CN111093810A - 在抗体药物缀合物偶联后的未结合药物的除去 - Google Patents
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Abstract
在本文中公开了含有生物大分子产物以及要从产物流中分离的物质的产物流(3)的超滤和纯化单元(1)，其包含至少一个毛细管超滤模块(2)，其特征在于‑至少一个泵(4)将产物流输送到所述至少一个毛细管超滤模块的毛细管中，‑至少一个正排量泵(5)从毛细管输送产物流和‑至少一个附加泵(6)在毛细管的外侧传送洗涤流体(9)，‑所述单元不包括用于将产物流和洗涤流体循环到超滤模块中的措施，以及至少一个保护过滤器(8)，朝产物流的方向离开所述至少一个毛细管超滤模块的所有流体经过其中。
Description
抗体可在体内选择性识别非常特异性的结构并与它们相互作用和结合的事实使得它们在用于将活性物质直接传送到疾病的精确病灶方面有吸引力。
抗体药物缀合物（ADCs）包含共价连接到高效药物上的抗体。对于该连接，可以使用各种缀合（conjugation）技术。作为疗法，ADCs将抗体的精妙特异性（以能够区分健康组织和患病组织）与药物，例如细胞毒性药物的细胞杀伤能力相结合。换言之，抗体例如用于将细胞毒性物质直接传送到癌细胞并在细胞内释放它。由此健康细胞在很大程度上免受使用传统化疗法时发生的毒副作用。
详细地，ADCs由三种不同组分构成：抗体、药物，例如细胞毒性活性成分（毒簇（toxophore））和连接抗体和毒簇的所谓“连接基”。抗体识别并结合至肿瘤细胞表面上的某些蛋白质分子（“肿瘤标志物”）。这种结合过程触发将ADC传送到细胞内的机制，其中药物（例如毒簇）与抗体分离并可作用于癌细胞，例如通过阻断重要的细胞功能，由此引起程序性细胞死亡（凋亡）。因此，对于采用ADCs的疗法的成功而言至关重要的是，缀合物在体内经过时不丢失其缀合的药物，并且直到其在癌细胞内时才释放它。因此以只能在癌细胞内断裂的方式设计“连接基”。
但是，在抗体与药物偶联的过程中，总是生成正确缀合的抗体药物缀合物以及未结合药物的混合物。因此，在使用ADCs之前，这种含有抗体-药物缀合物以及未结合药物的溶液需要在严格条件下纯化以使未结合药物的含量最小化。
通过含有抗体-药物缀合物以及未结合药物的溶液的使用高渗滤因子的分批渗滤实现这种严格纯化。
ADC复合物通常需要小心处理以防止该复合物受损，如碎片化（fragmentation）和/或形成聚集体，例如在储存时形成亚可见粒子。因此较短处理时间可以有益于ADC复合物的稳定性。这些可通过较大的膜面积实现。但是，这种措施会导致较高的泵速率和可能导致较低的收率。此外，扩大规模可以一方面会带来由于混合不足而发生产物与未结合药物的不充分分离的风险，另一方面避免上述缺点的较高混合率造成ADC复合物受损。
为了实现更灵活的生产方法，这种将未结合药物与ADCs分离的步骤应该理想地在各种工艺条件下可靠和稳健以及容易扩大规模。
因此，本发明的一个目的是提供更灵活的生产方法，其中将未结合药物与ADCs分离的步骤应该理想地在各种工艺条件下可靠和稳健以及容易扩大规模。
通过提供一种产物流(3)的超滤和纯化单元(1)实现这一目的，所述产物流(3)含有生物大分子产物以及要从产物流中分离的物质，所述单元(1)包含至少一个毛细管超滤模块(2)，其特征在于
- 至少一个泵(4)将产物流输送到所述至少一个毛细管超滤模块的毛细管中，
- 至少一个正排量泵(5)从毛细管输送产物流和
- 至少一个附加泵(6)在毛细管的外侧传送洗涤流体(9)，
- 所述单元不包括用于将产物流和洗涤流体循环到超滤模块中的措施，以及
- 至少一个保护过滤器（guard filter）(8)，朝产物流的方向离开所述至少一个毛细管超滤模块的所有流体（= 超滤渗余物）经过其中。
所述单元的效果在于其可靠地确保在低剪切力下分离要从产物流中分离的物质由此避免在长时间储存时形成亚可见粒子和形成聚集体的风险。情况确实如此，因为具有上述特征的所述至少一个毛细管超滤模块通常已可靠地除去所有要从产物流中分离的物质。此外，保护过滤器充当防备措施（safeguard）以确保一旦渗余物离开所述至少一个保护过滤器，要从产物流中分离的物质的浓度低于给定阈值。
换言之，在包含抗体药物缀合物（作为生物大分子产物）以及毒簇（作为要从产物流中分离的物质）的产物流的情况下，如本文所述的超滤和纯化单元可靠地确保未结合毒簇与产物流中的抗体药物缀合物分离，同时避免在长时间储存时形成亚可见粒子和形成聚集体的风险。
通过一个或多个如上文详述装配的超滤模块和至少一个充当对任何剩余未结合药物粒子的防备措施（safeguard）的保护过滤器的组合实现这一效果。
本文所用的术语“保护纯化器”与术语“保护过滤器”同时使用并且是指适用于除去要从产物流中分离的物质（例如通过与它结合）的过滤器。保护过滤器不是色谱基质。
本文所用的术语“抗体-药物缀合物（ADC）”是指包含至少一种抗体、至少一种药物和至少一种将抗体与药物连接的“连接基”的复合物。
本文所用的术语“药物”、“治疗剂（therapeutic）”、“活性剂”是指为诊断或治疗目的，包括疾病或感染的治疗、医学成像、监控、避孕、美容、营养保健、制药和预防用途给药于生物体的任何分子、分子复合物或物质。术语“药物”包括化学改性和/或可操作地连接到生物或生物相容结构上的任何这样的分子、分子复合物或物质。术语“前药”是指直到在体内转化成其治疗活性或可利用形式才有完全活性或可利用的药物、药物前体或改性药物。
本文所用的术语“要从产物流中分离的物质”是指例如由于所述物质对生物体或环境具有有害作用而要从最终产物中净化的物质。但是，可能出于其它原因从最终产物中净化“要从产物流中分离的物质”。
本文所用的术语“产物流”是指经过本文所述的超滤和纯化单元的包含生物制药用生物大分子产物的流体。换言之，在进入超滤和纯化单元前，产物流也可被称为进料，并且在离开超滤和纯化单元后，产物流也可被称为渗余物。
“要从产物流中分离的物质”的一个实例是毒簇。
本文所用的术语“毒簇”是指在给药于细胞时产生毒性作用的化学基团。
换言之，活性物质可以例如是原子，如放射性试剂 – 例如钍同位素 – 或抗有丝分裂剂。
因此本领域技术人员立即认识到，本文所述的用于抗体-药物-缀合物的方法和装置也适用于靶向的钍缀合物（TTC）。
在一些实施方案中，要从产物流中分离的物质是毒簇以及其它物质，例如连接基和/或螯合剂。
本文所用的术语“单元”或“单元操作”是指在生物大分子产物的生产方法中执行一个工艺步骤的装置或装置组合。换言之，为了提供最终生物大分子产物，产物流必须经过几个单元。
本文所用的术语“亚可见粒子”是指尺寸为0,1 µm – 100 µm的蛋白质粒子和非蛋白质粒子。
本文所用的术语“超滤”是指无论单个组分（例如产物）的浓度是否改变，涉及基于它们的分子大小除去或分离溶液的组分（可渗透分子，如盐、小蛋白、溶剂等）的方法。对于这种方法，使用对1至100000 Da之间的分子可渗透的过滤器。施加力，例如压力以驱动超滤过程。
优选使用对1至1000 Da之间的分子可渗透，更优选对1至10.000 Da之间的分子可渗透，最优选对1至30.000 Da之间的分子可渗透的过滤器。
本文所用的术语“渗滤”是指一种特定类型的超滤，其中交换悬浮液的缓冲液或改变盐浓度，但或多或少地保持悬浮液中所含的产物浓度。如果分批处理是用于渗滤，不断将溶剂添加到渗余物中直至经由过滤膜替换之前的溶剂。通过扩散和一种单独的力（separate force）或几种单独的力（separate forces），例如压力的组合驱动这种溶剂替换，即总质量传递。
本文所用的术语“渗析”是指仅通过其扩散速率的差异分离溶液中的分子而不施加任何其它力如压力的过程。但是，如果在过滤膜的两侧上要分离的分子的浓度差变得太大，可发生从过滤膜的一侧到另一侧的净流。由所述净流生成的力可导致由于它们的分子量应该被截留的分子穿过过滤膜。因此，这种净流可导致渗余物中存在不想要的分子或如果产物被转移到渗透物中，可导致产物损失。此外，净流不利地影响必须朝净流的相反方向移动的分子的交换速率。因此，渗析在分批生产法中通常受到尚未造成净流的最大浓度差限制。
因此，如果希望在膜各侧之间实现小分子的高效交换，在本文所述的超滤和纯化单元中穿过膜的净体积流尽可能最小化，以如在渗析法中那样，传输尽可能通过扩散发生。特别在以最多1至5的因子，优选以1至2的因子，特别优选以1的因子发生非渗透物质的稀释或浓缩时实现扩散传输。
本文所用的术语“毛细管超滤模块”是指包含毛细管作为膜过滤器和/或平板膜作为膜过滤器的超滤模块。
因此，毛细管超滤模块也可仅包含毛细管作为膜过滤器或仅包含平板膜作为膜过滤器，或包含毛细管膜过滤器和平板膜作为膜过滤器。
为了更换毛细管超滤模块，通常中断产物流并且临时袋（interim bag）在更换持续期间顶替。
通过使用无菌过滤单元进一步降低生物负荷，可以改进特定模块的寿命以使中断和产物流在更换持续期间捕获（= 存储）在临时袋中是合理的。
本文所用的术语“生物大分子产物”是指通常通过较小亚基（单体）的聚合制成的大生物分子，如生物聚合物。实例包括通常通过较小亚基（单体）的聚合制成的核酸、肽蛋白、碳水化合物、多酚，如蛋白质。
本文所用的术语“肽”是指相对较短长度的氨基酸（例如小于50个氨基酸）的聚合物。该聚合物可以是线性或支化的，其可包含修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。该术语还包含已修饰的氨基酸聚合物；例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分，例如但不限于荧光标记物、粒子、生物素、珠粒、蛋白质、放射性标记、化学发光标签、生物发光标签等缀合。
本文所用的术语“蛋白质”是指氨基酸的多肽。该术语包含可为全长、野生型的蛋白质或其片段。蛋白质可以是人的、非人的，和相应天然存在氨基酸的人工或化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
该蛋白质优选是治疗用蛋白质。
本文所用的术语“治疗用蛋白质”是指可给药于生物体以引起所述生物体的组织、器官或系统的生物或医学响应的蛋白质。
在一个优选实施方案中，生物大分子产物是在生物源中制造、从生物源中提取或由生物源半合成的生物，即制药药品。
甚至更优选地，该蛋白质是抗体。
本文所用的术语“抗体”是指结合分子，如免疫球蛋白或免疫球蛋白的免疫活性部分，即含有抗原结合部位的分子。
本文所用的术语“小分子药物”是指可有助于调节生物过程的低分子量（<900道尔顿）化合物。
本文所用的术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。除非明确限制，该术语包含含有具有与参考核酸类似的结合性质并以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢的天然核苷酸类似物的核酸。除非另行指明，特定核酸序列除明确指出的序列外也隐含地包含其保守修饰变体（例如简并密码子取代）和互补序列。
在本文所述的超滤和纯化单元的优选实施方案中，保护过滤器是可结合要从产物流中分离的物质的深度过滤器（depth filter），和/或可结合要从产物流中分离的物质的柱。
在优选实施方案中，保护过滤器是活性炭深度过滤器。
活性炭深度过滤器的一个实例是来自Merck Millipore的MCR4023CL3 Millistak+®深度过滤器。
本发明的发明人首次想出在超滤（和纯化）单元中使用活性炭深度过滤器而不是代替或补充色谱纯化或借助膜吸收器纯化的可能性。
换言之，用于生产蛋白质如抗体的典型下游方法包含下列步骤：
1. 捕获色谱法
2. 病毒灭活
3. 色谱中间和精细纯化
4. 超滤（尺寸排阻步骤）
5. 经由渗滤的缓冲液更换
6. 病毒过滤
其因此不包含在超滤过程中使用活性炭深度过滤器。
因此，在渗滤的非色谱生产步骤中使用活性炭深度过滤器能够生成高质量标准产物，同时具有进一步的益处。益处之一在于，如本文所述的包含活性炭深度过滤器的超滤和纯化单元可以比包含其它纯化装置，例如色谱基质，即与要被所述色谱基质截留的蛋白质相互作用的固体载体材料的超滤和纯化单元更容易灭菌。此外，本文所述的包含活性炭深度过滤器的超滤和纯化单元的组装没有包含其它纯化装置，例如色谱基质的超滤和纯化单元的组装麻烦和耗时。在本文所述的超滤和纯化单元的一个优选实施方案中，该单元是用于连续超滤和连续纯化的单元。
本文所用的术语“连续”是指超滤和纯化单元的产物流输入和产物流从超滤和纯化单元的除去无中断进行的事实。换言之，后续单元操作可在第一单元操作已结束处理产物流之前开始处理产物流。
本文所用的术语“分批”是指通常各个生产周期以分批方式不连续操作的事实，在一个生产周期完成后除去所有产物。为了再生产，随后必须启动单独的新生产周期/批次。
高度管制的制药生产在时间、技术和人员方面需要巨大的努力以提供清洁和无菌的设施，从而确保无菌产品。此外，为了可靠地避免在多用途系统中的产品切换时或在两个产品批次之间的交叉污染，非常复杂的清洁验证是强制性的，这又在时间和人员方面需要巨大的努力。因此，用于生产ADCs的连续方法是有利的。
原则上，使用高渗滤因子分批渗滤含有抗体药物缀合物以及未结合药物的溶液的目前使用的方法可以交替模式进行，以模拟具有批处理步骤的连续法。换言之，为了实现连续产物流，可以交替模式使用两个分批渗滤，即在第一渗滤单元中进行渗滤的同时，通过调节参数如缓冲液浓度、ADC浓度和流量使第二单元准备好渗滤。在具体预定时间后，将处理从第一渗滤单元切换到第二单元，并再生第一渗滤单元并通过调节必要的参数再为渗滤做准备。因此，可以实现恒定产物流。
但是，使用这种方法可以不利地影响产品质量，因为高洗涤率造成较长处理时间、较高输入搅拌能量和较高泵速率，并因此最终造成较高程度的剪切力。因此，所有这些因素都有可能破坏脆弱的ADC复合物，以造成在长时间储存时形成亚可见粒子和形成聚集体的风险。
相反，所述超滤和纯化单元能使超滤模块的运行模式不同于典型的超滤模块，区别在于
a) 没有置于指定容器中的产物溶液
b) 没有经超滤膜循环泵送产物流。
相反，所述单元实现真正连续运行模式，因为产物流连续进入该单元，连续除去洗涤流体，并且产物流和洗涤流体的各部分分别仅经过毛细管超滤模块一次。
此外，所述超滤和纯化单元能使超滤模块的运行模式不同于典型渗析，因为至少一个正排量泵从毛细管输送产物流。这种至少一个正排量泵生成在典型渗析中不存在的正压或负压，因为典型渗析仅依赖于扩散。因此，正排量泵确保产物流进入超滤和纯化单元的速率在渗余物离开超滤和纯化单元的速率的± 20%的范围内，即相似，或相等。这种布置因此使从毛细管内部，即从过滤膜的一侧，到毛细管外部，即到过滤膜的一侧的不想要的净流最小化，或反之亦然。由于这种调节，要经由过滤膜交换的分子的浓度可在很大程度上不同而不发生不想要的净流，因为从毛细管内部到毛细管外部的流动不像渗析中的情况那样仅归因于扩散。
本文所用的术语“净流”是指从毛细管内部，即从过滤膜的一侧，到毛细管外部，即到过滤膜的一侧或反过来的对流。因此净流不基于扩散。
在优选实施方案中，产物流进入超滤和纯化单元的速率在渗余物离开超滤和纯化单元的速率的± 20%的范围内，更优选在± 10%的范围内，最优选在± 5%的范围内，或与渗余物离开超滤和纯化单元的速率相等。
在超滤和纯化单元的进一步优选的实施方案中，生物大分子产物是ADC。
在超滤和纯化单元的进一步优选的实施方案中，要从产物流中分离的物质是毒簇。
在超滤和纯化单元的进一步优选的实施方案中，本文所述的超滤和纯化单元是用后可弃的和/或一次性使用的。
无菌性的维持对生物制药产物和生物大分子产物的(半)连续生产构成挑战。因此，优选地，在所述超滤和纯化单元中，所有组件通过管材，特别是用后可弃的管材连接在一起。例如，使用生物相容管材Pharmed BPT®（耐热硅酮管）。该装置的其它组件也优选是用后可弃的组件；特别地，使用选自用后可弃的过滤元件、用后可弃的阀、用后可弃的传感器（流量、pH、电导率、UV、压强）、用后可弃的管材、用后可弃的膜、用后可弃的连接器、用后可弃的容器和用后可弃的取样系统的组件。用于输送液体的装置，特别是泵也优选是用后可弃的泵。
优选的洗涤流体，如配制缓冲液，例如pH大约6,8-7,5的包含氯化钠、Tris等的水溶液是本领域中已知的。
在超滤和纯化单元的进一步优选的实施方案中，要从产物流中分离的物质是毒簇，并以根据提供给定毒簇的推荐每日剂量的International Council forHarmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use(ICH)的指南确定的比率清除所述毒簇。
在另一个方面中，本发明涉及一种连续超滤和连续纯化含有生物大分子产物以及要从产物流中分离的物质的产物流的方法，其特征在于
- 经由毛细管超滤模块的至少一个毛细管超滤膜用洗涤流体洗涤产物流，
- 将产物流输送到毛细管中和在毛细管的外侧输送洗涤流体，
- 将产物流和洗涤流体连续供入毛细管超滤模块并从毛细管超滤模块中连续除去，
- 产物流和洗涤流体不循环到毛细管超滤模块中
- 调节产物流的除去以使产物流进入超滤和纯化单元的速率在渗余物离开超滤和纯化单元的速率的± 20%的范围内或与之相等以确保没有不想要的净流可以从毛细管内部传送到毛细管外部或反之亦然。
- 朝产物流的方向离开所述至少一个毛细管超滤模块的所有流体经过至少一个保护过滤器。
特征“产物流和洗涤流体不循环到毛细管超滤模块中”是由连续超滤和连续纯化方法的设计和布置带来的内在特征，因为产物流的每一部分仅经过毛细管超滤模块的毛细管超滤膜一次。
通过提供至少一个从毛细管输送产物流的正排量泵，如蠕动泵实现特征“调节产物流的除去以使没有不想要的净流可以从毛细管内部传送到毛细管外部或反之亦然（即从毛细管过滤膜的一侧到毛细管过滤膜的另一侧）”。或者可以使用控制阀和/或流量控制以确保调节产物流的除去以使没有不想要的净流可以从毛细管内部传送到毛细管外部或反之亦然。
在再一个方面中，本发明涉及一种生产装置，其包含至少一个如本文所述的连续超滤和纯化单元。
优选地，所述生产装置是在生物大分子产物的生产中用于连续或半连续实施一个或多个生产步骤的生产装置。
由于本文所述的超滤和纯化单元实现真正连续超滤和纯化的事实，所述单元也能在生产方法中连续生产抗体药物缀合物，其中一部分产物流连续进入，且另一部分产物流连续离开特定单元操作，如本文所述的超滤和纯化单元。换言之，后续单元操作在第一单元操作已结束处理产物流之前开始处理产物流。
但是，如上所述，也有可能在半连续或分批法中使用该超滤和纯化单元。如果在这样的布置中，例如，产物是抗体-药物缀合物并且要从产物流中除去毒簇，在本文所述的超滤和纯化单元之前可存在收集槽（holding tank），并且渗余物可收集在另一收集槽中。
所述生产步骤可以例如选自：细胞培养、细胞截留、色谱法、病毒灭活。
优选地，在所述生产装置中，所有组件通过管材，特别是用后可弃的管材连接在一起。例如，使用生物相容管材Pharmed BPT®（耐热硅酮管）。该装置的其它组件也优选是用后可弃的组件；特别地，使用选自用后可弃的反应器、用后可弃的过滤元件、用后可弃的阀、用后可弃的传感器（流量、pH、电导率、UV、压强）、用后可弃的细胞截留系统、用后可弃的管材、用后可弃的膜、用后可弃的连接器、用后可弃的色谱柱、用后可弃的容器和用后可弃的取样系统的组件。用于输送液体的装置，特别是泵也优选是用后可弃的泵。
在另一个方面中，本发明涉及使用如本文所述的产物流的至少一次连续超滤和连续纯化（渗滤）连续、病菌减少地（germ-reduced）生产和/或处理抗体-药物-缀合物的方法，其中所述方法以封闭和模块化方式进行。
本文所用的术语“封闭”是指以流体流不暴露于室内环境的方式运行所述方法。材料、物体、缓冲液等可从外部加入，但是其中这种添加以避免流体流暴露于室内环境的方式进行。因此，可以使用无菌过滤器提供与环境中的污染物的有效阻隔。封闭系统的实例包括配有集成无菌连接装置的无菌一次性使用的袋。此外，可以打开工艺系统但通过适当或与工艺要求（无论是灭菌（sterile）、无菌（aseptic）或低生物负荷）相符的清洁、消毒和/或灭菌法“使其封闭”。实例包括可在使用之间CIP’d和SIP’d的工艺容器。如果在特定系统布置的过程中采用适当措施，也可在低生物负荷操作中使非无菌系统，如色谱系统或一些过滤系统封闭。本文所用的术语“封闭”是指“功能封闭”以及“封闭”系统，并且如上文规定，通常是指所述方法以流体流不暴露于室内环境的方式运行的事实。
本文所用的术语“病原体减少”与“微生物减少”和“病菌减少（germ-reduced）”可互换使用并且是指借助合适的病菌减少（germ-reducing）方法可实现的病原体计数减少，例如病毒计数减少，即接近0的每单位面积或单位体积的病原体计数的状态，其中这种病菌减少方法可选自γ辐照、β辐照、高压灭菌、环氧乙烷（ETO）处理、臭氧处理、"Steam-In-Place"（SIP）和/或Heat in Place处理或用消毒剂如1 M NaOH处理。
为了提供生物大分子产物——在这一实例中，对产物流施以如本文所述的超滤和纯化，即经由毛细管超滤模块的至少一个毛细管超滤膜用洗涤流体洗涤产物流，其中将产物流输送到毛细管中和在毛细管的外侧输送洗涤流体，和将产物流和洗涤流体连续供入毛细管超滤模块并从毛细管超滤模块中连续除去，和产物流和洗涤流体不循环到毛细管超滤模块中，和调节产物流的除去以使没有不想要的净流可以从毛细管内部传送到毛细管外部或反之亦然，和朝产物流的方向离开所述至少一个毛细管超滤模块的所有流体经过至少一个保护过滤器。为了将产物流（= 进料流）输送到毛细管中和在超滤模块的毛细管的外侧输送洗涤流体（= 渗透物），在每种情况下使用一个泵。为了从毛细管中受控除去产物流（= 渗余物），使用另一个泵。通过使用这个泵（= 渗余物泵），简化对渗余物的除去的控制。这是有利的，因为没有可靠地测量在这种连续法中通常使用的低流量（≤ 100 ml/min）的足够的流量传感器。特别优选地，在此可以使用蠕动泵，其优点在于用后可弃的蠕动泵可商购获得，因此可提供无菌性和用后可弃的技术。此外，泵用于受控除去洗涤流体（渗透物）。
附图
图1显示如本文所述的超滤和纯化单元(1)的示意图。详细地，所述超滤和纯化单元(1)包含一个毛细管超滤模块(2) – 在此是具有允许1-10.0000 Da的分子经过的毛细管的Gambro Polyflux® 2H、将产物流(3) – 在这一实例中产物流包含抗体药物缀合物以及未结合的毒簇 – 输送到毛细管中的一个泵(4)、从超滤模块(2)的毛细管中输送产物流的一个正排量泵(5)、在毛细管的外侧传送洗涤流体– 在这种情况下是渗滤缓冲液(9)–的两个泵(6、7)，和一个活性炭深度过滤器(8)，朝产物流的方向离开所述至少一个毛细管超滤模块的所有流体– 即渗余物(13) – 经过其中。术语渗余物是指离开超滤和纯化单元的产物流和离开活性炭深度过滤器的产物流。离开毛细管超滤模块(2)的渗滤缓冲液含有未结合毒簇，即构成这一实例中的渗透物(10)。在这一具体设置中，产物流以10 ml/min的速率进入超滤和纯化单元(1)。这也是产物流经过活性炭深度过滤器(8)的速率。渗滤缓冲液(9)以30 ml/min的速率进入和离开毛细管超滤模块(2)。因此，在这种情况下使产物流和毒簇分离的驱动力是能够穿过毛细管超滤模块的毛细管中的过滤膜的粒度、产物流和渗滤缓冲液之间的流量差（其造成压力），以及梯度差（例如产物流和渗滤缓冲液之间的梯度差）。
图2对应于图1，但除图1的细节外还描绘了在产物流进入超滤和纯化单元之前提取样品(11)的点。在渗余物(13)进入活性炭深度过滤器(8)之前提取第二样品(12)，并在渗余物(13)经过活性炭深度过滤器(8)之后提取最终样品(14)。
图3显示在产物流（进料）(3)进入超滤和纯化单元之前、在产物流（渗余物）(13)进入活性炭深度过滤器(8)之前和在产物流(13)离开活性炭深度过滤器之后以十亿分率（ppb）计的毒簇浓度的示意图。据描绘，活性炭深度过滤器进一步降低在产物流进入活性炭深度过滤器之前已低于临界浓度的产物流的毒簇浓度。
图4布置如上面对图2所述，但产物流在进入活性炭深度过滤器之前掺入附加的毒簇负荷(15)以证实活性炭深度过滤器可充当防备措施以确保一旦产物流离开超滤和纯化单元，毒簇浓度低于临界阈值。
实施例
1) 使用包含毒簇的产物流的示例性操作模式
为了证实如本文所述的超滤和纯化单元可靠和有效地从包含毒簇和抗体-毒簇缀合物的产物流中分离毒簇，进行下列实验。用5ml/min的产物流流量和15 ml/min的洗涤缓冲液流量运行如参考图2描绘和描述的超滤和纯化单元。在产物流进入超滤和纯化单元之前提取样品(11)。在渗余物进入活性炭深度过滤器(8)之前提取第二样品(12)，并在渗余物经过活性炭深度过滤器(8)之后提取最终样品(14)。如图3中所示，在产物流进入超滤和纯化单元之前提取的样品(11)中，毒簇浓度高于临界阈值。如图3中所示，在产物流经过活性炭深度过滤器之后提取的样品(14)中，毒簇浓度低于临界阈值。
2) 使用标志分子代替毒簇的示例性操作模式
游离毒簇是潜在危险的物质。因此，使用日落黄染料代替毒簇进行下列模型实验，由此避免可能与使用毒簇有关的任何风险。日落黄染料因此模拟游离毒簇的存在。
2.1 使用标志分子的一般设置
详细地，将标志分子日落黄（CAS 2783-94-0，Sigma Aldrich 465-223-25）掺入在pH5.5和电导率8.5 mS/cm的柠檬酸缓冲液/氯化钠缓冲液中包含单克隆抗体的产物流。单克隆抗体浓度为12.85 g/L，日落黄浓度为913 mg/L。
逆流渗滤的实验设置与图1中描绘的相同，只是不存在保护过滤器(8)。将中空纤维超滤膜模块（Revaclear 300，Gambro）连接到四个蠕动泵Masterflex Easy Load II。包含单克隆抗体的产物流进入膜模块底部的管腔侧。将产物流（= 进料流）和渗余物流（即离开本文所述的超滤和纯化单元后的产物流）设定为10 mL/min的相同流量。将渗滤缓冲液以60 mL/min的流量泵入膜模块的顶部壳侧并以大致相同的流量从模块中泵出以将壳侧入口的压强控制在100毫巴。
在进料入口和渗滤缓冲液入口使用Pendotech压力传感器。作为渗滤缓冲液，使用20 mM L Histidin、50 mM Arginin*HCl、50 mM Glycin，pH 4.8和5.5 mS/cm。
使用中央Siemens PCS7控制系统控制蠕动泵和压强。
结果（未显示）证实逆流渗滤在正常情况下可靠地从渗余物流中清除标志分子。
2.2. 使用保护过滤器的操作模式
在第二个实验中，再将日落黄掺入单克隆抗体溶液至11.7 g/L的单克隆抗体浓度和4.5 mg/L的日落黄浓度。
所得溶液经保护过滤器– 在此是Millistak木炭深度过滤器，MCR4023CL3型（过滤面积23cm²，滞留量22 mL） – 过滤以证实在上述渗滤(2.1)没有从工艺流中清除所有标志分子（即游离毒簇）的极不可能的情况下，保护过滤器可靠地结合该标志分子（即游离毒簇）。使用Masterflex Easy Load II泵作为工艺泵。在处理前，用渗滤缓冲液（上述）以6mL/min的流量预处理保护过滤器直至在排气出口不再可见空气。然后关闭排气出口并用650 mL渗滤缓冲液以23 mL/min冲洗过滤器。
在过滤器的出口提取40毫升样品。
| 样品编号 | mAB (g/L) | 日落黄 |
| 进料 | 11.7 | 4.5 |
| 1 | 2.3 | 0 |
| 2 | 10.6 | 0 |
| 3 | 11.3 | 0 |
| 4 | 11.4 | 0.3 |
| 5 | 11.5 | 0.2 |
以这种方式处理大约12升包含单克隆抗体和日落黄的产物流。使用UV 280nm测量法（DropSense 16，Trinian）测量在进入超滤和纯化单元时的产物流（= 进料流）中和在离开超滤和纯化单元时的产物流（即作为渗余物流）中的单克隆抗体浓度。渗余物浓度略微提高到14.45 g/L，这可由略慢的渗余物泵造成。
使用UVVIS光谱仪NanoDrop 2000c使用10 mm比色皿在481 nm下测量日落黄浓度。测得渗余物浓度为0.3 mg/L。
换言之，木炭深度过滤器可靠地结合标志分子（游离毒簇），因此适合作为用于包含游离毒簇的产物流的连续纯化和渗滤的保护过滤器。
总体而言，这能够实现从产物流中除去毒簇的连续和甚至更安全的方法。
Claims (9)
1.含有生物大分子产物以及要从产物流中分离的物质的产物流(3)的超滤和纯化单元(1)，其包含至少一个毛细管超滤模块(2)，其特征在于
- 至少一个泵(4)将产物流输送到所述至少一个毛细管超滤模块的毛细管中，
- 至少一个正排量泵(5)从毛细管输送产物流和
- 至少一个附加泵(6)在毛细管的外侧传送洗涤流体(9)，
- 所述单元不包括用于将产物流和洗涤流体循环到超滤模块中的措施，以及
至少一个保护过滤器(8)，朝产物流的方向离开所述至少一个毛细管超滤模块的所有流体（= 超滤渗余物）经过其中。
2.根据权利要求1的超滤和纯化单元，其中所述保护过滤器是可结合要从产物流中分离的物质的深度过滤器和/或可结合要从产物流中分离的物质的柱。
3.根据权利要求1-2的超滤和纯化单元，其中所述保护过滤器是活性炭深度过滤器。
4.根据根据前述权利要求任一项的超滤和纯化单元，其中所述单元是用于连续超滤和连续纯化的单元。
5.根据根据前述权利要求任一项的超滤和纯化单元，其中所述生物大分子产物是抗体-药物-缀合物。
6.根据前述权利要求任一项的超滤和纯化单元，其中要从产物流中分离的物质是毒簇。
7.根据前述权利要求任一项的超滤和纯化单元，其中所述单元是用后可弃的和/或一次性使用的。
8.连续超滤和连续纯化含有生物大分子产物以及要从产物流中分离的物质的产物流的方法，其特征在于
- 经由毛细管超滤模块的至少一个毛细管超滤膜用洗涤流体洗涤产物流，
- 将产物流输送到毛细管中和在毛细管的外侧输送洗涤流体，
- 将产物流和洗涤流体连续供入毛细管超滤模块并从毛细管超滤模块中连续除去，
- 产物流和洗涤流体不循环到毛细管超滤模块中
- 调节产物流的除去以使产物流进入超滤和纯化单元的速率在渗余物离开超滤和纯化单元的速率的± 20%的范围内或与之相等以确保没有不想要的净流可以从毛细管内部传送到毛细管外部或反之亦然
- 朝产物流的方向离开所述至少一个毛细管超滤模块的所有流体经过至少一个保护过滤器。
9.根据权利要求8的方法在连续、病菌减少地生产和/或处理抗体-药物-缀合物的方法中的用途，其中所述方法以封闭和模块化方式进行。
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