 및 골 전이로부터 유래된 전립선 세포주에서 상승한다 (40-43). 상승한 TfR 수준은 또한 종양 세포의 침습성 또는 증식 능력과 상호 관련된다 (44). 따라서, TfR은 악성 세포 성장의 치료시에 약물 전달을 위한 잠재적인 표적이다 (45, 46). 본 발명자들의 실험실에서, 본 발명자들은 SCCHN에서 종양 세포 형질감염 효율이 리간드가 존재하지 않은 양이온성 리포좀에 의한 5-20％에 비해 (47) 60％-70％인 트랜스페린-복합체화된 양이온성 리포좀을 제조하였다. 또한 PCT 특허 출원 공개 WO 00/50008을 참조한다.
종양 세포 상의 수용체에 의해 인식되는 리간드의 사용 이외에, 특이적인 항체가 리포좀 표면에 부착되어 (48), 항체가 특이적인 종양 표면 항원 (수용체를 포함하고 이로 제한되지 않음)에 유도되도록 할 수 있다 (49). 상기 "면역리포좀", 특히 입체적으로 안정화된 면역리포좀은 치료 약물을 특이적인 표적 세포 집단에 전달할 수 있다 (50). 문헌 [Parks et al. (51)]에서는 리간드에 접합된 항-HER-2 모노클로날 항체 (MAb) Fab 단편이 HER-2를 과다발현하는 유방암 세포주인 SK-BR-3에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여주었다. 면역리포좀은 피막 홈 (coated pit) 경로를 통한 수용체 매개 세포내이입에 의해 및 또한 가능하게는 막 융합에 의해 효율적으로 내재화되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 항-HER-2 Fab 단편의 앵커링 (anchoring)은 그의 억제 효과를 향상시켰다. 보다 최근에, 문헌 [Park et al. (23)]은 HER-2가 과다발현되지 않지만 독소루비신을 유방암 종양에 전달하기 위해 항-HER-2 모노클로날 항체 scFv 단편에 화학적으로 접합된 오래 순환되는 리포좀으로 구성된 항-HER-2 면역리포좀을 사용하였다. 시험관 내에서 또는 생체 내에서 전구약물 및 약물의 전달을 위해 종양 세포를 표적화하기 위해 리포좀, 주로 입체적으로 안정화된 리포좀에 커플링된, 종양 특이적 항원에 대해 작용하는 항체를 사용한 많은 다른 연구가 발표되었다 (52-56). 이들 연구는 종양을 표적으로 하는 약물 전달을 위한 면역리포좀의 유용성을 입증하였다. 양이온성 리포좀-유전자 전달과 면역리포좀 기술의 조합은 표적화된 유전자 요법을 위한 유망한 시스템으로 보이고, 이는 본 출원의 주제이다.
생명공학의 발전을 통해 MAb로부터 특이적인 인식 도메인을 유도할 수 있게 되었다 (57). 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 재조합 및 이들의 단일 폴리펩티드 내로의 통합은 표적화 목적을 위해 단일쇄 항체 유도체 (scFv로 명명됨)를 사용할 수 있는 가능성을 제공한다. 따라서, 항-TfR MAb 5E9를 기초로 한 scFv (52)는 대략 분자량 26,000의 단일 폴리펩티드쇄로서 상기 MAb에 의해 인식되는 TfR의 에피토프에 대한 완전한 항체 결합 부위를 포함한다. 상기 TfRscFv는 각각 중쇄 및 경쇄로부터의 성분 VH 및 VL 가변 도메인을 적절하게 설계된 펩티드와 함께 연결시켜 형성된다. 펩티드는 제1 가변 영역의 C-말단과 제2 가변 영역의 N-말단을 VH-펩티드-VL 또는 VL-펩티드-VH의 순서로 가교시킨다. scFv의 결합 부위는 그의 모 항체 결합 부위의 친화도 및 특이성을 모두 모방할 수 있다.
TfRscFv는 리포좀 또는 양이온성 중합체를 많은 이유로 TfR의 수준이 상승한 암 세포에 대해 표적화하기 위해 인간에 사용할 때 Tf 분자 자체 또는 심지어 전체 MAb에 비해 잇점을 갖는다. 먼저, scFv의 크기 (약 28 kDa)는 Tf 분자 (약 80 kDa) 또는 모 MAb (약 150 kDa)보다 훨씬 더 작다. scFv-리포좀-치료제 복합체 또는 scFv-중합체-치료제 복합체는 따라서 고형 종양에 특징적인 작은 모세관 내로의 우수한 투과성을 보일 수 있다. 두번째로, 보다 작은 scFv는 그의 재조합 단백질로서의 생산과 관련된 실제적인 잇점을 갖는다. 본 발명에서 고려되는 요법을 최종적인 인간 시험으로 실행하기 위해 TfRscFv의 대규모 생산이 필요할 것이다. 세번째로, scFv는 재조합 분자이고 (Tf와 같은 혈액 제품이 아님), 따라서 혈액에 함유된 병원체의 잠재적인 오염에 관련된 문제를 제시하지 않는다. TfRscFv 사용시의 추가의 잇점은 리간드에 철이 로딩된 후에만 Tf가 TfR과 높은 친화도로 상호작용한다는 사실과 관련된다. 철-로딩된 Tf를 포함하는 리포좀의 대규모 생산은 실제적인 문제를 제시할 수 있다. 따라서, TfRscFv를 사용함으로써 철 (자체가 암과 관련됨 (58))을 포함하지 않는 리포좀 치료 복합체가 종양 세포 TfR을 표적으로 할 수 있다. 네번째로, MAb의 Fc 영역이 없으면, Fc 수용체를 통한 비-항원 특이적 결합의 문제가 방지된다 (57).
p53 종양 서프레서 (suppressor) 유전자 및 전립선암의 발병기전
종양 서프레서 유전자 p53은 DNA 복구, 세포 주기의 조절 및 프로그래밍된 세포 사멸 (세포자멸)과 같이 DNA 손상에 반응하여 활성화되는 것을 포함하여 다양 한 세포 경로에서 중요한 역할을 수행한다 (1). 상기 중요한 세포 경로의 기능장애는 종양 발생 과정과 연관된다. 60％ 이상의 인간 암에 관련된 기능성 p53의 상실은 p53 유전자 자체의 돌연변이를 통해 (가장 흔하게 발생함), 또는 MDM-2 유전자의 증폭과 같은 다른 메카니즘 (특정 육종, 및 다른 암에서 발견), 또는 p53과 인간 유두종 바이러스의 E6 단백질의 회합 (아마도 자궁경부 암종에서 일정 역할을 한다)을 통해 발생할 수 있다 (2).
p53 기능의 상실은 예를 들어 15-50％의 유방암, 25-70％의 전이성 전립선암, 25-75％의 폐암, 및 33-100％의 두경부암과 관련된 비-기능성 p53이 존재하는 광범위한 암 종류와 관련된다 (3). 또한, 돌연변이체 p53의 존재는 폐, 결장, 및 유방을 포함하는 많은 인간 암의 불리한 예후와 연관되었고 (3), 돌연변이체 p53은 대부분의 치료가능한 형태의 몇몇 암, 예를 들어 윌름 (Wilm) 종양, 망막모세포종, 고환암, 신경모세포종 및 급성 림프모구 백혈병에서 거의 발견되지 않는다 (4). 또한, p53 단백질은 고형 종양 성장에 필요한 과정인 혈관신생에 관여하는 유전자를 전사 수준에서 조절한다 (5). 볼퍼트 (Volpert) 등은 상기 종양에 대한 혈관신생 표현형의 발달이 두 p53 대립유전자 모두의 상실을 필요로 함을 제안하였다 (6).
대부분의 항암제는 세포자멸을 유도함으로써 작용하는 것으로 보이기 때문에 (20), 상기 경로가 억제 또는 변경되면 치료 요법이 실패할 수 있다. p53의 돌연변이와 세포독성 암 치료 (화학 요법 및 방사선 요법 모두 (21))에 대한 내성 사이의 직접적인 연관성이 제안되었다. 또한, p53 기능의 상실이 일부 종양 세포에서 관찰된 항암제에 대한 교차내성의 원인이 될 수 있음이 제안되었다 (22).
따라서, p53 기능의 회복은 원발성 전립선 종양 및 심지어 전이의 방사선 요법/화학요법에 대한 감작을 유발할 수 있다. wtp53의 도입은 시험관 내에서 및 마우스 이종이식편 모델 모두에서, 다양한 종류의 종양, 예를 들어, 전립선 (23,24), 두경부 (25,26), 결장 (27), 자궁경부 (28) 및 폐 (15,29) 종양 세포의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다. 그러나, p53 단독은 종양 성장을 부분적으로 억제할 수 있지만, 확립된 종양을 제거할 수는 없다고 밝혀졌다. 그러나, 본 발명자들은 전신 전달된 리포좀-p53과 방사선 조사를 조합함으로써 확립된 두경부 이종이식편 종양의 완전한 장기 종양 퇴행을 유도하였음을 입증하였다 (25, 30).
요약하면, 유의한 비율의 인간 암에서 p53 유전자가 관련된다는 사실에 비추어 p53 유전자는 암 유전자 요법을 위한 주요한 후보자이다. p53 기능에 관련된 증가 추세에 있는 증거를 기초로 하여, 종양 세포에서 상기 기능의 효과적인 회복은 정상 세포 성장 조절을 재확립하고, DNA-손상제에 대한 적절한 반응을 회복시키고 (예를 들어, 화학요법 및 방사선 요법), 혈관신생을 방해할 것으로 예상할 수 있다.
화학요법 및 방사선 조사에 대한 종양의 감작은 두 종류의 항암 방식 모두의 효과적인 용량을 저하시키고, 따라서 상기 치료에 종종 관련되는 심한 부작용을 완화시킬 수 있다. 현재까지, 대다수의 p53 유전자 요법 프로토콜은 wtp53 유전자 대체만을 사용하였다. 현재 발간된 문헌 및 본 발명자들의 데이타 (30, 59)를 기초로 할 때, wtp53 대체 단독은 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있지만, 종양을 장기간 제거하기에는 불충분한 것으로 보인다. 따라서, 표준 요법과 표적화된 유전자 요법을 모두 포함하는 조합 방법이 암 치료를 위한 보다 효과적인 신규한 임상 방식으로 상당히 유망해 보인다. 또한, 본 발명자들의 전신 전달된 리간드-리포좀 wtp53 복합체의 입증된 종양 세포 선택성은 심지어 매우 많은 전립선암 사망의 궁극적인 원인인 원격 미소 전이 (micrometastasis)도 감작화시키는 상기 방법의 잠재성을 나타낸다.
수용체 티로신 키나제 (RTK) 및 비-수용체 티로신 키나제 (비-RTK)를 포함하고 이로 제한되지 않는 세포내 신호전달 경로의 성분은 세포 증식, 분화, 이동, 혈관신생, 세포 주기 조절 등을 포함하는 많은 중요한 경로의 중요한 매개체이다 ([Baselga, Science 312, 1175-1178 (2006)], [Arora and Scholar, J Pharmacol Exp Ther 315, 971-979 (2005)], [Krause and Van Etten N Eng J Med 353, 172-187 (2005)]). 상기 중요한 많은 경로는 암 세포에서 탈조절된다. 따라서, RTK 및 비-RTK는 암 치료제를 위한 좋은 표적이다. 상기 치료제의 한 종류는 성장 인자 수용체를 표적으로 하여 상기 신호전달 경로에 영향을 끼치는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 소분자이다 (Imai and Takoka, Nature Reviews: Cancer 6, 714-727 (2006)). 상기 억제제는 ATP와 경쟁하고 (ATP 모방체 (mimetic)), 키나제 활성을 억제한다. 최초의 성공적인 소분자 억제제 중의 하나는 이마티닙 메실레이트 (글리벡 (GLEEVEC)(등록상표))이다. 이 소분자는 CML에서 BCR-ABL 융합 단백질의 키나제 활성을 불활성화시키고 (Druker Trends in Molecular Medicine 8, S14-S18 (2002)), 필라델피아 염색체 양성 CML 환자의 치료에서 유의한 효능을 보였다. 이 소분자는 또한 KIT를 포함하는 다른 TK의 억제제이고, PDGFRα 및 PDGFRβ KIT는 전이성 GIST에 관련되고, 두 혈소판 유래 성장 인자 수용체는 아교모세포종 및 융기성 피부섬유육종과 같은 종양에 관련된다. EGF 수퍼패밀리의 멤버이기 때문에, EGFR은 또한 소분자 억제제를 위한 필연적인 표적이다. 게피티닙 (이레사 (IRESSA)(등록상표)) (Herbst et al Nature reviews Cancer 4, 9560965 (2004)) 및 에를로티닙 (타르체바 (TARCEVA)(등록상표)) (Minna and Dowell Nature Reviews Drug Discovery Suppl. S14-S15 (2005))은 EGFR을 선택적으로 억제하고, NSCLC 및 두경부의 편평세포 암종과 EGFR을 발현하는 암에 대해 효능을 보였다. 또한, 이들은 화학요법제와 조합되어 II상 시험에서 효능을 보였다. 에를로티닙과 화학요법제 겜시티빈 (항대사제)의 조합물은 진행된 췌장암 치료에 유용한 것으로 입증되었다. 게피티닙에 대한 여러 III상 시험이 현재 진행되고 있다 (Chai and Grandis Current Treat Opin Oncol 7, 3-11 (2006)).
소분자 물질은 형질막을 통해 위치를 옮기고, 세포 표면 수용체의 세포질 도메인 및 세포내 신호전달 분자와 상호작용한다. 따라서, 프레닐화, RAF-MEK 키나제, PI3 키나제, mTOR 경로 (라파마이신, 및 심지어 열 충격 단백질 9의 포유동물 표적)을 억제함으로써 암 세포 증식 및 생존에 영향을 끼치는 소분자도 개발되고 있다. 이들 소분자는 또한 SRC 키나제 또는 기질 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase)를 억제함으로써 세포 부착 및 침습에 영향을 끼칠 수 있다. 소분자에 의한 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제도 종양의 혈관신생을 억제할 수 있다.
새로운 종류의 소분자 물질, 즉 소라페닙 (Sorafenib) (넥사바르 (Nexavar))은 RAF 세린 키나제의 상이한 이소형 및 다양한 RTK (VEGF, EGFR, 및 PDGF)에 대한 그의 억제 효과를 발휘한다 (Arora and Scholar, J Pharmacol Exp Ther 315, 971-979 (2005)). 상기 "이중 작용" 키나제 억제제는 종양 증식 및 혈관신생을 억제함으로써 광범위한 항-종양 활성을 보인다 (Marx Science 308, 1248-1249 (2005)). 수니티닙 말레이트 (수텐트 (SUTENT)(등록상표))도 VEGF, PDGFR, KIT 및 FLIT3의 다중표적 TK 억제제이다 (Marx Science 308, 1248-1249 (2005)). 또한, 소분자 물질에 대한 잠재적인 표적이 세포 주기 정지 및 세포자멸 (프로그래밍된 세포 사멸)에 중요한 유비퀴틴-프로테오좀 경로에서 확인되었다. 26S 프로테오좀에서 키모트립신 분해 (chymotryptic) 프로테아제의 선택적인 가역적 억제제인 보르테좀 (Bortezomb) (벨케이드 (Velcade))이 다양한 암, 특히 혈액암에 대해 효과적인 것으로 보고되었다.
항-EGFR TK 억제제는 약 500 Da의 합성 화학물질이고, 경구 투여되고, 이레사(등록상표)의 반감기는 약 46시간, 타르체바(등록상표)의 반감기는 약 36시간이다. 이들은 정맥내보다는 경구로 투여되기 때문에, 소분자 치료제의 동일한 용량에서의 혈장 농도가 환자 사이에 상이할 수 있다 (Dancy and Sausville Nature Rev Drug Discov 2, 116-124 (2003)). 이것은 현재 사용되는 상기 물질의 단점이다. 따라서, 본 발명에서처럼 동일한 용량으로 일관되게 정맥내 투여될 수 있는 종양을 표적으로 하는 전달 복합체에 소분자 물질을 봉입하는 것은 치료제로서의 그의 용도를 개선시킬 것이다. 또한, 상기 리간드-리포좀 복합체 내의 봉입은 소분자 물 질을 분해로부터 보호하여 그의 효능을 보다 향상시킬 것이다. 비표적화된 경구 투여된 소분자 물질은 종양 세포에 특이적이지 않고, 이것은 정상 세포 독성 및 유해한 부작용의 위험이 증가함을 의미한다. 상기 부작용은 일반적으로 경미하지만 (예를 들어 발진, 여드름, 건조한 피부 및 소양증), 위장관 독성 (영역, 구토, 식욕부진 및 특히 설사)이 용량을 제한할 수 있다. 가장 흔한 부작용인 피부 발진은 가능하게는 표피 내의 표적 키나제에 대한 비특이적인 효과에 의한 것이다 (Herbst et al Clin Lung Caner 4, 366-369 (2003)). 따라서, 종양 세포 특이적 물질에 의한 전달은 상기 문제를 감소시킬 수 있다. 지금까지 보고된 가장 심한 독성은 이레사(등록상표) (게피티닙)에서 발생한 것으로, 하기도에서의 비-감염성 염증 및 섬유증이라는 특징을 갖는 폐렴의 형태인 간질성 폐렴이다. 170명 초과의 환자가 이레사(등록상표) 치료 후에 상기 질병으로 사망하였다 (Arora and Scholar, J Pharmacol Exp Ther 315, 971-979 (2005)). 최근에, 흉부 CT 및 방사선 영상은 게피티닙-관련 간질성 폐 질환이 종래의 항신생물제에 의해 야기되는 폐 손상과 유사하고 직접적인 세포독성 효과가 존재할 수 있음을 보여주었다. 따라서, 이레사(등록상표), 또는 임의의 소분자 물질을 직접 종양 세포에 전달하기 위해 종양 세포 특이적 물질을 사용하면 간질성 폐렴의 문제 및 다른 부작용에 대한 해결책을 제공할 수 있다. 또한, 뇌를 포함하여 본 발명의 방법이 필요한 부위에 대한 직접적인 전달 (원발성 및 전이성 질병)도 효과적인 치료에 필요한 투여량을 감소시킬 것이고, 이것은 현재 기술로는 이룰 수 없는 추가의 잇점이다.
<발명의 개요>
본 발명에 따라, 인간 질병 치료에 사용하기 위한 다양한 종류의 치료 분자의 종양을 표적으로 하는 전신 전달이 가능한 다양한 면역리포좀 및 중합체 복합체가 제조되었다. 항체- 또는 항체 단편-표적화 면역리포좀 또는 중합체 복합체는 간단하고 효율적인 비-화학적 접합 방법에 의해 제조된다. 상기 복합체는 항체 또는 항체 단편의 리포좀 또는 중합체 복합체에 대한 화학적 접합에 의해 제조된 유사한 복합체와 동등하게 효과적이거나, 그보다 더 효과적이다. 항체 단편이 사용될 경우, 생성되는 복합체는 완전한 항체 분자를 포함하는 동일한 리포좀-치료제 또는 중합체-치료제 복합체보다 훨씬 더 높은 수준의 형질감염 효율을 제시할 수 있다.
본 발명에 따르면, 단일쇄 단백질은 리포좀 또는 중합체에 화학적으로 접합되지 않는다. 오히려, 항체- 또는 scFv-리포좀-치료제 또는 진단제 복합체 또는 항체- 또는 scFv-중합체-치료제 또는 진단제 복합체는 규정된 비율 및 순서로 성분을 간단히 혼합함으로써 형성된다. 항체 또는 항체 단편은 직접 리포좀과 복합체화된다 (예를 들어, 전하-전하 상호작용을 통해 회합된다). 한 실시태양에서, 항체 또는 단일쇄 단백질은 먼저 양이온성 리포좀 또는 중합체와 약 1:20 내지 약 1:40 (w:w) 범위의 단백질:지질 비율로 또는 약 0.1:1 내지 10:1 (몰비) 범위의 단백질:중합체 비율로 혼합된다. 이어서, 항체- 또는 항체 단편-리포좀 또는 항체- 또는 항체 단편-중합체는 목적하는 치료제 또는 진단제, 예를 들어 핵산과 약 1:10 내지 1:20 (㎍ 치료제 또는 진단제:nmole 총 지질) 또는 약 1:1 내지 1:40 (㎍ 치료제 또는 진단제:nmole 중합체) 범위의 비율로 혼합되고, 10-15분 동안 실온에서 인큐베이팅된다. 치료제 또는 진단제가 소분자인 실시태양에서, 항체- 또는 항체 단편-리포좀 또는 항체- 또는 항체 단편-중합체는 소분자와 약 0.2:7 내지 약 14:7 (소분자:리포좀/중합체 복합체) 범위의 몰비, 적합하게는 약 2.8:7 또는 약 7:7 (소분자:리포좀/중합체 복합체)의 몰비로 혼합된다.
생성되는 치료제 또는 진단제-항체-리포좀 또는 치료제-항체-중합체 복합체는 포유동물의 신체 내의 표적 세포에 물질을 전달하기 위해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 복합체는 암 세포 또는 비-암 세포를 포함하는 세포일 수 있는 목적하는 부위를 표적으로 한다. 표적화제는 한 예시적인 실시태양에서 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체 또는 항체 단편이고, 표적 세포는 목적하는 표적 부위를 발현하거나 함유하는 세포이다. 항체 또는 항체 단편이 트랜스페린 수용체에 결합하면, 표적 세포는 트랜스페린 수용체를 발현하는 세포이다. 치료제는 소분자, 핵산, 예를 들어 DNA 분자, 적합하게는 야생형 p53 분자, Rb 분자 또는 아폽틴 (Apoptin) 분자 또는 안티센스 HER-2를 코딩하는 DNA 분자일 수 있다. 예를 들어 치료 조성물 내의 복합체는 전신으로, 바람직하게는 정맥내 투여될 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제조하고; 항체 또는 항체 단편을 양이온성 리포좀과 혼합하여 양이온성 면역리포좀을 형성하되, 여기서 항체 또는 항체 단편은 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합되지 않고 (대신 리포좀과 직접 복합체화/회합됨); 양이온성 면역리포좀을 소분자와 혼합하여 상기 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체를 형성하는 것을 포함하 는, 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체를 제조하는 방법을 제공한다. 적합한 실시태양에서, 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편, 예를 들어 항-트랜스페린 수용체 단일쇄 Fv (TfRscFv)이다.
본 발명의 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀 복합체 제조에 유용한 적합한 지질은 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 중성 또는 헬퍼 (helper) 지질의 혼합물을 포함한다. 적합하게는, 항체 또는 항체 단편은 상기 양이온성 리포좀과 약 1:20 내지 약 1:40 (w:w) 범위의 비율로 혼합된다. 실시태양에서, 양이온성 리포좀은 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및/또는 콜레스테롤의 혼합물; 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및/또는 콜레스테롤의 혼합물을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 양이온성 면역리포좀은 소분자와 약 0.2:7 내지 약 14:7 (소분자:면역리포좀) 범위의 몰비, 적합하게는 약 1:7 내지 약 12:7, 약 1:7 내지 약 10:7, 약 2:7 내지 약 9:7, 약 4:7 내지 약 8:7, 약 5:7 내지 약 8:7 또는 약 7:7 (소분자:면역리포좀)의 몰비로 혼합된다.
본 발명의 실시에 유용한 소분자는 적합하게는 분자량이 약 5000 달톤 미만, 보다 적합하게는 약 1000 달톤 미만, 예를 들어 약 300 내지 약 700 달톤이다. 추가의 실시태양에서, 소분자의 적어도 하나의 pKa는 약 2 내지 약 9의 범위 내에 있다. 본 발명의 실시에 유용한 적합한 소분자는 GMC-5-193, YK-3-250, 이마티닙 메실레이트, 에를로티닙 히드로클로라이드, 수니티닙 말레이트, 게피티닙 및 그의 유사체 및 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는 항암 소분자를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조되는 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀 복합체를 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 양이온성 리포좀, 항체 또는 항체 단편, 및 소분자를 포함하는, 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체를 제공하고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 상기 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합되지 않는다 (대신에 리포좀과 직접 회합/복합체화된다). 소분자는 양이온성 리포좀 내에 봉입되거나, 양이온성 리포좀의 탄화수소쇄 영역 내에 함유되거나, 양이온성 리포좀의 내부 또는 외부 단층 (헤드기 (head-group) 영역 포함)과 회합되거나, 또는 이들의 임의의 조합이 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명의 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀 복합체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 포함하고 이로 제한되지 않는 질병 상태로 고통받거나 질병 상태에 걸리기 쉬운 환자의 치료 방법을 제공한다. 적합하게는, 복합체는 정맥내 투여로 투여될 수 있다. 별법으로, 복합체는 다른 투여 경로, 예를 들어 종양내, 병변내, 분무, 경피, 내시경하 (endoscopic), 국소, 경구, 또는 피하 투여에 의해 투여될 수 있다. 환자가 암으로 고통받거나 암에 걸리기 쉬운 실시태양에서, 본 발명의 방법은 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 전, 동안 또는 후에 (예를 들어, 적어도 12시간 전, 적어도 12시간 후, 또는 동시에) 환자에게 방사선을 조사하거나 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 화학요법제는 독소루비신, 시스플라틴, 미톡산트론, 탁소테레 (Taxotere) 및 CDDP를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 양이온성 면역리포좀 복합체 의 투여 전, 동안 또는 후에 (예를 들어, 적어도 12시간 전, 적어도 12시간 후, 또는 동시에) 투여되는 화학요법제와 함께, 본 발명의 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 화학요법제의 효과를 향상시키는 방법을 제공한다.
도 1은 단백질/지질 및 DNA/지질의 다양한 비에서의 간단한 혼합에 의한 TfRscFv-리포좀-DNA 복합체의 DU145 세포에 대한 결합을 보여주는 ELISA 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 2는 DU145 세포에서 상이한 혼합비의 TfRscFv:지질을 사용한 시험관내 형질감염 분석의 결과를 도시한 것이다 (루시퍼라제 분석).
도 3은 래트 C6 세포에서 상이한 혼합비의 TfRscFv:지질을 사용한 시험관내 형질감염 분석의 결과를 도시한 것이다 (루시퍼라제 분석).
도 4는 >95％의 TfRscFv가 간단한 혼합 후에 리포좀 또는 리포좀-p53에 결합함을 보여주는 비-변성 폴리아크릴아미드 겔을 보여준다.
도 5A는 간단한 혼합에 의해 제조된 TfRscFv-리포좀-p53으로 처리된 DU145 세포에서 유도된 겜자르 (GEMZAR)(등록상표)에 대한 약제감수성 (chemosensitivity)을 보여주는 XTT 세포독성 분석 결과를 도시한 것이다.
도 5B는 간단한 혼합에 의해 제조된 TfRscFv-리포좀-p53으로 처리된 DU145 세포에서 유도된 미톡산트론에 대한 약제감수성을 보여주는 XTT 세포독성 분석 결과를 도시한 것이다.
도 6A 및 6B는 간단한 혼합에 의해 제조된 TfRscFv-리포좀-p53으로 처리된 췌장암 세포주 (Colo 357 및 Panc I)에서 유도된 겜자르(등록상표)에 대한 약제감수성을 보여주는 XTT 세포독성 분석 결과를 도시한 것이다.
도 7A는 DNA:지질의 다양한 비에서 간단한 혼합에 의해 제조된 전신 투여된 TfRscFv-리포좀-EGFP 복합체의 시험관내 종양 표적화 능력을 보여준다.
도 7B는 4개의 상이한 종양에서 다수의 배치의 TfRscFv 단백질을 사용하여 간단한 혼합에 의해 제조된 전신 투여된 TfRscFv-리포좀-EGFP 복합체의 생체내 종양 표적화 능력을 보여준다.
도 8은 간단한 혼합에 의해 제조된 전신 투여된 TfRscFv-리포좀 A-p53과 방사선 조사의 조합의 DU145 인간 전립선 이종이식편 종양에 대한 효과를 보여준다.
도 9는 TfRscFv-리포좀-AS HER-2 ODN으로 처리된 Panc I 세포에서 유도된 겜자르(등록상표)에 대한 약제감수성을 보여주는 XTT 세포독성 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 10A는 전신 투여된 TfRscFv-리포좀 A-AS HER-2 ODN과 겜자르(등록상표)의 조합물의 Panc I 인간 췌장 이종이식편 종양에 대한 효과를 보여준다.
도 10B는 전신 투여된 TfRscFv-리포좀 B-AS HER-2 ODN과 탁소테레의 조합물의 MDA-MB-435 인간 유방 이종이식편 종양에 대한 효과를 보여준다.
도 11은 TfRscFv-리포좀-마그네비스트 (MAGNEVIST)(등록상표) 복합체의 전신 투여에 의한 향상된 종양 영상화를 보여준다.
도 12는 MDA-MB-435 세포에서 입체적으로 안정화된 TfRscFv-PEG-리포좀 A- pLuc의 시험관내 형질감염 분석의 결과를 도시한 것이다 (루시퍼라제 분석).
도 13은 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비의 최적화, 및 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 상이한 비에서 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체의 DU145 인간 전립선암 세포에 대한 효과를 보여준다.
도 14는 상이한 세포주에 대한 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체의 효과를 보여준다.
도 15A는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체를 사용하여, MDA-MB-435 인간 흑색종 세포의 독소루비신에 대한 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달의 효과를 유리 GMC-5-193과 비교하여 보여준다.
도 15B는 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체를 사용하여, MDA-MB-435 인간 흑색종 세포의 독소루비신에 대한 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달의 효과를 유리 GMC-5-193과 비교하여 보여준다.
도 15C는 1.25 μM GMC-5-193의 농도에서 시스플라틴에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체)의 효과를 유리 GMC-5-193과 비교하여 보여준다.
도 15D는 2 μM GMC-5-193의 농도에서 시스플라틴에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체)의 효과를 유리 GMC-5-193과 비교하여 보여준다.
도 15E는 2.5 μM GMC-5-193의 농도에서 시스플라틴에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체)의 효과를 유리 GMC-5-193과 비교하여 보여준다.
도 16A는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체를 사용하여, 독소루비신에 대한 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달의 효과를 보여준다.
도 16B는 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체를 사용하여, 독소루비신에 대한 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달의 효과를 보여준다.
도 16C는 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체를 사용하여, 미톡산트론에 대한 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달의 효과를 보여준다.
도 17A는 탁소테레에 대한 DU145 인간 전립선암 세포의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체)의 효과를 보여준다.
도 17B는 미톡산트론에 대한 DU145 인간 전립선암 세포의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체)의 효과를 보여준다.
도 17C는 탁소테레에 대한 MDA-MB-435 인간 흑색종 세포의 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체)의 효과를 보여준다.
도 18은 CDDP에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 GMC-5-193 의 종양 표적화 리포좀 전달의 효과를 보여준다.
도 19A는 MDA-MB-435 세포에서 유리 GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체 흡수에 대한 시험관내 비교를 보여준다.
도 19B는 MDA-MB-435 세포에서 유리 GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체 흡수에 대한 시험관내 비교를 보여준다.
도 20A는 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 (scL-GMC) 복합체에 형광 소분자의 도입에 의한 전신 투여 후의 향상된 종양-특이적 흡수를 보여준다.
도 20B는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체에 형광 소분자의 도입에 의한 전신 투여 후의 향상된 종양-특이적 흡수를 보여준다.
도 20C는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체를 사용하여 형광 GMC-5-193의 도입에 의한 전신 투여 후의 향상된 종양-특이적 흡수를 보여주는 추가의 데이타를 도시한 것이다.
도 21A는 유리 GMC-5-193, TfRscFv/LipA/GMC-5-193 (scL-GMC) 및 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 (scLHK-GMC) 복합체로 처리한 후에 B16/F10 폐 종양 보유 동계 (syngenic) 마우스에서 종양 성장의 억제를 보여준다.
도 21B는 시스플라틴이 존재하거나 존재하지 않은 상태에서 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 (scL-GMC)과 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 (scLHK-GMC) 복합체의 조합물로 처리한 후에 B16/F10 폐 종양 보유 동계 마우스에서 종양 성장의 억제를 보여준다.
도 21C는 CDDP가 존재하거나 존재하지 않은 상태에서 TfRscFv/LipA/GMC-5- 193과 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체의 조합물로 처리한 후에 B16/F10 폐 종양 보유 동계 마우스에서 종양 성장의 억제를 보여준다.
도 22는 CDDP가 존재하거나 존재하지 않은 상태에서 TfRscFv/LipA/GMC-5-193과 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체의 조합물로 처리한 후에 B16/F10 폐 종양 보유 동계 마우스의 혈청에서 절단된 카스파제-3를 보여준다.
도 23A는 MDA-MB-435 세포에서 YK-3-250 대 LipA의 상이한 비에서 TfRscFv/LipA/YK-3-250 복합체의 효과를 비교하여 보여준다.
도 23B는 MDA-MB-435 세포에서 유리 및 복합체화된 YK-3-250의 효과를 비교하여 보여준다.
도 24A는 리포좀 복합체를 통해 전달된 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) 및 유리 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표))의 인간 전립선암 세포에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 24B는 리포좀 복합체를 통해 전달된 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) 및 유리 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표))의 인간 흑색종 세포에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 24C는 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표))의 B16-F10 세포에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 25A는 탁소테레에 대한 MDA-MB-435 인간 흑색종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (20 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 25B는 탁소테레에 대한 MDA-MB-435 인간 흑색종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (30 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 26A는 미톡산트론에 대한 DU145 인간 전립선암 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (20 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 26B는 미톡산트론에 대한 DU145 인간 전립선암 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (30 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 27A는 겜시타빈에 대한 PANC-1 인간 췌장암 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (20 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 27B는 겜시타빈에 대한 PANC-1 인간 췌장암 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (30 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 28A는 시스플라틴 (CDDP)에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (20 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 28B는 시스플라틴 (CDDP)에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (30 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 29A는 다카르바진 (DTIC) 24시간 인큐베이션에 대한 B16/F10 마우스 흑색 종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (15 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 29B는 다카르바진 (DTIC) 24시간 인큐베이션에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (20 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 29C는 다카르바진 (DTIC) 48시간 인큐베이션에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (15 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 29D는 다카르바진 (DTIC) 48시간 인큐베이션에 대한 B16/F10 마우스 흑색종 세포의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) (20 μM)의 리포좀 복합체 전달 효과를 보여준다.
도 30A는 미톡산트론에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡(등록상표))) 효과를 보여준다.
도 30B는 탁소테레에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡(등록상표))) 효과를 보여준다.
도 31은 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡(등록상표))와 CDDP의 조합물에 의한 B16/F10 폐 종양 성장의 억제를 보여준다.
도 32A는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 에를로티닙 (타르체바(등록상 표)) (TfRscFv/LipA/에를로티닙 (scL-타르체바(등록상표))) 및 유리 에를로티닙의 인간 전립선암 세포 (DU145)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 32B는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) (TfRscFv/LipA/에를로티닙 (scL-타르체바(등록상표))) 및 유리 에를로티닙의 인간 췌장암 세포 (PANC-1)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 32C는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) (TfRscFv/LipA/에를로티닙 (scL-타르체바(등록상표))) 및 유리 에를로티닙의 인간 흑색종 세포 (MDA-MB-435)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 33A는 미톡산트론에 대한 인간 전립선암 세포주 DU145의 감작에 대한 3.75 μM 농도의 에를로티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 33B는 미톡산트론에 대한 인간 전립선암 세포주 DU145의 감작에 대한 7.5 μM 농도의 에를로티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 34A는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 인간 흑색종 세포의 감작에 대한 3.75 μM 농도의 에를로티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 34B는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 인간 흑색종 세포의 감작에 대한 7.5 μM 농도의 에를로티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 35는 겜시타빈 (겜자르(등록상표))에 대한 인간 췌장암 세포 PANC-1의 감작에 대한 7.5 μM 농도의 에를로티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 36A는 미톡산트론에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 에를로티닙 (타르체바(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/에를로티닙 (scL-타르체바(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 36B는 탁소테레에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 에를로티닙 (타르체바(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/에를로티닙 (scL-타르체바(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 36C는 겜시타빈 (겜자르(등록상표))에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 에를로티닙 (타르체바(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/에를로티닙 (scL-타르체바(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 37은 TfRscFv/LipA/수니티닙 복합체 내의 상이한 비의 수니티닙 (수텐트(등록상표))/LipA의 DU145 인간 전립선암 세포에 대한 효과를 유리 수니티닙과 비교하여 보여준다.
도 38A는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 수니티닙 (수텐트(등록상표)) (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표))) 및 유리 수니티닙의 인간 전립선암 세포 (DU145)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 38B는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 수니티닙 (수텐트(등록상표)) (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표))) 및 유리 수니티닙의 인간 췌장암 세포 (PANC-1)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 39A는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435의 감작에 대한 2.5 μM 농도의 수니티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 수니티닙 (수텐트(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 39B는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435의 감작에 대한 5 μM 농도의 수니티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 수니티닙 (수텐트(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 40은 미톡산트론에 대한 인간 전립선암 세포주 DU145의 감작에 대한 5 μM 농도의 수니티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달의 효과를 유리 수니티닙 (수텐트(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 41은 겜시타빈 (겜자르(등록상표))에 대한 인간 췌장암 세포주 PANC-1의 감작에 대한 2.5 μM 농도의 수니티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달의 효과를 유리 수니티닙 (수텐트(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 42A는 미톡산트론에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 수니티닙 (수텐트(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 42B는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 수니티닙 (수텐트(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 42C는 겜시타빈 (겜자르(등록상표))에 대한 정상 인간 섬유아세포 세포주 H500의 감작에 대한 수니티닙 (수텐트(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 43A는 미톡산트론에 대한 정상 인간 폐 섬유아세포 세포주 IMR90의 감작에 대한 수니티닙 (수텐트(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 43B는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 정상 인간 폐 섬유아세포 세포주 IMR90의 감작에 대한 수니티닙 (수텐트(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 43C는 겜시타빈 (겜자르(등록상표))에 대한 정상 인간 폐 섬유아세포 세포주 IMR90의 감작에 대한 수니티닙 (수텐트(등록상표))의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/수니티닙 (scL-수텐트(등록상표)))의 효과를 보여준다.
도 44는 TfRscFv/LipA/게피티닙 복합체 내의 상이한 비의 게피티닙 (이레사(등록상표))/LipA의 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 효과를 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 45A는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 게피티닙 (이레사(등록상표)) (TfRscFv/LipA/게피티닙 (scL-게피티닙) 및 유리 게피티닙의 인간 유방암 세포 (MDA-MB-231)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 45B는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 게피티닙 (이레사(등록상표)) (TfRscFv/LipA/게피티닙 (scL-게피티닙) 및 유리 게피티닙의 인간 흑색종 세포 (MDA-MB-435)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 45C는 리간드-리포좀 복합체에 의해 전달된 게피티닙 (이레사(등록상표)) (TfRscFv/LipA/게피티닙 (scL-게피티닙) 및 유리 게피티닙의 인간 전립선암 세포 (DU145)에 대한 효과를 비교하여 보여준다.
도 46A는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231의 감작에 대한 12 μM 농도의 게피티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 46B는 도세탁셀 (탁소테레)에 대한 인간 흑색종 세포의 감작에 대한 15 μM 농도의 게피티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))과 비교하여 보여준다.
도 46C는 미톡산트론에 대한 인간 전립선암 세포주 (DU145)의 감작에 대한 8 μM 농도의 게피티닙의 TfRscFv/LipA (scL) 복합체 전달 효과를 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))과 비교하여 보여준다.
본 발명에 따른 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 리포좀 또는 양이온성 중합체 복합체는 목적하는 복합체의 성분들을 규정된 비율로 규정된 순서로 함께 혼합하는 간단하고 효율적인 비-화학적 접합 방법에 의해 제조된다. 예기치 않게, 생성되는 복합체는 항체 또는 항체 단편이 리포좀 또는 중합체에 화학적으로 접합된 유사한 복합체만큼 효과적이거나, 그보다 더 효과적이다.
전체 항체 또는 항체 단편이 본 발명의 복합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 항체 단편이 사용된다. 적합하게는, 항체 단편은 항체의 단일쇄 Fv 단편이다. 하나의 예시적인 항체는 항-TfR 모노클로날 항체이고, 적합하게는 항체 단편은 항-TfR 모노클로날 항체를 기초로 한 scFv이다. 적합한 항-TfR 모노클로날 항체는 5E9이다. 상기 항체를 기초로 한 scFv는 대략 분자량 26,000의 단일 폴리펩티드쇄로서 상기 MAb에 의해 인식되는 TfR의 에피토프에 대한 완전한 항체 결합 부위를 포함한다. scFv는 각각 중쇄 및 경쇄로부터의 성분 VH 및 VL 가변 도메인을 적절하게 설계된 펩티드와 함께 연결시켜 형성되고, 상기 펩티드는 제1 가변 영역의 C-말단과 제2 가변 영역의 N-말단을 VH-펩티드-VL 또는 VL-펩티드-VH의 순서로 가교시킨다. 다른 예시적인 항체는 항-HER-2 모노클로날 항체이고, 다른 바람직한 항체 단편은 항-HER-2 모노클로날 항체를 기초로 한 scFv이다.
바람직한 실시태양에서, 시스테인 부분이 scFv의 C-말단에 부가된다. 이론에 지지되기를 바라지는 않지만, 유리 술프히드릴기를 제공하는 시스테인이 항체와 리포좀 사이의 복합체의 형성을 향상시킬 수 있다고 생각된다. 하기 실시예에 상세히 설명되는 바와 같이, 시스테인이 존재하거나 존재하지 않은 단백질이 이. 콜라이 (E. coli) 봉입체 (inclusion body) 내에 발현된 후, 재폴딩되어 활성 형태의 항체 단편을 생산할 수 있다.
복합체의 형성에 입체적으로 안정화된 면역리포좀이 요구되지 않으면, 복합체 제조시의 제1 단계는 양이온성 리포좀 또는 리포좀의 조합물 또는 작은 중합체와 선택된 항체 또는 항체 단편의 혼합을 포함한다. 매우 다양한 양이온성 리포좀이 본 발명의 복합체의 제조에 유용하다. PCT 특허 출원 공개 WO99/25320에서는 몇몇 양이온성 리포좀의 제제를 설명한다. 바람직한 리포좀의 예는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트 (DOTAP) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 및/또는 콜레스테롤 (chol)의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 DOPE 및/또는 chol의 혼합물을 포함하는 것을 포함한다. 지질의 비는 특이적인 표적 세포 종류에 대한 치료 분자의 흡수 효율을 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 리포좀은 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 양이온성 지질(들) 대 중성 또는 헬퍼 지질(들)의 바람직한 비율은 약 1:(O.5-3), 바람직하게는 1:(1-2) (몰비)이다. 또한, 리포좀은 엔도좀 붕괴 펩티드, 예를 들어 시그마-제노시스 (Sigma-Genosys, 미국 텍사스주 더 우들랜즈)에서 제조한 K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (서열 2) 펩티드도 포함할 수 있다. 엔도좀 붕괴 펩티드 HoKC는 세포의 세포질 내에서 물질의 방출을 도울 수 있다.
적합한 중합체는 DNA 압축 (compaction)을 매개할 수 있고 엔도좀 방출도 매개할 수 있는 DNA 결합 양이온성 중합체이다. 바람직한 중합체는 폴리에틸렌이민이다. 다른 유용한 중합체는 폴리신, 프로타민 및 폴리아미도아민 덴드리머를 포함한다.
항체 또는 항체 단편은 표적 세포의 표면, 바람직하게는 표적 세포 상에 차별적으로 발현되는 수용체에 결합하는 것이다. 항체 또는 항체 단편을 양이온성 리포좀 또는 중합체와 실온에서 약 1:20 내지 약 1:40 (w:w) 범위의 단백질:지질 비율 또는 약 0.1:1 내지 10:1 (몰비) 범위의 단백질: 중합체 비율로 혼합한다.
항체 또는 항체 단편 및 리포좀 또는 중합체를 실온에서 짧은 시간, 대개 약 10-15분 동안 인큐베이팅한 후, 혼합물을 선택된 치료제 또는 진단제와 혼합한다. 항체 및 리포좀에 복합체화될 수 있는 치료 분자 또는 치료제의 예는 유전자, 고분자량 DNA (게놈 DNA), 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 펩티드, 리보자임, 핵산, 소분자, 바이러스 입자, 면역조절제, 단백질, 조영제 및 화학제를 포함한다. 바람직한 치료 분자는 p53, Rb94 또는 아폽틴을 코딩하는 유전자를 포함한다. RB94는 망막모세포종 종양 서프레서 유전자의 변이체이다. 아폽틴은 종양 세포에서만 세포자멸을 유도하는 유전자이다. 다른 바람직한 실시태양에서, 물질은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 HER-2이다. 바람직한 HER-2 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3' (서열 1). 제3의 바람직한 물질은 진단 조영제, 예를 들어 MRI 조영제, 예를 들어 Gd-DTPA 물질이다. 물질이 DNA, 예를 들어 p53의 코딩 영역일 경우, 이는 강력한 구성적 (constitutive) 프로모터, 예를 들어 RSV 또는 CMV 프로모터의 조절 하에 위치할 수 있다.
항체 또는 항체 단편 및 리포좀 조합물을 치료제 또는 진단제와 약 1:10 내지 1:20 (㎍ 물질:nmole 총 지질) 또는 약 1:10 내지 1:40 (㎍ 물질:nmole 총 중합체) 범위의 비율로 혼합하고, 실온에서 짧은 시간 동안, 대개 약 10 내지 15분 동안 인큐베이팅하였다. 리포좀 복합체의 크기는 맬버른 (Malvern) 제타시저 (ZETASIZER)(등록상표) 3000을 사용하여 동적 광산란에 의해 측정할 때 대개 약 50-500 nm 범위 내에 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 복합체의 형성에 사용된 리포좀은 입체적으로 안정화된 리포좀이다. 입체적으로 안정화된 리포좀은 친수성 중합체, 예컨대 PEG, 폴리(2-에틸아크릴산), 또는 폴리(n-이소프로필아크릴아미드) (PNIPAM)가 통합된 리포좀이다. 이같은 변형 리포좀은 치료제 또는 진단제와 복합체화될 때 특히 유용할 수 있고, 이것은 변형 리포좀이 대체로 이렇게 변형되지 않은 유사한 리포좀만큼 신속하게 망상내피 시스템에 의해 혈류로부터 소거되지 않기 때문이다. 본 발명의 입체적으로 안정화된 리포좀 복합체를 제조하기 위해, 항체 또는 항체 단편, 리포좀 및 치료제 또는 진단제의 혼합 순서는 상기 기재된 순서와 역순이다. 제1 단계에서, 상기한 바와 같은 양이온성 리포좀을 먼저 상기한 바와 같은 치료제 또는 진단제와 약 1:10 내지 1:20 (㎍ 물질:nmole 지질) 범위의 비율로 혼합한다. 이러한 리포플렉스(lipoplex)에, 생리학상 허용되는 버퍼 내의 PEG 중합체의 용액이 첨가되고, 생성된 용액은 중합체가 리포좀 복합체 내로 통합되기에 충분한 시간 동안 실온에서 인큐베이션된다. 그후, 항체 또는 항체 단편을 안정화된 리포좀 복합체와 실온에서 약 1:5 내지 약 1:30 (w:w) 범위의 단백질:지질 비율로 혼합한다.
본 발명에 따라 제조된 리포좀 또는 중합체 복합체는 생체내 투여를 위한 약물학상 허용되는 제제로 제제화될 수 있다. 복합체는 약물학상 혼화성인 비히클 또는 담체와 조합될 수 있다. 조성물은 예를 들어 복합체의 치료 또는 진단 분자의 투여가 이로운 인간 환자에 대한 정맥내 투여를 위해 제제화될 수 있다. 복합체는 정맥내 투여 후 신체의 전반에 걸쳐 분포되도록 적합하게 크기가 정해진다. 별법으로, 복합체는 또다른 투여 경로, 예를 들어 종양내, 경구, 병변내, 분무, 경피, 내시경하, 국소, 복강내 또는 피하 투여를 통해 전달될 수 있다.
한 실시태양에서, 항체- 또는 항체 단편-표적화 리포좀 (또는 중합체) 및 치료제 복합체를 포함하는 조성물이 인간 유전자 요법을 달성하도록 투여된다. 복합체의 치료제 성분은 적합한 조절 서열의 제어 하의 치료 유전자를 포함한다. 다양한 형태의 인간 암에 대한 유전자 요법이 wt p53을 코딩하는 핵산을 함유하는 항체- 또는 항체 단편-표적화 리포좀 또는 중합체 복합체의 전신 전달에 의해 달성될 수 있다. 복합체는 시험관내 및 생체내 모두에서 종양 세포 (원발성 및 전이성 종양 모두)를 특이적으로 표적화할 수 있고, 이를 방사선 조사 및/또는 화학요법에 대해 감작화시킬 수 있다.
복합체는 지질의 선택 및 비율, 항체 또는 항체 단편 대 리포좀의 비율, 항체 또는 항체 단편 및 리포좀 대 치료제 또는 진단제의 비율, 및 항체 또는 항체 단편 및 치료제 또는 진단제의 선택을 통해 표적 세포 유형에 대해 최적화될 수 있다.
한 실시태양에서, 표적 세포는 암 세포이다. 악성 세포 성장이 있는 임의의 조직이 표적일 수 있지만, 두경부, 유방, 전립선, 췌장, 아교모세포종, 신장, 간, 자궁경부, 폐, 지방육종, 횡문근육종, 융모막암종, 흑색종, 망막모세포종, 난소, 위 및 결장직장 암이 바람직한 표적이다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 복합체는 또한 치료 분자의 전달을 위해 비-종양 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 임의의 정상 세포가 표적일 수 있지만, 바람직한 세포는 수지상 세포, 혈관의 내피세포, 폐 세포, 유방 세포, 골수 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 비관의 세포 및 간 세포이다. 바람직하지 않지만, 양성인 세포, 예컨대 양성 전립선 비대증 세포, 과활성 갑상선 세포, 지방종 세포, 및 자가면역 질병에 관련된 세포, 예컨대 관절염, 루푸스, 중증 근무력증, 편평상피 화생, 형성이상 등에서 수반되는 항체를 생산하는 B 세포가 또한 표적화될 수 있다.
복합체는 다른 치료제, 예를 들어 방사선 조사 또는 화학요법제와 조합되어 투여될 수 있다. 치료제, 또는 치료제의 조합물은 복합체의 투여 전에 또는 투여 후에, 예를 들어 약 12시간 내지 약 7일 내에 투여될 수 있다. 화학요법제는 예를 들어 독소루비신, 5-플루오로우라실 (5FU), 시스플라틴 (CDDP), 도세탁셀. 겜시타빈, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 에토포시드 (VP-16), 캄프토테시아, 악티노마이신-D, 미톡산트론 및 미토마이신 C를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 방사선 요법은 감마선 조사, X선, UV 조사, 마이크로파, 전자 방출 등을 포함한다.
또한, 진단제도 리포좀 또는 중합체 복합체를 통해 표적화된 세포에 전달될 수 있다. 투여 후에 생체 내에서 검출될 수 있는 물질이 사용될 수 있다. 예시적인 진단제는 전자 밀도가 높은 물질, 자기 공명 조영제 및 방사성 약물이 포함된다. 영상화에 유용한 방사선핵종에는 64Cu, 67Cu, 111In, 99mTc, 67Ga 또는 68Ga가 포함되는 구리, 갈륨, 인듐, 레늄, 및 테크네튬의 방사성 동위원소가 포함된다. 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,688,488 (Low et al.)에 개시된 조영제가 본 발명에서 유용하다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 복합체는 복합체에 의한 치료 분자의 전신 전달에서 사용하기 위한 키트의 형태로 제공될 수 있다. 적절한 키트는 분리된 적절한 용기 내에 리포좀, 항체 또는 항체 단편, 및 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 성분을 무균 조건 하에 적합한 순서로 혼합하고, 적당한 시간, 일반적으로 제조 후 약 30분 내지 약 24시간 이내에 환자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는, 키트 성분은 용액으로서 또는 건조 분말로서 제공된다. 바람직하게는, 용액 형태로 제공되는 성분은 적합한 버퍼, 삼투압 조절제 등과 함께 주사용 멸균수에서 제제화된다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 진단제 및/또는 치료제가, 리포좀 내부에 봉입되거나, 이중층의 탄화수소쇄 영역 내에 함유되거나, 내부 및/또는 외부 단층과 복합체화/회합되거나 (예를 들어, 정전기적 상호작용 또는 화학적/공유 상호작용을 통해), 또는 임의의 또는 모든 상기 가능성이 조합된 하나 이상의 소분자인 리포좀 복합체를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "소분자"는 일반적으로 분자량이 약 10 kD 미만, 적합하게는 약 5000 달톤 미만, 보다 적합하게는 약 1000 달톤 미만, 예를 들어 약 100 내지 약 900 달톤, 약 200 내지 약 800 달톤, 약 300 내지 약 700 달톤, 약 400 내지 약 600 달톤, 또는 약 500 달톤인 저분자량 약제, 치료제 및/또는 진단제 (후자의 예는 마커, 염료 등), 및 상기 화합물의 염, 에스테르, 및 다른 제약상 허용되는 형태를 의미한다.
소분자의 예는 암 (예를 들어, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 고환암, 폐암, 백혈병, 림프종, 결장암, 위장관암, 췌장암, 방광암, 신장암, 골암, 신경암, 두경부암, 피부암, 육종, 선종, 암종 및 골수종); 감염성 질병 (예를 들어, 세균 질병, 진균 질병, 기생충 질병 및 바이러스 질병 (예를 들어 바이러스 간염, 심장친화성 바이러스에 의해 야기되는 질병; HIV/AIDS, flu, SARS 등)); 및 유전 질환 (예를 들어, 빈혈, 호중구 감소증, 저혈소판증, 혈우병, 왜소증 및 중증 복합 면역결핍병 ("SCID"); 자가면역 질환 (예를 들어, 건선, 전신 홍반 루푸스 및 류마티스성 관절염) 및 신경변성 질환 (예를 들어, 상이한 형태 및 단계의 다발성 경화증, 크로이츠펠트-야콥 (Creutzfeldt-Jakob) 병, 알쯔하이머 (Alzheimer) 병 등)을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 질병 상태로 고통받거나 이들 질병에 걸리기 쉬운 환자의 치료에 유용한 화합물을 포함한다.
암 치료에 유용한 예시적인 소분자 (즉, 항암 소분자)는 튜불린 중합을 억제하는 소분자, 항-혈관신생 소분자, 키나제 억제제 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 소분자는 적합하게는 약 2 내지 약 9의 pKa를 갖고, 많은 경우에 상기 범위 내의 복수의 pKa (즉, 2, 3, 4 등)를 가질 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 소분자는 수용성, 저수용성, 또는 수난용성일 수 있다 (물에 불용성인 화합물 포함).
적합한 실시태양에서, 본 발명의 실시에 유용한 소분자는 튜불린 중합 억제제, 예를 들어 GMC-5-193 (및 그의 유사체) 및 YK-3-250 (및 그의 유사체)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
GMC-5-193 (및 그의 유사체)은 몇몇 암 세포주에서 항미세관 및 항-혈관신생 효과를 갖는 탈리도마이드 유사체이다. GMC-5-193은 항증식 활성으로 인간 암 세포 증식을 억제한다. 상기 분자의 효능은 잘 공지된 항유사분열제인 빈크리스틴과 유사하다. 몇몇 연구에서는 항증식 효과가 몇몇 종류의 암 세포에서 튜불린 중합의 억제에 의한 것일 수 있음을 제안하였다. 상기 유사체는 암 세포에서 유사분열 축적 및 이상 유사분열 방추사의 형성을 개시시켰다.
x-선 구조로부터, GMC-5-193은 βIII 인간 튜불린 내의 탁솔 및 콜히친 결합 부위 근처의 아미노산 차이가 가장 큰 구역 내로 바로 도입되는 것으로 확인되었다. 그러나, 생체내 효능 조사시에, 상기 소분자의 수난용성은 그의 투여를 방해한다. 용해도는 전신 약물 생체이용률의 측면에서 중요한 고려사항이고, 그 이유는 불용성이 약물 효능을 추가로 제한하고 후속적으로 필요한 증가된 투여량이 환자 허용성을 손상시키기 때문이다. 상기 문제를 방지하기 위해서, pH-감수성의 히스티딜화된 합성 올리고리신인 HoKC와 접합된 (또는 접합되지 않은), 종양을 표적으로 하는 리간드 (TfRscFv) 및 양이온성 리포좀을 사용하여 상기 분자에 대한 종양을 표적으로 하는 리포좀 전달 시스템을 이용하였다. HoKC는 표적화 복합체의 항암 효과를 개선시키기 위해서 복합체에 포함되고, 엔도좀 이탈을 돕기 위해 설계되었다. 약물은 세포질 내로 확산되고, 세포질로부터 그의 세포독성 효과를 발휘하는 핵으로 전달되거나 또는 세포외 컴파트먼트로 방출되어 다른 종양 세포에 대한 세포독성 효과 (방관자 (bystander) 효과)를 보일 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 실시에 유용한 추가의 소분자는 다음과 같은 티로신 키나제 억제제 (이로 제한되지 않음)를 포함한다:
이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)):
Figure 112008085585654-pct00001
에를로티닙 히드로클로라이드 (타르체바(등록상표)):
Figure 112008085585654-pct00002
수니티닙 말레이트 (SU11248, 수텐트(등록상표)):
Figure 112008085585654-pct00003
게피티닙 (이레사(등록상표)):
Figure 112008085585654-pct00004
본 발명의 실시에 유용한 추가의 소분자는 제약 화합물, 및 마커 염료 및 다른 진단용 분자를 포함한다. 상기 소분자의 예는 공지되어 있고, 당업자가 쉽게 확인할 수 있고, 많은 소분자는 Pharmabase (National Center for Research Sources, National Institutes of Health)와 같은 데이타베이스에서 찾을 수 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 제약 소분자의 일반적인 종류는 막 수송 조절에 관여하는 화합물 (예를 들어, 채널, 펌프, 수용체, 수송체); 대사에 관여하는 화합물 (예를 들어 ATP 억제제, 전자 수송 조절제, 아미노산 또는 지방산 합성의 억제제, 세라미드 유사체 등); 세포내 메신저 (예를 들어, 키나제 억제제 등); 세포 신호전달 조절에 관여하는 화합물; 세포 구역 조절에 관여하는 화합물; 및 다른 공지의 소분자 종류를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 소분자 종류 및 화합물의 추가의 예는 각각의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 7,041,651, 7,033,775, 7,005,255 및 6,900,198에서 볼 수 있다.
본원에 설명된 바와 같이, 소분자는 적합하게는 프로세싱 동안 하나 이상의 소분자를 단순히 리포좀과 혼합함으로써 본 발명의 리포좀 복합체에 봉입되거나, 포함되거나 또는 복합체화/회합된다. 소분자:리포좀 복합체의 적합한 비율은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 예를 들어, 소분자 대 리포좀 복합체의 몰비는 적합하게는 약 0.2:7 내지 약 14:7 (소분자:리포좀) 범위, 적합하게는 약 1:7 내지 약 12:7, 약 1:7 내지 약 10:7, 약 2:7 내지 약 9:7, 약 4:7 내지 약 8:7, 약 5:7 내지 약 8:7, 약 2.8:7 또는 약 7:7 (소분자:리포좀)이다. 명세서 전반에 걸쳐 설명되는 바와 같이, 소분자의 전달을 위한 바람직한 양이온성 리포좀의 예에는 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트 (DOTAP)와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 및/또는 콜레스테롤 (chol)의 혼합물, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)와 DOPE 및/또는 chol의 혼합물을 포함하는 것이 포함된다. 지질의 비는 특이적인 표적 세포 종류에 대한 치료 분자의 흡수 효율이 최적화되도록 변할 수 있다. 리포좀은 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 중성 또는 헬퍼 지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 양이온성 지질(들) 대 중성 또는 헬퍼 지질(들)의 바람직한 비율은 약 1:(0.5-3), 바람직하게는 1:(1-2) (몰비)이다. 다양한 지질의 비율의 예는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:
LipA DOTAP/DOPE 1:1 몰비
LipB DDAB/DOPE 1:1 몰비
LipC DDAB/DOPE 1:2 몰비
LipD DOTAP/Chol 1:1 몰비
LipE DDAB/Chol 1:1 몰비
LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
(DOTAP = 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트, DDAB = 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드; DOPE = 디올레오일포스파티딜에탄올아민; chol = 콜레스테롤).
한 실시태양에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제조하고; 항체 또는 항체 단편을 양이온성 리포좀과 혼합하여 양이온성 면역리포좀을 형성하되, 여기서 항체 또는 항체 단편은 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합되지 않고; 양이온성 면역리포좀을 소분자와 혼합하여 상기 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체를 형성하는 것을 포함하는, 소분자를 포함하는, 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체의 제조 방법을 제공한다. 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합되지 않지만, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 전하-전하, 또는 다른 비-화학적 접합 상호작용을 통해 리포좀과 직접 회합/복합체화되어 면역리포좀을 형성한다.
적합한 실시태양에서, 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편, 예를 들어, 항-트랜스페린 수용체 단일쇄 Fv (TfRscFv)이다. 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀의 제조에 사용하기 적합한 지질의 예는 본원에서 설명되고, 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및/또는 콜레스테롤의 혼합물; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및/또는 콜레스테롤의 혼합물을 포함한다. 적합하게는, 양이온성 면역리포좀은 소분자와 약 0.2:7 내지 약 14:7 (소분자:면역리포좀) 범위의 몰비, 적합하게는 약 1:7 내지 약 12:7, 약 1:7 내지 약 10:7, 약 2:7 내지 약 9:7, 약 4:7 내지 약 8:7, 약 5:7 내지 약 8:7 또는 약 7:7 (소분자:면역리포좀)의 몰비로 혼합된다. 본 발명의 실시에 유용한 예시적인 소분자는 본원에 기재된 것 및 당업계에 공지되어 있고, 당업자가 쉽게 확인할 수 있는 추가의 소분자를 포함한다. 적합하게는, 소분자는 항암 소분자, 예를 들어 GMC-5-193, YK-3-250, 이마티닙 메실레이트, 에를로티닙 히드로클로라이드, 수니티닙 말레이트, 게피티닙 및 그의 유사체 및 유도체, 및 본원에서 설명되고/되거나 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 소분자이고, 이로 제한되지 않는다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 방법에 의해 제조된, 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀 복합체를 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 양이온성 리포좀, 항체 또는 항체 단편, 및 소분자를 포함하는, 항체- 또는 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체를 제공하고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합되지 않는다. 소분자(들)은 양이온성 리포좀 내에 봉입되거나, 양이온성 리포좀의 탄화수소쇄 영역 내에 함유되거나, 양이온성 리포좀의 내부 또는 외부 단층 (헤드기 영역 포함)과 회합되거나, 또는 이들의 임의의 조합이 가능하다. 적합하게는, 본 발명의 양이온성 면역리포좀은 단일층 (unilamellar) 리포좀 (즉, 단일 이중층)이지만, 몇몇 동심성 이중층을 포함하는 다중층 리포좀도 사용될 수 있다. 본 발명의 단일 이중층 양이온성 면역리포좀은 물질 (예를 들어, 소분자)이 그 내부에 봉입될 수 있는 내부 수성 부피를 포함한다 (적합하게는 수용성 물질). 면역리포좀은 또한 물질 (예를 들어, 소분자)이 그 내부에 포함될 수 있는 탄화수소쇄 영역 (즉, 지질의 지질쇄 영역)을 갖는 단일 이중층을 포함한다 (적합하게는 지용성 물질). 또한, 물질 (예를 들어, 소분자)은 리포좀 막의 내부 단층 및/또는 외부 단층 (즉, 지질의 헤드기 영역)의 하나 또는 둘 모두와 복합체화되거나 회합될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 물질 (예를 들어, 소분자)은 본 발명의 양이온성 면역리포좀 복합체의 상기 임의의 또는 모든 영역에 봉입/회합/복합체화될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀 복합체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 상태로 고통받거나 이들 질병에 걸리기 쉬운 환자의 치료 방법을 제공한다. 면역리포좀 복합체는 정맥내, 경구, 국소, 흡입, 근육내 주사, 종양내 주사, 병변내 주사, 분무, 경피, 내시경하, 국소, 복강내, 또는 피하 투여 또는 다른 주사 경로를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 바람직한 경로로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "환자"는 동물 환자 (예를 들어, 포유동물, 개, 고양이, 돼지, 양 등) 및 인간을 모두 포함한다.
적합하게는, 본 발명의 방법은 암으로 고통받거나 암에 걸리기 쉬운 환자의 치료를 위해 사용된다. 추가의 실시태양에서, 암으로 고통받거나 암에 걸리기 쉬운 환자를 치료하는 방법은 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체의 투여 이외에 화학요법제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 독소루비신, 시스플라틴, 미톡산트론, 탁소테레 및 CDDP로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화학요법제와 함께 GMC-5-193, YK-3-250, 이마티닙 메실레이트, 에를로티닙 히드로클로라이드, 수니티닙 말레이트, 게피티닙 및 그의 유사체 및 유도체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체를 투여하는 것을 포함한다. 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체 및 화학요법제는 동시에 투여될 수 있거나, 상이한 시간에 (예를 들어, 서로의 투여 전후에) 투여될 수 있다. 적합하게는, 화학요법제는 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체의 투여 전 또는 후에 (예를 들어, 양이온성 면역리포좀 복합체 투여의 적어도 6시간 전 또는 후, 적어도 12시간 전 또는 후, 적어도 24시간 전 또는 후, 적어도 48시간 전 또는 후 등) 투여된다. 추가의 실시태양에서, 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체 및 화학요법제는 환자에게 동시에 투여된다. 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체 및 화학요법제의 적절한 투여량 및 시기 또는 투여 방식은 본원에 제시되고 당업계에서 쉽게 이용가능한 정보를 기초로 하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 양이온성 면역리포좀 복합체 (예를 들어, 소분자를 포함하는 양이온성 면역리포좀 복합체)를 화학요법제와 함께 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 화학요법제의 효과를 향상시키는 방법을 제공한다. 적합한 소분자 및 화학요법제는 본원에서 설명되는 것 및 당업계에 공지된 것을 포함한다. 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체 및 화학요법제는 동시에 투여되거나, 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 적합하게는, 화학요법제는 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체의 투여 전 또는 후에 (예를 들어, 양이온성 면역리포좀 복합체 투여의 적어도 6시간 전 또는 후, 적어도 12시간 전 또는 후, 적어도 24시간 전 또는 후, 적어도 48시간 전 또는 후 등) 투여된다. 추가의 실시태양에서, 화학요법제 및 소분자를 포함하는 면역리포좀 복합체은 환자에게 동시에 투여된다.
본원에서 설명된 방법 및 용도에 대한 다른 적절한 변형 및 변용이 본 발명 또는 그의 임의의 실시태양의 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음이 관련 분야의 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 단지 설명을 위해 본원에 포함되고 본 발명을 한정하고자 의도하지 않는 하기 실시예를 참조로 하여 본 발명이 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예 1
3'-시스테인을 사용하는 TfRscFv의 제작 및 정제
플라스미드 발현 벡터 pDFH2T-vecOK는 피츠제랄드 박사 (Dr. David Fitzgerald (NCI))로부터 입수하였다. 상기 벡터는 인간 트랜스페린 수용체 (CD71)을 인식하는 5E9 항체에 대한 단일쇄 단편을 코딩한다. VH-링커-VκTfRscFv는 목적하는 단편의 PCR 증폭에 의해 입수하였다. 시스테인 부분을 TfRscFv 단백질의 3' 단부에 첨가하였다. 2가지 형태의 상기 벡터가 제작되었다. 첫번째는 pelB 리더 (leader) 신호 서열 (원형질막주위 공간으로 전달을 위한), 및 His Tag을 함유한다. His Tag의 존재는 단백질의 검출을 도와, 정제 프로토콜의 개발을 단순화시킨다. 이 형태는 초기 시험에 사용되었지만, FDA 지침에서는 임상 시험에 사용하기 위해 외래 서열이 존재하지 않을 것을 권장한다. 따라서, 상기 두 서열을 제외한(minus) 두번째 형태 또한 제조하였다.
PCR 증폭을 이용하여, 시스테인 잔기에 대한 뉴클레오티드 서열 및 NotI 제한 부위를 3' 단부에 도입하였다. 유사하게, 5' NcoI 부위를 또한 포함시켰다. PCR 산물을 시판 벡터 pET26b(+) (노바겐 (Novagen))의 NcoI 및 NotI 부위 내로 클로닝하여, pelB 리더 신호 서열 및 His Tag를 모두 함유하는 단백질 산물을 생산하였다. IPTG를 함유하는 세균 배양액에서의 성장은 단일쇄 단백질 발현을 약 100배 증가시켰고, 이는 IPTG 도입의 약 10시간에 최대였다. 상기 단백질은 주로 불용형 분획 (봉입체)에서 발견되었다.
상기 구성체를 또한 최종 단백질 산물에서 His Tag 및 pelB 서열을 모두 제거하기 위해 변형하였다. 이를 달성하기 위해, pET26b(+) 벡터를 pelB 서열의 5'의 NdeI 효소 부위에서 절단하였다. PCR 증폭으로 TfR 서열에 대해 VH-링커-VκscFv의 5' 단부에 NdeI 부위를 삽입하였다. 시스테인 잔기에 대한 뉴클레오티드 서열 및 3' 단부에서 NotI 제한 부위에 추가로, DNA 중지 코돈을 시스테인 서열에 인접하게 NotI 부위 앞에 도입하였다. PCR 산물을 시판 발현 벡터 pET26b(+) (노바겐)의 NdeI 및 NotI 부위 내로 클로닝하였다. 따라서, 상기 구성체의 단백질 산물은 pelB 서열 또는 His-tag을 함유하지 않을 것이다.
대다수의 cys-TfRscFv 단백질 (약 90％)은 가용성은 아니고 봉입체 내부에 포함되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 설명된 구성체로부터의 단백질을 초음파분해에 의해 봉입체로부터 단리하고, 6 M 구아니딘-HCl, 200 mM NaCl (6 M GuHCl 버퍼)로 처리하고, Sephacryl S-200 겔 여과 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. cys-TfRscFv 단백질의 재폴딩은 감소하는 농도의 구아니딘-HCl에 대한 4℃에서 투석에 의해 달성하였다. 별법으로, cys-TfRscFv 단백질은 Triton X-100을 사용한 초음파분해에 이어, 6 M 구아니딘-HCl, 0.1M tris-HCl pH=8.0, 2 mM EDTA pH=8.0 및 디티오에리트리톨 내에 용해시킴으로써 봉입체의 단리에 의해 제조하였다. 재폴딩은 0.1 M Tris-HCl pH=8.0, 0.5M L-아르기닌-HCl, 2 mM EDTA 및 0.9 mM 글루타티온으로 이루어진 버퍼와 혼합하고, 4℃에서 36-48시간 유지한 후, 4℃에서 20-24시간 동안 20 mM Tris-HCl (pH=9.0), 100 mM 우레아, 및 2 mM EDTA (pH=8.0)에 대해 투석함으로써 달성하였다. 투석 후, cys-TfRscFv를 Q-세파로스를 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 농축하고 (Amicon 한외여과 장치를 사용하여), 4℃에서 30시간 동안 PBS (pH=7.4) + 0.06 M 염화나트륨에 대한 투석하였다. 정제 후, SDS-PAGE는 정확한 분자량이 약 28-30 kDa인 가용화된 재폴딩된 cys-TfRscFv 단백질의 단일 밴드를 보여주었다 (WO 00/50008에 기재된 바와 같이). cys-TfRscFv 단백질은 -80℃에서 저장한다.
실시예 2
간단한 혼합에 의한 cys-TfRscFv-리포좀의 제조
본원에 참고로 포함된 PCT 출원 공개 WO 99/25320에서는 몇몇 양이온성 리포좀의 제제를 설명한다. 제조된 양이온성 리포좀은 투명한 용액이고, 그들의 조성 및 비율은 다음과 같다:
LipA DOTAP/DOPE 1:1 몰비
LipB DDAB/DOPE 1:1 몰비
LipC DDAB/DOPE 1:2 몰비
LipD DOTAP/Chol 1:1 몰비
LipE DDAB/Chol 1:1 몰비
LipG DOTAP/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
LipH DDAB/DOPE/Chol 2:1:1 몰비
(DOTAP = 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트, DDAB = 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드; DOPE = 디올레오일포스파티딜에탄올아민; chol = 콜레스테롤)
당업자는 접합된 TfRscFv-면역리포좀이 그의 면역학적 활성을 보유하는 것을 잘 알 것이다. 본 발명자들은 cys-TfRscFv가 리포플렉스에 화학적으로 접합될 수 있고 (PCT 출원 WO 00/50008), 시험관 내에서 및 생체 내에서 인간 전립선 종양 세포를 효율적으로 형질전환시킬 수 있음을 확립하였다. 단일쇄 항체 단편을 다양한 화학적 접합 방법을 이용하여 리포좀에 부착시키는 것은 일반적인 실무이다. 화학적 접합 대신에 cys-TfRscFv 및 양이온성 리포좀 (환원가능한 기, 예를 들어 말레이미드 DOPE 또는 임의의 환원가능한 기를 갖는 임의의 지질을 함유하지 않는)의 간단한 혼합이 여전히 종양 세포에 효율적으로 결합하여 형질전환시킬 수 있는 면역 활성 복합체의 형성을 일으킬지 여부를 결정하기 위해 연구를 수행하였다. cys-TfRscFv를 1/25 내지 1/36 (w/w) 범위의 규정된 비율의 단일쇄 단백질 대 리포좀에서 리포좀 A와 혼합함으로써 일련의 cys-TfRscFv-면역리포좀 복합체를 제조하였다. 접합된 cys-TfRscFv 복합체를 사용하는 ELISA 데이타에 기초하여, 혼합된 복합체 내의 DNA 대 nmole 총 지질의 비율은 또한 1/8 내지 1/18로 변화시켰다. 복합체의 제조는 다음 일반적인 절차를 따랐다: 적절한 양의 2 mM 리포좀 (상기 설명된 A-H)을 목적하는 부피를 제공하도록 요구되는 임의의 물과 혼합하고, 뒤집어 혼합하였다. 리포좀-물에, 적절한 양의 cys-TfRscFv를 목적하는 비율을 제공하도록 첨가하고, 5-10초 동안 가볍게 뒤집어 혼합한다. 상기 혼합물을 실온에서 10분 동안 유지하였다 (약 5분 후 다시 5-10초 동안 가볍게 뒤집는다). 동시에, 적절한 양의 DNA를 목적하는 부피를 제공하도록 요구되는 임의의 물과 함께 5-10초 동안 뒤집어 혼합한다. 대개, 시험관내 분석에서 사용하기 위해, DNA 농도는 약 0.01 ㎍ 내지 약 2 ㎍/웰 범위인 것이 바람직하고; 생체내 사용을 위해, 주사당 약 5 ㎍ 내지 약 100 ㎍ DNA를 제공하는 것이 바람직하다. DNA 용액을 재빨리 cys-TfRscFv-리포좀 용액에 첨가하고, 혼합물을 5-10초 동안 뒤집었다. 최종 혼합물을 실온에서 10분 동안 유지하면서 약 5분 후 다시 5-10초 동안 가볍게 뒤집었다. 생체 내 사용을 위해, 50％ 덱스트로스 또는 50％ 수크로스를 5-10％ (V:V)의 최종 농도로 첨가하고, 5-10초 동안 가볍게 뒤집어 혼합한다. 1:30 (cys-TfRscFv:리포좀, w:w) 및 1:14 (㎍ DNA:nmole 총 지질)의 바람직한 비율에서 구체적인 예는 다음과 같다: 800 ㎕의 최종 부피 내의 40 ㎍ DNA에 대해, 183 ㎕ 물을 280 ㎕의 2 mM 리포좀 용액과 혼합한다. 34 ㎕의 cys-TfRscFv (농도 0.4 ㎍/ml)을 첨가한다. 183 ㎕ 물을 40 ㎕의 1 ㎍/1 ㎕ DNA과 혼합한다. 최종 단계로서 80 ㎕의 50％ 덱스트로스를 첨가한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 최종 복합체의 크기는 맬버른 제타시저 3000을 사용하는 동적 광산란에 의해 결정할 때 25 내지 35의 제타 전위를 갖는 100 내지 400 (수치 값)이다. 이 크기는 종양 모세혈관상 (bed)를 통해 효율적으로 통과하여 종양 세포에 도달하기 위해 충분히 작다.
인간 전립선암 DU145 세포에 대한 혼합된 복합체의 결합 능력을 평가하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 비교를 위해, 접합된 면역리포좀을 사용하여 제조된 복합체를 또한 분석에 포함시켰다. 도 1에 나타낸 결과는 cys-TfRscFv 단백질을 양이온성 리포좀과 간단한 혼합에 의해 제조된 면역리포좀 복합체가 적어도 접합을 통해 제조된 것과 같은 정도로 DU145 세포에 결합하는 것을 명백하게 입증한다. 접합된 복합체와 유사하게, 1/30 단백질 대 지질 및 1/14 DNA 대 지질의 비율이 최고 결합 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한 접합된 복합체를 사용하여 앞서 관찰된 것과 같이, 결합은 DNA 용량 의존 방식으로 감소하였다. 상기 발견은 그의 면역학적 활성을 보유하는 성분들의 간단한 혼합이 복합체를 형성할 수 있음을 나타낸다. 루시퍼라제 분석 (도 2 및 3)을 사용하여 인간 전립선 DU145 세포 및 RAT C6 세포에서, 및 형질감염 효율을 평가하기 위해 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 사용하여 인간 췌장암 세포주 Panc I (표 I, II)에서 동일한 최적 비율이 밝혀졌다.
EGFP 리포터 유전자 I을 사용하여 평가된, 간단한 혼합에 의해 제조된 Panc I 세포에서 cys-TfRscFv-리포좀 A의 형질감염 효율
비율 DNA:총 지질
(㎍: nmole)		 ％ 형광 세포
1:8 20
1:10 22
1:12 35
1:14 50
1:16 24
1:18 20
cys-TfRscFv:리포좀의 비율은 1:3 (w:w)이었다.
EGFP 리포터 유전자 II를 사용하여 평가된, 간단한 혼합에 의해 제조된 Panc I 세포에서 cys-TfRscFv-리포좀 A의 형질감염 효율
비율 cys-TfRscFv:지질(w:w) ％ 형광 세포
1:26 14
1:28 14
1:30 30
1:32 28
1:34 15
1:36 18
간단한 혼합에 의한 리포좀 복합체에 대한 cys-TfRscFv의 결합의 효율을 확립하기 위해, 비-변성 폴리아크릴아미드 겔을 사용하였다. 혼합된 cys-TfRscFv-리포좀 A-p53 복합체, 및 p53 DNA가 존재하지 않는 cys-TfRscFv-리포좀 A를 유리 cys-TfRscFv와 함께 복합체를 제조하기 위해 사용된 cys-TfRscFv의 양의 1/5 또는 1/10의 양으로 겔 상에 로딩하였다. 1:30 (w:w)의 cys-TfRscFv:리포좀 및 1:14 (㎍:nmol 총 지질)의 DNA:총 지질의 비율을 사용하여 복합체를 제조하였다. 비-변성 조건 하에, 복합체는 겔 내로 도입할 수 없고, 단지 유리 형태의 비결합 cys-TfRscFv가 그를 통해 이동할 수 있기 때문에, 유리 cys-TfRscFv 복합체는 정량 표준품으로서 역할을 한다. 막으로 옮겨진 후, 겔을 ECL 웨스턴 블롯 (Western Blot) 검출 키트 (아머샴 (Amersham, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))를 사용하여 항-cys-TfRscFv 항체로 프로빙하였다. 유리 cys-TfRscFv 표준품으로부터의 신호와 함께 도 4에 나타낸 2개의 복합체 (p53 DNA가 존재하거나 존재하지 않은)에 대한 낮은 신호 수준의 비교에서는 95％ 초과의 cys-TfRscFv가 성분들의 간단한 혼합에 의해 복합체 내로 포함되는 것을 나타낸다.
실시예 3
cys-TfRscFv-면역리포좀 전달된 wtp53에 의한
인간 암 세포주의 시험관내 화학감작
간단한 혼합에 의해 제조된 cys-TfRscFv-리포좀-p53 복합체가 전립선 종양 세포를 약물 겜자르(등록상표) (겜시타빈 HCl; 일라이 릴리 앤드 컴퍼니 (Eli Lilly and Co.) 제품) 및 노반트론 (NOVANTRONE)(등록상표) (미톡산트론, 이뮤넥스 코퍼레이션 (Immunex Corp.)) (둘 모두 현재 전립선암 치료에 사용된다)에 감작시키는데 얼마나 효과적인지 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 돌연변이체 p53을 수용하는 전립선 종양 세포주 DU145를 상기 연구에서 사용하였다. XTT 세포독성 분석 (66)을 사용하여 본 발명의 cys-TfRscFv-리포좀-p53 복합체에 의해 유도된 약제감수성 수준을 확립하였다. 5 x 103 DU145 세포를 96웰 플레이트의 웰에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 혼합된 cys-TfRscFv-리포좀-p53 복합체로 형질감염시켰다. cys-TfRscFv-리포좀-pSS 복합체는 1:30 (w:w) (cys-TfRscFv:리포좀 A) 및 1:14 (㎍ p53 DNA:nmole 총 지질)의 비율에서 혼합하여 제조하였다. 형질감염 1일 후, 항-신생물제를 증가하는 농도 (삼중 시험으로)로 첨가하였다. 약 3일 후에 XTT 분석을 수행하고, IC50 값 (50％ 성장 억제를 일으키는 약물 농도)을 계산하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, cys-TfRscFv-리포좀-p53 복합체로 처리하면 겜자르(등록상표)에 대한 세포의 감수성이 8배 증가하였다. 도 5A에 대해, IC50 값 (nM)은 다음과 같다: cys-TfRscFv-LipA-p53: 0.5; cys-TfRscFv-LipA: 4.0; cys-TfRscFv-LipA-Vec: 4.0; 형질감염되지 않은: 5.0. 감작 배수 (fold): Vec/p53 = 8 및 UT/p53 = 10.
유사하게, DU145 세포는 약물 미톡산트론에 대해 17.5배 감작되었다 (도 5B). 도 5B에 대해, IC50 값 (ng/ml)은 다음과 같았다: cys-TfRscFv-LipA-p53: 0.08; cys-TfRscV-LipA: 1.20; cys-TfRscFv-LipA-Vec: 1.40 및 형질감염되지 않은: 1.80. 감작 배수: Vec/p53 = 17.5 및 UT/p53 = 22.5. 인간 췌장암 세포주 Panc I를 사용하여 유사한 연구를 수행하였다. 4x103 Panc I 세포/웰을 플레이팅하고, XTT 분석을 상기한 바와 같이 수행하였다. 1:30 (cys-TfRscFv:리포좀 A w:w) 및 1:14 (㎍ p53 DNA:nmole 총 지질)의 바람직한 비율을 또한 여기서 사용하였다. DU145에서와 같이, 종양 세포가 화학요법제에 대해 유의하게 감작되었다 (도 6A 및 B). 0.06 ㎍/웰의 p53 DNA 농도에서, 혼합된 cys-TfRscFv-리포좀 DNA 복합체를 사용하여 겜자르(등록상표)에 대한 감작이 23.8배 증가하였다 (도 6A). 도 6A에 대해, IC50 값은 다음과 같았다: cys-TfRscFvLipA-p53: 0.21 nM; cys-TfRscFvLipA-Vec: 5.00 nM 및 TfLipA-p53: 0.30 nM. cys-TfRscFvLipA-Vec의 IC50/cys-TfRscFrLipA-p53의 IC50 = 23.8. p53 대신 빈 벡터를 사용할 때 감작이 관찰되지 않았다. 0.08 ㎍ DNA/웰의 p53 DNA 농도에서 Panc I 세포의 반응이 획기적으로 증가하였다 (도 6B). 여기서, 감작이 거의 200배 증가한 것이 관찰되었다. 도 6B에 대해, IC50 값은 다음과 같았다: cys-TfRscFvLipA-p53: 1.8 nM; cys-TfRscFvLipA-Vec: 350 nM; 및 cys-TfRscFvLipA: 600 nM. cys-TfRscFvLipA-Vec의 IC50/cys-TfRscFvLipA-p53의 IC50 = 194.44. 따라서, 상기 시험관내 연구에서는 간단한 혼합에 의해 제조된 cys-TfRscFv-리포좀이 wtp53을 전립선 종양 세포 내로 효율적으로 형질감염시키고, 이들을 통상의 화학요법제에 감작시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 4
간단한 혼합에 의해 제조된 cys - TfRscFv - LipA - EGFP 에 의한 생체내 종양 표적화
DU145 종양을 암컷 무흉선 누드 (nude) (NCR nu/nu) 마우스에서 피하 유도하였다. 1/30의 scFv:리포좀 비율에서, 그러나 다양한 DNA:총 지질 비율 (1/10, 1/11, 1/12, 1/13. 1/14)에서 간단한 혼합에 의해 제조된 cys-TfRscFv-LipA-EGFP (향상된 녹색 형광 단백질) (TfRscFvII)를 32 ug DNA/주사로 마우스에게 24시간에 걸쳐 꼬리 정맥에 3회 주사하였다. 비교를 위해, 접합 방법을 통해 제조된 1/30, 1/14에서 복합체 (도 7B에서 TfRscFv III) 및 1/30, 1/14에서 상이한 배치의 단일쇄 (도 7B에서 TfRscFv I)를 또한 마우스에게 주사하였다. 주사 60시간 후, 마우스를 희생시키고, 종양 및 폐를 회수하고, 단백질을 항-EGFP 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 위해 단리하였다. 대조군으로서 리간드가 결합되지 않은 LipA-EGFP 복합체 (UL), Tf-LipA-EGFP 복합체 (Tf) 및 BSA-LipA-EGFP 복합체 (BSA)를 마우스에 주사하였다. 도 7A - DU145 종양에서 나타난 바와 같이, EGFP 밴드가 양성 대조군 Tf, TfRscFvIII, 및 TfRscFvI에서 관찰된다. 보다 유의하게, 1/14의 DNA 대 지질 비율에서 TfRscFvII에서 강한 EGFP 신호가 발견되었다. 이와 반대로, 단지 매우 낮은 수준의 EGFP 발현이 정상 폐 조직에서 명백하였다. 따라서, 간단한 혼합에 의해 제조된 cys-TfRscFv-리포플렉스는 전신 투여 후 종양을 효과적으로 표적화할 수 있다.
혼합의 재현성을 평가하기 위해, 상이한 배치의 cys-TfRscFv (I 내지 V)를 1:30 (scFv:리포좀 w:w) 및 1:14 (㎍ DNA:nmole 총 지질)의 바람직한 비율에서 간단한 혼합에 의해 리포좀 A-EGFP에 복합체화하였다. 인간 전립선 DU145, 방광 HTB-9, 유방 MDA-MB-435 및 두경부 JSQ-3 이종이식편 종양을 상기와 같이 피하 유도하였다. 복합체를 또한 24시간에 걸쳐 꼬리 정맥에 3회 주사하였다. Tf-LipA-EGFP(Tf) 및 리간드가 결합되지 않은 LipA-EGFP 복합체 (UL)를 대조군으로서 사용하였다. 주사 60시간 후에, 마우스를 희생시키고, 종양 및 간을 회수하고, 상기와 같이 분석하였다. 4가지 종양 종류에서 모든 혼합된 복합체에서 표적화가 명백하다 (도 7B). 그러나, 정상 조직 (간)에서는 신호가 거의 없다. 동일한 막을 동일한 로딩을 보여주기 위해 액틴 (Actin) 수준에 대해 프로빙하였다.
실시예 5
간단한 혼합에 의해 제조된 전신 투여된 cys-TfRscFv-리포좀-p53에 의한
인간 이종이식편 종양의 방사성/화학감작
생체 내에서 wtp53을 종양 세포에 효율적으로 결합시키고 전달하는 본 발명의 cys-TfRscFv-면역리포좀 복합체의 능력을 추가로 확인하기 위해 효능 연구를 수행하였다. 약 60-90 mm3의 피하 DU145 종양을 보유하는 마우스에게 cys-TfRscFv-리포좀-p53을 꼬리 정맥을 통해 매주 3회 (총 10회 주사) 주사하였다. 상기 복합체를 1/30 (cys-TfRscFv:리포좀 A, w:w) 및 1/14 (㎍ DNA/nmole 총 지질)의 비율에서 간단한 혼합에 의해 제조하였다. 종양 구역을 2.0 Gy 매일 분할 용량의 γ-방사선에 총 32 Gy으로 선택적으로 노출시켰다 (도 8). 혼합된 cys-TFRscFv-리포좀 A 복합체 + 방사선 조사로 처리된 동물은 유의한 종양 성장 억제를 보였다. 항암 약물 겜자르(등록상표) 및 종양 서프레서 유전자 Rb94를 인간 방광 암종 이종이식편 종양 (HTB-9)에 전달하는 본 발명의 cys-TFRscFv-면역리포좀의 조합물을 사용하여, 및 겜자르(등록상표) 및 세포자멸을 유도하는 다른 유전자 (아폽틴) 또는 p53을 보유하는 cys-TFRscFv-리포좀으로 처리한 Panc I 이종이식편에서 또한 유사한 발견이 관찰되었다.
상기 발견은 본 발명의 방법에 의해 제조된 복합체가 치료적 처치로서 암 세포로 효과적인 생체 내 전달을 위해 다양한 유전자 (플라스미드 벡터 내로 포함된)를 포함할 수 있음을 입증한다.
실시예 6
간단한 혼합에 의해 제조된 cys-TFRscFv-리포좀 A에 의해 전달된 안티센스 HER-2 올리고뉴클레오티드에 의한 시험관 내에서 췌장암 세포의 화학감작
본 실시예는 치료적 처치를 위해 유전자 이외의 분자를 종양 세포로 효율적으로 전달하는데 있어서 본 발명의 유용성을 입증한다. 복합체를 실시예 2에서와 같이 제조하였지만, 여기서 봉입된 DNA는 HER-2 유전자의 개시 코돈(AS HER-2) 에 대해 지정된 18량체 포스포로티올화 올리고뉴클레오티드 (ODN)이었다 (51). 사용된 비율은 상기와 같이 플라스미드 DNA 1:30 (cys-TfRscFv:리포좀, w:w) 및 1:14 (nmole ODN: nmole 총 지질)이었다. Panc I 세포를 4x103 세포/웰에서 96웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후 세포를 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv-LipA-AS HER-2로 형질감염시켰다. Tf-LipA-AS HER-2 및 cys-TfRscFv-LipA-SC ODN을 대조군으로서 사용하였다. SC ODN은 무작위 순서로 AS HER-2 ODN과 동일한 뉴클레오티드 조성을 갖는 스크램블링된 (scrambled) ODN이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv-LipA-AS HER-2 복합체는 췌장암 세포주 Panc I를 화학요법제 겜자르(등록상표)의 효과에 대해 11배 초과로 감작시킬 수 있었다. 상기 감작의 증가는 양성 대조군 Tf-LipA-AS HER2 복합체로 형질감염시켜 생성되는 것과 동일하다. 도 9에 대해, IC50 값은 다음과 같았다: TfRscFv-LipA3-AS-HER-2: 16 nM; Tf-LipAe-AS-HER-2: 14 nM 및 TfR-scFv-LipAe-SC: 200 nM. TfR-scFv-LipAe-SC의 IC50/TfR-scFv-LipAe-AS-HER-2의 IC50= 12.5.
실시예 7
간단한 혼합에 의해 제조된 전신 전달된 cys-TFRscFv-LipA-AS HER-2 ODN에 의한 인간 이종이식편 종양의 시험관내 화학감작
본 실시예에서, 전신 전달 후 안티센스 분자를 생체 내에서 종양 세포에 전달하는 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv 리포좀-DNA 복합체의 능력을 입증한다. 상기 전달 시스템의 보편성을 보여주기 위해, 2가지 상이한 인간 이종이식편 마우스 종양 모델 (췌장암 및 유방암)을 사용하였다. 첫번째 (도 10A)에서, Panc I 피하 이종이식편 종양을 암컷 무흉선 누드 (NCR nu/nu) 마우스에서 유도하였다. 종양이 100-200 mm3 크기일 때, 동물에게 화학요법제 겜자르(등록상표) (복강내) 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv-LipA AS HER-2 (I.V.)를 주사하였다. 복합체는 1:30 (cys-TfRscFv:리포좀, w:w) 및 1:15 (nmole ODN: nmole 총 지질)의 비율을 이용하여 제조하였다. I.V. 주사에 추가로, 상기 설명된 복합체를 또한 종양내 주사하였다. 하나의 군의 동물에게 겜자르(등록상표) 만을 투여하고, 제2 대조군에 겜자르(등록상표) + 빈 벡터를 보유하는 복합체를 투여하였다. 겜자르(등록상표) 단독으로 처리하면 췌장 종양 성장을 유의하게 억제할 수 없었다. 이와 반대로 (도 10A), 겜자르(등록상표) 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv-LipA 복합체에 의해 전달된 AS-HER-2 ODN의 조합은 종양 성장을 유의하게 억제하였을 뿐만 아니라 종양 퇴행을 일으켰다.
인간 유방암 이종이식편 종양의 유의한 종양 성장 억제는 약물 탁소테레(등록상표) (도세탁셀; 아벤티스 파마슈티칼스 (Aventis Pharmaceuticals, 미국 펜실배니아주 칼리지빌레) 제품) 및 I.V. 투여된 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv-LipB AS HER-2의 조합을 사용한 경우에도 관찰되었다 (도 10B). 리포좀 제제 B가 유방 종양에서 사용되는 동안, Panc I에 대해 상기 설명된 바와 동일한 비율을 사용하였다.
실시예 8
간단한 혼합에 의해 제조된 cys-TFRscFv-리포좀에 의한
조영제 마그네비스트(등록상표)의 전달에 의한 MRI 영상의 향상
본 실시예는 MRI 조영제를 봉입하고 본 발명의 방법에 의한 cys-TfRscFv-리포좀-조영제 복합체를 형성하는 능력을 입증한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 복합체는 정맥내 투여될 수 있어서, 원발성 종양 및 전이 모두에 대해 종양 영상의 향상을 증가시킨다. 상기 조영제는 마그네비스트(등록상표) (Gd-DTPA) (쉐링 아게 (Schering AG))를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 간단한 혼합에 의해 복합체를 형성하기 위해 사용되는 비율은 1:30 (cys-TfRscFv:리포좀, w:w) 및 1:14 (㎍ 조영제:nmole 지질)의 바람직한 비율이다. 상기 연구에서, 16 ㎕의 마그네비스트(등록상표)를 복합체에 사용하였다.
도 11은 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv-LipA-마그네비스트(등록상표)를 인간 두경부 (상부 패널), 유방 (중앙 패널) 또는 전립선 (하부 패널) 기원의 피하 이종이식편 종양을 보유하는 마우스 내로 1회 I.V. 주사한 결과를 도시한 것이다. 유리 마그네비스트(등록상표)를 투여한 것에 비해 cys-TfRscFv-LipA-마그네비스트(등록상표)를 투여한 종양에서 보다 높은 수준의 조영제 향상이 명백하여, 본 발명의 방법에 의해 제조된 복합체를 사용하여 조영제를 투여하는 잇점을 입증한다. 다른 실험에서, 둘러싸는 정상 조직에 비해 종양에서 증가된 흡수가 또한 관찰되었다.
유사한 향상은 동계 마우스 폐 전이 모델을 사용하여 또한 관찰되었다. B16/F10 마우스 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스에 정맥내 주사하였다. 상기 세포는 마우스 폐에서 종양 결절을 형성한다. cys-TfRscFv-리포좀-마그네비스트(등록상표) 복합체를 또한 1:30 및 1:14의 바람직한 비율을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 제조하였다. 복합체를 I.V. 투여하고, 종양 결절을 MRI를 통해 영상화하였다. 또한, 유리 마그네비스트(등록상표)에 비해 복합체에서 피크 향상이 더 나중에 발생하기 때문에, 봉입된 조영제는 유리 마그네비스트(등록상표)에 비해 종양에서 흡수가 연장된다.
실시예 9
간단한 혼합에 의한 입체적으로 안정화된 면역리포좀의 제조
리포좀 복합체는 세망내피계에 의해 혈류로부터 신속하게 청소된다. 상기 순환 시간을 연장하기 위한 노력에서, 리포좀 복합체 내로 통합된 친수성 중합체, 예를 들어 PEG를 갖는 입체적으로 안정화된 리포좀을 제제화하였다. 표적화 리간드, 예를 들어 항체 또는 항체 단편을 PEG-리포좀 복합체 내에 포함시키기 위해 다양한 방법을 고안하였다. 전부는 아니지만 대부분의 상기 방법론은 항체 또는 항체 단편을 PEG에 연결시키는 화학적 접합 단계를 포함한다. 복합체 형성에 사용된 상기 가혹한 화학 반응 및 방법은 항체 활성의 상실 또는 차폐를 일으킬 수 있다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 cys-TfRscFv 단백질이 간단한 혼합에 의해 PEG-리포좀 분자에 연결될 수 있고, 생성되는 복합체는 인간 종양 세포를 보다 효율적으로 형질감염시킬 수 있음을 입증하였다.
상기 복합체를 형성하기 위해, 실시예 2에 제시된 양이온성 지질 제제 중 하나로 이루어지는 리포플렉스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 1:14 (㎍ DNA:nmole 지질)의 비율로 핵산과 혼합하였다. 상기 리포플렉스에 25 mM HEPE 버퍼 (pH 7.2) 중 상업적으로 이용가능한 NHS-PEG-MAL 중합체 (2％)를 첨가하였다. 용액을 3-5초 동안 가볍게 뒤집고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이팅하였다. cys-TfRscFv-PEG-리포좀-DNA 복합체를 형성하기 위해, cys-TfRscFv 단백질을 PEG-리포플렉스에 1:8 (cys-TfRscFv:리포좀, w:w)의 비율로 첨가하고, 가볍게 뒤집고 실온에서 10분 내지 1시간 동안 유지한 후, 시험관 내에서 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. 복합체를 형성하기 위해 1:5 내지 1:30 (cys-TfRscFv:리포좀, w:w) 범위의 다른 비를 또한 사용할 수 있다. 생체내 사용을 위해, 50％ 덱스트로스를 인큐베이션 후 5％ 최종 농도로 첨가하고, 가볍게 뒤집어 혼합하고, 동물에 주사하였다. 별법으로, 최종 복합체를 4℃에서 밤새 (12-18 hr) 저장할 수 있다.
여기서 제시된 실험에서, 핵산은 개똥벌레 루시퍼라제 유전자를 코딩하는 플라스미드 DNA인 pLuc이었다. 인간 흑색종 세포 MDA-MB-435를 5x104 세포/웰로 플레이팅하였다. 24시간 후, 이들을 실시예 3에 설명된 바와 같이 cys-TfRscFv-PEG-LipA-pLuc로 형질감염시키고, 형질감염 효율을 루시퍼라제 활성 수준에 의해 평가하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 cys-TfRscFv-PEG-LipA-pLuc 복합체는 표적화 cys-TfRscF 단백질이 존재하지 않는 PEG-LipA-pLuc보다 더 우수한 효율로 표적 세포를 형질감염시킬 수 있었다.
따라서, 본원에 기재된 간단한 혼합 방법은 또한 입체적으로 안정화된 표적화된 면역리포좀을 제조하기 위한 간단한 비파괴적 수단으로서 사용될 수 있다.
실시예 10
간단한 혼합에 의해 소분자 (GMC-5-193)를 포함하는 면역리포좀의 제조 및 특성화
소분자 GMC-5-193의 시험관내 및 생체내 항암 효과를 개선시키기 위해서, 소분자를 포함하는 종양을 표적으로 하는 리포좀 복합체를 제조하였다. TfRscFv/LipA 복합체 외에, 엔도좀 붕괴 펩티드에 접합된 양이온성 리포좀 (LipA-HoKC)도 제조하였다. 엔도좀 붕괴 펩티드 HoKC는 세포질 내에서 튜불린 중합에 영향을 미치도록 세포의 세포질에서 GMC-5-193의 방출을 도울 수 있다. 리간드-리포좀 복합체는 그의 표면 상이 상응하는 수용체의 상승된 수준으로 인해 종양 세포를 우선적으로 표적화한다. 리간드-리포좀 전달된 유전자의 고수준 발현은 원발성 종양 및 전이에서 명백하였지만, 정상 조직, 예를 들어 간, 폐, 골수 및 장선 (intestinal crypt)에서는 그렇지 않았다. 본 실시예에서, 트랜스페린 수용체 단일쇄 (TfRscFv)를 포함하는 본 발명의 리포좀 복합체는 GMC-5-193을 포함하는 리포플렉스의 시험관내 및 생체내 생체 효능을 평가하기 위해 시험관 내에서 및 생체 내에서 GMC-5-193을 암 세포에 전달하기 위해 사용되었다.
물질 및 방법
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 및 N-말레이미도-페닐부티레이트 DOPE (MPB-DOPE)는 아반티 폴라 리피즈 (Avanti Polar Lipids, 미국 알라바마주 알라바스터))에서 구입하였다. K[K(H)KKK]5-K(H)KKC(HoKC) (서열 2) 펩티드는 시그마-제노시스에서 제조되었다.
GMC-5-193의 합성
화합물 GMC-5-193은 버지니아 대학 화학과 (the department of Chemistry, University of Virginia)에서 합성되었다. 이는 분자량이 359.4 Da이고, 그의 구조는 질량 분광법 및 NMR에 의해 확인하였다. 아미드 양성자 및 아민 양성자의 pKa 값은 각각 15 및 9이었다. 화합물의 2.5 mg/mL 원액을 DMSO 내에 제조하였다.
세포주 및 배양액
인간 전립선암 세포주 DU145 (HTB-81) 및 마우스 흑색종 세포주 B16/F10 (CRL-6475)은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC; 미국 버지니아주 매나서스)으로부터 입수하였다. DU145를 10％ 열 불활성화된 우태 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 얼스 (Earls) 염을 함유하는 이글 (Eagle) 최소 필수 배지 (EMEM) 내에서 배양하였다. B16/F10 (ATCC, CRL-6475)을 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 둘베코 (Dulbecco) 변형된 이글 배지 (DMEM) 내에서 배양하였다. 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231, 및 인간 췌장암 세포주 PANC-1을 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 개선된 MEM (IMEM) 내에서 배양하였다. 전이성 세포주 MDA435/LCC6을 MDA-MB-435 복수로부터 개발하였다. MDA435/LCC6을 5％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 IMEM 내에서 배양하였다. 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90 세포 (파니우틴 박사 (Dr. I. Panyutin) (Nuclear Medicine Department, National Institutes of Health, Bethesda, MD)의 기증품)를 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 EMEM 내에서 배양하였다. 정상 (비-암성) 피부 섬유아세포 세포주 H500을 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM 비필수 아미노산 + 10％ 열 불활성화된 우태 혈청, 2 mM L-글루타민 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 EMEM 내에서 배양하였다. EMEM은 미디어테크 (MediaTech, 미국 버지니아주 헌던)로부터 구입하였고, 다른 세포 배양 배지 및 성분은 바이오플루이즈 (Biofluids, 미국 메릴랜드주 록빌)로부터 입수하였다.
TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체의 제조
양이온성 리포좀 제제 LipA (DOTAP:DOPE 또는 DDAB:DOPE, 1:1 내지 1:2 몰비)를 본원 전체에서 및 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 09/914,046에 설명된 바와 같이 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체를 다음과 같이 제조하였다. LipA와 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 wt/wt)을 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, GMC-5-193을 적절한 농도에서 첨가하고, 실온에서 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안 인큐베이팅하였다. 동물 주사를 위해, 덱스트로스 또는 수크로스를 각각의 샘플에 1％ 내지 20％, 보다 적합하게는 5-10％의 최종 농도로 첨가하였다. GMC-5-193 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 2:7 내지 8:7, 가장 적합하게는 7:7 또는 2.8:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템 (맬버른, 영국)을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체의 제조
HoKC 펩티드 및 LipA-MPB에서 사용하기 위한 양이온성 리포좀 제제 (DOTAP:DOPE:MPB-DOPE 또는 DDAB:DOPE:MPB-DOPE, 1:1:0.1 내지 1:2:0.1 몰비)를 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. 이어서, LipA-HoKC 리포좀을 앞서 설명된 바와 같이 말레이미드기를 운반하는 양이온성 리포좀과 펩티드가 운반하는 말단 시스테인기 사이의 커플링 반응을 이용하여 제조하였다 (Yu, W., et al., "Enhanced transfection efficiency of a systemically delivered tumor-targeting immunolipoplex by inclusion of a pH-sensitive histidylated oligolyxine peptide." Nucleic Acids Research 32:e4S (2004)). 시스테인 상에 유리 티올기가 존재하는 0.1 mmol의 펩티드의 분취액을 10 mM HEPES (pH 7.4) 용액 중 2 mmol의 LipA-MPB에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 생성되는 LipA-HoKC는 지질 농도가 1.4 mM이었다. TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체를 다음과 같이 제조하였다. LipA-HoKC 및 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA-HoKC의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 (wt/wt))을 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, GMC-5-193을 적절한 농도에서 첨가하고, 실온에서 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안 인큐베이팅하였다. 동물 주사를 위해, 덱스트로스 또는 수크로스를 각각의 샘플에 1％ 내지 20％, 보다 적합하게는 5-10％의 최종 농도로 첨가하였다. GMC-5-193 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 2:7 내지 8:7, 가장 적합하게는 7:7 또는 2.8:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
시험관내 세포 생존력 및 TfRscFv / LipA / GMC -5-193 또는 TfRscFv/리포좀-HoKC/GMC-5-193 복합체의 최적화
시험관내 세포독성 연구를 위해, 100 ㎕의 적절한 성장 배지 중 5 내지 5.5 x 103 세포/웰의 각각의 세포주를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 무혈청 배지 중 100 ㎕의 TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 (적절하게 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193) 또는 유리 GMC-5-193을 증가하는 농도로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 보충하였다. 이어서, 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 37℃에서 5％ CO2를 함유하는 가습 대기 중에서 인큐베이팅하였다. 그 후에, 웰을 페놀 레드 없이 IMEM으로 세척하고, 세포-생존력 XTT-기반 분석을 제조사의 프로토콜 (뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))에 따라 수행하였다. 전자-커플링 시약의 존재 하에, XTT (나트륨 3'-[1-(페닐아미노-카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠 술포네이트)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에서 데히드로게나제에 의해 주황색 포르마잔으로 전환된다. 포르마잔 흡광도 (이는 살아있는 세포의 수에 상호관련된다)를 450 nm에서 미세판 판독기 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 멘로 파크))를 사용하여 측정하였다. 50％ 성장 억제를 일으키는 IC50을 약물 농도의 로그 대 생존 세포 분획의 그래프로부터 내삽하였다.
시험관내 화학감작
화학감작 연구를 위해, 100 ㎕ 중 4~5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 100 ㎕의 TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 (적절하게 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193) 또는 유리 GMC-5-193으로 GMC-5-193으로서 1.25-2.5 μM에서 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 19시간 동안 인큐베이팅한 후, 화학요법제가 존재하거나 존재하지 않은 적절한 보충 배지를 증가하는 농도로 첨가하고, 약 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 계속 인큐베이팅하였다. 사용된 화학요법 약물은 독소루비신 (베드포드 랩스 (Bedford Labs), 미국 오하이오주 베드포드), 도세탁셀 (탁소테레; 아벤티스 파마슈티칼스 (미국 뉴저지주 브릿지워터)), 미톡산트론 (NOVANTRONE(등록상표), 이뮤넥스 코퍼레이션 (미국 와싱턴주 시애틀) 및 시스플라틴 (CDDP; 베드포드 랩스)이었다. 화학요법제에 대한 감작도를 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하고, 각각의 세포의 IC50 값을 계산하였다. 감작 배수는 다음과 같다: IC50 (형질감염되지 않은)/IC50 (각각의 복합체).
시험관내 공초점 영상화
공초점 영상화를 위해, 5.0 x 104 세포/웰의 MDA-MB-435를 24-웰 플레이트 내에 유리 상에 접종하고, 24시간 후에 무혈청 배지로 세척하고, TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 적절한 경우 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193) 또는 유리 GMC-5-193으로 처리하고, 6시간 동안 인큐베이팅하였다. 처리 6시간 후, 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 2회 세척하고, PBS 중 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 다시 PBS로 세척하였다. 이어서, 세포를 프롤롱 (PROLONG)(등록상표) Antifade Kit (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진))를 사용하여 슬라이드 글래스 상에 탑재하였다. 핵 염색을 위해, 고정된 세포를 위한 Select FX Nuclear Labeling Kit 내의 청색-형광 대조염색 (counterstain) 시약인 DAPI (몰레큘라 프로브스)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다. 영상화를 위해, GUMC Microscopy and Imaging Shared Resource (MISR)에 위치하는 올림푸스 (Olympus) 플루오뷰 (FLUOVIEW)(등록상표)-300 레이저 스캐닝 공초점 시스템을 사용하였다.
생체내 종양 표적화
PBS에 현탁시킨 인간 전이 세포 MDA435/LCC6 (8 x 106)를 무흉선 누드 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. MDA-MB-435/LCC6 이종이식편 종양을 보유한 마우스에게 유리 GMC-5-193, TfRscFv/LipA/GMC-5-193, TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 또는 LipA/GMC-5-193 (리간드가 결합되지 않은 복합체)를 마우스 당 9 mg/kg GMC-5-193을 정맥내 주사하였다. 이는 2.8:7 (소분자 대 리포좀)의 몰비이다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 주사 3시간 후, 간, 폐 및 임의의 다른 가시적인 종양을 절제하고, 형광 현미경 (Nikon SMZ-1500 EPI-형광 입체영상 시스템) 하에 검사하였다.
생체내 효능 연구
PBS에 현탁시킨 마우스 흑색종 세포 B16/F10 (1x105)를 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. B16/F10 종양을 보유한 마우스에게 유리 GMC-5-193 단독, 또는 TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 적절한 경우 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193) 단독 또는 CDDP와 조합한 복합체를 3 mg/kg의 GMC-5-193/주사의 용량으로 매주 2회 내지 3회로 총 7회 주사로 정맥내 주사하였다. 각각의 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA 또는 LipA-HoKC의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 또한, 특정 군에는 CDDP만을 1주 2회로 총 6회 주사하였다. 처음 2회 CDDP 주사는 2.5 mg/kg이었다. 모든 후속 주사는 2 mg/kg이었다. 처리 3주 후에, 마우스를 희생시키고, 폐를 절제하고, 각각의 마우스로부터 혈액을 취하였다. 장기를 10％ 포름알데히드에 고정시키고, 사진을 찍기 전에 70％ 에탄올 내에 보존하였다.
마우스 혈청으로부터 절단된 카스파제-3의 웨스턴 블롯 분석
마우스의 후안구동으로부터 취한 혈액을 실온에서 1 hr 동안 응고시킨 후 1,000 rpm에서 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 혈청을 새로운 시험관에 옮기고, 다시 10,000 g에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액 혈청을 P-30 Micro-Bio-Spin 크로마토그래피 칼럼 (바이오라드 (BIORAD, 미국 캘리포니아주 허큘레스))을 사용하여 정제하였다. 15 ㎕의 분획을 4％ 내지 12％ 구배 NuPAGE 겔 (인비트로겐 라이프 테크놀로지스 (Invitrogen Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼스바드)) 상에 로딩하고, 10 kDa 단백질 마커가 겔로부터 흘러나올 때까지 (약 1.5 내지 2시간) 진행시켰다. 전기영동 후에, 단백질을 Protran BA 85 니트로셀룰로스 전달 막 (쉴라이처 앤 슈엘 (Schleicher and Schuell), 미국 뉴햄프셔주) 상으로 옮겼다. 마지막으로, 절단된 카스파제-3에 대한 웨스턴 블롯 분석을 절단된 카스파제-3 (17 kD) 항체를 사용하여 수행하였다. 비특이적인 결합을 차단하기 위해, 막을 실온에서 1시간 동안 150 mM NaCl 및 0.05％ Tween 20 (TBST)을 함유하는 10 mM Tris-HCl 버퍼, pH 8.0 중에서 5％ 탈지 분유와 함께 인큐베이팅하였다. 블롯을 5％ 우유 TBST 중의 절단된 카스파제-3 토끼 일차 항체 (셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology, 미국 매사추세츠주 베벌리))로 1:1000 희석에서 4℃에서 밤새 프로빙한 후, TBST로 3회 (각각 15분) 세척하였다. 단백질은 염소 항토끼 2차 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보래토리스 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 미국 펜실배니아주 웨스트 그로브)), ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약, 및 Hyperfilm ECL (아머샴)을 사용하여 검출하였다.
결과
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체의 몰비의 시험관내 최적화
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체를 상기 상세히 설명된 바와 같이 제조하고, TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체의 소분자 대 리포좀의 몰비를 최적화하였다. DU145 인간 전립선암 세포에 대한 상이한 비의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC에서 복합체화된 GMC-5-193의 세포독성 효과를 검사하였다. 5.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체 또는 유리 GMC-5-193으로 처리하였다. 세포독성을 평가하기 위해 처리 48시간 후에 XTT 분석을 수행하고, 농도-세포 생존력 곡선으로부터 IC50 값 (50％ 성장 억제를 일으키는 약물 농도)을 계산하였다. 도 13은 각각의 복합체로 처리한 DU145 세포의 IC50 값을 보여준다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 2:7~7:7의 GMC-5-193 대 리포좀의 몰비 범위에서, 유리 GMC-5-193으로 처리한 세포에 비해 복합체화된 GMC-5-193으로 처리한 세포에서 IC50 값의 감소가 관찰되었고, IC50 값은 7.7±0.9 μM에서 2.2±5 μM로 감소하였다. 8:7의 GMC-5-193 대 리포좀의 몰비에서, 복합체화된 또는 유리 GMC-5-193으로 형질감염된 세포의 IC50 값은 유사하였다. 2:7 ~ 7:7의 GMC-5-193 대 리포좀의 몰비의 범위에서 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 DU145 세포의 IC50 값에서 유의한 차이가 없으므로, 7:7의 GMC-5-193 대 리포좀의 몰비의 GMC-5-193 복합체를 추가의 실험을 위해 선택하였다. 7:7 (1:1과 동등함)의 GMC-5-193 대 리포좀의 몰비에서 복합체화된 GMC-5-193의 입자 크기는 5％ 덱스트로스 중에서 약 300 nm이었다.
상이한 세포주에서 세포 치사 (감수성)에 대한 유리 또는 복합체화된 GMC-5-193의 효과
도 14는 상이한 세포주 (DU145, MDA-MB-435, MDA435/LCC6, B16/F10)에서 복합체화된 GMC-5-193 및 유리 GMC-5-193의 세포 치사 수준의 비교를 보여준다. 여기서, 4 ~ 5.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체, 유리 GMC-5-193로 처리하였다. GMC-5-193의 농도는 50 nM ~ 31.25 μM이었다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 세포독성을 평가하기 위해 처리 48시간 후에 XTT 분석을 수행하고, IC50 값을 계산하였다. TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193으로 처리한 DU145, MDA435/LCC6 및 B16/F10 세포의 IC50 값은 유리 GMC-5-193으로 처리한 것보다 더 낮았고, 이는 상기 분자에 대한 증가된 감수성을 나타낸다. MDA-MB-435는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체 또는 유리 GMC-5-193에 대해 유사한 감수성을 보였다. 유리 및 복합체화된 GMC-5-193 사이에서 감수성의 최대 차이는 DU145 세포 (IC50 값이 유리 형태로 처리한 경우의 7.9 μM에서 복합체로 처리한 경우의 3.2 μM로 감소함) 및 B16/F10 세포 (IC50 값이 6.6±0.8 μM에서 4.2± 0.0 μM 범위로 감소함)에서 보였다.
하기 표 III은 유리 GMC-5-193 및 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체를 비교하여 수행한 유사한 실험의 결과를 보여준다.
XTT 생존력 분석으로 얻은 IC50 값 (μM)*
세포주 유리 GMC-5-193 TfRscFv/LipA/GMC-5-193
DU145 11.3±0.6 3.9±0.5
MDA-MB-435 4.0±0.5 2.5±0.1
B16/F10 >31 5.7±0.4
*3회 연속 측정의 평균±S.D.
따라서, GMC-5-193을 본 발명의 TfRScFv/LipA-HoKC로 복합체화하면 당업계에 현재 사용되는 것과 같은 유리 소분자에 대한 반응에 비해 소분자에 대한 다수 인간 및 마우스 세포주의 반응을 증가시킨다.
TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체에 의한 시험관내 화학감작
GMC-5-193은 미세관 파괴 및 항-혈관신생 효과를 갖는다. 통상의 화학요법의 항암 효과가 향상될 수 있는지 결정하기 위해 및 유리 소분자에 비해 복합체화된 소분자의 향상 수준을 비교하기 위해, 유리 및 리간드/리포좀 복합체화된 GMC-5-193과 통상의 화학요법제와의 조합 요법의 효과를 연구하였다. MDA-MB-435 인간 흑색종 세포를 독소루비신에 대해 감작시키는 리간드/리포좀/GMC-5-193 (TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193) 복합체의 능력을 검사하였고, 결과를 도 15A에 제시한다. 여기서, 4.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체, 유리 GMC-5-193 또는 LipA-HoKC 단독으로 처리하였다. GMC-5-193의 농도는 1.25 μM/웰이었다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 24시간 후에, 독소루비신을 2.07에서 약 2070 ng/mL로 증가하는 농도로 첨가하였다. 48시간 후에, 처리에 반응하는 세포 생존력을 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하였다. 도 15A에서 각 지점은 삼중 샘플의 평균±표준 편차를 나타낸다. IC50 값은 50％ 성장 억제를 일으키는 약물 농도를 나타낸다. UT = 형질감염되지 않음. 안트라사이클린 항생제 독소루비신이 가장 일반적인 화학요법제 중 하나이고, 유방암에 대해 미세관을 표적으로 하는 튜불린-중합화제와 조합 요법에 사용되었으므로 선택하였다. IC50 값을 계산하였다. GMC-5-193 없이 LipA-HoKC로 형질감염된 세포는 형질감염되지 않은 세포와 유사한 IC50을 보였고, 이는 리포좀 자체는 무독성이라는 것을 나타낸다. 유리 GMC-5-193으로 처리한 세포는 약간 감소된, 그러나 유의하게 상이하지 않은 IC50을 보였고, 이는 유리 GMC-5-193이 세포 성장을 효과적으로 억제하지 않는 것을 나타낸다. 그러나, 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포에 비해 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 세포에서 감작의 유의한 (약 50배) 증가가 관찰되었고, IC50 값은 300에서 8 ng/mL로 감소하였다.
독소루비신 단독, 독소루비신 + 유리 GMC-5-193 (GMC) 및 독소루비신 + TfRscFv/LipA/GMC-5-193 (scL-GMC) 복합체 (즉, HoKC 펩티드가 없는 양이온성 면역리포좀)의 효과를 검사하는 유사한 연구의 결과를 도 15B에 도시한다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 독소루비신 단독으로 처리된 세포 및 독소루비신 + 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포 모두에 비해, 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 세포에서 감작의 약 10배 증가가 관찰되었다.
시스플라틴 (CDDP)에 대한 B16/F10 세포 상의 감작화에 대한 증가하는 용량의 유리 형태 또는 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체로서 투여된 GMC-5-193의 효과의 연구를 수행하였고, 도 15C-E에 도시한다. GMC-5-193의 농도는 각각 1.25, 2 및 2.5 μM이었다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 도 15C에서, GMC-5-193의 농도는 1.25 μM/웰이고, XTT 분석에서는 9시간 동안 인큐베이팅하였다. 도 15D에서, GMC-5-193의 농도는 2 μM/웰이고, XTT 분석에서는 7시간 동안 인큐베이팅하였다. 도 15E에서, GMC-5-193의 농도는 2.5 μM/웰이고, XTT 분석에서는 9시간 동안 인큐베이팅하였다. 최저 용량의 GMC-5-193에서, 유리 및 복합체화된 GMC-5-193은 CDDP에 대한 반응을 향상시키지 않는다 (도 15C). 그러나, GMC-5-193의 용량을 2 μM 및 2.5 μM으로 증가시키면 감작도는 증가한다. 두 경우에, CDDP 단독 및 유리 GMC-5-193에 비해 복합체화된 소분자는 세포에 대해 증가된 효과를 가졌다. 상기 차이는 2 μM 용량에서 가장 현저하다. 따라서, 상기 치료 프로토콜 하에, 동일한 농도에서 GMC-5-193으로 처리된 세포에 비해 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 세포에서 감작의 증가가 관찰되었고, 이는 복합체를 사용하는 전달의 유리한 효과를 설명한다. 따라서, 복합체로 전달되는 GMC-5-193에서 감작이 용량-의존적으로 증가한다.
상기 일련의 실험은 또한 소분자를 전달하기 위해 TfRscFv/LipA-HoKC 또는 TfRscFv/LipA가 사용될 때 증가된 반응이 얻어짐을 입증한다.
본 발명의 복합체의 일부로서 포함될 때 소분자의 효과의 특이성을 정상 폐 섬유아세포 세포주 IMR-90을 사용하여 도 16A-C에 도시한다. B16/F10 및 MDA-MB-435를 사용하는 상기 감작 결과는 동일한 조건 하에 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90을 사용하는 결과와 크게 상이하였다. 4.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체, 유리 GMC-5-193 또는 LipA-HoKC 단독으로 처리하였다 (도 16A). GMC-5-193의 농도는 1.25 μM/웰이었다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 24시간 후에, 독소루비신을 2.07 ng/mL에서 약 2070 ng/mL로 증가하는 농도로 첨가하였다. 48시간 후에, 처리에 반응하는 세포 생존력을 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하였다. 각 지점은 삼중 샘플의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. IC50 값은 50％ 성장 억제를 일으키는 약물의 농도를 나타낸다. UT = 형질감염되지 않음. IMR-90 세포에서, LipA-HoKC 단독, 유리 GMC-5-193, 및 복합체화된 GMC-5-193의 감작 배수는 통계상 상이하지 않았고, 단독으로 투여되든지 TfRscFv/Lip-HoKC로 복합체화되어 투여되든지 정상 세포에 대한 GMC-5-193의 효과를 거의 또는 전혀 보이지 않았다. MDA-MB-435 세포에서 8 ng/mL과 비교하여 복합체화된 GMC-5-193을 사용한 IMR-90 IC50은 200 ng/mL이었으므로 이는 추가로 입증되었고, 이는 정상 및 종양 세포주 사이에 25배 차이를 나타낸다. 비교해보면, 유리 GMC-5-193으로 처리한 후, 2개의 세포주 사이의 IC50 값 차이는 단지 1.1배이었다. 따라서, GMC-5-193은 유리 GMC-5-193으로 투여될 때보다 TfRscFv/LipA-HoKC 복합체의 성분으로서 전달될 때 종양 세포에 대해 특히 더 효과적이다.
독소루비신에 대한 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90의 감작에 대한 GMC-5-193의 TfRscFV/LipA (HoKC 없는) 전달의 효과를 검사하는 유사한 실험의 결과를 도 16B에 나타낸다. 다시, 복합체를 사용하는 소분자의 투여는 정상 세포를 화학요법제에 감작시키지 않았다.
유사하게, IMR-90 및 상이한 화학요법제를 사용하는 연구에서, 미톡산트론에 대한 감작에 대한 GMC-5-193의 종양 표적화 리포좀 전달 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193)의 효과를 검사하였다 (도 16C). 여기서, 또한 소분자를 복합체화하면 미톡산트론에 대한 정상 세포의 반응에 영향을 미치지 않았다.
탁소테레에 대한 다른 인간 종양 세포주인 DU145 인간 전립선암 세포의 감작에 대한 복합체의 효과를 또한 검사하였다 (도 17A). 4.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체로 처리하였다. GMC-5-193의 농도는 1.25 μM/웰이었다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 24시간 후에, 탁소테레를 0.08 nM에서 약 82.7 nM로 증가하는 농도로 첨가하였다. 48시간 후에, 처리에 반응하는 세포 생존력을 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하였다. 각 지점은 삼중 샘플의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. IC50 값은 50％ 성장 억제를 일으키는 약물의 농도를 나타낸다. UT = 형질감염되지 않음. 탁소테레는 고수준의 임상 활성을 발휘하는 것으로 입증된 미세관을 표적으로 하는 튜불린-중합화제이다. 상기 약물은 전립선암에 대한 조합 요법으로 사용되는 제1선 화학요법제 중 하나이므로 선택되었다. LipA-HoKC 단독, 유리 GMC-5-193, 및 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193으로 처리한 후 탁소테레에 대한 DU145 세포의 감작 배수는 각각 1.1, 1.2, 및 47.1이었고, 이는 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 세포에서 탁소테레에 대한 반응 수준이 매우 향상되었음을 나타낸다.
DU145 인간 전립선암 세포에서 유리 GMC-5-193, LipA 단독 및 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체에 의한 미톡산트론에 대한 감작도를 비교하는 상이한 화학요법제를 사용하는 유사한 연구의 결과를 도 17B에 도시한다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 미톡산트론 단독으로 처리한 세포에 비해 복합체화된 GMC-5-193으로 처리한 세포에서 감작의 약 3배 증가가 관찰된 반면, 유리 GMC-5-193에서는 단지 1.7배 증가가 보였다. 복합체를 사용할 때 감작 배수는 2배이다.
MDA-MB-435 인간 흑색종 세포에서 유리 GMC-5-193 (GMC), LipA 단독 및 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체에 의한 탁소테레에 대한 감작도를 비교하는 추가 연구의 결과를 도 17C에 도시한다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 탁소테레 단독으로 처리한 세포에 비해 복합체화된 GMC-5-193로 처리된 세포에서 감작의 약 10배 증가가 관찰되었고, 유리 GMC-5-193에 비해서는 2배이었다.
이어서, 마우스 동계 폐 전이 모델에서 복합체화된 GMC-5-193 및 CDDP를 사용한 치료의 효과의 비교를 검사하였다. 도 18은 유리 GMC-5-193에 비해 CDDP에 대한 B16/F10 세포의 감작에 대한 복합체의 효과를 보여준다. 3.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 LipA-HoKC 단독, 유리 GMC-5-193 및 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체로 형질감염시켰다. GMC-5-193의 농도는 2 μM/웰이었다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 24시간 후에, CDDP를 0.4 μM ~ 200 μM의 증가하는 농도로 첨가하였다. CDDP에 대한 감작도를 평가하기 위해 CDDP 처리 48시간 후에 XTT 분석을 수행하였다. 각각의 지점은 삼중 샘플의 평균 ± 표준 편차이다. IC50 값은 50％ 성장 억제를 일으키는 약물 농도이다. UT = 형질감염되지 않음. 유리 GMC-5-193에 비해 복합체화된 GMC-5-193에 의한 감작의 증가가 관찰되었고, IC50 값은 42에서 20 μM으로 감소하였다. 복합체의 감작 배수는 2.6이었고, 다시 한번 유리 GMC-5-193의 2배이었다. 따라서, 상기 모든 시험관내 실험으로부터의 결과는 표적화된 리포좀, 즉, TfRscFv/LipA 및 TfRScFv/LipA-HoKC5 모두와 복합체화된 GMC-5-193이 당업계에 현재 사용되는 유리 GMC-5-193으로서 전달될 때보다 통상의 화학요법제에 대해 암 세포를 보다 효과적으로 감작시킨다는 관찰을 지지한다.
시험관내 공초점 영상화
공초점 영상화를 사용하여, GMC-5-193의 고유 형광을 이용하여 유리 GMC-5-193으로서 전달될 때 및 표적화된 리포좀 (HoKC 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는)과 복합체화될 때 GMC-5-193의 내재화를 비교하였다. MDA-MB-435 세포를 6시간 동안 유리 GMC-5-193 또는 복합체화된 GMC-5-193에 노출시킨 후, PBS로 세척하고, PBS 중 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고 공초점 현미경으로 가시화하였다. 도 19A는 유리 GMC-5-193의 흡수와 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체에 의해 세포에 전달된 것 사이의 비교를 보여주고; 도 19B는 유리 GMC-5-193의 흡수와 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 (scLHK-GMC) 복합체에 의해 세포에 전달된 것 사이의 비교를 보여준다. 5 x 104 세포/웰을 24-웰 플레이트 내에 유리 슬라이드 상에 접종하고, 24시간 후에 TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 또는 유리 GMC-5-193으로 처리하였다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA 또는 LipA-HoKC의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 처리 6시간 후에, 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세척하고, PBS 중 4％ 파라포름알데히드로 고정시키고, 유리 슬라이드 상에 탑재하였다. 올림푸스 플루오뷰(등록상표)-300 레이저 스캐닝 공초점 시스템을 사용하여 형광을 가시화하였다. 유리 GMC-5-193로 처리된 세포에 비해, 소분자 GMC-5-193이 본 발명의 TfRScFv/LipA 또는 TfRScFv/LipA-HoKC 복합체와 복합체화될 때 세포에 의한 유의하게 증가된 형광 흡수가 관찰되었다.
GMC-5-193 형광 분포 패턴은 복합체화된 GMC-5-193으로 처리한 세포에서 세포질 및 핵 내를 포함하여 세포 전체에서 관찰되었다. DIC 영상은 GMC-5-193 복합체로 처리된 세포의 형태학이 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포와 상이함을 밝혔다. 전자는 비교적 둥근 세포를 보여주고, 후자는 처리되지 않은 세포에서 관찰된 것과 유사하게 길고 보다 퍼져있는 세포를 보여주었다. 상기 결과는 TfRscFv/LopA 또는 TfRScFv/LipA-HoKC으로 복합체화한 후, GMC-5-193이 암 세포에 의해 보다 효율적으로 흡수될 수 있음을 나타내고, 의도된 세포 치사의 증거가 보다 크다. 추가의 조사를 위해, 핵을 핵 특이적 염료 DAPI (청색 형광)으로 염색하고, 영상을 분석하였다. 사진을 찍은 세포의 3차원 애니메이션으로부터, GMC-5-193 복합체 중 하나로 처리된 세포에서 GMC-5-193 녹색 형광이 세포 전체에 동일하게 분포된 반면, 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포에서 녹색 형광은 세포질보다 핵에서 더 많이 관찰되었음이 명백하였다.
GMC-5-193을 보유하는 리간드/리포좀 복합체에 의한 생체내 종양 표적화
종양을 보유하는 동물을 생성하기 위해, PBS 중에 현탁시킨 MDA435/LCC6 인간 흑색종 세포 (8 x 106)를 무흉선 누드 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다.
TfRscFv/LipA/GMC-5-193의 사용:
주로 폐 내에 MDA435/LCC6 이종이식편 종양을 보유하는 마우스에게 유리 GMC-5-193, 비-표적화된 LipA/GMC-5-193 (L-GMC) 또는 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 (scL-GMC)를 9 mg GMC-5-193/kg/마우스로 정맥내 주사하였다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA의 몰비는 1:2.5 (2.8:7과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 주사 3시간 후에, 간 및 폐를 절제하고, 형광 현미경 하에 검사하였다. 전이는 미시적인 내지 작은 가시적인 전이로 크기가 다양하였다. 도 20A는 명시야로 및 형광으로 사진을 찍은 동일한 시야를 보여준다. TfRscFv/LipA-GMC-5-193 복합체가 폐에서 종양 세포로 GMC-5-193을 특이적으로 전달할 수 있음을 분명히 볼 수 있다. 유리 GMC-5-193으로 처리된 마우스의 명시야 영상에서, 폐 주위에 큰 종양을 관찰할 수 있었고, 간으로 전이가 있었다. 그러나, 형광 영상은 모든 조직에서 매우 약한 형광을 보여준다. 표적화되지 않은 복합체 (LipA/GMC-5-193 (L-GMC))는 폐 및 간 모두에서 매우 약한 신호를 보였고, 종양 특이성은 없었다. 이와 반대로, TfRscFv/LipA/GMC-5-193 복합체 (scL-GMC)를 주사한 마우스에서, GMC-5-193의 형광 신호는 폐 전이에서 훨신 더 강하였다 (명시야 영상에서 정상 폐 조직의 보다 밝은 기포성 외관에 비해 보다 치밀한 외관으로 구분가능함). 또한, 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 마우스의 정상 간에서 매우 낮은 배경 신호가 관찰되었고, 이는 다시 종양 특이성을 입증한다. 상기 결과는 GMC-5-193이 TfRscFv/LipA 복합체 내로 포함될 때 전신 투여 후 GMC-5-193의 종양 특이적 흡수가 향상됨을 보여준다.
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193의 사용
주로 폐에서 MDA-MB-435/LCC6 이종이식편 종양을 보유하는 마우스에게 유리 GMC-5-193 (도 20B (패널 B)) 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 (도 20B (패널 A))을 9 mg GMC-5-193/kg/마우스로 정맥내 주사하였다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비는 1:2.5 (2.8:7과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 주사 3시간 후에, 간 및 폐를 절제하고, 형광 현미경 하에 검사하였다. 전이는 미시적인 내지 작은 가시적인 전이로 크기가 다양하였다. 동일한 시야를 명시야로 및 형광으로 사진을 찍었다. 리간드-리포좀 복합체가 폐에서 종양 세포로 GMC-5-193을 특이적으로 전달할 수 있음 (도 20B (좌측 패널))을 분명히 볼 수 있다. 유리 GMC-5-193으로 처리된 마우스의 명시야 영상에서 (도 20B (우측 패널)), 폐 주위에 큰 종양을 관찰할 수 있었고, 간으로 전이가 있었다. 그러나, 모든 조직에서 형광이 매우 약하였고, 간에서 전이에서 형광이 없었다. 상기 결과는 GMC-5-193이 TfRscFv/LipA-HoKC 복합체 내로 포함될 때 전신 투여 후 GMC-5-193의 종양 특이적 흡수가 향상됨을 보여준다.
TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체를 사용하여 전달된 형광 GMC-5-193의 종양-특이적 도입을 보여주는 추가의 결과를 도 20C에 도시한다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA-HoKC의 몰비는 1:2.5 (2.8:7과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 여기서, 또한 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193을 정맥내 투여한 마우스와 정맥내 유리 GMC-5-193을 투여한 마우스에서 신호 사이에 차이는 매우 컸다. 유리 GMC-5-193을 투여한 마우스에서 간 내에 및 척추 근처에 큰 종양이 존재하였다. 그러나, 상기 종양에서 매우 적은 형광이 명백하였다. 이와 반대로, 복합체화된 GMC-5-193을 투여한 마우스로부터 폐 전이 및 별도의 종양에서 형광 신호가 훨씬 더 강하였다. 상기 실험에서는 본 발명의 리간드/리포좀 (HoKC 펩티드가 존재하거나 존재하지 않는) 복합체와 복합체화될 때 전신 투여된 GMC-5-193의 효율적인 종양 표적화 및 전달을 분명히 증명한다.
생체내 효능 연구
B16/F10 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스에게 CDDP 또는 TiRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193)를 단독으로 또는 CDDP와 조합하여 투여하였다. 복합체 내의 GMC-5-193 대 LipA 또는 LipA-HoKC의 몰비는 1:1이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 도 21A-21C는 처리 3주 후에 각각의 마우스의 폐의 사진을 보여준다. B16/F10의 다수의 전이가 처리를 하지 않은 (UT) 마우스의 폐에서 관찰되었다. 도 21A에서, 마우스에게 GMC-5-193을 3 mg GMC-5-193/kg/주사로 매주 2 또는 3회로 7회 정맥내 주사하였다. 상기 결과는 복합체화된 GMC-5-193 (HoKC 펩티드가 존재하거나 존재하지 않음)이 단일제 치료로서 유리 GMC-5-193보다 더 우수함을 보여준다. 도 21B 및 21C에서, 마우스에게 또한 GMC-5-193을 3 mg GMC-5-193/kg/주사로 매주 2 또는 3회로 7회 정맥내 주사하였다. CDDP를 투여한 군에서, CDDP는 매주 2회로 총 6회 주사로 투여하였다. CDDP의 초기 용량은 2.5 mg/kg인 반면, 모든 후속 용량은 2.0 mg/kg이었다. TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193) 복합체 + CDDP의 조합으로 처리한 마우스는 폐 전이의 수에서 유의한 감소를 보여주었다 (도 21B). 도 21C에서, TfRscFv/LipA/GMC-5-193 (scL-GMC) 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 (scL-HK-GMC) 복합체 + 시스플라틴의 조합으로 처리한 마우스는 또한 단일제 치료 (복합체 또는 CDDP)에 비해 폐 전이의 수에서 유의한 감소를 보여주었다.
도 21B의 결과는 세포자멸의 마커로서 절단된 카스파제-3에 대한 웨스턴 블롯 분석과 상호관련된다 (도 22). 처리하지 않은 마우스, 또는 TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 (HoKC가 존재하거나 존재하지 않음) 단독으로 처리한 마우스의 혈청에서, 절단된 카스파제-3은 검출되지 않았고, 세포자멸을 보이지 않고, 따라서 소분자 치료제의 유의한 효과가 없었다. 절단된 카스파제-3은 CDDP 단독으로 투여한 마우스의 혈청에서 단지 약한 밴드로서 검출되었다. 가장 유의하게, 복합체화된 GMC-5-193 (TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193) + CDDP의 조합으로 처리한 마우스는 높은 수준의 절단된 카스파제-3을 보였고, 이는 조합 치료에 의한 프로그래밍된 세포 사멸의 향상을 나타낸다.
논의
DU145 세포, B16/F10 세포, 및 더 적은 정도로 MDA435/LCC6 세포는 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포에 비해 TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193 복합체에 대한 향상된 감수성을 보여주었다 (도 14). GMC-5-193을 복합체화하면 또한 다양한 화학요법제에 대한 다수의 종양 세포주 (인간 및 마우스)의 감작을 증가시켰다. 공초점 영상에서는 GMC-5-193이 유리 GMC-5-193보다 복합체화된 GMC-5-193으로서 MDA-MB-435 세포에 의해 보다 효율적으로 흡수됨을 밝혔다 (도 19A 및 19B). 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포에 비해 GMC-5-193 복합체로 처리된 세포에서 훨씬 더 강한 녹색 형광이 관찰되었다. 흥미롭게도, GMC-5-193 녹색 형광은 GMC-5-193 복합체로 처리된 세포에서 세포 전체에서 동일하게 관찰된 반면, 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포에서, 녹색 형광은 세포질보다 핵에서 더 많이 관찰되었다. GMC-5-193을 리간드가 결합된 리포좀 복합체에 포함시키면 세포성 흡수를 상승시키고, 세포 내에 GMC-193의 국소 패턴을 변경시켰다.
GMC-5-193은 세포질 내에서 튜불린에 결합함으로써 항암 효과를 보여주고; 따라서 세포질 내의 소분자의 존재는 항암 효과를 예상하기 위해 바람직하다. 또한, 세포질 내로 약물 방출 이후 세포외 컴파트먼트 내로 후속 방출이 일어나고, 이는 방관자 효과를 유발할 수 있다. 상기 이유 때문에, 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 세포에서 향상된 항암 활성이 검사되었다.
독소루비신에 대한 인간 흑색종 세포 MDA-MB435의 시험관내 화학감작의 결과로서, 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포에 비해 복합체화된 GMC-5-193으로 처리된 세포에서 감작의 유의한 증가가 관찰되었다 (도 15A-15B). 상기 감작 결과는 동일한 조건 하에 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90의 결과와 크게 상이하였고, 여기서 GMC-5-13은 유리 형태이거나 복합체화되거나 실질적으로 효과가 없었다 (도 16A-16B). 유리 GMC-5-193으로 처리된 세포와 비교하여 세포를 복합체화된 GMC-5-193으로 처리될 때, 암 세포에서 IC50 값 사이에 증가된 배수 차이가 관찰되었다. 상기 발견은 TfRscFv는 세포독성을 증가시키도록 복합체를 암 세포에 표적화하고 효율적으로 전달하지만, 정상 세포에는 그렇지 않고, 이는 복합체화된 GMC-5-193을 사용하는 조합 요법이 치료 지수를 증가시킬 수 있음을 입증한다. 탁소테레에 대한 DU145 인간 전립선암 세포의 유사한 화학감작이 관찰되었다 (도 17A-17B). CDDP에 대한 B16/F10 전이성 마우스 흑색종 세포의 감작 배수는 세포를 복합체로 처리할 때 또한 2.6배 더 높았다 (도 18).
시험관내 실험으로부터의 모든 결과는 표적화된 리포좀과 복합체화된 GMC-5-193이 유리 GMC-5-193으로서 전달될 때보다 통상의 화학요법제에 대해 암 세포를 보다 효과적으로 감작시킨다는 관찰을 지지한다.
본 연구에서 한가지 관심사는 전신 투여 후 GMC-5-193의 종양을 표적으로 하는 전달이다. TfRscFv/LipA/GMC-5-193 또는 TfRscFv/LipA-HoKC/GMC-5-193을 주로 폐에 MDA-MB-435/LCC6 이종이식편 종양을 보유하는 무흉선 누드 마우스에 정맥내 투여할 때, 리간드-리포좀 복합체가 GMC-5-193을 폐 내의 종양 세포에 특이적으로 전달하는 것을 분명히 볼 수 있다 (도 20A-20C). 폐 전이에서 GMC-5-193의 녹색 형광 신호가 유리 GMC-5-193으로 처리한 마우스에서보다 상기 마우스에서 훨씬 더 강하였다. 전신 투여 후 GMC-5-193의 종양-특이적 흡수는 소분자가 성분들의 간단한 혼합에 의해 제조된 본 발명의 리간드가 결합된 리포좀 복합체 내로 포함될 때 향상된다. 상기 결과로부터, 본 발명의 TfRScFv/LipA 또는 TfRScFV/LipA-HoKC 복합체 내에 소분자를 포함시키면 원발성 종양이든 전이이든 종양 세포 내로 특이적으로 소분자의 흡수를 향상시킨다.
상기 종양을 표적으로 하는 능력은 생체내 효능 연구에서 반영되었다. B16/F10 세포는 상기 설명한 바와 같이 복합체화된 GMC-5-193으로 처리할 때 향상된 감수성을 보였다. 따라서, B16/F10 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스를 효능 연구에 대한 동물 모델로서 선택하였다. 상기 나타낸 바와 같이, TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 (HoKC 펩티드가 존재하거나 존재하지 않음) + CDDP의 조합으로 처리한 마우스는 CDDP 또는 TfRscFv/리포좀/GMC-5-193 복합체 단독으로 처리한 마우스와 비교하여 그들의 폐에서 전이의 유의한 감소를 보이고, 절단된 카스파제-3의 수준을 상승시켰다.
세포자멸에 관여하는 카스파제는 2개의 군으로 분류된다: 개시인자 카스파제 (카스파제-2, -8, -9 및 -10 포함), 및 효과인자 카스파제 (카스파제-3, -6 및 -7 포함). 개시인자 카스파제에 의한 효과인자 카스파제의 활성화가 액틴, 리민, 폴리(ADP-리보스) 중합효소 (PARP), 및 데옥시리보뉴클레아제의 억제제 (예를 들어 DFF45 또는 ICAD)를 포함한 세포 기질의 단백분해 절단을 담당한다. 상기 기질의 절단은 세포자멸 동안 염색체를 뉴클레오좀 단편으로 분해시킨다. 카스파제-3은 프로테아제 캐스케이드 경로에서 그의 위치 때문에 세포자멸과 가장 직접적으로 상관되는 것으로 간주되었다. 카스파제-3은 32-kD 전구체로서 합성되고, 절단되어 중간체 20-kD 및 12-kD 하위단위를 통해 17-kD 하위단위로 이루어진 성숙형을 생성한다 (34-36). 상승된 수준의 17-kD의 절단된 카스파제-3은 프로그래밍된 세포 사멸의 마커로 간주된다.
따라서, 항암 소분자 GMC-5-193의 특이적이고 효율적인 표적화된 약물 전달을 달성하였다. 상기 결과는 TfRscFv가 시험관 내에서 및 생체 내에서 양이온성 리포좀-GMC-5-193 복합체 (HoKC가 존재하거나 존재하지 않음)를 종양 세포에 표적화시키고, 시험관 내에서 및 생체 내에서 통상의 화학요법제의 항종양 효과를 향상시키는 것을 보여준다. 특히, 통상의 화학요법제의 유효 용량을 낮추는 것이 그들의 독성 효과를 동반하여 감소시키는 것과 함께 입증되었다.
실시예 11
간단한 혼합에 의해 면역리포좀을 포함하는 소분자 (YK-3-250)의 제조 및 특성화
소분자 YK-3-250 (미세관 파괴 화합물)의 시험관내 및 생체내 항암 효과를 개선시키기 위해서, 소분자를 포함하는 종양을 표적으로 하는 리포좀 복합체를 제조하였다. TfRscFv/LipA 복합체에 추가로, 엔도좀 붕괴 펩티드 (LipA-HoKC)와 접합된 양이온성 리포좀도 제조하여 본원에 기재된 바와 같이 연구할 수 있다. 엔도좀 붕괴 펩티드 HoKC는 세포질에서 튜불린 중합을 실시하기 위해 YK-3-250의 세포의 세포질 내 방출을 도울 수 있다. 리간드-리포좀 복합체는 그의 표면 상의 상응하는 수용체의 상승한 수준 때문에 종양 세포를 우선적으로 표적으로 정한다. 리간드-리포좀에 의해 전달된 유전자의 높은 수준의 발현은 원발성 종양 및 전이에서 분명하게 나타났지만, 정상 조직, 예를 들어 간, 폐, 골수, 및 장선에서는 보이지 않았다. 본 실시예에서, YK-3-250을 포함하는 리포플렉스의 시험관내 생체 효능을 평가하기 위해 시험관 내에서 YK-3-250을 암 세포에 전달하기 위해 트랜스페린 수용체 단일쇄 (TfRscFv)를 포함하는 본 발명의 리포좀 복합체를 사용하였다.
물질 및 방법
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 및 N-말레이미도-페닐부티레이트 DOPE (MPB-DOPE)는 아반티 폴라 리피즈에서 구입하였다. K[K(H)KKK]5-K(H)KKC (HoKC) (서열 2) 펩티드는 시그마-제노시스 제품이었다.
세포주 및 배양액
인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435를 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 개선된 MEM (IMEM) 내에서 배양하였다. EMEM은 미디어테크로부터 구입하였고, 다른 세포 배양 배지 및 성분은 바이오플루이즈로부터 입수하였다.
TfRscFv/LipA/YK-3-250 복합체의 제조
양이온성 리포좀 제제 LipA (DOTAP:DOPE 또는 DDAB:DOPE, 1:1 내지 1:2 몰비)를 본원에 설명된 바와 같이 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. 농도는 2 mM이다. TfRscFv/LipA/YK-3-250 복합체를 다음과 같이 제조하였다: LipA와 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 wt/wt)을 적합하게는 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, YK-3-250를 적절한 농도에서 첨가하고, 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안, 바람직하게는 실온에서 인큐베이팅하였다. YK-3-250 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 2:7 내지 8:7, 가장 적합하게는 7:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
TfRscFv/LipA-HoKC/YK-3-250 복합체의 제조
양이온성 리포좀 제제 및 LipA-MPB (DOTAP:DOPE:MPB-DOPE 또는 DDAB:DOPE:MPB-DOPE, 1:1:0.1 내지 1:2:0.1 몰비)를 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. 이어서, LipA-HoKC 리포좀을 본원에서 앞서 설명된 바와 같이 말레이미드기를 운반하는 양이온성 리포좀과 펩티드가 운반하는 말단 시스테인기 사이의 커플링 반응을 이용하여 제조하였다. 시스테인 상에 유리 티올기가 존재하는 0.1 mmol의 펩티드 분취액을 10 mM HEPES (pH 7.4) 용액 중 2 mmol의 LipA-MPB에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 생성되는 LipA-HoKC의 지질 농도는 1.4 mM이었다. TfRscFv/LipA-HoKC/YK-3-250 복합체는 다음과 같이 제조하였다: LipA-HoKC 및 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA-HoKC의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 (wt/wt))을 바람직하게는 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, YK-3-250을 적절한 농도에서 첨가하고, 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 동물 주사를 위해, 덱스트로스 또는 수크로스를 각각의 샘플에 1％ 내지 20％, 보다 적합하게는 5-10％의 최종 농도로 첨가하였다. YK-3-250 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 2:7 내지 8:7, 가장 적합하게는 7:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
시험관내 세포 생존력 및 TfRscFv/리포좀/YK-3-250 복합체의 최적화
시험관내 세포독성 연구를 위해, 100 ㎕의 적절한 성장 배지 중 5 내지 5.5 x 103 세포/웰의 각각의 세포주를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 무혈청 배지 중 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/YK-3-250, LipA 단독 또는 유리 YK-3-250을 증가하는 농도로 덮고, 4-6시간, 바람직하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 보충하였다. 이어서, 세포를 추가의 24-72시간, 바람직하게는 48시간 동안 37℃에서 5％ CO2를 함유하는 가습 대기 중에서 인큐베이팅하였다. 그 후에, 웰을 페놀 레드 없이 IMEM으로 세척하고, 세포-생존력 XTT-기반 분석을 제조사의 프로토콜 (뵈링거 만하임)에 따라 수행하였다. 전자-커플링 시약의 존재 하에, XTT (나트륨 3'-[1-(페닐아미노-카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠 술포네이트)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에서 데히드로게나제에 의해 주황색 포르마잔으로 전환된다. 포르마잔 흡광도 (이는 살아있는 세포의 수에 상호관련된다)를 450 nm에서 미세판 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 측정하였다. 50％ 성장 억제를 일으키는 IC50을 약물 농도의 로그 대 생존 세포 분획의 그래프로부터 내삽하였다.
결과
TfRscFv/LipA/YK-3-250 복합체의 몰비의 시험관내 최적화
TfRscFv/LipA/YK-3-250 복합체를 제조하고, TfRscFv/LipA/YK-3-250 복합체의 소분자 대 리포좀의 몰비를 최적화하였다. 상이한 비의 YK-3-250 대 LipA에서 복합체화된 및 유리 YK-3-250의 MDA-MB-435 암 세포에 대한 세포 치사 효과를 비교하였다. TfRscFv 대 LipA의 비율은 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 (wt/wt)이었다. 5.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후 TfRscFv/LipA/YK-3-250 복합체, LipA 단독 또는 유리 YK-3-250으로 처리하였다. 세포독성을 평가하기 위해 처리 48시간 후에 XTT 분석을 수행하고, 농도-세포 생존력 곡선으로부터 IC50 값 (50％ 성장 억제를 일으키는 약물 농도)을 계산하였다. 도 23A는 각각의 처리에 대한 MDA-MB-435의 IC50 값을 보여준다. 6:7-8:7의 YK-3-250 대 리포좀의 몰비 범위에서, 유리 YK-3-250, 또는 유리 LipA로 처리한 세포에 비해 복합체화된 YK-3-250으로 처리한 세포에서 IC50 값의 감소가 관찰되었고, IC50 값은 >300 nM로부터 16 nM로 감소하였고, 7:7의 YK-3-250 대 리포좀의 몰비에서 8 nM로 감소하였다.
도 23B는 7:7 (1:1과 동등함)의 YK-3-205 대 리포좀 복합체 (LipA) 몰비를 사용하여 MDA-MB-435 세포에 대한 유리 YK-3-250 및 TfRscFv/LipA/YK-3-250 (scL-YK-3-250) 복합체의 효과를 비교하여 보여준다. 복합체화된 YK-3-250의 세포 치사 수준은 유리 소분자에 비해 본 발명의 복합체를 사용할 때 약 2배의 효과 증가를 나타낸다.
실시예 12
간단한 혼합에 의해 소분자 (이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)))를
포함하는 면역리포좀의 제조 및 특성화
이전에 STI-571로 알려진 글리벡(등록상표) (이마티닙 메실레이트; 노바티스 파마슈티칼스 코퍼레이션 (Novartis Pharmaecuticals Corp., 미국 뉴저지주 이시트 하노버))은 항증식제 (신호 전달 억제제)로서, 종양 세포의 성장 및 증식 신호를 전달하는 경로를 방해한다. 이마티닙 메실레이트는 Bcr-Abl, c-KIT 및 PDGF 수용체 알파 및 베타를 포함하는 일군의 수용체 티로신 키나제를 선택적으로 억제하여, 세포 성장을 붕괴시키고 최종적으로 세포 사멸을 야기한다.
이마티닙 메실레이트는, 상기 질병에서 그 기능이 이상하고 세포가 성장하고 계속적으로 분열하도록 신호를 보내는 티로신 키나제 단백질인 Bcr-Abl의 활성 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌고, c-KIT 티로신 키나제의 활성에 의한 암의 비교적 드문 형태인 KIT (CD117) 양성의 절제불가능 및/또는 전이성 악성 위장관 간질 종양 (GIST)의 환자 치료를 위해 승인되었다.
단백질 키나제는 세포성 신호 전달 캐스케이드에서 중요한 기능을 수행하고, 따라서 암을 포함하는 많은 질병에 직접 관여하기 때문에, 키나제 억제제가 새로운 종류의 항암 치료제 개발을 위한 중심이 자리하고 있다. 현재 30개 초과의 다른 키나제 억제제가 임상 시험 중이다. 또한, 이마티닙 메실레이트는 많은 다른 암, 특히 PDGF 수용체 알파 및 베타를 포함하여 이마티닙 메실레이트에 의해 표적화되는 것으로 밝혀진 티로신 키나제의 이상 활성을 보이는 암의 치료에 이용될 수 있다. 초기 결과는 고무적이지만, 상기 약물은 그의 독성 부작용이 존재한다. 이마티닙 메실레이트의 경우, 상기 부작용은 조혈 억제, 간독성, 및 신장 독성 및 체액 잔류 (눈 또는 다리 주위의 부기), 설사, 영역, 구토, 피로, 근 경련, 근육통 또는 골 통증, 복통, 및 발진을 포함한다. 상기 부작용을 감소시키면 환자의 삶의 질을 유의하게 개선시킬 것이다. 그러나, 상기 독성의 감소가 중요하지만, 종양 세포 내의 치료제 농도의 증가가 치료 이익에 있어서 훨씬 더 중요하다. 여기서 설명되는 실험은 본 발명의 면역리포좀에 이마티닙 메실레이트의 봉입, 및 인간 유방, 전립선 및 췌장암 모델에서의 작용을 보여준다.
물질 및 방법
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 및 N-말레이미도-페닐부티레이트 DOPE (MPB-DOPE)는 아반티 폴라 리피즈에서 구입하였다.
세포주 및 배양액
인간 전립선암 세포주 DU145 (HTB-81) 및 마우스 흑색종 세포주 B16/F10 (CRL-6475)은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 입수하였다. DU145를 10％ 열 불활성화된 우태 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 얼스 염을 함유하는 이글 최소 필수 배지 (EMEM) 내에서 배양하였다. B16/F10 (ATCC, CRL-6475)을 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM) 내에서 배양하였다. 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435 및 인간 췌장암 세포주 PANC-1을 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 개선된 MEM (IMEM) 내에서 배양하였다. 정상 (비-암성) 피부 섬유아세포 세포주 H500을 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM 비필수 아미노산 + 10％ 열 불활성화된 우태 혈청, 2 mM L-글루타민 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 EMEM 내에서 배양하였다. EMEM은 미디어테크로부터 구입하였고, 다른 세포 배양 배지 및 성분은 바이오플루이즈로부터 입수하였다.
TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표)) 복합체의 제조
양이온성 리포좀 제제 LipA (DOTAP:DOPE 또는 DDAB:DOPE, 1:1 내지 1:2 몰비)를 본원에 설명된 바와 같이 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체를 다음과 같이 제조하였다. LipA와 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 wt/wt)을 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, 이마티닙 메실레이트를 적절한 농도에서 첨가하고, 실온에서 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안 인큐베이팅하였다. 동물 주사를 위해, 덱스트로스 또는 수크로스를 각각의 샘플에 1％ 내지 20％, 보다 적합하게는 5-10％의 최종 농도로 첨가하였다. 이마티닙 메실레이트 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 2:7 내지 8:7, 가장 적합하게는 7:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체를 사용한 시험관내 세포 생존력
시험관내 세포독성 연구를 위해, 100 ㎕의 적절한 성장 배지 중 2.5 내지 5.5 x 103 세포/웰의 각각의 세포주를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 무혈청 배지 중 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체 또는 유리 이마티닙 메실레이트를 증가하는 농도로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 보충하였다. 이어서, 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 37℃에서 5％ CO2를 함유하는 가습 대기 중에서 인큐베이팅하였다. 그 후에, 웰을 페놀 레드 없이 IMEM으로 세척하고, 세포-생존력 XTT-기반 분석을 제조사의 프로토콜 (뵈링거 만하임)에 따라 수행하였다. 전자-커플링 시약의 존재 하에, XTT (나트륨 3'-[1-(페닐아미노-카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠 술포네이트)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에서 데히드로게나제에 의해 주황색 포르마잔으로 전환된다. 포르마잔 흡광도 (이는 살아있는 세포의 수에 상호관련된다)를 450 nm에서 미세판 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 측정하였다. 50％ 성장 억제를 일으키는 IC50을 약물 농도의 로그 대 생존 세포 분획의 그래프로부터 내삽하였다.
시험관내 화학감작
화학감작 연구를 위해, 100 ㎕ 중 2.5~5.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체 또는 유리 이마티닙 메실레이트를 15 내지 30 μM 이마티닙 메실레이트의 농도로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 19시간 동안 인큐베이팅한 후, 화학요법제가 존재하거나 존재하지 않은 적절한 보충 배지를 증가하는 농도로 첨가하고, 약 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 계속 인큐베이팅하였다. 사용된 화학요법 약물은 독소루비신 (베드포드 랩스), 도세탁셀 (탁소테레; 아벤티스 파마슈티칼스), 미톡산트론 (노반트론(등록상표), 이뮤넥스 코퍼레이션), 시스플라틴 (CDDP; 베드포드 랩스), 겜시타빈 (겜자르(등록상표), 일라이 릴리 앤드 컴퍼니) 및 다카르바진 (DTIC) (메인 파마슈티칼스 (Mayne Pharmaceuticals, 미국 뉴저지구 파라무스))이었다. 화학요법제에 대한 감작도를 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하고, 각각의 세포의 IC50 값을 계산하였다. 감작 배수는 다음과 같다: IC50 (형질감염되지 않은)/IC50 (각각의 복합체).
생체내 효능 연구
PBS에 현탁된 마우스 흑색종 세포 B16/F10 (1x105)를 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. 4일 후, B16/F10 종양을 보유한 마우스에게 유리 이마티닙 메실레이트; CDDP 단독 또는 CDDP와 조합한 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트를 0.5 mg/kg의 이마티닙 메실레이트 용량으로 정맥내 주사하였다. 주사는 1주에 3회, 총 9회 주사하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 또한, 특정 군에는 CDDP만을 투여하였다. CDDP는 2 mg/kg으로 1주 2회, 총 6회 주사하였다. 처리 3주 후에, 마우스를 희생시키고, 폐를 절제하고, 장기를 10％ 포름알데히드에 고정시키고, 사진을 찍기 전에 70％ 에탄올 내에 보존하였다.
결과
봉입된 및 유리 이마티닙 메실레이트의 비교
세포 생존에 대한 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표))의 효과를 유리 이마티닙 메실레이트 (글리벡(등록상표))와 비교하여 인간 전립선암 세포주 (DU145) (도 24A) 및 인간 흑색종 세포주 (MDA-MB-435) (도 24B), 및 마우스 흑색종 세포주 (B16/F10) (도 24C) 모두에서 XTT 분석 (본원에서 설명된 바와 같은)을 통해 평가하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 이마티닙 메실레이트를 DMSO 또는 물에 용해시켰다. 도 24A에 도시된 바와 같이, DU145 세포를 리포좀 복합체에 의해 전달된 이마티닙 메실레이트로 처리하면 세포 치사가 DMSO 또는 물에 용해된 유리 이마티닙 메실레이트에 비해 5배를 초과하여 증가하였다.
유사하게, 인간 흑색종 세포에서 (도 24B), 리포좀 복합체를 통해 전달된 이마티닙 메실레이트는 '유리' 형태로 전달될 경우보다 세포 치사에 대해 유의하게 더 큰 효과를 보였다. TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트가 유리 소분자에 비해 3배 개선을 보였다. 그 결과는 글리벡이 물 또는 DMSO에 용해되었는지와 상관없이 동일하였다. 따라서, 후속 실험은 물에 용해된 글리벡을 이용하였다.
유리 또는 TfRScFv/LipA 복합체화된 이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡)의 효과를 B16/F10 마우스 흑색종 세포에서 비교할 때, 유리 글리벡에 비해 세포 치사의 3배 증가가 scL-글리벡에서 유사하게 관찰되었다 (도 24C).
TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡)에 의한 화학감작
종양 세포 (인간 및 마우스)를 1차 화학요법제에 대해 감작시키는, '유리' 형태로 또는 리포좀 복합체를 통해 전달된 이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡(등록상표))의 능력도 XTT 분석에 의해 평가하였다. 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435를 20 μM 또는 30 μM 유리 또는 복합체화된 이마티닙 메실레이트로 처리한 후, 증가하는 용량의 탁소테레를 첨가하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 몰비는 1:30 (w:w)이었다. 도 25A에 나타낸 바와 같이, 20 μM 이마티닙 메실레이트 농도에서, 이마티닙 메실레이트가 리포좀 복합체 (scL-글리벡(등록상표))에 의해 전달될 때 유리 이마티닙 메실레이트로서 투여된 경우에 비해 화학요법제에 대한 반응이 거의 50배 증가하였다. 상기 용량에서 유리 이마티닙 메실레이트는 세포를 탁소테레에 대해 감작시키지 못하였다. 또한, 화학감작의 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 30 μM 이마티닙 메실레이트에서, 유리 이마티닙 메실레이트는 약 4배의 감작을 보였지만, 리포좀 복합체 이마티닙 메실레이트를 사용한 반응은 IC50 값이 결정될 수 없을 정도로 크게 증가하였다 (도 25B).
유사하게, 인간 전립선 세포 (DU145)에서, 리포좀 복합체에 의해 전달된 이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡(등록상표))는 20 μM에서 유리 이마티닙 메실레이트에 비해 미톡산트론에 대한 세포의 반응을 약 4배 향상시켰다 (도 26A). 또한, TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체 (scL-글리벡(등록상표))를 사용하여 IC50 값을 결정할 수 없는 용량 반응이 30 μM에서 존재하였다 (도 26B). 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다.
또한, 이마티닙 메실레이트의 리포좀 복합체 전달 효과를 인간 췌장암 세포주 PANC-1에서 평가하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 다른 종양 세포에서 관찰된 바와 같이, 이마티닙 메실레이트가 본 발명의 리포좀 복합체 (scL-글리벡(등록상표))를 통해 전달될 때 용량 반응 및 화학요법제 겜자르(등록상표) (겜시타빈 HCl)에 대한 감수성 수준의 획기적인 증가가 존재하였다 (도 27A 및 B). 20 μM에서, 유리 이마티닙 메실레이트에 비해 리포좀 복합체 이마티닙 메실레이트를 사용할 때 겜시타빈에 대한 PANC-1의 반응이 100배 증가하였다 (도 27A). 상기 경우와 같이, 30 μM에서 IC50 값을 결정할 수 없었다 (도 27B). 이와 반대로, 유리 이마티닙 메실레이트를 사용할 때 IC50 값은 용량 증가시에 유의하게 변하지 않았다.
마우스 흑색종 세포주 B16/F10를 사용한 결과는 인간 종양 세포와 흡사하다. 유리 및 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체 (scL-글리벡(등록상표))에 의한 화학감작에 대한 효과의 비교는 2개의 별개의 화학요법제 시스플라틴 (CDDP 및 다카르바진 (DTIC)을 사용할 때 용량 및 시간 의존성임이 밝혀졌다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. CDDP와 함께, 20 μM의 농도에서 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체 (scL-GLEE VEC(등록상표))를 사용한 형질감염은 유리 이마티닙 메실레이트에 비해 감작을 2배 증가시켰다 (도 28A). 여기서, 다시 30 μM의 이마티닙 메실레이트 농도에서 CDDP에 대한 감작 수준은 최저 이마티닙 메실레이트 용량에서 단지 10％ 이하의 세포만이 생존할 정도로 매우 강력하였다 (도 28B).
유리 또는 복합체화된 이마티닙 메실레이트에 의한 다른 화학요법제, 즉 다카르바진 (DTIC)에 대한 B16/F10 세포의 감작을 비교하기 위해 유사한 실험을 수행하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 여기서, 다시 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트를 사용할 경우 유리 소분자에서 관찰되지 않은 감작의 용량 의존성 향상 이외에, 형질감염 후에 화학요법제 첨가 전에 인큐베이션 시간을 증가시킬 때 감작 배수가 증가하였다 (도 29A 내지 D). 24시간 인큐베이션 후에, 15 μM의 이마티닙 메실레이트 농도에서, 복합체화된 이마티닙 메실레이트는 유리 이마티닙 메실레이트에 비해 DTIC에 대한 반응을 2.1배 증가시켰다 (도 29A). 이것은 소분자의 농도가 20 μM로 증가할 때 유리 이마티닙 메실레이트에 비해 본 발명의 복합체에 의한 감작이 4.2배 증가로 2배 증가하였다 (도 29B). 보다 긴 인큐베이션 시간 (48시간)에서, 유리 이마티닙 메실레이트 (농도 = 15 μM)에 비해 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 사용시의 감작의 증가는 5.7배이었고 (도 29C), 20 μM의 농도에서 48시간에서의 반응은 IC50을 얻을 수 없을 정도로 컸다 (도 29D). 따라서, 여기서 다시 본 발명자들은 다수의 종양 세포 종류에서 다양한 화학요법제를 사용하여 소분자 이마티닙 메실레이트의 전달 및 효능은 소분자가 본 발명의 복합체에 봉입될 경우에 향상됨을 밝혀내었다.
리간드/리포좀/이마티닙 메실레이트 유발 화학감작의 종양 세포 특이적 특성은 도 30A 및 B에 도시되어 있다. 정상 (비-암성) 피부 섬유아세포 세포 (H500)를 상기와 같이 LipA 단독, 유리 이마티닙 메실레이트 및 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡(등록상표)) (20 μM의 농도에서)로 형질감염시킨 후, 화학요법제 미톡산트론 (도 30A) 또는 탁소테레 (도 30B)를 첨가하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 두 실험에서, 화학요법제에 대한 감작의 어떠한 유의한 증가도 관찰되지 않았다. 모든 IC50 값은 대조군과 동일한 범위 내, 미톡산트론에 대해 > 100 ng/ml, 탁소테레에 대해 >100 nM이었다.
TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 복합체의 생체내 효능: 향상된 종양 성장 억제
PBS에 현탁된 1x105 B16/F10 마우스 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. 4일 후, B16/F10 폐 전이를 보유한 마우스에게 시스플라틴 (CDDP) 단독, 유리 이마티닙 메실레이트 또는 시스플라틴과 조합한 TfRscFv/LipA/이마티닙 메실레이트 (scL-글리벡(등록상표)) 복합체를 주사하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 마우스에게 유리 이마티닙 메실레이트 또는 scL-글리벡(등록상표) 복합체를 0.5 mg 이마티닙 메실레이트/마우스/주사로 1주 3회, 총 9회 주사하였다. CDDP를 2 mg/kg의 용량으로 1주 2회, 총 6회 i.p. 주사하였다. 처리 3주 후에, 마우스를 인도적으로 안락사시키고, 폐를 절제하고, 사진을 찍었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 단일 물질만을 투여한 동물에 비해 TfRScFv/LipA/이마티닙 메실레이트 + CDDP의 조합물을 투여한 마우스의 폐에서 종양 세포 성장의 유의한 억제가 존재하였다. 따라서, 이것은 특히 화학요법제와 조합되어 사용될 때 본 발명의 리간드/리포좀/소분자 복합체의 항암제로서의 용도를 지지한다.
결론
이마티닙 메실레이트는 필라델피아 염색체-양성 (Ph+) 만성 골수성 백혈병 (CML) 환자 및 KIT (CD 117) 양성 절제불가능 및/또는 전이성 악성 위장관 간질 종양 (GIST) 환자의 치료를 위해 승인되었다. 이것은 시험관 내에서 Bcr-Abl, c-KIT 및 PDGF 수용체 알파 및 베타를 포함하는 많은 티로신 키나제를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 약물은 상기 키나제를 발현하는 다른 암의 치료를 위한 잠재력을 갖는다. 상기 연구에서, 본 발명자들은 종양 세포 사멸을 유도하고 (유방, 전립선 및 췌장암에서) 1차 화학요법제에 대한 반응을 증가시킬 때 이마티닙 메실레이트의 효과는 이마티닙 메실레이트가 본 발명의 표적화된 리포좀 전달 복합체를 통해 세포에 전달될 때 획기적으로 개선됨을 입증하였다. 상기 결과는 또한 이마티닙 메실레이트의 효능을 크게 증가시키는 상기 나노복합체의 능력을 보여준다.
실시예 13
간단한 혼합에 의해 소분자 (에를로티닙 (타르체바(등록상표)))를
포함하는 면역리포좀의 제조 및 특성화
타르체바(등록상표) (에를로티닙, 제넨테크 인크 (미국 캘리포니아주 샌프란시스코))는 인간 표피 성장 인자 수용체 타입 1/표피 성장 인자 수용체 (HER1/EGFR) 티로신 키나제 억제제이다. 상기 티로신 키나제는 비-소세포 폐암 및 췌장암에서 세포 성장에 중요한 인자 중의 하나이다.
표피 성장 인자 수용체 (EGFR)는 HER (인간 표피 성장 인자 수용체) 신호전달 경로의 성분이다. 경로는 적어도 4개의 세포성 수용체, 즉 EGFR/HER1, HER2, HER3, 및 HER4로 구성된다. 약 11개의 상이한 인자가 특정 패턴으로 상기 수용체에 결합하여 활성화시킨다고 알려져 있다. HER 신호전달 경로는 세포 성장, 증식, 이동, 및 매개 과정, 예를 들어 상처 치유, 조직 복구, 및 피부 유지의 정상 조절에서 기능을 수행한다. 정상 세포의 성장 조절에서의 그의 역할에 추가하여, HER 신호전달 경로는 암 세포의 성장, 증식, 이동, 및 생존에 대해 유의한 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다.
EGFR 및 HER 신호전달 경로의 다른 성분은 복잡하고 잘 조절된 방식으로 상호작용하여 세포 성장을 조절한다. HER 패밀리 멤버의 양 또는 활성의 변경은 부적절한 세포 성장을 야기하거나 지지하여 암 세포의 증식, 이동, 및 생존을 유발할 수 있다. 신호전달 경로는 각각의 단계에서 성장 신호를 증폭시키는 캐스케이드로서 작용하기 때문에, EGFR의 양 또는 활성의 작은 변화는 세포 성장 및 전이 (세포 이동)을 촉진하고 세포자멸 (프로그래밍된 세포 사멸)을 억제함으로써 암의 발생 또는 진행을 유의하게 유도할 수 있다. 추가로, 몇몇 연구는 정상 세포 및 조직 복구의 중요한 조절인자인 HER 신호전달이 일부 화학요법제 및 방사선 조사를 포함하여 세포 및 조직을 손상시키는 다양한 암 요법에 반응하여 활성화됨을 밝혀내었다. 이들 연구는 EGFR을 포함하여 HER 경로의 활성화가 치료 내성 암의 발달에 기여할 수 있음을 제안한다.
타르체바(등록상표)는 세포 내부의 HER1 신호전달 경로의 티로신 키나제 활성을 억제하도록 설계된다. 타르체바(등록상표)는 경구 투여 정제이다. 에를로티닙은 화학명이 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민인 퀴나졸린아민이다. 타르체바(등록상표)는 에를로티닙을 히드로클로라이드 염으로서 포함한다. 에를로티닙은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)와 회합된 티로신 키나제의 세포내 인산화를 억제한다. 다른 티로신 키나제 수용체에 대한 억제 특이성은 충분히 특성화되지 않았다. EGFR은 정상 세포 및 암 세포의 세포 표면 상에 발현된다. 2004년 11월에, 미국 식품 의약품 안전청 (FDA)은 적어도 하나의 사전 화학요법의 실패 후에 국소 진행된 또는 전이성 비-소세포 폐암 (NSCLC)의 환자 치료를 위해 타르체바(등록상표) (150 mg)를 승인하였다. 국소 진행된 또는 전이성 NSCLC의 1차 환자에 대해 수행된 2개의 다기관, 위약-대조, 무작위 배정 III상 시험의 결과는 백금계 화학요법제와 타르체바(등록상표)의 동시 투여에 의한 임상적 잇점이 존재하지 않음을 보여주었고, 상기 환경에 이를 사용하는 것이 권장되지 않는다. 이러한 측면에서, 본 발명의 방법을 통해, 즉 간단한 혼합을 통해 소분자를 종양 표적화 리간드-리포좀 복합체와 복합체화함으로써, 여러 종양 세포주에서 에를로티닙 (타르체바(등록상표))에 의한 다양한 화학요법제에 대한 감작은 매우 놀라운 것이다. 타르체바(등록상표) 단일요법제 150 mg을 투여한 NSCLC 환자에서 가장 일반적인 부작용은 저수준 내지 중등도의 발진 및 설사이다. 등급 3/4 발진 및 설사는 각각 9％ 및 6％의 타르체바(등록상표) 치료 환자에서 발생하였고, 이에 의해 각각 1％의 환자에 대한 단일-물질 III상 시험이 중단되었다. NSCLC, 췌장암 또는 다른 진행된 고형 종양의 치료를 위해 타르체바(등록상표)를 투여한 환자에서 사망을 포함하는 중증 간질성 폐 질환 (ILD)-유사 상태가 드물게 보고되었다. NSCLC 단일-물질 시험에서, ILD-유사 상태의 발생은 드물었고 (0.8％), 치료 군 사이에 균등하게 분포하였다.
2005년 11월에, FDA는 이전에 화학요법을 실시하지 않은 환자의 국소 진행된, 수술이 불가능한 또는 전이성 췌장암 치료를 위해 겜시타빈 화학요법과 조합 투여되는 타르체바(등록상표) (100 mg)를 승인하였다. 췌장암의 III상 연구에서, 보고된 가장 일반적인 부작용은 피로, 발진, 영역, 식욕부진 및 설사이었다. 발진은 타르체바(등록상표) + 겜시타빈을 투여한 69％의 환자에서, 겜시타빈 + 위약을 투여한 30％의 환자에서 보고되었다. 설사는 타르체바 + 겜시타빈을 투여한 48％의 환자에서, 겜시타빈 + 위약을 투여한 36％의 환자에서 보고되었다. 발진 및 설사는 각각 타르체바(등록상표) + 겜시타빈을 투여한 2％의 환자에서 용량 감소를 유발하였고, 1％ 이하의 환자에서 연구를 중단시켰다. 또한, 타르체바(등록상표) + 겜시타빈을 투여한 환자의 심각하고 잠재적인 치명적인 부작용은 간질성 폐 질환 유사 합병증, 심근 경색 또는 허혈, 뇌혈관 사고, 및 저혈소판증을 동반한 미세혈관병성 용혈성 빈혈을 포함하였다.
물질 및 방법
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 및 N-말레이미도-페닐부티레이트 DOPE (MPB-DOPE)는 아반티 폴라 리피즈에서 구입하였다.
세포주 및 배양액
인간 전립선암 세포주 DU145 (HTB-81)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 입수하였다. DU145를 10％ 열 불활성화된 우태 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 얼스 염을 함유하는 이글 최소 필수 배지 (EMEM) 내에서 배양하였다. 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435 및 인간 췌장암 세포주 PANC-1을 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 개선된 MEM (IMEM) 내에서 배양하였다. 정상 (비-암성) 피부 섬유아세포 세포주 H500을 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM 비필수 아미노산 + 10％ 열 불활성화된 우태 혈청, 2 mM L-글루타민 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 EMEM 내에서 배양하였다. EMEM은 미디어테크로부터 구입하였고, 다른 세포 배양 배지 및 성분은 바이오플루이즈로부터 입수하였다.
TfRscFv/LipA/에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 복합체의 제조
양이온성 리포좀 제제 LipA (DOTAP:DOPE 또는 DDAB:DOPE, 1:1 내지 1:2 몰비)를 본원에 설명된 바와 같이 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. TfRscFv/LipA/에를로티닙 복합체를 다음과 같이 제조하였다: LipA와 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 wt/wt)을 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, 에를로티닙을 적절한 농도에서 첨가하고, 실온에서 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안 인큐베이팅하였다. 동물 주사를 위해, 덱스트로스 또는 수크로스를 각각의 샘플에 1％ 내지 20％, 보다 적합하게는 5-10％의 최종 농도로 첨가하였다. 에를로티닙 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 2:7 내지 8:7, 가장 적합하게는 7:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
TfRscFv/LipA/에를로티닙 복합체를 사용한 시험관내 세포 생존력
시험관내 세포독성 연구를 위해, 100 ㎕의 적절한 성장 배지 중 2.5 내지 3.5 x 103 세포/웰의 각각의 세포주를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 무혈청 배지 중 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/에를로티닙 복합체 또는 유리 에를로티닙을 증가하는 농도로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 보충하였다. 이어서, 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 37℃에서 5％ CO2를 함유하는 가습 대기 중에서 인큐베이팅하였다. 그 후에, 웰을 페놀 레드 없이 IMEM으로 세척하고, 세포-생존력 XTT-기반 분석을 제조사의 프로토콜 (뵈링거 만하임)에 따라 수행하였다. 전자-커플링 시약의 존재 하에, XTT (나트륨 3'-[1-(페닐아미노-카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠 술포네이트)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에서 데히드로게나제에 의해 주황색 포르마잔으로 전환된다. 포르마잔 흡광도 (이는 살아있는 세포의 수에 상호관련된다)를 450 nm에서 미세판 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 측정하였다. 50％ 성장 억제를 일으키는 IC50을 약물 농도의 로그 대 생존 세포 분획의 그래프로부터 내삽하였다.
시험관내 화학감작
화학감작 연구를 위해, 100 ㎕ 중 2.5~3.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24 시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/에를로티닙 복합체 또는 유리 에를로티닙을 3 내지 8 μM 에를로티닙으로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 19시간 동안 인큐베이팅한 후, 화학요법제가 존재하거나 존재하지 않은 적절한 보충 배지를 증가하는 농도로 첨가하고, 약 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 계속 인큐베이팅하였다. 사용된 화학요법 약물은 도세탁셀 (탁소테레; 아벤티스 파마슈티칼스), 미톡산트론 (노반트론(등록상표), 이뮤넥스 코퍼레이션) 및 겜시타빈 (겜자르(등록상표), 일라이 릴리 앤드 컴퍼니 (일라이 릴리 앤드 컴퍼니, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))이었다. 화학요법제에 대한 감작도를 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하고, 각각의 세포의 IC50 값을 계산하였다. 감작 배수는 다음과 같다: IC50 (형질감염되지 않은)/IC50 (각각의 복합체)
결과
봉입된 및 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))의 비교
인간 전립선암 세포주 (DU145) (도 32A), 인간 췌장암 세포주 (PANC-1) (도 32B) 및 인간 흑색종 세포주 (MDA-MB-435) (도 32C)에서 세포 생존에 대한 TfRscFv/LipA/에를로티닙 (타르체바(등록상표))의 효과를 XTT 분석 (본원에서 설명된 바와 같은)을 통해 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))과 비교하여 평가하였다. 각각의 복합체 내의 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 에를로티닙 (타르체바(등록상표))을 물에 용해시켰다. 도 32A에 도시된 바와 같이, DU145 세포를 리포좀 복합체에 의해 전달된 에를로티닙 (타르체바(등록상표))으로 처리하면 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))에 비해 세포 치사가 5배를 초과하여 증가하였다.
유사하게, 인간 췌장암 세포에서 (도 32B), 리포좀 복합체를 통해 전달된 에를로티닙 (타르체바(등록상표))은 '유리' 형태로 전달될 경우보다 세포 치사에 대해 유의하게 더 큰 효과를 보였다. TfRscFv/LipA/에를로티닙 (타르체바(등록상표))이 유리 소분자에 비해 거의 10배의 개선을 보였다.
유리 또는 TfRScFv/LipA 복합체화된 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) (scL-타르체바)의 효과를 인간 흑색종 세포 (MDA-MB-435)에서 비교할 때, scL-타르체바(등록상표)를 사용할 때 유리 타르체바에 비해 2배 초과의 세포 치사 증가가 관찰되었다 (도 32C).
TfRscFv/LipA/에를로티닙 (scL-타르체바(등록상표))에 의한 화학감작
종양 세포를 1차 화학요법제에 대해 감작시키는, '유리' 형태로 또는 리포좀 복합체를 통해 전달된 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) (scL-타르체바(등록상표))의 능력도 XTT 분석에 의해 평가하였다. 인간 전립선 세포주 DU145를 3.75 μM 또는 7.5 μM의 유리 또는 복합체화된 에를로티닙 (타르체바(등록상표))로 처리한 후, 증가하는 용량의 미톡산트론을 첨가하였다. 각각의 복합체 내의 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7 (1:1과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 도 33A에 나타낸 바와 같이, 3.75 μM의 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 농도에서, 에를로티닙 (타르체바(등록상표))이 리포좀 복합체 (scL-타르체바(등록상표))에 의해 전달될 때, 유리 에를로티닙으로서 투여될 때에 비해 화학요법제에 대한 반응이 거의 13배 증가하였다. 상기 용량에서, 유리 에를로티닙은 세포를 미톡산트론에 대해 감작화시키지 못하였다. 또한, 화학감작의 용량 의존적 증가는 에를로티닙 (타르체바(등록상표))이 본 발명의 방법을 통해 전달된 경우에만 관찰되었고, 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))으로서 전달된 경우에는 관찰되지 않았다. 7.5 μM 에를로티닙 (타르체바(등록상표))에서, scL-타르체바(등록상표)의 처리 후에 DU145 세포의 미톡산트론에 대한 감작 수준은 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))보다 34배 이상 더 컸다 (도 33B). 이와 반대로, 상기 보다 많은 용량에서도 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))은 화학요법제에 대한 반응에 효과를 보이지 않았다.
유사하게, 인간 흑색종 세포 (MDA-MB-435)에서, 3.75 μM에서 리포좀 복합체에 의해 전달된 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) (scL-타르체바(등록상표))은 탁소테레에 대한 세포의 반응을 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표))에 비해 4배를 초과하여 향상시켰다 (도 34A). 여기서, 다시 용량 반응이 존재하였지만, 이것은 scL에 의해 전달된 소분자에서만 발생하였다. 7.5 μM에서, 감작 수준은 TfRscFv/LipA/에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 복합체 (scL-타르체바(등록상표))를 사용하여 IC50 값을 결정할 수 없을 정도로 매우 높았지만 (도 34B), 유리 에를로티닙가 비교한 감작 배수는 >140배로 추정된다. 이와 반대로, 유리 에를로티닙의 경우에는 최소 효과만이 존재하였다. 각각의 복합체 내의 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다.
또한, 에를로티닙 (타르체바(등록상표))의 리포좀 복합체 전달 효과를 인간 췌장암 세포주 PANC-1에서 평가하였다. 각각의 복합체 내의 이마티닙 메실레이트 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 다른 종양 세포에서 관찰된 바와 같이, 에를로티닙 (타르체바(등록상표))이 본 발명의 리포좀 복합체 (scL-타르체바(등록상표))를 통해 전달될 때 화학요법제 겜자르(등록상표) (겜시타빈 HCl)에 대한 감수성 수준이 획기적으로 증가하였다 (도 35). 7.5 μM에서, 유리 에를로티닙에서 관찰된 것에 비해 리포좀 복합체화된 에를로티닙 (타르체바(등록상표))을 사용한 경우에 겜시타빈에 대한 PANC-1의 반응이 무려 545배 증가하였다. 유리 타르체바(등록상표)가 표준 화학요법제의 효과를 향상시키지 못한 것으로 밝혀진 임상 시험의 결과에 비추어, 표준 화학요법제에 대한 상기 획기적인 효과는 매우 놀라운 것이다.
따라서, 여기서 다시 선행 실시예의 다른 소분자처럼, 본 발명자들은 다수의 종양 세포 종류에서 다양한 화학요법제를 사용하여 소분자 에를로티닙의 전달 및 효능은 소분자가 본 발명의 복합체에 봉입될 경우에 향상됨을 밝혀내었다.
리간드/리포좀/에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 유발 화학감작의 종양 세포 특이적 특성은 도 36A-C에 도시되어 있다. 정상 (비-암성) 피부 섬유아세포 세포 (H500)를 상기와 같이 LipA 단독, 유리 에를로티닙 (타르체바(등록상표) 단독) 및 TfRscFv/LipA/에를로티닙 (타르체바(등록상표)) (scL-타르체바(등록상표)) (7.5 μM의 농도에서)로 형질감염시킨 후, 화학요법제 미톡산트론 (도 36A), 탁소테레 (도 36B) 또는 겜시타빈 (겜자르(등록상표)) (도 36C)을 첨가하였다. 각각의 복합체 내의 에를로티닙 (타르체바(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 3개의 실험 모두에서, 화학요법제에 대한 감작의 어떠한 유의한 증가도 관찰되지 않았다. 모든 IC50 값은 대조군과 동일한 범위 내에 존재하였다.
따라서, 여기서 다시 선행 실시예의 다른 소분자처럼, 본 발명자들은 다수의 종양 세포 종류에서 다양한 화학요법제를 사용하여 소분자 에를로티닙의 전달 및 효능은 소분자가 본 발명의 복합체에 봉입될 경우에 향상됨을 밝혀내었다.
실시예 14
간단한 혼합에 의해 소분자 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))를
포함하는 면역리포좀의 제조 및 특성화
신장 세포 암종 (RCC) 및 위장관 기질 종양 (GIST)을 포함하여 대부분의 암은 하나의 잘 규정된 돌연변이 또는 이상이 아니라 다수의 신호전달 경로의 돌연변이 또는 다른 이상으로부터 발생한다. 상기 변화는 최종적으로 암 성장에 중요한 과정을 가능하게 하고, 성장 신호의 자족 (self-sufficiency), 성장-억제 신호에 대한 불감성, 프로그래밍된 세포 사멸 (세포자멸)의 회피, 무한 증식 능력, 지속적 혈관신생, 및 조직 침습 및 전이를 포함한다. 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))는 RCC 및 GIST 발달에 관여하는 몇몇 수용체 키나제를 동시에 억제하는 경구 다중-키나제 억제제이다. 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))는 종양 세포 증식 및 혈관신생 모두에서 일정 역할을 수행하는 모든 공지의 PDGF 및 VEGF 수용체를 동시에 억제한다. 수텐트(등록상표)는 PDGF, VEGF, 및 KIT 수용체를 동시에 억제하는 최초의 다중-키나제 GIST 요법제이다. 수텐트(등록상표)는 RCC 및 GIST 모두의 전임상 연구에서 혈관주위세포 상의 PDGF 수용체 및 내피 세포 상의 VEGF 수용체를 억제함으로써 항혈관신생 활성을 보였다. 수텐트(등록상표)는 종양 퇴행을 유도하고, 전임상 연구에서 혈관신생 및 전이성 진행을 억제하였다. 따라서, 수텐트(등록상표)는 다수의 신호전달 경로를 억제하여 이중 작용 항증식 및 항혈관신생 효과를 생성시킨다.
수텐트(등록상표)는 이마티닙 메실레이트에 대해 질병이 진행한 후에 또는 이마티닙 메실레이트에 대한 불내성 후에 위장관 기질 종양 (GIST)의 치료를 위해 및 진행된 신장 세포 암종 (RCC)의 치료를 위해 처방된다. 진행된 RCC에 대한 승인은 부분적인 반응 속도 및 반응 지속 기간을 기초로 한 것이다. RCC에서 생존 증가 또는 질병 관련 증상의 개선과 같은 임상 잇점을 보이는 수텐트(등록상표))에 대한 무작위 시험은 수행되지 않았다.
물질 및 방법
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 및 N-말레이미도-페닐부티레이트 DOPE (MPB-DOPE)는 아반티 폴라 리피즈에서 구입하였다.
세포주 및 배양액
인간 전립선암 세포주 DU145 (HTB-81)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 입수하였다. DU145를 10％ 열 불활성화된 우태 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 얼스 염을 함유하는 이글 최소 필수 배지 (EMEM) 내에서 배양하였다. 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435 및 인간 췌장암 세포주 PANC-1을 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 개선된 MEM (IMEM) 내에서 배양하였다. 정상 인간 폐 섬유아세포 IMR-90 세포 (파니우틴 박사의 기증품)를 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신, 및 네오마이신을 보충한 EMEM 내에서 배양하였다. 정상 (비-암성) 피부 섬유아세포 세포주 H500을 1 mM 피루브산나트륨, 1 mM 비필수 아미노산 + 10％ 열 불활성화된 우태 혈청, 2 mM L-글루타민 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 EMEM 내에서 배양하였다. EMEM은 미디어테크로부터 구입하였고, 다른 세포 배양 배지 및 성분은 바이오플루이즈로부터 입수하였다.
TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체의 제조
양이온성 리포좀 제제 LipA (DOTAP:DOPE 또는 DDABrDOPE, 1:1 내지 1:2 몰비)를 본원에 설명된 바와 같이 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체를 다음과 같이 제조하였다: LipA와 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 wt/wt)을 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))를 적절한 농도에서 첨가하고, 실온에서 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안 인큐베이팅하였다. 동물 주사를 위해, 덱스트로스 또는 수크로스를 각각의 샘플에 1％ 내지 20％, 보다 적합하게는 5-10％의 최종 농도로 첨가하였다. 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 3:7 내지 11:7, 가장 적합하게는 7:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체를 사용한 시험관내 세포 생존력
시험관내 세포독성 연구를 위해, 100 ㎕의 적절한 성장 배지 중 2.5 내지 3.5 x 103 세포/웰의 각각의 세포주를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 무혈청 배지 중 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체 또는 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))을 증가하는 농도로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 보충하였다. 이어서, 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 37℃에서 5％ CO2를 함유하는 가습 대기 중에서 인큐베이팅하였다. 그 후에, 웰을 페놀 레드 없이 IMEM으로 세척하고, 세포-생존력 XTT-기반 분석을 제조사의 프로토콜 (뵈링거 만하임)에 따라 수행하였다. 전자-커플링 시약의 존재 하에, XTT (나트륨 3'-[1-(페닐아미노-카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠 술포네이트)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에서 데히드로게나제에 의해 주황색 포르마잔으로 전환된다. 포르마잔 흡광도 (이는 살아있는 세포의 수에 상호관련된다)를 450 nm에서 미세판 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 측정하였다. 50％ 성장 억제를 일으키는 IC50을 약물 농도의 로그 대 생존 세포 분획의 그래프로부터 내삽하였다.
시험관내 화학감작
화학감작 연구를 위해, 100 ㎕ 중 2.5~3.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체 또는 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))를 2 내지 6 μM 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 19시간 동안 인큐베이팅한 후, 화학요법제가 존재하거나 존재하지 않은 적절한 보충 배지를 증가하는 농도로 첨가하고, 약 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 계속 인큐베이팅하였다. 사용된 화학요법 약물은 도세탁셀 (탁소테레; 아벤티스 파마슈티칼스), 미톡산트론 (노반트론(등록상표), 이뮤넥스 코퍼레이션) 및 겜시타빈 (겜자르(등록상표), 일라이 릴리 앤드 컴퍼니)이었다. 화학요법제에 대한 감작도를 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하고, 각각의 세포의 IC50 값을 계산하였다. 감작 배수는 다음과 같다: IC50 (형질감염되지 않은)/IC50 (각각의 복합체)
결과
TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체의 몰비의 시험관내 최적화
TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체를 제조하고, TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체의 소분자 대 리포좀의 몰비를 최적화하였다. 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 LipA의 상이한 비에서 복합체화된 및 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))의 DU1455 인간 전립선암 세포에 대한 세포 치사 효과를 비교하였다. TfRscFv 대 LipA이 비율은 1:30 (wt/wt)이었다. 3 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 복합체, 또는 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))로 처리하였다. 세포독성을 평가하기 위해 처리 72시간 후에 XTT 분석을 수행하고, IC50 값 (50％ 성장 억제를 일으키는 약물 농도)을 농도-세포 생존력 곡선으로부터 계산하였다. 도 37은 각각의 비율에 대한 IC50 값을 보여준다. 3:7~7:7의 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 리포좀의 몰비에서, 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))로 처리된 세포에 비해 복합체화된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))로 처리된 세포에서 IC50 값의 감소가 관찰되었다.
봉입된 및 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))의 비교
인간 전립선암 세포주 (DU145) (도 38A), 및 인간 췌장암 세포주 (PANC-1) (도 38B)에서 세포 생존에 대한 TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))의 효과를 XTT 분석 (본원에서 설명된 바와 같은)을 통해 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))와 비교하여 평가하였다. 각각의 복합체 내의 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7 (1:1과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 도 38A에 도시된 바와 같이, DU145 세포를 리포좀 복합체에 의해 전달된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))로 처리하면 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))에 비해 세포 치사가 유의하게 증가하였다.
유사하게, 인간 췌장암 세포에서 (도 38B), 리포좀 복합체를 통해 전달된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))는 '유리' 형태로 전달될 경우보다 세포 치사에 대해 유의하게 더 큰 효과를 보였다. TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))가 유리 소분자에 비해 4배의 개선을 보였다.
TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (scL-수텐트(등록상표))에 의한 화학감작
종양 세포를 1차 화학요법제에 대해 감작시키는, '유리' 형태로 또는 리포좀 복합체를 통해 전달된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) (scL-수텐트(등록상표))의 능력도 XTT 분석에 의해 평가하였다. 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435를 2.5 μM 또는 5 μM의 유리 또는 복합체화된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))로 처리한 후, 증가하는 용량의 탁소테레를 첨가하였다. 각각의 복합체 내의 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7 (1:1과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 도 39A에 나타낸 바와 같이, 2.5 μM 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 농도에서, 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 리포좀 복합체 (scL-수텐트(등록상표))에 의해 전달될 때 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))로서 투여된 경우에 비해 화학요법제에 대한 반응이 8배를 초과하여 증가하였다. 또한, 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))가 본 발명의 방법을 통해 전달될 때 화학감작의 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 5 μM 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))에서, 감작의 수준은 IC50 값에 도달할 수 없을 정도로 높았지만, scL-수텐트(등록상표)로 처리한 후에 탁소테레에 대한 MDA-MB-435 세포의 감작 수준은 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))보다 300배를 초과하여 더 높은 것으로 추정되었다 (도 39B).
유사하게, 인간 전립선암 세포 (DU145)에서, 5 μM에서 리포좀 복합체에 의해 전달된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) (scL-수텐트(등록상표))는 화학요법제에 대한 전립선암 세포의 감작에 대한 최소 효과만이 존재하는 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))에 비해 미톡산트론에 대한 세포의 반응을 400배를 초과하여 향상시켰다 (도 40). 각각의 복합체 내의 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다.
또한, 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))의 리포좀 복합체 전달 효과도 인간 췌장암 세포주 PANC-1에서 평가하였다. 각각의 복합체 내의 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 다른 종양 세포에서 관찰된 바와 같이, 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))가 본 발명의 리포좀 복합체 (scL-수텐트(등록상표))를 통해 전달될 때 화학요법제 겜자르(등록상표) (겜시타빈 HCl)에 대한 감수성 수준이 획기적으로 증가하였다 (도 41). 2.5 μM에서, 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))에서 관찰된 것에 비해 리포좀 복합체화된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))를 사용한 경우에 겜시타빈 (겜자르(등록상표))에 대한 PANC-1의 반응이 거의 6배 증가하였다.
리간드/리포좀/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 유발 화학감작의 종양 세포 특이적 특성은 도 42 (A-C) 및 43 (A-C)에 도시되어 있다. 정상 (비-암성) 피부 섬유아세포 세포 (H500)를 상기와 같이 LipA 단독, 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 단독 및 TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) (scL-수텐트(등록상표)) (2.5 또는 5 μM의 농도에서)로 형질감염시킨 후, 화학요법제 미톡산트론 (도 42A), 탁소테레 (도 42B) 또는 겜시타빈 (겜자르(등록상표)) (도 42C)을 첨가하였다. 각각의 복합체 내의 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 3개의 실험 모두에서, 화학요법제에 대한 감작의 어떠한 유의한 증가도 관찰되지 않았다. 모든 IC50 값은 대조군과 동일한 범위 내에 존재하였다.
정상 인간 폐 섬유아세포 (IMR-90) 세포를 상기한 바와 같이 LipA 단독, 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 단독 및 TfRscFv/LipA/수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) (scL-수텐트(등록상표)) (2.5 μM의 농도에서)로 형질감염시킨 후, 화학요법제 미톡산트론 (도 43A), 탁소테레 (도 43B) 또는 겜시타빈 (겜자르(등록상표)) (도 43C)을 첨가한 경우에 유사한 결과가 관찰되었다. 각각의 복합체 내의 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 3개의 실험 모두에서, 화학요법제에 대한 감작의 어떠한 유의한 증가도 관찰되지 않았다. 모든 IC50 값은 대조군과 동일한 범위 내에 존재하였다.
따라서, 여기서 다시 선행 실시예의 다른 소분자처럼, 본 발명자들은 다수의 종양 세포 종류에서 다양한 화학요법제를 사용하여 소분자 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))의 전달 및 효능은 소분자가 본 발명의 복합체에 봉입될 경우에 향상됨을 밝혀내었다. 유리 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))에 비해 본 발명에서 설명된 바와 같이 복합체화된 수니티닙 말레이트 (수텐트(등록상표))에 대해 유의하게 더 감작화되는, 본 실시예에서 제시된 3가지 종양 종류는 상기 소분자의 사용이 유용한 것으로 밝혀진 종양 종류가 아니기 때문에, 상기 종양 세포가 본 발명에 잘 반응한다는 것은 놀라운 발견이다.
실시예 15
간단한 혼합에 의해 소분자 (게피티닙 (이레사(등록상표)))를 포함하는
면역리포좀의 제조 및 특성화
게피티닙 (이레사(등록상표))은 판매 승인을 얻기 위한, 표피 성장 인자 수용체 티로신 키나제 (EGFR-TK) 억제제로 알려진 새로운 종류의 항암 약물의 최초의 약물이고, 전세계의 36개국에서 진행된 비-소세포 폐암 (NSCLC)의 치료를 위해 현재 인가되어 있다. 암 세포를 포함하여 많은 세포는, 신체에 의해 정상적으로 생산되고 세포의 성장 및 증식을 촉진시키는 단백질인 표피 성장 인자 (EGF)에 대한 수용체를 그 표면 상에 갖는다. EGF가 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 부착할 때, EGF는 티로신 키나제로 불리는 효소를 세포 내에서 활성을 갖도록 만든다. 티로신 키나제는 암 세포를 포함하는 세포가 성장하고, 증식하고, 전파되도록 하는 화학적 과정을 촉발시킨다. 게피티닙은 EGFR에 부착하여, EGF의 부착 및 티로신 키나제의 활성화를 차단한다. 암 세포의 성장 및 증식을 정지시키기 위한 상기 메카니즘은 화학요법 및 호르몬 요법의 메카니즘과 매우 상이하다. 게피티닙은 2003년 5월에 FDA에 의해 승인되었다. 게피티닙은 특정 종류의 폐암, 즉, 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자의 치료를 위해 단독으로 사용된다 (단일요법).
승인은 사전에 치료된 적이 있는 진행된 NSCLC의 많은 환자에 대해 이레사가 효과적인 치료제임을 밝힌 2개의 II상 시험인 IDEAL 1 및 2를 기초로 하였다. IDEAL 시험에서 약 50％의 환자에서 종양 수축 또는 종양의 안정화가 달성되었고, 약물은 일반적으로 잘 관용되는 것으로 밝혀졌고, 가장 일반적으로 보고된 유해한 약물 반응은 저수준 내지 중등도의 피부 발진 및 설사이었다. 그러나, 발병시에 급성이 될 수 있는 간질성 폐 질환 (ILD)이 이레사를 투여한 환자에서 관찰되었고, 일부 환자는 치명적인 상태에 빠졌다. 동시에 발생하는 특발성 폐 섬유증/간질성 폐렴/진폐증/방사선 폐렴/약물-유발 폐렴 환자는 그 병태에 따른 사망률이 증가하는 것으로 관찰되었다.
2004년 12월에, 아스트라제네카 (AstraZeneca)는 하나 또는 두개의 사전 화학요법이 실패한 바 있는 진행된 NSCLC 환자에서 이레사(등록상표)를 위약과 비교한 III상 ISEL (폐암에서 이레사(등록상표) 생존 평가) 연구 결과를 발표하였다. ISEL은 이레사(등록상표)를 사용할 때 생존이 일부 개선됨을 보여주었지만, 이것은 전체 집단 또는 선암종 환자에서 위약과 비교할 때 통계적으로 유의한 정도에는 도달하지 못하였다. 사전 계획된 (pre-planned) 하위군 분석물은 아시아계 환자 및 흡연 경험이 없는 환자에서 이레사(등록상표)를 사용할 때 위약에 비해 통계적으로 유의한 생존 증가를 보여주었다. 또한, ISEL의 바이오마커 데이타에 대한 탐색 분석은 EGFR 유전자의 높은 카피 수가 치료된 적이 있는 진행된 NSCLC에서 이레사(등록상표) 사용시의 잇점에 대한 강력한 예측인자임을 제안하였다.
ISEL 데이타 발표 후에, 아스트라제네카는 이레사(등록상표)에 대한 유럽내 사용 신청을 자발적으로 철회하였고, USA 및 캐나다의 감독 당국은 이레사(등록상표)의 용도를 이 약물로부터 이미 잇점을 경험한 환자로 제한하였다. 아시아 태평양 지역에서는, 폐암의 분자적 차이에 의해, 이레사(등록상표)가 치료된 적이 있는 진행된 NSCLC에 대한 요법제로서 확립되었고, 1차 진행된 환경에서 약물의 사용이 현재 IPASS 연구로 알려진 큰 III상 범-아시아 시험에서 연구되고 있다.
ISEL 결과 및 광범위한 임상 경험으로부터, 이레사(등록상표)가 몇몇 진행된 NSCLC 환자에 대해 효과적인 치료제임이 분명하다. 아스트라제네카는 현재 이 약물로부터 잇점을 얻을 가능성이 가장 큰 NSCLC 환자를 확인하는데 촛점을 맞추고 있다.
이레사(등록상표)는 많은 고형 종양의 성장에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보이는 신호전달 경로를 표적으로 하기 때문에, 매우 다양한 암에서 치료제로서의 잠재력을 가질 수 있다. 상기 잠재력에 대해 현재 진행중인 조사는 두경부암 및 유방암에서의 임상 시험을 포함한다.
물질 및 방법
1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE), 및 N-말레이미도-페닐부티레이트 DOPE (MPB-DOPE)는 아반티 폴라 리피즈에서 구입하였다.
세포주 및 배양액
인간 전립선암 세포주 DU145 (HTB-81)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 입수하였다. DU145를 10％ 열 불활성화된 우태 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 얼스 염을 함유하는 이글 최소 필수 배지 (EMEM) 내에서 배양하였다. 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435 및 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 세포주를 10％ 열 불활성화된 FBS, 2 mM L-글루타민, 및 각각 50 ㎍/mL의 페니실린, 스트렙토마이신 및 네오마이신을 보충한 개선된 MEM (IMEM) 내에서 배양하였다. EMEM은 미디어테크로부터 구입하였고, 다른 세포 배양 배지 및 성분은 바이오플루이즈로부터 입수하였다.
TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체의 제조
양이온성 리포좀 제제 LipA (DOTAP:DOPE 또는 DDAB:DOPE, 1:1 내지 1:2 몰비)를 본원에 설명된 바와 같이 에탄올 주사 방법을 이용하여 제조하였다. TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체를 다음과 같이 제조하였다. LipA와 TfRscFv의 혼합물 (TfRscFv 대 LipA의 비율, 1:1 내지 1:40 (wt/wt), 보다 적합하게는 1:10 내지 1:30 wt/wt)을 실온에서 회전 또는 교반하면서 10분 인큐베이팅한 후, 게피티닙 (이레사(등록상표))을 적절한 농도에서 첨가하고, 실온에서 역전 또는 교반에 의해 혼합하고, 10분 동안 인큐베이팅하였다. 동물 주사를 위해, 덱스트로스 또는 수크로스를 각각의 샘플에 1％ 내지 20％, 보다 적합하게는 5-10％의 최종 농도로 첨가하였다. 게피티닙 (이레사(등록상표)) 대 리포좀의 몰비는 0.2:7 내지 14:7, 보다 적합하게는 3.5:7 대 7:7, 가장 적합하게는 7:7이었다. 복합체 크기는 제타시저(등록상표) 3000HS 시스템을 사용하여 25℃에서 동적 광산란에 의해 결정하였다.
TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체를 사용한 시험관내 세포 생존력
시험관내 세포독성 연구를 위해, 100 ㎕의 적절한 성장 배지 중 2.5 내지 3.5 x 103 세포/웰의 각각의 세포주를 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 무혈청 배지 중 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체 또는 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))을 증가하는 농도로 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 보충하였다. 이어서, 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 72시간 동안 37℃에서 5％ CO2를 함유하는 가습 대기 중에서 인큐베이팅하였다. 그 후에, 웰을 페놀 레드 없이 IMEM으로 세척하고, 세포-생존력 XTT-기반 분석을 제조사의 프로토콜 (뵈링거 만하임)에 따라 수행하였다. 전자-커플링 시약의 존재 하에, XTT (나트륨 3'-[1-(페닐아미노-카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠 술포네이트)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에서 데히드로게나제에 의해 주황색 포르마잔으로 전환된다. 포르마잔 흡광도 (이는 살아있는 세포의 수에 상호관련된다)를 450 nm에서 미세판 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 사용하여 측정하였다. 50％ 성장 억제를 일으키는 IC50을 약물 농도의 로그 대 생존 세포 분획의 그래프로부터 내삽하였다.
시험관내 화학감작
화학감작 연구를 위해, 100 ㎕ 중 2.5~3.5 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후에, 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 100 ㎕의 TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체 또는 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))을 8 내지 15 μM 게피티닙 (이레사(등록상표)) 농도에서 덮고, 4-6시간, 적합하게는 5시간 동안 인큐베이팅한 후, FBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 추가의 24-72시간, 적합하게는 19시간 동안 인큐베이팅한 후, 화학요법제가 존재하거나 존재하지 않은 적절한 보충 배지를 증가하는 농도로 첨가하고, 약 24-72시간, 적합하게는 48시간 동안 계속 인큐베이팅하였다. 사용된 화학요법 약물은 도세탁셀 (탁소테레; 아벤티스 파마슈티칼스), 및 미톡산트론 (노반트론(등록상표), 이뮤넥스 코퍼레이션)이었다. 화학요법제에 대한 감작도를 평가하기 위해 XTT 분석을 수행하고, 각각의 세포의 IC50 값을 계산하였다. 감작 배수는 다음과 같다: IC50 (형질감염되지 않은)/IC50 (각각의 복합체)
결과
TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체의 몰비의 시험관내 최적화
TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체를 제조하고, TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체의 소분자 대 리포좀의 몰비를 최적화하였다. 게피티닙 (이레사(등록상표)) 대 LipA의 상이한 비에서 복합체화된 및 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))의 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 세포 치사 효과를 비교하였다. TfRscFv 대 LipA의 비율은 1:30 (wt/wt)이었다. 3 x 103 세포/웰을 96-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 후에 TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표)) 복합체, 또는 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))으로 처리하였다. 세포독성을 평가하기 위해 처리 72시간 후에 XTT 분석을 수행하고, IC50 값 (50％ 성장 억제를 일으키는 약물 농도)을 농도-세포 생존력 곡선으로부터 계산하였다. 도 44는 각각의 비율에 대한 IC50 값을 보여준다. 3:5~7:7의 게피티닙 (이레사(등록상표)) 대 리포좀의 몰비 범위에서, 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))로 처리된 세포에 비해 복합체화된 게피티닙 (이레사(등록상표))으로 처리된 세포에서 IC50 값의 감소가 관찰되었다.
봉입된 및 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))의 비교
인간 유방암 세포주 (MDA-MB-231) (도 45A), 인간 흑색종 세포주 (MDA-MB-435) (도 45B) 및 인간 전립선암 세포주 (DU145) (도 45C)에서 세포 생존에 대한 TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표))의 효과를 XTT 분석 (본원에서 설명된 바와 같은)을 통해 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))와 비교하여 평가하였다. 각각의 복합체 내의 게피티닙 (이레사(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7 (1:1과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 도 45A에 도시된 바와 같이, MDA-MB-231 세포를 리포좀 복합체에 의해 전달된 게피티닙 (이레사(등록상표))로 처리하면 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))에 비해 세포 치사가 2배 증가하였다.
또한, MDA-MB-435 세포에서, 게피티닙 (이레사(등록상표))이 본 발명의 복합체 (scL-이레사(등록상표))의 일부로서 전달될 경우에 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))에 비해 반응의 1.5배 증가가 관찰되었다 (도 45B).
유사하게, 인간 전립선암 세포에서 (도 45C), 리포좀 복합체를 통해 전달된 게피티닙 (이레사(등록상표))은 '유리' 형태로 전달될 경우보다 세포 치사에 대해 유의하게 더 큰 효과를 보였다. TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표))가 유리 소분자에 비해 1.7배의 개선을 보였다.
TfRscFv/LipA/게피티닙 (이레사(등록상표))에 의한 화학감작
종양 세포를 1차 화학요법제에 대해 감작시키는, '유리' 형태로 또는 리포좀 복합체를 통해 전달된 게피티닙 (이레사(등록상표)) (scL-이레사(등록상표))의 능력도 XTT 분석에 의해 평가하였다 (도 46A-C). 3가지의 상이한 인간 암 세포주를 8-15 μM 유리 또는 복합체화된 게피티닙 (이레사(등록상표))으로 처리한 후, 증가하는 용량의 화학요법제를 첨가하였다. 각각의 복합체 내의 게피티닙 (이레사(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7 (1:1과 동등함)이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 도 46A에 나타낸 바와 같이, 12 μM 게피티닙 (이레사(등록상표)) 농도에서, 게피티닙 (이레사(등록상표)) 리포좀 복합체 (scL-이레사(등록상표))에 의해 전달될 때 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))로서 투여된 경우에 비해 화학요법제 탁소테레에 대한 반응이 2배를 초과하여 증가하였다.
유사하게, 인간 흑색종 세포 (MDA-MB-435)에서, 15 μM에서 리포좀 복합체에 의해 전달된 게피티닙 (이레사(등록상표)) (scL-이레사(등록상표))는 세포를 화학요법제에 대해 감작시키지 못하는 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))에 비해 탁소테레에 대한 세포의 반응을 2.2배 향상시켰다 (도 46B). 각각의 복합체 내의 게피티닙 (이레사(등록상표)) 대 LipA의 몰비 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다.
또한, 게피티닙 (이레사(등록상표))의 리포좀 복합체 전달 효과도 인간 전립선암 세포주 DU145에서 평가하였다. 각각의 복합체 내의 게피티닙 (이레사(등록상표)) 대 LipA의 몰비는 7 대 7이었다. 각각의 복합체 내의 단일쇄 항체 단편 대 리포좀의 비율은 1:30 (w:w)이었다. 다른 종양 세포에서 관찰된 바와 같이, 게피티닙 (이레사(등록상표))이 본 발명의 리포좀 복합체 (scL-이레사(등록상표))를 통해 전달될 때 화학요법제 미톡산트론에 대한 감수성 수준이 유의하게 증가하였다 (도 46C). 8 μM에서, 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))에서 관찰된 것에 비해 리포좀 복합체화된 게피티닙 (이레사(등록상표))를 사용한 경우에 미톡산트론에 대한 DU145의 반응이 거의 5배 증가하였다.
따라서, 여기서 다시 선행 실시예의 다른 소분자처럼, 본 발명자들은 다수의 종양 세포 종류에서 다양한 화학요법제를 사용하여 소분자 게피티닙 (이레사(등록상표))의 전달 및 효능은 소분자가 본 발명의 복합체에 봉입될 경우에 향상됨을 밝혀내었다. 유리 게피티닙 (이레사(등록상표))에 비해 본 발명에서 설명된 바와 같이 복합체화된 게피티닙 (이레사(등록상표))에 대해 보다 더 감작화되는, 본 실시예에서 제시된 3가지 종양 종류는 상기 소분자의 사용이 유용한 것으로 밝혀진 종양 종류가 아니기 때문에, 상기 종양 세포가 본 발명에 잘 반응한다는 것은 놀라운 발견이다.
참조문헌
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Figure 112008085585654-pct00007
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추가의 인용 문헌
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Figure 112008085585654-pct00011
Figure 112008085585654-pct00012
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본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 당업자의 기술 수준을 나타내고, 각각의 개별적인 간행물, 특허 및 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시되는 것과 같은 정도로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Georgetown University Synergene Therapeutics, Inc. CHANG, Esther H. PIROLLO, Kathleen F. <120> Preparation of Antibody or an Antibody Fragment-Targeted Immunoliposomes for Systemic Administration of Therapeutic or Diagnostic Agents and Uses Thereof <130> 2474.002PC06 <140> PCT/US2007/011407 <141> 2007-05-11 <150> US 60/800,163 <151> 2006-05-15 <150> US 60/844,352 <151> 2006-09-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HER-2 antisense oligonucleotide <400> 1 tccatggtgc tcact 15 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HoKC peptide chemically synthesized <400> 2 Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys 1 5 10 15 Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Lys Lys His Lys Lys Cys 20 25 30

Claims (66)

  1. (a) 항-트랜스페린 수용체 단일쇄 Fv (TfRscFv) 항체 단편을 제조하는 단계,
    (b) 상기 항체 단편을, 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 콜레스테롤의 혼합물; 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 포함하는 양이온성 리포좀과 혼합하여 양이온성 면역리포좀을 형성하는 단계, 및
    (c) 상기 양이온성 면역리포좀을, 2,3-디히드로-2-(2'-메틸(1,1'-비페닐)-4-일)-6-니트로-4(1H)-퀴나졸리논(GMC-5-193), 이마티닙 메실레이트, 에를로티닙 히드로클로라이드, 수니티닙 말레이트 및 게피티닙으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 소분자 억제제와 혼합하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 양이온성 면역리포좀은 상기 소분자 억제제와 4:7 내지 14:7 (소분자 억제제:리포좀) 범위의 몰비로 혼합되고, 상기 항체 단편은 상기 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합되지 않는 것인,
    항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체의 제조 방법.
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  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 단편이 상기 양이온성 리포좀과의 혼합 이전에 카르복시 말단에 시스테인 부분을 포함하는 것인 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 단편이 상기 양이온성 리포좀과 1:20 내지 1:40 (w:w) 범위의 비율로 혼합되는 것인 방법.
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  11. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 면역리포좀이 상기 소분자 억제제와 5:7 내지 14:7 (소분자 억제제:리포좀) 범위의 몰비로 혼합되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 면역리포좀이 상기 소분자 억제제와 7:7 (소분자 억제제:리포좀)의 몰비로 혼합되는 것인 방법.
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  19. 제1항의 방법으로 제조된 양이온성 면역리포좀 복합체.
  20. 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 콜레스테롤의 혼합물; 디올레오일트리메틸암모늄 포스페이트와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민 및 콜레스테롤의 혼합물; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 콜레스테롤의 혼합물; 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드와 디올레오일포스파티딜에탄올아민의 혼합물을 포함하는 양이온성 리포좀;
    항-트랜스페린 수용체 단일쇄 Fv (TfRscFv) 항체 단편; 및
    2,3-디히드로-2-(2'-메틸(1,1'-비페닐)-4-일)-6-니트로-4(1H)-퀴나졸리논(GMC-5-193), 이마티닙 메실레이트, 에를로티닙 히드로클로라이드, 수니티닙 말레이트 및 게피티닙으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 소분자 억제제를 포함하고,
    여기서 상기 소분자 억제제 및 상기 양이온성 리포좀은 4:7 내지 14:7 (소분자 억제제:리포좀) 범위의 몰비로 존재하며, 상기 항체 단편은 상기 양이온성 리포좀에 화학적으로 접합되지 않은 것인, 항체 단편-표적화 양이온성 면역리포좀 복합체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 소분자 억제제가 상기 양이온성 리포좀 내에 봉입된 것인 양이온성 면역리포좀 복합체.
  22. 제20항에 있어서, 상기 소분자 억제제가 상기 양이온성 리포좀의 탄화수소쇄 영역 내에 함유된 것인 양이온성 면역리포좀 복합체.
  23. 제20항에 있어서, 상기 소분자 억제제가 상기 양이온성 리포좀의 내부 또는 외부 단층과 회합된 것인 양이온성 면역리포좀 복합체.
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  26. 삭제
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  28. 제20항에 있어서, 상기 항체 단편 및 상기 양이온성 리포좀이 1:20 내지 1:40 (w:w) 범위의 비율로 존재하는 것인 양이온성 면역리포좀 복합체.
  29. 삭제
  30. 제20항에 있어서, 상기 소분자 억제제 및 상기 양이온성 리포좀이 5:7 내지 14:7 (소분자 억제제:리포좀) 범위의 몰비로 존재하는 것인 양이온성 면역리포좀 복합체.
  31. 제20항에 있어서, 상기 소분자 억제제 및 상기 양이온성 리포좀이 7:7 (소분자 억제제:리포좀)의 몰비로 존재하는 것인 양이온성 면역리포좀 복합체.
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  40. 제19항 또는 제20항의 양이온성 면역리포좀 복합체를 포함하는, 암으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 정맥내 투여되는 제약 조성물.
  42. 제40항에 있어서, 종양내, 병변내, 분무, 경피, 내시경하(endoscopic), 국소, 경구, 및 피하 투여로 이루어지는 군 중에서 선택되는 경로를 통해 투여되는 제약 조성물.
  43. 제40항에 있어서, 독소루비신, 미톡산트론, 탁소테레 및 시스플라틴(CDDP)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화학요법제와 함께 투여되는 제약 조성물.
  44. 삭제
  45. 제43항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 후에 전달되는 것인 제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하고 적어도 12시간 후에 전달되는 것인 제약 조성물.
  47. 제43항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 전에 전달되는 것인 제약 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하기 적어도 12시간 전에 전달되는 것인 제약 조성물.
  49. 독소루비신, 미톡산트론, 탁소테레 및 시스플라틴(CDDP)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화학요법제와 함께 투여되는 제19항 또는 제20항의 양이온성 면역리포좀 복합체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  50. 삭제
  51. 제49항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 후에 전달되는 것인 제약 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하고 적어도 12시간 후에 전달되는 것인 제약 조성물.
  53. 제49항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 전에 전달되는 것인 제약 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 화학요법제가 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하기 적어도 12시간 전에 전달되는 것인 제약 조성물.
  55. 제40항에 있어서, 방사선 요법과 함께 투여되는 제약 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 방사선 요법이 감마선 조사, X선, UV 조사, 마이크로파 및 전자 방출로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  57. 제55항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 후에 수행되는 것인 제약 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하고 적어도 12시간 후에 수행되는 것인 제약 조성물.
  59. 제55항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 전에 수행되는 것인 제약 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하기 적어도 12시간 전에 수행되는 것인 제약 조성물.
  61. 방사선 요법과 함께 투여되는 제19항 또는 제20항의 양이온성 면역리포좀 복합체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 방사선 요법이 감마선 조사, X선, UV 조사, 마이크로파 및 전자 방출로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
  63. 제61항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 후에 수행되는 것인 제약 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하고 적어도 12시간 후에 수행되는 것인 제약 조성물.
  65. 제61항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체의 투여 전에 수행되는 것인 제약 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 방사선 요법이 양이온성 면역리포좀 복합체를 투여하기 적어도 12시간 전에 수행되는 것인 제약 조성물.
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