CN101778860A - α-1-抗胰蛋白酶和载脂蛋白A-I的纯化方法 - Google Patents

α-1-抗胰蛋白酶和载脂蛋白A-I的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及例如从人血浆的一个部分中对于α-1-抗胰蛋白酶(AAT，亦称α-1蛋白酶抑制剂、API、以及A1-P1)和载脂蛋白A-I(ApoA-I)二者都进行分离与纯化的方法。在某些具体实施方式中，本发明提供了在纯化的最初阶段将ApoA-1与AAT分离的方法，这样同一起始材料能够被用作对于这两种蛋白的来源。这些方法进一步涉及提供适合于药物的用途的AAT和ApoA-1的组合物，并且适合于进行大规模的纯化。

Description

α-1-抗胰蛋白酶和载脂蛋白A-I的纯化方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年8月17日提交的美国临时申请第60/935,527号的优先权的权益，并将其全部内容通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及来自(例如)人血浆的一个部分的α-1-抗胰蛋白酶(AAT，亦称为α-1蛋白酶抑制剂、API、以及A1-PI)和载脂蛋白A-I(ApoA-I)二者的蛋白分离与纯化的方法。在某些具体实施方式中，本发明提供了在纯化的最初阶段将AAT与ApoA-I分离的方法，这样使得同一起始材料能够被用作对于这两种蛋白的来源。这些方法进一步涉及提供AAT和ApoA-I的组合物，这些组合物适合于药物的用途并且适合于大规模纯化。
背景技术
许多基于蛋白的生物药剂是从人血浆分离的。原料人血浆(它们部分依赖于志愿的血液捐赠)的有限供应结合总体上的低浓度、高脆性、以及在血浆蛋白纯化中的有限的产率使得这种类别的药物的制造是困难的和昂贵的。因此存在这样一种需要：提高血浆蛋白的纯化方法的效率，这样使得能够以可达到的最高的产率从相同的人血浆样品中分离出尽可能多的医学上有关的蛋白。
由于蛋白的多样性、与每种蛋白制品有关的可能的污染物和/或杂质的性质改变、以及对于生物药剂的生产通常需要大量的蛋白，因此对于人血浆蛋白的蛋白分离与纯化的方法提出了独特的挑战。纯化技术总体上包括一系列纯化步骤，这些步骤具有分离一种单一目标蛋白的目的。
α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和载脂蛋白A-I(ApoA-I)是可以被制成生物药剂的人血浆蛋白的实施例。已经说明了使用专用的纯化工艺来纯化这些蛋白的方法。例如PCT公开号WO04060528说明了一种用于AAT的纯化工艺以及美国专利号5,089,602说明了ApoA-I的纯化，每种工艺开始于人血浆部分并且各自得到一种单一蛋白的产品。
我们现在已经发展了多种方法，这些方法允许从相同的人血浆的部分开始的AAT和ApoA-I的纯化。这些方法适合于大规模纯化，因此为工业上适用的制造过程提供了基础。本发明提供了用于在纯化初期将AAT与ApoA-I分离的方法，这样使得同一起始材料能够被用作一种起始材料来纯化这两种蛋白；以及在所述分离之后生产药物级的AAT和ApoA-I的方法。
ApoA-I是高密度脂蛋白(HDL)的一种28kDa的主要蛋白组分并且它在为排泄或再循环进行的从外周至肝脏的胆固醇逆向转运中起一种关键作用。
特别在重建的HDL样颗粒中的ApoA-I长期以来已被说明为具有治疗的潜能。最近刚发表的一项研究强调了这种潜能(JAMA(2007)；vo1.297，p.1675-1682)。
已经发展了多种用于ApoA-I的纯化技术。
小规模纯化ApoA1的最常见的途经之一是使用超速离心以便分离HDL，接着从该HDL-颗粒中分离ApoA-I。存在若干不同的途径来从HDL中纯化ApoA-I，包括溶剂提取。超速离心是一项非常耗时的方法，并且它不适合大规模的分离。
也已经说明了不包括超速离心的使用血浆作为起始材料的方法，例如：层析纯化法(Ross S.E.等人，Rapid chromatographic purification of apolipoproteins A-I andA-II from human plasma，Analytical Biochemistry 149，p.166-168(1985))以及使用凝胶过滤HPLC的纯化法(Tricerri A.等人.，A rapid and efficient procedure for thepurification of human apolipoprotein A-I using gel-filtration HPLC，IJBC，1，p.159-166(1994))。使用来自人血浆的冷乙醇分级分离的部分作为起始材料的其他方法也已经被公布(Peitsch等人，A purification method for apolipoprotein A-I and A-II，Analytical Biochemistry，178.p.301-305(1989))。
授予Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Blutspendedienst SRK的EP0329605和Lerch等人的Isolation and properties of apolipoprotein A for therapeutic use，ProtidesBiol.Fluids，36，p.409-416(1989)涉及从含有脂蛋白的人血浆的部分中制备载脂蛋白。两个公开文件均报道了可以将冷乙醇分级分离过程的沉淀B和IV用作起始材料用于生产ApoA-I。利用含有高乙醇浓度的缓冲液、任选地用一种有机溶剂来使污染物沉淀。将这些沉淀溶解在盐酸胍中，随后通过凝胶过滤或透析过滤将其除去。包括了阴离子交换层析步骤以便在ApoA-I通过时结合这些污染物。可任选的是，提出了通过吸附到一种第二离子交换树脂上来浓缩ApoA-I。
WO9807751也报道了使用离子交换层析用于ApoA-I的分离。
α-1-抗胰蛋白酶(AAT)是一种主要的丝氨酸肽链内切酶抑制剂，它以大约1.9g/1至3.5g/l的浓度存在于人血浆中。这种大约53kDa的糖蛋白是在肝脏中产生的并且抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(一种参与特别是肺中的结缔组织的蛋白水解作用的酶)。AAT在天冬酰胺残基46、83、以及247上具有三个N-糖基化位点，通过复合的二触角和三触角聚糖(triantennary glycans)的混合物使这三个残基糖基化。这产生了具有在4.0至5.0范围内的等电点的多种AAT异构体(isoform)。通过AAT的蛋白酶抑制作用是调节组织蛋白水解作用的必需的成分，并且AAT的缺陷与若干种疾病的病理学有关。例如，遗传了AAT缺陷的个体具有的患严重的早发性肺气肿的风险增加，这种疾病是由人白细胞弹性蛋白酶对肺组织产生的未调节性破坏的结果。已经显示外源性的人AAT的给药在AAT缺陷的患者中抑制了弹性蛋白酶并且与存活率的提高以及肺功能的减退率的降低有关(Crystal等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.158：49-59(1998)；对于综述，见R.Mahadeva and D.Lomas，Thorax53：501-505(1998))。
因为治疗的有用性，商品化的AAT生产已经成为大量研究的主题。在大肠杆菌中(R.Bischoff等人，Biochemistry 30：3464-3472(1991))、酵母中(K.Kwon等人，J.Biotechnology 42：191-195(1995)；Bollen等人，U.S.Patent No.4,629,567)、植物中(J.Huang等人，Biotechnol.Prog.17：126-33(2001))生产重组的AAT，以及通过在转基因哺乳动物的乳汁中分泌(G.Wright等人，Biotechnology，9：830-834(1991)；A.L Archibald，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：5178-5182(1990))来生产重组的AAT已经取得了许多进展。然而，从人血浆中分离AAT目前是大量获得AAT的最有效率的实用方法，并且人血浆是唯一的被FDA批准的来源。
已经说明了许多用于从人血浆部分中分离与纯化AAT的方法，包括沉淀、吸附、提取、以及层析步骤的组合。绝大多数公布的用于分离AAT的方法是开始于人血浆的一种或多种部分，这些人血浆部分被称为Cohn部分IV沉淀(例如Cohn部分IV、或更具体的部分IV1、以及部分IV1-4)以及Kistler-Nitschmann上清液A或A-I的沉淀，它们是在一系列乙醇沉淀以及pH调整之后作为糊状物从血浆中获得的(E.J.Cohn等人，J.Amer.Chem.Soc.，68：459-475(1946)；P.Kistler，H.S.Nitschmann，Vox Sang.，7：414-424(1962))。
Glaser等人的Preparative Biochemistry，5：333-348(1975)说明了一种从Cohn部分IV1糊状物中分离AAT的方法。在pH 8.5的磷酸盐缓冲液中对该糊状物进行搅拌以便于使该AAT恢复活性，AAT被科恩分级分离法(Cohn fractionation)中采用的5.2的pH大部分灭活。在透析以及离心之后，使上清液经历在pH 6.0至pH 7.6以及在pH 8.6的两轮阴离子交换层析，接着经历在pH 7.6以及在pH 8.0的进一步层析处理，以便产生大约30％总产率的AAT。
Lebing和Chen在美国专利号5,610,285中说明了一种纯化过程，该方法采用初始的阴离子交换层析步骤，接着通过在低pH以及低离子强度下的阳离子交换层析来从血浆以及血浆部分中纯化出人AAT。该阳离子层析法利用了这样的事实，即在这些条件下活性的AAT不结合该离子交换柱，而污染蛋白(包括变性的AAT以及清蛋白)被保留下来。
Coan在美国专利号4,697,003中说明了一种用于从不同的Cohn血浆部分中分离AAT的方法，该方法包括从含有AAT的部分中除去乙醇以及盐类，接着在一些条件下在DEAE纤维素或在一种相似的材料上进行的阴离子交换层析，这些条件使得AAT被保留在柱上而不希望有的蛋白被洗脱。Coan还说明了在大约60℃或更高的温度持续大约10小时的“巴斯德杀菌法”，该方法被表述为足以使肝炎病毒不具传染性。
Glaser等人在Anal.Biochem.，124：364-371(1982)中以及还在欧洲专利申请EP 0067 293中说明了在一种用于从Cohn部分IV1沉淀分离AAT的方法上的若干变化，该方法包括以下步骤：(a)将糊状物溶解于pH 8.5的缓冲液中；(b)过滤；(c)添加二硫酚，例如DTT；以及(d)用硫酸铵来沉淀变性蛋白。Glaser等人说明了一种变化，其中用DTT的处理是在2.5％的AEROSILTM气相白炭黑(silica)的存在下进行的，之后用50％饱和的硫酸铵进行沉淀。AAT的回收与不存在白炭黑时一样好，并且该纯化因子(purification factor)提高了大约70％。Glaser阐明了可以将Aerosil 380用在该方法中以便除去α-和β-脂蛋白。
Mattes等人在Vox Sanguinis 81：29-36(2001)中、以及在PCT公开文件WO98/56821、美国专利号6,974,792以及美国专利公开文件2002/0082214中披露了用于从Cohn部分IV中分离AAT的方法，该方法包括乙醇沉淀、阴离子交换层析、以及在羟基磷灰石上的吸附层析。据报道后面的步骤是将无活性的AAT除去，从而提供一种具有很高的比活性的产品，根据发明人，这是由于具有4.3和4.4的pI值的AAT异构体的富集，据说这些异构体不存在于在本领域中已知的其他高纯度的AAT制品中。
Key等人在PCT公开文件WO 04060528中披露了一种用于从包括AAT的部分(优先地从Cohn部分IV1-4)中分离AAT的方法，在允许AAT被溶解的条件下将含有AAT的蛋白混合物悬浮在缓冲液中；将生成的悬浮液与二硫化物-还原剂进行接触来产生还原的悬浮液；将该还原的悬浮液与不溶的蛋白-吸附材料进行接触；并且从该悬浮液除去不溶解的材料，进一步结合离子交换层析法以及疏水作用层析法。
Ralston和Drohan在美国专利号6,093,804中说明了一种方法，该方法包括通过“脂类去除剂(lipid removal agent)”将脂蛋白从初始的蛋白悬浮液中除去、接着通过用柠檬酸盐缓冲液从阴离子交换介质中洗脱而除去“无活性的AAT”。阐明了该脂类去除剂是MICRO CELTM E或Chromosorb ETM(一种合成的含水的硅酸钙)。在非-柠檬酸盐缓冲液的存在下，阴离子交换介质结合有活性的AAT同时允许“无活性的AAT”穿过。柠檬酸盐缓冲液被指明用于随后的AAT从该阴离子交换介质上洗脱，并且还用于更迟的从阳离子交换介质上洗脱。Ralston和Drohan没有说明二硫化物还原剂的使用。阐明该方法提供了具有大于90％的产品纯度(并且大于90％的纯化的AAT是活性的AAT)以及大于70％的制造规模产率的AAT。Ralston和Drohan阐明了Cohn部分IV1的制品特别含有了显著量的ApoA-I，并且指出这在纯化过程中具有抑制柱的流量和容量的效应。他们报道了用上述的“脂类去除剂”对该蛋白混合物悬浮液进行的处理除去了ApoA-I。
在PCT公开文件WO 05027821中Bauer说明了一种纯化AAT的方法，该方法从不同的Cohn部分(优选部分IV-1)开始，除去污染物质(即脂类、脂蛋白、及其他蛋白)并通过连续的层析步骤从非活性的AAT中分离活性的AAT。Bauer没有提及纯化ApoA-I将是令人希望的；相反，Bauer指出ApoA-I在纯化过程中抑制了柱流量并降低了容量，并且提出通过将污染的ApoA-I结合到气相白炭黑(AerosilTM)上来将其去除。Bauer既没有披露是否可以将ApoA-I从气相白炭黑上洗脱，也没有提出这将是令人希望的。
尽管AAT是对由于α-1-抗胰蛋白酶缺陷所致的肺气肿的一种有效治疗，由于该蛋白的限制供应以及复杂的制造过程，这种治疗是非常昂贵的(目前大约每年$25,000)。对用于从血浆以及其他含有AAT的复杂的蛋白混合物中分离人AAT的更有效率并且有成本效益的方法仍存有一种需求。
在上述讨论到的对于AAT的几乎所有的纯化方法中，脂蛋白(包括ApoA-I)作为污染物被丢弃，它通常仍然结合在脂类去除剂上。另一方面，公布的对于ApoA-I的纯化方法丢弃了在具有许多其他的血浆蛋白的混合物中的AAT。
仅在以上引用的美国专利号6,093,804中提到了从该同一人血浆部分中纯化AAT和ApoA-1二者，其中它阐明了可以在下一步的下游处理之前通过将ApoA-I吸附到合成的含水的硅酸钙上并且随后用0.5N NaOH进行洗脱将其从AAT中分离。它没有披露可以如何从始于同一人血浆部分的纯化方法中获得药物纯等级的AAT和ApoA-I。事实上，来自同一申请人的后来的一项申请(美国红十字会、PCT公开文件WO 05027821)指出这种方法不适合大规模的制备，特别指出如在美国专利号6,093,804中所说明的方法仅仅对于在几千克范围内的源材料的小规模到中等规模的处理是有效率的。
此外，如在美国专利号6,093,804中所提出的用0.5N NaOH来洗脱ApoA-I产生了大约pH 13.69的高碱性的环境，这会导致ApoA-I的部分的或甚至完全的脱酰胺作用(见Johnson A.等人，Biochem.Biophys.1989，268(1)：276-86)，并且可能导致不可逆变性。因为如果脱酰胺和/或变性，生物药剂通常丢失其生物活性并且更糟糕的是易于引起免疫原性反应，所以存在一种需要来开发较少地引起或不引起变性的另外的纯化方法。
发明内容
本发明披露了用于在纯化的最初阶段将AAT与ApoA-I分离的方法，这样使得能将同一起始材料用作这两种蛋白的来源；以及进一步将该分离的AAT和ApoA-I纯化到药物级纯度的方法。换言之，本发明披露了一种用于纯化ApoA-I以及AAT的方法，该方法包括下列步骤：i)对包括ApoA-I以及AAT的起始材料进行处理来从含有AAT的部分中分离含有ApoA-I的部分；ii)从该含有ApoA-I的部分中将ApoA-I纯化到药物级纯度；并且iii)从该含有AAT的部分中将AAT纯化到药物级纯度。
在本发明的意义上“药物级纯度”是指75％以上的纯度、优选85％以上、以及甚至更优选95％以上。
本发明的方法使脱酰胺作用和变性降到最低。这可以通过以下条件来获得：在纯化这两种蛋白的每个步骤中将pH保持在13.69以下、等于或低于13、等于或低于12、或者等于或低于11，或者可替代地使这些蛋白在pH为11或更高的pH孵育的时间降到最低。在一个具体实施方式中，可以通过确保pH是从7直到12、并且包括12，将ApoA-I和AAT的脱酰胺作用和变性降到最低。在另一个具体实施方式中，该pH范围是从8直到11、并且包括11。在又一个具体实施方式中该pH范围是从9直到10、并且包括10。使ApoA-I和AAT的脱酰胺作用和变性降到最低的pH值的一些具体的、但非限制性的实施例包括pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5以及11。在本说明书中任何地方所提及的pH保留在以上讲解的水平以下时，这些范围以及具体的pH点同样适用。
防止这些蛋白的脱酰胺作用会导致更少的变性并且生成的生物药剂药物将会有免疫原性的风险降低。
本发明确切地教导了实现AAT和ApoA-I的这种分离与纯化的四种不同的方法，所有这些方法都适合于大规模纯化。适合于大规模纯化在本发明的意义上意味着从数十千克的起始材料(例如人血浆部分)开始的纯化，例如从50千克或更多的人血浆部分开始。
在此具体涉及的所有公开文件以及专利申请均通过引用以其全文结合在此。除非另外限定，否则在此使用的所有的技术和科学术语均具有本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的意义。
术语“AAT”是指通常从人血清分离的人AAT。该术语旨在包括药理学上有效的自然发生的变体(见例如Brantly等人，Am.J.Med.84(sup.6A)：13-31(1988))。
术语“ApoA-I”是指通常从人血清分离的人ApoA-I。该术语旨在包括药理学上有效的自然发生的变体。
本领域的技术人员将会理解与在此说明的方法以及材料相似或等效的方法以及材料可被用于本发明的实施中，并且此类等效物意处于本发明的范围内。以下所说明的具体实施方式仅仅是作为举例提供的，并且本发明的范围不局限于所说明的特别具体实施方式。
根据本发明的方法可以将任何未纯化的含有实质性数量的AAT和ApoA-I的蛋白的混合物作为起始材料用于AAT和ApoA-I的纯化。根据一个具体实施方式，含有AAT和ApoA-I的蛋白混合物可以选自人血浆的一个部分，特别是选自血浆Cohn部分IV糊状物。术语“人血浆的部分”包括通过从血浆除去一种或多种血浆组分所获得的任何含有AAT和ApoA-I的起始材料。在某些具体实施方式中，可以将Cohn部分IV1糊状物作为起始材料，但是相似的血浆部分的使用考虑在本发明的范围之内。替代的起始材料包括但不限于其他的含有AAT-和ApoA-I的Cohn部分、来自Kistler-Nitschmann上清液A或A+I的沉淀(P.Kistler，H.S.Nitschmann，Vox Sang.，7：414-424(1962))、以及如由Schultze等人在美国专利号3,301,842中所说明的来自血浆的硫酸铵沉淀。本发明的所有方法的一个共同的步骤是对该人血浆部分进行处理，其方式为使得AAT和ApoA-I都溶解。
在本发明的一个具体实施方式中，AAT和ApoA-I的分离与纯化可以通过调整pH以及在该AAT/ApoA-I悬浮液中低级脂肪醇的浓度来实现，这样使得ApoA-I沉淀而AAT保持在溶液中。可以将这种沉淀的ApoA-I从含有AAT的溶液中分离。本发明提供了用于从悬浮液中使ApoA-I沉淀的新颖和有利的条件。虽然本领域(例如专利申请EP0329605)提出用低级脂肪醇将ApoA-I沉淀可能适合于大规模处理，但是发现了在本领域教导的条件下ApoA-I与AAT一起沉淀。同样，AAT的产率降低并且AAT被部分灭活。本发明解决了从AAT中分离ApoA1的问题，同时还防止了在通过用处于5％和25％(v/v)之间的浓度和pH 4到pH 8之间的pH低级脂肪醇使ApoA-I沉淀来将ApoA-I从包括AAT和ApoA-I二者的溶液中分离时AAT的损失和灭活。
本发明的某些具体实施方式教导了AAT和ApoA-I的分离与纯化的方法，其中该AAT/ApoA-I溶液的pH用ApoA-I结合剂进行处理并且任选的是可以用DTT进行处理，将其调整为使得ApoA-I与ApoA-I结合剂相结合。ApoA-I结合剂的实施例包括气相白炭黑(例如AerosilTM)、脂类去除剂(LRATM)、或特异的ApoA-I结合配体像Cibacron blueTM衍生物(Ciba)；三嗪衍生物(Prometic)或VHH抗体片段(The Bio Affinity Company)。在某些具体实施方式中，可以将ApoA-I结合至气相白炭黑。可以将与气相白炭黑结合的ApoA-I从含有AAT的溶液分离并且可以在下一个步骤中将ApoA-I从该气相白炭黑洗脱。在不同的具体实施方式中，在小于pH 13.69、等于或低于13、等于或低于12、或者等于或低于11的pH可以将ApoA-I从气相白炭黑洗脱。
在一些具体实施方式中，本发明教导了一种AAT和ApoA-I的分离与纯化的方法，其中AAT/ApoA-I溶液是在其中两种蛋白都不结合的条件下用二硫苏糖醇(DTT)和气相白炭黑(Aerosil 380)进行处理的。将该可溶的AAT/ApoA-I部分从沉淀的气相白炭黑/污染的蛋白中分离，从而产生含有AAT和ApoA-I的上清液。将AAT和ApoA-I进一步用离子交换层析法进行纯化并且在随后的疏水作用层析法步骤的过程中进行分离。
在不同的具体实施方式中，本发明教导了一种AAT和ApoA-I的分离与纯化的方法，其中将AAT/ApoA-I溶液在一些条件下穿过阴离子树脂交换柱，其中ApoA-I与AAT两者都不结合该离子交换柱，随后在一些条件下将该流穿液(flow through)与疏水作用层析(HIC)柱相接触这样使得ApoA-I可以结合并且AAT可以保持可溶并且在该流穿液部分中可以将其从ApoA-I中分离。
在AAT与ApoA-I分离之后，可以通过本领域中已知的用于蛋白纯化的任何方法对含有AAT和ApoA-I的溶液分别进行进一步处理，特别通过已经知道的适合于纯化AAT或ApoA-I的方法。
在某些具体实施方式中，减少病毒的步骤可以在以下详细说明的蛋白纯化步骤过程中或在蛋白纯化步骤之后来完成，可以将纯化的蛋白灭菌并且在药物的适当的储存缓冲区中配制、并且将其冻干或储存为液体配制品。
从下列详细说明中其他的目的、特征、以及优点将会变得明白。给出了详细说明以及具体的实施例仅供说明之用，因为对于本领域的技术人员而言从这一详细说明中本发明的精神和范围之内的不同的改变和变更将会变得明白。此外，这些实施例展现了本发明的原理而不能期望它们将本发明的应用确切地展示为对本领域的普通技术人员而言显而易见会是有用的全部实施例。
附图说明
图1：流程图展示了如在实施例2中所详细说明的ApoA-I以及AAT的分离的具体实施方式。
具体实施方式
本发明提供了在纯化的最初阶段将AAT与ApoA-I分离的方法，这样使得能将同一起始材料用于这两种蛋白。本发明还提供了将这些分离的AAT和ApoA-I分别大规模地进一步纯化至药物级纯度的方法。本发明的方法使脱酰胺作用和变性降到最低。这可以通过以下条件来获得：在这两种蛋白的纯化的每个步骤保持pH在13.69以下、等于或低于13、等于或低于12、或者等于或低于11，或者可替代的使将这些蛋白在pH 11或更高的pH孵育的时间降到最低。将这种暴露的持续时间降到最低，例如，在某些具体实施方式中pH值等于或高于11的时间不应超过5h以上。在一些具体实施方式中，pH值等于或高于pH 11的时间不应超过1h。在其他的具体实施方式中，在25℃pH值等于或高于pH 11的时间不应超过30min。在更高的温度可接受的暴露时间甚至更短，在较低的温度可接受的暴露时间可以更长。防止将有待纯化的蛋白的脱酰胺作用会导致相当程度上更小的变性并且极大地降低生成的生物药剂学药物将会有免疫原性的风险。在一个具体实施方式中，可以通过确保pH是从7直到12并且包括12来使ApoA-I以及AAT的脱酰胺作用和变性降到最低。在另一个具体实施方式中，该pH范围是从8直到11并包括11。在又另一个具体实施方式中该pH范围是从9直到10并包括10。使ApoA-I以及AAT的脱酰胺作用和变性降到最低的pH值的一些具体的、但非限制性的实施例包括pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5以及11。
根据本发明的方法可以将任何未纯化的含有实质性数量的AAT和ApoA-I的蛋白混合物作为起始材料用于AAT和ApoA-I的纯化。根据一个具体实施方式，含有AAT和ApoA-I的蛋白混合物可以选自于来自人血浆的一个部分，特别是来自血浆Cohn部分IV糊状物。在某些具体实施方式中，Cohn部分IV1糊状物是起始材料，但是相似的血浆部分的使用考虑在本发明的范围之内。替代的起始材料包括但不限于其他的含有AAT-以及ApoA-I的Cohn部分、来自Kistler-Nitschmann上清液A或A+I的沉淀(Kistler and Nitschmann，Vox Sang.，7：414-424(1962))、以及如由Schultze等人在美国专利号3,301,842中所说明的来自血浆的硫酸铵沉淀。
可以通过将人血浆冷却到在-2℃至2℃之间的温度并且将其调整到大约6.9至7.5的pH来制备Cohn部分IV1糊状物。在添加冷乙醇至大约6％到10％(v/v)的浓度并且降温至大约-4℃到0℃之后，形成了称作部分I(Fraction I)的沉淀，然后将其通过离心或过滤而除去。然后可以将来自以上操作的滤液或上清液调整到大约6.7至7.1的pH并且可以添加冷乙醇至大约18％到22％(v/v)的浓度。然后可以将该温度降低至大约-7℃至-3℃，并且再次使该混合物经受离心或过滤。现在形成的沉淀称作部分II+III，可以将其除去并且用来纯化其他的蛋白。然后可以将这第二种滤液或上清液调整到大约5.0至5.1的pH，将乙醇浓度调整至大约20.0％至22.0％(v/v)，并且将该温度调整到大约-6℃至-3℃。现在将部分IV1沉淀出来并且可以通过离心或过滤来将其除去，并且以糊状物形式储存直到需要时。部分IV1糊状物含有AAT、ApoA-I、连同其他的污染的蛋白和脂类。
本发明的用于纯化ApoA-I以及AAT的方法适合于大规模纯化。适合于大规模纯化在本发明的意义上意味着即使当从数十千克的起始材料开始(例如从数十千克的人血浆部分开始)时也以高产率和高纯度纯化ApoA-I以及AAT。在一些具体实施方式中，纯化从超过50kg的人血浆部分开始。在一些具体实施方式中，纯化从50kg以上的Cohn部分IV1开始，后者是相当于大约900升的起始容积的人血浆。还可以将在介于3000升和4000升之间的范围中或更高的人血浆的起始容积用于本发明的方法中。如用SDS-Page以及免疫测定法(例如ELISA)或浊度测定法的所测定的：根据本发明纯化的AAT具有96％以上的纯度。典型地，大约79％至99％的纯化的AAT是有活性的，平均大约90％。基于Cohn部分IV1的有功能活性的AAT含量的回收率是在人血浆中正常含量的大约40％至60％或大致20％至40％。
根据本发明纯化的ApoA-I具有至少75％的纯度。使用某些具体实施方式，ApoA-I的纯度是85％以上。产率至少是15％。使用某些具体实施方式，与在血浆中的ApoA-I含量相比较，产率至少是30％。
在本发明的一些具体实施方式中，可以通过调整在AAT/ApoA-I溶液中的pH以及低级脂肪醇(例如乙醇)的浓度而使得ApoA-I沉淀出来而AAT保持在溶液中从而实现AAT和ApoA-I的分离与纯化。可以将沉淀的ApoA-I从含有AAT的溶液中分离。EP0329605报道了可以通过用低级脂肪醇进行沉淀来从重悬的人血浆部分中沉淀出ApoA-I。
我们现在已经发现，在EP0329605中披露的一些条件下浓度40％(v/v)以下的低级脂肪醇来沉淀ApoA-I没有导致ApoA-I以及AAT的分离并且还导致伴随性的AAT的损失和灭活，并且因此对于这两种蛋白的纯化方法是不适合的。低级脂肪醇在本发明的意义上是指具有C1-C4的脂肪醇，例如：甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇。
现在已经令人惊奇地发现在低级脂肪醇(例如乙醇)低到近似5％至25％(v/v)的浓度在4.5至6.5的pH可以将ApoA-I沉淀而AAT保持在溶液中并且保留它的活性。在一些具体实施方式中，pH是5至6。在某些具体实施方式中，低级脂肪醇的浓度是大约7％至15％(v/v)。在某些具体实施方式中，低级脂肪醇的浓度是大约8％至14％(v/v)。在更高的pH，例如6.5以上，ApoA-I的沉淀作用将会被降低，而在较低的pH，例如4.5以下，AAT也将会逐渐地被沉淀。在低级脂肪醇的较低的浓度下，例如5％(v/v)以上的乙醇浓度，ApoA-I将不沉淀，而在低级脂肪醇的较高的浓度下，例如在25％(v/v)以上的乙醇浓度，AAT也将会被逐渐地沉淀。在不同的具体实施方式中，在一个或多个沉淀作用步骤过程中可以将温度保持低于大约10℃。
除允许ApoA-I以及AAT的分离以及在沉淀ApoA-I时防止AAT的损失以及灭活之外，本发明的方法还提供了比相关领域中所建议的更为经济的用低级脂肪醇来沉淀ApoA-I的途径。同样，由于使用较低的浓度的低级脂肪醇降低了爆炸危险，导致在沉淀步骤的制造单位的构建中耗费较低。
在沉淀步骤之后可以在一个或多个处理步骤中将AAT和ApoA-I分别地纯化至药物级纯度。在分离AAT和ApoA-I之后，可以通过在本领域中已知的用于蛋白纯化的任何方法对含有AAT和ApoA-I的溶液进行进一步处理，例如通过已经知道的适合于分别纯化AAT或ApoA-I的方法。
在本发明的一些具体实施方式中，可以将Cohn部分IV1重悬于大约50mM至150mM的Tris、0mM至30mM NaCl中(在大约8.0至10.0之间的pH)并且在大约0至10℃进行搅拌达至少1小时。在不同的具体实施方式中，pH可以在大约8.8以及9.6之间。在某些具体实施方式中，可以对该重悬的Cohn部分IV1的溶液进行搅拌达大约2小时至3小时。每kg的Cohn部分IV1可以使用大约6kg至18kg、或12kg至16kg的缓冲液。作为一个任选的使AAT产率最大化的步骤，可以将该Tris缓冲液悬浮液加热至大约40℃至45℃的温度达大约1小时至1.5小时的时间，然后再次冷却至大约0℃至10℃。
然后可以将该Tris缓冲液悬浮液冷却至大约0℃至2℃的温度。然后可以通过调整ApoA-I以及AAT的悬浮液至大约5.0至6.0的pH以及8％至14％(v/v)的乙醇浓度将ApoA-I沉淀。这种调整可以通过(例如)将预先确定量的乙醇与乙酸钠/乙酸的溶液加入到该Tris缓冲液悬浮液中来实现。在温度冷却至大约0℃至-7℃时，在大约30分钟至60分钟期间内可以加入该乙醇/酸溶液，然后将这些条件维持一段大约2小时至4小时的时间。为了促进随后的通过过滤进行的ApoA1分离，可以添加助滤剂(例如C1000)并且然后可以对该混合物进行搅拌最少15分钟。通过过滤可以将可溶的含有AAT的滤液从不溶解的ApoA-I材料中分离，优选地利用压滤机。可替代地，可以通过离心将不溶解的ApoA-I材料分离。
然后可以将以上所说明的分离方法的滤液或上清液中的AAT进一步纯化。在一些具体实施方式中，可以将AAT滤液调整至大约0℃至8℃以及大约8.8至9.6的pH。在调整pH之后，可以加入DTT至大约15mM至30mM的浓度。然后可以将该DTT处理的滤液在大约0℃至10℃混合达大约2至4小时，同时维持pH在大约8.8至9.6。然后可以在含有血浆的糊状物部分中以近似16.7g/L血浆当量的浓度将气相白炭黑加入到该溶液中。然后在大约0℃至10℃、在大约8.8至9.6的pH范围之内，可以对该悬浮液进行搅拌达至少30分钟。在一些具体实施方式中，将该溶液搅拌达大约1小时至4小时。在这一阶段该AAT滤液的剩余的杂质可以结合气相白炭黑的悬浮液，然后它形成沉淀。作为气相白炭黑，例如可以使用AerosilTM。使用压滤机可以将保持在溶液中的AAT从已沉淀的气相白炭黑以及污染的蛋白中分离，可任选的是在添加助滤剂(像C1000)之后，产出纯化的AAT滤液。如果使用助滤剂，数量可以是每1kg的气相白炭黑大约3kg的助滤剂。在不同的具体实施方式中，可以将悬浮液通过压滤机再循环直到获得希望的澄清度的水平。
在如下所述的具体实施方式中，可以使滤液首先经受用盐梯度洗脱的离子交换层析(“IEC”)。层析柱可以含有阴离子交换树脂，该阴离子交换树脂由多孔的树脂支承基质组成，带正电荷的基团被共价附着在基质上。这些带正电荷的基团可逆地结合阴离子，包括具有阴离子基团的蛋白，例如AAT。
AAT以及在洗脱缓冲液的pH时具有净负电荷的其他的蛋白可以与IEC柱结合。具有很少或没有负电荷的污染的蛋白可以穿过阴离子交换树脂柱而没有结合并且随柱流出液排出。然后通过梯度洗脱将那些结合到柱上的污染的蛋白与AAT分离。在对柱进行洗脱时盐浓度可以是逐渐增加的以便依次释出与树脂结合的不同的蛋白。
可以将AAT最终的滤液直接施加在含有阴离子交换树脂的层析柱上，用IEC平衡缓冲液使之平衡(大致50mM的Tris以及大约8.6至8.9的pH)。可以用AAT最终的滤液来将该柱负载至预先测定的蛋白容量的大致50％至70％。然后通过用IEC洗涤缓冲液(例如大致50mM Tris、大约25mM至65mM NaCl、以及大约7.1至7.7的pH)清洗该柱能将污染物除去，并且使用IEC洗脱缓冲液(例如大致50mM Tris、大约70mM至120mMNaCl、以及大约7.1至7.7的pH)随后可以将AAT洗脱。
在如下所说明的某些具体实施方式中，可以使来自IEC柱的含有AAT的洗出液经受疏水作用层析(“HIC”)。这类层析法采用支持基质，多个部分(moieties)被共价附着在该支持基质上。在水相环境中，这些疏水的部分可以可逆地结合至疏水的分子上，例如污染的蛋白仍保持在该IEC洗出液中。AAT是相对非疏水的。因此，在用缓冲液将该柱洗脱的过程中大多数AAT可以通过该柱，而更疏水的污染的蛋白保持结合在柱上。这样该柱流出液含有已纯化的AAT。在实践中，已经发现AAT对于某些HIC柱介质具有微小的亲和力，并且在此情况下进一步用若干体积的洗涤缓冲液洗脱可以是所希望的以便回收在最初应用的样品中的实质上全部的AAT。
通过添加硫酸铵至大致0.9至1.1M的终浓度，可以将来自IEC柱的洗出液制备用于HIC。然后可以将该溶液过滤并且施加在疏水作用柱上，柱子已经用HIC洗涤缓冲液(如大致50mM Tris、大约1M硫酸铵、pH大约7.3至7.5)平衡。然后可以将该柱负载在大约25克至75克蛋白/L重力沉降树脂的范围内。在负载过程中，AAT没有与该疏水的柱基质结合并且通过该柱。在该负载完成时，使用HIC洗涤缓冲液可以将保持在该填充柱中的未结合的AAT从柱上洗掉。可以将组合的柱流穿液以及随后的洗液通过超滤法进行并使其透析过滤(diafilter)进入磷酸盐缓冲液(大约40mM磷酸钠以及大致在7.2至7.6之间的pH)。该最终的AAT浓度优选地是不大于7％蛋白。
在此类达到希望的纯度以及活性的水平所需要的附加的纯化步骤之后，然后可以将该AAT溶液进行浓缩以及灭菌。在不同的具体实施方式中，在疏水作用层析之后AAT可以是在药学上可接受的纯度和活性水平，并且附加的步骤可能不是必需的。在一些具体实施方式中，可以通过超滤法接着透析过滤法(透析过滤)来完成浓缩。在这些技术中，使溶剂以及溶解的盐类和小分子穿过过滤膜，留下更浓缩的蛋白质溶液。然后可以通过对像该产物连续添加若干体积的新的缓冲液使保持在该蛋白质溶液中的盐以及小分子与不同的缓冲液相交换，同时通过连续地使溶液通过同一个膜来维持恒定的产物体积。
然后可以将该AAT用药学上可接受的缓冲液来提供，并且通过在本领域中已知的方法或者以液体形式储存或者以冻干的形式储存，例如：通过已知的适合于制备AAT治疗配制品的方法。
从哺乳动物来源分离的蛋白可能含有病原性的病毒污染物，并且在药物组合物中减少或除去这样的污染物可以是所希望的。减少病毒的方法为相关领域中的技术人员所知。考虑能应用于本发明的方法包括但不限于：巴斯德杀菌法、辐射、溶剂/洗涤剂处理、消毒、过滤、以及用超临界流体处理。例如通过用聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯以及磷酸三丁酯接触蛋白质溶液，可以进行溶剂/洗涤剂处理(见美国专利号4,820,805；也见WO 95/35306用于对AAT组合物的方法的应用)。蛋白质溶液的消毒可以通过将该溶液暴露于可溶的病原体灭活剂来进行，例如在美国专利号6,106,773、6,369,048、以及6,436,344中披露的；或通过与不溶解的病原体灭活基质接触来进行，例如在美国专利号6,096,216以及其中的参考文献中披露的。可以通过15nm至70nm的超滤器进行过滤处理(例如VirAGardTM过滤器、A/GTechnology Corp；PlanovaTM过滤器、Asahi Kasei Corp；ViresolveTM过滤器、MilliporeCorp；DV以及OmegaTM过滤器、Pall Corp；连同来自GE Healthcare的中空纤维过滤器)。可以用紫外线或γ辐射来进行照射；例如见美国专利6,187,572以及其中的参考文献。在美国专利号6,465,168中说明了通过用超临界流体处理来灭活病毒。蛋白质溶液的巴斯德杀菌可以通过在由待处理的蛋白的热稳定性所规定的限制之内进行加热来完成。在AAT的情况下通过加热至大约60℃至70℃通常可以完成巴斯德杀菌法。在如下所说明的一些具体实施方式中，通过巴斯德杀菌法以及超滤法可以使该AAT浓缩物的病毒减少。在巴斯德杀菌步骤的过程中，可以加入稳定添加剂来保护AAT免遭热降解，例如在美国专利号4,876,241中披露的。可以将蔗糖以及乙酸钾作为稳定剂添加，并且然后可以将该稳定的AAT溶液在大约60℃进行巴氏灭菌来减少病毒污染物。该蔗糖的量可以是按重量计的至少40％、至少50％、或大约60％。已经发现使用小于40％蔗糖产生不希望的AAT的聚集水平。乙酸钾的量可以是按重量计的至少4％、至少5％、或大约6％。
在病毒减少以后，可以任选地将AAT溶液稀释以及超滤，然后重新浓缩并且灭菌(例如通过过滤)。然后可以将灭菌的含有AAT的浓缩物冻干来形成治疗的产品。在一些具体实施方式中，冻干的AAT粉末可以被制备在20mM磷酸钠、45mMNaCl、3％甘露醇中。这种组合物本身是适合于注射的，但是可以是冻干的并且保存在小玻璃管中用于以后用无菌水重新配制。
将AAT最终的滤液直接施加在含有阴离子交换树脂的层析柱上，该柱用IEC平衡缓冲液进行平衡(大致50mM Tris以及大约8.6至8.9的pH)。用AAT最终的滤液将该柱负载至预先测定的蛋白容量的大致50％至70％。然后通过用IEC洗涤缓冲液(大致50mM Tris、大约25mM至65mM NaCl、以及大约7.1至7.7的pH)清洗该柱将污染物从柱上除去，并且随后使用IEC洗脱缓冲液(大致50mM Tris、大约70mM至120mM NaCl、以及大约7.1至7.7的pH)洗脱AAT。
最终的配制品将会取决于选择的一个或多个病毒灭活步骤以及预定的给药方式。取决于是否AAT是通过注射给药、作为气溶胶给药、或局部给药，可以将AAT作为冻干的粉末、液体、或悬浮液来储存。用于吸入的干粉配制品的组合物可以是(例如)每一剂量7.44mg AAT、0.059mg柠檬酸钠、以及0.001mg柠檬酸的标称的含量。如在美国专利号5,780,014中所说明的，这样的配制品适合于吸入给药，用计量吸入器或用肺部的递送装置，例如在美国专利号6,138,668中所披露的。
根据本发明纯化的AAT具有96％以上的纯度，如通过SDS-Page以及免疫测定(例如酶联免疫吸附(ELISA)或浊度测定法)所测定的。典型地，大约79％至99％的纯化的AAT是有活性的，平均大约90％。基于Cohn部分IV1的有功能活性的AAT含量的回收率是与在人血浆中初始含量相比的大约40％至60％或20％至40％。
通过这种方法或如下所说明的任何方法纯化的AAT并不富含具有4.3至4.4的pI的异构体，例如在美国专利号6,974,792中说明的。
可以将如在本发明中所说明的纯化的AAT配制成药物制剂用于治疗的用途。该纯化的蛋白可以溶于常规的生理上相容的水性缓冲溶液，对此可以可任选地添加药物的赋形剂来提供药物制剂。
这样的药物的载体以及赋形剂连同适当的药物的配方在本领域中为大家所熟知(见例如：″Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins″，Frokjaer等人，Taylor & Francis(2000)或″Handbook of Pharmaceutical Excipients″，3rd edition，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000))。特定地，可以将包括本发明的多肽变体的药物组合物配制成冻干的或稳定的液体形式。通过在本领域中已知的各种操作可以将AAT冻干。在使用之前通过添加一种或多种药学上可接受的稀释剂(例如像注射用灭菌水或灭菌生理盐水溶液)将冻干的配制品重新配制。
可以将该组合物的配制品通过任何药学上合适的给药方法递送给个体。不同的递送系统是已知的并且可以被用于通过任何便利的途径给予该组合物。还可以将本发明的组合物全身性给药(administered systemically)。对于全身性的使用，根据常规方法可以将本发明的蛋白配制成用于经肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内、或经皮)或经肠(例如口服、经阴道、或直肠)递送。在某些具体实施方式中，给药途径是静脉内、皮下、或肺内。可以将该配制品通过输注或通过弹丸注射连续地给药。一些配制品含有缓释系统。
根据本发明的AAT能够以治疗有效剂量而给予患者，治疗有效剂量是指足以产生一种或多种希望的效果的剂量，从而防止或减轻被治疗的病况或适应症的严重程度或传播而没有达到产生无法忍受的不良副作用的剂量。确切的剂量取决于许多因素(例如像适应症、配制品、给药的方式)并且必须是在每种适应症的临床前试验以及临床试验中已确定的。
本发明还提供了治疗患有常见的AAT缺陷以及其他适应症的个体的方法，其中AAT的治疗的用途可能是有益的，例如：肺气肿以及囊性纤维病。这些方法包括给予所述个体治疗有效量的AAT。可以将本发明的药物组合物单独给药或与其他的治疗剂一起给药。这些治疗剂可以作为同一药物的部分被加入。
在本发明的特别的具体实施方式中，通过如上所述的方法所获得的ApoA-I沉淀可以如下所说明被进一步纯化。
通过将处于大约0℃至-2℃、大约5至6的pH的低级脂肪醇(例如乙醇)的浓度为大约8％至14％的人血浆蛋白部分的悬浮液在0℃到50℃的温度在包括大约20mM的Tris的pH为6到10的缓冲液中孵育持续大约2h至最多24h，从所获得的沉淀中可以提取出ApoA-I。在一些具体实施方式中，该缓冲液的pH可以是大约8.0。可任选的是，可以添加水溶性的盐类，浓度为大约0M至1M。
为了提高ApoA-I的溶解度，可以添加非离子型洗涤剂(例如聚山梨醇酯、Brii、辛基-糖苷)、离子型去垢剂(例如胆汁酸)、或两性离子洗涤剂(例如CHAPSTM、ZwittergentTM)。取决于下列步骤，通过(例如)透析过滤或吸收到适当的树脂(BioBeadsTM)中可以将洗涤剂除去或部分地除去。
可以将该缓冲液悬浮液搅拌、孵育达大约1h至4h，然后过滤或离心。可以将含有于滤液或上清液中的ApoA-I通过如下所说明的方法进一步纯化。
可以将该滤液或上清液的pH适当地调整并且添加乙醇直到大多数高分子量污染物沉淀而ApoA-I保持在溶液中。在某些具体实施方式中，可以将在大约45％(35％至55％)(v/v)的乙醇、pH 3.5(pH 3至5)、10至200mM NaCl的条件下使ApoA-I沉淀。还可以通过增加该pH至5(pH 4至6)以及该乙醇浓度至大于50％(50％至60％)(v/v)来使ApoA-I沉淀。
在根据本发明的另外的一个方法中，可以通过用(例如)硫酸铵的沉淀作用使ApoA-I从滤液或上清液中分离：在6至9的pH范围内，在大约0.6M至1.4M的终浓度下，可以将硫酸铵加入至作为固体或浓缩的母液的ApoA-I提取物中。在大约0℃至30℃，可以将该悬浮液孵育达大约2h至24h，并且可以通过过滤或离心将沉淀的ApoA-I部分收集。
然后可以通过在本领域中已知的方法来实现ApoA-I的进一步纯化，这些方法包括(例如)在可以由本领域的技术人员确定的适当的条件下从阳离子或阴离子交换树脂、疏水性相互作用基质、以及混合态树脂(如具有允许它们与离子以及疏水的部位相互作用的性质的树脂)中结合以及洗脱ApoA-I。在本发明的一些具体实施方式中，可以选择一些条件这样使得在阳离子-、阴离子交换树脂中、在疏水性相互作用基质中、和/或在混合态树脂的条件中，ApoA-I是在流穿部分中，并且大多数污染物保持与树脂结合。
可任选的是，通过与气相白炭黑(AerosilTM)和/或脂类除去试剂(ERATM；World Minerals)相结合或者通过特异的配体吸附(adsoption)至例如CibacronTM blue衍生物(Ciba)、三嗪衍生物(Prometic)、或VHH抗体片段(The Bio AffinityCompany)，可以进一步使ApoA-I纯化。可以用以下条件来进行ApoA-I从这些结合剂的洗脱，例如：洗涤剂、乙醇、离液剂(chaotropic reagent)、高pH(在某些具体实施方式中低于pH 13.69、或者等于或低于13、等于或低于12、或者等于或低于11)或其组合。
根据本发明纯化的ApoA-I具有至少75％的纯度，典型地85％以上。在某些具体实施方式中，与在血浆中的ApoA-I含量相比较该产率至少是15％。在某些具体实施方式中，与在血浆中的ApoA-I含量相比较该产率至少是30％。
在不同的具体实施方式中，可以使ApoA-I经受如上对于AAT所述的至少一个减少病毒的步骤。
可以将如本发明中所说明的纯化的ApoA-I配制成药物制剂用于治疗的用途。可以将纯化的蛋白溶于常规的生理上相容的水性缓冲溶液中，对其可以任选地添加药物的赋形剂来提供药物制剂。这样的药物载体以及赋形剂连同适当的药物配制品在本领域中为大家所熟知(见例如：″Pharmaceutical Formulation Developmentof Peptides and Proteins″，Frokjaer等人，Taylor & Francis(2000)或″Handbook ofPharmaceutical Excipients″，3rd edition，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000))。特定地，可以将包括本发明的多肽变体的药物组合物配制成冻干的或稳定的液体形式。通过在本领域中已知的各种操作可以将ApoA-I冻干。在使用之前通过添加一种或多种药学上可接受的稀释剂(例如像注射用的灭菌水或灭菌生理盐水溶液)将冻干的配制品重新配制。在一些具体实施方式中，可以将纯化的ApoA-I以在Lerch等人，Vox Sanguinis 1996；71：155-164中所说明的重建的HDL样颗粒(rHDL)的形式用于治疗。
可以将包括ApoA-I的配制品通过任何药学上合适的给药方法递送给个体。不同的递送系统是已知的并且可以被用于通过任何便利的途径给予该组合物。在某些具体实施方式中，可以将本发明的组合物全身性给药。对于全身性的使用，可以根据常规方法将本发明的蛋白配制成用于经肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内、或经皮)或经肠的(例如口服、经阴道、或直肠)递送。在一些具体实施方式中，可以将ApoA-I或重新配制的ApoA-I经静脉内给药。可以将这些配制品通过输注或通过弹丸注射连续地给药。一些配制品含有缓释系统。
可以将根据本发明的ApoA-I以治疗有效剂量给予患者，治疗有效剂量是指足以产生希望的效果的剂量，该剂量是防止或减轻被治疗的病况或适应症的严重程度或传播而没有达到产生无法忍受的不良副作用的剂量。确切的剂量取决于许多因素(例如像适应症、配制品、以及给药的方式)，并且必须是在每种各自的适应症的临床前试验以及临床试验中已确定的。
本发明还提供了治疗患有常见的ApoA-I缺陷以及其他的适应症的方法，其中ApoA-I的治疗的用途可能是有用的，例如：动脉硬化、心血管疾病、脑血管疾病(例如中风)、局部缺血再灌注损伤、外周血管疾病、血管病相关的糖尿病、连同慢性和急性的炎性疾病、以及对过度凝血的抑制。本方法包括给予所述个体治疗有效量的ApoA-I或rHDL。
可以将本发明的药物组合物单独给药或与其他的治疗剂一起给药。这些治疗剂可以作为同一药物的部分被加入。
在某些具体实施方式中，本发明提供了AAT和ApoA-I的分离与纯化的方法，其中可以将AAT/ApoA-I溶液的pH调整成使得ApoA-I可以与添加的ApoA-I结合剂(例如像气相白炭黑(如IAerosilTM))、脂类除去试剂(LRATM)、或特异的ApoA-I结合配体(像Cibacron blueTM衍生物(Ciba)；三嗪衍生物(Prometic)或VHH抗体片段(The Bio Affinity Company))相结合。在一些具体实施方式中，气相白炭黑是ApoA-I结合剂。可以将结合到气相白炭黑上的ApoA-I从含有AAT的溶液中分离，然后在以下pH可以将ApoA-I从该气相白炭黑上洗脱：在小于13.69、或者等于或低于13、等于或低于12、或者等于或低于11的pH。在一个具体实施方式中，在7直到12并且包括12的pH可以将ApoA-I洗脱。在另一个具体实施方式中、该pH可以是8直到11并包括11。在又另一个具体实施方式中该pH范围可以是9直到10并包括10。可以将ApoA-I洗脱的pH值的一些具体的、但非限制性的实施例包括pH 8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、以及11。在分离AAT和ApoA-I之后，可以通过在本领域中已知的用于蛋白纯化的任何方法将含有AAT和ApoA-I的溶液进一步处理，例如已知的适合于纯化AAT或ApoA-I的方法。
在本发明的某些具体实施方式中，可以将Cohn部分IV1糊状物悬浮在悬浮缓冲液中(例如大约50mM至150mM Tris、0mM至30mM NaCl、在大约8.0至大约10.0之间的pH)并且在大约0℃至10℃搅拌达最少1小时。在一些具体实施方式中，该pH可以在大约9.0以及9.6之间。在不同的具体实施方式中，可以将悬浮液搅拌达2小时至3小时。该缓冲液的量可以是每kg含有血浆的部分(部分IV1)从6kg至18kg(或12kg至16kg)的范围内。作为使AAT产率最大化的任选的步骤，可以将Tris缓冲液悬浮液加热至大约40℃至45℃的温度达大约1小时至1.5小时的一段时间，然后冷却至大约0℃至10℃。
然后可以将该Tris缓冲液的悬浮液用二硫苏糖醇(DTT)以及气相白炭黑来处理。可以将DTT以在大约15mM至50mM范围内的浓度加入至该Tris缓冲液悬浮液。然后可以将该溶液在大约0℃至10℃在大约9.0至9.6的pH搅拌达最少约30分钟。在某些具体实施方式中，将该溶液搅拌达大约2小时至4小时。然后可以(例如)使用稀盐酸溶液将该DTT处理的提取物调整至大约7.5至7.8的pH。然后可以将气相白炭黑(例如AerosilTM380)以大致16.7克/升血浆当量加入至该含有血浆的部分。然后可以在低温下、在大约7.5至8.0的pH将该悬浮液搅拌至少30分钟。在一些具体实施方式中，可以将该悬浮液搅拌达大约1小时至4小时。可以将助滤剂(例如C1000)以按重量计每一份气相白炭黑大约3份助滤剂的比率进行添加，并且可以将该混合物搅拌达最少约15分钟。然后可以使用压滤机将可溶的AAT部分从气相白炭黑/ApoA-I以及污染的蛋白中分离，得到AAT最终的滤液。该AAT滤液可以被进一步处理，而气相白炭黑/ApoA-I沉淀可以被收集用于进一步纯化。可替代地，可以通过离心将结合至气相白炭黑上的ApoA-I分离。通过在50mM至100mM Tris中(在9至10的pH、优选大约9.5的pH)孵育实现ApoA-I从气相白炭黑中的洗脱。在分离AAT和ApoA-I以后，可以将这两种蛋白都进行进一步的纯化，例如用如上所说明的方法。
在一些具体实施方式中，本发明提供了AAT和ApoA-I的分离与纯化的方法，其中在这两种蛋白都不结合的条件下将AAT/ApoA-I溶液用二硫苏糖醇(DTT)以及气相白炭黑(AerosilTM)进行处理。可以将可溶的AAT/ApoA-I部分从沉淀的气相白炭黑/污染的蛋白中分离，从而得到含有AAT和ApoA-I的上清液。可以通过离子交换层析将AAT和ApoA-I进一步纯化并且在疏水作用层析步骤的过程中使之分离。
在本发明的不同的具体实施方式中，可以将部分IV1糊状物悬浮在悬浮缓冲液中(例如：50mM至150mM Tris、0mM至30mM NaCl、在8.0至大约10.0之间的pH)并且在0℃至10℃搅拌达最少1小时。在一些具体实施方式中，悬浮液的缓冲液的pH可以在9.0至9.6之间。在某些具体实施方式中，可以将悬浮液搅拌达2小时至3小时。所使用的缓冲液的量可以是每kg的含有血浆的部分(部分IV1)从6kg至18kg(或12kg至16kg)的缓冲液的范围内。然后可以将该Tris缓冲液的悬浮液加热至40℃至45℃的温度达1小时至1.5小时的时间，然后冷却至0℃至10℃。
然后可以将该Tris缓冲液的悬浮液用二硫苏糖醇(DTT)以及气相白炭黑(AerosilTM)来处理。可以将DTT以在大约15mM至50mM范围内的浓度加入至该Tris缓冲液悬浮液。然后可以将该溶液在大约0℃至10℃的温度、在大约9.0至9.6的pH搅拌至少大约30分钟。在一些具体实施方式中，可以将该溶液搅拌达大约2小时至4小时。然后可以将气相白炭黑(例如AerosilTM)以大致16.7克/升血浆当量加入至该含有血浆的糊状物部分中。然后可以将该悬浮液在大约0℃至10℃搅拌至少约30分钟，同时维持大约9.0至9.6的pH。在一些具体实施方式中，可以将该溶液搅拌达大约1小时至4小时。可以将助滤剂(例如C1000)以按重量计每一份气相白炭黑大约3份助滤剂的比率进行添加，并且可以将该混合物搅拌达最少约15分钟。可以将该可溶的AAT/ApoA-I部分从沉淀的气相白炭黑/污染的蛋白中分离来，例如使用压滤机，从而得到AAT/ApoA-I滤液。可替代地可以采用其他的分离气相白炭黑的方式，例如离心。
使用如上所说明的离子交换层析法以及疏水作用层析法可以将AAT和ApoA-I进一步纯化，除此之外，在该疏水作用层析法(HIC)步骤的过程中，在已经用洗涤缓冲液(包括50mM Tris、7.5M硫酸铵，大约7.3至7.5的pH)将AAT洗出之后，最后用水将ApoA-I洗脱。通过超过滤对AAT组合的柱流穿液以及随后的洗液进行浓缩，并使其透析过滤进入磷酸盐缓冲液(大约40mM磷酸钠以及大约7.2至7.6的pH)流穿液。最终的AAT浓度优选地是不大于7％蛋白。AAT以药物级纯度从该HIC柱洗脱。
然后可以将从气相白炭黑洗脱出的ApoA-I如上所说明进行进一步纯化。
在一些具体实施方式中，本发明提供了将AAT和ApoA-I分离与纯化的方法，其中将AAT/ApoA-I溶液用DTT以及气相白炭黑处理，然后在ApoA-I与AAT两者都不与该离子交换柱结合的条件下穿过阴离子树脂交换柱，在一些条件下使该流穿液与HIC柱接触这样使得ApoA-I结合而AAT保持可溶，并且在流穿液部分中可以将其从ApoA-I分离。在分离AAT和ApoA-I之后，可以通过在本领域中已知的用于蛋白纯化的任何方法将含有AAT和ApoA-I的溶液进行进一步处理，例如通过已知的适合于纯化AAT或ApoA-I的方法。
在某些具体实施方式中，可以将Cohn部分IV1糊状物用如上所说明的缓冲液悬浮、用DTT以及AerosilTM处理、并且过滤。可以将AAT/ApoA-I滤液的pH调整至大约7.1至7.7，例如，通过稀盐酸溶液的添加。然后可以在22.0℃通过(例如)2M NaCl溶液的添加将该AAT/ApoA-I滤液的电导率调整至大致15mS/cm。然后可以将该调整了pH/电导率的AAT/ApoA-I滤液直接施加在层析柱上，该层析柱含有阴离子交换树脂，用平衡缓冲液(例如大约50mM Tris、大致pH 7.4、大约15mS/cm的电导率)使之平衡。污染的蛋白可以结合至该柱上，而AAT和ApoA-I流动穿过。
然后通过添加硫酸铵至大约0.9M至1.1M的终浓度可以将该AAT/ApoA-I流穿液制备成用于HIC。可以将该溶液过滤并且施加在HIC柱上，该HIC柱已经用HIC洗涤缓冲液进行平衡。在负载过程中初始的洗脱可以提供含有AAT的流出液，并且用添加的洗涤缓冲液洗脱可以除去留在柱中的任何AAT。可以(例如通过超滤法)将组合的流出液以及洗液浓缩并使其透析过滤进入磷酸盐缓冲液。在一些具体实施方式中，最终的AAT浓度是不高于7％蛋白。一旦除去AAT部分，可以用0.1M到0.2M的硫酸铵溶液将额外的杂质从柱上洗掉，然后利用水可以将ApoA-I从柱上洗脱。AAT以药物级纯度从HIC柱洗脱。可以将ApoA-I以及AAT进一步纯化，例如，使用如上所说明的方法。
实施例
实施例1：Cohn部分IV1沉淀的制备
将人血浆冷却至大约0℃并且调整pH至大约7.2。添加冷乙醇至大约8％(v/v)的浓度，并且使温度降低至大致-2℃。通过离心或过滤将形成的沉淀(部分I)除去。
将来自以上操作的滤液或上清液调整至大约pH 6.9，并且加入冷乙醇至大致20％(v/v)的浓度。然后使温度降低至5℃，并且使该混合物再次经受离心或过滤。将形成的沉淀(部分II+III)留出用于其他的目的。
将来自以上操作的滤液或上清液调整至大致5.05的pH，并且将乙醇浓度调整至21％(v/v)。将温度调整至-5℃。通过离心或过滤将形成的沉淀(部分IV1)移出并且将其以糊状物形式来储存直至需要时。这种部分IV1糊状物含有AAT、ApoA-I、连同污染的蛋白、以及脂类。
实施例2：ApoA-I以及AAT的纯化包括ApoA-I的沉淀
2.1ApoA-I以及AAT的分离：
2.1.1部分IV1的抽提以及ApoA-I部分的沉淀
将该部分IV1材料悬浮在悬浮缓冲液中(100mM Tris、pH 9.6)并且在2℃至8℃搅拌达2小时。使用的缓冲液的量是每kg的含有血浆的部分15kg的缓冲液。然后将该悬浮液冷却至大致0℃并且将一定量的乙醇与乙酸钠/乙酸的溶液加入至该Tris缓冲液悬浮液以得到悬浮液，该悬浮液具有5.4的pH以及12％(v/v)的乙醇浓度。在使温度冷却至大致-4℃时，在30分钟的时间内添加该乙醇/酸的溶液。然后将该pH/乙醇条件维持达2小时。以100克助滤剂/kg部分IV1沉淀的比率添加助滤剂C1000。然后将该混合物搅拌达大约15分钟。通过用压滤机过滤(ApoA-I沉淀)，将可溶的AAT材料(AAT滤液)从不溶解的ApoA-I材料中分离。
2.2AAT的进一步纯化
2.2.1用DTT以及白炭黑纯化
在将该AAT滤液的温度调整至大致5℃时，使用1M NaOH将该滤液的pH调整至9.4左右。在调整pH以后，加入DTT至30mM的浓度。然后在大致5℃将该DTT处理过的滤液进行混合达2小时同时维持9.4左右的pH。然后在含有糊状物部分的血浆中以大致16.7g/L血浆当量的浓度将气相白炭黑(AerosilTM 380)加入至该溶液中。然后在5℃左右的温度以及大致9.4的pH，将该悬浮液搅拌大致1小时。将助滤剂C1000以3kg/kg气相白炭黑的比率添加，并且将该混合物搅拌大致15分钟。使用压滤机将该可溶的AAT产物从沉淀的气相白炭黑以及污染的蛋白中分离，从而得到AAT最终的滤液。通过压滤机使该悬浮液再循环直至获得希望的澄清度的水平。
2.2.2离子交换层析法
将该AAT最终的滤液直接施加在含有TMAE Fractogel的层析柱上，该柱用IEC平衡缓冲液(50mM Tris，pH 8.8)进行平衡。用该AAT最终的滤液来使该柱负载至其蛋白容量的大致65％。然后通过用IEC洗涤缓冲液(50mM Tris、大致45mMNaCl、大致7.4的pH)洗涤该柱将污染物从该柱除去，并且随后使用IEC洗脱缓冲液(大致50mM Tris、大约95mM NaCl、大致7.4的pH)洗脱AAT。
2.2.3疏水作用层析法(HIC)
通过添加硫酸铵至大致1M的终浓度，可以将来自该IEC柱的洗出液制备成用于HIC。然后将该溶液过滤并且施加在疏水作用柱上(GE Healthcare PhenylSepharose high sub)，该柱已经用HIC洗涤缓冲液(50mM Tris、1M硫酸铵、大致7.4pH)进行平衡。以大致40克蛋白/L重力沉降树脂使该柱负载。在负载过程中，AAT没有结合该疏水的柱基质并且流穿该柱。在负载完成时，使用HIC洗涤缓冲液可以将保持在该填充柱中的未结合的AAT从柱上洗掉。可以通过超过滤对组合的柱流穿液以及随后的洗液进行浓缩并使其透析过滤进入磷酸盐缓冲液(大约40mM磷酸钠、大致7.4的pH)中流穿液。
如通过SDS-Page以及免疫测定法(例如酶联免疫吸附(ELISA)或浊度测定法)所测定发现该产物是≥96％纯的AAT，并且通过尺寸排阻HPLC发现该产物≥93％是单体。基于该Cohn部分IV1糊状物的有功能活性的AAT含量的回收率是正常血浆含量的40％至60％或大致20％至40％。平均起来，89％纯化的AAT是有活性的，而典型地观察到79％至99％的范围。
表1：根据实施例2的AAT的纯化(g蛋白/L血浆产率)
Figure G2008800253192D00201
＊在这个步骤中有时观察到的AAT效价测定的干扰。
2.3ApoA-I的进一步纯化
将如在2.1中说明所获得的大致50g的ApoA-I沉淀用七倍量的Tris-HCl、pH 8.0的缓冲液悬浮并且在室温搅拌达大致2h。然后使该悬浮液通过涂有助滤剂(CeliteTM 574)的纤维素过滤器而过滤。
将固体的硫酸铵加入至含有ApoA-I的滤液至以下终浓度：0.8M、0.9M、1.0M、1.2M、以及1.4M。将每种悬浮液的pH调整至在7.0以及7.5之间。然后在室温将这些悬浮液孵育达至少2h，然后通过涂有CeliteTM574助滤剂的纤维素过滤器进行过滤将沉淀最终分离。
使用这种方法，获得了纯度高达89％的ApoA-I制备物，该纯度对应于药物级纯度。
实施例3：将ApoA-I吸附至气相白炭黑来对ApoA-I以及AAT纯化
3.1ApoA-I以及AAT的分离：与气相白炭黑结合
将部分IV1糊状物悬浮在悬浮缓冲液中(100mM Tris、20mM NaCl、大致pH9.6)并且在大致5℃搅拌达大致2小时。使用的缓冲液的量是每kg的含有血浆的部分(部分IV1)大致12kg的缓冲液。为了使AAT产率最大化，将该Tris缓冲液的悬浮液加热至大致43℃大致1.5小时的一段时间，然后冷却至大致5℃。
然后用DTT以及气相白炭黑(AerosilTM 380)处理该Tris缓冲液的悬浮液。将DTT以大约30mM的浓度加入至该Tris缓冲液的悬浮液。在大致5℃、9.4左右的pH，将该溶液搅拌大致2小时。然后使用稀盐酸溶液将该DTT处理的提取物的pH调整至大约7.8。然后将气相白炭黑(AerosilTM380)以大致16.7克/升血浆当量加入至该含有血浆的糊状物部分。在大致5℃在7.5至8.0的pH将该悬浮液搅拌达大致1小时。可以将CelpureTM C1000助滤剂以按重量计每一份气相白碳黑大约3份助滤剂的比率进行添加，并且将该混合物搅拌达15分钟。使用压滤机将该可溶的AAT部分从该沉淀的气相白炭黑/ApoA-I以及污染的蛋白中分离，从而得到AAT最终的滤液。将该AAT滤液进行进一步处理，而收集该气相白炭黑APOA-1沉淀用于进一步纯化。
3.2AAT的进一步纯化
通过如在2.2.2以及2.2.3中所说明的离子交换层析以及疏水作用层析将AAT进一步纯化。
表2：根据实施例3的AAT的纯化
Figure G2008800253192D00211
Figure G2008800253192D00221
NT＝未检测到
如通过SDS-Page以及免疫测定法二者测定，该产物是≥96％纯的AAT，并且通过尺寸排阻HPLC该产物是≥93％的单体。基于该Cohn部分IV糊状物的有功能活性的AAT含量的回收率是正常血浆含量的40％至60％或大致20％至40％。平均起来，纯化的AAT的89％是有活性的，而典型地观察到79％至99％的范围。
3.3ApoA-I的进一步纯化
通过将步骤3.1中从AAT分离的气相白炭黑重悬在pH 9.5的50mM至100mM的Tris缓冲液中，使ApoA-I从该气相白炭黑释出。在随后通过离心或过滤将ApoA-I从气相白炭黑分离之后，可以如在2.3中所说明的对ApoA-I进行进一步纯化。实施例4：通过离子交换层析法以及疏水作用层析法将ApoA-I以及AAT纯化
4.1ApoA-I以及AAT的分离
将部分IV1糊状物悬浮在悬浮缓冲液中(100mM Tris、20mM NaCl、pH大致9.6)并且在大致5℃搅拌大致2小时。使用的缓冲液的量是每kg的含有血浆的部分(部分IV1)大致12kg的缓冲液。将该Tris缓冲液的悬浮液加热至大致43℃达1.5小时左右的一段时间，然后冷却至大致5℃。
然后用DTT以及气相白炭黑(AerosilTM 380)处理该Tris缓冲液的悬浮液。将DTT以30mM的浓度加入至该Tris缓冲液悬浮液。在大致5℃在大致9.4的pH将该溶液搅拌达2小时。然后将气相白炭黑(AerosilTM 380)以大致16.7克/升血浆当量加入至含有血浆的糊状物部分中。在5℃左右将该悬浮液搅拌大致1小时，同时维持大致9.4的pH。可以将CelpureTM C1000助滤剂以按重量计每一份气相白炭黑大约3份助滤剂的比率进行添加，并且将该混合物搅拌大约15分钟。使用压滤机可以将该可溶的AAT/ApoA-I部分从沉淀的气相白炭黑/污染的蛋白中分离，从而得到AAT/ApoA-I最终的滤液。
通过如在2.3.2以及2.3.3中所说明的离子交换层析法以及疏水作用层析法将AAT和ApoA-I进一步纯化，除此之外，在疏水作用层析法步骤的过程中，在AAT的洗涤步骤之后用水将ApoA-I洗脱。
可以通过超滤法对AAT组合的柱流穿液以及随后的洗液进行浓缩并使其透析过滤进入磷酸盐缓冲液(大约40mM磷酸钠、大致7.4的pH)流穿液。如通过SDS-Page以及免疫测定法二者所测定，该产物是≥96％纯的AAT，并且通过尺寸排阻HPLC该产物是≥93％的单体。基于该Cohn部分IV糊状物的有功能活性的AAT含量的回收率是正常血浆含量的40％至60％或大致20％至40％。平均起来，纯化的AAT的89％是有活性的，而典型地观察到79％至99％的范围。
4.2AAT的进一步处理
表3：用50kg部分IV1作为起始材料的来自每一步骤的平均处理产率
  部分IV-1的提取物(g/L血浆)   AAT/APOA-1滤液(g/L血浆) IEC洗出液(g/L血浆) HIC流出液(g/L血浆) HIC WFI洗液(g/L血浆) HIC浓缩液(g/L血浆)
  AAT   0.71   0.562   0.556   0.450   N/A   0.450
  APOA-1 0.70 0.466 0.340 未检测到 0.387 未检测到
实施例5：通过负性模式离子交换层析法(negative mode ion-exchangechromatography)接着通过疏水作用层析法将ApoA-I以及AAT纯化
5.1用DTT以及白炭黑纯化
部分IV-1的抽提以及用DTT以及白炭黑进行的纯化如在实施例4.1中所说明的来完成。
5.2.离子交换层析法
通过稀盐酸溶液的添加，可以将AAT/ApoA-I最终的滤液调整至大约7.4的pH范围。在22.0℃通过添加2M NaCl溶液将该AAT/ApoA-I滤液的电导率调整至大致15mS/cm。可以将该调整了pH/电导率的AAT/ApoA-I最终的滤液直接施加在含有该阴离子交换树脂EMD TMAE Fractogel 650(m)的层析柱上，该层析柱用平衡缓冲液(50mM Tris、pH 7.4、15mS/cm的电导率)进行平衡。在负载过程中，污染的蛋白结合至该柱上，而AAT和ApoA-I流穿。将该含有AAT/ApoA-I的离子交换柱流穿液部分如指明的进行进一步处理。
5.3.ApoA-I和AAT的分离：疏水作用层析法
通过添加硫酸铵至1M的终浓度可以将该AAT/ApoA-I IEC流穿液制备成用于HIC。然后将这种溶液过滤并且施加在疏水作用层析柱上(GE Healthcare PhenylSepharose high sub)，该柱已经用HIC洗涤缓冲液(50mM Tris、pH 7.4、1M硫酸铵)进行平衡。在负载过程中初始的洗脱提供了含有AAT的流出液，并且用添加的洗涤缓冲液(50mM Tris、pH 7.4、1M硫酸铵)洗脱除去任何保留在该柱上的AAT。通过超滤法对组合的流出液以及洗液进行浓缩并且使其透析过滤进入磷酸盐缓冲液。一旦除去AAT部分，可以用0.1M至0.2M的硫酸铵溶液将额外的杂质从该柱上洗掉，然后用水将ApoA-I从该柱上洗脱。
表4：根据实施例5运行6次的平均产率
  部分IV-1的提取物   部分IV-1的滤液   IEC流穿液   HIC流出液   HIC WFI洗液 HIC浓缩液
  AAT产率(g/L血浆) 0.715 0.691 0.505 0.116* N/A 0.415
  APOA-1产率(g/L血浆) 0.758 0.715 0.636 0 0.572 0
*在该HIC流出液下AAT效价的干扰。
N/A＝不适用，因为AAT存在于部分中，但是用“注射用水”(WFI)的洗液是一种废弃部分并且没有从其中回收AAT。
如通过SDS-Page以及免疫测定法二者所测定，该产物是≥96％纯的AAT，并且通过尺寸排阻HPLC该产物是≥93％的单体。基于该Cohn部分IV糊状物的有功能活性的AAT含量的回收率是下常血浆含量的40％至60％或大致20％至40％。平均起来，纯化的AAT的89％是有活性的，而在6次运行中，观察到79％至99％的范围。
贯穿这一说明书中的词“包括”或变体例如“包括(comprises)”或“包括了(comprising)”将被理解成暗示含有一种阐明的要素、整体或步骤，或者多个要素、整体或步骤的组，但是不排除任何其他的要素、整体或步骤，或者多个要素、整体或步骤的组。
应当理解的是：无需背离本发明的精神或范围即可以对以上说明的这些部分做出不同的改变或添加。

Claims (25)

1.一种方法，该方法用于将载脂蛋白A-I(ApoA-I)以及α-1-抗胰蛋白酶(AAT)从含有这两种蛋白的单一的起始人血浆部分中纯化，该方法包括：
i)对包括ApoA-I以及AAT的起始人血浆部分进行处理，以便将含有ApoA-I的部分与含有AAT的部分分离开；
ii)从该含有ApoA-I的部分将ApoA-I纯化到药物级纯度；并且
iii)从该含有AAT的部分将AAT纯化到药物级纯度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法用于大规模纯化。
3.如权利要求1所述的方法，其中起始人血浆部分选自：多个Cohn部分IV中的一种或多种、来自Kistler-Nitschmann上清液A以及A+I的沉淀、或硫酸铵沉淀。
4.如权利要求3所述的方法，其中该一种或多种Cohn部分IV是Cohn部分IV1。
5.如权利要求1所述的方法，其中AAT和ApoA-I未暴露于13.69或以上的pH。
6.如权利要求1所述的方法，其中AAT和ApoA-I未暴露于13或以上的pH。
7.如权利要求1所述的方法，其中AAT和ApoA-I未暴露于12或以上的pH。
8.如权利要求1所述的方法，其中AAT和ApoA-I未暴露于11或以上的pH。
9.如权利要求1所述的方法，其中该方法包括：
a)对于被用作起始材料的起始人血浆部分进行处理，这样使得ApoA-I以及AAT二者均被溶解；
b)通过添加足够量的低级脂肪醇并且确保该溶液的适当的pH来使ApoA-I从该溶液沉淀，这样使得ApoA-I沉淀而AAT保持在溶液中；
c)将沉淀的ApoA-I从该含有AAT的溶液中分离；并且
d)在一个或多个处理步骤中分别将ApoA-I以及AAT纯化至药物级纯度。
10.如权利要求9所述的方法，其中起始人血浆部分是在步骤a)中溶解在缓冲液中，该缓冲液包括大约50mM-150mM Tris以及大约0mM至20mM NaCl而处于大约8.0至10.0的pH。
11.如权利要求9所述的方法，其中pH在步骤b)中被调整至大约4.5至6.5的pH并且加入低级脂肪醇，这样使得该低级脂肪醇的浓度是大约5％至25％(v/v)。
12.如权利要求11所述的方法，其中该低级脂肪醇是乙醇。
13.如权利要求11所述的方法，其中ApoA-I是在等于或低于10℃的温度沉淀的。
14.如权利要求1所述的方法，其中该方法包括：
a)对于被用作起始材料的人血浆部分进行处理，其方式为使得ApoA-I以及AAT均被溶解；
b)添加ApoA-I结合剂；并确保适当的pH，这样使得ApoA-I结合至所添加的ApoA-I结合剂上；
c)将结合至所述ApoA-I结合剂上的ApoA-I从含有AAT的溶液中分离；
d)将ApoA-I从所述ApoA-I结合剂上洗脱；并且
e)在一个或多个处理步骤中分别将ApoA-I以及AAT纯化至药物级纯度。
15.如权利要求14所述的方法，其中ApoA-I结合剂是选自：气相白炭黑、脂类去除剂、或特异的ApoA-I结合配体。
16.如权利要求15所述的方法，其中ApoA-I结合剂是气相白炭黑。
17.如权利要求16所述的方法，其中ApoA-I是通过在大约9.0至10.0的pH在包括大约50mM至100mM Tris的缓冲液中孵育而从气相白炭黑上洗脱的。
18.如权利要求1所述的方法，其中该方法包括：
a)对被用作起始材料的起始人血浆部分进行处理这样使得ApoA-I以及AAT二者均被溶解；
b)在一些条件下添加二硫苏糖醇以及气相白炭黑，在这些条件下ApoA-I以及AAT都不与该气相白炭黑结合；
c)将含有AAT和ApoA-I的溶液从该气相白炭黑分离，以此制造含有AAT和ApoA-I的上清液；
d)通过离子交换层析法将AAT和ApoA-I从某些其他的蛋白分离；
e)通过疏水作用层析法将AAT与ApoA-I分离；并且
f)在一个或多个处理步骤中分别将ApoA-I以及AAT纯化至药物级纯度。
19.如权利要求1所述的方法，其中该方法包括：
a)对起始材料进行处理这样使得ApoA-I以及AAT二者均被溶解；
b)在一些条件下使溶解的ApoA-I以及AAT穿过阴离子交换柱来形成含有ApoA-I以及AAT的流穿液，在这些条件下ApoA-I以及AAT都不与该离子交换柱结合流穿液；
c)使含有ApoA-I以及AAT的流穿液与疏水作用层析基质相接触，其条件为使得ApoA-I结合而AAT保持可溶；
d)将可溶的AAT从该疏水作用层析基质中分离；
e)将ApoA-I从该疏水作用层析基质上洗脱；并且
f)在一个或多个处理步骤中分别将ApoA-I以及AAT纯化至药物级纯度。
20.如权利要求19所述的方法，其中在该阴离子交换步骤之前将这些条件设置为大约7.1至7.7的pH以及在大约22℃、大约15mS/cm的电导率。
21.如权利要求19所述的方法，其中施加在疏水作用层析基质上的ApoA-I以及AAT的溶液包括0.9M至1.1M硫酸铵。
22.如前述权利要求中的任何一项所述的方法，进一步包括减少病毒的步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其中减少病毒的步骤包括在大约60℃的巴斯德杀菌处理。
24.如权利要求23所述的方法，其中巴斯德杀菌步骤是在包括至少40％w/w的蔗糖以及至少4％w/w的乙酸钾的溶液中进行的。
25.如权利要求24所述的方法，其中该减少病毒的步骤包括通过可以除去病毒颗粒的过滤器的过滤处理。
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