KR101580907B1 - 알파-1-안티트립신 및 아포지단백질 ａ-ｉ의 정제 방법 - Google Patents

알파-1-안티트립신 및 아포지단백질 ａ-ｉ의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-1-안티트립신(AAT, 알파-1 프로테이나제 억제제, API, 및 A1-PI라고도 알려짐) 및 아포지단백질 A-I (ApoA-I) 둘 다를, 예를 들어, 인간 혈장의 분획으로부터 단백질 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 정제의 초기 단계에 ApoA-I로부터 AAT를 분리하기 위한 방법을 제공하여, 동일한 출발 물질을 두 단백질을 위한 원천으로서 사용할 수 있게 한다. 나아가 본 발명은 약학적 용도에 적합한 AAT 및 ApoA-I의 조성물을 제공하는 것에 관한 것이며, 대규모 정제에 적합하다.

Description

알파-1-안티트립신 및 아포지단백질 Ａ-Ｉ의 정제 방법{METHODS FOR PURIFICATION OF ALPHA-1-ANTITRYPSIN AND APOLIPOPROTEIN A-I}
관련 출원의 교차 참조
본 발명은 2007년8월 17일에 출원된 미국 임시 출원 번호 제 60/935,527호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체가 참고로서 본 명세서에 병합되어 있다.
기술분야
본 발명은, 예를 들어, 인간 혈장의 분획으로부터 알파-1-안티트립신(alpha-1-antitrypsin)(AAT, 또한 알파-1 프로테이나아제 억제제(alpha-1 proteinase inhibitor), API 및 A1-PI라고도 알려짐) 및 아포지단백질 A-I(Apolipoprotein A-I)(ApoA-I) 둘 다에 대한 단백질 분리 및 정제 방법에 관한 것이다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 정제의 초기 단계에 ApoA-I로부터 AAT를 분리하기 위한 방법을 제공하여, 동일한 출발 물질을 두 단백질을 위한 원천(source)으로서 사용할 수 있게 한다. 나아가 본 발명은 약학적 용도에 적합한 AAT 및 ApoA-I의 조성물을 제공하는 것에 관한 것이며, 대규모 정제에 적합하다.
많은 단백질-기반 생물약제는 인간 혈장에서 분리된다. 자발적인 헌혈에 부분적으로 의존하는 원료 인간 혈장의 한정된 공급은, 일반적으로 낮은 농도, 높은 취약성 및 혈장 단백질의 정제에 있어서의 한정된 수율과 결합되어, 이러한 류의 약제의 제조를 어렵고 많은 비용이 들게 한다. 따라서 가능한 많은 의학적 관련 단백질을 인간 혈장의 동일한 샘플로부터 가능한 최고의 수율로 분리할 수 있도록 하기 위하여, 혈장 단백질의 정제 방법의 효율성을 향상시킬 필요가 있다.
인간 혈장 단백질의 단백질 분리 및 정제 과정은 단백질의 다양성, 각 단백질 제조와 연관되어 있는 있음직한 오염물 및/또는 불순물의 가변 성질, 및 생물 약제의 생산에 보통 요구되는 다량의 단백질로 인하여 독특한 난제를 준다. 정제 기술은 일반적으로 단일 단백질 타겟을 분리하는 목적을 갖는 일련의 정제 단계들을 포함한다.
알파-1-안티트립신(AAT) 및 아포지단백질 A-I(ApoA-I)은 생물약제로 제조될 수 있는 인간 혈장 단백질의 예들이다. 전용 정제 공정을 이용하여 이들 단백질을 정제하는 방법은 기술되어 있었다. 예를 들어 PCT 공개 번호 제 WO04060528호는 AAT의 정제 과정을 기술하고 미국 특허 번호 제 5,089,602호는 ApoA-I의 정제를 기술하는데, 각각의 과정은 인간 혈장 분획으로부터 시작하며 각각은 단일 단백질에 이른다.
우리는 이제 인간 혈장의 동일한 분획으로부터 출발하는 AAT 및 ApoA-I의 정제를 허용하는 방법을 발전시켰다. 이들 방법은 대규모 정제에 적합하여, 산업적으로 응용가능한 제조 공정의 기초를 제공한다. 본 발명은, 동일한 출발 물질을 두 단백질 모두를 정제하기 위한 출발 물질로서 사용할 수 있게 하기 위하여, 정제의 초기 단계에서 ApoA-I로부터 AAT를 분리하는 방법과, 상기 분리 후에 약학-등급(pharmaceutical-grade)의 AAT 및 ApoA-I을 생산하는 방법을 제공한다.
ApoA-I은 28 kDa의 고-밀도 지단백질(high-density lipoprotein; HDL)의 주요 단백질 성분이며, 배설 또는 재순환을 위하여 말초부에서 간까지의 콜레스테롤의 역수송에 있어서 중요한 역할을 한다.
특히 재구성된 HDL-유사 입자(reconstituted HDL-like particles) 내의 ApoA-I은 치료 능력을 가지는 것으로 오랫동안 설명되어 왔다. 최근에 들어서 이 능력을 강조하는 연구가 공개되었다(JAMA (2007); vol. 297, p. 1675-1682).
ApoA-I에 대한 다양한 정제 기술이 개발되어 왔다.
HDL을 분리하고 HDL-입자에서 ApoA-I을 분리하기 위하여, 소규모로 ApoA1을 정제하기 위한 가장 일반적인 방법들 중의 하나가 초원심분리를 이용하는 것이다. 용매 추출을 포함하여, HDL에서 ApoA-I을 정제하기 위한 몇가지 상이한 방법이 있다. 초원심분리는 가장 시간이 걸리는 방법이고, 이것은 대규모 분리에 적합하지 않다.
초원심분리를 제외한, 혈장을 출발 물질로 이용하는 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 정제(Ross S. E. 등, Rapid chromatographic purification of apolipoproteins A-I and A-II from human plasma, Analytical Biochemistry 149, p. 166-168 (1985)) 및 겔-여과 HPLC를 이용하는 정제(Tricerri A. 등, A rapid and efficient procedure for the purification of human apolipoprotein A-I using gel-filtration HPLC, IJBC, 1, p. 159-166 (1994))가 또한 설명되어 왔다. 인간 혈장의 냉 에탄올 분획으로부터의 분획을 출발 물질로 이용하는 다른 방법이 또한 공개되었다(Peitsch 등, A purification method for apolipoprotein A-I and A-II, Analytical Biochemistry, 178. p. 301-305 (1989)).
Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Blutspendedienst SRK의 제 EP0329605호 및 Lerch 등, Isolation and properties of apolipoprotein A for therapeutic use, Protides Biol. Fluids, 36, p. 409-416 (1989)는, 지단백질을 함유하는 인간 혈장의 분획으로부터 아포지단백질을 제조하는 것에 관한 것이다. 두 공개물은 냉 에탄올 분별 공정에서의 B 및 IV 침전물들이 ApoA-I을 생산하기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있음을 보고한다. 오염물을 침전시키기 위하여, 선택적으로 유기 용매와 함께, 고 에탄올 농도를 포함하는 버퍼를 이용한다. 그 침전물을 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)에 용해하고, 이어서 겔 여과 또는 투석여과(diafiltration)에 의하여 제거된다. ApoA-I이 통과하는 동안에, 오염물을 고정하기 위하여 음이온-교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 선택적으로 2차 이온 교환 수지 상으로의 흡착에 의하여 ApoA-I을 농축하는 것을 제안한다.
또한 제 WO9807751호는 ApoA-I의 분리를 위하여 이온-교환 크로마토그래피를 사용하는 것을 보고한다.
주요한 세린 엔도펩티다제 억제제(serine endopeptidase inhibitor)인 알파-1-안티트립신(AAT)은 인간 혈장 내에 약 1.9 내지 3.5 g/l의 농도로 존재한다. 이러한 약 53 kDa의 당단백질(glycoprotein)은 간에서 생성되며, 특히 폐에서 연결 조직의 단백질분해(proteolysis)에 연관되는 효소인 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase)를 억제한다. AAT는 복합체 바이- 및 트리-안테나리(antennary) 글리칸(glycans)의 혼합에 의하여 글리코실화되는, 아스파라긴 잔기 46, 83 및 247에서 3개의 N-글리코실화 자리를 가진다. 이것은 4.0 내지 5.0 범위의 등전점을 갖는, 다중 AAT 이소형태를 생기게 한다. AAT에 의한 프로테아제 억제는 조직 단백질 분해를 조절하는 데 필요한 성분이며, AAT결핍은 여러가지 질환의 병상에 관련되어 있다. AAT 결핍을 물려받은 개인은, 예를 들어, 인간 백혈구 엘라스타제(human leukocyte elastase)에 의한 폐 조직의 비조절된 파괴의 결과인, 중증의 폐기종 초기 증상을 앓게 될 위험성을 크게 가진다. 외인성 인간 AAT의 투여가 엘라스타제를 억제하는 것으로 보여졌으며, AAT-결핍 환자에게 있어서 생존율을 향상시키고 폐 기능의 저하율을 감소시키는 것과 관련이 있다(Crystal 등, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158:49-59 (1998); 검토를 위하여R. Mahadeva 및 D. Lomas, Thorax 53:501-505 (1998)을 참조).
그의 치료적 유용성 때문에, 상업용 AAT 생산은 중요한 연구의 주제가 되어왔다. 대장균(E. coli) (R. Bischoff 등, Biochemistry 30:3464-3472 (1991)), 이스트(K. Kwon 등, J. Biotechnology 42:191-195 (1995); Bollen 등, 미국 특허 번호 제4,629,567호), 식물(J. Huang 등, Biotechnol. Prog. 17:126-33 (2001)) 내의 재조합 AAT의 생산에 있어서, 그리고 유전자 변형 동물(transgenic mammals)의 젖에서의 분비물에 의하여(G. Wright 등, Biotechnology, 9:830-834 (1991); A.L. Archibald, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5178-5182 (1990)) 상당한 진보가 있었다. 그러나, 인간 혈장으로부터의 AAT의 분리는 양적으로 AAT를 얻는 데 현재 가장 효율적이고 실제적인 방법이며, 인간 혈장은 유일한 FDA-승인 원천이다.
침전, 흡착, 추출 및 크로마토그래피 단계들의 조합을 포함하여, 인간 혈장 분획으로부터 AAT를 분리하고 정제하기 위한 수 많은 과정이 설명되었다. AAT를 분리하는 대부분의 공지된 공정은 Cohn 분획IV 침전물, 예컨대 Cohn 분획IV, 또는 더 상세하게는 분획 IV1, 분획 IV1 -4 는 물론이고 키슬러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 상청액 A 또는 A-I의 침전물로 알려진 인간 혈장의 하나 이상의 분획과 함께 시작하는데, 이것들은 일련의 에탄올 침전 및 pH 조정 후에 페이스트(paste)로서 혈장으로부터 얻어진다(E. J. Cohn 등, J. Amer. Chem. Soc., 68:459-475 (1946); P. Kistler, H. S. Nitschmann, Vox Sang., 7:414-424 (1962)).
Glaser 등, Preparative Biochemistry, 5:333-348 (1975)은, Cohn 분획 IV1 페이스트에서 AAT를 분리하는 방법을 설명한다. Cohn 분획 내에서 이용되는 pH 5.2에 의하여 크게 비활성화되는, AAT를 재활성화하기 위하여 pH 8.5 에서 페이스트를 인산염 버퍼에서 교반한다. 투석 및 원심분리 후에, 상청액에 pH 6.0 내지 7.6 및 pH 8.6에서 2회의 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하고, 이어서 pH 7.6 및 pH 8.0에서 크로마토그래피 과정을 더 실시하여, 약 30%의 총 수율로 AAT를 생산한다.
미국 특허 번호 제 5,610,285호에서, Lebing와 Chen는, 혈장 및 혈장 분획에서 인간 AAT를 정제하기 위하여, 낮은 pH 및 낮은 이온 세기에서 초기 음이온 교환 크로마토그래피 단계, 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 실시하는 정제 공정을 설명한다. 양이온 크로마토그래피는 활성 AAT가 이러한 조건하에서 이온 교환 컬럼에 결합하지 않으며, 반면에 변성 AAT 및 알부민을 포함하는 오염성 단백질이 남아있는 것을 이용한다.
미국 특허 번호 제 4,697,003호에서, Coan은 다양한 Cohn 혈장 분획에서 AAT를 분리하는 방법을 설명하는데, 이것은 AAT-함유 분획으로부터 에탄올 및 염을 제거한 후에, 원하지 않은 단백질이 용출되는 동안 AAT가 컬럼 상에 남아있도록 하는 조건 하에서 DEAE 셀룰로오스 또는 유사한 물질 상에서 음이온-교환 크로마토그래피를 실시하는 것을 포함한다. Coan은 또한 간염 바이러스(hepatitis viruses)를 비전염성으로 만드는데 충분하도록 설정된, 약 60℃ 이상에서 약 10시간 동안의 "저온살균"을 설명한다.
Anal. Biochem., 124:364-371 (1982)와 또한 유럽 특허 출원 제 EP 0 067 293호에서, Glaser 등은, Cohn 분획 IV1 침전물에서 AAT를 분리하는 방법에 대한 여러가지 변형예들을 설명하는데, 이 방법은 (a) 페이스트를 pH 8.5 버퍼에서 용해하는 단계, (b) 여과하는 단계, (c) DTT와 같은 디티올을 첨가하는 단계, 및 (d) 황산 암모늄으로 변성 단백질을 침전하는 단계를 포함한다. Glaser 등은 50% 포화성 황산 암모늄으로 침전하기 전에, 2.5% AEROSILTM 퓸드 실리카(fumed silica)의 존재하에서 DTT에 의한 처리를 실시한 하나의 변형예을 설명한다. AAT의 회수율은 실리카의 부재하에서와 같이 양호하며, 정제율은 약 70% 만큼 향상하였다. Glaser는 알파- 및 베타-지단백질을 제거하기 위하여 Aerosil 380을 공정에 사용할 수 있음을 언급한다.
Vox Sanguinis 81:29-36 (2001)에서, 그리고 PCT 공개 제 WO 98/56821호, 미국 특허 번호 제 6,974,792호 및 미국 공개 제 2002/0082214호에서, Mattes 등은, 에탄올 침전, 음이온 교환 크로마토그래피 및 수산화인회석(hydroxyapatite) 상에서의 흡착 크로마토그래피를 포함하는, Cohn 분획 IV으로부터 AAT를 분리하는 방법을 공개한다. 후자의 단계는 비활성 AAT를 제거하여, 매우 높은 비활성도(specific activity)를 갖는 생성물을 제공하는 것으로 보고되든데, 발명자에 의하면, 이것은 4.3 및 4.4의 pI 값을 갖는 AAT 이소형태의 농축에 기인하며, 당해 분야에서 알려진 다른 고순도 AAT 제조물에는 존재하지 않는다.
PCT 공개 제 WO 04060528호에서 Key 등은 우선적으로 Cohn 분획 IV1 -4으로부터의 분획을 포함하는 AAT에서 AAT를 분리하는 방법을 공지하는데, 이 방법은 AAT가 용해되도록 허용한 조건하에서 버퍼에 AAT-함유 단백질 혼합물을 현탁하며; 그 결과의 현탁액을 이황화물-환원제(disulfide-reducing agent)에 접촉시켜 환원된 현탁액을 생산하고; 그 환원된 현탁액을 불용성 단백질-흡착 물질에 접촉시키며; 및 그 현탁액으로부터 불용성 물질을 제거하여, 이온성 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 더 결합시킨다.
미국 특허 번호 제 6,093,804호에서, Ralston와 Drohan은 "지질 제거제"을 통하여 초기 단백질 현탁액으로부터 지단백질을 제거하고, 이어서 용출을 통하여 구연산 버퍼를 이용한 음이온-교환 매질로부터 "비활성 AAT"을 제거하는 것을 포함하는 방법을 공지하다. 지질 제거제는 MICRO CELTM E 또는 Chromosorb ETM, 합성 함수 규산 칼슘(synthetic hydrous calcium silicate)이라 언급된다. 비-구연산 버퍼의 존재하에서, 음이온-교환 매질은 활성 AAT에 결합하는 반면에 "비활성 AAT"이 통과하는 것을 허용한다. 구연산 버퍼는 음이온 교환 매질로부터의 AAT의 후속 용출 및 양이온-교환 매질로부터의 이후의 용출을 위하여 특정된다. Ralston과 Drohan은 이황화물-환원제의 이용을 기술하지 않는다. 그 공정은 >90%의 생성물 순도(및 활성 AAT가 될 정제된 AAT의 >90%) 및 >70%의 제조 규모 수율로 AAT를 제공하는 것으로 언급되어 있다. Ralston과 Drohan은 Cohn 분획 IV1 제조물이 상당한 양의 ApoA-I을 특히 포함하는 것을 언급하며, 이것은 정제 동안에 컬럼 유동 및 용량을 억제하는 효과를 가지고 있다는 것을 지적한다. 그들은 상기 언급된 "지질 제거제"을 이용한 단백질 혼합 현탁액의 처리로 ApoA-I을 제거한다는 것을 보고한다.
Bauer는 PCT 공개 제 WO 05027821호에서, 상이한 Cohn 분획, 바람직하게는 분획 IV-1로부터 출발하여, 후속의 연속 크로마토그래피 단계들에 의하여 오염성 물질(예, 지질, 지단백질 및 기타 단백질)을 제거하고 불활성 AAT로부터 활성 형태를 분리하는, AAT 정제의 방법을 설명한다. Bauer는 ApoA-I을 정제하는 것이 바람직할 것이라고 언급하지 않는다; 반대로, Bauer는 정제 동안에 ApoA-I이 컬럼 유동을 방해하고 컬럼 용량을 줄인다는 것을 지적하며, 오염성 ApoA-I 을 퓸드 실리카(AerosilTM)에 결합시킴으로써 그것을 제거하는 것을 제안한다. Bauer는 ApoA-I을 퓸드 실리카로부터 용출할 수 있는지를 밝히지도 않고 이것이 바람직한지 제안하지도 않는다.
AAT가 알파-1-안티트립신 결핍으로 인한 폐기종에 효과적인 치료법인 반면에, 이 치료법은 단백질의 한정된 공급 및 복잡한 제조 공정으로 인해 매우 비용이 많이 든다(현재 일년에 약 25,000 달러). 혈장 및 AAT를 함유하는 다른 복합 단백질 혼합물로부터 인간 AAT를 분리하기 위한 더 효율적이고 더 비용-효과적인 방법이 요구된다.
상기에서 기술된 AAT의 거의 모든 정제 방법에서, ApoA-I을 포함하여, 지단백질은 보통 지질 제거제에 결합된 상태에서, 오염물질로서 버려진다. 다른 한편으로, ApoA-I 의 공지된 정제 방법들은 많은 다른 혈장 단백질을 포함하는 혼합물 내의 AAT를 버린다.
인간 혈장의 동일한 분획으로부터의 두 AAT 및 ApoA-I의 정제는 상기에서 인용된 미국 특허 번호 제 6,093,804호에서만 언급되어 있는데, 여기에서, 추가의 다운스트림 공정 전에, ApoA-I을 합성 함수 규산 칼슘으로의 흡착에 의하여 AAT로부터 분리하고 이어서 0.5 N NaOH으로 용출할 수 있음이 설명되어 있다. 어떠한 약학적 정제 등급의 AAT 및 ApoA-I을 동일한 인간 혈장 분획으로 출발하는 정제 공정으로부터 수득할 수 있는지는 설명되어 있지 않다. 사실, 동일 출원의 후 출원(American Red Cross, PCT 공개 제 WO 05027821호)은 이 방법이 대규모 정제에 적합하지 않다고 지적하며, 특히 미국 특허 번호 제 6,093,804호에서 설명된 방법이 수 킬로그램의 범위내에서 소규모 내지 중규모의 원료 물질 공정에만 효율적이다라고 지적한다.
또한, 미국 특허 번호 제 6,093,804호에서 제안된 바와 같이 0.5 N NaOH으로 ApoA-I을 용출하는 것은 약 pH 13.69의 고 알칼리성 환경을 만드는데, 이러한 환경은 ApoA-I 의 부분적 또는 심지어 완전한 탈아미드화(Johnson A. 등, Biochem. Biophys. 1989, 268(1): 276-86을 참조)를 이루거나 아마도 비가역적 변성를 이루게 할 것이다. 생약제는 탈아미드화 및/또는 변성되면, 보통 그들의 생물학적 활성을 잃고 심지어는 면역 반응을 일으키기 쉬우므로, 변성을 덜 일으키거나 아예 일어나지 않게 하기 위한 추가의 정제의 방법을 연구할 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명은 정제의 초기 단계에서 ApoA-I로부터 AAT를 분리하는 방법을 공지하는데, 그렇게 함으로써 동일한 출발 물질을 두 단백질 모두를 위한 원천으로 사용할 수 있으며, 분리된 AAT 및 ApoA-I을 약학 등급 순도로 더 정제하기 위한 방법들도 공지한다. 즉, 본 발명은 ApoA-I 및 AAT를 정제하는 방법을 공지하는데, 이 방법은 i) ApoA-I 및 AAT를 포함하는 출발 물질을 처리하여 AAT 함유 분획으로부터 ApoA-I 함유 분획을 분리하는 단계; ii) ApoA-I 함유 분획으로부터 ApoA-I을 약학 등급 순도로 정제하는 단계; 및 iii) AAT 함유 분획으로부터 AAT를 약학 등급 순도로 정제하는 단계들을 포함한다.
본 발명에서 "약학 등급 순도"은 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 순도를 의미한다.
본 발명의 방법은 탈아미드화 및 변성을 최소화한다. 이것은 두 단백질의 정제에서의 각 단계에서 13.69 미만, 13 이하, 12 이하, 혹은 11 이하의 pH를 유지하거나, 대안적으로 단백질을 11 이상의 pH에서 배양하는 시간을 최소화함으로써 달성할 수 있다. 한 구체예에서, pH가 7부터 그 이상으로 12를 포함하도록 확보함으로써 ApoA-I 및 AAT의 탈아미드화 및 변성을 최소화할 수 있다. 다른 구체예에서, pH 범위는 8부터 그 이상으로 11을 포함한다. 또 다른 구체예에서 pH 범위는 9부터 그 이상으로 10을 포함한다. 좀 더 구체적으로, ApoA-I 및 AAT의 탈아미노화 및 변성을 최소화하는 pH 값의 비-제한된 예들은 pH 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 10.5, 및 11을 포함한다. 상기에서 가르쳐준 레벨 미만에서 머무르는 pH를 언급하는 본 명세서에서의 임의의 점에서, 이들 범위 및 특정한 pH 점도 이용한다.
단백질의 탈아미노화를 막는 것은 변성을 덜 이르게 하고 결과의 생약학 약물이 면역화될 위험성을 줄인다.
본 발명은 AAT 및 ApoA-I의 이러한 분리 및 정제를 달성하는 특히 4가지의 상이한 방법을 가르쳐주는데, 그것들 모두는 대규모 정제에 적합하다. 본 발명에서 대규모 정제에 적합하다는 것은 인간 혈장 분획과 같은 수십 킬로그램의 출발 물질로 출발하는, 예를 들어 50 킬로그램 이상의 인간 혈장 분획으로 출발하는 정제를 의미한다.
본 명세서에서 특히 참조된 모든 공개물 및 특허 출원들은 그것들 전체가 참고로서 병합된다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자 중의 한 사람에 의하여 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.
용어 "AAT"은 일반적으로 인간 혈청에서 분리된 인간 AAT를 지칭한다. 이 용어는 약학적으로 효과적이고 자연적으로 일어나는 변형체를 포함하는 것으로 의도된다(예를 들어, Brantly 등, Am. J. Med. 84(sup.6A):13-31 (1988)을 참조).
용어 "ApoA-I"은 일반적으로, 인간 혈청에서 분리된, 인간 ApoA-I을 지칭한다. 이 용어는 약학적으로 효과적이고 자연적으로 일어나는 변형체를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질을 본 발명의 실제에서 사용할 수 있고, 그러한 등가물들은 본 발명의 범위 안에 있는 것으로 의도된다는 것을 당해 분야의 기술자들은 알 수 있을 것이다. 하기에서 기술되는 구체예들은 단지 실시예를 위하여 제공되는 것이며, 본 발명의 영역은 기술되는 특정 구체예에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 따르면 상당한 양의 AAT 및 ApoA-I을 함유하는 단백질의 비정제된 혼합물을 AAT 및 ApoA-I 정제를 위한 출발 물질로서 사용할 수 있다. 한 구체예에 따르면, AAT 및 ApoA-I 함유 단백질 혼합물을 인간 혈장, 특히 혈장 Cohn 분획 IV 페이스트로부터 선택할 수 있다. 용어 "인간 혈장의 분획"은 혈장으로부터 하나 이상의 혈장 성분을 제거함으로써 얻을 수 있는 AAT 및 ApoA-I을 함유하는 임의의 출발 물질을 포함한다. 어떤 구체예에서, Cohn 분획 IV1 페이스트를 출발 물질로 사용할 수 있으나, 본 발명의 영역 내에서 유사한 혈장 분획의 사용이 고려된다. 대안적 출발 물질은 다른 AAT- 및 ApoA-I-함유 Cohn 분획, 키슬러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 상청액 A 또는 A+I로부터의 침전물(P. Kistler, H. S. Nitschmann, Vox Sang., 7:414-424 (1962)), 및 미국 특허 번호 제 3,301,842호에서의 Schultze 등에 의하여 설명된 혈장으로부터의 황산 암모늄 침전물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 모든 방법에 공통적인 단계는 인간 혈장 분획을 AAT 및 ApoA-I 둘 다를 용해할 수 있는 방식으로 처리한다는 것이다.
본 발명의 구체예에서, AAT/ApoA-I 현탁액에서 pH 및 저급 지방족 알코올의 농도를 조정함으로써 용액에 AAT를 잔류시키고 ApoA-I을 침전시킴으로써, AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제를 달성할 수 있다. 침전된 ApoA-I을 AAT 함유 용액으로부터 분리할 수 있다. 본 발명은 현탁액에서 ApoA-I을 침전시키기 위한 새롭고 이로운 조건을 제공한다. 비록 종래의 기술, 예컨대 특허 출원 제 EP0329605호가 저급 지방족 알코올로 ApoA-I을 침전시키는 것이 대규모 공정에 적합할 수 있다 할지라도, 종래의 기술에서 가르쳐준 조건 하에서, ApoA-I은 AAT와 함께 침전한다는 것이 알려졌다. 또한, AAT의 수율은 감소하고 AAT는 부분적으로 비활성화된다. 본 발명은 4 내지 8 사이의 pH에서 5%와 25% (v/v)의 사이의 농도에서 저급 지방족 알코올로 ApoA-I을 침전시킴으로써, AAT 및 ApoA-I 둘 다를 포함하는 용액으로부터 ApoA-I을 분리할 때 AAT로부터 ApoA1을 분리하는 문제점을 해결하고 AAT의 손실 및 비활성화를 방지한다.
본 발명의 어떤 구체예들은 AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제의 방법을 가르치는데, 여기에서 ApoA-I 결합제로 처리되고 선택적으로 DTT로 처리될 수 있는, AAT/ApoA-I 용액의 pH를 조정함으로써 ApoA-I은 ApoA-I 결합제에 결합한다. ApoA-I 결합제의 예들은 퓸드 실리카(예, AerosilTM), 지질 제거제(LRATM) 또는 시버크론 블루(Cibacron blueTM) 유도체(Ciba), 트리아진(Triazine) 유도체(Prometic)와 같은 특정 ApoA-I 결합 리간드 또는 VHH 항체 단편(The Bio Affinity Company)을 포함한다. 어떤 구체예에서, ApoA-I을 퓸드 실리카에 결합시킬 수 있다. 퓸드 실리카에 결합되는 ApoA-I을 AAT 함유 용액으로부터 분리하고, 다음 단계에서 ApoA-I을 퓸드 실리카로부터 용출할 수 있다. 다양한 구체예에서, ApoA-I을 pH 13.69 보다 작은, 또는 13 이하, 또는 12 이하, 또는 11 이하의 pH에서 퓸드 실리카로부터 용출할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제의 방법을 가르쳐주는데, 여기에서 AAT/ApoA-I 용액을 어떠한 단백질도 결합하지 않는 조건에서 디티오트레이톨(dithiothreitol)(DTT) 및 퓸드 실리카(Aerosil 380)로 처리한다. 용해성 AAT/ApoA-I 분획을 상기 침전된 퓸드 실리카/오염성 단백질으로부터 분리하여 AAT 및 ApoA-I 함유 상청액을 생성한다. AAT 및 ApoA-I을 이온 교환 크로마토그래피로 더 정제하고 후속 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계의 동안에 분리한다.
다양한 구체예에서, 본 발명은 AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제의 방법을 가르쳐주는데, 여기에서 ApoA-I도 AAT도 이온-교환 컬럼에 결합하지 않는 조건에서 상기 AAT/ApoA-I 용액을 음이온-교환 컬럼에 통과시키고, 이어서 ApoA-I이 결합할 수 있고 AAT가 용해성 상태로 잔존할 수 있으며 유체 통과 분획(flow-through fraction) 내에서 ApoA-I로부터 분리할 수 있는 조건 하에서 유체 통과물(flow through)을 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 접촉시킨다.
AAT 및 ApoA-I의 분리 후에, 각각의 AAT 및 ApoA-I 함유 용액을 단백질 정제를 위한 당해 분야에 알려진 방법들 중 임의의 것에 의하여, 특히 AAT 또는 ApoA-I의 정제에 적합하다고 이미 알려진 방법들에 의하여 더 정제할 수 있다.
어떤 구체예에서, 바이러스 감소 단계를 하기에 자세하게 기술된 단백질 정제 단계의 동안에 또는 그 후에 실시할 수 있으며, 상기 정제된 단백질을 약학적으로 적합한 저장 버퍼 내에서 살균하거나 제형화할 수 있고 액상 제제로서 동결건조하거나 저장할 수 있다.
다른 목적, 특징 및 장점은 다음 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 본 발명의 영감 및 영역 내에서 다양한 변형 및 변경이 본 명세서의 상세한 설명으로부터 당해 기술 분야의 기술자들에게 명확하므로 상세한 설명 및 특정 실시예들은 설명만을 위하여 주어진다. 또한, 실시예들은 본 발명의 원칙을 입증하며, 본 발명의 응용을 종래의 기술 분야에서의 기술자에게 명백하게 유용한 모든 실시예에 대하여 명확하게 서술할 수 없으리라 예상된다.
도 1은 실시예 2에서 자세히 기술된 ApoA-I 및 AAT의 분리의 구체예를 설명하는 흐름도이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 정제의 초기 단계에서 ApoA-I로부터 AAT를 분리하는 방법을 제공하는데, 그렇게 함으로써 동일한 출발 물질을 두 단백질 모두에 사용할 수 있다. 또한 본 발명은 분리된 AAT 및 ApoA-I을 각각 대규모로 약학 등급 순도로 더 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 탈아미드화 및 변성을 최소화한다. 이것은 두 단백질의 정제의 각 단계에서 pH를 13.69 미만, 또는 13 이하, 또는 12 이하, 또는 11이하를 유지하거나 대안적으로 단백질을 11 이상의 pH에서 배양하는 시간을 최소화함으로써 달성할 수 있다. 이러한 노출의 기간을 최소화하여야 하는데, 예를 들어, 어떤 구체예에서 pH 11 에서 또는 그 이상에서의 시간은 5 시간을 넘기지 말아야 한다. 어떤 구체예에서, pH 11 에서 또는 그 이상에서 pH 값의 시간은 1 시간을 넘기지 말아야 한다. 다른 구체예에서, pH 11 또는 그 이상에서 pH 값의 시간은 25℃에서 30분을 넘기지 말아야 한다. 더 높은 온도에서 허용가능 노출 시간은 훨씬 더 짧으며, 더 낮은 온도에서 허용가능한 노출 시간은 더 길어질 것이다. 정제될 단백질의 탈아미드화를 방지하는 것은 상당한 정도로 변성을 덜 일으키며 그 결과의 생약학 약물이 면역성이 될 위험성을 크게 줄인다. 어떤 구체예에서, pH를 7부터 그 이상으로 12를 포함하도록 확실하게 함으로써 ApoA-I 및 AAT의 탈아미드화 및 변성을 최소화할 수 있다. 다른 구체예에서, pH 범위는 8부터 그 이상으로 11을 포함한다. 또 다른 구체예에서 pH 범위는 9부터 그 이상으로 10을 포함한다. ApoA-I 및 AAT의 탈아미드화 및 변성을 최소화하는 pH 값의 더 명확하나 비-제한된 예는 pH 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 10.5 및 11을 포함한다.
상당한 양의 AAT 및 ApoA-I을 함유하는 단백질의 비정제된 혼합물을 본 발명의 방법에 따른 AAT 및 ApoA-I 정제를 위한 출발 물질로서 사용할 수 있다. 한 구체예에 따르면, 상기 AAT 및 ApoA-I 함유 단백질 혼합물을 인간 혈장, 특히 혈장 Cohn 분획 IV 페이스트로부터 선택할 수 있다. 어떤 구체예에서, Cohn 분획 IV1 페이스트가 출발 물질이지만, 본 발명의 영역 내에서 유사한 혈장 분획의 사용이 고려된다. 대안적 출발 물질은 다른 AAT- 및 ApoA-I-함유 Cohn 분획, 키슬러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 상청액 A 또는 A+I로부터의 침전물(Kistler and Nitschmann, Vox Sang., 7:414-424 (1962)), 및 미국 특허 번호 제 3,301,842호에서 Schultze 등에 의하여 기술된 혈장으로부터의 황산 암모늄 침전물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
인간 혈장을 -2℃ 내지 2℃ 사이의 온도로 냉각하고 그것을 약 6.9 내지 7.5의 pH로 조정함으로써 Cohn 분획 IV1 페이스트를 제조할 수 있다. 냉 에탄올을 약 6 내지 10% (v/v)의 농도로 첨가하고 약 -4℃ 내지 0℃로 온도를 낮춘 후에, 분획 I로 불리는 침전물을 형성하고 이후에 원심 분리 및 여과에 의하여 제거한다. 그리고 나서 상기 공정으로부터의 여과액 또는 상청액을 약 6.7 내지 7.1의 pH로 조정할 수 있고 냉 에탄올을 약 18 내지 22% (v/v)의 농도로 첨가할 수 있다. 그리고 나서 온도를 약 -7℃ 내지 -3℃로 낮추고, 상기 혼합물을 다시 원심분리 또는 여과시킨다. 분획 II + III으로 불리는, 이제 형성한 침전물을 제거하며 다른 단백질을 정제하는데 사용할 수 있다. 그리고 나서 이 두 번째 여과액 또는 상청액을 약 5.0 내지 5.1의 pH로 조정하고, 에탄올 농도를 약 20.0 내지 22.0% (v/v)로 조정하고, 온도를 약 -6℃ 내지 -3℃로 조정할 수 있다. 이제 분획 IV1은 침전하고 원심분리 또는 여과에 의하여 제거할 수 있고, 필요할 때까지 페이스트 형태로 저장할 수 있다. 분획 IV1 페이스트는 AAT, ApoA-I은 물론, 다른 오염성 단백질 및 지질을 포함한다.
ApoA-I 및 AAT를 정제하기 위한 본 발명의 방법은 대규모 정제에 적합하다. 본 발명에서 대규모 정제에 적합하다는 것은 수십 킬로그램의 출발 물질 예를 들어 수십 킬로그램의 인간 혈장 분획으로부터 출발할 때라도 높은 수율 및 순도로 ApoA-I 및 AAT를 정제하는 것을 의미한다. 어떤 구체예에서, 정제는 50kg 이상의 인간 혈장 분획으로부터 출발한다. 어떤 구체예에서, 정제는 50kg 이상의 Cohn 분획 IV1으로부터 출발하는데, 후자는 약 900 리터의 인간 혈장의 출발 부피와 동일하다. 또한 3000 내지 4000리터 또는 그 이상의 범위 내의 인간 혈장의 출발 부피를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 정제된 AAT는 SDS-Page, 및 ELISA 또는 네펠로법(nephelometry)과 같은 면역 분석법으로 결정되는 >96%의 순도를 가진다. 일반적으로, 정제된 AAT의 약 79 내지 99%는 평균 약 90%로 활성을 띤다. Cohn 분획 IV1의 기능적으로 활성을 띠는 AAT 함량에 근거하는 수복률은 인간 혈장 내에서 정상 함량의 약 40 내지 60% 또는 대략으로 20 내지 40%이다.
본 발명에 따라 정제된 ApoA-I은 적어도 75%의 순도를 가진다. 어떤 구체예를 이용하면, ApoA-I의 순도는 85%보다 높다. 수율은 적어도 15%이다. 어떤 구체예를 이용하면, 수율은 혈장 내의 ApoA-I 함량에 비하여 적어도 30%이다.
본 발명의 어떤 구체예에서, AAT/ApoA-I 용액에서, pH 및 저급 지방족 알코올, 예컨대 에탄올의 농도를 조정하여 용액 내에 ApoA-I은 침전시키고 반면에AAT는 잔류시킴으로써, AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제를 달성할 수 있다. 침전된 ApoA-I을 AAT 함유 용액으로부터 분리할 수 있다. 제 EP0329605호는 ApoA-I을 저급 지방족 알코올을 이용한 침전에 의하여 재현탁된 인간 혈장 분획으로부터 침전시킬 수 있음을 보고한다.
ApoA-I 을 침전시키기 위한 제 EP0329605호에 공지된 바와 같은 조건 하에서의 저급 지방족 알코올의 40% (v/v) 이하 농도는 ApoA-I 및 AAT를 분리하지 못하고 또한 AAT의 부대 손실 및 불활성화를 만들기 때문에, 두 단백질의 정제 방법에 적합하지 않음을 알아냈다. 본 발명에서 저급 지방족 알코올은 C1 내지 C4를 갖는 지방족 알코올, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 의미한다.
4.5 내지 6.5의 pH에서 ApoA-I을 저급 지방족 알코올, 예컨대, 에탄올의 대략 5 내지 25 % (v/v) 정도로 낮은 농도에서 침전시킬 수 있고 그러는 동안 AAT는 용액 내에 잔류하고 그의 활성을 유지한다는 것을 놀랍게도 알아냈다. 어떤 구체예에서, pH는 5 내지 6이다. 어떤 구체예에서, 저급 지방족 알코올의 농도는 약 7 내지 15% (v/v)이다. 어떤 구체예에서, 저급 지방족 알코올의 농도는 약 8 내지 14% (v/v)이다. 더 높은 pH, 예컨대, 6.5 초과에서, ApoA-I의 침전은 줄어들것이며, 반면에 더 낮은 pH, 예컨대 4.5 미만에서, AAT는 마찬가지로 점점 침전될 것이다. 저급 지방족 알코올의 더 낮은 농도에서, 예컨대, 5% (v/v) 미만의 에탄올 농도에서, ApoA-I은 침전하지 않을 것이고, 반면에 저급 지방족 알코올의 더 높은 농도, 예컨대 25% (v/v) 초과의 에탄올 농도에서, AAT는 마찬가지로 점점 침전할 것이다. 다양한 구체예에서, 침전 단계 동안에의 온도를 약 10℃ 이하에서 유지할 수 있다.
ApoA-I을 침전시키는 동안 ApoA-I 및 AAT의 분리를 허용하고 AAT의 손실 및 불활성화를 막는 것에 더하여, 본 발명의 방법은 종래의 기술에서 제안된 것 보다 더 저급의 지방족 알코올로 ApoA-I을 침전시키는 더 경제적인 방법을 제공한다. 또한, 더 낮은 농도의 더 저급의 지방족 알코올의 사용으로 인한 폭발 위험의 감소는 침전 단계를 위한 제조공정 단위의 설계에 있어서 더 낮은 비용을 들게 한다.
침전 단계 후에 AAT 및 ApoA-I을 개별적으로 하나 이상의 공정 단계에서 약학 등급 순도로 정제시킬 수 있다. AAT 및 ApoA-I의 분리 후에, AAT - 및 ApoA-I - 함유 용액을 단백질 정제를 위한 당해 기술 분야에서 알려진 방법들, 예를 들어, 각각 AAT 또는 ApoA-I의 정제에 적합하다고 이미 알려진 방법들 중 임의의 것에 의하여 더 처리할 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서, Cohn 분획 IV1을 8.0 내지 10.0 사이의 pH에서, 약 50-150 mM Tris, 0-30 mM NaCl 내에서 재현탁시키고 약 0 내지 10℃에서 적어도 1시간동안 교반할 수 있다. 다양한 구체예에서, pH는 8.8과 9.6 사이에 있을 수 있다. 어떤 구체예에서, 재현탁된 Cohn 분획 IV1의 용액을 약 2-3 시간동안 교반할 수 있다. Cohn 분획 IV1의 kg당 약 6 내지 18 kg 또는 12 내지 16 kg의 버퍼를 사용할 수 있다. AAT 수율을 최대화하기 위한 선택 단계에서 Tris 버퍼 현탁액을 약 40 내지 45℃의 온도에서 약 1 내지 1.5 시간의 기간 동안에 가열하고 나서, 다시 약 0 내지 10℃로 냉각시킬 수 있다.
그리고 나서 Tris 버퍼 현탁액을 약 0℃ 내지 2℃의 온도로 냉각시킬 수 있다. 이어서 ApoA-I 및 AAT의 현탁액을 약 5.0 내지 6.0의 pH로 조정하고 에탄올 농도를 8% 내지 14% (v/v)로 조정함으로써 ApoA-I을 침전시킬 수 있다. 이 조정을, 예를 들어, 소정 양의 에탄올 및 아세트산 나트륨/아세트산 용액을 Tris 버퍼 현탁액에 첨가함으로써 달성할 수 있다. 온도가 약 0℃ 내지 -7℃로 냉각될 때 에탄올/산 용액을 30 내지 60분의 기간 동안 첨가할 수 있고 그리고 나서 이 조건을 약 2 내지 4 시간의 기간동안 유지한다. 여과를 통하여 ApoA1의 이후의 분리를 촉진시키기 위하여, C1000과 같은 필터 보조제를 첨가할 수 있으며 그리고 나서 그 혼합물을 최소 15 분동안 교반할 수 있다. 용해성 AAT 함유 여과액을, 우선적으로로 필터 프레스를 이용하는, 여과에 의하여 불용해성 ApoA-I 물질로부터 분리할 수 있다. 대안적으로, 불용해성 ApoA-I 물질을 원심분리에 의하여 분리할 수 있다.
이어서 상기에서 상술된 분리 방법에서의 여과액 또는 상청액 내의 AAT를 더 정제할 수 있다. 어떤 구체예에서, AAT 여과액을 약 0℃ - 8℃ 및 약 8.8 내지 9.6의 pH로 조정할 수 있다. pH 조정 후에, DTT를 약 15-30 mM의 농도로 첨가할 수 있다. 이어서 약 8.8 내지 9.6에서 pH를 유지하면서, DTT 처리 여과액을 약 0 내지 10℃에서 약 2 내지 4 시간 동안에 혼합할 수 있다. 이어서 퓸드 실리카를 페이스트 분획을 포함하는 혈장 내에서 대략 16.7 g/L 혈장 등가(16.7 g/L plasma equivalent)의 농도로 용액에 첨가할 수 있다. 이어서 약 8.8 내지 9.6의 pH 범위 내에서, 현탁액을 약 0 내지 10℃에서 적어도 30분 동안 교반할 수 있다. 어떤 구체예에서, 용액을 약 1-4 시간동안 교반한다. 이 단계에서, AAT 여과액의 잔여 불순물은 퓸드 실리카의 현탁액에 결합할 수 있는데, 이것은 이후에 침전물을 형성한다. 퓸드 실리카로서, 예를 들어, AerosilTM을 사용할 수 있다. 선택적으로 C1000와 같은 필터 보조제를 첨가한 후에, 필터 프레스를 이용하여 용액에 남아 있는 AAT를 침전된 퓸드 실리카 및 오염성 단백질로부터 분리하여 정제된 AAT 여과액을 생성할 수 있다. 필터 보조제를 사용하면, 그 양은 퓸드 실리카의 1kg 당 약 3kg의 필터 보조제일 수 있다. 다양한 구체예에서, 만족할 만한 수준의 순도를 얻을 때까지 현탁액을 필터 프레스를 통하여 재순환시킬 수 있다.
하기에 기술된 구체예에서, 여과액에 첫번째로 염 구배 용리(salt gradient elution)에 의한 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography, "IEC")를 실시한다. 크로마토그래피 컬럼은 양으로 하전된 기들(positively charged groups)이 공유적으로 부착된 다공성 수지 지지 매트릭스로 구성되는 음이온 교환 수지를 포함할 수 있다. 이들 양으로 하전된 기들은 AAT와 같은 음이온 기들을 갖는 단백질을 포함하여, 음이온에 가역적으로 결합한다.
AAT 및, 용출 버퍼의 pH에서 순(net) 음전하를 갖는 다른 단백질은, IEC 컬럼에 결합할 수 있다. 음전하가 거의 없거나 전혀 없는 오염성 단백질은 결합하는 일 없이 음이온 교환 수지 컬럼을 통과하여 컬럼 배출물(column effluent)과 함께 나온다. 이어서 컬럼에 결합하는 그러한 오염성 단백질을 구배 용리에 의하여 AAT로부터 분리한다. 수지에 결합되는 다양한 단백질을 연속적으로 방출시키기 위하여 컬럼이 용출됨에 따라 염 농도를 점진적으로 증가시킬 수 있다.
AAT 최종 여과액을 ICE 평형 버퍼(대략 50 mM Tris 및 약 8.6-8.9의 pH)로 평형화시킨 음이온 교환 수지를 함유하는 크로마토그래피 컬럼 상으로 직접 적용할 수 있다. 컬럼을 대략 50-70%의 미리 결정된 단백질 용량으로 AAT 최종 여과액과 함게 로드(load)할 수 있다. 이어서 IEC 워시 버퍼(예를 들어, 대략 50 mM Tris, 약 25-65 mM NaCl, 및 약 7.1-7.7의 pH)로 컬럼을 세정함으로써, 오염물질을 컬럼으로부터 제거할 수 있으며, 계속해서 IEC 용출 버퍼(예컨대, 대략 50 mM Tris, 약 70-120 mM NaCl, 및 약 7.1-7.7의 pH)를 이용하여 AAT를 용출시킬 수 있다.
하기에 기술된, 어떤 구체예에서, IEC 컬럼으로부터의 AAT-함유 용출액에 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, "HIC")를 실시할 수 있다. 이런 타입의 크로마토그래피는 성분들(moities)이 공유적으로 부착되는 지지 매트릭스를 이용한다. 수성 환경에서, 이러한 소수성 성분들은, IEC 용출액에 잔존하는 오염성 단백질과 같은, 소수성 분자에 가역적으로 결합할 수 있다. AAT는 상대적으로 비-소수성이다. 따라서, 더 많은 소수성 오염성 단백질이 컬럼에 결합하여 잔존하는 동안에, AAT의 대부분은 컬럼이 용출하는 동안에 버퍼와 함께 컬럼을 흐를 수 있다. 따라서 컬럼 유출액은 정제된 AAT를 함유할 수 있다. 실제로, AAT는 소정의 HIC 컬럼 매질에 대하여 약한 친화성을 가지는 것으로 밝혀졌고, 그와 같은 경우에, 최초 적용된 샘플에서 본질적으로 AAT의 전부를 수복하기 위하여 수 부피(several volumes)의 워시 버퍼와 함께 하는 추가의 용출이 바람직할 수 있다.
황산 암모늄을 대략 0.9 내지 1.1 M의 최종 농도로 첨가함으로써 HIC를 위하여 IEC 컬럼의 용출액을 제조할 수 있다. 이어서 이 용액을 여과하고, HIC 워시 버퍼(예, 대략 50 mM Tris, 약 1M 황산 암모늄, 약 7.3-7.5의 pH)로 평형화된, 소수성 상호작용 컬럼에 적용할 수 있다. 이어서 컬럼을 약 25-75 그램 단백질/리터 중력 고정 수지(25-75 grams proteins/L gravity settled resin)의 범위 내에서 로드할 수 있다. 로드의 동안에, AAT는 소수성 컬럼 매트릭스에 결합하지 않고 컬럼을 통과하여 흐른다. 로드의 완성 시에, 충전 컬럼에 잔존하는 결합하지 않은 AAT를 HIC 워시 버퍼를 이용하여 컬럼에서 세정해 낼 수 있다. 결합된 컬럼 유체 통과물(column flow through) 및 수반하는 세정물(subsequent wash)을 초-여과에 의하여 농축하고, 인산염 버퍼(약 40　mM 인산 나트륨 및 대략 7.2-7.6 사이의 pH)로 투석여과할 수 있다. 최종 AAT 농도를 바람직하게는 7% 단백질보다 크지 않다.
원하는 수준의 순도 및 활성도에 도달하는 데에 필요한 추가적인 정제 단계 후에, AAT 용액을 농축하고 살균할 수 있다, 다양한 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 후에, AAT를 약학적으로 허용가능한 수준의 순도 및 활성도에 있게 할 수 있으며, 추가적인 단계는 필요하지 않을 수 있다. 어떤 구체예에서, 농도는 초여과에 의하여 이어서 투석 여과에 의하여 달성할 수 있다. 이러한 기술에서, 용매 및 용해된 염 및 소분자를 여과막에 통과시켜 더 농축된 단백질 용액을 남긴다. 이어서, 용액을 동일한 막에 계속해서 통과시킴으로써 일정한 생성물 부피를 유지하면서, 수 부피의 새로운 버퍼를 생성물에 연속적으로 첨가함으로써 단백질 용액 내의 잔여 염 및 소분자를 상이한 버퍼와 교환할 수 있다.
이어서 AAT를 약학적으로 허용가능한 버퍼와 함께 제공하고, 액상으로 저장하거나 당해 기술에서 알려진 방법에 의하여, 예를 들어, AAT 치료적 제제를 제조하는데 적합하다고 알려진 방법에 의하여 동결건조시킬 수 있다.
포유류 원천(mammalian sources)으로부터 분리된 단백질은 병원성 바이러스 오염물을 포함할 수 있으며, 약학 조성문에서 그러한 오염물을 줄이거나 제거하는 것이 바람직하다. 바이러스 감소의 방법은 관련 분야의 기술자에게 알려져 있다. 본 발명에 적용될 것으로 생각되는 방법은, 저온살균, 방사선 요법, 용매/세제 처리, 소독살균, 여과 및 초임계 유체를 이용한 처리를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용매/세제 처리는, 예를 들어, 단백질 용액을 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르(polyoxyethylene sorbitan ester) 및 트리부틸 포스페이트(tributyl phosphate)에 접촉시킴으로써, 실시할 수 있다(미국 특허 번호 제 4,820,805호를 참조; 또한, AAT 조성물에 대한 방법의 적용을 위하여 제 WO 95/35306호를 참조). 단백질 용액의 소독 살균(disinfection)은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,106,773호, 제 6,369,048호 및 제 6,436,344호에 밝힌 바와 같이, 그 용액을 용해성 병원체 불활성화제에 노출시키거나, 예를 들어 미국 특허 번호 제 6,096,216호 및 그의 명세서 내의 참조물에 밝힌 바와 같이, 불용해성 병원체 불활성 매트릭스에 접촉시킴으로써, 실시할 수 있다. 여과는 15-70 nm 초여과를 이용하여 실시할 수 있다(예, VirAGardTM 필터, A/G Technology Corp.; PlanovaTM 필터, Asahi Kasei Corp.; ViresolveTM 필터, Millipore Corp.; DV 및 OmegaTM 필터, Pall Corp. 는 물론이고 GE Healthcare의 할로우 파이바 필터(hollow fibre filters)). 방사선 요법은 자외선 또는 감마 방사선으로 실시할 수 있다; 예를 들어 미국 특허 제 6,187,572호 및 그의 참고 문헌을 참조. 초임계 유체를 이용한 처리에 의한 바이러스의 불활성화는 미국 특허 번호 제 6,465,168호에 기술되어 있다. 단백질 용액의 저온 살균은 처리될 단백질의 열적 안적성에 의하여 제시된 한도 내에서의 가열을 수반한다. AAT의 경우에서, 저온 살균은 보통 약 60-70℃로 가열함으로써 실시할 수 있다. 하기에 기술된, 어떤 구체예에서, AAT 농축액의 바이러스 감소를 저온 살균 및 초여과에 의하여 실시할 수 있다. 미국 특허 번호 제 4,876,241호의 실시예에서 밝힌 바와 같이, 저온 살균 단계의 동안에 열적 열화로부터 AAT를 보호하기 위하여 안정화제를 첨가할 수 있다. 자당(sucrose) 및 아세트산 칼륨을 안정화제로서 첨가하고, 이어서 안정화된 AAT 용액을 약 60℃에서 저온살균하여 바이러스 오염을 줄일 수 있다. 자당의 양은 중량에 대하여 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 약 60%일 수 있다. 40% 미만의 자당을 사용하는 것은 원하지 않는 수준의 AAT 응집을 만들어 낸다는 것이 밝혀졌다. 아세트산 칼륨의 양은 중량에 대하여 적어도 4%, 적어도 5% 또는 약 6%일 수 있다.
바이러스 감소 후에, AAT 용액을 선택적으로 희석하고 초여과하고 나서, 예컨대 여과에 의하여 재농축하고 살균할 수 있다. 이어서 살균된 AAT-함유 농축액을 동결건조하여 치료 생성물(therapeutic product)을 형성한다. 어떤 구체예에서, 동결건조된 AAT 가루를 20　mM 인산 나트륨, 45　mM NaCl, 3% 만니톨(mannitol) 내에서 제조할 수 있다. 이 조성물은 주사와 같은 것에 적합하나, 이후의 재구성을 위하여 동결건조시키거나 살균수와 함께 유리 바이알(glass vials)에 저장할 수 있다. AAT 최종 여과액을 IEC 평형 버퍼(대략 50 mM Tris 및 약 8.6-8.9의 pH)로 평형화된 음이온 교환 수지를 함유하는 크로마토그래피 컬럼 상에 직접 적용한다. 컬럼을 AAT 최종 여과액과 함께 대략 50-70%의 미리 결정된 단백질 용량에 로드한다. 이어서 IEC 워시 버퍼(대략 50 mM Tris, 약 25-65 mM NaCl, 및 약 7.1-7.7의 pH)로 컬럼을 세정함으로써, 오염물질을 컬럼으로부터 제거하고, 계속해서 IEC 용출 버퍼(대략 50 mM Tris, 약 70-120 mM NaCl, 및 약 7.1-7.7의 pH)를 이용하여 AAT를 용출한다.
최종 제형은 선택된 바이러스 비활성화 단계 및 의도된 투여 모드에 따라 다를 것이다. AAT를, 에어로졸로서, 주사에 의하여, 또는 국부적으로, 투여하는 지의 여부에 따라, AAT를 동결건조된 파우더, 액상 또는 현탁액으로서 저장할 수 있다. 흡입을 위한 건성 파우더 제형의 조성물은, 예를 들어, 7.44 mg AAT, 0.059 mg 시트르산 나트륨 및 0.001 mg 시트르산의 1회분당 적은 양일 수 있다. 그러한 제형은 정량 흡입기(metered dose inhaler) 또는 미국 특허 번호 제 6,138,668호에 공지된 것과 같은 허파용 운반 장치(pulmonary delivery device) 중의 하나를 이용하여, 미국 특허 번호 제 5,780,014호에 기술된 바와 같은 흡입 투여에 적절하다.
본 발명에 따라 정제된 AAT는 SDS-Page 및 ELISA 또는 네펠로법(nephelometry)과 같은 면역 분석법으로 결정된 >96%의 순도를 가진다. 일반적으로, 정제된 AAT의 약 79 내지 99%는 평균 약 90%로, 활성을 띤다. Cohn 분획 IV1의 기능적으로 활성을 띠는 AAT 함량에 근거하는 수복률은 인간 혈장 내의 원천 함량에 비하여 약 40 내지 60%, 대략 20 내지 40%이다.
본 방법 또는 하기에 기술된 임의의 방법에 의하여 정제된 AAT는, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,974,792호에 기술된 바와 같이, 이성체에서 4.3 내지 4.4의 pI로 농축되지 않는다.
본 발명에서 설명된 정제된 AAT를 치료 용도를 위한 약학 제조물로 제형화할 수 있다. 첨가될 수 있는 종래의 생리학적으로 적합한 수성 버퍼 용액(physically compatible aqueous buffer solutions), 선택적으로 약학적 부형제(pharmaceutical excipients)에 정제된 단백질을 용해하여 약학 제조물을 제공할 수 있다.
적절한 약학 제형 뿐만 아니라 그러한 약학적 담체 및 부형제는 당해 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer 등, Taylor & Francis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3판, Kibbe 등, Pharmaceutical Press (2000)을 참조). 특히, 본 발명의 폴리펩티드 변형체를 포함하는 약학적 조성물을, 동결건조된 또는 안정한 액상 형태로 제형화할 수 있다. AAT를 당해 분야에서 알려진 다양한 과정들에 의하여 동결건조시킬 수 있다. 예를 들어, 주사를 위한 살균수 또는 살균 생리 식염수와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석액을 첨가함으로써, 동결건조된 제형을, 사용전에 재구성할 수 있다.
조성물의 제형을 임의의 약학적으로 적절한 투여 수단에 의하여 개체에 전달할 수 있다. 다양한 전달 시스템은 공지되어 있으며 임의의 편리한 경로에 의하여 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 체계적으로 투여될 수 있다. 체계적 사용을 위하여, 종래의 방법에 따르면 본 발명의 단백질을 비경구적(예, 정맥내, 피하의, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피성) 또는 장관적(예, 구강의, 질의, 직장의) 전달을 위하여 제형화할 수 있다. 어떤 구체예에서, 투여의 경로는 정맥내, 피하, 또는 폐내이다. 제형을 주입에 의하여 또는 거환 주사(bolus injection)에 의하여 연속적으로 투여할 수 있다. 어떤 제형은 서방형 시스템(slow release systems)을 포함한다.
본 발명에 따른 AAT를 환자에게 치료에 효과적인 양으로 투여할 수 있는데, 이 양은 원하는 효과를 내기에 충분한 용량을 의미하는 것으로, 통증을 막거나 완화시키는 것 또는 참을 수 없는 부작용을 만드는 용량에 도달함에 없이 치료되는 조건 또는 징후를 전개하는 것이다. 정확한 용량은, 예컨대, 징후, 제형, 투여 방식과 같은 많은 요소에 의존하며, 각 징후에 따라 임상전 및 임상 실험으로 결정해야 한다.
또한 본 발명은 AAT의 익숙한 결핍증을 물론, AAT의 치료적 용도가 효과적일 수 있는 다른 징후, 예를 들어, 폐기종(emphysema)과 낭성 섬유종(cystic fibrosis)으로 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 개체에 치료적으로 효과있는 양의 AAT를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 제제은 동일한 약제의 일 부분으로서 결합될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기에 기술된 방법에 의하여 획득한 침전된 ApoA-I을 아래에 기술한 바와 같이 더 정제할 수 있다.
6 내지 10의 pH에서의 약 20 mM Tris를 포함하는 버퍼 내에, 약 0 내지 -2℃에 약 5 내지 6의 pH에서의 인간 혈장 단백질 분획의 현탁액을 저급 지방족 알코올, 예컨대 에탄올을 8 내지 14%의 농도로, 약 2 시간 내지 최대 24 시간 동안 0℃ 내지 50℃의 온도에서 배양함으로써 얻은 침전물로부터 ApoA-I을 추출할 수 있다. 어떤 구체예에서, 버퍼의 pH는 약 8.0이다. 선택적으로, 수용성 염을 약 0-1 M의 농도로 첨가할 수 있다.
ApoA-I의 용해성을 향상시키기 위하여, 비-이온성 세제(예, 폴리소르베이트(polysorbate), 브리지(Brij), 옥틸-글리코시드(octyl-glycosides)), 이온성 세제(예, 담즙산(bile acids)). 또는 쯔비터이온(zwitterionic) 세제(예, CHAPSTM, ZwittergentTM)를 첨가할 수 있다. 이어지는 단계에 따라, 예컨대, 투석여과 또는 적절한 수지(BioBeadsTM)로의 흡착에 의하여 세제를 제거하거나 부분적으로 제거할 수 있다.
완충 현탁액을 교반하고 약 1 내지 4 시간 동안에 배양하고 나서, 여과하거나 원심분리할 수 있다. 여과액 또는 청상액에 포함된 ApoA-I을 하기에 기술된 방법에 의하여 더 정제할 수 있다.
여과액 또는 청상액의 pH를 적절하게 조정하며, ApoA-I이 용액에 잔류하는 동안 대부분의 고분자 중량 오염물질이 침전될 때까지 에탄올을 첨가할 수 있다. 어떤 구체예에서, ApoA-I을 대략 45% (35 - 55%) (v/v) 에탄올, pH 3.5 (pH 3 - 5), 10 - 200 mM NaCl에서 침전시킬 수 있다. 또한 pH를 5(pH 4-6)로 그리고 에탄올 농도를 >50% (50-60%) (v/v)로 증가시킴으로써 ApoA-I을 침전시킬 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 방법에 있어서, 예를 들어 황산 암모늄을 이용한 침전에 의하여 ApoA-I을 여과액 또는 상청액으로부터 분리할 수 있다: 황산 암모늄을 고체로서 또는 농축된 모액(stock solution)으로서 약 0.6-1.4M의 최종 농도에 6 내지 9의 pH 범위에서 ApoA-I 추출액에 첨가할 수 있다. 현탁액을 약 0℃ 내지 30℃에서 약 2 내지 24 시간 동안 배양할 수 있으며, 침전된 ApoA-I 분획을 여과 또는 원심분리에 의하여 모을 수 있다.
이어서, 당해 분야에 알려진 방법에 의하여 ApoA-I의 정제를 더 실시할 수 있는데, 이 방법은, 당해 분야의 기술자들에 의하여 결정될 수 있는 적절한 조건 하에서, 예를 들어, 양이온- 또는 음이온-교환 수지, 소수성 상호작용 매트릭스 및 혼합 모드 수지(예, 그것들을 이온성 및 소수성 부위와 상호작용하게 하는 성질을 가지는 수지)로부터 ApoA-I을 결합하고 용출하는 것을 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 양이온-, 음이온 교환 수지, 소수성 상호작용 매트릭스, 및/또는 혼합 모드 수지에서 ApoA-I이 유체 통과 분획(flow through fraction) 내에 있도록 하는 조건을 선택할 수 있으며, 오염물 대부분은 수지에 결합하여 잔류한다.
선택적으로, 퓸드 실리카(AerosilTM) 및/또는 지질 제거제(LRATM; World Minerals)에 결합함으로써 또는 예컨대, 시버크론 블루(Cibacron blueTM) 유도체(Ciba), 트리아진(Triazine) 유도체(Prometic), 또는 VHH 항체 절편(The Bio Affinity Company)으로의 특이성 리간드 흡착에 의하여, ApoA-I을 더 정제할 수 있다. 이러한 결합제로부터 ApoA-I을 용출하는 것은, 예를 들어, 세정제, 에탄올, 카오트로픽 시약(chaotropic reagent), 높은pH, 어떤 구체예에서는 pH 13.69 미만, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 또는 그의 조합에서 실시할 수 있다.
본 발명에 따라 정제된 ApoA-I은 적어도 75%, 일반적으로 85% 초과의 순도를 가진다. 어떤 구체예에서, 수율은 혈장 내의 ApoA-I 함량에 비하여 적어도 15%이다. 어떤 구체예에서, 수율은 혈장 내의 ApoA-I 함량에 비하여 적어도 30%이다
다양한 구체예에서, AAT에 대하여 상기에서 기술한 바와 같은 적어도 한 번의 바이러스 감소 단계를 ApoA-I에 적용할 수 있다.
본 발명에서 기술된 바와 같은 정제된 ApoA-I을 치료적 용도를 위하여 약학 조제물로 제형화할 수 있다. 첨가될 수 있는 종래의 생리학적으로 적합한 수성 버퍼, 선택적으로 약학적 부형제(pharmaceutical excipients)에 정제된 단백질을 용해하여, 약학 제조물을 제공할 수 있다. 적절한 약학 제형 뿐만 아니라 그러한 약학적 담체 및 부형제는 당해 분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer 등, Taylor & Francis (2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3판, Kibbe 등, Pharmaceutical Press (2000)을 참조). 특히, 본 발명의 폴리펩티드 변형체를 포함하는 약학 조성물을 동결건조된 또는 안정한 액상 형태로 제형화할 수 있다. ApoA-I을 당해 분야에서 알려진 다양한 과정들에 의하여 동결건조시킬 수 있다. 동결건조된 제형을, 예를 들어, 주사를 위한 살균수 또는 살균 생리 식염수와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석물을 첨가함으로써, 사용전에 재구성할 수 있다. 어떤 구체예에서, Lerch 등, Vox Sanguinis 1996; 71: 155-164에 기술된 바와 같이 정제된 ApoA-I을 재구성 HDL 유사 입자(reconstituted HDL like particles, rHDL)의 형상으로 치료적으로 사용할 수 있다.
ApoA-I 을 포함하는 제형을 임의의 약학적으로 적절한 투여 수단에 의하여 개체에 전달할 수 있다. 다양한 전달 시스템은 공지되어 있으며 임의의 편리한 경로에 의하여 조성물을 투여하는데 사용할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 조성물을 체계적으로 투여할 수 있다. 체계적 사용을 위하여, 종래의 방법에 따르면 비경구적(예, 정맥내, 피하의, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피성) 또는 장관적(예, 구강의, 질의, 직장의) 전달을 위하여 본 발명의 단백질을 제형화할 수 있다. 어떤 구체예에서, ApoA-I 또는 재구성된 ApoA-I을 정맥내로 투여할 수 있다. 제형을 주입에 의하여 또는 거환 주사(bolus injection)에 의하여 연속적으로 투여할 수 있다. 어떤 제형은 서방형 시스템(slow release systems)을 포함한다.
본 발명에 따른 ApoA-I을 환자에게 치료에 효과적인 양으로 투여할 수 있는데, 이 양은 원하는 효과를 내기에 충분한 용량을 의미하는 것으로, 통증을 막거나 완화시키는 것 또는 참을 수 없는 부작용을 만드는 용량에 도달함에 없이 치료되는 조건 또는 징후를 전개하는 것이다. 정확한 용량은, 예컨대, 징후, 제형, 투여 방식과 같은 많은 요소에 의존하며, 각 징후에 따라 임상전 및 임상 실험으로 결정해야 한다.
또한 본 발명은 ApoA-I의 익숙한 결핍증은 물론, ApoA-I의 치료적 사용이 유용한 다른 징후, 예를 들어, 동맥 경화증(atherosclerosis), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 대뇌 혈관 질환(cerebral vascular diseases)(예, 발작), 국소 빈혈 상해(ischemia reperfusion injuries), 말초 혈관 질환(peripheral vascular diseases), 당뇨병과 관련된 혈관 질환(vascular disease) 뿐만 아니라 만성 및 급성 염증성 질환 그리고 과도한 응고의 억제로 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 개체에 치료적으로 유용한 양의 ApoA-I 또는 rHDL을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 제제는 동일한 약제의 일부로서 병합될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제의 방법을 제공하는데, 여기에서 AAT/ApoA-I 용액의 pH를 조정하여, ApoA-I이, 예를 들어, 퓸드 실리카(예, AerosilTM), 지질 제거제(LRATM), 또는 시버크론 블루(Cibacron blueTM) 유도체(Ciba); 트리아진(Triazine) 유도체(Prometic) 또는 VHH 항체 절편(The Bio Affinity Company)과 같은 특이성 ApoA-I 결합 리간드와 같은 첨가된 ApoA-I 결합제에 결합할 수 있게 한다. 어떤 구체예에서, 퓸드 실리카는 ApoA-I 결합제이다. 퓸드 실리카에 결합되는 ApoA-I을 AAT-함유 용액으로부터 분리하고 이어서 ApoA-I을 퓸드 실리카로부터 pH 13.69 미만, 또는 13 이하, 12 이하, 또는 11이하의 pH에서 용출할 수 있다. 한 구체예에서, ApoA-I을 7부터 그 이상으로 12를 포함하는 pH에서 용출할 수 있다. 다른 구체예에서, pH를 8부터 그 이상으로 11을 포함하는 것 일 수 있다. 또 다른 구체예에서, pH 범위는 9 부터 그 이상으로 10을 포함할 수 있다. 더 명확하게, ApoA-I을 용출할 수 있는 pH 값의 비-제한된 예들은 pH 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 10.5, 및 11을 포함한다. AAT 및 ApoA-I의 분리 후에, AAT- 및 ApoA-I-함유 용액을 단백질 정제로 당해 분야에서 알려진 임의의 방법, 예를 들어, AAT 또는 ApoA-I의 정제에 적합하다고 알려진 방법에 의하여 더 처리할 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서, Cohn 분획 IV1 페이스트를 현탁액 버퍼, 예컨대, 약 50 내지 150 mM Tris, 0 내지 30 mM NaCl 내에서, 약 8.0 내지 약 10.0 사이의 pH에서 현탁시키고 약 0 내지 10℃에서 최소 1시간동안 교반할 수 있다. 어떤 구체예에서, pH는 약 9.0과 9.6 사이에 있을 수 있다. 다양한 구체예에서, 현탁액을 2-3 시간동안 교반할 수 있다. 버퍼의 양은 혈장-함유 분획(분획 IV1)의 kg당 6 kg 내지 18 kg(또는 12 kg 내지 16 kg)까지의 범위일 수 있다. AAT 수율을 최대화하기 위한 선택 단계에서, Tris 버퍼 현탁액을 약 40 내지 45℃의 온도로 약 1 내지 1.5 시간의 기간 동안 가열하고 나서, 다시 약 0 내지 10℃로 냉각시킬 수 있다.
이어서 Tris 버퍼 현탁액을 디티오트레이톨(DTT) 및 퓸드 실리카로 처리할 수 있다. DTT를 약 15 내지 50 mM의 범위의 농도에서 Tris 버퍼 현탁액에 첨가할 수 있다. 이어서 용액을 약 9.0 내지 9.6의 pH에서 약 0 내지 10℃에서 최소 약 30분 동안에 교반할 수 있다. 어떤 구체예에서, 용액을 약 2-4 시간동안 교반한다. 이어서 DTT-처리 추출액을 약 7.5 내지 7.8의 pH로, 예를 들어, 묽은 염산 용액을 이용하여 조정한다. 이어서 퓸드 실리카(예를 들어 AerosilTM 380)를 혈장 함유 분획 내에 대략적으로 16.7 그램/리터 혈장 등량(Liter plasma equivalent)으로 첨가할 수 있다. 이어서 현탁액을 약 7.5 내지 8.0의 pH에서, 저온에서 적어도 30분 동안 교반할 수 있다. 어떤 구체예에서, 현탁액을 1 내지 4 시간 동안에 교반할 수 있다. C1000과 같은 필터 보조제를, 중량당, 실리카 한 부분에 대하여 필터 보조제 약 세 부분의 비율로 첨가할 수 있으며, 그 혼합물을 최소 약 15분 동안 교반할 수 있다. 이어서 용해성 AAT 분획을 필터 프레스를 이용하여 침전된 퓸드 실리카/ApoA-I 및 오염성 단백질로부터 분리하여 AAT 최종 여과액을 생성한다. AAT 여과액을 더 처리할 수 있고, 반면에 퓸드 실리카 ApoA-I 침전물을 추가의 정제를 위하여 모을 수 있다. 대안적으로, 퓸드 실리카에 결합된 ApoA-I을 원심분리에 의하여 분리할 수 있다. 9 내지 10의 pH에서 바람직하게는 약 9.5의 pH에서 50-100 mM Tris 내에서의 배양에 의하여 퓸드 실리카로부터의 ApoA-I의 용출을 실시할 수 있다. AAT 및 ApoA-I을 분리한 후에, 두 단백질을 예를 들어 상기에 기술된 방법을 이용하여 더 정제할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제의 방법을 제공하는데, 여기에서 AAT/ApoA-I 용액을 두 단백질 모두 결합하지 않는 조건 하에서 디티오트레이톨(DTT) 및 퓸드 실리카로 처리한다. 용해성 AAT/ApoA-I 분획을 침전된 퓸드 실리카/오염성 단백질로부터 분리하여 AAT 및 ApoA-I-함유 상청액을 만들 수 있다. AAT 및 ApoA-I을 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 더 정제하고 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 동안에 분리할 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 분획 IV1 페이스트를 현탁액 버퍼(예컨대, 50 내지 150 mM Tris, 0-30　mM NaCl, 8.0 내지 약 10.0 사이의 pH)에서 현탁하고 0-10℃에서 최소 1시간 동안 교반할 수 있다. 어떤 구체예에서, 현탁액 버퍼의 pH는 9.0 및 9.6 사이일 수 있다. 어떤 구체예에서, 현탁액을 2-3 시간 동안 교반할 수 있다. 사용된 버퍼의 양은 혈장-함유 분획(분획 IV1)의 kg당 6 내지 18 kg (또는 12-16 kg)의 범위일 수 있다. 이어서 Tris 버퍼 현탁액을 1 내지 1.5 시간 동안 40 내지 45℃의 온도로 가열하고, 이어서 0 내지 10℃의 온도로 냉각한다.
이어서 Tris 버퍼 현탁액을 디티오트레이톨(DTT) 및 퓸드 실리카(AerosilTM)로 처리할 수 있다. DTT를 약 15 내지 50 mM의 범위의 농도에서 Tris 버퍼 현탁액에 첨가할 수 있다. 이어서 용액을 약 9.0 내지 9.6의 pH에서 약 0-10℃의 온도에서 적어도 약 30분 동안 교반할 수 있다. 어떤 구체예에서, 용액을 약 2-4 시간 동안 교반할 수 있다. 이어서 퓸드 실리카(예, AerosilTM)를 페이스트 분획을 함유하는 혈장에서 대략적으로 16.7 그램/리터 혈장 등량(Liter plasma equivalent)으로 첨가할 수 있다. 이어서 약 9.0 내지 9.6의 pH를 유지하면서 현탁액을 약 0 내지 10℃에서 적어도 약 30 분 동안 교반할 수 있다. 어떤 구체예에서, 용액을 약 1-4 시간 동안 교반할 수 있다. C1000과 같은 필터 보조제를, 중량당, 퓸드 실리카 한 부분에 대하여 필터 약 세 부분의 비율로 첨가할 수 있으며, 그 혼합물을 최소 약 15분 동안 교반할 수 있다. 용해성 AAT/ApoA-I 분획을, 예를 들어, 필터 프레스를 이용하여, 침전된 퓸드 실리카/오염성 단백질로부터 분리하여, AAT/ApoA-I 여과액을 생성할 수 있다. 대안적으로, 퓸드 실리카를 분리하는 다른 모드, 예를 들어, 원심분리가 이용될 수 있다.
약 7.3 내지 7.5의 pH에서 50 mM Tris, 7.5 M 황산 암모늄을 포함하는 세정 버퍼를 사용하여 AAT를 세정한 후에, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계의 동안, 물로 ApoA-I을 최종적으로 용출하는 것을 제외하고는, AAT 및 ApoA-I을 상기에 기술된 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 더 정제할 수 있다. AAT 결합성 컬럼 유체 통과물(column flow through) 및 수반하는 세정물(subsequent wash)을 초-여과에 의하여 농축하고, 인산염 버퍼(약 40　mM 인산 나트륨 및 약 7.2-7.6의 pH)로 투석여과한다. 최종 AAT 농도는 바람직하게는 7% 단백질보다 크지 않다. AAT는 HIC 컬럼으로부터 약학 등급 순도로 용출한다.
이어서 퓸드 실리카로부터 용출된 ApoA-I을 상기 기술된 바와 같이 더 정제할 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 AAT 및 ApoA-I의 분리 및 정제의 방법을 제공하는데, 여기에서 AAT/ApoA-I 용액을 DTT 및 퓸드 실리카로 처리하고 나서, ApoA-I과 AAT의 어느 것도 이온-교환 컬럼에 부착하지 않는 조건 하에서 음이온-교환 컬럼을 통과시키며, ApoA-I은 결합하고 AAT는 용해성으로 남겨지는 조건 하에서 상기 유체 통과물을 HIC 컬럼에 접촉시키며 유체 통과 분획 내의 ApoA-I로부터 분리한다. AAT 및 ApoA-I의 분리 후에, AAT- 및 ApoA-I- 함유 용액을 단백질 정제를 위하여 당해 분야에 알려진 방법, 예를 들어 AAT 또는 ApoA-I의 정제에 적합하다고 알려진 방법에 의하여 더 처리할 수 있다.
어떤 구체예에서, Cohn 분획 IV1 페이스트를 상기에서 기술한 바와 같은 버퍼로 현탁하고, DTT 및 AerosilTM로 처리하고, 여과할 수 있다. AAT/ApoA-I 여과액의 pH를, 예를 들어, 묽은 염산 용액의 첨가에 의하여, 약 7.1 내지 7.7로 조정할 수 있다. 이어서 AAT/ ApoA-I 여과액의 전도도를, 예를 들어, 2 M NaCl 용액의 첨가에 의하여, 22.0℃에서 대략 15 mS/cm으로 조정할 수 있다. 이어서 pH/전도도가 조정된 AAT/ApoA-I 여과액을 평형 버퍼(예, 약 50　mM Tris, 대략적으로 pH 7.4, 약 15 mS/cm 전도도)로 평형화된 음이온 교환 수지를 함유한 크로마토그래피 컬럼에 직접 적용할 수 있다. AAT 및 ApoA-I이 흐르는 동안에 오염성 단백질을 컬럼에 결합시킬 수 있다.
이어서 황산 암모늄을 약 0.9M 내지 1.1M의 최종 농도로 첨가함으로써 AAT/ApoA-I 유체 통과물을 HIC를 위하여 제조할 수 있다. 이 용액을 여과하고, HIC 세정 버퍼로 평형화된 HIC 컬럼에 적용할 수 있다. 로드 동안의 최초 용출은 AAT-함유 유출액을 제공하고, 추가의 세정 버퍼로 인한 용출은 컬럼 내에 유지된 임의의 AAT를 제거할 수 있다. 결합된 유출액 및 세정물을, 예를 들어, 초여과 및 인산염 버퍼로의 투석여과에 의하여 농축할 수 있다. 어떤 구체예에서, 최종 AAT 농축액은 7% 단백질보다 높지 않다. 일단 AAT 분획을 제거하면, 추가의 불순물을 0.1 내지 0.2 M 황산 암모늄 용액을 이용하여 컬럼에서 세정할 수 있으며, 이어서 물을 이용하여 ApoA-I을 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다. AAT는 약학 등급 순도로 HIC 컬럼으로부터 용출한다. ApoA-I 및 AAT를, 예를 들어, 상기에서 기술된 방법을 이용하여, 더 정제할 수 있다.
실시예
실시예 1: Cohn 분획 IV 1 침전물의 분리
인간 혈장을 약 0℃로 냉각하고 약 7.2의 pH로 조정하였다. 냉 에탄올을 약 8% (v/v)의 농도로 첨가하고, 온도를 대략 -2℃로 낮추었다. 형성된 침전물(분획I)을 원심분리 또는 여과에 의하여 제거하였다.
상기 과정으로부터의 여과액 또는 상청액을 약 pH 6.9로 조정하고, 냉 에탄올을 대략 20%　(v/v)의 농도로 첨가하였다. 이어서 온도를 5℃로 낮추었으며, 그 혼합물을 다시 원심분리 또는 여과시켰다. 형성된 침전물(분획 II + III)을 다른 목적을 위하여 놓아 두었다.
상기 과정에서의 여과액 또는 상청액을 대략 5.05의 pH로 조정하고, 이어서 에탄올 농도를 21% (v/v)로 조정하였다. 온도를 -5℃로 조정하였다. 형성된 침전물(분획IV1)을 원심분리 또는 여과에 의하여 제거하고, 필요할 때까지 페이스트의 형태로 저장하였다. 이 분획 IV1 페이스트는 AAT, ApoA-I은 물론, 오염성 단백질 및 지질을 함유한다.
실시예 2: ApoA -I의 침전을 포함하는 ApoA -I 및 AAT 의 정제
2.1 ApoA -I 및 AAT 의 분리:
2.1.1 ApoA -I 분획의 분획 IV 1 추출 및 침전
분획 IV1 물질을 현탁액 버퍼(100 mM Tris, pH 9.6) 내에 현탁하고 2-8℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 이용된 버퍼의 양은 혈장-함유 분획의 kg당 15 kg의 버퍼였다. 이어서 현탁액을 대략 0℃로 냉각하고 에탄올 및 아세트산 나트륨/아세트산 용액의 양을 Tris 버퍼 현탁액 첨가하여 5.4의 pH 및 12% (v/v)의 에탄올 농도를 갖는 현탁액을 생성하였다. 온도를 대략 -4℃로 냉각하면서 에탄올/산 용액을 30분의 기간 동안 첨가하였다. 이어서 pH/에탄올 조건을 2 시간 동안 유지하였다. 필터 보조제 C1000을 분획 IV1 침전물의 Kg 당 필터보조제 100 그램(100 grams filter aid/Kg of Fraction IV1 precipitate)으로 첨가하였다. 이어서 이 혼합물을 약 15분 동안 교반하였다. 필터 프레스를 이용한 여과에 의하여 용해성 AAT 물질(AAT 여과액)을 불용해성 ApoA-I 물질로부터 분리하였다(ApoA-I 침전물).
2.2 AAT 의 추가 정제
2.2.1 DTT 및 실리카를 이용한 정제
AAT 여과액의 온도를 대략 5℃로 조정하면서, 여과액의 pH를 1 M NaOH을 사용하여 9.4 정도로 조정하였다. pH 조정 후에, DTT를 30 mM의 농도로 첨가하였다. 이어서 9.4 정도의 pH를 유지하면서 DTT-처리 여과액을 대략 5℃에서 2시간 동안 혼합하였다. 이어서 혈장-함유 페이스트 분획 내에서 대략 16.7 g/L 혈장 등량의 농도로 퓸드 실리카(AerosilTM 380)를 용액에 첨가하였다. 이어서 현탁액을 5℃ 정도의 온도 및 대략 9.4의 pH에서 대략 1시간 동안 교반하였다. 필터 보조제 C1000을 퓸드 실리카의 kg 당 3 kg(3 kg's/kg of fumed silica)의 비율로 첨가하고, 그 혼합물을 대략 15분 동안 교반하였다. 필터 프레스를 이용하여 용해성 AAT 생성물을 침전된 퓸드 실리카 및 오염성 단백질로부터 분리하여, AAT 최종 여과액을 생산하였다. 원하는 레벨의 순도를 얻을 때까지 현탁액을 필터 프레스를 통하여 재순환시켰다.
2.2.2 이온 교환 크로마토그래피
AAT 최종 여과액을 IEC 평형 버퍼(50 mM Tris, pH 8.8)로 평형화된 TMAE Fractogel을 함유한 크로마토그래피 컬럼 상으로 직접 적용하였다. 컬럼을 AAT 최종 여과액과 함께 그의 단백질 용량의 대략 65%로 로드하였다. IEC 세정 버퍼(50　mM Tris, 대략 45 mM NaCl, 대략 7.4의 pH)를 이용한 세정에 의하여 오염물을 컬럼으로부터 제거하였고, 이어서 IEC 용출 버퍼(대략 50 mM Tris, 약 95 mM NaCl, 대략 7.4의 pH)를 이용하여 AAT를 용출하였다.
2.2.3 소수성 상호작용 크로마그래피( Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC )
황산 암모늄을 대략 1M의 최종 농도로 첨가함으로써 HIC를 위하여 IEC 컬럼으로부터의 용출액을 제조하였다. 이어서 이 용액을 여과하고, HIC 세정 버퍼(50 mM Tris, 1　M 황산 암모늄, 대략 7.4의 pH)로 평형화했던 소수성 상호작용 컬럼(GE Healthcare Phenyl Sepharose high sub) 에 적용하였다. 컬럼을 대략 40 그램 단백질/L 중력 고정 수지(40 grams protein/L gravity settled resin)으로 로드하였다. 로드 동안에, AAT는 소수성 컬럼 매트릭스에 결합하지 않고 컬럼을 통과하여 흘렀다. 로드의 완성시에, 충전 컬럼에 잔류한 결합되지 않은 AAT를 HIC 세정 버퍼를 이용하여 컬럼으로부터 세정하였다. 결합된 컬럼 유체 통과물 및 수반하는 세정물을 초-여과에 의하여 농축하고 인산염 버퍼(40 mM 인산 나트륨, 대략 7.4의 pH)로 투석여과하였다.
생성물은 SDS-Page와, ELISA 또는 네펠로법(nephelometry)과 같은 면역 분석법 둘 다에 의하여 결정된 ≥96% 순도의 AAT임이 밝혀졌고, 크기 배제 HPLC에 의하면 >93% 모노머(monomer)였다. Cohn 분획 IV 페이스트의 기능적으로 활성인 AAT 함량에 기반한 수복율은 40 내지 60% 이거나 정상 혈장 함량의 대략 20 내지 40%였다. 평균적으로, 정제된 AAT의 89%가 활성적이고, 반면에 79-99% 범위가 전형적으로 관찰되었다.
실시예 2에 따른 AAT의 정제(g 단백질/L 혈장 수율)
실험 pH/에탄올 침전 DTT/Aerosil 처리 여과액 IEC 용출액 HIC 유출액 HIC 농축액 HIC
농축액 순도
침전물 내의 APO 여과액 내의 AAT
T070216 0.678 0.064* 0.601 0.515 0.394 0.425 99.6%
T070226 0.757 0.589 0.575 0.405 0.368 0.274 99.7%
T070230 0.690 0.604 0.477 0.339 0.337 0.252 99.9%
* AAT 역가 검정 간섭(potency assay interference)이 이 단계에서 간혹 관찰되었다.
2.3 ApoA -I의 추가 정제
2.1에 기술된 바와 같이 얻어진 대략 50 g의 ApoA-I 침전물을 Tris-HCl의 7-배의 양, pH 8.0, 버퍼와 함께 현탁하고, 실온에서 대략 2시간 동안 교반하였다. 이어서 현탁액을 필터 보조체(CeliteTM 574)로 코팅된 셀룰로오스 필터를 통하여 여과하였다.
고형 황산 암모늄을 ApoA-I 함유 여과액에 0.8, 0.9, 1.0, 1.2 및 1.4 M의 최종 농도로 첨가하였다. 각 현탁액의 pH를 7.0과 7.5 사이로 조정하였다. 이어서, 침전물을 CeliteTM 574 필터 보조제로 코팅된 셀룰로오스 필터를 통한 여과에 의하여 최종적으로 분리하기 전에, 현탁액을 실온에서 적어도 2시간 동안 배양하였다.
이 방법을 이용하여 약학 등급 순도에 해당하는 89%에 이르는 순도를 갖는 ApoA-I 제조물을 얻었다.
실시예 3: 퓸드 실리카로의 ApoA -I의 흡착을 이용한 ApoA -I 및 AAT 의 정제
3.1 ApoA -I 및 AAT 의 분리: 퓸드 실리카로의 결합
분획 IV1 페이스트를 현탁액 버퍼(100 mM Tris, 20 mM NaCl, 대략 9.6의 pH)에 현탁하고 대략 5℃에서 대략 2시간 동안 교반하였다. 이용된 버퍼의 양은 대략 혈장-함유 분획(분획 IV1)의 kg 당 대략 12 kg이었다. AAT 수율을 최대화하기 위하여, Tris 버퍼 현탁액을 대략 1.5 시간 동안 대략 43℃로 가열하고, 이어서 대략 5℃로 냉각하였다.
이어서 Tris 버퍼 현탁액을 DTT 및 퓸드 실리카(AerosilTM 380)로 처리하였다. DTT를 약 30 mM의 농도로 Tris 버퍼 현탁액에 첨가하였다. 용액을 9.4 정도의 pH에서 대략 5℃에서 대략 2 시간 동안 교반하였다. 이어서 DTT-처리 추출물의 pH를 묽은 염산 용액을 이용하여 약 7.8로 조정하였다. 이어서 퓸드 실리카(AerosilTM 380)를 페이스트 분획을 함유하는 혈장 내에서 대략 16.7 그램/리터 혈장 등량(16.7 grams/Liter plasma equivalent)으로 첨가하였다. 현탁액을 pH 7.5 내지 8.0에서 대략 5℃로 대락 1 시간 동안 교반하였다. CelpureTM C1000 필터 보조제를, 중량당, 실리카 한 부분에 대하여 필터 보조제 3 부분의 비율로 첨가하고, 그 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 필터 프레스를 이용하여 용해성 AAT 분획을 침전된 퓸드 실리카/ApoA-I 및 오염성 단백질로부터 분리하여, AAT 최종 여과액을 생산하였다. AAT여과액은 더 처리하였고 반면에 퓸드 실리카 APO A-1 침전물은 추가 정제를 위하여 수거하였다.
3.2 AAT 의 추가 정제:
2.2.2 및 2.2.3에 기술된 바와 같은 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의하여 AAT를 더 정제하였다.
실시예 3에 따른 AAT의 정제
런(Run) DTT/Aerosil 단계 IEC 용출액 (g/L) HIC 유출액 (g/L) HIC 농축액
조건 케이크(cake) 내의 APO (g/L) 여과액 내의 APO (g/L) 여과액 내의 AAT (g/L) AAT 수율
(g/L)		 SDS-Page
T070228 pH 7.8에서 흡착;
가열된
추출물		 NT 0.06 0.472 0.568 0.579 0.461 100%
T070229 pH 7.8에서 흡착 ;
비가열된 추출물		 0.596 ND 0.395 0.541 0.468 0.358 99.6%
T070232 pH 8.0에서 흡착;
가열된
추출물		 NT 0.280 0.774 0.775 0.589 0.432 99.8%
T070233 pH 7.5에서 흡착;
비가열된 추출물		 NT ND 0.292 0.458 0.336 0.280 99.7%
T083017 PH 7.8에서 흡착;
비가열된 추출물		 0.540 0.060 0.254 0.410 0.313 0.246 99.5%
NT = 테스트하지 않음
생성물은 SDS-Page와, 면역 분석법 둘 다에 의하여 결정된 바에 따르면 ≥96% 순도의 AAT이고, 크기 배제 HPLC에 의하면 >93% 모노머(monomer)였다. Cohn 분획 IV 페이스트의 기능적으로 활성인 AAT 함량에 기반한 수복율은 40 내지 60% 이거나 정상 혈장 함량의 대략 20 내지 40%였다. 평균적으로, 정제된 AAT의 89%가 활성적이고, 반면에 79-99% 범위가 전형적으로 관찰되었다.
3.3 ApoA -I의 추가 정제
단계 3.1에서 AAT로부터 분리된 퓸드 실리카를 50-100 mM Tris 버퍼 내에서 pH 9.5에서 재현탁함으로써 ApoA-I을 퓸드 실리카로부터 방출하였다. 원심분리 또는 여과에 의한 퓸드 실리카로부터의 후속 분리 후에, ApoA-I을 2.3에 설명된 바와 같이 더 정제하였다.
실시예 4: 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 ApoA -I 및 AAT 의 정제
4.1 ApoA -I 및 AAT 의 분리
분획 IV1 페이스트를 현탁액 버퍼(100 mM Tris, 20 mM NaCl, 대략 9.6의 pH)에 현탁하고 대략 5℃에서 대략 2시간 동안 교반하였다. 이용된 버퍼의 양은 혈장-함유 분획(분획 IV1)의 kg 당 대략 12 kg이었다. Tris 버퍼 현탁액을 1.5 시간 정도의 기간 동안 대략 43℃로 가열하고, 이어서 대략 5℃로 냉각하였다.
이어서 Tris 버퍼 현탁액을 DTT 및 퓸드 실리카(AerosilTM 380)로 처리하였다. DTT를 약 30 mM의 농도로 Tris 버퍼 현탁액에 첨가하였다. 용액을 대략 9.4의 pH에서 대략 5℃에서 대략 2 시간 동안 교반하였다. 이어서 퓸드 실리카(AerosilTM 380)를 페이스트 분획을 함유하는 혈장 내에서 대략 16.7 그램/리터 혈장 등량(16.7 grams/Liter plasma equivalent)으로 첨가하였다. 대략 9.4의 pH를 유지하면서, 현탁액을 5℃ 정도에서 대략 1 시간 동안 교반하였다. CelpureTM C1000 필터 보조제를, 중량당, 퓸드 실리카 한 부분에 대하여 필터 보조제 3 부분의 비율로 첨가하고, 그 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 필터 프레스를 이용하여 용해성 AAT/ApoA-I 분획을 침전된 퓸드 실리카/오염성 단백질로부터 분리하여, AAT/ApoA-I 최종 여과액을 생성하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 단계의 동안, 물을 이용한 AAT 세정 단계 후에 ApoA-I을 용출하는 것을 제외하고는, AAT 및 ApoA-I을 2.3.2 및 2.3.3에 기술된 바와 같은 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의하여 더 정제하였다.
AAT 결합 컬럼 유체 통과물 및 수반하는 세정물을 초-여과에 의하여 농축하고 인산염 버퍼(40mM 인산 나트륨, 약 7.4의 pH)로 투석여과하였다. 생성물은 SDS-Page와 면역 분석법 둘 다에 의하여 결정된 바에 의하면 >96% 순도의 AAT이고, 크기 배제 HPLC에 의하면 >93% 모노머(monomer)였다. Cohn 분획 IV 페이스트의 기능적으로 활성인 AAT 함량에 기반한 수복율은 40 내지 60% 이거나 정상 혈장 함량의 대략 20 내지 40%였다. 평균적으로, 정제된 AAT의 89%가 활성적이고, 반면에 79-99% 범위가 전형적으로 관찰되었다
4.2 AAT 의 추가 정제
50 kg 분획 IV1을 출발 물질로서 사용할 때 각 단계에서의 평균 공정 수율
분획 IV-1 추출물
(g/L혈장)		 AAT/APO A-1 여과액
(g/L 혈장)		 IEC 용출액 (g/L 혈장) HIC 유출액
(g/L혈장)		 HIC WFI 세정물
(g/L혈장)		 HIC 농축액
(g/L혈장)
AAT 0.71 0.562 0.556 0.450 N/A 0.450
APO A-1 0.70 0.466 0.340 None Det. 0.387 None. Det
실시예 5: 음성형 이온-교환 크로마토그래피 및 다음의 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 ApoA -I 및 AAT 의 정제
5.1 DTT 및 실리카를 이용한 정제
분획 IV-1의 추출 및 DTT 및 실리카를 이용한 정제를 실시예 4.1에 설명된 바와 같이 실시하였다.
5.2. 이온 교환 크로마토그래피
AAT/ ApoA-I 최종 여과액을 묽은 염산 용액의 첨가에 의하여 약 7.4 범위의 pH로 조정하였다. AAT/ ApoA-I 여과액의 전도도를 2 M NaCl 용액의 첨가에 의하여 22.0℃에서 대략 15 mS/cm로 조정하였다. pH/전도도가 조정된 AAT/ ApoA-I 최종 여과액을 평형 버퍼(50　mM Tris, pH 7.4, 15 mS/cm 전도도)로 평형화된 음이온 교환 수지 EMD TMAE Fractogel 650 (m)를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 직접적으로 적용하였다. 로드 동안에 AAT 및 ApoA-I이 흐르면서 오염성 단백질이 컬럼에 결합되었다. AAT/ ApoA-I 함유 이온 교환 컬럼 유체 통과물 분획을 지시한 바와 같이 더 처리하였다.
5.3. ApoA -I 및 AAT 의 분리: 소수성 상호작용 크로마토그래피
황산 암모늄을 1M의 최종 농도로 첨가함으로써 AAT/ ApoA-I IEC 유체 통과물을 HIC를 위하여 제조하였다. 이어서 이 용액을 여과하고, HIC 세정 버퍼(50　mM Tris, pH 7.4, 1M 황산 암모늄) 내에서 평형화시켰던 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼(GE Healthcare Phenyl Sepharose high sub)에 적용하였다. 로드 동안의 초기 용출은 AAT-함유 유출액을 제공하였고, 추가의 세정 버퍼(50　mM Tris, pH 7.4, 1 M 황산 암모늄)를 이용한 용출은 컬럼 내에 잔존하는 임의의 AAT를 제거하였다. 결합된 유출액 및 세정물을 초여과에 의하여 농축하고 인산염 버퍼로 투석여과하였다. 일단 AAT 분획을 제거하면, 추가의 불순물을 0.1 내지 0.2 M 황산 암모늄 용액으로 컬럼에서 세정하고, 이어서 ApoA-I을 물을 이용하여 컬럼에서 용출시켰다.
실시예 5에 따른 6개 런(runs)의 평균 수율
분획 IV-1 추출물 분획 IV-1 여과액 IEC 유체 통과물 HIC 유출액 HIC WFI
세정물		 HIC
농축액
AAT 수율 (g/L 혈장) 0.715 0.691 0.505 0.116* N/A 0.415
APO A-1 수율
(g/L혈장)		 0.758 0.715 0.636 0 0.572 0
* HIC 유출액에서의 AAT 역가 간섭.
N/A = AAT가 분획 내에 존재하나 "주입를 위한 물(water for injection, WFI)"을 이용한 세정물은 폐(waste) 분획이며 AAT는 그것으로부터 회복되지 못하여 적용할 수 없음.
생성물을 SDS-Page와 면역 분석법 둘 다에 의하여 결정된 바와 같이 >96% 순도의 AAT이고, 크기 배제 HPLC에 의하면 >93% 모노머(monomer)였다. Cohn 분획 IV 페이스트의 기능적으로 활성인 AAT 함량에 기반한 수복율은 40 내지 60% 이거나 정상 혈장 함량의 대략 20 내지 40%였다. 평균적으로, 정제된 AAT의 89%가 활성적이고, 반면에 6런(run)에서 79-99% 범위가 전형적으로 관찰되었다
이 명세서를 통하여, 단어 "포함한다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은, 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의 그룹, 정수들 또는 단계들을 포함하나, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들의 그룹, 정수들 또는 단계들을 배제하는 것은 아님을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 영감 또는 영역에 벗어남이 없이 다양한 변경 또는 추가를 이전에 설명된 분분에 만들어질 수 있음을 알아야 한다.

Claims (25)

  1. 아포지단백질 A-I(ApoA-I) 및 알파-1-안티트립신(AAT) 모두를 함유하는 단일 출발 인간 혈장 분획으로부터의 A-I(ApoA-I) 및 AAT의 정제 방법으로,
    i) ApoA-I 및 AAT를 포함하는 출발 인간 혈장 분획을 처리하여 AAT 함유 분획으로부터 ApoA-I 함유 분획을 분리하는 단계;
    ii) 상기 ApoA-I 함유 분획으로부터 약학 등급 순도로 ApoA-I을 정제하는 단계; 및
    iii) 상기 AAT 함유 분획으로부터 약학 등급 순도로 AAT를 정제하는 단계;
    를 포함하는 방법으로서, 여기서 상기 방법은,
    a) ApoA-I 및 AAT 모두가 용해될 수 있도록 출발 물질로서 이용되는 상기 출발 인간 혈장 분획을 처리하는 단계;
    b) 에탄올을 첨가하여 상기 에탄올의 농도가 8 내지 14%(v/v)되게 하고, ApoA-I는 침전되고 AAT는 용액에 잔류하도록 pH를 5 내지 6으로 조절하고, 온도를 10℃ 이하로 조절하여, 상기 용액으로부터 ApoA-I을 침전시키는 단계;
    c) AAT를 함유하는 상기 용액으로부터 침전된 ApoA-I을 분리하는 단계; 및
    d) 하나 이상의 공정 단계를 통해 ApoA-I 및 AAT를 약학 등급 순도로 개별적으로 정제하는 단계;
    를 포함하는 것인 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 대규모 정제에 이용되는 것인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 출발 인간 혈장 분획은 Cohn 분획 IV, 키슬러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 상청액 A 및 A+I로부터의 침전물, 및 황산 암모늄 침전물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 Cohn 분획 IV는 Cohn 분획 IV1인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 AAT 및 ApoA-I을 13.69 이상의 pH에 노출시키지 않는 것인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 AAT 및 ApoA-I을 13 이상의 pH에 노출시키지 않는 것인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 AAT 및 ApoA-I을 12 이상의 pH에 노출시키지 않는 것인 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 AAT 및 ApoA-I을 11 이상의 pH에 노출시키지 않는 것인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 출발 인간 혈장 분획은 단계 a)에서 8.0 내지 10.0의 pH에서 50-150 mM Tris 및 0-20 mM NaCl을 포함하는 버퍼 내에 용해시키는 것인 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 바이러스 감소 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 바이러스 감소 단계는 60℃에서의 저온살균을 포함하는 것인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 저온살균 단계를 적어도 40% w/w 자당 및 적어도 4% w/w 아세트산칼륨을 포함하는 용액에서 실시하는 것인 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 바이러스 감소 단계는 바이러스 입자들을 제거할 수 있는 필터를 통한 여과를 포함하는 것인 방법.
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