TW201311897A - 純質絲狀噬菌體及其生產方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關於已純化之絲狀噬菌體，以及許可高濃度絲狀噬菌體可再現性地純化之方法。

Description

純質絲狀噬菌體及其生產方法
本案請求美國臨時專利申請案第61/515,726號申請日2011年8月5日之優先權，該案全文係以引用方式併入此處。
本發明係有關於用於製備治療有效性藥學組成物之具有夠低濃度的宿主細胞污染物，諸如細菌性內毒素的絲狀噬菌體之組成物，及由該組成物製備的藥品及藥學組成物。本發明也係關於用以製造此等組成物之方法。
絲狀噬菌體已經崛起用作為神經退化病及病症的治療劑，包括帕金森氏病或對帕金森氏病易感(參考PCT專利公告案WO20100060073)，及於腦部及身體它處有澱粉樣蛋白斑形成為特徵的病症(例如參考美國專利公告案20110142803、美國專利公告案20090180991、及PCT專利公告案WO2008011503)。絲狀噬菌體也已經崛起用作為神經退化tau病的治療劑(參考PCT專利申請案第PCT/US2012/028762號，申請日2012年3月12日)。此等參考文獻也指出絲狀噬菌體可減低對神經退化tau病及/或斑塊形成病的易感性。此外，經基因改造來表現治療劑、抗原、或抗體的絲狀噬菌體也曾提示作為有用的治療劑。例如參考PCT專利公告案WO2002074243、WO2004030694、WO2007094003、及WO2007001302；及美國專利公告案US20020044922。
絲狀噬菌體係使用革蘭氏陰性細菌細胞作為生長宿主藉發酵製造。革蘭氏陰性菌係以複合生長培養基培養，該培養基通常係由動物血清製劑供應，含有醣類、胺基酸類、及生長因子。細菌性DNA及蛋白質為典型地連同噬菌體一起出現在發酵培養基的非期望污染物。又復，革蘭氏陰性菌產生內毒素，內毒素為任何治療劑內有毒且高度非期望的污染物，難以從絲狀噬菌體分離。美國食品藥物管理局(FDA)已經設定藥品中內毒素的最大容許量指南，係於5.0內毒素單位(EU)/千克體重/劑，針對鞘內注射藥品為0.2 EU/千克/劑。參考食品藥物管理局檢驗技術指南40號，1985年3月20日，可以檔名ucm07298.htm得自FDA網站ICECI/Inspections/InspectionGuides/InspectionTechnicalGuides子目錄(URL；http：//www.fda.gov/ICECI/Inspections/InspectionGuides/InspectionTechnicalGuides/ucm072918.htm)。因此，大規模經濟型純化絲狀噬菌體有關的困難問題是生技業日漸重要的課題。
發酵技術的進步已經大為提高可在任何給定組成物中製造的絲狀噬菌體濃度。但此種上游效率的增高已經導致下游加工處理上的困難。產生較高濃度的噬菌體要求較高濃度的細菌宿主，及併同地要求較高濃度的細菌性DNA、蛋白質及內毒素。噬菌體須從噬菌體生長於其中的細菌宿主及存在於發酵介質中的此等細菌性副產物分開來用作為治療性組成物。
絲狀噬菌體的提純程序典型地仰賴聚乙二醇(PEG)沈澱及藉超離心形成的氯化銫梯度。例如參考Sambrook J.及Russell D.W.「分子選殖，實驗室手冊」，第三版(2001年)第三章。藉此等程序所製造的噬菌體不適合供治療使用，原因在於該等程序無法去除足量細菌細胞副產物來許可投予人體。因此，大為需要有純化絲狀噬菌體組成物的改良方法。
純化技術須為可擴充性、有效、具成本效益、可靠、且滿足終產品的嚴苛純度要求。
本發明部分係植基於發現新穎純化技術，結果.導致包含可容許地低濃度細菌細胞污染物，諸如內毒素的絲狀噬菌體組成物。此等新穎純化技術為可擴充性、有效、具成本效益、且可靠。但最重要地，本發明之純化技術可用以製造適合投予人體的絲狀噬菌體組成物。內毒素對任一型投藥而言為夠低，包括例如直接投予腦部，對許多以腦斑塊形成為特徵的疾病而言，此乃較佳遞送方法。
大規模純化高濃度絲狀噬菌體的方法對欲用在神經元疾病及病症的治療及預防上的治療性絲狀噬菌體之商業製備而言相當重要。
本發明之實施例包含具有少於5x10-14內毒素單位(EU)/噬菌體的一內毒素對噬菌體之比的含絲狀噬菌體之組成物。組成物也可包含具有內毒素對噬菌體之比少於1x10-13 EU/噬菌體，少於1x10-12 EU/噬菌體，少於1x10-11 EU/噬菌體，及少於1x10-10 EU/噬菌體的絲狀噬菌體。
進一步本發明之實施例包括包含野生型絲狀噬菌體或不顯示一抗體或一非絲狀噬菌體抗原在其表面上的絲狀噬菌體之組成物，該組成物係包含每個絲狀噬菌體少於1x10-10內毒素單位，少於1x10-11 EU/噬菌體，少於1x10-12 EU/噬菌體，少於1x10-13 EU/噬菌體，及少於5x10-14 EU/噬菌體。
本發明之額外實施例包括用於一腦病或以澱粉樣蛋白斑為其特徵之一疾病的診斷、治療或預防的包含絲狀噬菌體之組成物，該組成物係包含每個絲狀噬菌體少於1x10-10內毒素單位，少於1x10-11 EU/噬菌體，少於1x10-12 EU/噬菌體，少於1x10-13 EU/噬菌體，及少於5x10-14 EU/噬菌體。於又更進一步實施例中，本發明提出用於一腦病或以澱粉樣蛋白斑為其特徵之一疾病的診斷、治療或預防的包含絲狀噬菌體之方法，包含對有需要的個體投予包含每個絲狀噬菌體少於1x10-10內毒素單位，少於1x10-11 EU/噬菌體，少於1x10-12 EU/噬菌體，少於1x10-13 EU/噬菌體，及少於5x10-14 EU/噬菌體的組成物。
圖式簡單說明
第1圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。測量於242奈米激光後於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例中，420毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第2圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示螢光(激光242奈米；發光334奈米)。M13峰經標示。於本實例中，320毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第3圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示於A254奈米的吸光比。M13峰經標示。於本實例中，320毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第4圖為得自DEAE AEX步驟的層析圖。顯示螢光(激光242奈米；發光334奈米)。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋六倍，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，150 mM氯化鈉及25 mM磷酸鹽，pH 7.4，250 mM氯化鈉以100毫升/分鐘流速的連續洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第5圖為得自DEAE AEX步驟的層析圖。顯示於 242奈米激光及於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例中，約2升含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以10升25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋，且載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，150 mM氯化鈉及25 mM磷酸鹽，pH 7.4，250 mM氯化鈉連續洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第6圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於242奈米激光及於334奈米發光的螢光(本回合的相對應吸光比線跡係提供於第7圖)。M13峰經標示。於本實例中，750毫升含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以750毫升25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第7圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於A254奈米的吸光比(本回合的相對應螢光線跡係提供於第6圖)。M13峰經標示。於本實例中，750毫升含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以750毫升25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第8圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示於激光242奈米及於發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，400毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且使用蠕動泵 浦以100毫升/分鐘載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第9圖為得自DEAE步驟的層析圖。顯示於激光242奈米及發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋六倍，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，150 mM氯化鈉及25 mM磷酸鹽，pH 7.4，250 mM氯化鈉的連續洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第10圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於242奈米激光及於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以等體積25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第11圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示於激光242奈米及於發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自深度過濾步驟的上清液係以等體積25 mM Tris pH 7.5/4M氯化鈉稀釋，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第12圖為得自DEAE步驟的層析圖。顯示於激光242奈米及發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，3升含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以10升25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第13圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於242奈米激光及於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例中，約3升含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以2升25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第14圖顯示使用實例5所述方法從分析AEX管柱(普隋(ProSwift)WAX-1S)純化的M13之洗提輪廓圖。5微升淨M13係以75微升緩衝液A(50 mM磷酸鹽，pH 7.5)稀釋。M13係以從100%緩衝液A至100%緩衝液B(50 mM磷酸鹽，pH 2.2/2M氯化鈉)之線性梯度洗提。
第15圖顯示使用庫瑪西(Coomassie)染色的SDS PAGE凝膠的影像，於該處管柱1係載荷以藉實例5摘述之純化程序製造的絲狀噬菌體。管柱2係載荷以10微升分子量標記(標記12；英維仇貞(Invitrogen))，及管柱3係載荷以陽性對照(參考M13；批次5)。在全部線道(標記除外)M13係以1.5x1011載荷。本凝膠顯示存在有主被覆蛋白質g8p而缺乏 其它主蛋白質污染物帶。
第16圖顯示使用實例4(批次2)所述方法從分析AEX管柱(普隋WAX-1S)純化的M13之洗提輪廓圖。5微升淨M13係以75微升緩衝液A(50 mM磷酸鹽，pH 7.5)稀釋。M13係以從100%緩衝液A至100%緩衝液B(50 mM磷酸鹽，pH 2.2/2M氯化鈉)之線性梯度洗提。
第17圖顯示SDS PAGE凝膠，於該處管柱1係載荷以陽性對照(批次5)，管柱2係載荷以藉實例4摘述之純化程序製造的絲狀噬菌體(批次2)，及管柱3係載荷以10微升分子量標記(標記12；英維仇貞)。在全部線道(標記除外)M13係以1.5x1011載荷。本凝膠顯示存在有主被覆蛋白質g8p而缺乏其它主蛋白質污染物帶。
第18圖顯示使用PEG沈澱及2x氯化銫密度梯度(超離心法)從分析AEX管柱(普隋WAX-1S)純化的M13之洗提輪廓圖。參考實例7。5微升淨M13係以75微升緩衝液A(50 mM磷酸鹽，pH 7.5)稀釋。M13係以從100%緩衝液A至100%緩衝液B(50 mM磷酸鹽，pH 2.2/2M氯化鈉)之線性梯度洗提。
第19圖顯示SDS PAGE凝膠，於該處管柱1係載荷以使用PEG沈澱及2x氯化銫密度梯度法所產生的M13批次。參考實例7。管柱2係載荷以10微升分子量標記(標記12；英維仇貞)，及管柱3係載荷以已純化絲狀噬菌體(批次2；實例4)的陽性對照(批次2；實例4)樣品，且管柱3具有標記。在全部線道(標記除外)M13係以1.5x1011載荷。本凝膠 顯示存在有主被覆蛋白質g8p而缺乏其它主蛋白質污染物帶。
較佳實施例之詳細說明 定義
絲狀噬菌體屬於一族感染革蘭氏陰性菌，諸如大腸桿菌的相關病毒。例如參考Rasched及Oberer，微生物綜論(1986)十二月：401-427。於本案中，絲狀噬菌體也稱作為「噬菌體(bacteriophage)」或「噬菌體(phage)」。除非另行載明，否則「絲狀噬菌體」一詞包括野生型絲狀噬菌體及重組絲狀噬菌體二者。
「野生型絲狀噬菌體」係指表現絲狀噬菌體蛋白質而不含任何異源性核酸序列，例如已經透過基因改造或操弄而添加至噬菌體的非噬菌體序列之絲狀噬菌體。可用於本發明之一種此等野生型絲狀噬菌體為M13。「M13」一詞用於此處表示只表現M13蛋白質而不含任何異源性核酸序列的一型M13噬菌體。M13蛋白質包括藉M13基因I、II、III、IIIp、IV、V、VI、VII、VIII、VIIIp、IX及X編碼的蛋白質。van Wezenbeek等人基因(1980)11：129-148。
可用於本發明組成物及方法的適當野生型絲狀噬菌體包括至少M13、f1或fd、或其混合物。雖然M13係用於下示實例，但預期任何緊密相關的野生型絲狀噬菌體的表現及功能類似M13。密切相關的野生型絲狀噬菌體係指在核苷酸或胺基酸層面與M13、f1或fd序列共享至少85%、 至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%相同度的噬菌體。於若干實施例中，緊密相關的絲狀噬菌體係指與M13之DNA序列共享至少95%相同度的噬菌體(例如參考GenBank：V00604；Refseq：NC 003287)。
「重組絲狀噬菌體」係指已經基因改造而表現至少一種非絲狀噬菌體蛋白質及/或包含至少一種異源性核酸序列的絲狀噬菌體。舉例言之，重組絲狀噬菌體可經基因改造來表現治療性蛋白質，包括例如抗體、抗原、可檢測標記(用於診斷用途)、調製受體的胜肽、由β-中斷劑胺基酸例如脯胺酸所組成的胜肽、形成奈米管由交錯D及L殘基所組成的環狀胜肽、及金屬結合蛋白質。
本發明之絲狀噬菌體組成物可藉視需要調整後述處理程序而以任何期望的體積純化，此等處理程序為熟諳技藝人士所已知。於各個實施例中，組成物包含已經純化來減低細菌性細胞污染物例如內毒素濃度的絲狀噬菌體或重組絲狀噬菌體。內毒素濃度夠低來透過任何投予途徑例如包括直接注射腦部而投予人體。於一個實施例中，純質絲狀噬菌體具有至少4x1012噬菌體/毫升，至少1x1013噬菌體/毫升，至少5x1013噬菌體/毫升，至少9x1013噬菌體/毫升，或至少1x1014噬菌體/毫升之濃度。要緊地，EU/噬菌體比係低於1x10-10 EU/噬菌體，低於1x10-11 EU/噬菌體，低於1x10-12 EU/噬菌體，低於1x10-13 EU/噬菌體，或低於5x10-14 EU/噬菌體。
「內毒素」係出現於全部革蘭氏陰性菌的外細胞膜。「內毒素」於全文中也稱作為「脂多醣」或「LPS」。
如此處使用，「藥學組成物」係指此處所述絲狀噬菌體與其它化學成分諸如生理上適宜載劑及/或賦形劑之製劑。
「生理上可容許載劑」及「藥學上可容許載劑」二片也可互換使用，指稱不會對有機體造成顯著刺激且不會消除所投予的絲狀噬菌體化合物之生物活性及性質的載劑或稀釋劑。輔劑也含括於此等片語之內。
「賦形劑」一詞係指添加至藥學組成物來進一步協助活性成分之投予的惰性物質。其實例包括但非限於碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類及各類澱粉、纖維素衍生物、明膠、植物油類、聚乙二醇類、及界面活性劑，例如包括波利索貝(polysorbate)20。
「劑量」一詞係指經歷不超過1小時時間投予病人特別為人體之數量。「劑量」包括單一大劑量或固體劑型，以及輸注液及藉植入泵浦所遞送之量。
「單位劑型」或「單一劑型」等詞大致上係指本發明藥物產品意圖於投藥時間例如於家中、醫院、機構等提供單一劑量藥物給病人。藥物產品係調劑於單位劑量容器，亦即不可再度使用的容器、錠劑、丸劑等設計來盛裝從容器、錠劑、丸劑等以單位劑量意圖投藥(腸道外途徑以外)的藥量。單位劑量調劑的優點為藥物可完整識別且劑型 的完好受到保護直到實際投藥瞬間為止。若未使用藥物且容器、錠劑、丸劑等保持完好，則藥物可經取出且重新調劑而不損害其完好性。
「滲餘物」一詞係指不通過過濾膜的溶液部分。本詞係與通過過濾膜的溶液部分「滲透物」相反。
如此處使用，「洗提物」一詞大致上係指藉改變溶劑條件而從另一個實體釋放出的一個實體(例如藉提高鹽濃度而從經填充的層析術基體釋放已結合的M13)。
「治療」一詞意圖表示實質上抑制、減慢或逆轉疾病的進行，實質上改善疾病的臨床症狀，或實質上防止疾病臨床症狀的出現。也如此處使用，「斑塊形成病」一詞係指以藉凝集蛋白質(斑塊形成胜肽)的形成斑塊為其特徵的疾病，諸如但非限於α-合成核蛋白(synuclein)、β-澱粉樣蛋白、血清澱粉樣蛋白A、細胞靜止素(cystatin)C、IgG κ輕鏈、tau蛋白、或普利子(prion)蛋白。此等疾病包括但非限於早發型阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、症狀前阿茲海默氏病、SAA澱粉樣變性、遺傳性冰島症候群、早衰症、多發性骨髓瘤、克魯病、庫賈氏病(CJD)、哲史許氏病(GSS)、致命性家族型失眠症(FFI)、綿羊搔癢病、牛海綿樣腦炎(BSE)、帕金森氏病、肌萎縮性脊側索硬化/帕金森-失智綜合症、嗜銀顆粒失智症、腦皮質及基底神經節退化、拳擊手型失智症、帶有鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結、唐氏症候群、鏈結至染色體17帶有帕金森氏症的額顳失智症、哈史氏病(Hallervorden-Spatz disease)、肌強直性營養 不良、C型聶皮氏病(Niemann-Pick disease)、帶有神經原纖維纏結的非關島運動神經元病、皮克氏病、腦炎後帕金森症候群、進行性皮質下神經膠質增生、進行性核上性神經麻痺、亞急性硬化泛腦炎、及只有纏結的失智症。
組成物
於若干實施例中，本發明提供大規模絲狀噬菌體組成物。「大規模組成物」一詞係指包含足夠數目的絲狀噬菌體可供至少10、100、1,000、10,000、100,000、或以上的治療有效劑量之組成物。於本實施例之某些面向中，組成物包含至少2x1016至4.5x1021之總絲狀噬菌體。此等組成物中之絲狀噬菌體具有至少4x1012噬菌體/毫升，或至少1x1014噬菌體/毫升之濃度。組成物之EU/噬菌體比係低於1x10-10 EU/噬菌體，低於1x10-11 EU/噬菌體，低於1x10-12 EU/噬菌體，低於1x10-13 EU/噬菌體，或低於5x10-14 EU/噬菌體。
於本發明之若干面向中，組成物包含低於20奈克/毫升細菌性細胞DNA，及低於10奈克/毫升細菌性細胞蛋白質(也稱作為宿主細胞蛋白質或HCP)。
於若干實施例中，本發明之大規模組成物可藉技藝界眾所周知之方法諸如超濾、蒸發、噴乾、凍乾等而濃縮或轉變成固體劑型供隨後重新調製之用。當應用此等方法而所得劑型仍然為液體時，噬菌體及內毒素(於某些情況下，細菌性細胞DNA及細菌性細胞蛋白質)之濃度將提高，但於大規模組成物中內毒素對噬菌體之比維持約略相等。 當應用此等方法且所得劑型為固體時，噬菌體對內毒素之比將如同於大規模組成物般維持實質上相等。此等固體劑型或濃縮組成物也構成本發明之一部分。
於若干實施例中，本發明提供包含具有低於5x10-14 EU/噬菌體的EU/噬菌體比之絲狀噬菌體的藥學上可容許組成物。藥學上可容許組成物例如可呈食鹽水溶液形式。
於若干實施例中，本發明提供呈單一劑型之藥學上可容許組成物。於若干面向中，單一劑型構成本發明之大規模藥學組成物之一部分。於單一劑型中如同於大規模組成物中，內毒素對噬菌體之比將維持約略相等。單一劑型可呈液體劑型或固體劑型。單一劑型可未經修改而直接投予病人，或可於投予前稀釋或重新調製。於某些實施例中，單一劑型含有少於200內毒素單位，少於100內毒素單位，少於50內毒素單位，少於20內毒素單位，少於10內毒素單位，少於8內毒素單位，少於5內毒素單位，少於3內毒素單位，少於2內毒素單位，少於1內毒素單位，少於0.5內毒素單位，或少於0.2內毒素單位。
於某些實施例中，單一劑型可以大劑量形式投予，例如單次注射、單一口服劑量，包括包含多個錠劑、膠囊劑、丸劑等的口服劑量。於其它實施例中，單一劑型可經歷一段時間諸如藉輸注或透過植入泵浦，諸如ICV泵浦投予。於後述實施例中，單一劑型可為輸注袋或為泵浦貯槽預填充指示數量之絲狀噬菌體。另外，輸注袋或泵浦貯 槽可藉混合單劑絲狀噬菌體於輸注袋或泵浦貯槽溶液而恰在投予病人之前製備。
於若干實施例中，當投予人類病人時，藥學上可容許組成物或其單位劑型可提供每劑每千克體重少於5.0內毒素單位。於本發明之更特定面向中，當投予人類病人時，藥學上可容許組成物或其單位劑型可提供每劑每千克體重少於0.2內毒素單位。
於一個實施例中，前述藥學組成物可經由混合全部或部分大規模組成物與至少一種藥學上可容許賦形劑製備。因此，本發明也涵蓋包含混合含有絲狀噬菌體之大規模組成物之一部分與至少一種藥學上可容許賦形劑而製備絲狀噬菌體之藥學組成物之方法。
於若干實施例中，藥學組成物進一步接受稀釋或濃縮；或接受打錠、凍乾、直接壓縮、熔解方法或噴乾來形成錠劑、粒劑、奈米粒子、奈米膠囊、微膠囊、微錠劑、丸劑、或散劑。
單一劑型之本發明之藥學組成物可藉將大規模組成物或藥學組成物劃分成為更小整份或平分至單劑容器，或將大規模組成物或藥學組成物調配成單劑固體劑型，諸如錠劑、粒劑、奈米粒子、奈米膠囊、微膠囊劑、微錠劑、丸劑或散劑而製備。更小量整分至容器或單劑容器包括小瓶、輸注袋或泵浦貯槽。預期供單劑使用的小瓶包括1毫升小瓶、2毫升小瓶、3毫升小瓶、5毫升小瓶、10毫升小瓶、20毫升小瓶、30毫升小瓶、40毫升小瓶、50毫 升小瓶、60毫升小瓶、70毫升小瓶、80毫升小瓶、90毫升小瓶、及100毫升小瓶。小瓶可含有液體形式或固體形式的單劑。含有固體形式單劑的小瓶可藉在投予病人前添加液體，典型為無菌水或食鹽水溶液而重新調製。含有液體形式之單劑的小瓶典型係填充占小瓶體積50%至90%或占小瓶體積60%至80%之絲狀噬菌體組成物或藥學組成物。
於若干實施例中，依據本發明之組成物包含定量內毒素，當投予人體時將提供少於5.0內毒素單位/千克體重/劑，或少於0.2內毒素單位/千克體重/劑。用於此處計算目的，可假設人類具有至少40千克或50千克體重，及假設劑量具有用於液體劑型的最大10毫升體積。劑量可呈大劑量(例如注射投予)或長達1小時時間投予(例如輸注)。因此，依據本發明之單一劑型可包含少於250內毒素單位；少於200內毒素單位；少於10內毒素單位；少於8內毒素單位；少於25內毒素單位/毫升；少於20內毒素單位/毫升；少於1內毒素單位/毫升；或少於0.8內毒素單位/毫升。依據本發明之多劑形式可包含少於250內毒素單位/劑；少於200內毒素單位/劑；少於10內毒素單位/劑；少於8內毒素單位/劑；少於25內毒素單位/毫升/劑；少於20內毒素單位/毫升/劑；少於1內毒素單位/毫升/劑；或少於0.8內毒素單位/毫升/劑。
本發明之額外實施例包括：- 一種包含依據本發明之絲狀噬菌體及內毒素之組成物，當投予人體時提供少於5.0內毒素單位/千克體重/劑，其中該人具有至少40千克體重及該劑具有10毫升之最大體 積；- 一種包含依據本發明之絲狀噬菌體及內毒素之組成物，當投予人體時提供少於0.2內毒素單位/千克體重/劑，其中該人具有至少40千克體重及該劑具有10毫升之最大體積；- 一種包含依據本發明之絲狀噬菌體及內毒素之組成物，當投予人體時提供少於5.0內毒素單位/千克體重/劑，其中該人具有至少50千克體重及該劑具有10毫升之最大體積；及- 一種包含依據本發明之絲狀噬菌體及內毒素之組成物，當投予人體時提供少於0.2內毒素單位/千克體重/劑，其中該人具有至少50千克體重及該劑具有10毫升之最大體積。
本發明之另一面向包括製備本發明之藥學組成物之方法，其中該方法包含將大規模組成物或藥學組成物接受打錠、凍乾、直接壓縮、熔解方法或噴乾來形成錠劑、粒劑、奈米粒子、奈米膠囊、微膠囊、微錠劑、丸劑、或散劑。
同樣也涵蓋將大規模組成物或藥學組成物調配成奈米粒子、奈米膠囊、微膠囊劑、微錠劑、丸劑、或散劑隨後置於膠囊內。
於若干實施例中，依據本發明之組成物為野生型絲狀噬菌體或表面上不顯示抗體或非絲狀噬菌體抗原的絲狀噬菌體。該絲狀噬菌體可為任一種絲狀噬菌體諸如 M13、f1或fd。預期任一種絲狀噬菌體皆可以類似方式表現及發揮功能，原因在於其具有相似結構式且其基因體具有大於95%基因體相同度。於若干實施例中，依據本發明之組成物不含表現上顯示抗體的絲狀噬菌體。於若干實施例中，依據本發明之組成物不含其表面上顯示非絲狀噬菌體抗原之絲狀噬菌體。
純化方法
也涵蓋用以獲得本發明組成物之純化方法及容後詳述。利用此等方法許可至少10%，較佳30%、40%、50%、60%、或70%之噬菌體的百分比回收率。
純化程序實例
依據本發明之純化方法純化的絲狀噬菌體於革蘭氏陰性菌生長後係於溶液例如於培養基獲得。於本發明之若干面向中，絲狀噬菌體係依據美國申請案第61/512,169號，申請日2011年7月27日，全文以引用方式併入此處所述方法實例獲得。
通常，依據本發明之純化方法可包含一串列層析術步驟。步驟之實例及步驟之組合提供如下。
於若干實施例中，該等方法包含提供已經接受一或多個步驟諸如離心、核酸酶處理、及/或過濾的噬菌體材料。
於若干實施例中，核酸酶處理係在或可在過濾步驟之前或之中進行，例如分別於如下實例10及11所述。
於若干實施例中，該等方法包含至少一個斥水性 交互作用層析術步驟。
於若干實施例中，該等方法包含至少一個陰離子交換層析術步驟，可為減少型步驟或接合型步驟(於減少型步驟中，噬菌體材料不保留在洗滌步驟的管柱，反而前進通過該管柱；此型步驟常見係以等梯度進行直到已經收集產物為止。於結合型步驟中，噬菌體材料載荷至管柱上且藉緩衝液洗提，相對於載荷緩衝液內之交互作用強度，該緩衝液傾向於減低噬菌體材料與管柱基體間的交互作用)。於若干實施例中，該方法包含至少兩個陰離子交換層析術步驟。當使用至少兩個陰離子交換層析術步驟時，一個步驟可能為結合陰離子交換步驟，而另一個步驟為減少陰離子交換步驟。
於若干實施例中，載荷至層析術步驟中之一或多根管柱的材料包含清潔劑。至於與噬菌體可相容的清潔劑之實例列表請參考實例13。於若干實施例中，載荷以包含清潔劑之材料之管柱為陰離子交換管柱。於管柱載荷前噬菌體可與清潔劑一起培養，例如1小時。載荷以包含清潔劑之材料後的層析術步驟可為結合型步驟或減少型步驟。
於若干實施例中，該方法包含使用帶有陽離子電荷之以多胺為主的樹脂可結合內毒素的至少一個層析術步驟。用於此步驟的樹脂可為艾托里爾(Etoxiclear)樹脂(得自波美泰克生科公司(ProMetic BioSciences Ltd.)，美國馬里蘭州洛克維)。
艾托里爾管柱由製造商決定特性如下： 平均粒徑100±10微米
交聯6%近單分散瓊脂(漂樂珠(PuraBead)6XL)
動態結合容量>500,000 EU/毫升吸附劑(以120厘米/小時載荷，5分鐘滯留時間)
最大操作流速高達400厘米/小時(5毫升預充填艾托里爾管柱)
推薦操作流速高達200厘米/小時
操作pH範圍pH 4.0至pH 8.0
離心
溶液中絲狀噬菌體之起始體積以足夠從起始溶液諸如噬菌體生長於其中的大腸桿菌細胞的細胞物質中之細菌性細胞及細菌性細胞副產物中分離絲狀噬菌體的時間及速度。於若干具體實施例中，絲狀噬菌體之起始溶液係使用梭佛(Sorvall)HG 4L轉子等於梭佛RC-3離心機等於2℃至8℃以約4000 rpm離心40分鐘。離心後，收集上清液及拋棄丸粒。
DNase處理
其次上清液可使用DNase酶處理經歷一定時間及濃度，該時間及濃度係足夠分解可能存在的任何大腸桿菌細胞DNA。於一個具體實施例中，得自如上離心步驟的0.5升至1升上清液於5 mM氯化鎂存在下以10單位/毫升與DNA酶班左酶(Benzonase)一起培養。上清液及DNase係於振搖瓶內於室溫培養約60分鐘及以95 rpm速度攪動。班左酶步驟可在離心步驟之前或恰在其後執行，或於某些實施 例中係在深度過濾步驟之後執行。
深度過濾
其次經DNase處理的上清液接受深度過濾，涉及將上清液通過含有一系列各種過濾介質的至少三個過濾器，及收集通過流，該通過流包含絲狀噬菌體。深度過濾(與表面過濾相反)通常係指「厚」過濾器，該過濾器係基於大小、流體力學直徑及結構而捕捉粒狀物質及污染有機體，該等大小或直徑係大於該膜之名目截留(針對一系列操作的多個過濾器)。深度過濾材料及方法為熟諳技藝人士眾所周知。舉例言之，過濾器材料典型係由厚且纖維狀結構組成，該結構例如係由聚醚碸(PES)或乙酸纖維素(CA)與無機過濾助劑諸如矽藻土粒子埋設於纖維的開孔內製成。此種濾材具有大的內表面積，大的內表面積為粒子捕捉及過濾器容量的關鍵。此等深度過濾模組含有1.0微米至4.5微米之孔隙，包括至少1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0及4.5微米的過濾大小及介於期間之分量過濾大小。深度過濾模組之實例包括但非限於惠特曼(Whatman)波利開(Polycap)HD模組(惠特曼公司；紐澤西州浮漢公園市)、沙托瑞(Sartorius)沙托里爾(Sartoclear)P模組(沙托瑞公司；紐約州，艾吉沃)及密里波(Millipore)密里史代(Millistak)HC模組(密里波；麻州比雷利卡)。於一個特定實施例中，細胞培養流體係透過深度過濾(於室溫執行)澄清，絲狀噬菌體係於濾液中回收。
於若干實施例中，深度過濾係於DNAse處理之前 進行。
於一個具體實施例中，通過一系列三個過濾器出現0.5升至1升的深度過濾。來自離心步驟或DNase處理步驟的溶液使用蠕動泵浦通過各個過濾器。各種情況下收集通過流。過濾器為如下：
本系列過濾次步驟係用來澄清及減輕生物負擔。藉增加膜表面積(例如較大型過濾器)或更多個小型過濾器可達成規模的增加。
超濾及滲濾
於最終深度過濾步驟後，通過流施加至超濾/滲率步驟，於該處絲狀噬菌體係藉膜所保留(500或750 KD NMWCO)。滲濾的目標係完成離子交換，而超濾的目標係純化，或去除具有低於500或750 KDa分子量的成分。於一個具體實施例中，500毫升澄清的上清液+/-班左酶處理係使用聚醚碸(「PES」)500或750 KD淨分子量截留(「NMWCO」)對5-10體積25 mM Tris，100 mM NaCl，pH 8.0滲濾。另外，澄清的上清液對5-10體積25 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.4滲濾。橫向流或穿膜壓力(dP)為約5 psi。滲透物速率設定於約100毫升/分鐘。絲狀噬菌體諸如M13係藉膜所保留(「滲 餘物選分」)，及滲透物通過膜。
超濾/滲濾步驟也可稱作為「超濾(UF)」或「切線流過濾(TFF)」。
於若干實施例中，來自TFF步驟(亦即超濾/滲濾步驟)的材料係使用例如沙托佳(Sartoguard)PES膠囊0.2微米(沙托瑞)，0.021平方米於製造商推薦的150毫升/分鐘流速深度過濾。
HIC苯基
衍生自TFF步驟的材料係於高鹽緩衝液(例如2-2.1 M氯化鈉)中載荷至含東洋珍珠(Toyopearl)苯基650 M(托梭生科公司(Tosoh Bioscience))的3升管柱上，床高度約為21厘米。此點係藉以25 mM Tris-HCl 4 M NaCl pH 7.4等稀釋兩倍(1：1稀釋)達成。管柱以97.5厘米/小時流速以3管柱體積(「CV」)25 mM Tris-HCl pH 7.4，2 M NaCl等預平衡。典型地，於至少4x1012噬菌體/毫升濃度的300-500毫升絲狀噬菌體於溶液係以48.7厘米/小時的線性流速載荷至管柱上。接著以97.5厘米/小時線性流速以約3管柱體積的25 mM Tris-HCl pH 7.4，2 M NaCl之洗滌步驟。噬菌體分量以97.5厘米/小時線性流速於3管柱體積25 mM Tris-HCl pH 7.4 250mM NaCl等中洗提。基於線內檢測收集絲狀噬菌體峰(典型2升至2.5升)。絲狀噬菌體係以一階梯度或線性梯度洗提。當使用一階梯度時，銳減至250 mM氯化鈉而非徐緩線性梯度改變氯化鈉濃度。管柱階級產率對M13典型為90%或以上。使用其它絲狀噬菌體預期有類似產率。此步驟之 目的係藉透過以結合模式及洗提物模式操作的斥水性交互作用層析術(官能基苯基)減少宿主細胞污染物來提高產物純度。於其它實施例中，使用線性梯度。
為了確保峰的一致收集且提供峰收集的起始點及終點，峰收集標準係基於螢光或吸光比(此點也可用於不同位置間轉移處理步驟來確保應用相同峰收集參數)。吸光比典型係在流經管柱後及時檢測。峰分量的進一步分析可提供有關何時及多少產物已經從管柱洗提(例如離線ELISA)的進一步(更特定及補充)資訊。產物豐富分量也可離線測試污染物諸如內毒素。
螢光檢測(激光波長-242奈米，發光波長-334奈米)提供檢測絲狀噬菌體諸如M13的敏感方法。另外，絲狀噬菌體也可使用254奈米或280奈米(A269奈米)波長的吸光比檢測。用於螢光檢測，峰通常係始於A254奈米的0.1 U(螢光單位)或0.05 AU(吸光比單位)或前緣(向上斜坡)的0.01 AU(吸光比單位)收集，收集係止於峰的尾緣(下方斜率)。於一個實施例中，收集係始於觀察得峰，增加可於預期滯留時間或體積少於或大於1%峰高度，及收集係止於信號降至最大峰高度約5%時。於又一實施例中，峰收集係始於經界定的處理時間(基於預期洗提時間或洗提體積)。於一個實施例中，收集可始於及終於0.05至0.05 U(254奈米)及0.01至0.01 U(280奈米)吸光比單位。也可使用其它吸光比波長及發光波長。
管柱係以3管柱體積25 mM Tris-HCl pH 7.4 2 M NaCl等汽提，接著為氫氧化鈉洗滌基體(CIP)。
弱陰離子交換樹脂(例如DEAE AEX)
其次，得自先前苯基HIC步驟的洗提物分量以約5體積25 mM磷酸鹽pH 6.5緩衝液等稀釋，及通過弱陰離子交換樹脂例如沙托波2、150、0.45微米/0.2微米過濾器等過濾。pH典型為pH 6.0-7.0，含6.5及傳導率16.8 mS/cm。於一個具體實施例中，3升管柱(床高度約22厘米)以97.5厘米/小時流速使用3管柱體積25 mM磷酸鹽100 mM NaCl pH 6.5平衡。得自前一步驟(如前述稀釋及過濾)的絲狀噬菌體分量係以97.5厘米/小時流速載荷。管柱以2管柱體積25 mM磷酸鹽150 mM NaCl pH 6.5接著為四管柱體積的25 mM磷酸鹽250 mM NaCl pH 6.5洗滌，洗滌步驟係以97.5厘米/小時流速進行。絲狀噬菌體係以97.5厘米/小時流速等使用3管柱體積25 mM磷酸鹽300 mM NaCl pH 6.5洗提。噬菌體峰係基於螢光及/或吸光比的線內檢測收集(典型3-3.5升)。線內檢測係在流經管柱後及時檢測。進一步分析峰分量可提供有關何處及多少產物已經從管柱洗提(例如離線ELISA)的額外(更特定及補充)資訊。產物豐富分量也可離線測試污染物諸如內毒素。
螢光檢測(激光波長-242奈米，發光波長-334奈米)提供檢測絲狀噬菌體諸如M13的敏感方法。另外，絲狀噬菌體也可使用254奈米或280奈米(A269奈米)波長的吸光比檢測。用於螢光檢測，峰通常係始於A254奈米的0.1 U(螢光單位)或0.05 AU(吸光比單位)或前緣(向上斜坡)的0.01 AU(吸光比單位)收集，收集係止於峰的尾緣(下方斜率)。於一個實施例中，收集係始於觀察得峰，增加可於預期滯留時間或體積少於或大於1%峰高度，及收集係止於信號降至最大峰高度約5%時。於又一實施例中，峰收集係始於經界定的處理時間(基於預期洗提時間或洗提體積)。於一個實施例中，收集可始於及終於0.05至0.05 U(254奈米)及0.01至0.01 U(280奈米)吸光比單位。也可使用其它吸光比波長及發光波長。
管柱係以3管柱體積25 mM磷酸鹽1M NaCl pH 6.5等汽提，接著為氫氧化鈉洗滌基體(CIP)。
絲狀噬菌體係於一階或線性梯度洗提。當使用一階梯度時，管柱階級產率對M13典型為55%或以上。其它絲狀噬菌體預期具有類似產率。本步驟之目的係藉經由以結合及洗提模式操作的弱陰離子交換(官能基二乙基胺基乙基(DEAE))層析術減少宿主細胞污染物來提高產物純度。
強陰離子交換樹脂(例如AEX Q)
得自弱陰離子交換樹脂(例如DEAE)的M13洗提物以等體積(1：1)25 mM Tris pH 7.4等稀釋，及通過適當過濾器例如沙托波300 0.45+0.2微米過濾器(沙托瑞)過濾。pH典型為7.3及傳導率為15.8 mS/cm。於一個實施例中，索斯(Source)15Q(GE健康照護公司(GE Healthcare))管柱以169.5厘米/小時線性流速以3管柱體積20 mM Tris pH 7.4等平衡。絲狀噬菌體例如M13係以169.5厘米/小時載荷。管柱以3管柱體積25 mM Tris 200 mM NaCl pH 7.4等洗滌。絲狀 噬菌體例如M13以169.5厘米/小時以5管柱體積25 mM Tris-HCl pH 7.4，280 mM或300 mM NaCl(等)洗提。基於線內檢測收集噬菌體峰(典型0.5升)。吸光比或螢光典型係於流經管柱後及時檢測。峰分量的進一步分析可提供有關何時及多少產物已經從管柱洗提(例如離線ELISA)的進一步(更特定及補充)資訊。產物豐富分量也可離線測試污染物諸如內毒素。
螢光檢測(激光波長-242奈米，發光波長-334奈米)提供檢測絲狀噬菌體諸如M13的敏感方法。另外，絲狀噬菌體也可使用254奈米或280奈米(A269奈米)波長的吸光比檢測。用於螢光檢測，峰通常係始於A254奈米的0.1 U(螢光單位)或0.05 AU(吸光比單位)或前緣(向上斜坡)的0.01 AU(吸光比單位)收集，收集係止於峰的尾緣(下方斜率)。於一個實施例中，收集係始於觀察得峰，增加可於預期滯留時間或體積少於或大於1%峰高度，及收集係止於信號降至最大峰高度約5%時。於又一實施例中，峰收集係始於經界定的處理時間(基於預期洗提時間或洗提體積)。於一個實施例中，收集可始於及終於0.05至0.05 U(254奈米)及0.01至0.01 U(280奈米)吸光比單位。也可使用其它吸光比波長(例如A269奈米)及發光波長。
管柱係以3管柱體積25 mM磷酸鹽1M NaCl pH7.4等汽提，接著為氫氧化鈉洗滌基體(CIP)。
絲狀噬菌體係於一階或線性梯度洗提。當使用一階梯度時，管柱階級產率對M13典型為80%或以上。其它絲 狀噬菌體預期具有類似產率。本步驟之目的係藉經由以結合及洗提模式操作的強陰離子交換(官能基第四銨(Q))層析術減少宿主細胞污染物來提高產物純度。
瑪斯田(Mustang)Q/餘隙過濾器
得自前一步驟(強陰離子交換樹脂；AEX Q)的洗提物以約150毫升/分鐘流速直接載荷至一或多個10毫升瑪斯田Q(波爾(Pall))膜上。「瑪斯田Q」於此處也稱作為「餘隙過濾器」或「終餘隙過濾器」。沙托班(Sartobind)過濾器(沙托瑞)可用來替代瑪斯田Q過濾器。帶電過濾器(官能基Q)係以「流經」模式操作。收集含有流經分量的絲狀噬菌體產物(例如M13)。此步驟用來去除剩餘帶負電污染物，主要為內毒素，但也去除宿主細胞DNA及帶負電宿主細胞蛋白質。
超濾
絲狀噬菌體例如M13係經濃縮且使用500 kD NMWCO PES中空纖維過濾器滲濾入PBS(155 mM NaCl，1.06 mM KH2PO4，2.97 mM Na2HPO4．7H2O-pH 7.4)。
本系統以約5系統體積(25毫升)水接著為5系統體積(25毫升)0.5 M氫氧化鈉(50℃)洗滌。0.5氫氧化鈉重新循環通過過濾器歷約20至40分鐘。以5系統體積注射用水(WFI)水等洗滌接著以5系統體積25 mM Tris 280 mM NaCl pH 7.4等洗滌去除氫氧化鈉。產物(得自前一瑪斯田Q處理步驟的M13流經流)添加至系統且濃縮至約1.0-1.5x1014噬菌體/毫升目標濃度，循環及藉添加5-10體積磷酸鹽緩衝食 鹽水(PBS)pH 7.4滲濾。
典型地，於此步驟後之M13產率為70%或以上。其它絲狀噬菌體預期具有類似產率。
無菌過濾
回收自超濾步驟的上清液以2毫升/分鐘的約略流速或任何其它適當流速過濾通過1或多個瓦特曼飄洛迪克(PURADISC)25過濾器或沙托標度(Sartoscale)沙托波2，0.2微米(等)過濾。過濾後濃度使用磷酸鹽緩衝食鹽水pH 7.4調整至例如4x1012噬菌體/毫升，或於若干實施例中1.0x1014噬菌體/毫升，或1.0x1013噬菌體/毫升之目標濃度。
以下為依據本發明之噬菌體純化方法之具體實施例的列表。
1.一種用於製備包含絲狀噬菌體及少於1x10-10內毒素單位/絲狀噬菌體之組成物之方法包含：a)提供包含絲狀噬菌體之第一載荷緩衝液，其中該絲狀噬菌體係於絲狀噬菌體生長後經離心，使用核酸酶處理及過濾；b)進行第一層析術步驟，包含第一層析術樹脂接觸包含絲狀噬菌體之第一載荷緩衝液，該樹脂接觸新鮮緩衝液，及收集包含絲狀噬菌體之第一洗提分量；c)進行第二層析術步驟，包含第二層析術樹脂接觸包含先前收集的絲狀噬菌體之第二載荷緩衝液，該樹脂接觸新鮮緩衝液，及收集包含絲狀噬菌體之第二洗提分量；d)進行最末層析術步驟，包含最末層析術樹脂接觸包含絲狀噬菌體之最末載荷緩衝液，該樹脂接觸新鮮緩衝液，及收集最末洗提分量包含該絲狀噬菌體及低於1x10-10內毒素單位/絲狀噬菌體，其中該等層析術步驟中之至少一者為陰離子交換步驟。
2.如上實施例1之方法，其中該製備之核酸酶處理係發生於過濾步驟之前。
3.如上實施例1之方法，其中該製備之核酸酶處理係發生於過濾步驟期間。
4.如上實施例1至3中任一項之方法，其中該最末洗提 分量包含低於1x10-11內毒素單位/絲狀噬菌體。
5.如上實施例1至4中任一項之方法，其中該最末洗提分量包含低於1x10-12內毒素單位/絲狀噬菌體。
6.如上實施例1至5中任一項之方法，其中該最末洗提分量包含低於1x10-13內毒素單位/絲狀噬菌體。
7.如上實施例1至6中任一項之方法，其中該最末洗提分量包含低於5x10-14內毒素單位/絲狀噬菌體。
8.如上實施例1至7中任一項之方法，其中該絲狀噬菌體係包含不顯示抗體或非絲狀噬菌體表面抗原的噬菌體。
9.如上實施例1至8中任一項之方法，其中該絲狀噬菌體係包含野生型噬菌體。
10.如上實施例1至9中任一項之方法，其中該絲狀噬菌體係包含M13噬菌體。
11.如上實施例1至10中任一項之方法，其中該第一層析術樹脂係包含斥水性交互作用層析術樹脂或陰離子交換樹脂。
12.如上實施例1至11中任一項之方法，其中該第二層析術樹脂係包含陰離子交換樹脂。
13.如上實施例1至12中任一項之方法，其中該第一或第二層析術樹脂係包含弱陰離子交換樹脂。
14.如上實施例13之方法，其中於該弱陰離子交換樹脂接觸載荷緩衝液之前，清潔劑添加至該載荷緩衝液。
15.如上實施例14之方法，其中該清潔劑係選自崔頓(Triton)X-100及兩性潔(Zwittergent)Z3-12。
16.如上實施例13至14中任一項之方法，其中該清潔劑係以0.05%至2%範圍之濃度存在。
17.如上實施例1至16中任一項之方法，其中該終層析術樹脂包含陰離子交換樹脂。
18.如上實施例1至17中任一項之方法，其中該最末層析術樹脂包含可結合內毒素的帶陽離子電荷的以多胺為主之樹脂。
19.如上實施例18之方法，其中該親和樹脂為艾托里爾樹脂。
20.如上實施例1至19中任一項之方法，其中該第一層析術樹脂係包含弱陰離子交換樹脂，及該第一層析術步驟係於清潔劑存在下進行為減少層析術步驟，該第二層析術樹脂包含弱陰離子交換樹脂及該第二層析術步驟係進行為結合層析術步驟，及該最末層析術樹脂包含帶陽離子電荷以多胺為主之樹脂其係結合內毒素。
21.如上實施例1至19中任一項之方法，其中該第一層析術樹脂包含斥水性交互作用層析術樹脂，該第二層析術樹脂包含弱陰離子交換樹脂及該第二層析術步驟係執行為結合層析術步驟，及該最末層析術樹脂包含帶陽離子電荷以多胺為主之樹脂其係結合內毒素。
22.如上實施例1至19中任一項之方法，進一步包含於該第二與最末層析步驟間，進行額外層析步驟，包含額外層析術樹脂接觸包含先前收集的絲狀噬菌體之額外載荷緩衝液，額外樹脂接觸新鮮緩衝液，及收集包含絲狀噬菌體 之第二洗提分量。
23.如上實施例22方法，其中該第一層析術樹脂包含斥水性交互作用層析術樹脂，該第二層析術樹脂包含弱陰離子交換樹脂，及該第二層析術步驟係執行為於清潔劑存在下之減少層析術步驟，該額外層析術樹脂包含弱陰離子交換樹脂，及該額外層析術步驟係執行為結合層析術步驟，及該最末層析術樹脂包含結合內毒素的帶陽離子電荷以多胺為主的樹脂。
24.如上實施例22方法，其中該第一層析術樹脂包含斥水性交互作用層析術樹脂，該第二層析術樹脂包含弱陰離子交換樹脂，及該第二層析術步驟係執行為結合層析術步驟，該額外層析術樹脂包含強陰離子交換樹脂，及該額外層析術步驟係執行為結合層析術步驟，及該最末層析術樹脂包含強陰離子交換樹脂及最末層析術步驟係執行為減少層析術步驟。
25.如上實施例1至19中任一項之方法，其中該方法以相對於藉OD或ELISA測量之輸入量至少為10%量獲得噬菌體粒子。
26.如上實施例1至25中任一項之方法，其中該最末洗提分量包含至少1013噬菌體粒子。
27.如上實施例1至26中任一項之方法，其中該最末洗提分量包含藉OD或ELISA測量於至少1012/毫升濃度之噬菌體粒子。
28.如上實施例1至27中任一項之方法，進一步包含調 配得自最末層析術步驟之噬菌體及至少一種藥學賦形劑至藥學組成物。
29.一種用以純化絲狀噬菌體之培養之方法包含：a)離心包含絲狀噬菌體之培養基歷經足夠從該上清液分離細胞物質的時間及速度；b)以DNase酶處理該已離心之培養基之上清液；c)施加得自步驟b)之上清液至深度過濾；d)使用500或700 KDa分子量截留膜超濾該經深度過濾的上清液及滲濾該滲餘物來交換緩衝液；e)施用該經滲濾的滲餘物至包含HIC苯基之層析術管柱；f)施用得自HIC苯基管柱之M13洗提分量至包含弱陰離子交換樹脂之層析術管柱；g)施用得自弱陰離子交換樹脂的M13洗提分量至強陰離子交換樹脂；h)施用得自強陰離子交換樹脂之M13洗提分量至過濾澄清步驟；i)超濾該流經流，離心及對該最末調配緩衝液滲濾；及j)滅菌過濾該剩餘物。
調配
藥物之調配技術例如可參考「雷明頓製藥科學」，默克出版公司，賓州伊斯頓，最新版，該文全文以引用方式併入此處。
本發明之藥學組成物之適當投予路徑例如包括 經口、經直腸、經黏膜，特別為經鼻、經腸道或經腸道外遞送，包括肌肉、皮下及骨髓內注射以及鞘內、直接室內、靜脈、腹內、鼻內或眼內注射。
另外，可以局部方式而非系統方式投予藥學組成物，例如透過將藥學組成物直接注射於病人腦部。
本發明之藥學組成物可藉技藝界眾所周知之方法製造，例如利用習知混合、溶解、造粒、製造糖衣錠、研磨、乳化、包膠、捕獲或凍乾方法。
如此依據本發明使用的藥學組成物可以習知方式使用包含賦形劑及輔劑的一或多種生理上可容許載劑調配，該等載劑有助於活性成分加工處理成為可供藥物使用的組成物。適當調配配方係取決於所選用的投藥途徑。
供注射用，本發明之活性成分可調配於水溶液，較佳調配於生理上可相容緩衝液，諸如漢克氏溶液，林格氏溶液，或生理鹽緩衝液。供經黏膜投予，適合用於欲穿透的障壁的穿透劑可用於配方。此等穿透劑通常為技藝界所已知。
為了用於經口投予，化合物可方便組合活性化合物與熟諳技藝人士已知之藥學容許載劑配方。此等載劑許可本發明化合物調配為由病人經口服用的錠劑、丸劑、糖衣錠、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿劑、料漿劑、懸浮液劑等。口服使用的藥理組成物可使用固體賦形劑製備，選擇性地研磨所得混合物，及若有所需於添加輔劑之後加工處理顆粒混合物來獲得錠劑或糖衣錠核心。適當賦形劑特 別為填充劑諸如糖類包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇；纖維素組成物諸如玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；及/或生理上可容許聚合物諸如聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)。若有所需，可添加崩散劑諸如交聯聚乙烯基吡咯啶酮、瓊脂、或褐藻酸或其鹽諸如褐藻酸鈉。
於一個實施例中，錠劑、粒劑、奈米粒子、奈米膠囊、微膠囊劑、微錠劑、丸劑或散劑也涵蓋於其中，可未經包衣或包腸衣。奈米粒子、奈米膠囊、微膠囊劑、微錠劑、丸劑或散劑可放置於膠囊內。
糖衣錠核心可被提供以適當包衣。用於此項目的，可使用濃縮糖溶液，可選擇性地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯基、吡咯啶酮、卡玻波(carbopol)凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、清漆溶液及適當有機溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可添加至錠劑或糖衣錠包衣來識別或特徵化不同活性化合物劑量的組合。
可口服使用的藥學組成物包括明膠製成的推送嵌合膠囊劑，以及明膠及塑化劑諸如甘油或山梨糖醇製成的密封軟膠囊劑。推送嵌合膠囊劑可含有活性成分混合填充劑諸如乳糖，黏結劑諸如澱粉，潤滑劑諸如滑石或硬脂酸鎂，及選擇性地安定劑。於軟膠囊中，活性成分可溶解或懸浮於適當液體諸如脂肪油類、液體石蠟、或液體聚乙二醇類。此外，可添加安定劑。全部口服投藥的配方須於 適合所選用的投藥途徑之劑量。
供經頰投予，組成物可呈以習知方式調配之錠劑或口含錠劑型。
用於經鼻吸入投藥，本發明之絲狀噬菌體可習知地從加壓包裝或霧化器，使用適當推進劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。以氣溶膠噴霧形式遞送。於加壓噴霧劑之情況下，藉設置閥門來遞送計量定量而可決定劑量單位。用於配送器的明膠膠囊及明膠卡匣可經調配而含有化合物與適當粉末基劑諸如乳糖或澱粉之粉狀混合物。
此處所述組成物可調配供腸道外投藥，例如藉大劑量注射或連續輸注。注射用配方可呈單位劑型，例如於小瓶、安瓿或於選擇性地添加保藏劑之多劑量容器。組成物可為於油性或水性載媒劑之懸浮液劑、溶液劑或乳液劑，且可含有調配劑諸如懸浮劑、安定劑及/或分散劑。
供腸道外投藥之藥學組成物包括呈水溶性形式之絲狀噬菌體水溶液劑。此外，活性成分之懸浮液劑可製備成以油或以水為主的注射用懸浮液劑。適當親脂溶劑或載媒劑包括脂肪油類諸如芝麻油或合成脂肪酸酯類諸如油酸乙酯、三酸甘油酯類或微脂粒。水性注射用懸浮液劑可含有提高懸浮液劑之黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。選擇性地，懸浮液劑也含有可提高活性成分的溶解度來許可製備高度濃縮溶液的適當安定劑或作用劑(例如界面活性劑諸如波利索貝(吐溫(Tween)20))。以 蛋白質為主的作用劑例如白蛋白可用來防止M13吸附至遞送表面(亦即點滴袋、套管、針頭等)。
另外，絲狀噬菌體可呈散劑形式來在使用前使用適當載媒劑例如無菌以無熱原水為主的溶液調配。
本發明之藥學組成物也可使用例如習知栓劑基劑諸如可可脂或其它甘油酯類來調配成直腸用組成物諸如栓劑或滯留浣腸劑。
用於治療之絲狀噬菌體及包含投予絲狀噬菌體之治療方法
於若干實施例中，本發明提供一種依據本發明之絲狀噬菌體組成物來用於治療斑塊形成疾病，用於減少患有斑塊形成疾病病人的澱粉樣蛋白斑塊的數目，用來抑制澱粉樣蛋白沈積物的形成，或用來防止預先形成的澱粉樣蛋白沈積物的凝聚，或用來減少對斑塊形成疾病的易感性。
於若干實施例中，本發明提供用於治療斑塊形成疾病，用於抑制澱粉樣蛋白沈積物的形成或崩解病人體內預先形成的澱粉樣蛋白沈積物，用於減少患有斑塊形成疾病病人體內的澱粉樣蛋白斑數目，用於減低對斑塊形成疾病之易感性的方法，該等方法各自包含對有需要的病人投予依據本發明之絲狀噬菌體組成物。
於本實施例之某些面向中，於依據本發明之用途及方法中提供的絲狀噬菌體在其表面上並不顯示任何非絲狀噬菌體抗原。於此等實施例之某些面向中，於依據本發明之方法及用途所提供的絲狀噬菌體為野生型噬菌體。於更特定面向中，該噬菌體為野生型噬菌體。於又更特定面 向中，該絲狀噬菌體係選自M13、f1或fd。此等絲狀噬菌體各自預期以相似方式表現及發揮功能，原因在於其具有類似的結構式及其基因體具有大於95%之基因體相同度。於又更特定實施例中，依據本發明之前述用途之方法及組成物中的絲狀噬菌體為野生型M13。
於此等實施例之若干面向中，斑塊形成疾病係選自早發型阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、症狀前阿茲海默氏病、SAA澱粉樣變性、遺傳性冰島症候群、早衰症、多發性骨髓瘤、克魯病、庫賈氏病(CJD)、哲史許氏病(GSS)、致命性家族型失眠症(FFI)、綿羊搔癢病、牛海綿樣腦炎(BSE)、帕金森氏病、肌萎縮性脊側索硬化/帕金森-失智綜合症、嗜銀顆粒失智症、腦皮質及基底神經節退化、拳擊手型失智症、帶有鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結、唐氏症候群、鏈結至染色體17帶有帕金森氏症的額顳失智症、哈史氏病(Hallervorden-Spatz disease)、肌強直性營養不良、C型聶皮氏病(Niemann-Pick disease)、帶有神經原纖維纏結的非關島運動神經元病、皮克氏病、腦炎後帕金森症候群、進行性皮質下神經膠質增生、進行性核上性神經麻痺、亞急性硬化泛腦炎、及只有纏結的失智症。於此等實施例之更特定面向中，斑塊形成疾病係選自早發型阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病或症狀前阿茲海默氏病。
涉及崩解預先形成的澱粉樣蛋白沈積物之方法包含本發明之絲狀噬菌體組成物中之任一者接觸預先形成的澱粉樣蛋白沈積物。
於依據本發明方法之一個面向中，噬菌體投予病人作為額外包含藥學上可容許載劑的藥學上可容許組成物之一部分。例如，藥學上可容許載劑可為食鹽水。
於依據本發明之方法的一個實施例中，絲狀噬菌體組成物係經鼻內投予。於供前述使用之組成物的一個實施例中，絲狀噬菌體組成物係調配供鼻內投予。
於依據本發明方法之另一個實施例中，絲狀噬菌體係直接投予個體腦部。「直接投予腦部」一詞包括注射或輸注入腦本身，例如顱內投藥，以及注射或輸注入腦脊髓液。於本實施例之一個面向中，投藥係藉鞘內注射或輸注、室內注射或輸注、實質內注射或輸注，或腦室內注射或輸注。於更特定面向中，投藥係藉實質內注射；腦室內注射或腦室內輸注。於用於前述用途之組成物之一個實施例中，絲狀噬菌體組成物係調配用來直接投予個體腦部，諸如藉顱內投藥，以及注射或輸注入腦脊髓液、鞘內注射或輸注、室內注射或輸注、實質內注射或輸注或腦室內注射或輸注。
此處闡述之方法也包括其中病人係經識別為需要特定陳述的治療者。識別需要此種治療的病人可由病人或醫療照護專業人員的判定，且也可為主觀(例如觀點意見)或客觀(例如藉試驗或診斷方法測定)。
須瞭解前文及後文詳細說明部分僅為舉例說明而不限制如申請專利的本發明之範圍。
實例1-本發明之製造方法步驟實例
表3至表13以表格形式顯示依據本發明之純化方法之規定實例。熟諳技藝人士將瞭解可不損害此處所述新穎方法而做出修改。
班左酶步驟可於離心步驟之前或恰在其後或在三階段深度過濾之後進行。
實例2-緩衝液及溶液實例
實例3-M13批次1之代表性純化方法
以下為依據本發明之純化方法根據表2及實例1提供的步驟用於以2.45x1013噬菌體/毫升之起始濃度之0.32升M13。用於批次1，中空纖維以1xPBS平衡。隨後批次以25 mM Tris 280mM NaCl pH 7.4。
表15顯示從本實驗性純化所得噬菌體回收結果，例如包括於各步驟純化法後回收的噬菌體總數，及%回收率。
表16顯示於批次1之各步驟純化法後內毒素的去除。得自批次1之純質(第二UF步驟後)材料含有4.8x10-13 EU/噬菌體。
實例4-M13批次2之代表性純化方法
依據本發明之純化方法係根據表12及實例1提供之步驟用於0.35升M13，於起始濃度2.4x1013噬菌體/毫升。表17顯示從本實驗性純化的噬菌體回收結果，例如包括各純化法步驟後回收的噬菌體總數及%回收率。
表18顯示於批次2之各個純化步驟後內毒素的去除。得自批次2之已純化(後UF步驟)M13含有9.2x10-13 EU/噬菌體。HIC苯基步驟後之純度為5.8x10-8 EU/噬菌體。由DEAE步驟至最末純化材料觀察得純度的6.3x104增加(EU/ 噬菌體)。
表19顯示批次2之分析證明實例。
實例5-M13批次3之代表性純化方法
遵照依據本發明之純化方法，根據表2及實例1對0.4升M13，起始濃度7.2x1013噬菌體/毫升所提供之步驟。
表20顯示由本實驗性純化所得噬菌體回收結果，例如包括於純化法各步驟後回收的噬菌體總數，及%回收率。
表21顯示於批次3純化法之各步驟後內毒素的去除。
表22顯示批次3之分析證明實例。得自批次3之已純化(後UF步驟)M13材料含有8.5x10-14 EU/噬菌體。HIC苯基步驟後之純度為7.3x10-8 EU/噬菌體。由DEAE步驟至最末純化材料觀察得純度的8.6x105增加(EU/噬菌體)。
實例6-M13批次4之代表性純化方法
遵照依據本發明之純化方法，根據表2及實例1對0.4升M13，起始濃度2.2x1013噬菌體/毫升所提供之步驟。
表23顯示由本實驗性純化所得噬菌體回收結果，例如包括於純化法各步驟後回收的噬菌體總數，及%回收率。
表24顯示於針對批次4純化法之各步驟後內毒素之去除。得自批次4之已純化(後UF步驟)M13材料含有2.2x10-12 EU/噬菌體。HIC苯基步驟後之純度為8.7x10-8 EU/噬菌體。由DEAE步驟至最末純化材料觀察得純度的4.0x104增加(EU/噬菌體)。
實例7-M13之比較純化法-利用氯化銫純化法且非本發明之方法
表25顯示純化法氯化銫純化技術結果，但非表2 或實例1所述本發明技術。相對應於「氯化銫」批次的M13材料係藉於批次培養基中大腸桿菌JM109之感染生長製造。含M13之上清液係藉離心及PEG沈澱收穫。藉連續兩回合氯化銫(「CsCl」)密度梯度純化(藉超離心產生)達成進一步純化。
與實例1-6所述批次觀察得的純度相反，氯化銫純化批次只獲得2.6x10-10 EU/噬菌體純度。
實例8-內毒素含量之設定點
下表26摘述計算來設定M13之草稿目標內毒素釋放規定。
實例9-藥物物質規定實例
表27顯示包含M13絲狀噬菌體之藥物實例的屬性及規定。本規定涵蓋純質大量藥物。
表28顯示包含M13絲狀噬菌體之藥品範例的屬性及規定。本規定涵蓋經填充的藥品，例如藉通過兩個串聯無菌過濾器接著填充入玻璃小瓶內而從藥物衍生。
aUVabs(A269 nm)為目前決定濃度的首選方法，其它替代方案包括產品特異性ELISA及qPCR，可能此等方法中之一者置換於IND提出前的ELISA。
b制菌及制真菌係在第一cGMP批次釋放時進行。
c接受取決於給藥劑量改變之規定。
實例10-另一種製造法70065
本實例陳述依據本發明用於純化具有低內毒素污染的絲狀噬菌體之範例方法。
提供得自5升發酵之含M13噬菌體的上清液。
班左酶處理：班左酶添加至上清液來達成10單位/毫升之終濃度，及添加1M MgCl2來獲得5 mM終濃度；材料於室溫培養60分鐘。然後使用0.6微米、0.6/0.2微米及0.2微米ULTA普蘭(Prime)膠囊劑(GE)藉深度過濾澄清。由於過濾器堵塞故，只有1993.8克材料在此點繼續前進。
TFF1步驟：澄清材料使用500 kDa MWCO中空纖維卡匣(0.48平方米)以10周轉體積(TOV)滲濾直到滲透物之pH及傳導率皆與滲濾緩衝液(25 mM Tris，100 mM NaCl，pH 8.0)可相媲美為止。整個滲濾過程中維持入口壓力(約5 psi)。回收滲餘物(1864.6克)經0.45/0.2微米過濾(1795.6克)，及取樣接受分析，剩餘物主要儲存於2-8℃。
HIC步驟：後TFF1材料(1792.3克)以25 mM Tris，4 M NaCl，pH 7.4，經0.2微米過濾(3739.5克)及取樣接受分析。材料係於pH 8.0，且於稀釋後具有傳導率152.9 mS。
東洋珍珠苯基650M凡特吉(Vantage)90管柱 (1144.5毫升管柱體積(CV))於使用前消毒且以25 mM Tris-HCl，2M NaCl，pH 7.4。稀釋樣品(3739.5克)以48.7厘米/小時(50.5毫升/分鐘)流速載荷至東洋珍珠苯基650 M管柱上。流經(F/T)未經結合材料以3管柱體積25 mM Tris-HCl，2 M NaCl，pH 7.4洗滌出，隨後NPT002材料以250 mM NaCl洗提，管柱以2 M NaCl汽提。全部步驟皆係於97.5厘米/小時(101毫升/分鐘)之流速進行。始於A254從基準線增高而止於峰降至基準線(第2圖)收集噬菌體峰為單一匯集物(776.1克)。產品峰取樣接受分析，進行DEAE步驟前儲存於2-8℃隔夜。
DEAE陰離子交換步驟：後HIC材料(772.1克)從2-8℃儲存物中去除，以5體積25 mM磷酸鹽pH 6.5稀釋及通過0.45/0.2微米過濾器過濾(4614.5克)。材料係於pH 6.05，稀釋後具有21.1 mS之傳導率。菲特吉(Fractogel)EMD DEAE(M)凡特吉90管柱(864.6毫升管柱體積(CV))於使用前經消毒且以25 mM磷酸鹽，100 mM NaCl pH 6.5平衡。已稀釋的後HIC材料(4607.8克)現在以97.5厘米/小時(101毫升/分鐘)速率載荷至管柱上。然後管柱以含150 mM NaCl之緩衝液洗滌接著於250 mM NaCl洗滌。發現150 mM NaCl洗滌緩衝液具有17.7 mS之傳導率，係低於樣品的傳導率(21.1 mS)。噬菌體以300 mM NaCl洗提，始於254奈米的吸光比(A254)從基準線增加時，而止於峰降至5%基準線時收集為單一匯集物(1107.8克)。產品峰取樣分析，進行索斯15Q步驟前儲存於2-8℃隔夜。
索斯15Q步驟：後DEAE材料(1102.5克)從2-8℃儲存物移出，以25 mM Tris-HCl pH 7.4稀釋1：1且通過0.45/0.2微米過濾器過濾(2189.9克)。材料係於pH 6.79且於稀釋後具有15.29 mS之傳導率。索斯15Q番蘭(Fineline)35管柱(182.4毫升管柱體積(CV))在使用前消毒且以25 mM Tris-HCl，pH 7.4平衡。以稀釋的後DEAE樣品(2183.5克)及1管柱體積含200 mM NaCl的洗滌緩衝液以約60厘米/小時(9.5毫升/分鐘)之流速載荷至管柱上。由於介質的珠粒大小小及由層析術系統所提供的壓力上限，故使用此種減低的流速。
以169.5厘米/小時(27.1毫升/分鐘)使用AKTA派樂(Pilot)系統泵浦具有人工系統出口流徑進行。噬菌體的其餘洗滌步驟及洗提(於含280 mM NaCl緩衝液)。洗提出的材料始於A254從基準線增高而止於峰降至基準線的5%收集為單一匯集物(295.9克)。產品峰取樣接受分析且儲存於2-8℃隔夜，隨後進行瑪斯田Q步驟。
瑪斯田Q步驟：遵照製造商的指示製備10毫升瑪斯田Q膠囊且於25 mM Tris，280 mM NaCl，pH 7.4中平衡。從2-8℃儲存物中取出後索斯15Q匯集物(291.3克)及載荷至瑪斯田Q膠囊上，接著以150毫升/分鐘流速以約50毫升緩衝液沖洗。由載荷之始直到沖洗結束收集材料為單一匯集物(333.5克)。材料取樣接受分析，樣品儲存。
TFF2步驟：發現初過濾卡匣獲得低流速，故於後瑪斯田Q匯集物(330.5克)後，使用500 kDa MWCO中空纖 維卡匣(0.0041平方米)初步濃縮約2.8倍，使用500 kDa MWCO中空纖維卡匣(0.0041平方米)初步濃縮約2.8倍，回收滲餘物(116.8克)，TFF系統以約47毫升調配緩衝液清洗。TFF滲餘物使用沙托波2 150 0.45/0.2微米過濾器過濾(108.01克)。材料經取樣，TFF 2中間本體量儲存於2-8℃ 7日。獲得置換中空纖維，經沖洗濕潤使得其滲透率為474 LMH/barg；然後消毒準備使用。TFF 2中間本體材料濃縮至約1.1x1014粒子/毫升(約30毫升)，藉UV分析測定。然後材料經緩衝液交換6週轉體積(TOV)成為配方緩衝液。然後材料進一步濃縮至約1.5x1014粒子/毫升，隨後從系統回收(20.21克)。
材料經取樣然後使用5x瓦特曼飄洛迪克0.2微米PES 25毫米注射過濾器(型錄號碼6780-2502)接受0.2微米過濾。然後材料以配方緩衝液稀釋，基於藉UV進行UV分析獲得25毫升於9.93x1013病毒粒子/毫升之濃度。
處理期間收集的資料顯示於下表。
實例11-另一種製法70078
本製法之步驟係類似製法70065(實例10)，但有下列改變。製程始於得自兩次5升發酵的上清液；作為一般物質，鑑於材料量，藉將材料分成兩份進行兩回合管柱操作，一般進行管柱分析。
TFF1及班左酶步驟：使用班左酶處理發生於TFF1過濾步驟期間。更明確言之，使用4x1.2微米及2x0.65微米沙托飄爾GF+過濾器(沙托瑞)進行深度過濾後，5011.5克澄清材料使用500 kDa MWCO中空纖維卡匣(0.48平方米，60厘米徑長，型錄號碼RTPUFP-500-C-6S)滲濾5週轉體積(TOV)進入25 mM Tris，100 mM氯化鈉，pH 8.0。整個滲濾期間維持入口壓力(約5 psi)。班左酶處理係出現在用於TFF1步驟的TFF系統內，而非在TFF1步驟前。更明確言之，適量體積來達成10單位/毫升終濃度的班左酶溶液及1 M氯化鎂溶液獲得於滲濾材料之5 mM終濃度一起混合，通過注射器埠口注入TFF系統貯槽內。然後材料藉攪動混合，隨後於約20%回合流速以滲透物管路封閉於室溫於TFF系統內循環60分鐘。
材料進一步滲濾5週轉體積(TOV)，直到滲透物之pH及傳導率可媲美滲濾緩衝液(25 mM Tris，100 mM NaCl，pH 8.0)為止。整個滲濾期間維持入口壓力(約5 psi)。
回收之滲餘物(5036.7克)使用沙托波2 XLG米迪蓋(MidiCap)過濾器0.8/0.2微米過濾(3個過濾器用來獲得4600.8克(型錄號碼5445307G9-OO))，及樣品接受分析，剩 餘主體儲存於2-8℃。
進行DEAE、索斯15Q、及瑪斯田Q步驟。
TFF 2步驟：使用500 kDa MWCO中空纖維卡匣(0.014平方米，30厘米徑長(UFP-500-C-3MA))，基於紫外光分析(約70毫升)，後瑪斯田Q匯集物(646.7克)濃縮至約1.5x1014粒子/毫升。
然後材料經緩衝液交換5週轉體積(TOV)進入配方緩衝液(1.06 mM磷酸鉀，2.97 mM磷酸鈉，155.17 mM氯化鈉，pH 7.4)。整個處理期間切變率維持於6500/秒至8000/秒間。剩餘物從系統回收獲得75.6克。
樣品經取樣然後使用無菌沙托波2 150過濾器(型錄號碼5441307H4-00--B)接受0.45/0.2微米過濾。然後材料以配方緩衝液稀釋，基於紫外光分析到達1.05x1014粒子/毫升之目標效價。稀釋後，藉紫外光分析產生74.79克終材料於9.24x1013病毒粒子/毫升濃度。終材料具有58.2 EU/1014噬菌體粒子(亦即低於10-12 EU/噬菌體粒子)。
製法期間收集的資料顯示於下表。
實例12-方法70101及70107
此等方法步驟係類似方法70078的方法步驟(實例11)，包括深度過濾、TFF1步驟期間之班左酶處理、一系列層析術(HIC、DEAE、15Q)，然後瑪斯田Q過濾及TFF2步驟。
製法期間收集的資料顯示於下表。
方法70107係使用大部分相同設備，但時間上比實例11及12的其它製法延遲進行。比較前一方法，通過製法70107之總較低內毒素減低，提示管柱重複使用影響污染物移出效率。
實例13-用於純化步驟之清潔劑篩選
下列清潔劑係以1%(w/v)濃度添加至TFF1緩衝液(25 mM Tris，100 mM NaCl，pH 8.0)，經由製備模擬樣本模擬含1x105 EU/mL內毒素之TFF1樣本稀釋液，分析前述內毒素檢定分析中的干擾(QCSOP296)：
1.兩性潔3-12
2.兩性潔3-14
3.崔頓X-100
4.崔頓X-114
5.吐溫20
清潔劑最初於TFF1緩衝液製備為5%(w/v)，然後於TFF1緩衝液稀釋至1%(w/v)來映射實際製程步驟。內毒素檢定分析之干擾係藉添加至各樣本的尖峰內毒素之陽性產品對照(PPC)回收率測量。未觀察得干擾效應，在於%PPC值係落入於容許範圍內(50%至200%視為可容許；數值係在83-117%之範圍；資料未顯示)。
提供經部分處理之噬菌體製劑，已經以實例10之順序通過TFF 1步驟(「後TFF1材料」)。如表33詳細說明，上表列舉的清潔劑以兩個不同終濃度添加至後TFF 1材料。也於無清潔劑存在下進行一個回合作為對照(回合1)。 材料於室溫培養1小時，於轉子混合機上連續溫和混合。具有15-17厘米床高度的11根約30毫升希法羅斯(Sepharose)6快速流(Fast Flow)管柱(XK16管柱)遵照製造商的指示填充。各管柱經消毒、平衡及載荷至約20%管柱體積來操作為群體分離。由於清潔劑於280奈米的吸光比，觀察得清潔劑干擾層析術資料至不等程度。
對回合1至回合11的後SEC材料藉ELISA測得內毒素濃度及效價顯示於表34。0.1%崔頓X-100(回合2)及1%兩性潔Z3-12(回合9)顯示可獲得內毒素濃度的最顯著減低。對對照組之其它清潔劑未觀察得顯著內毒素的去除。
實例14-於管柱層析步驟中使用清潔劑的評估
提供經部分處理的噬菌體製劑，已經以實例10的順序通過TFF1步驟，及HIC步驟(東洋珍珠苯基650M)及DEAE步驟(菲特吉EMD DEAE(M))係於清潔劑的存在下進行。
詳言之，21.3毫升HIC管柱(10.6厘米床高度)及21.1毫升DEAE管柱(10.5厘米床高度)係遵照製造商的指示填充。使用各回合間執行的原位清潔(CIP)方法各管柱再度用於4個回合。
後TFF 1材料調整至要求的清潔劑濃度，對照回合係使用不含清潔劑的相對應緩衝液稀釋。使用磁攪棒及平台(HIC回合1-4)或使用轉子混合機(DEAE回合1-4)。材料於室溫溫和混合1小時。然後材料調整至氯化鈉的要求濃度(表8)及恰在載荷至個別管柱上之前接受0.8/0.2微米過濾。使用後TFF 1效價(ELISA)且考慮通過材料調整所應用的總2.5x稀釋因素，基於如所計算的理論效價，HIC管柱以5.5x1012粒子/毫升樹脂載荷。個別DEAE管柱以0.81毫升/毫升樹脂載荷，當考慮透過材料調整所施用的總1.61x稀釋因數時，等於0.5毫升後TFF 1材料/毫升樹脂。收集噬菌體材料作為HIC回合的單峰，及作為DEAE回合的2毫升分量。小比例的減低DEAE分量經組合來獲得匯集物樣品用於隨後內毒素分析。測量樣品中的內毒素濃度，得自HIC回合及DEAE回合的結果顯示於表35。
含0.1%崔頓之減低DEAE步驟顯示可最有效用於內毒素去除，內毒素減低4.4倍，比較對照組只觀察得0.5 log。含1%兩性潔3-12的回合4當匯集一定比例的流經材料(分量A1-A8)時驗證內毒素濃度減低1.6 log。但流經材料的稍後分量(A11)顯示含較高濃度內毒素。
基於如上結果，進一步研究菲特吉EMD DEAE(M)與含0.1%崔頓X-100之緩衝液(參考下文)。
實例15-DEAE結合內毒素之容量的特徵化
新10.9毫升DEAE管柱(13.9厘米床高度)遵照製造商的指示填充。提供經部分處理的噬菌體製劑，已經以實例11之順序通過TFF1步驟。
此種材料調整至0.1%崔頓X-100終濃度及於室溫培養1小時，使用磁攪棒及平台溫和混合。氯化鈉濃度調 整至300 mM，及材料通過0.8/0.2微米過濾隨後即刻載荷至管柱上。減低的DEAE管柱以0.81毫升/毫升樹脂載荷，等於5毫升後TFF 1材料/毫升樹脂，此時考慮透過材料調整施用的1.61x稀釋因數。遵照階段4a DEAE回合1-4進行層析術回合。整個回合以3毫升間隔收集洗提分。選定的洗提分接受內毒素分析；結果顯示於表37。
觀察內毒素濃度顯著增高高於選分A5後管柱載荷開始觀察得的濃度，相對應於0.77毫升後TFF 1材料/毫升介質載荷量。基於此項結果，預期80%(亦即0.6毫升後TFF1 材料/毫升介質)或以下的載荷容量將提供針對減低的DEAE管柱通過此步驟之內毒素濃度一致地且最佳地減低。
實例16-對其它層析術樹脂之研究。
提供經部分處理之噬菌體製劑，該製劑已經以實例10之順序通過TFF 1步驟。此材料以等體積4 M NaCl緩衝液稀釋接著0.8/0.2微米過濾。HIC東洋珍珠苯基650M管柱(446毫升管柱體積，22.8厘米床高度於XK50管柱，新樹脂)經消毒且於使用前平衡。使用後TFF1效價(藉ELISA)且考慮所進行的兩次稀釋中的一次，假設過濾步驟無損耗，基於計算的理論效價，管柱係於5.5x1012噬菌體/毫升樹脂載荷。管柱操作如下：流速：97.5厘米/小時(樣品載荷以外之步驟)
樣品載荷流速：48.7厘米/小時
管柱平衡-25 mM Tris，2M NaCl，pH 7.4
3管柱體積洗滌-25 mM Tris，2M NaCl，pH 7.4
3管柱體積洗提-25 mM Tris，250 mM NaCl，pH 7.4
後HIC材料以5倍體積DEAE稀釋緩衝液稀釋接著0.45/0.2微米過濾。使用前結合DEAE(菲特吉EMD DEAE)管柱(421.4毫升管柱體積，21.5厘米床高度於XK 50管柱，辛樹脂)經滅菌及平衡。基於計算得理論值DEAE載荷效價，管柱係於5x1012噬菌體/毫升樹脂載荷，使用後HIC效價(藉OD)且考慮進行1份於6份稀釋，假設過濾步驟無損失。管柱操作如下：流速：97.46厘米/小時(全部步驟)
管柱平衡-25 mM磷酸鹽，100 mM NaCl，pH 6.5
2CV洗滌-25 mM磷酸鹽，150 mM NaCl，pH 6.5
4CV洗滌-25 mM磷酸鹽，250 mM NaCl，pH 6.5
3管柱體積洗提-25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5
如此製造的後結合DEAE材料用來存取可能隨後步驟之功效用以進一步減低內毒素含量。除非另行指示，針對下段所述管柱，當A256開始且降至峰最高值的5%時，收集噬菌體流經峰為5毫升選分。
後結合DEAE材料基於4毫升/毫升樹脂載荷量而載荷至減低DEAE管柱上。減少DEAE管柱(17.08毫升管柱體積，菲特吉EMD DEAE，8.5厘米床於XK 16管柱，新樹脂)經消毒且於使用前平衡。
後結合DEAE材料基於4毫升/毫升樹脂載荷量而載荷至減低Q希法羅斯XL管柱上。減少QXL管柱(14.67毫升管柱體積，7.3厘米床於XK 16管柱，新樹脂)經消毒且於使用前平衡。
5毫升預填充艾托里爾管柱(波美泰克生科公司，美國馬里蘭州洛克維)於使用前經消毒且於適當緩衝液內平衡。回合1、2及3使用新艾托里爾管柱，用於回合1的管柱重複用於回合4及5，各回合間執行消毒步驟。回合1及4後結合DEAE材料載荷而未經稀釋，回合2及5稀釋獲得200 mM NaCl之終氯化鈉濃度，回合3稀釋而獲得100 mM的終氯化鈉濃度。於pH 5.0執行的回合4-5利用後結合DEAE材料，已經透過透析而緩衝液交換，於2-8℃使用蛇皮管(10 kDa MWCO)來減低pH。
管柱載荷於約40毫升後結合DEAE材料/毫升樹脂(參考表38)。對回合1及2隨後測定內毒素載荷量為32,800 EU/mL樹脂及27,200 EU/mL樹脂，而對回合4及5為約15,000 EU/mL。流經未結合的材料使用適當平衡緩衝液洗滌出。A256開始且降至20 mAU時，收集噬菌體峰為多個選分。選分大小經調整來考慮載荷材料的稀釋程度(表38)。經載荷且於100 mM NaCl操作的管柱(回合3)顯示噬菌體材料的部分結合，係使用25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5而從管柱洗提出。
減少陰離子交換(AEX)及艾托里爾回合的內毒素結果顯示於表39。因減少AEX及艾托里爾用於內毒素之容量初始為未知，流經選分係未經匯集反而選擇針對內毒素分開分析的選分及藉OD決定效價來評估管柱步驟之效能。
減少AEX(DEAE及QXL)比較載荷材料對所分 析的流經選分的內毒素濃度(EU/mL)時顯示內毒素的1對數減少。
於200-300 mM NaCl存在下執行的艾托里爾層析術(回合1、2、3及4)證實比較載荷材料對所分析的流經選分中的內毒素濃度(EU/mL)，有約3.4-4.9內毒素對數減少。效價測量指示針對回合1、2、4及5於艾托里爾步驟並無產率的顯著減低。
如此，艾托里爾樹脂的篩選驗證內毒素濃度顯著減低之有展望結果且選用於進一步研究。發現於25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5執行艾托里爾層析術可遵照DEAE層析術步驟進行而無需額外緩衝液交換步驟。
實例17-對純化步驟之其它組合物之研究
提供經部分處理之噬菌體製劑(「後-TFF1材料」)，其已經以實例11之順序通過TFF 1步驟。執行三個純化步驟的組合及評估內毒素之去除程度。
於第一步驟組合中(下表40回合1)，崔頓X-100添加至後-TFF1材料至0.1%終濃度，且添加氯化鈉至300 mM終濃度。於崔頓X-100及氯化鈉添加後，材料培養1小時接著為0.45/0.2微米過濾(2x沙托波2 150過濾器)。進行減少DEAE層析術，使用25 mM Tris，300 mM NaCl，pH 7.4作為使用前已經消毒及平衡的菲特吉EMD DEAE管柱(415毫升管柱體積(CV)，21.17厘米床高度於XK50管柱(新樹脂)) 上的緩衝液條件。基於0.5毫升後TFF 1材料/毫升樹脂(考慮調整後為x1.31的總稀釋倍率來產生載荷材料)，經後過濾且經氯化鈉及崔頓X-100調整的材料載荷至DEAE管柱上。當A254開始且降至20 mAU時，收集噬菌體峰為單一匯集物。要求儲存於-65℃之樣品使用液態氮瞬間冷凍，且於處理當日結束時儲存於-65℃。全部其它樣品及本體材料係維持於2-8℃。
含噬菌體的流經流以5體積25 mM磷酸鹽pH 6.5稀釋，接著為0.45/0.2微米過濾(1x沙托波2 300過濾器)。基於使用藉ELISA決定的後TFF1效價求出的理論值效價，考慮通過調整的材料稀釋度，也考慮於減少DEAE步驟的體積增加且假設減少DEAE步驟為90%步驟產率，然後此材料以5x1012噬菌體/毫升樹脂載荷至結合DEAE層析術管柱(菲特吉EMD DEAE，229毫升管柱體積，11.68厘米床高度於XK50管柱(新樹脂))上。取DEAE載荷樣品及藉ELISA回溯分析效價。結合DEAE管柱載荷分別藉ELISA回溯分析為1.6x1012粒子/毫升樹脂。結合DEAE管柱以含250 mM NaCl之緩衝液洗滌及以25 mM磷酸鹽，300 mm NaCl，pH 6.5洗提。後結合DEAE材料於線上(當天)分析內毒素，決定為1.17x103 EU/mL，然後基於線上測量值以10000 EU/mL樹脂通過5毫升新預填充經消毒且經平衡的艾托里爾管柱(未經緩衝液調整)。次日，取樣DEAE匯集物材料第二樣品，稱做艾托里爾載荷，回溯分析內毒素為931 EU/mL，獲得7960 EU/mL樹脂的管柱載荷量。管柱載荷測定值的兩個結果間的差異 可能係由於檢定分析的變異。噬菌體產物載荷至管柱上，當A254增至20 mAU且於使用平衡緩衝液的洗滌步驟後降回20 mAU時，收集為流經選分。該回合結束時匯集所收集的選分。樣品要求在處理當天結束時使用液態氮執行瞬間冷凍且儲存於-65℃。剩餘樣品係維持於2-8℃。
於各步驟之第二次組合(下表40之回合2)中，後-TFF1材料以25 mM Tris，4M NaCl，pH 7.4稀釋1：1，接著為0.45/0.2微米過濾(1x沙托波2 150)，及然後載荷至經消毒且經平衡的HIC管柱(東洋珍珠苯基650M，440毫升管柱體積，22.4厘米床高度於XK50管柱，樹脂用於前一個週期)上。材料以25 mM Tris，250 mM NaCl，pH 7.4洗提。當A254開始且降至20 mAU時，收集噬菌體峰為單一匯集物。觀察得洗提物之傳導率開始降低後不久，噬菌體峰開始洗提出，導致氯化鈉濃度大於250 mM。要求瞬間冷凍的樣品係在處理當天結束時使用液態氮執行且儲存於-65℃。剩餘樣品係維持於2-8℃。
崔頓X-100係添加至0.1%終濃度，基於假設得自前一步驟的洗提物含有250 mM氯化鈉，氯化鈉添加至300 mM計算得的終濃度。然後材料以25 mM Tris pH 7.4回稀釋2.5倍，獲得傳導率匹配下一根管柱的管柱平衡緩衝液(29.1 mS)。也添加額外量崔頓X-100來維持0.1%濃度。此材料培養1小時接著為0.45/0.2微米過濾(1x沙托波2 150)。
減少DEAE層析術係使用25 mM Tris，300 mM NaCl，pH 7.4作為緩衝條件進行；減少DEAE管柱(菲特吉 EMD DEAE，80毫升管柱體積(CV)，15厘米床高度於XK26管柱(新樹脂))以3.09毫升後HIC材料/毫升樹脂載荷(計算考慮對稀釋及調整步驟的x2.9總稀釋倍率)。流經噬菌體材料係在A254開始且使用平衡緩衝液洗滌降至20 mAU時收集為單一匯集物。要求瞬間冷凍的樣品係在處理當天結束時使用液態氮執行且儲存於-65℃。剩餘樣品係維持於2-8℃。
後減少DEAE材料係以5體積25 mM磷酸鹽pH 6.5稀釋，接著0.45/0.2微米過濾(1x沙托波2 300)。此稀釋材料然後載荷至已消毒且已平衡的結合DEAE層析管柱(菲特吉EMD DEAE，372毫升管柱體積，19厘米床高度於XK50管柱(新樹脂))，以含250 mM NaCl之緩衝液洗滌，及以25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5洗提。結合DEAE步驟之載荷無法藉OD測定，原因在於載荷樣品內存在有崔頓-X100且此點的濃度低。因此管柱載荷係基於使用藉OD測定的後HIC材料之效價計算得的理論值效價，及假設90%減少DEAE步驟產率，同時考慮材料調整/稀釋步驟及於減少DEAE步驟的體積增加。使用此理論效價，管柱以5x1012噬菌體/毫升樹脂載荷。實際結合DEAE管柱載荷量藉ELISA回溯測定為4.4x1012粒子/毫升樹脂。當A254開始且降至20 mAU時，收集噬菌體峰為單一匯集物。要求瞬間冷凍的樣品係在處理當天結束時使用液態氮執行且儲存於-65℃。剩餘樣品係維持於2-8℃。
後減少DEAE材料係在線上(當天)分析內毒素及決定為1.57 EU/mL。因線上內毒素濃度測定為比回合1及3 顯著更低，管柱無法以10000 EU/mL樹脂載荷。因此，全部可用後結合DEAE材料載荷至管柱上來獲得63 EU/mL樹脂之管柱載荷，然後通過5毫升預填充經消毒且經平衡的艾托里爾管柱(先前用於回合1)。當A254增至20 mAU且於使用平衡緩衝液(25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5)的洗滌步驟後降回20 mAU時，收集噬菌體產物為流經選分。
於第三組合步驟(下表40回合3)中，使用回合2產生的後-HIC材料。以5體積稀釋緩衝液稀釋，接著0.45/0.2微米過濾(1x沙托波2 150)。基於使用藉OD測定的後HIC匯集物效價求出理論結合DEAE載荷效價，且考慮1於6結合DEAE載荷材料的稀釋，假設過濾無損耗，後過濾材料係以5x1012噬菌體/毫升載荷至結合DEAE管柱上。結合DEAE管柱載荷係藉ELISA回溯測定為5.3x1012粒子/毫升樹脂。
結合DEAE管柱(菲特吉EMD DEAE，34毫升管柱體積，16.9厘米床高度於XK16管柱(新樹脂))於使用前經消毒及平衡。材料係載荷至管柱上，使用含250 mM NaCl的洗滌緩衝液進行洗滌步驟，隨後噬菌體以300 mM NaCl洗提。當A254開始且降至20 mAU時，收集噬菌體峰為單一匯集物。要求瞬間冷凍的樣品係在處理當天結束時使用液態氮執行且儲存於-65℃。剩餘樣品係維持於2-8℃。
後結合DEAE材料於線上(當天)分析內毒素且測得為1.34E+4EU/mL。基於線上內毒素資料，管柱載荷於10720 EU/mL樹脂。次日取樣DEAE匯集物材料的第二樣品且定名為艾托里爾載荷，回溯分析內毒素為7.03E+3 EU/mL，獲得5624 EU/mL樹脂之管柱載荷。
艾托里爾管柱(5毫升預填充新管柱)於使用前經消毒及平衡。噬菌體材料載荷至管柱上，當A254增至20 mAU且於使用平衡緩衝液(25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5)的洗滌步驟後降回20 mAU時收集為流經選分。要求瞬間冷凍的樣品係在處理當天結束時使用液態氮執行且儲存於-65℃。剩餘樣品係維持於2-8℃。
有關本實例回合1-3之一般註釋：三個處理回合之後艾托里爾材料分析顯示並未檢測得任何殘餘班左酶，藉噬菌體檢定分析測定感染力在各回合間可相媲美(5.1-6.3x1011 pfu/mL)，落入於檢定分析之誤差範圍內。因檢定分析為非特異性，故ELISA檢定分析已知有特有的變異。ELISA檢定分析使用商業G3蛋白質捕捉抗體，該抗體實際上結合G8蛋白質。
回合1、2及3之結果顯示於下表。
基於此等結果，結合DEAE步驟顯示獲得HCP含量的最大減少，當崔頓X-100存在於本管柱的載荷材料時顯然更為有效(回合1及2比較回合3不含清潔劑)。處理回合2及3含括HIC步驟，顯示產生具有最低HCP含量於1.5-1.8 ng/mL(表41)的後艾托里爾材料，標準化為1x1014粒子，分別對回合2及3獲得95及70 ng/1x1014粒子(表42)。內毒素減少之最佳執行步驟適用於當遵照HIC步驟之後進行且有崔頓X-100存在於管柱材料(回合2、5.78對數減少(表40))及艾托里爾步驟具有2.7至5.7對數減少(回合1-3)執行時作為結合DEAE。得自回合2及3之後艾托里爾材料達成小於0.01 EU/mL的內毒素含量，標準化至1x1014粒子獲得<0.5 EU/1x1014粒子。
實例18.額外純化方案
下述純化絲狀噬菌體之方案也落入於依據本發明之方法之範圍內。須瞭解熟諳技藝人士將於適當時間進行材料的過濾及管柱的消毒與平衡。
依據回合3b，提供後TFF1材料且使用25 mM Tris，4 M NaCl，pH 7.4稀釋1：1。然後使用25 mM Tris，250 mM NaCl，pH 7.4洗提進行HIC層析術。然後後HIC材料以5體積25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋。其次，稀釋材料接受結合DEAE層析術，具有洗滌步驟接著於25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5洗提。然後後結合DEAE材料通過艾托里爾管柱，也使用25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5。
依據回合4，提供後TFF1材料且使用25 mM Tris，4 M NaCl，pH 7.4稀釋1：1。然後使用25 mM Tris，250 mM NaCl，pH 7.4洗提進行HIC層析術。然後後HIC材料使用5體積0.12%崔頓X-100，25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋(稀釋材料含有0.1%崔頓X-100)。其次，稀釋後材料接受結合DEAE層析術，具有洗滌步驟接著於25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5洗提。然後後結合DEAE材料通過艾托里爾管柱，也係使用25 mM磷酸鹽，300 mM NaCl，pH 6.5。
本發明之其它實施例對熟諳技藝人士經由考慮此處揭示之本發明說明書及實務將更為彰顯。意圖考慮說明書及實例僅為說明性，本發明之真正範圍及精髓係由如下申請專利範圍指示。
第1圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。測量於242奈米激光後於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例中，420毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第2圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示螢光(激光242奈米；發光334奈米)。M13峰經標示。於本實例中，320毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第3圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示於A254奈米的吸光比。M13峰經標示。於本實例中，320毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第4圖為得自DEAE AEX步驟的層析圖。顯示螢光(激光242奈米；發光334奈米)。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋六倍，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，150 mM氯化鈉及25 mM磷酸鹽，pH 7.4，250 mM氯化鈉以100毫升/分鐘流速的連續洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第5圖為得自DEAE AEX步驟的層析圖。顯示於242奈米激光及於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例 中，約2升含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以10升25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋，且載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，150 mM氯化鈉及25 mM磷酸鹽，pH 7.4，250 mM氯化鈉連續洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第6圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於242奈米激光及於334奈米發光的螢光(本回合的相對應吸光比線跡係提供於第7圖)。M13峰經標示。於本實例中，750毫升含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以750毫升25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第7圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於A254奈米的吸光比(本回合的相對應螢光線跡係提供於第6圖)。M13峰經標示。於本實例中，750毫升含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以750毫升25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第8圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示於激光242奈米及於發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，400毫升含有M13的得自第一超濾步驟的滲餘物係以等體積25 mM Tris pH 7.4/4M氯化鈉稀釋，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris， pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第9圖為得自DEAE步驟的層析圖。顯示於激光242奈米及發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋六倍，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，150 mM氯化鈉及25 mM磷酸鹽，pH 7.4，250 mM氯化鈉的連續洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第10圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於242奈米激光及於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以等體積25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第11圖為得自苯基HIC步驟的層析圖。顯示於激光242奈米及於發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，含有M13的得自深度過濾步驟的上清液係以等體積25 mM Tris pH 7.5/4M氯化鈉稀釋，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至苯基HIC管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，2M氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，250 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第12圖為得自DEAE步驟的層析圖。顯示於激光242奈 米及發光334奈米的螢光。M13峰經標示。於本實例中，3升含有M13的得自HIC苯基步驟的洗提物係以10升25 mM磷酸鹽，pH 6.5稀釋，且使用蠕動泵浦以100毫升/分鐘載荷至DEAE管柱上。於使用25 mM磷酸鹽，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌後，M13係以25 mM磷酸鹽，pH 6.5，300 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第13圖為得自AEX Q步驟的層析圖。顯示於242奈米激光及於334奈米發光的螢光。M13峰經標示。於本實例中，約3升含有M13的得自DEAE AEX步驟的洗提物係以2升25 mM Tris pH 7.4稀釋，且載荷至AEX Q管柱上。於使用25 mM Tris，pH 7.4，200 mM氯化鈉的洗滌步驟後，M13係以25 mM Tris，pH 7.4，280 mM氯化鈉之階級梯度洗提。
第14圖顯示使用實例5所述方法從分析AEX管柱(普隋(ProSwift)WAX-1S)純化的M13之洗提輪廓圖。5微升淨M13係以75微升緩衝液A(50 mM磷酸鹽，pH 7.5)稀釋。M13係以從100%緩衝液A至100%緩衝液B(50 mM磷酸鹽，pH 2.2/2M氯化鈉)之線性梯度洗提。
第15圖顯示使用庫瑪西(Coomassie)染色的SDS PAGE凝膠的影像，於該處管柱1係載荷以藉實例5摘述之純化程序製造的絲狀噬菌體。管柱2係載荷以10微升分子量標記(標記12；英維仇貞(Invitrogen))，及管柱3係載荷以陽性對照(參考M13；批次5)。在全部線道(標記除外)M13係以1.5x1011載荷。本凝膠顯示存在有主被覆蛋白質g8p而缺乏其它主蛋白質污染物帶。
第16圖顯示使用實例4(批次2)所述方法從分析AEX管 柱(普隋WAX-1S)純化的M13之洗提輪廓圖。5微升淨M13係以75微升緩衝液A(50 mM磷酸鹽，pH 7.5)稀釋。M13係以從100%緩衝液A至100%緩衝液B(50 mM磷酸鹽，pH 2.2/2M氯化鈉)之線性梯度洗提。
第17圖顯示SDS PAGE凝膠，於該處管柱1係載荷以陽性對照(批次5)，管柱2係載荷以藉實例4摘述之純化程序製造的絲狀噬菌體(批次2)，及管柱3係載荷以10微升分子量標記(標記12；英維仇貞)。在全部線道(標記除外)M13係以1.5x1011載荷。本凝膠顯示存在有主被覆蛋白質g8p而缺乏其它主蛋白質污染物帶。
第18圖顯示使用PEG沈澱及2x氯化銫密度梯度(超離心法)從分析AEX管柱(普隋WAX-1S)純化的M13之洗提輪廓圖。參考實例7。5微升淨M13係以75微升緩衝液A(50 mM磷酸鹽，pH 7.5)稀釋。M13係以從100%緩衝液A至100%緩衝液B(50 mM磷酸鹽，pH 2.2/2M氯化鈉)之線性梯度洗提。
第19圖顯示SDS PAGE凝膠，於該處管柱1係載荷以使用PEG沈澱及2x氯化銫密度梯度法所產生的M13批次。參考實例7。管柱2係載荷以10微升分子量標記(標記12；英維仇貞)，及管柱3係載荷以已純化絲狀噬菌體(批次2；實例4)的陽性對照(批次2；實例4)樣品，且管柱3具有標記。在全部線道(標記除外)M13係以1.5x1011載荷。本凝膠顯示存在有主被覆蛋白質g8p而缺乏其它主蛋白質污染物帶。

Claims (21)

  1. 一種包含野生型絲狀噬菌體或不顯示一抗體或一非絲狀噬菌體抗原在其表面上的絲狀噬菌體之組成物，該組成物係包含每個絲狀噬菌體少於1x10-10內毒素單位。
  2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其係包含每個絲狀噬菌體少於1x10-11內毒素單位。
  3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其係包含每個絲狀噬菌體少於1x10-12內毒素單位。
  4. 如申請專利範圍第1項之組成物，其係包含每個絲狀噬菌體少於1x10-13內毒素單位。
  5. 如申請專利範圍第1項之組成物，其係包含每個絲狀噬菌體少於5x10-14內毒素單位。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之組成物，其中該組成物為一液體組成物。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之組成物，其係含有至少4x1017絲狀噬菌體。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之組成物，其中該絲狀噬菌體為M13。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之組成物，其係額外地包含一藥學上可容許之賦形劑，該組成物係調配用於藥學投予。
  10. 如申請專利範圍第9項之組成物，其係呈固體形式。
  11. 如申請專利範圍第9至10項中任一項之組成物，其係調配成錠劑、粒劑、奈米粒劑、奈米膠囊劑、微膠囊劑、 微錠劑、丸劑、或散劑。
  12. 如申請專利範圍第9至11項中任一項之組成物，其係調配成單一劑型。
  13. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該單一劑型係含在一小瓶內。
  14. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該單一劑型係含在一輸注袋或泵浦貯槽內。
  15. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該單一劑型係含在一或多個錠劑或膠囊劑內。
  16. 如申請專利範圍第10至15項中任一項之組成物，其係包含定量內毒素，該內毒素當投予一人體時係提供每劑每千克體重少於5.0內毒素單位。
  17. 如申請專利範圍第16項之組成物，其係包含定量內毒素，該內毒素當投予一人體時係提供每劑每千克體重少於0.2內毒素單位。
  18. 如申請專利範圍第10至17項中任一項之組成物，其係用於一腦病或以澱粉樣蛋白斑為其特徵之一疾病的診斷、治療或預防。
  19. 一種用於一腦病或以澱粉樣蛋白斑為其特徵之一疾病的診斷、治療或預防的包含絲狀噬菌體之組成物，該組成物係包含每個絲狀噬菌體少於1x10-10內毒素單位。
  20. 如申請專利範圍第18或19項之組成物，其中該疾病係選自於阿茲海默氏病、SAA澱粉樣變性、遺傳性冰島症候群、早衰症、多發性骨髓瘤、克魯病、庫賈氏病(CJD)、 哲史許氏病(GSS)、致命性家族型失眠症(FFI)、綿羊搔癢病、牛海綿樣腦炎(BSE)、帕金森氏病、肌萎縮性脊側索硬化/帕金森-失智綜合症、嗜銀顆粒失智症、腦皮質及基底神經節退化、拳擊手型失智症、帶有鈣化的瀰漫性神經原纖維纏結、唐氏症候群、鏈結至染色體17帶有帕金森氏症的額顳失智症、哈史氏病(Hallervorden-Spatz disease)、肌強直性營養不良、C型聶皮氏病(Niemann-Pick disease)、帶有神經原纖維纏結的非關島運動神經元病、皮克氏病、腦炎後帕金森症候群、進行性皮質下神經膠質增生、進行性核上性神經麻痺、亞急性硬化泛腦炎、及只有纏結的失智症。
  21. 如申請專利範圍第20項之組成物，其中該病係選自於早發型阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、或症狀前阿茲海默氏病。
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