CN107022025A - 一种纯化α1‑抗胰蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从血液组分IV中纯化出α₁‑抗胰蛋白酶的方法。包括离子交换凝胶层析、超滤浓缩和分子筛层析等步骤。本方法在层析过程中，不对目的蛋白进行洗脱，避免高盐缓冲液的使用，简化工艺步骤，减少α₁‑抗胰蛋白酶的变性风险，实现对血液组分IV的废物利用，具有相当的应用前景。

Description

一种纯化α1-抗胰蛋白酶的方法

技术领域

本发明属于蛋白质纯化领域，具体涉及一种纯化α₁-抗胰蛋白酶的方法。

技术背景

血液制品(Blood products)，是指由健康人血浆或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成份。目前，按照血液制品不同作用，可将其分为人血白蛋白、免疫球蛋白类、凝血因子类、特殊蛋白及微量蛋白和纤维蛋白粘合剂五大类。在过去几十年里，因治疗和预防用血液制品的大量研制与应用，使原本无法治愈和控制的疾病获得了有效遏制，因此，世界各国对其品种和工艺进行了深入的研发，主要采用的是低温乙醇技术提纯血液制品，如Cohn和N-K法。

低温乙醇法是以混合血浆为原料，逐级降低酸度(pH7.0降到pH4.0),提高乙醇浓度(从0升到40％)，同时降低温度(从2℃降到-2℃)，各种蛋白在不同条件下以组分(粗制品)的形式分步从溶液中析出，并通过离心或过滤分离出来。根据粗制品沉淀的先后次序分别称为“冷沉淀”、“组分1”、“组分2”、“组分3”、“组分4”和“组分5”。蛋白分子量越大(如凝血因子)越先析出，分子量越小(如白蛋白)越后析出(见表4-10)。除酸度、乙醇浓度和温度外，低温乙醇法的控制参数还有蛋白浓度、溶液离子强度和反应时间。从1940年发明低温乙醇法到1950年的10多年间，Cohn及其同事一共研究了10种变法，各种方法的差异在于参数的变化和不同组合，比较常用的是Cohn6法。在此基础上，以后很多学者为了简化分离步骤、提高蛋白得率、降低生产成本，提出了许多改良方法。其中得到应用的有Nitschman和Kistler提出的N-K法和压滤法。N-K法的优点是简化了操作，缩短了生产周期，提高了白蛋白和免疫球蛋白的回收率，生产中乙醇的消耗量降低了约40％，最大溶液体积减少了约20％～25％。压滤法是在低温乙醇分离蛋白组分的过程中，用加压过滤技术代替低温离心技术来进行固液分离的一种方法，与传统的离心法相比，该法操作更为方便、蛋白回收率高、生产周期短。

表1低温乙醇法各组分所含主要的血浆蛋白成分

α₁-抗胰蛋白酶(α₁-Antitrypsin,α₁-AT)又称α₁-蛋白酶抑制剂，是人血浆中含量最为丰富的一种蛋白酶抑制剂，它可有效抑制弹性蛋白酶、组织蛋白酶以及蛋白酶III等，从而保护正常细胞不受蛋白酶溶解而损伤。而自首例α₁-AT缺乏症患者起，国外相继报道出α₁-AT与肺气肿、脑中风以及机体免疫抑制的相关研究。但是，目前我国对于α₁-AT研究报道相对较少，其中原因之一是进口产品价格昂贵，而我国内企业又无上市的α₁-AT生物制品，使得大规模临床研究较难顺利开展。

α₁-AT缺乏症属于遗传性疾病，α₁-AT缺乏常可导致患者肺部组织对嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抵抗减弱，从而引发肺气肿；若给予一定剂量α₁-AT，患者症状又可显著缓解。但是α₁-AT属于血液中微量蛋白，如何获得大量α₁-AT则成了治疗α₁-AT缺乏症的关键因素。

Reh等(Reh G,Nerli B,Picó G.Isolation of alpha-1-antitrypsin fromhuman plasma by partitioning in aqueous biphasic systems ofpolyethyleneglycol–phosphate[J].Journal of Chromatography B,2002,780(2):389-396.)则发现，采用双水相系统可从人血浆中直接分离α₁-AT，且该法可使α₁-AT比活提高10倍，活性回收43％。此外，Kumpalume(Kumpalume P,Podmore A,LePage C,et al.NewProcess for the Manufacture of α-1 Antitrypsin[J].Journal of ChromatographyA,2007,1148(1):31-37)采用Capto Q柱及Chelating sepharose层析柱从Kistler和Nitschmann法组分A1上清中分离出纯度＞90％α₁-AT。但是，前者并非提高了血清利用率，而后者以Kistler和Nitschmann法组分A1为原料与我国低温乙醇法并不相符合。可见，完全照搬国外的分离技术在我国并非可行。此外，我国学者张学俊(张学俊,叶生亮,曹海军,等.亲和凝胶分离纯化人α1-抗胰蛋白酶的研究[J].中国输血杂志,2012,25(06):560-564.)等人以低温乙醇组分FIV为原料，采用气相二氧化硅去除脂蛋白、免疫亲和层析吸附α₁-AT成功回收40％产品活性。但是，亲和层析需制备相应抗体并将与介质进行结合，虽然蛋白纯度及活性均能获得较好保障，但前期制备流程复杂且成本相对较高，在实际大规模应用将受到一定限制。Yavelow发现，将α₁-AT加入到乳腺癌细胞中可抑制细胞增殖作用，并能降低IL-6表达水平及活性，阻碍TGFα的释放及抑制生长因子活性，从而抑制癌细胞生长。此外，Mercapide^[曾将含α₁-AT序列载体转染入神经胶质瘤细胞中，并在成功表达α₁-AT后，细胞生长速度及侵袭能力均明显减弱，并有凋亡现象发生。

中国专利200710044380.9(抗胰蛋白酶的纯化方法)中公开了使用离子交换柱层析纯化α₁-AT的方法，应用DEAE-Sepharose或DEAE-Separose FF离子交换介质，采用Tris-HCl分步洗脱，解析吸附到柱上的目的蛋白；中国专利101778860A(α-1-抗胰蛋白酶和载脂蛋白A-I的纯化方法)0063中描述的也是通过将α1-AT吸附在IEC介质中，通过洗脱解析得到目的蛋白。由此可见，目前的离子层析技术总是有洗脱分离目的蛋白的步骤，后续也不可避免地需要进行脱盐处理。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化α₁-抗胰蛋白酶的方法，利用工业废物血浆IV组分作原料，该方法在层析分离过程中不需要对目的蛋白进行洗脱分离，避免目的蛋白因洗脱分离和后续脱盐而变性。

出于不对目的蛋白进行洗脱分离的指导思想，本发明通过大量实验比较在不同层析缓冲液的pH值和离子浓度条件下，目的蛋白与DEAE-Sepharose-FF的吸附能力后。发现在特定的pH值和离子浓度下，目的蛋白与DEAE-Sepharose-FF不吸附，且此时杂蛋白表面带的负电荷较多，加上空间位阻效应，杂蛋白能有效吸附到介质上，从而使目的蛋白作为流穿峰(流传液)收集，不需要离子液洗脱。

提高了收获率，降低了目的蛋白解吸时对于蛋白结构等的再次影响。

本发明方法包括：首先是血浆组分IV的预处理；然后对血浆组分IV进行第一次离子交换凝胶层析，获得流穿液I；对流穿液I进行第二次离子交换凝胶层析，获得流穿液II；对流穿液II进行超滤浓缩，得到浓缩液；对浓缩液进行分子筛层析，即得到最终的α₁-抗胰蛋白酶。

其中优选的血浆组分IV预处理方法是，取血浆组分Ⅳ，加入缓冲液溶解、离心、弃沉淀、取上清液I；向上清液I加入盐析常用的盐，静置过夜，离心，弃沉淀，取上清液II；对上清液II进行透析除盐，收集透析液。

其中优选的离子交换凝胶层析方法是，使用DEAE-Sepharose-FF进行一次层析，先以pH6.5 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，再将血浆组分IV的pH调至6.5，将其以60cm/h线速度流经层析柱，收取流穿液I；使用DEAE-Sepharose-FF进行第二次层析，以pH7.1 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，调整流穿液I的pH为7.1，将其以60cm/h线速度流经层析柱，收取流穿液II。

其中优选的超滤浓缩方法是，使用30KD分子截留管离心，使用pH8.20.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，将流穿液II浓缩15倍。

其中优选的分子筛层析方法是，用Sephacryl S-200进行柱层析，用超滤浓缩得到的浓缩液进行上样，上样体积为柱体积10％，以10cm/h线速度流经层析柱，得到纯化的α₁-抗胰蛋白酶。

此外，本发明通过底物显色反应确认α₁-抗胰蛋白酶生物学活性，随后将该纯化的α1-抗胰蛋白酶作用于肺癌A549细胞，并用传统工艺纯化的蛋白做对照，观察α1-抗胰蛋白酶对该细胞的抗增殖及成瘤性影响。通过抗细胞增殖及软克隆形成实验可知，α1-抗胰蛋白酶浓度＞1mg/ml时，A549细胞增殖速度则明显变缓，且细胞更不容易形成克隆体，即可明显抑制细胞增殖(F＝5.464，P＜0.05)以及细胞克隆群的形成。

本发明以血液制品传统工艺中的组分IV为原料，通过硫酸铵沉淀、两步DEAE层析及S200分子筛步骤，最终获得纯度大于90％(93％)浓度大于3mg/ml(3.2mg/ml)的α₁-AT蛋白，产品活性回收率为37.8％，虽然产品在活性回收上略低于以往发表的研究，但基本达已到了对废弃物FIV组分回收再利用目的。与现有技术相比，本发明最大区别在于进行DEAE吸附时，目的蛋白并不与DEAE介质产生吸附作用，而主要是存在于流穿液中，层析分离过程中不需要洗脱，简化工艺步骤，提高收获率和更重要的是避免离子洗脱液带来再次脱盐对于蛋白结构或者表面的影响。

有益效果：简化离子交换层析工艺步骤，不对目的蛋白进行洗脱分离，也避免后续脱盐操作，最终获得纯度95％，浓度为3.2mg/ml的α₁-AT蛋白，产品活性回收率为37.8％，所得α₁-AT可对细胞增殖及成瘤进行干扰，基本已达到了对废弃物FIV(血浆组分IV)回收再利用目的。

附图说明

图1：实验组3各步骤所获溶液的蛋白电泳图谱；

1.分子量标准、2.透析液、3.流穿液I、4.第一次洗脱液、5.第二次流穿液、6.第二次洗脱液、7.最终蛋白液

图2：实验组14各步骤所获溶液的蛋白电泳图谱；

1.分子量标准、2.透析液、3.流穿液I、4.第一次洗脱液、5.第二次流穿液、6.第二次洗脱液、7.最终蛋白液

图3：实验组7各步骤所获溶液的蛋白电泳图谱；

1.分子量标准、2.透析液、3.流穿液I、4.第一次洗脱液、5.第二次流穿液、6.第二次洗脱液、7.最终蛋白液

图4：中试工艺中各步骤所获溶液的SDS-PAGE图；

图5.软琼脂克隆形成实验；

A：0mg/ml、B：0.125mg/ml、C：0.25mg/ml、D：0.5mg/ml、E：1mg/ml、F 2mg/ml

具体实施方式

材料：

血浆组分IV(FIV)由深圳卫光生物制品股份有限公司提供；

DEAE-Sepharose-FF、Sephadex G25、Sephacryl S-200购自GE公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐购自上海硕拓生物科技有限公司；胰蛋白酶、人血清白蛋白、α₁-AT标准品购自sigma公司；RPMI-1640、胎牛血清购自gibco公司，A549细胞来自深圳市大规模细胞培养技术与细胞资源库公共技术服务平台；

低熔点琼脂糖及其余试剂均购自广州鼎国。

实施例1【FIV的预处理】

1.1样品前处理：取一定量-80℃保存的FIV，按重量比1∶10(血浆：缓冲液)加入pH8.2 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，冰浴搅拌至无明显固体，离心(4℃，6000g×30min)，弃去沉淀；上清液Ⅰ可放置于4℃备用。

1.2硫酸铵沉淀：取1.1的上清液Ⅰ缓慢加入硫酸铵固体粉末，并不断搅拌，直至使硫酸铵终浓度达20％后，4℃静置过夜，离心(4℃，6000rpm 30min)，弃沉淀，上清液Ⅱ置于4℃备用。

1.3透析：取1.2的上清液Ⅱ放置于透析袋中，每隔6小时依次放入10％硫酸铵溶液、5％硫酸铵溶液、pH8.2 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，透析液置于4℃备用。

实施例2【离子交换层析的条件确定】

设计实验组1-19，每一个实验组都顺序进行离子交换层析，超滤浓缩和分子筛层析步骤，所述离子交换层析使用DEAE-Sepharose-FF填料和Tris-HCl缓冲液，所述超滤浓缩使用30KD分子截留管，所述分子筛层析使用Sephacryl S-200填料。其中实验组12-19用于筛选用于离子交换层析的Tris-HCl缓冲液浓度，实验组1-11用于筛选用于离子交换层析的Tris-HCl缓冲液的pH。

2.1 Tris-HCl缓冲液浓度筛选

用不同浓度的Tris-HCl缓冲液进行离子交换层析，并测定各工艺步骤中目的蛋白的纯度和活力等，以确定目的蛋白分布位置和最佳平衡液的浓度，层析图谱结果见表2，其中所述第一流穿峰为第一次层析的流穿液I，所述洗脱峰为对杂质进行洗脱得到的洗脱液，所述“部分”意味着目的蛋白在此不完全地分布。

表2.缓冲液浓度筛选

由此可知当Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L(第14组)时，目的蛋白主要分布于层析的流穿液I(第一流穿峰)，根据对最终得到的蛋白液检测，其纯度和活性也是最高的。

2.2 Tris-HCl缓冲液的pH筛选

在采用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液的基础上，调节其pH进行离子交换层析，以确定目的蛋白分布位置和最佳平衡液的pH，结果见表3，其中所述第一流穿峰为第一次层析的流穿液I，所述洗脱峰为对杂质进行洗脱得到的洗脱液，所述“部分”意味着目的蛋白在此不完全地分布。

表3.缓冲液pH筛选

结果发现pH为6.5时，目的蛋白主要分布于层析的流穿液I(第一流穿峰)。

以Tris-HCl缓冲液的pH为6.5浓度为0.05mol/L的实验组(第3组)的蛋白收率和蛋白纯度以及蛋白活性最好，所以选择这个条件进行下面的纯化。

实施例3【离子交换柱层析中试工艺】

第一次层析：先以pH6.5 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-Sepharose-FF柱，将实施例1.3的透析液pH调至6.5，以60cm/h线速度过柱，收取流穿液I；流穿液I的成分分析见图4；

第二次层析：调节流穿液I的pH至7.1，再次以相同线速度，流经以pH 7.10.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose-FF柱，收取流穿液II。

流穿液II的成分分析见图4。

实施例4【超滤浓缩和层析中试工艺】

3.1超滤浓缩：使用pH8.2 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，将流穿液II经30KD分子截留管离心(30min，4000rpm，4℃)浓缩15倍，得到浓缩液。

3.2分子筛层析：上样体积为柱体积10％，将3.1的浓缩液按10cm/h流经SephacrylS-200柱(柱高*内径40cm*1.2cm)，依据出峰情况收集最终蛋白液，对其进行蛋白纯度(SDS-PAGE)检测。

实施例5【本发明方法各步骤中a1-抗胰蛋白酶活性测定】

检测方法：参照文献(Rennert O M.Measurement of AIpha1-AntitrypsininSerum,by Immunodiffusionand by EnzymaticAssay[J].Clinical Chemistry,1974,20(3):396-399.)，其步骤如下，每个样品准备3根试管，两根平行管，一根空白管，每管均添加5ml BNPNA(1mg/ml)，37℃孵育10min，随后往平行管中加入待测样品2ml+胰蛋白酶2ml的混合液，空白管不添加，37℃孵育10min，每管均加入1ml醋酸终止反应，同时向空白管中添加样品2ml+胰蛋白酶2ml混合液。在400nm处检测样品吸光度值，以初始溶解血浆组分IV吸光度值作为100％活性。

分别检测实施例1中的上清液Ⅰ、上清液Ⅱ、透析液，实施例2中的流穿液Ⅰ、流穿液Ⅱ，实施例3的浓缩液、最终蛋白液，检测结果见表4。

结果表明，最终蛋白液的α₁-AT蛋白纯度90.22％，浓度为0.95mg/ml。

表4：中试工艺纯化各步α1-AT蛋白纯度、活性及收率等结果

实施例6【本发明α₁-抗胰蛋白的效果验证】

6.1不同纯化工艺制备的α₁-AT比活比较：在所含α₁-AT浓度相同的情况下，本发明工艺纯化制备的α₁-AT的活力是原料(FIV)中α₁-AT的1.4倍

6.2抗增殖试验：A549细胞传代2-3次后，经胰酶消化，调整细胞浓度至1*10⁶/ml，以100μl/孔接种于2块96孔板中，且96孔板外围添加100μl PBS。将96孔板放置在37℃，5％CO₂培养箱中培养4h至细胞完全贴壁后，取α1-AT用完全培养基稀释、过滤除菌，按100μl/孔添加到96孔板细胞中，并使样品终浓度为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml，每孔设置5个复孔。同时设置调零孔(仅添加200μl完全培养基)及空白孔(100μl细胞悬液+100μl细胞培养基)，放入37℃，5％CO₂培养箱培养分别于24h或48h后，取出1块96孔板，每孔添加10μlMTT(5mg/ml)后，继续放入37℃，5％CO₂培养箱培养4h，每孔添加100μlDMSO，避光振荡10min后，在490nm处检测吸光度值。细胞增殖速度随着α₁-AT添加浓度的增加明显减慢，且经S-N-K检验可知，不同α₁-AT浓度下，细胞的吸光度值不全相同(F＝5.464，P＜0.05)，如表5所示，本发明工艺所获α₁-AT抗增殖效果与同类产品相当。

表5 不同工艺纯化的α₁-AT抗细胞增殖结果

6.3软琼脂克隆形成试验：配置2X RPMI-1640完全培养基(含2X FBS)，用其稀释α₁-AT样品，并与等体积1.2％低熔点琼脂混合，使得样品终浓度为2mg/ml(F)、1mg/ml(E)、0.5mg/ml(D)、0.25mg/ml(C)、0.125mg/ml(B)、0mg/ml(A)，加入6孔板中，每孔2ml，常温过夜放置促其凝固。隔日，将经传代2-3次的A549细胞胰酶消化、离心，添加2X完全培养基使细胞浓度为1*10⁴cell/ml；另用2X RPMI-1640完全培养基稀释α₁-AT样品，并与等体积0.7％低熔点琼脂糖混合，使α₁-AT样品浓度与前一天点孔样品浓度保持一致，再分别加入100μl细胞悬液混匀，分别添加至α₁-AT浓度相对应的凝固的琼脂完全培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱10-14天后，每孔加入1ml(0.1％)结晶紫，室温染色10min，拍照计数。结果显示，α₁-抗胰蛋白酶(0mg/ml)组细胞增殖快，且未见单独细胞；而随着α₁-抗胰蛋白酶浓度增加，视野下可见单独细胞数逐渐增多，其中以α₁-抗胰蛋白酶(2mg/ml)组视野最为明显，见图5。

Claims (8)

1.一种纯化α₁-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于，以血浆组分IV为原料，包括下述步骤：

(1)对血浆组分IV进行离子交换凝胶层析，收集流穿液I；再次对流穿液I进行离子交换凝胶层析，收集流穿液II；

(2)对步骤(1)得到的流穿液II进行超滤浓缩，得到浓缩液；

(3)对步骤(2)得到的浓缩液进行分子筛层析，得到纯化的α₁-抗胰蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：用缓冲液平衡层析柱，调节血浆组分IV的pH，让其流经层析柱，收集流穿液I；用缓冲液平衡层析柱，调节流穿液I的pH，让其流经层析柱，收集流穿液II。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：使用DEAE-Sepharose-FF作为层析介质进行第一次层析，先以pH6.5 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，再将血浆组分IV的pH调至6.5，将其以60cm/h线速度流经层析柱，收取流穿液I；

再以DEAE-Sepharose-FF作为层析介质进行第二次层析，以pH7.1 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，调整流穿液I的pH为7.1，将其以60cm/h线速度流经层析柱，收取流穿液II。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)之前包括将所述血浆组分IV进行预处理的步骤，所述预处理的步骤包括：

取血浆组分Ⅳ，加入缓冲液溶解、离心、弃沉淀、取上清液I；

对上清液I进行盐析，静置过夜，离心，弃沉淀，取上清液II；

对上清液II进行透析除盐，收集透析液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：使用30KD分子截留管离心，使用pH8.2 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，将步骤(1)得到的流穿液II浓缩15倍。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：用Sephacryl S-200进行柱层析，用经步骤(2)得到的浓缩液进行上样，上样体积为柱体积10％，以10cm/h线速度流经层析柱，得到纯化的α₁-抗胰蛋白酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)取血浆组分Ⅳ，以血浆和缓冲液的重量比1∶10，加入pH8.2 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，4℃、6000g×30min离心，弃去沉淀，得上清液I；

向上清液I加入硫酸铵，至硫酸铵终浓度达20％后，4℃静置过夜，然后4℃、6000rpm离心30min，得上清液II；

将上清液II放置于透析袋中，每隔6小时依次加入10％硫酸铵溶液、5％硫酸铵溶液、pH8.2 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中，对上清液II进行透析除盐，收集透析液；

2)使用DEAE-Sepharose-FF进行第一次层析，先以pH6.5 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，再将步骤1)收集的透析液pH调至6.5，将其以60cm/h线速度流经层析柱，收取流穿液I；

再使用DEAE-Sepharose-FF进行第二次层析，以pH7.1 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，调整流穿液I的pH为7.1，将其以60cm/h线速度流经层析柱，收取流穿液II；

3)使用30KD分子截留管离心，使用pH8.2 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液，将步骤2)收取的流穿液II浓缩15倍，得到浓缩液；

4)用Sephacryl S-200进行柱层析，用经步骤3)得到的浓缩液进行上样，上样体积为柱体积10％，以10cm/h线速度流经层析柱，得到纯化的α₁-抗胰蛋白酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于获得的α₁-抗胰蛋白酶纯度大于90％，浓度大于3.0mg/ml。