CN108114508A - 无菌层析树脂及其在制造工艺中的用途 - Google Patents

无菌层析树脂及其在制造工艺中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及无菌层析树脂及其在制造工艺中的用途。具体提供降低层析树脂的生物负荷(例如，灭菌)的方法，所述方法包括将包括含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ‑照射剂量，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在暴露于所述γ‑照射剂量之后/之时的结合能力损失的量存在。还提供包括生物负荷降低的层析树脂的生物负荷降低的层析柱，包括层析树脂和至少一种螯合剂和/或抗氧化剂的组合物，使用这些生物负荷降低的层析柱之一进行生物负荷降低的柱层析的方法，和用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制备的一体化、封闭且连续的工艺。

Description

无菌层析树脂及其在制造工艺中的用途
分案申请信息
本申请是申请日为2015年01月16日、中国申请号为201580012461.3、发明名称为“无菌层析树脂及其在制造工艺中的用途”的发明申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2014年1月17日提交的美国临时专利申请号61/928,929和2014年5月21日提交的美国临时专利申请号62/001,498的优先权，将它们每一篇通过提述以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及生物技术的方法和重组蛋白的生物制造。
背景技术
包括编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞常用于产生治疗上或商业上重要的蛋白质。在多样化产品线的当前环境中，生物技术公司越来越多地受到驱使去开发用于治疗性蛋白药物物质高度灵活且有成本效益的制造的创新性解决方案。用于有效分离重组蛋白的策略之一是通过包括连续层析的工艺(例如，使用封闭系统)。连续层析的一种已知的局限是系统中污染剂的存在(例如，增加的生物负荷)，其导致污染的产品、生产产率的降低和系统中流速的降低(或压力的增加)。例如，系统内增加的生物负荷能够导致系统的完全停摆。
发明内容
本发明至少部分基于如下发现，即对层析树脂进行γ-照射降低了所述层析树脂的结合能力。鉴于这一发现，本文提供降低层析树脂的生物负荷的方法，其包括将包括含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在暴露于所述γ-照射剂量之后/之时的结合能力损失的量存在。还提供降低层析树脂的生物负荷的方法，其包括将包括含有层析树脂(和任选的足以改善所述层析树脂在暴露于γ-照射之后/之时的结合能力损失的量的至少一种抗氧化剂和/或螯合剂)的组合物的容器暴露于约0.1kGy/小时至约6kGy/小时的剂量率(rate)和/或在约4℃至约25℃的温度的γ-照射，进行足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量。还提供通过本文所述的任何方法制备的含有生物负荷降低的层析树脂的生物负荷降低的层析柱，包括层析树脂和至少一种螯合剂和/或抗氧化剂的组合物，使用这些生物负荷降低的层析柱中的至少一种进行生物负荷降低的柱层析的方法，以及包括使用这些生物负荷降低的层析柱中的至少一种的、用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭或基本上封闭且连续的工艺。通过本文所述的任何方法产生的任何层析树脂、通过本文所述的任何方法产生的任何装填的层析柱、进行柱层析的任何方法和本文所述的任何工艺可以是无菌的(sterile)、绝对无菌的、无致病菌的(aseptic)或生物负荷降低的。通过本文所述的任何方法产生的任何层析树脂、通过本文所述的任何方法产生的任何层析柱和本文所述的任何工艺可以是无致病菌的且无菌的、绝对无菌的、无致病菌的或生物负荷降低的。
本文提供降低层析树脂的生物负荷的方法，其包括：将包括含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在暴露于所述γ-照射剂量之后的结合能力损失的量存在。这些方法的一些实施方案进一步包括，在暴露之前，将所述组合物置于所述容器中。在一些实例中，所述照射以约0.1kGy/小时至约6kGy/小时的剂量率和/或在约4℃至约25℃的温度进行。在任何这些方法的一些实例中，所述容器是储存容器、层析柱或装填的层析柱。在本文所述的任何方法的一些实例中，所述组合物是沉降的层析树脂在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中的浆料。在一些实例中，所述液体包含：(i)75mM至约125mM(例如，80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甘露醇；(ii)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)；(iii)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)抗坏血酸钠；(iv)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)组氨酸；(v)30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)和约30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)组氨酸；(vi)约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)、约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)组氨酸和约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)抗坏血酸钠；或(vii)约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)抗坏血酸钠、约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)甲硫氨酸(或者半胱氨酸或谷胱甘肽)、约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)甘露醇和约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)组氨酸。在一些实例中，所述液体是缓冲的溶液(例如，磷酸盐缓冲的溶液，例如，磷酸钠缓冲的溶液，如50mM磷酸钠，pH6.0)。
在本文所述的任何方法的一些实例中，所述组合物是固体混合物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述组合物包含选自下组的至少一种抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑素、番茄红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸盐、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、羟基苯丙酸甲酯类(a phenolpropanoidacid)、利度卡因(lidocaine)、柚苷配基(naringenin)、富勒烯(fullerene)、葡萄糖、甘露醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和二甲基甲氧基苯丙二氢吡喃醇。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述组合物包含至少一种(一种、两种、三种或四种)选自甘露醇、抗坏血酸钠、甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)和组氨酸的抗氧化剂。在一些实施方案中，所述组合物包含甘露醇、抗坏血酸钠、甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)和组氨酸。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述组合物包含选自下组的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基琥珀酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺(desferroxamine)。
在本文所述的任何方法的一些实例中，所述组合物包含选自下组的至少一种层析树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和或伪亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂(或其任何组合)。在本文所述的任何方法的一些实例中，所述层析树脂可以是多模态(multi-modal)(例如，双模态)层析树脂(例如，具有阴离子交换和疏水相互作用基团的层析树脂，或具有阳离子交换和疏水相互作用基团二者的层析树脂)。在本文所述的任何方法的一些实例中，所述组合物包含亲和层析树脂，所述亲和层析树脂包括蛋白质配体(例如，蛋白A或蛋白G)。在本文所述的任何方法的一些实例中，所述组合物包含阴离子交换层析树脂(例如，包括N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。
在本文所述的任何方法的一些实例中，所述剂量为约2kGy至约45kGy(例如，约20kGy至约30kGy、约23kGy至约27kGy、约2kGy至约40kGy、约2kGy至约35kGy、约2kGy至约30kGy、约2kGy至约25kGy、约10kGy至约45kGy、约10kGy至约40kGy、约10kGy至约35kGy、约10kGy至约30kGy或约10kGy至约25kGy)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述暴露在约-25℃至约0℃(含端点)或约0℃至约25℃(含端点)(例如，约4℃至约25℃)的温度下进行。
还提供通过任何本文所述的方法产生的生物负荷降低的层析树脂。在任何本文提供的生物负荷降低的层析树脂的一些实例中，所述生物负荷降低的层析树脂具有约1x 10-8至约1x 10-5(例如，约1x 10-7至约1x 10-6)的无菌性保证水平(SAL)。例如，通过任何本文所述的方法产生的层析树脂可以具有降低的生物负荷，是无菌的，是无致病菌的或是绝对无菌的。在一些实施方案中，通过任何本文所述的方法产生的层析树脂可以是无致病菌的并且具有降低的生物负荷，是无菌的，或是绝对无菌的。任何本文提供的生物负荷降低的层析树脂的一些实例包括选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和或伪亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。在一些实施方案中，本文提供的生物负荷降低的层析树脂包括亲和层析树脂，所述亲和层析树脂包含蛋白质配体(例如，蛋白A或蛋白G)。在一些实施方案中，本文提供的生物负荷降低的层析树脂包括阴离子交换层析树脂(例如，包括N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。在一些实施方案中，本文提供的生物负荷降低的层析树脂是多模态层析树脂(例如，双模态层析树脂)。
还提供制备生物负荷降低的装填的层析柱的方法，其包括：提供通过本文所述的任何方法产生的任何生物负荷降低的层析树脂；和将所述层析树脂在无致病菌环境(aseptic environment)中装填至生物负荷降低的柱中。还提供生物负荷降低的装填的层析柱，其通过γ照射层析柱内包括的包含装填的层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物(例如，任何本文所述的示例性组合物)产生。本文提供的任何生物负荷降低的装填的层析柱可以具有约1x10-8至约1x 10-5(例如，约1x 10-7至约1x 10-6)的无菌性保证水平(SAL)。通过本文所述的任何方法产生的任何层析柱可以具有降低的生物负荷，是无菌的，是绝对无菌的或是无致病菌的。例如，通过本文所述的任何方法产生的任何层析柱可以是无致病菌并且可以具有降低的生物负荷，是无菌的，或者是绝对无菌的。
在本文提供的任何降低的装填的层析柱的一些实施方案中，所述装填的柱中的树脂包括选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。在本文提供的任何生物负荷降低的装填的层析柱的一些实施方案中，所述树脂包括亲和层析树脂，所述亲和层析树脂包含蛋白质配体(例如，蛋白A或蛋白G)。在本文提供的任何生物负荷降低的装填的层析柱的一些实例中，所述树脂包括阴离子交换层析树脂(例如，包括N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。
还提供包含层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在用足以降低所述组合物的生物负荷的γ-照射剂量处理之时的结合能力损失的量存在。在本文提供的任何组合物的一些实例中，所述组合物是沉降的层析树脂在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中的浆料。在一些实例中，所述液体包含：(i)75mM至约125mM(例如，80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甘露醇；(ii)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)；(iii)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)抗坏血酸钠；(iv)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)组氨酸；(v)30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)至约30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)组氨酸；(vi)约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)、约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)组氨酸，和约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)抗坏血酸钠；或(vii)约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)抗坏血酸钠、约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)、约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)甘露醇，和约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)组氨酸。在一些实例中，所述液体是缓冲的溶液(例如，磷酸盐缓冲的溶液，例如，磷酸钠缓冲的溶液，如50mM磷酸钠，pH6.0)。
在本文提供的任何组合物的一些实例中，所述组合物是固体组合物。
本文提供的任何组合物的一些实施方案可以包括选自下组的至少一种抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑素、番茄红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸盐、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、羟基苯丙酸甲酯类、利度卡因、柚苷配基(naringenin)、富勒烯(fullerene)、葡萄糖、甘露醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和二甲基甲氧基苯丙二氢吡喃醇。本文提供的任何组合物的一些实施方案可以包括至少一种(一种、两种、三种或四种)选自甘露醇、抗坏血酸钠、甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)和组氨酸的抗氧化剂。本文提供的任何组合物的一些实例包含甘露醇、抗坏血酸钠、甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)和组氨酸。本文提供的任何组合物的一些实例可以包含选自下组的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基琥珀酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺(desferroxamine)。在本文提供的任何组合物的一些实例中，所述层析树脂可以包括选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。在本文提供的任何组合物的一些实例中，所述树脂包括亲和层析树脂，所述亲和层析树脂包括蛋白质配体(例如，蛋白A或蛋白G)。
还提供进行生物负荷降低的柱层析的方法，其包括：(a)提供通过本文所述的任何方法产生的任何生物负荷降低的装填的层析柱；和(b)使用生物负荷降低的装填的层析柱和生物负荷降低的缓冲液在封闭系统中进行柱层析。在本文所述的任何方法的一些实例中，将使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少4天(例如，至少5天、至少7天、至少14天、至少28天或至少60天)的一段时间。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(a)中的生物负荷降低的装填的层析柱中的树脂与未用γ-照射处理的相同树脂相比具有约65％至约100％(例如，约75％至约100％)的百分比结合能力。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，生物负荷降低的装填的层析柱中的树脂包括选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和或伪亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。在本文所述的任何方法的一些实例中，所述树脂包括亲和层析树脂，所述亲和层析树脂包含蛋白质配体(例如，蛋白A或蛋白G)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述树脂包括阴离子交换层析树脂。
还提供用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；和(b)将所述液体培养基连续进料至包含至少一个通过本文所述的任何方法产生的任何生物负荷降低的装填的层析柱的多重组层析系统(MCCS)中；其中所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白。在本文所述的任何工艺的一些实施方案中，所述MCCS进行至少两种不同的单元操作。在本文所述的任何工艺的一些实施方案中，所述工艺包括柱切换。在本文所述的任何工艺的一些实施方案中，所述MCCS进行捕获重组蛋白和灭活病毒的单元操作，或进行捕获和纯化重组蛋白的单元操作。
在本文所述的任何工艺的一些实施方案中，所述MCCS包含至少两个生物负荷降低的装填的层析柱。在本文所述的任何工艺的一些实例中，所述MCCS是周期性逆流层析系统。在本文所述的任何工艺的一些实例中，所述MCCS包括用于亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合的多个柱。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述MCCS包括用于亲和层析的柱，并且所述工艺中进行的亲和层析使用选自下组的捕获机制：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。在本文所述的任何工艺的一些实例中，所述工艺中进行的亲和层析使用蛋白A结合捕获机制，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
还提供用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；(b)将所述液体培养基连续进料至第一多重柱层析系统(MCCS1)中；(c)使用所述MCCS1捕获所述液体培养基中的重组蛋白；(d)产生包含所述重组蛋白的MCCS1的洗脱物并将所述洗脱物连续进料至第二多重柱层析系统(MCCS2)中；(e)将来自所述洗脱物的重组蛋白连续进料至所述MCCS2中并随后将所述重组蛋白洗脱，由此产生纯化的重组蛋白，其中：所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至所述纯化的重组蛋白，并且所述MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱含有通过本文所述的任何方法产生的任何生物负荷降低的装填的层析柱。在本文所述的任何工艺的一些实施方案中，所述MCCS1和/或所述MCCS2进行至少两种不同的单元操作。本文所述的任何工艺的一些实例涉及柱切换。本文所述的任何工艺的一些实例中，所述MCCS1进行捕获重组治疗性蛋白和灭活病毒的单元操作。在本文提供的任何工艺的一些实施方案中，所述MCCS2进行纯化和精制所述重组蛋白的单元操作。在本文提供的任何工艺的一些实施方案中，所述MCCS1和/或MCCS2包含至少两个层析柱。在本文所述的任何工艺的一些实例中，所述MCCS1是第一周期性逆流层析系统(PCCS1)。本文所述的任何工艺的一些实例中，所述捕获使用亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合进行。在本文所述的任何工艺的一些实例中，所述亲和层析使用选自下组的捕获机制进行：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。在本文所述的任何工艺的一些实施方案中，所述亲和层析使用蛋白A结合捕获机制进行，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
在本文所述的任何工艺的一些实施方案中，所述MCCS2是第二周期性逆流(PCCS2)层析系统。在本文所述的任何工艺中，所述重组蛋白是治疗性重组蛋白。本文所述的任何工艺的一些实施方案进一步包括将所述纯化的治疗性重组蛋白配制成药物组合物。本文所述的任何工艺的一些实施方案可以连续进行至少4天(例如，至少5天、至少7天、至少14天或至少28天)的一段时间。
还提供降低层析的生物负荷的方法，包括(a)将包含基本上干燥的层析树脂的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量。这些方法的一些实施方案在步骤(a)之前进一步包括干燥层析树脂以将液体从层析树脂去除。在一些实施方案中，所述基本上干燥的层析树脂不含显著量的抗氧化剂或显著量的螯合剂。在一些实施方案中，所述容器是储存容器。在一些实施方案中，所述层析树脂共价附接于制品(例如，芯片、膜或盒)的表面。在一些实施方案中，所述层析树脂包含蛋白质配体(例如，蛋白A或蛋白G)。在一些实施方案中，所述层析树脂是阴离子交换层析树脂(例如，包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的层析树脂)。在一些实施方案中，所述剂量为约15kGy至约45kGy(例如，约20kGy至约30kGy)。还提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的层析树脂。在一些实施方案中，产生的生物负荷降低的层析树脂具有约1x 10-8至约1x 10-5的无菌性保证水平(SAL)(例如，约1x 10-7至约1x 10-6的SAL)。在一些实施方案中，降低的层析树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。在一些实施方案中，降低的层析树脂包括亲和层析树脂，所述亲和层析树脂包含蛋白质配体(例如，蛋白A)。在一些实施方案中，降低的层析树脂包括阴离子交换层析树脂(例如，包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。还提供制备生物负荷降低的装填的层析柱的方法，其包括提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的层析树脂；和在无致病菌环境中将所述层析树脂装填入生物负荷降低的柱。还提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。
还提供用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；和(b)将所述液体培养基连续进料至包含至少一个通过本文提供的任何方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱的多重柱层析系统(MCCS)；其中所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白。还提供用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；(b)将所述液体培养基连续进料至第一多重柱层析系统(MCCS1)中；(c)使用所述MCCS1捕获所述液体培养基中的重组蛋白；(d)产生包含所述重组蛋白的MCCS1的洗脱物并将所述洗脱物连续进料至第二多重柱层析系统(MCCS2)中；(e)将来自所述洗脱物的重组蛋白连续进料至所述MCCS2中并随后将所述重组蛋白洗脱，由此产生纯化的重组蛋白，其中：所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至所述纯化的重组蛋白，并且所述MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱含有通过本文提供的任何方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。
如用于本文，名词前的词语“一个/一种”代表一个或多个/一种或多种该特定名词。例如，短语“一个/一种生物负荷降低的层析柱”代表“一个或多个/一种或多种生物负荷降低的层析柱”。
术语“生物负荷”是本领域已知的并且指组合物(例如固体的或液体的)中和/或制品的表面(例如，外表面和/或内表面)上存在的自复制生物污染物的水平。例如，生物负荷可指含有层析树脂的组合物或装填的层析树脂中存在的自复制生物污染物(例如，装填的层析柱中装填的层析树脂中存在的自复制生物污染物)。在其他实例中，生物负荷可指层析柱内表面上的和/或层析柱内的层析树脂内的自复制生物污染物(例如，层析柱内表面上的生物污染物和层析柱内的装填的层析树脂中的生物污染物)。生物负荷还可指液体(例如，本文所述的任何方法或工艺中使用的缓冲液)内存在的自复制生物污染物。自复制生物污染物的非限定性实例可以是细菌(例如，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，或细菌孢子)、分枝杆菌、病毒(例如，囊泡病毒(vesivirus)、卡奇谷病毒(Cache Valley virus)、细小病毒、疱疹病毒和布尼亚病毒(bunyavirus))、寄生虫、真菌、酵母和原生动物(protozoa)。本文描述了用于测定生物负荷的示例性方法。用于测定生物负荷的其他方法是本领域已知的。
术语“降低生物负荷”是本领域已知的并且指组合物(例如固体的或液体的)中和/或制品的表面(例如，外表面和/或内表面)上存在的自复制生物污染物水平的减少(例如，可检测的减少)。本文描述了用于降低层析树脂(例如，装填的层析树脂)、缓冲液和/或层析柱(例如，装填的层析柱)的生物负荷的方法的非限定性实例。用于降低本文所述任何组合物的生物负荷的其他方法是本领域已知的。
术语“生物负荷降低的层析树脂”意指经过处理减少了层析树脂中存在的自复制生物污染物水平的层析树脂(例如，含有层析树脂的组合物例如浆料中存在的自复制生物污染物水平可检测的减少)。例如，生物负荷降低的层析树脂可以是暴露于足以减少所述层析树脂中自复制生物污染物水平的剂量的γ-照射的树脂(例如，含有层析树脂的组合物，其暴露于足以减少所述层析树脂中自复制生物污染物水平的剂量的γ-照射)。例如，生物负荷降低的层析树脂可以是已经暴露于约1kGy至约15kGy、约1kGy至约20kGyγ-照射、约1kGy至约25kGyγ-照射、约1kGy至约30kGyγ-照射或约1kGy至约35kGyγ-照射的剂量的树脂。本文描述了用于降低层析树脂的生物负荷的示例性方法。用于降低层析树脂的生物负荷的其他方法是本领域已知的。
术语“生物负荷降低的层析柱”意指包括经处理的层析树脂(例如，γ-照射的层析树脂)的层析柱(例如，装填的层析柱)，其具有低于包括未经处理的层析树脂的相同层析柱中存在的自复制生物污染物水平的自复制生物污染物水平。例如，生物负荷降低的层析柱可以包括具有至少或约1x 10-6、1x 10-7、1x 10-8、1x 10-9或1x 10-10的无菌性保证水平的经处理的层析柱。
术语“生物负荷降低的缓冲液”是本领域已知的并且意指经处理(例如，经过滤、高压灭菌和/或γ-照射)的液体(例如，经处理的缓冲的溶液)，其具有低于相同的未经处理的液体中存在的自复制污染剂水平的自复制污染剂水平。例如，生物负荷降低的缓冲液可以具有至少或约1x 10-6、1x 10-7、1x 10-8、1x 10-9或1x 10-10的无菌性保证水平。
“绝对无菌性”或“绝对无菌”是用于描述完全没有自复制生物污染物的组合物或工艺的术语。例如，该术语可以应用于经γ-照射的层析树脂、层析柱的内表面和内容物(例如，层析树脂)和/或缓冲液。绝对无菌的组合物或工艺可以是洁净的(如该术语在本领域已知的那样)。
“无菌”或“无菌性”是用于描述具有约或小于1.0x 10-6(例如，大约或小于1.0x10-7、大约或小于1.0x 10-8、大约或小于1.0x 10-9或1x 10-10)的无菌性保证水平的组合物或工艺。测定组合物或工艺是否是无菌的可以使用多种本领域已知的经验证的生产工艺来检测。例如，无菌组合物或工艺可以完全没有活的自复制生物污染物(例如，本文所述的任何自复制生物污染物)。无菌组合物或工艺也可以是洁净的(如该术语在本领域已知的那样)。
术语“灭菌”意指用于使组合物无菌(如本文所定义)的经验证的工艺。可以测量处理工艺过程中抗性指示剂自复制生物污染物(例如，细菌)的灭活率以测定对于组合物是否已经实现了无菌性(如本文所定义)。
术语“无菌性保证水平”或“SAL”是本领域已知的并且意指在一批经处理的单位内实现绝对无菌性的置信水平。所述概率通常基于验证过程中进行的灭活研究的结果来计算并且以1x 10-n的形式表示。
术语“无致病菌(aseptic)”用于描述没有引起疾病或引起症状的自复制生物污染物(例如，本文所述的任何自复制生物污染物)的组合物或工艺。无致病菌的组合物或工艺也可以是洁净的(如该术语在本领域已知的那样)。
术语“单元操作”是技术术语并且意指可以在从液体培养基纯化重组蛋白的工艺中进行的功能性步骤。例如，操作单元可以是过滤(例如，从包括重组蛋白的流体去除污染细菌、酵母、病毒和/或分枝杆菌，和/或颗粒物质)、捕获、表位标签去除、纯化、保持或储存、精制、病毒灭活、调节包括重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH和去除不想要的盐。
术语“捕获”意指为了从液体培养基或稀释的液体培养基中存在的一种或多种其他组分(例如，培养基蛋白或一种或多种哺乳动物细胞中存在的或从哺乳动物细胞分泌的其他组分(例如，DNA、RNA或其他蛋白质))部分纯化或分离(例如，至少或约5％，例如，至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或约95％纯的，按重量计)并浓缩重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)而进行的步骤。通常，捕获使用结合重组蛋白的层析树脂进行(例如，通过使用亲和层析)。本文描述了用于从液体培养基或稀释的液体培养基捕获重组蛋白的非限定性方法，并且其他方法是本领域已知的。可以使用至少一个层析柱和/或层析膜(例如，本文所述的任何层析柱和/或层析膜)从液体培养基捕获重组蛋白。
术语“纯化”意指为了将重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)从一种或多种其他杂质(例如，大块杂质(bulk impurities))或包括重组蛋白的流体中存在的组分(例如，液体培养基蛋白或一种或多种哺乳动物细胞中存在的或从哺乳动物细胞分泌的其他组分(例如，DNA、RNA、其他蛋白质、内毒素、病毒等))分离而进行的步骤。例如，纯化可以在初始捕获步骤的过程中或之后进行。纯化可以使用结合重组蛋白或污染物的层析树脂、膜或任何其他固体支持物进行(例如，通过使用亲和层析、疏水相互作用层析、阴离子或阳离子交换层析或分子筛层析)。可以使用至少一种层析柱和/或层析膜(例如，本文所述的任何层析柱或层析膜)从包括重组蛋白的流体纯化重组蛋白。
术语“精制”是技术术语并且意指为了从接近最终期望纯度的包括重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的流体去除残余的痕量或小量污染物或杂质而进行的步骤。例如，精制可以通过使包括重组蛋白的流体通过层析柱或膜吸附剂来进行，所述层析柱或膜吸附剂选择性结合目标重组蛋白或包括重组蛋白的流体中存在的小量污染物或杂质。在这样的实例中，层析柱或膜吸附剂的洗脱物/滤出物包括重组蛋白。
术语“过滤”意指从流体(例如，液体培养基或本文所述任何工艺中存在的流体)去除至少部分(例如，至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)不想要的生物污染物(例如，哺乳动物细胞、细菌、酵母细胞、病毒或分枝杆菌)和/或颗粒物质(例如，沉淀的蛋白质)。
术语“洗脱物/滤出物”是技术术语并且意指从层析柱或层析膜排出的包括可检测量的重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的流体。
术语“一体化的工艺”意指使用合作发挥功能以实现特定结果(例如，从液体培养基纯化重组蛋白)的结构元件进行的工艺。
术语“连续的工艺”意指连续进料流体通过至少部分系统的工艺。例如，连续的工艺是从生物反应器连续进料包括重组蛋白的液体培养基通过MCCS的工艺。连续的工艺的另一实例是从生物反应器连续进料包括重组蛋白的液体培养基通过第一和第二MCCS(MCCS1和MCCS2)的工艺。其他的实例包括连续进料包括重组蛋白的液体培养基通过MCCS的工艺，连续进料包括重组蛋白的液体培养基通过MCCS1和MCCS2的工艺，或连续进料包括重组蛋白的流体通过MCCS2的工艺。
术语“封闭的工艺”是技术术语并且意指不使与所述重组蛋白或包括重组蛋白的液体接触的工艺组分(例如，层析树脂和/或缓冲液)有意暴露于污染剂一段显著的时间的工艺(例如，不使其有意暴露于空气一段显著的时间)。
术语“治疗性蛋白药物物质”意指重组蛋白(例如，免疫球蛋白、蛋白片段、工程化蛋白或酶)，其已经从污染性蛋白质、脂质和核酸(例如，液体培养基中存在的或来自宿主细胞(例如，来自哺乳动物、酵母或细菌宿主细胞)的污染性蛋白质、脂质和核酸)和生物污染物(例如，病毒和细菌污染物)充分纯化或分离，并且可以配制成药剂而不用任何进一步的实质性纯化和/或去污染步骤。
术语“多重柱层析系统”或“MCCS”意指总共两个或更多个相互连接或切换的层析柱和/或层析膜的系统。多重柱层析系统的非限定性实例是包括总共两个或更多个相互连接或切换的层析柱和/或层析膜的周期性逆流层析系统(PCC)。多重柱层析系统的其他实例在本文描述并且是本领域已知的。
术语“基本上不含”意指至少或约90％不含(例如，至少或约95％、96％、97％、98％或至少或约99％不含，或约100％不含)指定物质(例如，哺乳动物细胞或来自哺乳动物细胞的污染性蛋白质、核酸、糖类或脂质)的组合物(例如，液体培养基)。
术语“哺乳动物细胞”意指来自或源自任何哺乳动物(例如，人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、牛或兔)的任何细胞。比如，哺乳动物细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是分化的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是未分化的细胞。本文描述了哺乳动物细胞的非限定性实例。其他哺乳动物细胞的实例是本领域已知的。
术语“培养”或“细胞培养”意指在一组受控的物理条件下维持或增殖哺乳动物细胞。
术语“哺乳动物细胞的培养物”意指包括在一组受控的物理条件下维持或增殖的多个哺乳动物细胞的液体培养基。
术语“液体培养基”意指包括允许细胞(例如，哺乳动物细胞)在体外生长或增殖的充足营养物的流体。例如，液体培养基可以包括下列中的一种或多种：氨基酸(例如，20种氨基酸)，嘌呤(例如，次黄嘌呤)，嘧啶(例如，胸苷)，胆碱，肌醇，硫胺，叶酸，生物素，钙，烟酰胺，吡哆醇，核黄素，胸苷，氰钴胺，丙酮酸盐，硫辛酸，镁，葡萄糖，钠，钾，铁，铜，锌和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可以包括来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基不包括血清或来自哺乳动物的别的提取物(限定的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可以包括痕量金属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的另一实例是基本培养基(minimal medium)(例如，仅包括无机盐、碳源和水的培养基)。本文描述了液体培养基的非限定性实例。液体培养基的其他实例是本领域已知的并且是商业上可以获得的。液体培养基可以包括任何密度的哺乳动物细胞。例如，如用于本文，从生物反应器去除的一定体积的液体培养基可以基本上不含哺乳动物细胞。
术语“无动物来源组分的液体培养基”意指不包括任何来源于哺乳动物的组分(例如，蛋白质或血清)的液体培养基。
术语“无血清的液体培养基”意指不包括哺乳动物血清的液体培养基。
术语“含血清的液体培养基”意指包括哺乳动物血清的液体培养基。
术语“化学限定的液体培养基”是技术术语并且意指其中全部化学组分已知的液体培养基。例如，化学限定的液体培养基不包括胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，因为这些制备物通常包括白蛋白和脂质的复杂混合。
术语“无蛋白液体培养基”意指不包括任何蛋白质(例如，任何可检测的蛋白质)的液体培养基。
术语“免疫球蛋白”意指包括免疫球蛋白(例如，可变结构域序列、框架序列和/或恒定结构域序列)的至少15个氨基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的氨基酸序列的多肽。免疫球蛋白可以例如包括轻链免疫球蛋白的至少15个氨基酸，例如，重链免疫球蛋白的至少15个氨基酸。免疫球蛋白可以是分离的抗体(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)，例如，IgG的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗体片段，例如，Fab片段、F(ab′)2片段或scFv片段。免疫球蛋白也可以是双特异性抗体或三特异性抗体，或二聚体、三聚体或多聚体抗体，或双抗体、或免疫球蛋白也可以是包括至少一个免疫球蛋白结构域(例如，融合蛋白)的工程化蛋白。本文描述了免疫球蛋白的非限定性实例并且免疫球蛋白的其他实例是本领域已知的。
术语“蛋白片段”或“多肽片段”意指多肽序列中长度为至少或约4个氨基酸、至少或约5个氨基酸、至少或约6个氨基酸、至少或约7个氨基酸、至少或约8个氨基酸、至少或约9个氨基酸、至少或约10个氨基酸、至少或约11个氨基酸、至少或约12个氨基酸、至少或约13个氨基酸、至少或约14个氨基酸、至少或约15个氨基酸、至少或约16个氨基酸、至少或约17个氨基酸、至少或约18个氨基酸、至少或约19个氨基酸或至少或约20个氨基酸或超过20个氨基酸的一部分。重组蛋白片段可以使用本文所述的任何工艺产生。
术语“工程化蛋白”意指不是生物体(例如，哺乳动物)内存在的内源核酸天然编码的多肽。工程化蛋白的实例包括酶(例如，具有导致工程化酶的稳定性和/或催化活性增加的一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加)、融合蛋白、抗体(例如，二价抗体、三价抗体或双抗体)，和包括至少一个重组支架序列的抗原结合蛋白。
术语“分泌的蛋白质”或“分泌的重组蛋白”意指当在哺乳动物细胞内翻译时原始包括至少一个分泌信号序列并且至少部分通过哺乳动物细胞中对分泌信号序列的酶促切割至少部分分泌至细胞外空间(例如，液体培养基)中的蛋白质(例如，重组蛋白)。本领域技术人员会理解“分泌的”蛋白质不需要完全从细胞脱离即可被认为是分泌的蛋白质。
术语“灌注生物反应器”意指包括在第一液体培养基中的多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的生物反应器，其中培养所述生物反应器中存在的细胞包括周期性或连续去除第一液体培养基并同时或在稍后不久添加基本上相同体积的第二液体培养基至所述生物反应器。在一些实例中，在培养期过程中在渐进的时间段内(例如，约24小时的时间段、约1分钟至约24小时的时间段或大于24小时的时间段)在去除和添加的第一培养基的体积方面存在渐进变化(例如，增加或减少)(例如，以天为基础培养基再补料速率)。每天去除和替换的培养基比例可以依赖于培养的特定细胞、初始接种密度和特定时间的细胞密度变化。“RV”或“反应器体积”意指在培养过程开始时存在的培养基体积(例如，接种后存在的培养基总体积)。
术语“补料分批生物反应器”是技术术语并且意指包括在第一液体培养基中的多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的生物反应器，其中培养所述生物反应器中存在的细胞包括周期性或连续添加第二液体培养基至所述第一液体培养基，而不从细胞培养物实质性或显著去除所述第一液体培养基或第二液体培养基。第二液体培养基可以与第一液体培养基相同。在补料分批培养的一些实例中，第二液体培养基是第一液体培养基的浓缩形式。在补料分批培养的一些实例中，第二液体培养基作为干粉添加。
术语“澄清的液体培养基”意指从细菌或酵母细胞培养物获得的、基本上不含(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％不含)细菌或酵母细胞的液体培养基。
除非另行定义，否则本文使用的任何技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的具有含义相同。本文描述了用于在本发明中使用的方法和材料；其他本领域已知的合适的方法和材料也可以使用。所述材料、方法和实例只是示例性的，而不旨在进行限制。本文提及的全部公开文本、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文件通过提述以其整体并入。如有冲突，以包括定义在内的本说明书为准。
本发明的其他特征和优势将由下文的详述和附图并由权利要求中变得显而易见。
本发明还涉及以下各项：
1.一种降低层析树脂的生物负荷的方法，包括：
将包含含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在暴露于所述γ-照射剂量之后的结合能力损失的量存在。
2.项1的方法，进一步包括在暴露之前将所述组合物置于所述容器中。
3.项1的方法，其中所述容器是储存容器。
4.项1的方法，其中所述容器是层析柱。
5.项1的方法，其中所述容器是装填的层析柱。
6.项1的方法，其中所述组合物是沉降的层析树脂在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中的浆料。
7.项1的方法，其中所述组合物是固体混合物。
8.项1的方法，其中所述组合物包含选自下组的至少一种抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑素、番茄红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸盐、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、羟基苯丙酸甲酯类(a phenolpropanoidacid)、利度卡因(lidocaine)、柚苷配基(naringenin)、富勒烯(fullerene)、葡萄糖、甘露醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和二甲基甲氧基苯丙二氢吡喃醇。
9.项1的方法，其中所述组合物包含选自下组的至少一种抗氧化剂：甘露醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
10.项1的方法，其中所述组合物包含甘露醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
11.项6的方法，其中所述液体包含：
(i)75mM至约125mM甘露醇；
(ii)75mM至约125mM甲硫氨酸；
(iii)75mM至约125mM抗坏血酸钠；
(iv)75mM至约125mM组氨酸；
(v)30mM至约70mM甲硫氨酸和约30mM至约70mM组氨酸；
(vi)约10mM至约50mM甲硫氨酸、约10mM至约50mM组氨酸和约10mM至约50mM抗坏血酸钠；或
(vii)约5mM至约45mM抗坏血酸钠、约5mM至约45mM甲硫氨酸、约5mM至约45mM甘露醇和约5mM至约45mM组氨酸。
12.项6或11的方法，其中所述液体是缓冲的溶液。
13.项1的方法，其中所述组合物包含选自下组的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基琥珀酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺(desferroxamine)。
14.项1的方法，其中所述组合物包含选自下组的至少一种层析树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
15.项14的方法，其中所述组合物包含含有蛋白质配体的亲和层析树脂。
16.项15的方法，其中所述蛋白质配体是蛋白A。
17.项14的方法，其中所述组合物包含阴离子交换层析树脂。
18.项17的方法，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
19.项1的方法，其中所述剂量为约15kGy至约45kGy。
20.项19的方法，其中所述剂量为约20kGy至约30kGy。
21.项20的方法，其中所述剂量为约23kGy至约27kGy。
22.项1的方法，其中暴露在约-25℃至约0℃之间，含端值，的温度下进行。
23.项1的方法，其中暴露在约0℃至约25℃之间，含端值，的温度下进行。
24.一种通过项3的方法产生的生物负荷降低的层析树脂。
25.项24的生物负荷降低的层析树脂，其中所述树脂具有约1x 10-8至约1x 10-5的无菌性保证水平(SAL)。
26.项25的生物负荷降低的层析树脂，其中所述树脂具有约1x 10-7至约1x 10-6的无菌性保证水平(SAL)。
27.项24的生物负荷降低的层析树脂，其中所述层析树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
28.项27的生物负荷降低的层析树脂，其中所述层析树脂包含含有蛋白质配体的亲和层析树脂。
29.项28的生物负荷降低的层析树脂，其中所述蛋白质配体是蛋白A。
30.项27的生物负荷降低的层析树脂，其中所述层析树脂包含阴离子交换层析树脂。
31.项30的生物负荷降低的层析树脂，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
32.一种制备生物负荷降低的装填的层析柱的方法，包括：
提供项24的生物负荷降低的层析树脂；和
将所述层析树脂在无致病菌环境中装填至生物负荷降低的柱中。
33.一种通过项32的方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。
34.一种通过项5的方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。
35.项34的生物负荷降低的装填的层析柱，其中在装填的柱中的树脂具有约1x10-8至约1x 10-5的无菌性保证水平(SAL)。
36.项35的生物负荷降低的装填的层析柱，其中在装填的柱中的树脂具有约1x10-7至约1x 10-6的无菌性保证水平(SAL)。
37.项34的生物负荷降低的装填的层析柱，其中在装填的柱中的树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
38.项37的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述树脂包含含有蛋白质配体的亲和或伪亲和层析树脂。
39.项38的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述配体是蛋白A。
40.项37的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述树脂包含阴离子交换层析树脂。
41.项40的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
42.一种包含层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物，其中所述一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在用足以降低所述组合物的生物负荷的γ-照射剂量处理之时的结合能力损失的量存在。
43.项42的组合物，其中所述组合物是沉降的层析树脂在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中的浆料。
44.项42的组合物，其中所述组合物是固体混合物。
45.项42的组合物，其中所述组合物包含选自下组的至少一种抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑素、番茄红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸盐、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、羟基苯丙酸甲酯类、利度卡因、柚苷配基(naringenin)、富勒烯(fullerene)、葡萄糖、甘露醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和二甲基甲氧基苯丙二氢吡喃醇。
46.项42的组合物，其中所述组合物包含选自下组的至少一种抗氧化剂：甘露醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
47.项42的组合物，其中所述组合物包含甘露醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
48.项43的组合物，其中所述液体包含：
(i)75mM至约125mM甘露醇；
(ii)75mM至约125mM甲硫氨酸；
(iii)75mM至约125mM抗坏血酸钠；
(iv)75mM至约125mM组氨酸；
(v)30mM至约70mM甲硫氨酸和约30mM至约70mM组氨酸；
(vi)约10mM至约50mM甲硫氨酸、约10mM至约50mM组氨酸和约10mM至约50mM抗坏血酸钠；或
(vii)约5mM至约45mM抗坏血酸钠、约5mM至约45mM甲硫氨酸、约5mM至约45mM甘露醇和约5mM至约45mM组氨酸。
49.项43或48的组合物，其中所述液体是缓冲的溶液。
50.项42的组合物，其中所述组合物包含选自下组的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基琥珀酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺。
51.项42的组合物，其中所述层析树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
52.项51的组合物，其中所述树脂包含含有蛋白质配体的亲和层析树脂。
53.项52的组合物，其中所述蛋白质配体是蛋白A。
54.一种进行生物负荷降低的柱层析的方法，包括：
(a)提供项33或34的生物负荷降低的装填的层析柱；和
(b)使用所述生物负荷降低的装填的层析柱和生物负荷降低的缓冲液在封闭系统中进行柱层析。
55.项54的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少4天的一段时间。
56.项55的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少5天的一段时间。
57.项56的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少7天的一段时间。
58.项57的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少14天的一段时间。
59.项58的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少28天的一段时间。
60.项54的方法，其中(a)中的所述生物负荷降低的装填的层析柱中的树脂与未用γ-照射处理的相同树脂相比具有约75％至约100％的百分比结合能力。
61.项54的方法，其中所述生物负荷降低的装填的层析柱中的树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
62.项61的方法，其中所述树脂包含含有蛋白质配体的亲和层析树脂。
63.项62的方法，其中所述蛋白质配体是蛋白A。
64.项61的方法，其中所述树脂包含阴离子交换层析树脂。
65.一种用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：
(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；和
(b)将所述液体培养基连续进料至包含至少一个项33或34的生物负荷降低的装填的层析柱的多重柱层析系统(MCCS)中；
其中所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白。
66.项65的工艺，其中所述MCCS进行至少两种不同的单元操作。
67.项65的工艺，其中所述工艺包括柱切换。
68.项65的工艺，其中所述MCCS进行捕获重组蛋白和灭活病毒的单元操作。
69.项65的工艺，其中所述MCCS进行捕获和纯化重组蛋白的单元操作。
70.项65的工艺，其中所述MCCS包含至少两个生物负荷降低的装填的层析柱。
71.项65的工艺，其中所述MCCS是周期性逆流层析系统。
72.项65的工艺，其中所述MCCS包括用于亲和或伪亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合的多个柱。
73.项72的工艺，其中所述MCCS包括用于亲和层析的柱，并且所述工艺中进行的亲和层析使用选自下组的捕获机制：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
74.项73的工艺，其中所述工艺中进行的亲和层析使用蛋白A结合捕获机制，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
75.一种用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：
(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；
(b)将所述液体培养基连续进料至第一多重柱层析系统(MCCS1)中；
(c)使用所述MCCS1捕获所述液体培养基中的重组蛋白；
(d)产生包含所述重组蛋白的MCCS1的洗脱物并将所述洗脱物连续进料至第二多重柱层析系统(MCCS2)中；
(e)将来自所述洗脱物的重组蛋白连续进料至所述MCCS2中并随后将所述重组蛋白洗脱，由此产生纯化的重组蛋白，其中：
所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至所述纯化的重组蛋白，并且
所述MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱含有项33或34的生物负荷降低的装填的层析柱。
76.项75的工艺，其中所述MCCS1和/或所述MCCS2进行至少两个不同的单元操作。
77.项75的工艺，其中所述工艺涉及柱切换。
78.项75的工艺，其中所述MCCS1进行捕获重组治疗性蛋白和灭活病毒的单元操作。
79.项75的工艺，其中所述MCCS2进行纯化和精制所述重组蛋白的单元操作。
80.项75的工艺，其中所述MCCS1和/或MCCS2包含至少两个层析柱。
81.项75的工艺，其中所述MCCS1是第一周期性逆流层析系统(PCCS1)。
82.项75的工艺，其中所述捕获使用亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合进行。
83.项82的工艺，其中所述亲和层析使用选自下组的捕获机制进行：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
84.项83的工艺，其中所述亲和层析使用蛋白A结合捕获机制进行，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
85.项75的工艺，其中所述MCCS2是第二周期性逆流(PCCS2)层析系统。
86.项65或75的工艺，其中所述重组蛋白是治疗性重组蛋白。
87.项86的工艺，进一步包括将所述纯化的治疗性重组蛋白配制成药物组合物。
88.项65或75的工艺，其中将工艺连续进行至少4天的一段时间。
89.项88的工艺，其中将工艺连续进行至少5天的一段时间。
90.项89的工艺，其中将工艺连续进行至少7天的一段时间。
91.项90的工艺，其中将工艺连续进行至少14天的一段时间。
92.项91的工艺，其中将工艺连续进行至少28天的一段时间。
附图说明
图1是对于未经处理的GE Mab Select SuReTM树脂、25kGyγ-照射的GE MabSelect SuReTM树脂、15kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂和15kGyγ-照射的Kaneka KanCap A树脂显示树脂静态结合曲线(mg/mL protein)的图。
图2是显示来自30kGyγ-照射之后的GE Mab Select SuReTM树脂和来自30kGyγ-照射之后的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂的上清液的280nm吸光度(蛋白A吸光度)的表。
图3是显示在使用未经处理的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(原始洗脱物(virgin eluate))或15kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(γ洗脱物)进行的多个层析循环中洗脱物中蛋白质的量的图。
图4是显示在使用未经处理的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂进行的连续层析过程中循环7和循环11的洗脱谱的层析图。
图5是显示在使用15kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂进行的连续层析过程中循环7和循环11的洗脱谱的层析图。
图6是显示在使用未经处理的LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(原始)或15kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(γ)进行的连续层析的多个循环中洗脱物中蛋白质的量的图。
图7是在使用未经处理的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(原始)或15kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(γ)进行的多个层析循环中结合的蛋白质的图。
图8是显示使用未经处理的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(原始)或29kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(γ)进行的多个层析循环中洗脱物中蛋白质的量的图。
图9是显示使用未经处理的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(原始)、15kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(15kGy)或29kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂(29kGy)进行的多个层析循环中洗脱物中蛋白质(抗-αβTCR(IgG1)或抗-TGFβ(IgG4))的量的图。
图10是示例性重组蛋白的列表，所述示例性重组蛋白是可用于治疗人的特定病症的酶。
图11是当使用含有单克隆IgG1的培养基来加载每种树脂时多个层析循环中未经处理的(原始)和29-kGyγ-照射的GE Mab Select SuReTM树脂的洗脱物中的蛋白质的图。
图12是当使用含有单克隆IgG1的培养基来加载每种树脂时多个层析循环中与未经处理的(原始)和29-kGyγ-照射的GE Mab Select SuReTM树脂结合的蛋白质的量的图。
图13是在用不同平衡浓度的单克隆IgG4抗体加载之后与未经处理的(原始)和29-kGyγ-照射的GE Mab Select SuReTMLX树脂结合的蛋白质的量(mg结合的蛋白/mL树脂)的图。
图14是在七种不同的含有至少一种氧化剂的测试缓冲液之一存在下，在2mg/mL的平衡IgG4抗体浓度下，未经处理的GE Mab Select SuReTM LX树脂(原始LX)、29-kGyγ-照射的GE Mab Select SuReTM LX树脂(29kGY LX)、干燥的未经处理的GE Mab Select SuReTMLX树脂和干燥的29-kGyγ-照射的GE Mab Select SuReTM LX树脂以及以29kGy剂量进行γ-照射的GE Mab Select SuReTM LX树脂的静态结合能力(mg蛋白质/mL树脂)的图。
图15是在25mM甘露醇、25mM组氨酸、25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、50mM磷酸钠，pH 6.0存在下，使用未经处理的GE Mab Select SuReTM LX树脂(原始)或以29kGy的剂量进行γ-照射的GE Mab Select SuReTM LX树脂进行的多个层析循环中洗脱物中蛋白质的量的图。
图16是在25mM甘露醇、25mM组氨酸、25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、50mM磷酸钠，pH 6.0存在下，使用未经处理的GE Mab Select SuReTM LX树脂(原始)或以29kGy的剂量进行γ-照射的GE Mab Select SuReTM LX树脂进行的多个层析循环中结合的蛋白质的量的图。
图17是非还原型十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶，其显示在25mM甘露醇、25mM组氨酸、25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、50mM磷酸钠，pH 6.0存在下，使用未经处理的GE MabSelect SuReTM LX树脂(原始LX)和以29kGy的剂量进行γ-照射的GE Mab Select SuReTMLX树脂的多个层析循环中的IgG1抗体洗脱物。
发明详述
本文提供降低层析树脂的生物负荷的方法，其包括将包含含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在暴露于所述γ-照射剂量之后/之时的结合能力损失的量存在。还提供通过本文所述的任何方法制备的含有生物负荷降低的层析树脂的生物负荷降低的层析柱，包含层析树脂和至少一种螯合剂和/或抗氧化剂的组合物，使用这些生物负荷降低的层析柱中的至少一种进行生物负荷降低的柱层析的方法，和包括使用这些生物负荷降低的层析柱中至少一种的、用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭或基本上封闭且连续的工艺。这些方法和工艺的非限定性方面在下文描述。正如本领域所理解的，下文描述的各个方面可以以任何组合使用而不受限制。
含有层析树脂和抗氧化剂和/或螯合剂的组合物
本文提供包含层析树脂(例如，本文所述的或本领域已知的任何层析树脂)和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂(例如，本文所述的或本领域已知的任何抗氧化剂和/或螯合剂)的组合物，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在用足以降低所述组合物的生物负荷的γ-照射剂量处理之时的结合能力损失的量存在。例如，所述层析树脂可以是阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和或伪亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂中的至少一种,或其任何组合。在一些实例中，所述层析树脂是包括蛋白质或肽配体(例如，具有蛋白质或肽配体的亲和层析树脂，例如，蛋白A或蛋白G层析树脂)的树脂。
例如，所述组合物可以是沉降的层析树脂在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中的浆料。例如，所述液体可以含有甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)、抗坏血酸钠、组氨酸和甘露醇中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)。在一些实例中，所述液体含有甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)、抗坏血酸钠、组氨酸和甘露醇。在一些实例中，所述液体包含：(i)75mM至约125mM(例如，80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甘露醇；(ii)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)；(iii)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)抗坏血酸钠；(iv)75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)组氨酸；(v)约30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)和约30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)组氨酸；(vi)约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽),约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)组氨酸，和约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM或约25mM至约35mM)抗坏血酸钠；或(vii)约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)抗坏血酸钠,约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽),约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)甘露醇，和约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM)组氨酸。在一些实例中，所述液体是缓冲的溶液(例如，磷酸盐缓冲的溶液，例如，磷酸钠缓冲的溶液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)。在一些实例中，所述液体是缓冲的溶液(例如，磷酸盐缓冲的溶液，如磷酸钠缓冲的溶液(例如，50mM磷酸钠，pH 6.0)。
在一些实例中，所述组合物可以是固体混合物(例如，干燥的固体混合物或润湿的(wetted)或潮湿的(moist)固体混合物)。所述固体混合物可以包括甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)、抗坏血酸钠、组氨酸和甘露醇中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)。在一些实例中，所述固体混合物含有甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)、抗坏血酸钠、组氨酸和甘露醇。在一些实例中，所述组合物是装填在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中的层析树脂。这些液体的非限定性实例在本文描述。
本文还提供包含层析树脂(例如，本文所述的或本领域已知的任何层析树脂)和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂(例如，本文所述的或本领域已知的任何抗氧化剂和/或螯合剂)的容器(例如，塑料容器或层析柱)，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在用足以降低所述组合物的生物负荷的γ-照射剂量处理之时的结合能力损失的量存在。例如，所述容器(例如，塑料容器或层析柱)可以具有例如，至少约1mL、5mL、至少约10mL、至少约20mL、至少约30mL、至少约40mL、至少约50mL、至少约60mL、至少约70mL、至少约80mL、至少约90mL、至少约100mL、至少约110mL、至少约120mL、至少约130mL、至少约140mL、至少约150mL、至少约160mL、至少约170mL、至少约180mL、至少约190mL、至少约200mL、至少约210mL、至少约220mL、至少约230mL、至少约240mL、至少约250mL、至少300mL、至少350mL、至少400mL或至少500mL的内部容积。例如，容器可以具有例如，约1mL至约500mL、约1mL至约50mL、约5mL至约500mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约150mL、约5mL至约100mL或约5mL至约50mL的内部容积。在一些实例中，容器中的层析树脂是沉降的层析树脂在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中的浆料。在一些实例中，所述容器包含装填的层析树脂(例如，装填在包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体中)。
本文提供的任何组合物可以含有至少一种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)抗氧化剂和/或至少一种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)螯合剂。本文提供的任何组合物中包括的任何抗氧化剂可以具有淬灭以下活性氧和/或氮类物质中一种或多种的能力：羟基自由基、碳酸根自由基、过氧化物阴离子、过氧化氢自由基(peroxyl radical)、过氧化亚硝酸盐(peroxynitrite)、二氧化氮和一氧化氮。能够包括在本文提供的任何组合物中的抗氧化剂的非限定性实例包括：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑素、番茄红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸盐、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、羟基苯丙酸甲酯类、利度卡因、柚苷配基(naringenin)、富勒烯(fullerene)、葡萄糖、甘露醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和二甲基甲氧基苯丙二氢吡喃醇。抗氧化剂的其他非限定性实例包括抗氧化酶(例如，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白还原酶)。能够包括在本文提供的任何组合物中的抗氧化剂的其他实例包括甘露醇、抗坏血酸钠、甲硫氨酸和组氨酸。抗氧化剂的其他实例包括半胱氨酸、牛磺酸、巯基丙酰甘氨酸(mercaptopropionylglycine)、N-乙酰半胱氨酸、大蒜油、二烯丙基硫醚(diallylsulfide)、二氢硫辛酸和三硫化二烯丙基(diallyltrisulfide)。包括抗氧化酶作为抗氧化剂的一些实施方案可以进一步包括所述酶的一种或多种底物。抗氧化剂可以使用多种本领域已知的方法鉴定，例如，自旋捕获(spin trapping)、氧化还原敏感性染料和化学发光测定法(chemiluminescence assay)。
本文提供的任何组合物中包括的任何螯合剂可以具有以高亲和力(例如，大约或低于1μM、大约或低于800nM、大约或低于700nM、大约或低于600nM、大约或低于500nM、大约或低于400nM、大约或低于300nM、大约或低于250nM、大约或低于200nM、大约或低于150nM、大约或低于100nM、大约或低于80nM、大约或低于60nM、大约或低于40nM、大约或低于20nM,或大约或低于1nm)结合氧化还原活性金属(例如，Cu2+和Fe2+)的能力。能够包括在本文提供的任何组合物中的螯合剂的非限定性实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠(DMPS)、二巯基琥珀酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺。
在本文提供的任何组合物中每种螯合剂和/或抗氧化剂的浓度可以是约0.1mM至约150mM(例如，约0.1mM至约150mM、约0.1mM至约125mM、约0.1mM至约100mM、约0.1mM至约80mM、约0.1mM至约60mM、约0.1mM至约50mM、约0.1mM至约40mM、约0.1mM至约30mM、约0.1mM至约25mM、约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约10mM、约0.1mM至约5.0mM、约0.5mM至约150mM、约0.5mM至约100mM、约0.5mM至约50mM、约0.5mM至约25mM、约0.5mM至约15mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约5mM、约1mM至约125mM、约1mM至约120mM、约1mM至约100mM、约1mM至约80mM、约1mM至约60mM、约1mM至约50mM、约1mM至约40mM、约1mM至约30mM、约1mM至约25mM、约5mM至约150mM、约5mM至约125mM、约5mM至约100mM、约5mM至约80mM、约5mM至约60mM、约5mM至约50mM、约5mM至约40mM、约5mM至约30mM、约5mM至约25mM、约10mM至约150mM、约10mM至约125mM、约1mM至约100mM、约10mM至约80mM、约10mM至约60mM、约10mM至约50mM、约10mM至约40mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM、约20mM至约150mM、约20mM至约125mM、约20mM至约100mM、约20mM至约80mM、约20mM至约60mM、约20mM至约50mM、约20mM至约40mM、约20mM至约30mM、约30mM至约150mM、约30mM至约125mM、约30mM至约100mM、约30mM至约80mM、约30mM至约60mM、约30mM至约50mM、约30mM至约40mM、约40mM至约150mM、约40mM至约125mM、约40mM至约100mM、约40mM至约90mM、约40mM至约80mM、约40mM至约70mM、约40mM至约60mM、约50mM至约150mM、约50mM至约125mM、约50mM至约100mM、约50mM至约80mM、约50mM至约60mM、约80mM至约150mM、约80mM至约125mM、约80mM至约100mM、约100mM至约150mM或约100mM至约125mM)。
在一些实例中，本文提供的组合物含有下列的一种或多种：5mM至约150mM甘露醇(例如，约10mM至约150mM、约20mM至约150mM、约30mM至约150mM、约40mM至约150mM、约50mM至约150mM、约60mM至约140mM、约70mM至约130mM、约80mM至约120mM、约90mM至约110mM、约95mM至约105mM、约5mM至约50mM、约5mM至约45mM、约5mM至约40mM、约5mM至约35mM、约10mM至约35mM、约15mM至约35mM或约20mM至约30mM甘露醇)；5mM至约150mM(例如，约10mM至约150mM、约20mM至约150mM、约30mM至约150mM、约40mM至约150mM、约50mM至约150mM、约60mM至约140mM、约70mM至约130mM、约80mM至约120mM、约90mM至约110mM、约95mM至约105mM、约30mM至约70mM、约35mM至约65mM、约40mM至约60mM、约45mM至约55mM、约20mM至约50mM、约25mM至约45mM、约30mM至约40mM、约30mM至约35mM、约5mM至约45mM、约10mM至约40mM、约15mM至约35mM、约20mM至约30mM或约20mM至约25mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)；5mM至150mM抗坏血酸钠(例如，约10mM至约150mM、约20mM至约150mM、约30mM至约150mM、约40mM至约150mM、约50mM至约150mM、约60mM至约140mM、约70mM至约130mM、约80mM至约120mM、约90mM至约110mM、约95mM至约105mM、约10mM至约50mM、约15mM至约45mM、约20mM至约40mM、约25mM至约35mM、约30mM至约35mM、约5mM至约45mM、约10mM至约40mM、约15mM至约35mM、约20mM至约30mM、约20mM至约25mM抗坏血酸钠)；和5mM至约150mM(例如，约10mM至约150mM、约20mM至约150mM、约30mM至约150mM、约40mM至约150mM、约50mM至约150mM、约60mM至约140mM、约70mM至约130mM、约80mM至约120mM、约90mM至约110mM、约95mM至约105mM、约30mM至约70mM、约35mM至约65mM、约40mM至约60mM、约45mM至约55mM、约20mM至约50mM、约25mM至约45mM、约30mM至约40mM、约30mM至约35mM、约5mM至约45mM、约10mM至约40mM、约15mM至约35mM、约20mM至约30mM或约20mM至约25mM)组氨酸。
任何所述组合物的非限定性实例含有(i)约75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甘露醇(例如，在缓冲的溶液中，例如，磷酸盐缓冲液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(ii)约75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)(例如，在缓冲的溶液中，例如，磷酸盐缓冲液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(iii)约75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)抗坏血酸钠(例如，在缓冲的溶液中，例如，磷酸盐缓冲液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(iv)约75mM至约125mM(例如，约80mM至约120mM、约85mM至约115mM、约90mM至约110mM或约95mM至约105mM)组氨酸(例如，在缓冲的溶液中，例如，磷酸盐缓冲液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(v)约30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)和约30mM至约70mM(例如，约35mM至约65mM、约40mM至约60mM或约45mM至约55mM)组氨酸(例如，在缓冲的溶液中，例如，磷酸盐缓冲液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)；(vi)约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM、约25mM至约35mM或约30mM至约35mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)，约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM、约25mM至约35mM或约30mM至约35mM)组氨酸和约10mM至约50mM(例如，约15mM至约45mM、约20mM至约40mM、约25mM至约35mM或约30mM至约35mM)抗坏血酸钠(例如，在缓冲的溶液中，例如，磷酸盐缓冲液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)；或(vii)约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM、约20mM至约30mM或约23mM至约27mM)抗坏血酸钠，约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM、约20mM至约30mM或约23mM至约27mM)甲硫氨酸(或者是半胱氨酸或谷胱甘肽)，约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM、约20mM至约30mM或约23mM至约27mM)甘露醇，和约5mM至约45mM(例如，约10mM至约40mM、约15mM至约35mM、约20mM至约30mM或约23mM至约27mM)组氨酸(例如，在缓冲的溶液中，例如，磷酸盐缓冲液，如50mM磷酸钠，pH 6.0)。
足以降低本文提供的任何组合物的生物负荷的非限定性γ-照射剂量在下文描述。足以降低本文提供的任何组合物的生物负荷的其他γ-照射剂量是本领域已知的。例如，本文所述的任何组合物可以以本文所述的任何剂量、以任何γ-照射剂量率和/或以任何用于进行γ-照射的温度(以任何组合)进行γ-照射。可以测定组合物的生物负荷，例如，通过从可能含有组合物中存在的自复制生物污染物的组合物取得样品，例如，通过消化(stomaching)、超声处理、摇动、涡旋振荡混合、冲刷(flushing)、混合或擦拭(swabbing)，并量化或定量样品中存在的自复制生物污染物的水平(例如，通过将样品置于生长培养基中，所述生长培养基会允许生物污染物自复制，例如，将样品涂板在培养皿上，或使样品运行通过膜)。
可以测定足以改善所述层析树脂在用足以降低组合物的生物负荷的γ-照射剂量处理之时的结合能力损失的量，例如，使用实施例中描述的方法。例如，可以将在一定量的至少一种抗氧化剂和/或螯合剂存在下用γ-照射处理的层析树脂的结合能力降低的水平与不存在所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的情况下用相同剂量的γ-照射处理的层析树脂的结合能力降低的水平相比，其中与不存在所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的情况下经γ-照射的层析树脂相比在所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂存在下经γ-照射的层析树脂的结合能力降低的水平的减少，表明所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善层析树脂用γ-照射处理之时结合能力损失的量存在。用于测定层析树脂的结合能力的示例性方法在实施例中描述。用于测定层析树脂的结合能力的方法的其他实例是本领域已知的。
降低层析树脂的生物负荷的方法
本文提供降低层析树脂的生物负荷的方法。这些方法包括将包含含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量的步骤，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在暴露于所述γ-照射剂量之后(或之时)的结合能力损失的量存在。
还提供降低层析树脂的生物负荷的方法，其包括将包括含有层析树脂(和任选的足以改善所述层析树脂在暴露于γ-照射之后/之时的结合能力损失的量的至少一种抗氧化剂和/或螯合剂)的组合物的容器暴露于约0.1kGy/小时至约6kGy/小时(例如，约0.1kGy/小时至约5.5kGy/小时、约0.1kGy/小时至约5.0kGy/小时、约0.1kGy/小时至约4.5kGy/小时、约0.1kGy/小时至约4.0kGy/小时、约0.1kGy/小时至约3.5kGy/小时、约0.1kGy/小时至约3.0kGy/小时、约0.1kGy/小时至约2.5kGy/小时、约0.1kGy/小时至约2.0kGy/小时、约0.1kGy/小时至约1.5kGy/小时、约0.1kGy/小时至约1.0kGy/小时、约0.5kGy/小时至约6kGy/小时、约0.5kGy/小时至约5.5kGy/小时、约0.5kGy/小时至约5.0kGy/小时、约0.5kGy/小时至约4.5kGy/小时、约0.5kGy/小时至约4.0kGy/小时、约0.5kGy/小时至约3.5kGy/小时、约0.5kGy/小时至约3.0kGy/小时、约0.5kGy/小时至约2.5kGy/小时、约0.5kGy/小时至约2.0kGy/小时)的剂量率和/或在约4℃至约25℃(例如，约4℃至约20℃、约4℃至约15℃、约4℃至约10℃、约10℃至约25℃、约10℃至约20℃、约10℃至约15℃或约15℃至约25℃)的温度下的γ-照射，进行足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量。在本段所述的方法中，通过这些方法产生的经γ-照射的层析树脂的结合能力水平高于以超过6.1kGy/小时的剂量率和/或在超过25℃的温度下的一种或两种条件下进行γ-照射的经γ-照射的层析树脂的结合能力水平。
可以将层析树脂使用本领域已知的方法暴露于γ-照射。例如，同位素如钴-60或铯-137可用作γ-射线的来源。可将所述层析树脂在约-25℃至约0℃(含端点)或约0℃至约25℃(含端点)的温度下暴露于γ-照射。可将所述层析树脂暴露于约0.1kGy至约100kGy、约1kGy至约100kGy、约1kGy至约90kGy、约1kGy至约80kGy、约1kGy至约70kGy、约1kGy至约65kGy、约5kGy至约65kGy、约10kGy至约60kGy、约10kGy至约55kGy、约10kGy至约50kGy、约10kGy至约45kGy、约10kGy至约40kGy、约10kGy至约35kGy、约10kGy至约30kGy、约15kGy至约50kGy、约15kGy至约45kGy、约15kGy至约40kGy、约15kGy至约35kGy、约20kGy至约30kGy或约23kGy至约27kGy的γ-照射剂量。可以将所述层析树脂暴露于足以导致所述层析树脂的无菌性保证水平为大约或小于1x 10-6、大约或小于1x 10-7、大约或小于10x 10-8、大约或小于1x 10-11或大约或小于1x 10-12或约1x 10-6至约1x 10-12、约1x 10-6至约1x 10-11、约1x 10-6至约1x 10-10、约1x 10-6至约1x 10-9、约1x 10-6至约1x 10-8、1x 10-6至约1x 10-7、约1x 10-7至约1x 10-12、约1x 10-7至约1x 10-11、约1x 10-7至约1x 10-10、约1x 10-7至约1x 10-9、约1x10-7至约1x 10-8、约1x 10-8至约1x 10-12、约1x 10-8至约1x 10-11、约1x 10-8至约1x 10-10或约1x 10-8至约1x 10-9的剂量的γ-照射。
足以降低层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量可以使用本领域已知的方法测定。例如，可将使用一定剂量的γ-照射处理的层析树脂的生物负荷水平与未经处理的(例如，对照的、非-γ-照射的)层析树脂的生物负荷水平比较，并且与所述未经处理的层析树脂相比经γ-照射的层析树脂中生物负荷水平的减少表明所述γ-照射剂量足以降低层析树脂的生物负荷。本文描述了用于测定组合物(例如，层析树脂)中生物负荷水平的示例性方法。用于测定组合物(例如，层析树脂)中生物负荷水平的其他方法是本领域已知的。
任何这些方法中的层析树脂可以是阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、尺寸排阻层析树脂、疏水相互作用层析树脂或亲和层析树脂，或其任何组合。亲和层析树脂的非限定性实例可以包括蛋白质或肽配体(例如，约5个氨基酸至约100个氨基酸、约5个氨基酸至约90个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、约5个氨基酸至约70个氨基酸、约5个氨基酸至约60个氨基酸、约5个氨基酸至约50个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约25个氨基酸或约5个氨基酸至约20个氨基酸)、小分子底物或酶的辅因子、适体、抑制剂(例如，竞争性蛋白抑制剂)或金属。在一些实施方案中，所述亲和层析树脂包括蛋白质配体(例如，蛋白A)。亲和层析树脂的其他实例包括辅因子配体、底物配体、金属配体、产物配体或适体配体。在一些实例中，所述层析树脂是双模态(biomodal)层析树脂(例如，阴离子交换层析树脂和疏水相互作用层析树脂)。所述层析树脂可以是阴离子交换层析树脂(例如，包括N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。
包含层析树脂的容器可以是塑料容器(例如，圆柱形管、密封的或夹紧的盒或密封袋)。这些方法中使用的容器的非限定性实例包括储存容器或层析柱。例如，包括所述层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物可以存在于密封的容器中(例如，密封的容器中的浆料或密封的容器(例如，层析柱)中的装填的层析树脂)。本文所述的方法中使用的容器可以是一次性层析柱。在一些实施方案中，本文所述的方法中使用的容器是置于吸塑包装(blister pack)中的一次性层析柱。所述容器(例如，储存容器或层析柱)可以具有约1mL至约1L(例如，约1mL至约900mL、约1mL至约800mL、约1mL至约700mL、约1mL至约600mL、约1mL至约500mL、约1mL至约450mL、约1mL至约400mL、约1mL至约350mL、约1mL至约300mL、约1mL至约250mL、约1mL至约200mL、约1mL至约150mL、约1mL至约100mL、约1mL至约75mL、约1mL至约50mL、约1mL至约40mL、约1mL至约30mL或约1mL至约20mL)的内部总容积。
所述容器中包含的含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物可以存在于固体混合物(例如，干燥的或润湿的固体混合物)中。例如，所述容器可以包括沉降的层析树脂在含有至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体(例如，缓冲的溶液)中的浆料。例如，包含含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或层析树脂的组合物的容器是装填的层析柱(例如，其中所述树脂装填在含有至少一种抗氧化剂和/或层析树脂的液体(例如，缓冲的溶液)中)。一些实施方案包括，在暴露之前，将所述含有层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物置于所述容器中。
本文所述的任何抗氧化剂和/或螯合剂可以以任何组合使用，使用本文所述的示例性浓度的任何组合。例如，所述组合物可以包括选自还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑素、番茄红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸盐、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、羟基苯丙酸甲酯类、利度卡因、柚苷配基(naringenin)、富勒烯(fullerene)、葡萄糖、甘露醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和二甲基甲氧基苯丙二氢吡喃醇的至少一种抗氧化剂和/或选自EDTA、DMPS、DMSA、金属硫蛋白和去铁胺的至少一种螯合剂。
本文描述了用于测定/鉴定足以改善所述层析树脂在用足以降低所述组合物的生物负荷的γ-照射剂量处理之时的结合能力损失的至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的量的示例性方法。用于测定/鉴定足以改善所述层析树脂在用足以降低所述组合物的生物负荷的γ-照射剂量处理之时的结合能力损失的至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的量的其他方法是本领域已知的。
本文还提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的层析树脂(例如，储存容器，例如，密封的储存容器中提供的生物负荷降低的层析树脂)。使用本文所述的任何方法生成的生物负荷降低的层析树脂可以具有大约或小于1x 10-6、大约或小于1x 10-7、大约或小于10x 10-8、大约或小于1x 10-11,或大约或小于1x 10-12或约1x 10-6至约1x 10-12、约1x 10-6至约1x 10-11、约1x 10-6至约1x 10-10、约1x 10-6至约1x 10-9、约1x 10-6至约1x10-8,1x 10-6至约1x 10-7、约1x 10-7至约1x 10-12、约1x 10-7至约1x 10-11、约1x 10-7至约1x10-10、约1x 10-7至约1x 10-9、约1x 10-7至约1x 10-8、约1x 10-8至约1x 10-12、约1x 10-8至约1x 10-11、约1x 10-8至约1x 10-10或约1x 10-8至约1x 10-9的无菌性保证水平。当使用相同的蛋白质来测试通过本文所述的方法产生的层析树脂和对照的未经处理的层析树脂二者的结合能力时，通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的层析树脂可具有未经降低其生物负荷的处理(例如，未经γ-照射)的相同层析树脂的结合能力的至少74％(例如，至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)或约74％至95％、约74％至约95％、约76％至约95％、至少约78％至约95％、约80％至约95％或约74％至约90％、约76％至约90％、约78％至约90％或约80％至约90％的结合能力。
制备生物负荷降低的装填的层析柱的方法
本文还提供制备降低的装填层析柱的方法，其包括提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的层析树脂并将所述层析树脂在无致病菌或生物负荷降低的环境中装填至生物负荷降低的柱中。在一些实施方案中，生物负荷降低的装填的层析柱可以通过将包含装填的层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的柱暴露于足以降低所述柱和所述装填的层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量来产生，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述装填的层析树脂在暴露于所述γ-照射剂量之后的结合能力损失的量存在。
还提供通过本文所述的方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。通过本文所述的方法产生的任何生物负荷降低的装填的层析柱可以具有大约或小于1x 10-6、大约或小于1x 10-7、大约或小于10x 10-8、大约或小于1x 10-11或大约或小于1x 10-12，或约1x 10-6至约1x 10-12、约1x 10-6至约1x 10-11、约1x 10-6至约1x 10-10、约1x 10-6至约1x 10-9、约1x 10-6至约1x 10-8、1x 10-6至约1x 10-7、约1x 10-7至约1x 10-12、约1x 10-7至约1x 10-11、约1x 10-7至约1x 10-10、约1x 10-7至约1x 10-9、约1x 10-7至约1x 10-8、约1x 10-8至约1x 10-12、约1x10-8至约1x 10-11、约1x 10-8至约1x 10-10或约1x 10-8至约1x 10-9的无菌性保证水平。通过本文所述的方法产生的任何生物负荷降低的装填的层析柱可以含有至少一种选自下组的层析树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂(例如，本文所述的或本领域已知的亲和层析树脂)、亲水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。例如，本文所述的任何生物负荷降低的装填的层析柱可以包括亲和层析树脂，所述亲和层析树脂包括蛋白质配体(例如，蛋白A)。本文所述的生物负荷降低的装填的层析柱可以包括阴离子交换层析树脂(例如，包括N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。
进行生物负荷降低的层析的方法
本文描述的方法包括使用本文提供的生物负荷降低的装填的层析柱，并且本文所述的工艺包括使用包括至少一个本文提供的生物负荷降低的装填的层析柱的一个或多个MCCS。经γ-照射的层析树脂可以是本文所述的任何类型的树脂(或本领域已知的任何类型的层析树脂)。
生物负荷降低的装填的层析柱可以使用本文所述的任何方法制备。例如，生物负荷降低的装填的层析柱可以通过用包含层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物(例如，本文所述的任何这类组合物)装填层析柱，并将所述装填的柱暴露于γ-照射(例如，使用本文所述的任何暴露和条件)来产生。在其他实例中，所述生物负荷降低的装填的层析柱可以通过将包含层析树脂和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的容器暴露于一定剂量的γ-照射并用所得的生物负荷降低的层析树脂装填层析柱来产生。在这类方法中，层析树脂(在暴露于γ-照射的过程中存在于容器内)可以作为容器中的浆料存在，并且将所述层析柱在生物负荷降低的通风橱(hood)中装填。在其他方法中，可以将与至少一种抗氧化剂和/或螯合剂一起存在于容器中的层析树脂作为所述容器中的固体混合物暴露于γ-照射，并且可以使用生物负荷降低的缓冲液制备所得的生物负荷降低的层析树脂的浆料(例如，在生物负荷降低的通风橱中制备)，并且将所得的浆料用于在生物负荷降低的通风橱中装填层析柱。在这些实例中的一些中，所述层析柱，在装填之前，可以经处理以降低生物负荷(例如，经高压灭菌、经γ-照射或暴露于环氧乙烷)。
在本文所述的任何方法中使用的生物负荷降低的装填的层析柱具有约1x 10-3至约1x 10-12、约1x 10-4至约1x 10-12、1x 10-5至约1x 10-11、约1x 10-5至约1x 10-10、约1x 10-5至约1x 10-9、约1x 10-6至约1x 10-9或约1x 10-6至约1x 10-8(含端点)的无菌性保证水平(SAL)。
生物负荷降低的缓冲液
本文所述的方法和工艺可以使用一种或多种生物负荷降低的缓冲液进行。正如本领域能够理解的，生物负荷降低的缓冲液可以是层析循环中使用的任何类型的缓冲液(例如，在层析循环的任何步骤中或在本文所述的任何单元操作中使用的缓冲液)。用于降低缓冲液的生物负荷的示例性方法包括过滤(0.2μm-孔径过滤)、高压灭菌和γ-照射。用于降低缓冲液的生物负荷的其他方法是本领域已知的。生物负荷降低的缓冲液可以具有约1x 10-3至约1x 10-12、约1x 10-4至约1x 10-12、1x 10-5至约1x 10-11、约1x 10-5至约1x 10-10、约1x10-5至约1x 10-9、约1x 10-6至约1x 10-9或约1x 10-6至约1x 10-8(含端点)的无菌性保证水平。
重组治疗性蛋白
本文所述的重组蛋白可以是重组治疗性蛋白。可以通过本文提供的方法产生的重组治疗性蛋白的非限定性实例包括免疫球蛋白(包括轻链和重链免疫球蛋白、抗体或抗体片段(例如本文所述的任何抗体片段)、酶(例如半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶)、或)、蛋白质(例如，人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)或干扰素α或β)或免疫原性或抗原性蛋白或蛋白片段(例如，用于在疫苗中使用的蛋白质)。可以用于治疗多种溶酶体贮积病的重组治疗性酶的非限定性实例示于图10。所述重组治疗性蛋白可以是包括至少一个多功能重组蛋白支架的工程化的抗原结合多肽(参见，例如，Gebauer等，Current Opin.Chem.Biol.13:245-255,2009中描述的重组抗原结合蛋白；和美国专利申请公开号2012/0164066(通过提述将其整体并入本文))。属于抗体的重组治疗性蛋白的非限定性实例包括：帕尼单抗(panitumumab)、奥马佐单抗(omalizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、Actoxumab、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、Afutuzumab、Alacizumab、Alacizumab、阿仑单抗(alemtuzumab)、Alirocumab、阿妥莫单抗(altumomab)、Amatuximab、Anatumomab、阿泊珠单抗(apolizumab)、Atinumab、托珠单抗(tocilizumab)、Basilizimab、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比西单抗(biciromab)、Canakinumab、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、Densumab、依库珠单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、Etaracizumab、戈利木单抗(golimumab)、英利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)和曲妥单抗(trastuzumab)。可以通过本文所述的方法产生的重组治疗性抗体的其他实例是本领域已知的。可以通过本发明方法产生/纯化的重组治疗性蛋白的其他非限定性实例包括：阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、Laronidase、阿贝西普(abatacept)、加硫酶(galsulfase)、促黄体素α(lutropin alfa)、抗血友病因子(antihemophilic factor)、Agalsidase beta、干扰素β-1a、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、替奈普酶(tenecteplase)、依那西普(etanercept)、凝血因子IX(coagulation factor IX)、促卵泡激素(follicle stimulating hormone)、干扰素β-1a、伊米苷酶(imiglucerase)、阿法链道酶(dornase alfa)、阿法依泊汀(epoetin alfa)和阿替普酶(alteplase)。
分泌的、可溶性重组治疗性蛋白可以通过将液体培养基从细胞(例如，哺乳动物细胞)去除或以其他物理方式分离来从液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)回收。用于将液体培养基从细胞(例如，哺乳动物细胞)去除的多种不同的方法是本领域已知的，包括例如，离心、过滤、移液和/或吸取。然后可以将分泌的重组治疗性蛋白使用多种生物化学技术从液体培养基回收并纯化，所述生物化学技术包括多种类型的层析(例如，亲和层析、分子筛层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或疏水相互作用层析，或其任何组合)和/或过滤(例如，分子量截留过滤)。
层析的循环
正如本领域所公知的，层析循环中的步骤可以取决于层析树脂、用于进行循环的每个步骤的缓冲液和目标重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的生物物理特征而变化。例如，亲和层析柱可以包括用包含目标重组蛋白的流体加载所述亲和层析柱、清洗所述柱以去除不想要的生物材料(例如，污染性蛋白质和/或小分子)、洗脱与所述柱结合的目标重组蛋白和重新平衡所述柱的步骤。使用阳离子和/或阴离子交换层析柱的层析循环(其中目标重组蛋白在加载步骤中与层析树脂结合)可以包括用包含目标蛋白的流体加载所述柱、清洗所述柱以去除不想要的生物材料、洗脱与所述柱结合的目标重组蛋白和重新平衡所述柱的步骤。在其他实例中，使用阳离子和/或阴离子交换层析柱的层析循环(其中不想要的生物材料在加载步骤过程中与层析树脂结合，而目标重组蛋白则不)可以包括用包含目标蛋白的流体加载所述柱、收集流过物(flow-through)中的目标重组蛋白和重新平衡所述柱的步骤。正如本领域所公知的，层析循环中的任何单一步骤可以包括单一缓冲液或多种缓冲液(例如，两种或更多种缓冲液)，并且层析循环中的一个或多个任何单一步骤可以包括缓冲液梯度。单一层析循环的多个公知的方面的任何组合可以以任何组合用于这些方法中，例如，不同的层析树脂、流速、缓冲液、柱的空隙体积、柱的柱床体积、每个步骤中使用的缓冲液体积、包含目标蛋白的流体的体积和每个步骤中使用的缓冲液的数目和类型。
进行生物负荷降低的柱层析的方法
本文提供进行生物负荷降低的层析的方法。这些方法包括提供使用本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱，和使用所述生物负荷降低的装填的层析柱进行柱层析。所述生物负荷降低的装填的层析柱可以以任何组合包括本文所述的任何层析树脂中的至少一种。例如，生物负荷降低的装填的层析柱中存在的层析树脂可以是包括蛋白质配体(例如，蛋白A)的亲和树脂或可以包括阴离子交换层析树脂。所述生物负荷降低的装填的层析柱可以具有任何本文所述的示例性内部容积。所述生物负荷降低的装填的层析柱可以具有本文所述的或本领域已知的任何形状(例如，圆柱体、近似圆柱形或椭球形)。这些方法中进行的柱层析可用于纯化或分离重组蛋白(例如，本文所述的或本领域已知的任何重组治疗性蛋白)。在一些实例中，所述生物负荷降低的装填的层析柱是多重柱层析系统(MCCS)的一部分，例如，可以是周期性逆流层析系统(PCCS)的一部分。
进行的柱层析可以包括本文所述的或本领域已知的至少一个层析循环。例如，所述至少一个层析循环可以包括下列步骤：通过使层析树脂暴露于包含重组蛋白的液体来捕获重组蛋白；通过使层析树脂暴露于清洗缓冲液来清洗层析树脂，通过使层析树脂暴露于洗脱缓冲液来洗脱所述重组蛋白；和通过使层析树脂暴露于再生缓冲液来再生所述层析树脂。在一些实例中，包含重组蛋白的液体是液体培养基(例如，从灌注或分批培养物收集的液体培养基)或稀释的液体培养基(例如，稀释于缓冲液中的培养基)。
可以使用封闭且一体化的系统(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性封闭且一体化的系统)进行柱层析。例如，可以使用封闭且一体化的系统进行柱层析，其中所述缓冲液是生物负荷降低的缓冲液。正如本领域所公知的，生物负荷降低的缓冲液可以使用多种不同的方法产生(例如，通过过滤、通过高压灭菌或热处理来制备)。
所述柱层析可以包括两个或更多个(例如，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个，6个或更多个，7个或更多个，8个或更多个，9个或更多个，10个或更多个，11个或更多个，12个或更多个，13个或更多个，14个或更多个，15个或更多个，20个或更多个，25个或更多个，30个或更多个，35个或更多个，40个或更多个，45个或更多个，50个或更多个，55个或更多个，60个或更多个，65个或更多个，70个或更多个，75个或更多个，80个或更多个，85个或更多个，90个或更多个，95个或更多个或100个或更多个)层析循环。在一些实例中，所述柱层析在至少3天(例如，至少4天，至少5天，至少6天，至少7天，至少8天，至少9天，至少10天，至少11天，至少12天，至少13天，至少14天，至少15天，至少16天，至少17天，至少18天，至少19天，至少20天，至少21天，至少22天，至少23天，至少24天，至少25天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天，至少50天，至少55天，至少60天，至少65天，至少70天，至少75天，至少80天，至少85天，至少90天，至少95天或至少100天)的一段时间内连续进行。
在一些实施方案中，生物负荷降低的装填的层析柱中的层析树脂与未用γ-照射处理的相同树脂相比(当使用相同的蛋白质测试两种树脂的结合能力时)(例如，在暴露于γ-照射之后立刻评估)具有约75％至约100％(例如，约76％至约98％，约76％至约96％，约76％至约94％，约76％至约92％，约76％至约90％，约78％至约100％，约78％至约98％，约78％至约96％，约78％至约94％，约78％至约92％，约78％至约90％，约80％至约100％，约80％至约98％，约80％至约96％，约80％至约94％，约80％至约92％，约80％至约90％，约82％至约100％，约82％至约98％，约82％至约96％，约82％至约94％，约82％至约92％，约82％至约90％，约84％至约100％，约84％至约98％，约84％至约96％，约84％至约94％，约84％至约92％，约84％至约90％，约86％至约100％，约86％至约98％，约86％至约96％，约86％至约94％，约86％至约92％，约88％至约100％，约88％至约98％，约88％至约96％，约88％至约94％，约90％至约100％，约90％至约98％，约90％至约96％，约92％至约100％或约92％至约98％)的百分比结合能力。
用于制造重组蛋白的一体化、封闭或基本上封闭且连续的工艺
本文提供用于制造重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的一体化、封闭或基本上封闭且连续的工艺。这些工艺包括提供基本上不含细胞的包含重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的液体培养基。
一些工艺包括将液体培养基连续进料至多重柱层析系统(MCCS)，所述多重柱层析系统(MCCS)包括至少一个本文提供的生物负荷降低的装填的层析柱，其中这些工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物物质)。
一些工艺包括将液体培养基连续进料至第一MCCS(MCCS1)，使用所述MCCS1从所述液体培养基中捕获重组蛋白，产生包含所述重组蛋白的MCCS1的洗脱物并将所述洗脱物连续进料至第二MCCS(MCCS2)中，并将来自所述洗脱物的重组蛋白连续进料至所述MCCS2中并随后将所述重组蛋白洗脱，由此产生纯化的重组蛋白，其中所述MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱是本文提供的生物负荷降低的装填的层析柱，所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至所述纯化的重组蛋白。
在一些实例中，MCCS、MCCS1和/或MCCS2中使用的每个层析柱是本文提供的生物负荷降低的装填的层析柱。一些实施方案进一步包括将所述纯化的重组蛋白配制成药物组合物的步骤。
本文所述的工艺提供从包含重组蛋白的液体培养基连续且省时地产生纯化的重组蛋白。例如，在将包含治疗性蛋白的液体培养基进料至MCCS或MCCS1中和将重组蛋白从MCCS或MCCS1洗脱之间分别经过的时间可以是，例如，约4个小时至约48个小时(含端点)，例如，约4个小时至约40个小时，约4个小时至约35个小时，约4个小时至约30个小时，约4个小时至约28个小时，约4个小时至约26个小时，约4个小时至约24个小时，约4个小时至约22个小时，约4个小时至约20个小时，约4个小时至约18个小时，约4个小时至约16个小时，约4个小时至约14个小时，约4个小时至约12个小时，约6个小时至约12个小时，约8个小时至约12个小时，约6个小时至约20个小时，约6个小时至约18个小时，约6个小时至约14个小时，约8个小时至约16个小时，约8个小时至约14个小时，约8个小时至约12个小时，约10个小时至20个小时，约10个小时至18个小时，约10个小时至16个小时，约10个小时至14个小时，约12个小时至约14个小时，约10个小时至约40个小时，约10个小时至约35个小时，约10个小时至约30个小时，约10个小时至约25个小时，约15个小时至约40个小时，约15个小时至约35个小时，约15个小时至约30个小时，约20个小时至约40个小时，约20个小时至约35个小时或约20个小时至约30个小时(含端点)。在其他实例中，在将包含重组蛋白的液体培养基进料至MCCS或MCCS1和将所述重组蛋白从MCCS或MCCS2洗脱之间分别经过的时间是，例如，大于约4个小时且小于约40个小时(含端点)，例如，大于约4个小时且小于约39个小时，约38个小时，约37个小时，约36个小时，约35个小时，约34个小时，约33个小时，约32个小时，约31个小时，约30个小时，约29个小时，约28个小时，约27个小时，约26个小时，约25个小时，约24个小时，约23个小时，约22个小时，约21个小时，约20个小时，约19个小时，约18个小时，约17个小时，约16个小时，约15个小时，约14个小时，约13个小时，约12个小时，约11个小时，约10个小时，约9个小时，约8个小时，约7个小时，约6个小时，约5个小时或约4.5个小时(含端点)。
可以在任何这些工艺中使用的MCCS(MCCS、MCCS1和/或MCCS2)的非限定性方面在美国临时专利申请序列号61/775,060和61/856,390中描述(各自通过提述并入本文)。
一些示例性工艺不使用保持步骤(例如，在整个工艺中不使用储器(例如，间歇罐(break tank)))。其他在整个工艺中可以使用最多1、2、3、4或5个储器(例如，间歇罐)。本文所述的任何工艺可以在整个工艺中使用最多1、2、3、4或5个储器(例如，间歇罐)，其中每个间歇罐只将重组蛋白保持总共例如约5分钟且小于约6个小时(含端点)，例如，约5分钟至约5个小时，约4个小时，约3个小时，约2个小时，约1个小时或约30分钟(含端点)的一段时间。
一些工艺使用一个、两个、三个、四个、五个或六个储器(例如，间歇罐)并且可以具有例如1mL至约300mL(含端点)，例如，1mL至约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(含端点)的容量。(在本文所述的任何工艺中)在将流体进料至MCCS或MCCS1之前用于保持所述流体的任何储器(例如，间歇罐)可以具有例如1mL至MCCS或MCCS1的第一柱的加载体积的约100％(含端点)，例如1mL至MCCS或MCCS1的第一柱的加载体积的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(含端点)的容量。储器(例如，间歇罐)可以用于在MCCS1的洗脱物进入MCCS2之前保持所述MCCS1的洗脱物并且可以具有例如，1mL至MCCS2的第一柱的加载体积的约100％(含端点)，例如，1mL至MCCS2的第一柱的加载体积的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(含端点)的容量。
这些工艺的多个其他方面在下文详细描述并且可以以任何组合没有限制地在本文提供的工艺中使用。所提供的工艺的示例性方面在下文描述；然而，本领域技术人员会理解可以为本文所述的工艺添加额外的步骤，并且可以将其他材料用于实施本文所述的工艺的任何步骤。
液体培养基
基本上不含细胞的包括重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的液体培养基可以源自任何来源。例如，所述液体培养基可以获得自重组细胞培养物(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞培养物)。所述液体培养基可以获得自补料分批细胞(例如，哺乳动物细胞)培养物(例如，包括分泌重组蛋白的哺乳动物细胞的培养物的补料分批生物反应器)或灌注细胞(例如，哺乳动物细胞)培养物(例如，包括分泌重组蛋白的哺乳动物细胞的培养物的灌注生物反应器)。所述液体培养基也可以是来自分泌重组蛋白的细菌或酵母细胞的培养物的澄清的液体培养基。
可以过滤或澄清获得自重组细胞培养物的液体培养基以获得基本上不含细胞和/或病毒的液体培养基。用于过滤或澄清液体培养基以去除细胞的方法是本领域已知的(例如，0.2-μm过滤和使用交替切向流(Alternating TangentialFlow(ATFTM))系统的过滤)。也可以使用离心并去除上清液(其为基本上不含细胞的液体培养基)，或通过允许细胞沉降至包括液体培养基的容器(例如，生物反应器)的重力底部并去除远离沉降的重组细胞的液体培养基(基本上不含细胞的液体培养基)来将重组细胞从液体培养基去除。
所述液体培养基可以获得自重组细胞(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞)的培养物，所述培养物产生本文所述的或本领域已知的任何重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)。本文所述的任何工艺的一些实例可以进一步包括培养产生重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)的重组细胞(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞)的步骤。
所述液体培养基可以是本文所述的或本领域已知的任何类型的液体培养基。例如，所述液体培养基可以选自下组：无动物来源组分的液体培养基、无血清的液体培养基、含血清的液体培养基、化学限定的液体培养基和无蛋白液体培养基。在本文所述的任何工艺中，获得自培养物的液体培养基可以通过在将其进料至MCCS或MCCS1之前添加第二流体(例如，缓冲液)来稀释。
基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基可以在将所述液体培养基进料至MCCS或MCCS1之前储存(例如，在约15℃以下(例如，约10℃以下，约4℃以下，约0℃以下，约-20℃以下，约-50℃以下，约-70℃以下或约-80℃以下)的温度)至少1天(例如，至少约2天，至少约5天，至少约10天，至少约15天，至少约20天或至少约30天)。或者，在一些实例中，将所述液体培养基直接从生物反应器进料至MCCS或MCCS1(例如，在过滤或澄清步骤之后从生物反应器直接进料至MCCS或MCCS1)。
多重柱层析系统
本文所述的工艺包括使用MCCS或两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)多重柱层析系统(MCCS)(例如，MCCS1和MCCS2)。MCCS可以包括两个或多个层析柱、两个或多个层析膜或至少一个层析柱和至少一个层析膜的组合。在非限定性实例中，MCCS(例如，本文的任何工艺中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)可以包括四个层析柱、三个层析柱和一个层析膜、三个层析柱、两个层析柱、两个层析膜，以及两个层析柱和一个层析膜。本领域技术人员可以预见层析柱和/或层析膜的组合的其他实例以供在MCCS(例如，本文所述的任何工艺中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中使用而没有限制。MCCS中存在的各个层析柱和/或层析膜可以是相同的(例如，具有相同的形状、容积/体积、树脂、捕获机制和单元操作)，或者可以是不同的(例如，具有不同的形状、容积/体积、树脂、捕获机制和/或单元操作中的一项或多项)。MCCS(例如，本文所述的任何工艺中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中存在的各个层析柱和/或层析膜可以进行相同的单元操作(例如，捕获、纯化或精制的单元操作)或不同的单元操作(例如选自，例如，捕获、纯化、精制、灭活病毒、调节离子包含重组蛋白的流体的浓度和/或pH和过滤的组的不同单元操作)。例如，在本文所述工艺的实例中，MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱和/或层析膜进行捕获重组蛋白的单元操作。
可以存在于MCCS(例如，存在于MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱可以具有例如，约1mL至约2mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL、约25mL、约30mL、约35mL、约40mL、约45mL、约50mL、约55mL、约60mL、约65mL、约70mL、约75mL、约80mL、约85mL、约90mL、约95mL或约100mL(含端点)的树脂体积。可以存在于MCCS(例如，存在于MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱可以具有约2mL至约100mL、约2mL至约90mL、约2mL至约80mL、约2mL至约70mL、约2mL至约60mL、约2mL至约50mL、约5mL至约50mL、约2mL至约45mL、约5mL至约45mL、约2mL至约40mL、约5mL至约40mL、约2mL至约35mL、约5mL至约35mL、约2mL至约30mL、约5mL至约30mL、约2mL至约25mL、约5mL至约25mL、约15mL至约60mL、约10mL至约60mL、约10mL至约50mL和约15mL至约50mL的树脂体积。在本文所述的任何工艺中使用的MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱可以具有基本上相同的树脂体积或者可以具有不同的树脂体积。用于MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中一个或多个层析柱的流速可以是例如约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5Ml/分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)。
MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱可以具有基本上相同的形状或者可以具有基本上不同的形状。例如，MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析柱可以基本上具有圆柱的形状或者可以基本上具有椭圆柱(oval cylinder)的相同形状。
可以存在于MCCS(例如，存在于MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中的一个或多个层析膜可以具有例如约1mL至约500mL(例如，约1mL至约475mL，约1mL至约450mL，约1mL至约425mL，约1mL至约400mL，约1mL至约375mL，约1mL至约350mL，约1mL至约325mL，约1mL至约300mL，约1mL至约275mL，约1mL至约250mL，约1mL至约225mL，约1mL至约200mL，约1mL至约175mL，约1mL至约150mL，约1mL至约125mL，约1mL至约100mL，约2mL至约100mL，约5mL至约100mL，约1mL至约80mL，约2mL至约80mL，约5mL至约80mL，约1mL至约60mL，约2mL至约60mL，约5mL至约60mL，约1mL至约40mL，约2mL至约40mL，约5mL至约40mL，约1mL至约30mL，约2mL至约30mL，约5mL至约30mL，约1mL至约25mL，约2mL至约25mL，约1mL至约20mL，约2mL至约20mL，约1mL至约15mL，约2mL至约15mL，约1mL至约10mL或约2mL至约10mL)的柱床体积(bed volume)。
在本文所述的任何工艺中，可以在使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2的过程中采用一种或多种(例如，三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十一种、二十二种、二十三种或二十四种)不同类型的生物负荷降低的缓冲液。正如本领域已知的，在本文所述工艺中的MCCS、MCCS1和/或MCCS2中使用的一种或多种类型的生物负荷降低的缓冲液会依赖于MCCS、MCCS1和/或MCCS2的层析柱和/或层析膜中存在的树脂、重组蛋白的生物物理性质和由MCCS、MCCS1和/或MCCS2的特定层析柱和/或层析膜进行的单元操作(例如，本文所述的任何示例性单元操作)。在本文所述的任何工艺中，在使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2的过程中采用的缓冲液的体积和类型也可以由本领域技术人员来确定(例如，在下文更详细讨论的)。例如，在本文所述的任何工艺中，在使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2的过程中采用的缓冲液的体积和类型可经选择以优化纯化的重组蛋白(例如，重组蛋白药物产品)中的以下一项或多项：重组蛋白的整体产率、重组蛋白的活性、重组蛋白的纯度水平和生物污染物从包含重组蛋白的流体(例如，液体培养基)的去除(例如，不含活性病毒、分枝杆菌、酵母、细菌或哺乳动物细胞)。
MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以是周期性逆流层析系统(PCCS)。例如，PCCS可以包括两个或多个层析柱(例如三个柱或四个柱)，切换所述柱以允许从所述两个或多个层析柱连续洗脱重组蛋白。PCCS可以包括两个或多个层析柱，两个或多个层析膜，或者至少一个层析柱和至少一个层析膜。柱操作(循环)通常由加载、清洗、洗脱和再生步骤组成。在PCCS中，使用多个柱以循环的方式离散地和连续地运行相同步骤。由于柱串联操作，来自一个柱的流过物和洗出物(wash)被另一个柱捕获。PCCS的这种独特的特征允许树脂的加载接近其静态结合能力而非动态结合能力(在分批模式层析过程中通常如此)。连续循环和洗脱的结果是进入PCCS的流体得到连续加工，并且连续产生包含重组蛋白的洗脱物。
在PCCS循环中采用柱切换策略从一个步骤推进至另一个。能够用于PCCS中的柱切换的实例在美国临时专利申请序列号61/775,060和61/856,390中描述。例如，柱切换方法可以采用每个柱两个的自动切换操作：其中第一个涉及初始产物的穿透(breakthrough)，而第二个与柱饱和吻合。确定何时应当进行柱切换操作可以通过监测PCCS中存在的每个层析柱的洗脱物中的重组蛋白浓度(例如，通过UV监测来进行的监测)来确定。例如，柱切换可以通过任何带有反馈控制的能够在线测量重组蛋白浓度的PAT工具来确定。所述PAT工具能够带有反馈控制地实时在线测量重组蛋白浓度。正如本领域已知的，柱切换也可以基于流体(例如，缓冲液)通过MCCS、MCCS1和/或MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜的时间和量来设计。
在PCCS中，可以在不增加柱/膜大小的前提下减少重组蛋白在PCCS中存在的每个层析柱和/或层析膜上的留驻时间(RT)，因为在PCCS中第一柱/膜的穿透物可以捕获在另一柱/膜上。连续工艺系统可以经设计通过改变柱/膜体积(V)和RT从而以任何灌注速率(D)加工液体培养基，其中使用等式：V＝D*RT。
能够由当前描述的工艺中使用的MCCS或MCC1和/或MCCS2进行的一个或多个单元操作包括，例如，捕获重组蛋白、灭活包含重组蛋白的流体中存在的病毒、纯化重组蛋白、精制重组蛋白、保持包含重组蛋白的流体(例如，使用本文所述的任何示例性间歇罐)、从包含重组蛋白的流体过滤或去除颗粒物质和/或细胞和调节包含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH。
在一些实施方案中，MCCS或MCCS1包括至少一个进行捕获重组蛋白的单元操作的层析柱和/或层析膜。捕获的单元操作可以使用至少一个层析柱和/或层析树脂进行，所述层析柱和/或层析树脂例如使用捕获机制。捕获机制的非限定性实例包括蛋白A-结合捕获机制、抗体-或抗体片段-结合捕获机制、底物-结合捕获机制、适体-结合捕获机制、标签-结合捕获机制(例如，基于多聚-His标签的捕获机制)和辅因子-结合捕获机制。捕获可以使用能够用于进行阳离子交换或阴离子交换层析、分子筛层析或疏水相互作用层析的树脂进行。本文描述了能够用于捕获重组蛋白的非限定性树脂。能够用于捕获重组蛋白的树脂的其他实例是本领域已知的。
灭活包含重组蛋白的流体中存在的病毒的单元操作可以使用MCCS、MCCS1和/或MCCS2(例如，其包括，例如，层析柱、层析膜或保持罐，其能够在约3.0至5.0(例如，约3.5至约4.5、约3.5至约4.25、约3.5至约4.0、约3.5至约3.8或约3.75)的pH下温育包含重组蛋白的流体一段至少30分钟的时间(例如，一段约30分钟至1.5小时的时间，一段约30分钟至1.25小时的时间，一段约0.75小时至1.25小时的时间或一段约1小时的时间))进行。
纯化重组蛋白的单元操作可以使用一个或多个MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)进行，所述MCCS包括，例如，包括树脂的层析柱或层析膜，例如，其使用捕获系统。捕获机制的非限定性实例包括蛋白A-结合捕获机制、抗体-或抗体片段-结合捕获机制、底物-结合捕获机制、适体-结合捕获机制、标签-结合捕获机制(例如，基于多聚-His标签的捕获机制)和辅因子-结合捕获机制。纯化也可以使用能够用于进行阳离子交换或阴离子交换层析、分子筛层析或疏水相互作用层析的树脂进行。本文描述了能够用于纯化重组蛋白的非限定性树脂。能够用于纯化重组蛋白的树脂的其他实例是本领域已知的。
精制重组蛋白的单元操作可以使用一个或多个MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)进行，所述MCCS包括，例如，包括树脂的层析柱或层析膜，例如，其可用于进行阳离子交换、阴离子交换、分子筛层析或疏水相互作用层析。本文描述了能够用于精制重组蛋白的非限定性树脂。能够用于精制重组蛋白的树脂的其他实例是本领域已知的。
保持包含重组蛋白的流体的单元操作可以使用MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)进行，所述MCCS包括至少一个储器(例如，间歇罐)或在MCCS或MCCS1和MCCS2中总共包括最多1、2、3、4或5个储器(例如，间歇罐)。例如，可以用于实现这一单元操作的储器(例如，间歇罐)可以各自具有约1mL至约1L(例如，约1mL至约800mL，约1mL至约600mL，约1mL至约500mL，约1mL至约400mL，约1mL至约350mL，约1mL至约300mL，约10mL至约250mL，约10mL至约200mL，约10mL至约150mL或约10mL至约100mL)的容积。在本文所述工艺中使用的储器(例如，间歇罐)可以具有例如1mL至约300mL(含端点)，例如，1mL至约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(含端点)的容量。(在本文所述的任何工艺中)用于在流体进入MCCS或MCCS1之前保持流体的任何储器(例如，间歇罐)可以具有例如1mL至所述MCCS或MCCS1的第一柱的加载体积的约100％(含端点)，约1mL至所述MCCS或MCCS1的第一柱的加载体积的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(含端点)的容量。用于在MCCS1的洗脱物(包含重组蛋白)进入MCCS2之前保持所述洗脱物的任何储器(例如，间歇罐)可以具有例如1mL至所述MCCS2的第一柱的加载体积的约100％(含端点)，例如，约1mL至所述MCCS2的第一柱的加载体积的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(含端点)的容量。
所述储器(例如，间歇罐)可各自保持包含重组蛋白的流体至少10分钟(例如，至少20分钟，至少30分钟，至少1小时，至少2小时，至少4小时或至少6小时)。在其他实例中，所述储器(例如，间歇罐)仅将重组蛋白保持总共例如，约5分钟并少于约6小时(含端点)，例如，约5分钟至约5小时，约4小时，约3小时，约2小时，约1小时或约30分钟(含端点)的一段时间。所述储器(例如，间歇罐)可用于同时保持和冷藏(例如，在低于25℃，低于15℃或低于10℃的温度下)含有重组蛋白的流体。所述储器可以具有任何形状，包括圆柱、椭圆柱或大致为矩形的密封且非渗透性的袋。
过滤包含重组蛋白的流体的单元操作可以使用包括例如滤器或层析柱或层析膜的MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)进行，所述层析柱或层析膜包括分子筛树脂。正如本领域已知的，多种多样的亚微米滤器(例如，具有小于1μm、小于0.5μm、小于0.3μm,约0.2μm、小于0.2μm、小于100nm、小于80nm、小于60nm、小于40nm、小于20nm或小于10nm的孔径的滤器)是本领域可得的，其能够去除任何沉淀的材料和/或细胞(例如，沉淀的、未折叠的蛋白质；沉淀的、不想要的宿主细胞蛋白；沉淀的脂质；细胞；酵母细胞；真菌细胞；分枝杆菌；和/或哺乳动物细胞)。已知具有约0.2μm或小于0.2μm的孔径的滤器从包含重组蛋白的流体有效去除细菌。正如本领域已知的，包括分子筛树脂的层析柱或层析膜也可以在MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中使用以进行过滤包含重组蛋白的流体的单元操作。
调节包含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH的单元操作可以使用MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)进行，所述MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)包括并使用缓冲液调节储器(例如，在线缓冲液调节储器)，其将新的缓冲溶液添加至包含重组蛋白的流体(例如，在MCCS、MCCS1和/或MCCS2内的柱之间，或在倒数第二个MCCS(例如，MCCS1)中的最后一个柱之后且在将包含重组蛋白的流体进料入下一MCCS(例如，MCCS2)的第一个柱之前)。正如本领域所理解的，在线缓冲液调整储器可以是任何尺寸(例如，大于100mL)并且可以包括任何缓冲的溶液(例如，具有下列一项或多项的缓冲的溶液：与包含重组蛋白的流体相比增加或减少的pH，与包含重组蛋白的流体相比增加或减少的离子(例如，盐)浓度，和/或与重组蛋白竞争与MCCS(例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2)中至少一个层析柱或至少一个层析膜中存在的树脂进行结合的作用剂的增加或减少的浓度。
所述MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以进行两种或多种单元操作。例如，所述MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以各自进行至少以下单元操作：捕获重组蛋白并灭活包含重组蛋白的流体中存在的病毒；捕获重组蛋白、灭活包含重组蛋白的流体中存在的病毒并调节包含重组蛋白的液体的离子浓度和/或pH；纯化重组蛋白并精制重组蛋白；纯化重组蛋白、精制重组蛋白并过滤包含重组蛋白的流体或从包含重组蛋白的流体去除沉淀物和/或颗粒物质；和纯化重组蛋白、精制重组蛋白、过滤包含重组蛋白的流体或从包含重组蛋白的流体去除沉淀物和/或颗粒物质并调节包含重组蛋白的液体的离子浓度和/或pH。
捕获重组蛋白
本工艺包括使用MCCS或MCCS1捕获重组蛋白的步骤。正如本领域所理解的，可以使用多种不同的方式将包含重组蛋白的液体培养基连续进料至MCCS或MCCS1。例如，可以将所述液体培养基主动泵入MCCS或MCCS1，或者可以使用重力将所述液体培养基进料入MCCS或MCCS1。可以将所述液体培养基在将其进料入MCCS或MCCS1之前储存在储器(例如，保持罐)中，或者可以将所述液体培养基从包含细胞(例如，将重组蛋白分泌入培养基的哺乳动物细胞)的培养物的生物反应器主动泵入MCCS或MCCS1。
可以将所述液体培养基以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟、约0.5mL/分钟至约20mL/分钟、约0.2mL/分钟至约15mL/分钟、约0.5mL/分钟至约15mL/分钟、约0.5mL/分钟至约10mL/分钟、约0.5mL分钟至约14mL/分钟、约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟、约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速进料(加载)入MCCS或MCCS1。所述包含重组蛋白的液体培养基可以源自本文所述的或本领域已知的任何示例性来源。
一些实例进一步包括在将其进料至MCCS或MCCS1之前过滤液体培养基的任选步骤。本文所述的任何过滤液体培养基或包含重组蛋白的流体的示例性手段，或本领域已知的任何过滤方式，可以用于在将其进料至MCCS或MCCS1之前过滤包含重组蛋白的液体培养基。
在本文所述的工艺中，从液体培养基捕获重组蛋白使用MCCS或MCCS1进行。正如本领域所理解的，为了实现对重组蛋白的捕获，MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱或至少一个层析膜必须包括使用捕获机制(例如，本文所述的任何示例性捕获机制)的树脂，或包括能够进行阳离子交换、阴离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂。例如，如果重组蛋白是抗体或抗体片段，那么所述捕获系统可以是蛋白A-结合捕获机制或抗体-结合捕获机制(其中捕获抗原由所述重组抗体或抗体片段特异性识别)。如果重组蛋白是酶，那么捕获机制可以使用特异性结合所述酶的抗体或抗体片段以捕获重组酶，使用酶的底物以捕获重组酶，使用酶的辅因子以捕获重组酶，或者，若重组酶包括标签，则使用特异性结合重组酶中存在的所述标签的蛋白质、金属螯合物或抗体(或抗体片段)。本文描述了能够用于捕获重组蛋白的非限定性树脂，并且能够用于捕获重组蛋白的其他树脂是本领域已知的。使用蛋白A-结合捕获机制的树脂的一个非限定性实例是Mab Select SuReTM树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ),JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203(Sunnyvale,CA)，和KanekaKanCap A(Osaka,Japan)。
本文描述了能够用于捕获重组蛋白的MCCS或MCCS1中存在的层析柱或层析膜的示例性非限定性大小和形状。进料(加载)至MCCS或MCCS1的液体培养基可以包括，例如，约0.05mg/mL至约100mg/mL重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL、约0.1mg/mL至约80mg/mL、约0.1mg/mL至约70mg/mL、约0.1mg/mL至约60mg/mL、约0.1mg/mL至约50mg/mL、约0.1mg/mL至约40mg/mL、约0.1mg/mL至约30mg/mL、约0.1mg/mL至约20mg/mL、0.5mg/mL至约20mg/mL、约0.1mg/mL至约15mg/mL、约0.5mg/mL至约15mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL或约0.5mg/mL至约10mg/mL重组蛋白)。重组蛋白结合至用于进行捕获单元操作的树脂所需的平均时间可以是，例如，约5秒至约10分钟(例如，约10秒至约8分钟，约10秒至约7分钟，约10秒至约6分钟，约10秒至约5分钟，约30秒至约5分钟，约1分钟至约5分钟，约10秒至约4分钟，约30秒至约4分钟或约1分钟至约4分钟)。
正如本领域所理解的，为了使用MCCS或MCCS1中存在的层析柱或层析膜捕获重组蛋白，必须进行加载、清洗、洗脱和再生MCCS或MCCS1中存在的层析柱或层析膜的贯序层析步骤。任何本文所述的示例性流速、缓冲液体积和/或为各个贯序层析步骤分配的时间长度可在这些不同的贯序层析步骤中的一步或多步中使用(加载、清洗、洗脱和再生用于捕获重组蛋白的MCCS或MCCS1中存在的层析柱或层析膜的贯序层析步骤中的一步或多步)。下文提供能够用于捕获MCCS或MCCS1(例如，PCCS或PCCS1)中的层析柱和/或层析膜的非限定性的流速、缓冲液体积和/或为各个贯序层析步骤分配的时间长度。另外，下文描述能够用于MCCS和/或MCCS1的示例性缓冲液。
包括至少一个包含能够进行捕获单元操作的树脂(例如，本文所述的能够用于捕获的任何示例性树脂)的层析柱和/或层析膜的MCCS或MCCS1可以使用上文所述的任何加载流速(进料速率)用包含重组蛋白的液体培养基加载。在一些实例中，包含能够进行捕获单元操作的树脂的单个层析柱或单个层析膜在例如，约10分钟至约90分钟(例如，约15分钟至约90分钟，约20分钟至80分钟，约30分钟至80分钟，约40分钟至约80分钟，约50分钟至约80分钟，和约60分钟至80分钟)中加载。在一些实例中，其中MCCS或MCCS1包括至少两个串联的包含能够进行捕获单元操作的树脂的层析柱，加载串联的所述两个层析柱所需的时间是，例如，约50分钟至约180分钟(例如，约60分钟至约180分钟，约70分钟至约180分钟，约80分钟至约180分钟，约90分钟至约180分钟，约100分钟至约180分钟，约110分钟至150分钟，和约125分钟至约145分钟)。
在将重组蛋白加载至包含能够进行捕获单元操作的树脂的MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱或层析膜上之后，将所述至少一个层析柱或层析膜用至少一种清洗缓冲液清洗。正如本领域所理解的，所述至少一种(例如，两种、三种或四种)清洗缓冲液旨在从所述至少一个层析柱或层析膜洗脱不是重组蛋白的全部或大部分蛋白质，同时不干扰所述重组蛋白与树脂的相互作用。
所述清洗缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟，约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速通过所述至少一个层析柱或层析膜。使用的清洗缓冲液的体积(例如，当使用超过一种清洗缓冲液时，清洗缓冲液的合并总体积)可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约15X CV(例如，约1X CV至约14X CV,约1X CV至约13X CV,约1X CV至约12X CV,约1X CV至约11X CV,约2X CV至约11X CV,约3X CV至约11XCV,约4X CV至约11X CV,约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。清洗的总时间可以是，例如，约2分钟至约3小时(例如，约2分钟至约2.5小时，约2分钟至约2.0小时，约5分钟至约1.5小时，约10分钟至约1.5小时，约10分钟至约1.25小时，约20分钟至约1.25小时或约30分钟至约1小时)。
在清洗包含能够进行捕获单元操作的树脂的MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱或层析膜之后，通过使洗脱缓冲液通过所述包含能够进行捕获单元操作的树脂的MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱或层析膜将重组蛋白从所述至少一个层析柱或层析膜洗脱。所述洗脱缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟,约0.5mL/分钟至约20mL/分钟,约0.2mL/分钟至约15mL/分钟,约0.5mL/分钟至约15mL/分钟,约0.5mL/分钟至约10mL/分钟,约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟,约1.0mL/分钟至约5.0mg/分钟,约0.5mL分钟至约14mL/分钟,约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速通过所述包含能够进行捕获单元操作的树脂的至少一个层析柱或层析膜。用于从所述包含能够进行纯化单元操作的树脂的至少一个层析柱或层析膜中的每一个洗脱重组蛋白的洗脱缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约15X CV(例如，约1X CV至约14X CV，约1X CV至约13X CV，约1X CV至约12X CV，约1X CV至约11X CV，约2X CV至约11X CV，约3X CV至约11X CV，约4X CV至约11X CV，约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。洗脱的总时间可以是，例如，约2分钟至约3小时(例如，约2分钟至约2.5小时，约2分钟至约2.0小时，约2分钟至约1.5小时，约2分钟至约1.5小时，约2分钟至约1.25小时，约2分钟至约1.25小时，约2分钟至约1小时，约2分钟至约40分钟，约10分钟至约40分钟或约20分钟至约40分钟)。能够用于这些方法中的洗脱缓冲液的非限定性实例会取决于捕获机制和/或重组蛋白。例如，洗脱缓冲液可以包含不同的盐浓度(例如，增加的盐浓度)、不同的pH(例如，增加的或减少的pH)或会与重组蛋白竞争结合能够进行捕获单元操作的树脂的分子。用于本文所述的各个示例性捕获机制的这些洗脱缓冲液的实例是本领域公知的。
在将重组蛋白从包含能够进行捕获单元操作的树脂的MCCS或MCCS1中的至少一个层析柱或层析膜洗脱之后，并且在将下一体积的液体培养基加载至所述至少一个层析柱或层析膜之前，必须施用再生缓冲液平衡所述至少一个层析柱或层析膜。所述再生缓冲液可以以例如，约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟，约1.0mL/分钟至约5.0mg/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟，约5.0mL/分钟至约15.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速通过包含能够进行捕获单元操作的树脂的至少一个层析柱或层析膜。用于平衡包含能够进行捕获单元操作的树脂的至少一个层析柱或层析膜的再生缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约15X CV(例如，约1X CV至约14X CV，约1X CV至约13X CV，约1X CV至约12X CV，约1X CV至约11X CV，约2X CV至约11XCV，约3X CV至约11X CV，约2X CV至约5X CV，约4X CV至约11X CV，约5X CV至约11X CV,或约5X CV至约10X CV)。
在本文所述的一些工艺中，MCCS或MCCS1包括储器，其将包含重组蛋白的流体保持在低pH(例如，低于4.6、低于4.4、低于4.2、低于4.0、低于3.8、低于3.6、低于3.4、低于3.2或低于3.0的pH)下例如，约1分钟至1.5小时(例如，约1小时)并灭活包含重组蛋白的流体中存在的病毒。能够用于进行灭活病毒的单元操作的储器的实例是搅拌瓶(例如，500-mL搅拌瓶,例如，带有搅拌板(stir plate)的500-mL搅拌瓶)，其能够将包含重组蛋白的流体保持例如约1分钟至1.5小时，例如，在将所述包含重组蛋白的流体进料至MCCS2之前。用于进行灭活病毒的单元操作的储器可以是带有程控的搅拌板(例如，程控以混合(例如，周期性混合)储器内的流体的搅拌板,例如，每4小时)的500-mL搅拌瓶。能够用于进行灭活病毒的单元操作的储器的另一实例是塑料袋(例如，500-mL塑料袋)，其能够将包含重组蛋白的流体保持例如约1分钟至1.5小时，例如，在将所述包含重组蛋白的流体进料至MCCS2之前。在一些实例中，所述包含重组蛋白的流体可能在将其进料至用于进行病毒灭活的单元操作的储器之时已经具有低pH(例如，低于4.6、低于4.4、低于4.2、低于4.0、低于3.8、低于3.6、低于3.4、低于3.2或低于3.0的pH)。正如本领域技术人员能够理解的，多种其他方式可以用于进行灭活病毒的单元操作。例如，UV照射包含重组蛋白的流体也可以用于进行灭活病毒的单元操作。本文描述了能够用于进行灭活包含重组蛋白的流体中存在的病毒的单元操作的储器的非限定性实例。
MCCS或MCCS1可以包括包含四个层析柱的PCCS，其中所述四个层析柱中的至少三个进行从液体培养基捕获重组蛋白的单元操作(例如，使用包含至少一个包含能够进行捕获单元操作的树脂的层析柱中任一种(例如，本文所述的那些中的任一种)的MCCS)。在这些实例中，PCC的第四柱可以进行灭活包含重组蛋白的流体中的病毒的单元操作(例如，能够用于实现包含重组蛋白的流体的病毒灭活的本文所述的任何示例性柱)。
在一些实例中，将包含重组蛋白的流体从MCCS1(例如，PCCS1)连续洗脱，并连续进料至MCCS2(例如，PCCS2)。在MCCS或MCCS1(例如，PCCS或PCCS1)的洗脱物中回收的重组蛋白的百分比可以是，例如，至少70％、至少72％、至少74％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％。可以将来自MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物使用本领域已知的多种方式(例如，管道(tubing))进料至MCCS2(例如，PCCS2)。可以将MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物以例如，约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟，约1.0mL/分钟至约5.0mg/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟，约5.0mL/分钟至约15.0mL/分钟，约15mL/分钟至约25mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速进料至MCCS2(例如，PCCS2)。
本文所述的一些工艺可以自进一步包括在将其进料至MCCS2(例如，PCCS2)之前调节来自MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物的离子浓度和/或pH的步骤。如本文所述，来自MCCS1(例如，PCCS1)的洗脱物的离子浓度和/或pH可以通过向所述洗脱物添加缓冲液(例如，通过使用在线缓冲液调节储器)来调节(在将其进料至MCCS2之前)。可以将缓冲液以例如约0.1mL/分钟至约15mL/分钟(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟，约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约6mL/分钟，约0.1mL/分钟至4mL/分钟或约0.5mL/分钟至约5mL/分钟)的流速添加至来自MCCS1的洗脱物。
本文所述的工艺可以进一步包括在将来自MCCS1的洗脱物进料至MCCS2之前保持或储存(和任选地还冷藏)来自MCCS1的洗脱物的步骤。如本文所述，这种保持或储存步骤可以使用本文所述的任何储器(例如，备份罐)进行。
本文所述的工艺也可以包括在将洗脱物进料至MCCS2之前过滤来自MCCS1的洗脱物的步骤。本文所述的用于过滤的任何示例性滤器或方法可用于在将洗脱物进料至MCCS2之前过滤来自MCCS1的洗脱物。
精制和纯化重组蛋白
MCCS、MCCS1和/或MCCS2可用于进行纯化和精制重组蛋白的单元操作。例如，MCCS2可用于进行纯化和精制重组蛋白的操作，并且来自MCCS2的洗脱物是蛋白药物物质。MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以包括能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个(例如，两个、三个或四个)层析柱或层析膜，和能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个(例如，两个、三个或四个)层析柱或层析膜。
能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜可以包括使用捕获机制(例如，本文所述的或本领域已知的任何捕获机制)的树脂，或能够用于进行阴离子交换、阳离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂。能够用于进行精制重组蛋白的操作单元的至少一个层析柱或层析膜可以包括能够用于进行阴离子交换、阳离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的树脂(例如，本文所述的或本领域已知的用于进行阴离子交换、阳离子交换、分子筛或疏水相互作用层析的任何示例性树脂)。
能够用于进行纯化重组蛋白的操作单元的至少一个层析柱或层析膜的大小、形状和体积，和/或能够用于进行精制重组蛋白的操作单元的至少一个层析膜的大小和形状可以是本文所述的层析柱或层析膜的示例性大小、形状和体积的任何组合。正如本领域技术人员所理解的，纯化或精制重组蛋白的步骤可以例如包括加载、清洗、洗脱和平衡用于进行纯化或精制重组蛋白的操作单元的至少一个层析柱或层析膜的步骤。通常，从用于进行纯化的单元操作的层析柱或层析膜流出的洗脱缓冲液包含重组蛋白。通常，从用于进行精制的单元操作的层析柱或层析膜流出的加载和/或清洗缓冲液包含重组蛋白。
例如，能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜的大小可以具有例如约2.0mL至约200mL(例如，约2.0mL至约180mL，约2.0mL至约160mL，约2.0mL至约140mL，约2.0mL至约120mL，约2.0mL至约100mL，约2.0mL至约80mL，约2.0mL至约60mL，约2.0mL至约40mL，约5.0mL至约40mL，约2.0mL至约30mL，约5.0mL至约30mL或约2.0mL至约25mL)的体积。包含重组蛋白的流体在将其加载至能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或至少一个层析膜上的流速可以是例如约0.1mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟，约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约6mL/分钟，约0.1mL/分钟至4mL/分钟，约0.1mL/分钟至约3mL/分钟，约0.1mL/分钟至约2mL/分钟或约0.2mL/分钟至约4mL/分钟)。加载至能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜上的流体中的重组蛋白的浓度可以是例如约0.05mg/mL至约100mg/mL重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL，约0.1mg/mL至约80mg/mL，约0.1mg/mL至约70mg/mL，约0.1mg/mL至约60mg/mL，约0.1mg/mL至约50mg/mL，约0.1mg/mL至约40mg/mL，约0.1mg/mL至约30mg/mL，约0.1mg/mL至约20mg/mL，0.5mg/mL至约20mg/mL，约0.1mg/mL至约15mg/mL，约0.5mg/mL至约15mg/mL，约0.1mg/mL至约10mg/mL或约0.5mg/mL至约10mg/mL重组蛋白)。用于进行纯化的单元操作的至少一个层析柱或层析膜中的树脂可以是能够用于进行阴离子交换或阳离子交换层析的树脂。用于进行纯化的单元操作的至少一个层析柱或层析膜中的树脂可以是阳离子交换树脂(例如，Capto-S树脂,GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)。
在将重组蛋白加载至能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜上之后，将所述至少一个层析柱或层析膜用至少一种清洗缓冲液清洗。正如本领域所理解的，所述至少一种(例如，两种、三种或四种)清洗缓冲液旨在从至少一个层析柱或层析膜洗脱不是重组蛋白的全部蛋白质，同时不干扰所述重组蛋白与树脂的相互作用，或者以其他方式洗脱所述重组蛋白。
清洗缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的速率通过至少一个层析柱或层析膜。使用的清洗缓冲液的体积(例如，当使用超过一种清洗缓冲液时，清洗缓冲液的合并总体积)可以是例如约1X柱体积(CV)至约15X CV(例如，约1X CV至约14X CV，约1X CV至约13X CV，约1X CV至约12X CV，约1X CV至约11X CV，约2X CV至约11X CV，约3X CV至约11X CV，约4XCV至约11X CV，约2.5X CV至约5.0X CV，约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。清洗的总时间可以是例如约2分钟至约3小时(例如，约2分钟至约2.5小时，约2分钟至约2.0小时，约5分钟至约1.5小时，约10分钟至约1.5小时，约10分钟至约1.25小时，约20分钟至约1.25小时，约30分钟至约1小时，约2分钟至10分钟，约2分钟至15分钟或约2分钟至30分钟)。
在清洗用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜之后，通过使洗脱缓冲液通过用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜来将重组蛋白从所述至少一个层析柱或层析膜洗脱。可以使洗脱缓冲液以约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟，约1.0mL/分钟至约5.0mg/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速通过能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜。用于将重组蛋白从能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜中的每一个洗脱的洗脱缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约25X CV(例如，约1X CV至约20X CV，约15X CV至约25X CV，约1X CV至约14X CV，约1X CV至约13X CV，约1X CV至约12X CV，约1X CV至约11X CV，约2XCV至约11X CV，约3X CV至约11X CV，约4X CV至约11X CV，约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。洗脱的总时间可以是例如约2分钟至约3小时(例如，约2分钟至约2.5小时，约2分钟至约2.0小时，约2分钟至约1.5小时，约2分钟至约1.5小时，约2分钟至约1.25小时，约2分钟至约1.25小时，约2分钟至约1小时，约2分钟至约40分钟，约10分钟至约40分钟，约20分钟至约40分钟或约30分钟至1.0小时)。可以在这些方法中使用的洗脱缓冲液的非限定性实例会取决于树脂和/或重组蛋白的生物物理性质。例如，洗脱缓冲液可以包含不同浓度的盐(例如，增加的盐浓度)、不同的pH(例如，增加的或减少的pH)或会与重组蛋白竞争结合至树脂的分子。用于本文所述的各种示例性捕获机制的这些洗脱缓冲液的实例是本领域公知的。
在将重组蛋白从用于进行纯化所述重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜洗脱之后，并且在下一体积包含重组蛋白的流体能够加载至所述至少一个层析柱或层析膜之前，必须使用再生缓冲液平衡所述至少一个层析柱或层析膜。所述再生缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL/分钟至约6.0mL/分钟，约1.0mL/分钟至约5.0mg/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟，约5.0mL/分钟至约15.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速通过用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜。用于平衡包括能够用于进行纯化重组蛋白的单元操作的树脂的至少一个层析柱或层析膜的再生缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约15X CV(例如，约1XCV至约14X CV，约1X CV至约13X CV，约1X CV至约12X CV，约1X CV至约11X CV，约2X CV至约11X CV，约3X CV至约11X CV，约2X CV至约5X CV，约2.5X CV至约7.5X CV，约4X CV至约11X CV，约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。用于进行纯化重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜的洗脱物中的重组蛋白的浓度可以是例如约0.05mg/mL至约100mg/mL重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL，约0.1mg/mL至约80mg/mL，约0.1mg/mL至约70mg/mL，约0.1mg/mL至约60mg/mL，约0.1mg/mL至约50mg/mL，约0.1mg/mL至约40mg/mL，约2.5mg/mL至约7.5mg/mL，约0.1mg/mL至约30mg/mL，约0.1mg/mL至约20mg/mL，0.5mg/mL至约20mg/mL，约0.1mg/mL至约15mg/mL，约0.5mg/mL至约15mg/mL，约0.1mg/mL至约10mg/mL或约0.5mg/mL至约10mg/mL重组蛋白)。
能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜可以包括能够用于进行阳离子交换、阴离子交换或分子筛层析的树脂。正如本领域所理解的，使用能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜精制重组蛋白可以包括例如加载、追捕(chasing)和再生能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜的步骤。例如，当使用加载、追捕和再生步骤进行精制时，重组蛋白不结合用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜中的树脂，并且所述重组蛋白从所述加载和追捕步骤中的至少一个层析柱或层析膜洗脱，并且使用再生步骤在额外的包含重组蛋白的流体可以加载至至少一个层析柱或层析膜之上之前从所述至少一个层析柱或层析膜去除任何杂质。下文描述了要在加载、追捕和再生步骤中的每一步中使用的示例性流速和缓冲液体积。
能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜的大小、形状和体积，和/或能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析膜的大小和形状可以是本文所述的层析柱或层析膜的示例性大小、形状和体积的任何组合。例如，能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜的大小可以具有例如约0.5mL至约200mL(例如，约0.5mL至约180mL，约0.5mL至约160mL，约0.5mL至约140mL，约0.5mL至约120mL，约0.5mL至约100mL，约0.5mL至约80mL，约0.5mL至约60mL，约0.5mL至约40mL，约5.0mL至约40mL，约0.5mL至约30mL，约5.0mL至约30mL，约0.5mL至约25mL，约0.2mL至约10mL或约0.2mL至约5mL)的体积。包含重组蛋白的流体在将其加载至能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜上的流速可以是例如约0.1mL/分钟至约25mL/分钟(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟，约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约6mL/分钟，约0.1mL/分钟至4mL/分钟，约0.1mL/分钟至约3mL/分钟，约2mL/分钟至约6mL/分钟，约0.1mL/分钟至约2mL/分钟或约0.2mL/分钟至约4mL/分钟)。加载至能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜上的包含重组蛋白的流体的总体积可以是例如约1.0mL至约250mL(例如，约1.0mL至约225mL，约1.0mL至约200mL，约1.0mL至约175mL，约1.0mL至约150mL，约100mL至约125mL，约100mL至约150mL，约1.0mL至约150mL，约1.0mL至约125mL，约1.0mL至约100mL，约1.0mL至约75mL，约1.0mL至约50mL或约1.0mL至约25mL)。用于进行精制的至少一个层析柱或层析膜中的树脂可以是阴离子交换或阳离子交换树脂。用于进行精制的单元操作的至少一个层析柱或层析膜中的树脂可以是阳离子交换树脂(例如，Q树脂,Sartorius,Goettingen,Germany)。
在加载步骤之后，进行追捕步骤(例如，使追捕缓冲液通过至少一个层析柱或层析膜以收集基本上不结合所述至少一个层析柱或层析膜的重组蛋白)。在这些实例中，追捕缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约50mL/分钟(例如，约1mL/分钟至约40mL/分钟，约1mL/分钟至约30mL/分钟，约5mL/分钟至约45mL/分钟，约10mL/分钟至约40mL/分钟，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速通过至少一个层析柱或层析膜。使用的追捕缓冲液的体积可以是例如约1X柱体积(CV)至约100X CV(例如，约1X CV至约90XCV，约1X CV至约80X CV，约1X CV至约70X CV，约1X CV至约60X CV，约1X至约50X CV，约1XCV至约40X CV，约1X CV至约30X CV，约1X CV至约20X CV，约1X CV至约15X CV，约5X CV至约20X CV，约5X CV至约30X CV，约1X CV至约14X CV，约1X CV至约13X CV，约1X CV至约12XCV，约1X CV至约11X CV，约2X CV至约11X CV，约3X CV至约11X CV，约4X CV至约11X CV，约2.5X CV至约5.0X CV，约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。追捕的总时间可以是例如约1分钟至约3小时(例如，约1分钟至约2.5小时，约1分钟至约2.0小时，约1分钟至约1.5小时，约2分钟至约1.5小时，约1分钟至约1.25小时，约2分钟至约1.25小时，约1分钟至约5分钟，约1分钟至约10分钟，约2分钟至约4分钟，约30分钟至约1小时，约2分钟至约10分钟，约2分钟至约15分钟或约2分钟至约30分钟)。通过加载步骤和追捕步骤中的柱的洗脱物中存在的重组蛋白的合并浓度可以是例如约0.1mg/mL至约100mg/mL重组蛋白(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL，约0.1mg/mL至约80mg/mL，约0.1mg/mL至约70mg/mL，约0.1mg/mL至约60mg/mL，约0.1mg/mL至约50mg/mL，约0.1mg/mL至约40mg/mL，约2.5mg/mL至约7.5mg/mL，约0.1mg/mL至约30mg/mL，约0.1mg/mL至约20mg/mL，0.5mg/mL至约20mg/mL，约0.1mg/mL至约15mg/mL，约0.5mg/mL至约15mg/mL，约0.1mg/mL至约10mg/mL，约0.5mg/mL至约10mg/mL或约1mg/mL至约5mg/mL重组蛋白)。
在追捕步骤之后并且在下一体积的包含重组蛋白的流体可以加载至能够用于进行精制的单元操作的至少一个层析柱或层析膜之上之前，所述至少至少一个层析柱或层析膜必需使用再生缓冲液再生。可以使所述再生缓冲液以例如，约0.2mL/分钟至约50mL/分钟(例如，约1mL/分钟至约40mL/分钟，约1mL/分钟至约30mL/分钟，约5mL/分钟至约45mL/分钟，约10mL/分钟至约40mL/分钟，约0.2mL/分钟至约20mL/分钟，约0.5mL/分钟至约20mL/分钟，约0.2mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约15mL/分钟，约0.5mL/分钟至约10mL/分钟，约0.5mL分钟至约14mL/分钟，约1.0mL/分钟至约25.0mL/分钟或约1.0mL/分钟至约15.0mL/分钟)的流速通过能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的至少一个层析柱或层析膜。用于再生能够用于精制单元操作的至少一个层析柱或层析膜的再生缓冲液体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约500X CV(例如，约1X CV至约450X CV，约1X CV至约400X CV，约1X CV至约350X CV，约1X CV至约300X CV，约1X CV至约250X CV，约1X CV至约200X CV，约1X CV至约150X CV，约1X CV至约100X CV，约1X CV至约90X CV，约1X CV至约80X CV，约1X CV至约70X CV，约1X CV至约60X CV，约1X至约50X CV，约1X CV至约40X CV，约1X CV至约30X CV，约1X CV至约20X CV，约1X CV至约15X CV，约5X CV至约20X CV，约5X CV至约30XCV，约1X CV至约14X CV，约1X CV至约13X CV，约1X CV至约12X CV，约1X CV至约11X CV，约2X CV至约11X CV，约3X CV至约11X CV，约4X CV至约11X CV，约2.5X CV至约5.0X CV，约5XCV至约11X CV,或约5X CV至约10X CV)。
在其他实例中，用于进行精制的单元操作的一个或多个层析柱和/或层析膜包括选择性结合或保留包含重组蛋白的流体中存在的杂质的树脂，并且一旦已经达到或基本上接近达到一个或多个柱和/或膜中的树脂的结合能力时，就替换所述一个或多个柱和/或膜(例如，用基本上相似的柱和/或膜替换)，而不是再生所述一个或多个柱和/或膜。
在本文所述的这些工艺的一些实例中，MCCS2包括了包括三个层析柱和一个层析膜的PCCS，例如，其中PCCS中的所述三个层析柱进行纯化重组蛋白的单元操作(例如，使用能够用于进行纯化蛋白的操作单元的至少一个层析柱)，并且PCCS中的所述层析膜进行精制重组蛋白的单元操作。在这些实例中，能够用于进行精制治疗性蛋白的单元操作的PCCS中的层析膜可以是能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的本文所述的任何示例性层析膜。可以使用本文所述的任何柱切换方法来决定在这种实例中何时可以切换前三个层析柱和层析膜。
这种实例的一些实施方案可以进一步包括在将洗脱物进料至PCCS中的层析膜之前，调整来自PCCS中三个层析柱的洗脱物的离子浓度和/或pH的步骤。如本文所述，可以通过向PCCS中的三个层析柱的洗脱物添加缓冲液(例如，通过使用在线缓冲液调节储器)来调节来自PCCS中三个层析柱的所述洗脱物的离子浓度和/或pH(在这种实例中在将其进料至PCCS中的层析膜之前)。可以以例如，约0.1mL/分钟至约15mL/分钟(例如，约0.1mL/分钟至约12.5mL/分钟，约0.1mL/分钟至约10.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约8.0mL/分钟，约0.1mL/分钟至约6mL/分钟，约0.1mL/分钟to 4mL/分钟或约0.5mL/分钟至约5mL/分钟)的流速向所述洗脱物添加缓冲液。
这些实例可以进一步包括在将洗脱物进料至层析膜(能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的层析膜)之前保持或储存在这种实例中来自PCCS中三个层析柱的洗脱物的步骤。如本文所述，这种保持或储存步骤可以使用本文所述的任何储器(例如，备份罐)进行。
这些实例还可以包括过滤来自示例性PCCS系统中的层析膜的洗脱物(能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的层析膜的洗脱物)的步骤。本文所述的用于过滤的任何示例性滤器或方法可以用于过滤来自这种示例性PCCS中的层析膜的洗脱物(能够用于进行精制重组蛋白的单元操作的层析膜的洗脱物)。
正如本领域人员能够理解的，可以使用本文所述的任何工艺将纯化的重组蛋白从MCCS或MCCS2周期性洗脱。例如，本文所述的任何工艺可以持续一段例如，约30秒至约5小时(例如，约1分钟至约4小时，约1分钟至约3小时，约1分钟至约2小时，约1分钟或约1.5小时，约1分钟至约1小时或约1分钟至约30分钟)的时间，以例如约1分钟至约6小时(例如，约1分钟至约5小时，约1分钟至约4小时，约1分钟至约3小时，约1分钟至2小时，约1分钟至1小时或约1分钟至30分钟)的频率洗脱所述纯化的重组蛋白，这取决于例如，MCCS或MCCS1和MCCS2中使用的层析柱和/或层析膜。
培养方法
本文所述的一些工艺进一步包括在包含液体培养基的生物反应器(例如，灌注或补料分批生物反应器)中培养分泌重组蛋白的细胞(例如，重组哺乳动物细胞)的步骤，其中连续或周期性地从所述生物反应器(例如，灌注生物反应器)移出一定体积的基本上不含细胞(例如，哺乳动物细胞)的液体培养基并进料至MCCS或MCCS1。所述生物反应器可以具有例如，约1L至约10,000L(例如，约1L至约50L，约50L至约500L，约500L至约1000L，500L至约5000L，约500L至约10,000L，约5000L至约10,000L，约1L至约10,000L，约1L至约8,000L，约1L至约6,000L，约1L至约5,000L，约100L至约5,000L，约10L至约100L，约10L至约4,000L，约10L至约3,000L，约10L至约2,000L或约10L至约1,000L)的体积。生物反应器中存在的液体培养基的量可以是例如约0.5L至约5,000L(例如，约0.5L至约25L，约25L至约250L，约250L至约500L，250L至约2500L，约250L至约5,000L，约2500L至约5,000L，约0.5L至约5,000L，约0.5L至约4,000L，约0.5L至约3,000L，约0.5L至约2,500L，约50L至约2,500L，约5L至约50L，约5L至约2,000L，约5L至约1,500L，约5L至约1,000L或约5L至约500L)。培养细胞可以例如使用补料分批生物反应器或灌注生物反应器进行。培养细胞(例如，培养哺乳动物细胞)的非限定性实例和不同方面在下文描述，并且可以以任何组合使用。
细胞
在本文所述的一些工艺中培养的细胞可以是细菌(例如，革兰氏阴性细菌)、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或Arxulaadeninivorans)或哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可以生长在悬浮物中的细胞或者是贴壁细胞。可以在本文所述的任何工艺中培养的哺乳动物细胞的非限定性实例包括：中华仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，CHO DG44细胞或CHO-K1s细胞)、Sp2.0、骨髓瘤细胞(例如，NS/0)、B-细胞、杂交瘤细胞、T-细胞、人胚胎肾(HEK)细胞(例如，HEK 293E和HEK 293F)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)细胞和Madin-Darby犬(可卡犬(Cocker Spaniel))肾上皮细胞(MDCK)细胞。在培养贴壁细胞的一些实例中，培养物还可以包括多种微载体(例如，包括一个或多个孔的微载体)。其他可以在本文所述的任何工艺中培养的哺乳动物细胞是本领域已知的。
哺乳动物细胞可以包含编码重组蛋白(例如，一种重组蛋白)的重组核酸(例如，稳定整合至哺乳动物细胞基因组中的核酸)。编码示例性重组蛋白的重组核酸的非限定性实例在下文描述，还描述了能够使用本文所述方法产生的重组蛋白。在一些实例中，在生物反应器(例如，本文所述的任何生物反应器)中培养的哺乳动物细胞源自更大的培养物。
可以将编码重组蛋白的核酸使用分子生物学和分子遗传学领域已知的多种多样的方法引入哺乳动物细胞。非限定性实例包括转染(例如，脂质体转染(lipofection))、转导(例如，慢病毒、腺病毒或逆转录病毒感染)和电穿孔。在一些情况下，编码重组蛋白的核酸并不稳定整合至哺乳动物细胞的染色体中(瞬时转染)，而在其他情况下核酸是整合的。另一种情况或者在此之上，编码重组蛋白的核酸可以存在于质粒和/或哺乳动物人工染色体(例如，人的人工染色体)中。另一种情况或者在此之上，可以将核酸使用病毒载体(例如，慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体)引入细胞。可以将核酸可操作地与启动子序列(例如，强启动子，如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子，或诱导型启动子)连接。包含核酸的载体视需要还可包含选择性标记(例如，为哺乳动物细胞赋予潮霉素、嘌呤霉素或新霉素抗性的基因)。
在一些情况中，所述重组蛋白是分泌的蛋白并且由哺乳动物细胞释放至细胞外培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)。例如，编码可溶性重组蛋白的核酸序列可以在重组蛋白的N-或C-末端包含编码分泌信号肽的序列，该序列由哺乳动物细胞中存在的酶切割，并且随后释放至细胞外培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)中。
培养基
液体培养基是本领域已知的。液体培养基(例如，第一和/或第二组织培养基)可以补充有哺乳动物血清(例如，胎牛血清和牛血清)和/或生长激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子)。另一种情况或者在此之上，所述液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)可以是化学限定的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清的液体培养基或含血清的液体培养基。化学限定的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清的液体培养基和含血清的液体培养基的非限定性实例是可以通过商业方法获得的。
液体培养基通常包含能量来源(例如，糖类，如葡萄糖)、必需的氨基酸(例如，二十种氨基酸的基本组加半胱氨酸)、维生素和/或其他以低浓度需要的有机化合物、游离脂肪酸和/或痕量元素。液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)可以视需要补充有例如哺乳动物激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐和缓冲液(例如，钙盐、镁盐和磷酸盐)、核苷和碱基(例如，腺苷、胸苷和次黄嘌呤)、蛋白质和组织水解物和/或这些添加剂的任何组合。
能够用于在本文所述的任何方法中培养细胞(例如，哺乳动物细胞)的多种不同液体培养基是本领域已知的。在本工艺中也可能有用的培养基组分包括但不限于化学限定的(CD)水解物，例如，CD蛋白胨、CD多肽(两种或多种氨基酸)和CD生长因子。液体组织培养基和培养基组分的其他实例是本领域已知的。
本领域技术人员会理解本文所述的第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基或不同的培养基。
示例性生物反应器的其他特征
本文所述的任何生物反应器的内表面可以具有至少一层涂层(例如，至少一层明胶、胶原、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的涂层)，和正如本领域已知的一个或多个用于向液体培养基中喷射O2、CO2和N2的端口，和用于搅拌液体培养基的搅拌机构。生物反应器可以在受控的加湿气氛(例如，以大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的湿度或100％的湿度)中温育细胞培养物。生物反应器也可以配备有能够将一定体积的液体培养基从生物反应器取出的机械装置，和任选的在所述机械装置内在将液体培养基转移出生物反应器的过程中从液体培养基去除细胞的滤器(例如，ATF系统或美国临时专利申请序列号61/878,502中描述的细胞过滤系统)。
温度
培养哺乳动物细胞的步骤可以在约31℃至约40℃的温度下进行。熟练的操作者会理解在培养步骤过程中在指定的时间点可以改变所述温度，例如，以每小时或每天为基础。例如，可以在用细胞(例如，哺乳动物细胞)初始接种生物反应器之后约一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天或约二十天或更多天改变或变换(shift)(例如，增加或减少)温度。例如，可以将温度向上变换(例如，高达或大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或高达或大约20℃的变化)。例如，可以将温度向下变换(例如，高达或大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或高达或大约20℃的变化)。
CO2
本文所述的培养步骤可以进一步包括使生物反应器中的液体培养基暴露于包含至多或大约15％CO2(例如，至多或大约14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2或至多或大约1％CO2)的气氛。
灌注生物反应器
本文所述的培养步骤可以使用灌注生物反应器进行。在灌注生物反应器中培养细胞(例如，哺乳动物细胞)包括从生物反应器取出第一体积的第一液体培养基(例如，包括任何浓度的哺乳动物细胞，例如，基本上不含细胞的第一体积的第一液体培养基)，并且向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。取出和添加可以同时或顺序进行，或以两者的组合进行。此外，取出和添加可以连续(例如，在任何给定的时间段内(例如，在24-小时时间段内，在约1小时至约24小时的渐进时间段内，或在大于24小时的渐进时间段内)以取出和替换生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至800％(例如，1％至700％，1％至600％，1％至500％，1％至400％，1％至350％，1％至300％，1％至250％，1％至100％，100％至200％，5％至150％，10％至50％，15％至40％，8％至80％或4％至30％)的体积的速率)或周期性(例如，每三天一次、每两天一次、每天一次、一天两次、一天三次、一天四次或一天五次)进行，或其任何组合。在周期性进行的情况下，去除或替换的体积(例如，在约24-小时的时间段内，在约1小时至约24小时的渐进时间段内，或在超过24小时的渐进时间段内)可以是例如，生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至800％(例如，1％至700％，1％至600％，1％至500％，1％至400％，1％至300％，1％至200％，1％至100％，100％至200％，5％至150％，10％至50％，15％至40％，8％至80％或4％至30％)。在一些情况下，取出的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积可以在整个或部分培养期在每24小时时间段(或者，可供选择地，约1小时至约24小时的渐进时间段或大于24小时的渐进时间段)内保持大致相同。如本文领域已知的，取出第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可以变化。取出第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可以大约相同或者可以不同。
可供选择地，取出的和添加的体积可以在培养期期间在每24小时时间段内(或者，可供选择地，1小时至约24小时的渐进时间段或大于24小时的渐进时间段)变化(例如，逐渐增加)。例如，在培养期内在每24小时时间段(或者可供选择地，约1小时至24小时以上的渐进时间段或大于24小时的渐进时间段)内取出的第一液体培养基的体积和添加的第二液体培养基的体积可以在培养期内从生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.5％至约20％的体积增加至(例如，逐渐或通过交错增量(staggered increment))生物反应器体积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。
熟练的操作者会理解第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基。在其他情况中，第一液体培养基和第二液体培养基可以不同。
第一体积的第一液体培养基可以例如通过能够从生物反应器取出第一体积的第一培养基(例如，从生物反应器取出基本上不含细胞的第一体积的第一液体培养基)的机械系统取出。另一种情况或者在此之上，第一体积的第一液体培养基可以通过使所述第一体积的第一液体培养基渗透或重力流动通过无菌膜来取出，所述无菌膜具有排除细胞(例如，哺乳动物细胞)的分子量截留值。
第二体积的第二液体培养基可以以自动化方式例如通过灌注泵添加至第一液体培养基。
在一些情况中，取出第一体积的第一液体培养基(例如，基本上不含哺乳动物细胞的第一体积的第一液体培养基)和向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基不在用哺乳动物细胞接种生物反应器的至少1小时内(例如，2小时内，3小时内，4小时内，5小时内，6小时内，7小时内，8小时内，9小时内，10小时内，12小时内，14小时内，16小时内，18小时内，24小时内，36小时内，48小时内，72小时内，96小时内或96小时之后)发生。
补料分批生物反应器
本文所述的培养步骤可以使用补料分批生物反应器进行。在补料分批生物反应器中培养细胞包括，在培养期的大多数时间内，向第一液体培养基添加(例如，周期性或连续添加)第二体积的第二液体培养基。第二液体培养基的添加可以连续(例如，在任何给定的时间段内(例如，在24-小时时间段内，在约1小时至约24小时的渐进时间段内，或在大于24小时的渐进时间段内)以添加生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至300％(例如，1％至250％，1％至100％，100％至200％，5％至150％，10％至50％，15％至40％，8％至80％或4％至30％)的体积的速率)或周期性(例如，每三天一次、每两天一次、每天一次、一天两次、一天三次、一天四次或一天五次)进行，或其任何组合。在周期性进行的情况下，添加的体积(例如，在24-小时的时间段内，在约1小时至约24小时的渐进时间段内，或在大于24小时的渐进时间段内)可以是例如，生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至300％(例如，1％至200％，1％至100％，100％至200％，5％至150％，10％至50％，15％至40％，8％至80％或4％至30％)。在一些情况下，添加的第二液体培养基的第二体积可以在整个或部分培养期在每24小时时间段(或者，可供选择地，约1小时至约24小时的渐进时间段或大于24小时的渐进时间段)内保持大致相同。如本文领域已知的，在整个或部分培养期内添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可以变化。例如，在培养期期间在每24小时时间段内(或者可供选择地，在1小时至约24小时的渐进时间段内，或在大于24小时的渐进时间段内)可以改变(例如，逐渐增加)添加的第二培养基的体积。例如，在培养期内在每24小时时间段内(或者可供选择地，在约1小时至24小时以上的渐进时间段或大于24小时的渐进时间段)内添加的第二液体培养基的体积可以在培养期内从生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.5％至约20％的体积增加(例如，逐渐或通过交错增量)至生物反应器体积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)在整个或部分培养期内可以大约相同。
熟练的操作者会理解第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基。在其他情况中，第一液体培养基和第二液体培养基可以不同。所述体积的第二液体培养基可以以自动化方式例如通过灌注泵添加至第一液体培养基。
在一些情况中，向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基不在用哺乳动物细胞接种生物反应器的至少1小时内(例如，2小时内，3小时内，4小时内，5小时内，6小时内，7小时内，8小时内，9小时内，10小时内，12小时内，14小时内，16小时内，18小时内，24小时内，36小时内，48小时内，72小时内，96小时内或96小时之后)发生。补料分批培养中的细胞培养基通常在培养期结束时收获并且在本文所述的任何工艺中使用，然而，补料分批培养中的细胞培养基也可以在培养期期间的一个或多个时间点收获并且在本文所述的任何工艺中使用。
熟练的操作者会理解可以以任何组合使用多种培养参数中的任一项(例如，容器、体积、替换培养物体积的速率或频率、搅拌频率、温度、培养基和CO2浓度)以进行这些方法。此外，本文所述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞可以用于产生重组蛋白。
示例性生物制造系统
对于进行本文所述的工艺有用的并且包括MCCS或MCCS1和MCCS2的生物制造系统的实例在美国临时专利申请序列号61/775,060和61/856,390(通过提述并入)中描述。在这些示例性系统中，本文提供的至少一个(例如至少两个、三个、四个、五个或六个)生物负荷降低的装填的层析柱存在于MCCS中或MCCS1和/或MCCS2中。例如，整个系统可以包括总共两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个或二十个本文提供的生物负荷降低的装填的层析柱。例如，MCCS、MCCS1和/或MCCS2可以包括(或者可以各自包括)一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个本文提供的生物负荷降低的装填的层析柱。
例如，有用的系统可以包括包含入口的MCCS1和包含出口的MCCS2，或者包含入口和出口的MCCS。在一些实施方案中，MCCS1和MCCS2彼此流体连通。也可以配置这些系统使得流体能够通入所述入口，通过MCCS1和MCCS2，并通过出口离开制造系统。这些系统提供从液体培养基连续且省时地产生治疗性药物物质。例如，在将包含治疗性蛋白的流体(例如，液体培养基)进料至MCCS1和从MCCS2的出口洗脱纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物物质)之间经过的时间可以是，例如，约4小时至约48小时(含端点)。
一些示例性系统不包括间歇罐。在其他情况下，所述系统可以在整个系统中包括最多1、2、3、4或5个间歇罐(例如，其中每个间歇罐仅保持治疗性蛋白总共例如约5分钟至约6小时(含端点)的时间段)。所述间歇罐可以具有1mL至约300mL(含端点)的容量。置于系统中使得流体在进入MCCS1或MCCS之前进入间歇罐的任何间歇罐可以具有1mL至MCCS1或MCCS各自的第一柱加载体积的约100％(含端点)的容量。置于系统中使得流体在进入MCCS2之前(并且在离开MCCS1之后)进入间歇罐的任何间歇罐可以具有例如1mL至MCCS2的第一柱加载体积的约100％(含端点)的容量。
其他示例性系统结构和特征
MCCS或MCCS1可以包括入口，通过该入口流体(例如，基本上不含细胞的液体培养基)可以分别通入MCCS或MCCS1。所述入口可以是本领域已知用于这种目的的任何结构。其可以包括，例如，允许流体管道插入的螺纹(threading)、棱纹(ribbing)或密封，由此在将流体管道插入所述入口之后，流体会通过该入口进入MCCS或MCCS1而没有显著的流体从所述入口渗出。本领域人员已知并且会理解能够在本系统中使用的非限定性入口。
MCCS或MCCS1可以包括至少两个层析柱，至少两个层析膜，或至少一个层析柱和至少一个层析膜，以及入口。MCCS或MCCS1可以是本文所述的任何示例性MCCS，或者具有本文所述的MCCS的任何示例性特征中的一种或多种(以任何组合)。MCCS或MCCS1中存在的层析柱和/或层析膜可以具有本文所述的任何示例性形状、大小、体积(柱床体积)和/或单元操作中的一项或多项。
MCCS或MCCS1中存在的层析柱和/或层析膜可以包括一种或多种本文所述的或本领域已知的任何示例性树脂。例如，包括在MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱和/或层析膜中的树脂可以是使用捕获机制(例如，蛋白A-结合捕获机制、蛋白G-结合捕获机制、抗体-或抗体片段-结合捕获机制、底物-结合捕获机制、辅因子-结合捕获机制、适体-结合捕获机制和/或标签-结合捕获机制)的树脂。包括在MCCS或MCCS1的一个或多个层析柱和/或层析膜中的树脂可以是阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、分子筛树脂或疏水相互作用树脂，或其任何组合。可以用于纯化重组蛋白的树脂的其他实例是本领域已知的，并且可以包括在MCCS或MCCS1中存在的一个或多个层析柱和/或层析膜中。MCCS或MCCS1中存在的层析柱和/或层析膜可以包括相同和/或不同的树脂(例如，本文所述的或本领域已知的用于重组蛋白纯化的任何树脂)。
MCCS或MCCS1中存在的两个或更多个层析柱和/或层析树脂可以进行一项或多项单元操作(例如，捕获重组蛋白、纯化重组蛋白、精制重组蛋白、灭活病毒、调节包含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH或过滤包含重组蛋白的流体)。在非限定性实例中，MCCS或MCCS1可以进行从流体(例如，液体培养基)捕获重组蛋白和灭活包含重组蛋白的流体中存在的病毒的单元操作。MCCS或MCCS1可以进行本文所述的或本领域已知的两种或更多种单元操作的任何组合。
MCCS或MCCS1中存在的层析柱和/或层析膜可以通过切换机构(例如，柱切换机构)连接或相对于彼此移动。MCCS或MCCS1也可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)泵(例如，自动化的，例如，自动化蠕动泵)。柱切换事件可以通过检测由对应于通过MCCS或MCCS1的流体(例如，MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜的输入物和/或洗脱物)中重组蛋白特定水平的UV吸光度检测出的重组蛋白水平、特定的液体(例如缓冲液)体积或经过的特定时间来触发。柱切换通常意指这样的机构，通过该机构允许MCCS或MCCS1中的至少两个不同的层析柱和/或层析膜(例如，MCCS1或MCCS2中存在的两个或更多个不同的层析柱和/或层析膜)在工艺的至少部分过程中在基本上相同的时间通过不同步骤(例如，平衡、加载、洗脱或清洗)。
MCCS或MCCS1可以是周期性逆流层析系统(PCCS)。例如，作为MCCS或MCCS1的PCCS(即，分别为PCCS或PCCS1)可以包括四个层析柱，其中前三个柱进行从流体(例如，液体培养基)捕获重组蛋白的单元操作，并且PCCS的第四个柱进行灭活包含重组蛋白的流体中的病毒的单元操作。作为MCCS或MCCS1的PCCS可以使用柱切换机构。PCCS系统可以使用改良的系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)，其能够运行多达例如四、五、六、七或八个柱，或更多。
MCCS或MCCS1可以配备有：一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV监测器、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)阀门、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)pH计和/或一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)电导率仪。MCCS或MCCS1还可以配备有使用软件的操作系统(例如，基于Unicorn的软件，GEHealthcare,Piscataway,NJ)，用于感应何时应当发生柱切换(例如，基于UV吸光度、液体体积或经过的时间)并进行(触发)柱切换事件。
MCCS或MCCS1可以进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个)在线缓冲液调节储器和/或缓冲液储器。在其他实例中，MCCS或MCCS1可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)间歇罐，其能够保持不能轻易通入MCCS或MCCS1中的一个或多个层析柱和/或层析膜的流体。本文所述的系统可以包括MCCS、MCCS1和/或MCCS2中的一个或多个间歇罐(例如，本文所述的间歇罐)。本文所述的系统的其他实例在MCCS、MCCS1或MCCS2中不包括间歇罐，或者在整个系统中不包括间歇罐。本文所述的系统的其他实例在整个系统中包括最多一个、两个、三个、四个或五个间歇罐(例如，本文所述的任何间歇罐)。
第二MCCS
示例性系统中的第二MCCS(MCCS2)包括至少两个层析柱，至少两个层析膜，或至少一个层析柱和至少一个层析膜，以及出口。MCCS2可以是本文所述的任何示例性MCCS，或者可以具有本文所述的MCCS的任何示例性特征中的一种或多种(以任何组合)。MCCS2中存在的层析柱和/或层析膜可以具有本文所述的任何形状、大小、体积(柱床体积)和/或单元操作中的一项或多项。层析柱和/或层析膜可以包括本文所述的或本领域已知的任何示例性树脂。例如，包括在MCCS2中存在的一个或多个层析柱和/或层析膜中的树脂可以是使用捕获机制(例如，蛋白A-结合捕获机制、蛋白G-结合捕获机制、抗体-或抗体片段-结合捕获机制、底物-结合捕获机制、辅因子-结合捕获机制、标签-结合捕获机制和/或适体-结合捕获机制)的树脂。有用的树脂包括例如阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、分子筛树脂和疏水相互作用树脂。树脂的其他实例是本领域已知的。MCCS2中存在的层析柱和/或层析膜可以包括相同和/或不同的树脂(例如，本文所述的或本领域已知的用于重组蛋白纯化的任何树脂)。
MCCS2中存在的层析柱和/或层析膜可以进行一项或多项单元操作(例如，本文所述的任何单元操作或本文所述的单元操作的任何组合)。在非限定性实例中，MCCS2可以进行从流体纯化重组蛋白和精制包含重组蛋白的流体中存在的重组蛋白的单元操作。在其他非限定性实例中，MCCS2可以进行纯化流体中存在的重组蛋白、精制流体中存在的重组蛋白和过滤包含重组蛋白的流体的单元操作。在另一实例中，MCCS2可以进行纯化流体中存在的重组蛋白、精制流体中存在的重组蛋白、过滤包含重组蛋白的流体和调节包含重组蛋白的流体的离子浓度和/或pH的单元操作。MCCS2可以进行本文所述的或本领域已知的两种或更多种单元操作的任何组合。
MCCS2中存在的层析柱和/或层析膜可以通过切换机构(例如，柱切换机构)连接或相对于彼此移动。MCCS2也可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)泵(例如，自动化的，例如，自动化蠕动泵)。柱切换事件可以通过检测由对应于通过MCCS2的流体(例如，MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜的输入物和/或洗脱物)中重组蛋白特定水平的UV吸光度检测出的重组蛋白水平、特定的液体(例如缓冲液)体积或经过的特定时间来触发。
MCCS2可以是周期性逆流层析系统(即，PCCS2)。例如，PCCS2可以包括进行从流体纯化重组蛋白的单元操作的三个柱和进行精制流体中存在的重组蛋白的单元操作的层析膜。例如，进行从流体纯化重组蛋白的单元操作的三个柱可以包括例如阳离子交换树脂，并且进行精制的单元操作的层析膜可以包括阳离子交换树脂。PCCS2可以使用柱切换机构。PCCS2可以使用改良的系统(GE Healthcare,Piscataway,NJ)，其能够运行多达例如四、五、六、七或八个柱，或更多。
MCCS2可以配备有：一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV监测器、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)阀门、一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)pH计和/或一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)电导率仪。MCCS2还可以配备有使用软件的操作系统(例如，基于Unicorn的软件，GE Healthcare,Piscataway,NJ)，用于感应何时应当发生柱切换(例如，基于UV吸光度、液体体积或经过的时间)并进行柱切换事件。
MCCS2可以进一步包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个)在线缓冲液调节储器和/或缓冲液储器。在其他实例中，MCCS2可以包括一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)间歇罐(例如，本文所述的任何间歇罐)，其能够保持不能轻易通入MCCS2中的一个或多个层析柱和/或层析膜的流体。
MCCS2包括出口，通过该出口治疗性蛋白药物物质能够离开系统。出口可以包括，例如，允许流体管道插入的螺纹、棱纹或密封，或设计来保持或储存纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物物质)的小瓶。出口可以包括能够用于将生物负荷降低的小瓶或其他这样的储存容器密封至出口上的表面，从而允许纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物物质)直接流入所述生物负荷降低的小瓶或储存容器。本领域人员已知并且会理解能够在本系统中使用的非限定性出口。
本文所述的系统也可包括置于MCCS1和MCCS2之间的流体导管。本文所述的任何流体导管可以是，例如，由例如聚乙烯、聚碳酸酯或塑料制成的管。置于MCCS1和MCCS2之间的流体导管可以进一步包括任何组合的下列一项或多项：一个或多个在线缓冲液调节储器，其与流体导管流体连通并且放置得使得储存在在线缓冲液调节储器中的缓冲液被添加至流体导管中存在的流体；间歇罐(例如，本文所述的任何间歇罐)，其与流体导管流体连通并且放置得使得其能够保持无法轻易进料入MCCS2的流体导管中存在的任何过剩流体；和一个或多个滤器，其置于流体导管中，使得它们能够过滤(例如，去除细菌)流体导管中存在的流体。任何在先缓冲液调节储器可以包括，例如约0.5L至50L体积的缓冲液(例如，在25℃、15℃或10℃或在低于25℃、15℃或10℃的温度下)。
本文所述的系统可以任选地包括置于MCCS2中最后的层析柱或层析膜与出口之间的流体导管。本文所述的系统可以进一步包括一个或多个滤器，其与置于MCCS2中最后的层析柱或层析膜与出口之间的流体导管流体连通，使得所述滤器能够从置于MCCS2中最后的层析柱或层析膜与出口之间的流体导管中存在的流体去除，例如，沉淀的材料、颗粒物质或细菌。
本文提供的系统的一些实例还包括生物反应器，其与MCCS或MCCS1的入口流体连接。本文所述的或本领域已知的任何示例性生物反应器可用于本系统中。
本文提供的系统的一些实例还包括泵系统。泵系统可以包括下列一项或多项：一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)泵(例如，本文所述的或本领域已知的任何泵)，一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)滤器(例如，本文所述的或本领域已知的任何滤器)，一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV检测器，和一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个)间歇罐(例如，本文所述的任何间歇罐)。本文提供的系统的一些实例进一步包括置于泵和MCCS或MCCS1的入口之间的流体导管(流入，本文所述的或本领域已知的任何示例性流体导管)。在一些实例中，这种特定的流体导管可以包括一个或多个(例如，两个、三个或四个)泵(例如，本文所述的或本领域已知的任何泵)和/或一个或多个(例如，两个、三个或四个)间歇罐(例如，本文所述的任何示例性间歇罐)，其中这些泵和/或间歇罐与流体导管中存在的流体是流体连接的。
本文所述的系统的一些实例进一步包括另外的与泵和入口之间的流体导管连接的流体导管，其中所述另外的流体导管的一端与生物反应器流体连接，且另一端与泵和入口之间的流体导管流体连接。这种另外的流体导管可以包括能够从液体培养基去除细胞的滤器(例如，ATF细胞留驻系统)，所述液体培养基自生物反应器取出。
本文提供的系统允许连续产生纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物物质)。如本领域已知的，所述系统可以提供纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物物质)的周期性洗脱。本文所述的系统还可以致使纯化的重组蛋白(例如，治疗性蛋白药物物质)的净收率在至少约5天，至少约10天，至少约15天，至少约20天，至少约25天，至少约30天，至少约40天，至少约50天，至少约60天，至少约70天，至少约80天，至少约90天或至少约100天的连续时间段内为至少约5g/天，至少约10g/天，至少约15g/天，至少约20g/天，至少约30g/天或至少约40g/天。
包括使用基本上干燥的层析树脂的降低层析树脂生物负荷的方法
本文还提供降低层析树脂的生物负荷的方法，其包括使包含基本上干燥的层析树脂的容器暴露于足以降低所述容器和层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量。这些方法的一些实施方案进一步包括在步骤(a)之前干燥层析树脂以从所述层析树脂去除液体。层析树脂的干燥可以使用热处理(例如，烘箱)或干燥器(dessicator)进行。用于干燥层析树脂的其他方法是本领域已知的。
本文所述的任何条件和γ-照射剂量可以用于这些方法中。例如，γ-照射剂量可以为约15kGy至约45kGy(例如，约20kGy至约30kGy)。本文所述的任何容器和层析树脂可以用于这些方法中。例如，所述容器可以是储存容器或层析柱。这些方法中的层析树脂可以包括蛋白质配体(例如，蛋白A或蛋白G)。在一些实例中，层析树脂可以包括阴离子交换层析树脂(例如，包括N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的层析树脂)。在一些实例中，层析树脂共价附接于制品(例如，芯片、膜或盒)表面。在一些实施方案中，基本上干燥的层析树脂不含显著量的抗氧化剂或显著量的螯合剂。还提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的层析树脂。
在一些实例中，产生的生物负荷降低的层析树脂具有约1x 10-8至约1x 10-5的无菌性保证水平(SAL)(例如，约1x 10-7至约1x 10-6的SAL)。产生的降低的层析树脂可以包括至少一种选自下组的树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。在一些实例中，产生的降低的层析树脂包括包含蛋白质配体(例如，蛋白A)的亲和层析树脂。在一些实例中，产生的降低的层析树脂包括阴离子交换层析树脂(例如，包括N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团的阴离子交换层析树脂)。还提供制备生物负荷降低的装填的层析柱的方法，其包括提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的层析树脂；和将所述层析树脂在无致病菌的环境中装填至生物负荷降低的柱中。还提供通过本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。
还提供用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，其包括：(a)提供基本上不含细胞的、包含重组蛋白的液体培养基；和(b)将液体培养基连续进料至多重柱层析系统(MCCS)，所述多重柱层析系统(MCCS)包含通过本文提供的任何方法产生的至少一个生物负荷降低的装填的层析柱；其中所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从液体培养基连续运行至MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白。还提供用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，其包括：(a)提供基本上不含细胞的、包含重组蛋白的液体培养基；和(b)将液体培养基连续进料至第一多重柱层析系统(MCCS1)；(c)使用MCCS1捕获液体培养基中的重组蛋白；(d)产生包含重组蛋白的MCCS1的洗脱物并且将所述洗脱物连续进料至第二多重柱层析系统(MCCS2)；(e)将来自洗脱物的重组蛋白连续进料至MCCS2并随后洗脱所述重组蛋白，由此产生纯化的重组蛋白，其中：所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从液体培养基连续运行至纯化的重组蛋白，并且MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱含有通过本文提供的任何方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。用于本文所述的纯化的重组蛋白生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺的任何示例性方面可在这些工艺中使用。
生产生物负荷降低的膜、树脂、有涂层材料、芯片和盒的方法
本文还提供用于生产生物负荷降低的膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒的方法，其包括：将包含含有膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒(例如，基于纤维素、琼脂糖或糖的膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒)和至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的组合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒的生物负荷的γ-照射剂量，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善在暴露于所述γ-照射剂量之后对所述膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒的损坏的量存在。在一些实例中，所述盒是含有树脂的盒(例如本文所述的或本领域已知的任何示例性树脂)。在一些实施方案中，所述膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒包括与其至少一个或部分表面共价附接的蛋白A或蛋白G配体。在一些实施方案中，所述组合物包含膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒和包含至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂的液体。本文所述的抗氧化剂和/或螯合剂的任何示例性组合和浓度可用于任何这些方法中。本文所述的任何示例性液体可用于任何这些方法中。在一些实施方案中，所述组合物是干燥材料。本文还提供使用本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒。在一些实例中，所述容器是密封的储存容器(container)或容器(vessel)。
本文还提供用于生产生物负荷降低的膜、树脂、有涂层材料、芯片和盒的方法，其包括：将包含基本上干燥的膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒(例如，基于纤维素、琼脂糖或糖的膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒)的容器暴露于足以降低所述容器和所述膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒的生物负荷的γ-照射剂量。一些实例进一步包括在所述暴露步骤之前干燥所述膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒的步骤。在一些实施方案中，所述膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒包括与其表面共价附接的蛋白A或蛋白G配体。在一些实例中，所述盒是含有树脂的盒(例如本文所述的或本领域已知的任何示例性树脂)。本文还提供使用本文所述的任何方法产生的生物负荷降低的膜、树脂、有涂层材料、芯片或盒。
本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不对权利要求中记载的本发明的范围构成限制。
实施例
实施例1.Γ-照射对不同层析树脂静态结合能力的作用
进行了一组实验来测试γ-照射对以下三种不同的蛋白A亲和层析树脂的静态结合能力的作用：GE Mab Select SuReTM(一种高度交联的琼脂糖树脂，具有85μm的颗粒大小，和将蛋白A与琼脂糖连接的环氧官能团)，JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203(一种多孔聚甲基丙烯酸酯树脂，具有～50μm的颗粒大小，和将蛋白A与聚甲基丙烯酸酯连接的环氧官能团)，和Kaneka KanCap A(一种高度交联的纤维素，具有65–85μm的颗粒大小，其中蛋白A通过还原胺化连接至纤维素)。将所述三种树脂中的每一种用15kGy的γ-照射处理，除了Mab Select SuReTM，将其用25kGy的照射剂量处理，而对照样品GE Mab Select SuReTM树脂不作处理，加载以抗TGFβ抗体(IgG4)，并且测定洗脱物中抗TGFβ抗体的水平。在本实施例中对每种树脂的Γ-照射在50mM磷酸盐，pH 7.0中进行。每种经γ-照射的树脂和未处理的对照树脂的静态结合曲线示于图1。这些数据显示γ-照射降低了三种测试的蛋白A层析树脂中每一种的结合能力，其中JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂响应于15kGyγ-照射显示最小的结合能力降低。
进行接下来的实验以测定γ-照射JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂或GE Mab Select SuReTM树脂是否导致蛋白A从所述层析树脂裂解(和释放)。在这些实验中，将JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂或GE Mab Select SuReTM树脂用30kGy的γ-照射处理，随后通过测量在280nm的吸光度来测定上清液中蛋白A的水平。来自这项实验的数据显示在用γ-照射处理之后几乎没有蛋白A从这两种测试的树脂中的任一种中释放(图2)。
这些数据显示γ-照射导致了亲和层析树脂结合能力的即时降低，并且这种结合能力的损失不是因为蛋白质配体从树脂裂解。
实施例2.在多重层析循环中多重Γ-照射对树脂结合能力的作用
进行下一组实验来测试在多重层析循环中γ-照射对层析树脂结合能力的作用。使用JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂进行这些实验，因为这种树脂在实施例1中响应于γ-照射显示了最小量的结合能力损失。在本实施例中对每种树脂的Γ-照射在50mM磷酸盐，pH 7.0中进行。
进行第一项实验来测试在多重层析循环中15kGyγ-照射对JSR LifeSciencesAmsphere ProA JWT203树脂结合抗TGFβ抗体(IgG4)的能力的作用。还使用未经处理的JSRLifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂来进行多重层析循环作为阳性对照。在每个循环结束时，将树脂用0.1N NaOH清洗。测定来自每个循环的洗脱物中的抗TGFβ抗体的量。数据显示15kGyγ-照射导致JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂的结合能力即时的、约20％至25％的降低(即，在第一循环中)，但是在多重额外的层析循环中结合能力仅以非常缓慢的速率降低(即，以一种与未经处理的树脂结合能力降低的速率相当的速率)(图3、6和7)。
在最初的层析循环之后经15kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProAJWT203树脂的结合能力的最小降低从对这些实验中循环7和循环11的层析图的比较中也是明显的(图4和图5)。这些图显示对于未经处理的和经15kGyγ-照射的JSR LifeSciencesAmsphere ProA JWT203树脂二者，在多重层析循环中这些树脂的结合能力仅存在中度的(若有的话)可观察到的变化。
进行了额外的实验来测试在多重层析循环中未经处理的或用29kGyγ-照射处理的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂的结合能力变化。在这些实验中，在每个循环结束时将树脂用0.1N NaOH清洗，并且在每个循环开始时用抗αβTCR单克隆抗体(IgG1)加载树脂。所得数据再次显示经29kGyγ-照射的树脂与未经处理的树脂相比结合能力约20％至25％的初始降低(图8)。在多重额外的层析循环中未经处理的和经29kGyγ-照射的树脂的结合能力仅中度降低(对于未经处理的和经29kGyγ-照射的树脂以大约相同的速率)(图8)。
进行了最后一组实验在多重层析循环中测试未经处理的、经15kGyγ-照射的和经29kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂的结合能力。在每个循环结束时，将树脂用0.1N NaOH清洗，并且用单克隆抗-TGFβ(IgG4)抗体或单克隆抗-αβTCR(IgG1)抗体(abTCR)加载树脂。数据显示用15kGy和29kGy的γ-照射进行的照射导致JSRLifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂结合能力基本上相同水平的降低，并且显示经15kGy和29kGyγ-照射的JSR LifeSciences Amsphere ProA JWT203树脂的结合能力水平在多重层析循环中以与未经处理的树脂相同的速率中度降低(图9)。
这些数据显示对具有蛋白质配体的层析树脂的γ-照射导致结合能力的即时降低，并且结合能力的损失在多轮层析中保持相对稳定。这些数据提示γ-照射导致在γ-照射过程中对层析树脂(例如，含有蛋白质或肽配体的层析树脂，如亲和层析树脂)的氧化破坏，并且在γ-照射过程中的层析树脂(例如，含有蛋白质或肽配体的层析树脂，如亲和层析树脂)结合能力的损失能够通过在至少一种螯合剂和/或抗氧化剂存在下γ-照射层析树脂来预防、改善或降低。
实施例3.Γ-照射对GE Mab Select SuReTM树脂的结合能力的作用
进行了一组实验来测定在多重层析循环中γ-照射对另一蛋白质配体层析树脂(GE Mab Select SuReTM树脂)的结合能力的作用。将树脂交换至50mM磷酸钠，pH 7.0中，然后用29kGyγ-照射在30-mL Nalgene瓶中处理。然后将树脂装填入床高3cm的0.66-cm直径的柱(1mL柱)。然后使用这种柱在多重层析循环中捕获细胞培养基中的单克隆IgG1抗体。还使用未经处理的GE Mab Select SuReTM树脂来进行多重层析循环作为阳性对照。在每个循环结束时，将树脂用0.1N NaOH清洗。测定来自每个循环的洗脱物中的IgG1的量。数据显示29kGyγ-照射导致GE Mab Select SuReTM树脂结合能力的即时的、约25％至约30％的降低(即，在第一个循环中)(图11和12)。在第一层析循环之后，经29kGyγ-照射的GE MabSelect SuReTM树脂仅显示在多重额外层析循环中非常缓慢的结合能力降低速率(即，在多重层析循环中以一种与未经处理的树脂结合能力降低的速率相当的速率)(图11和12)。这些数据与实施例2中描述的对于JSR蛋白A树脂获得的数据相似，并且树脂结合能力因为γ-照射而损失的机制似乎是相似的。
实施例4.Γ-照射对MAb Select SuReTM LX树脂静态结合能力的作用
实施例1中描述的数据显示γ-照射降低了三种不同蛋白A层析树脂(GE MabSelect SuReTM、JSR LifeSciences AmsphereTM ProA JWT203和Kaneka KanCapATM)的静态结合能力。用另一蛋白A层析树脂GE Mab Select SuReTMLX测试了Γ-照射。GE Mab SelectSuReTM LX树脂具有琼脂糖骨架和与Mab Select SuReTM树脂类似的蛋白A配体，但是具有与Mab Select SuReTM树脂相比更高的配体密度。将树脂缓冲液从20％乙醇交换成50mM磷酸钠，pH 6.0，然后进行29-kGyγ-照射。如实施例1中所述测定所述树脂的静态结合(在γ-照射之前和之后测定所述树脂的静态结合能力)。所述数据表明了在γ-照射之后树脂静态结合能力的类似下降(图13)。这种γ-照射引发的GE Mab Select SuReTM LX树脂静态结合能力的降低与实施例1中在γ-照射之后对于测试的三种蛋白A层析树脂观察到的静态结合能力下降(图1)类似。图13中的数据显示γ-照射Mab Select SuReTM LX导致该树脂静态结合能力的即时降低。
实施例5.Γ-照射引发的层析树脂结合能力降低
在先实施例中的数据显示以降低树脂的生物负荷的剂量γ-照射层析树脂还导致树脂结合能力的下降：树脂结合能力与对照的未经处理的树脂的结合能力相比约20％至约40％的降低。由γ-照射引起的结合能力的降低程度看起来不依赖于与树脂附接的蛋白A配体和/或树脂的珠化学。进行这组额外的实验来鉴定会防止层析树脂在γ-照射过程中发生的结合能力损失的缓冲的溶液。使用GE Mab Select SuReTM LX作为这些实验中的层析树脂。GE Mab Select SuReTM LX具有共价固定化在每个珠的多孔基质上的蛋白A。首先将树脂的缓冲液从20％乙醇交换成包含一种或多种抗氧化剂的不同缓冲液或不包含任何抗氧化剂的对照缓冲液。测试的缓冲的溶液示于下表1。在对照实验中，树脂在不存在抗氧化剂的条件下作为干燥组合物进行γ-照射。将这些树脂样品在烘箱中在23℃干燥2天，从而最小化γ-照射过程中的水含量。将表1中所示的每种树脂样品以29kGy剂量在30-mL Nalgene瓶中进行γ-照射。使用实施例1中所述的方法测定经γ-照射的树脂样品和未处理(非照射)树脂样品的静态结合能力。
表1.测试的GE Mab Select SuReTM LX树脂样品和缓冲的溶液
数据显示在一种或多种抗氧化剂存在下γ-照射层析树脂降低了γ-照射引起的结合能力损失(图14和表2)。25mM抗坏血酸钠、25mM甲硫氨酸、25mM甘露醇、25mM组氨酸、50mM磷酸钠pH 6.0的缓冲液(下文称作“SMMH”缓冲液)完全缓解了γ-照射引发的树脂结合能力的损失(即，在未处理的对照树脂和在SMMH缓冲液存在下用29kGy剂量γ-照射的树脂之间没有观察到结合能力损失)(图14和表2)。经29-kGyγ-照射的干燥树脂样品与未处理的树脂样品具有相同的结合能力。这些数据表明γ-照射干燥层析树脂是另一种降低γ-照射引发的树脂结合能力损失程度的方式。
表2.测试的GE Mab Select SuReTM LX树脂样品的比结合能力
进行了进一步的实验来测试在SMMH缓冲液存在下用29kGy剂量γ-照射的树脂和未处理的树脂在多重层析循环中的表现。将每种测试的树脂装填入0.66-cm直径且3-cm高的柱中。将所述柱用含有单克隆IgG1抗体的细胞培养基加载。如在静态结合能力实验中观察到的(图14)，动态结合能力在未处理的树脂和在SMMH缓冲液存在下用29kGy剂量γ-照射的树脂之间对于全部循环而言是相当的(图15和16)。另外，其他关键质量和工艺表现指示者也是相当的：洗脱物中通过尺寸排阻层析-高效液相层析(SEC-HPLC)测量的高分子量种类的百分比和宿主细胞蛋白(HCP)的浓度(表3)。图17是非变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，其示出了在多重循环中来自未处理树脂和在SMMH缓冲液存在下以29kGy剂量γ-照射的树脂的洗脱物的相当的纯度。
表3.未处理的GE Mab Select SuReTM LX树脂和在SMMH缓冲液存在下经Γ-照射的GE Mab Select SuReTM LX树脂的洗脱物中高分子量种类的百分比和宿主细胞蛋白
通过尺寸排阻层析高效液相层析(SEC-HPLC)使用Tosoh G3000SWxl柱测量百分比高分子量种类，并且使用ELISA测定来测量宿主细胞蛋白浓度。
对其他缓冲溶液就其降低γ-照射引发的层析树脂结合能力损失的能力进行了测试。在这些实验中，进行单一层析循环来测定动态模式的结合能力。对于每种测试的缓冲液，将与上文所述相似的柱(0.66-cm直径x 3-cm高)装填并用包含单克隆IgG1的细胞培养基加载。如在静态结合能力实验中观察到的(图14)，含有至少一种抗氧化剂的每种缓冲液降低了γ-照射引起的树脂结合能力的损失(表4)。这些数据显示至少一种抗氧化剂的存在能够降低γ-照射引起的树脂结合能力的损失。另外，这些数据还提示螯合剂(其结合并防止氧化还原活性金属生成活性氧和氮类物质)也能降低γ-照射引起的树脂结合能力的损失。
表4.来自具有含IgG1的细胞培养收获物的GE MabSelect SuRe LX树脂(未处理的和在淬灭剂存在或不存在条件下经29kGy-照射的)的单一层析循环的数据
总体上，这些数据提示在至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂存在下γ-照射层析树脂能够降低γ-照射引起的树脂结合能力的损失。这些数据还提示至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂的存在保护固定化的蛋白A配体以及树脂基础基质免受由γ-照射过程中形成的自由基引起的损坏。至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂的存在也能够在其他包括以可能引起对基质和/或官能团的损坏的剂量γ-照射材料的生物加工应用中使用。例如，含有至少一种抗氧化剂和/或至少一种螯合剂的组合物可以用于防止γ-照射引发的对纤维素膜和其他基于纤维素、琼脂糖或糖的树脂、膜或材料的损坏。
其他实施方案
应理解尽管本发明已经结合发明详述进行了说明，但是前述说明旨在例示而非限制发明的范围，发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改落入所附权利要求的范围内。

Claims (76)

1.一种降低层析树脂的生物负荷的方法，包括：
将包含润湿的固体混合物的容器暴露于足以降低所述容器和所述层析树脂的生物负荷的γ-照射剂量，所述润湿的固体混合物含有(i)层析树脂和(ii)包含至少一种抗氧化剂和/或螯合剂的液体，其中所述至少一种抗氧化剂和/或螯合剂以足以改善所述层析树脂在暴露于所述γ-照射剂量之后的结合能力损失的量存在。
2.权利要求1的方法，进一步包括在暴露之前将所述润湿的固体混合物置于所述容器中。
3.权利要求1的方法，其中所述容器是储存容器。
4.权利要求1的方法，其中所述容器是层析柱。
5.权利要求1的方法，其中所述液体包含选自下组的至少一种抗氧化剂：还原型谷胱甘肽、还原型硫氧还蛋白、还原型半胱氨酸、类胡萝卜素、褪黑素、番茄红素、生育酚、还原型泛醌、抗坏血酸盐、胆红素、尿酸、硫辛酸、类黄酮、羟基苯丙酸甲酯类(a phenolpropanoidacid)、利度卡因(lidocaine)、柚苷配基(naringenin)、富勒烯(fullerene)、葡萄糖、甘露醇、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和二甲基甲氧基苯丙二氢吡喃醇。
6.权利要求1的方法，其中所述液体包含选自下组的至少一种抗氧化剂：甘露醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
7.权利要求1的方法，其中所述液体包含甘露醇、抗坏血酸钠、组氨酸和甲硫氨酸。
8.权利要求1的方法，其中所述液体包含：
(i)75mM至125mM甘露醇；
(ii)75mM至125mM甲硫氨酸；
(iii)75mM至125mM抗坏血酸钠；
(iv)75mM至125mM组氨酸；
(v)30mM至70mM甲硫氨酸和30mM至70mM组氨酸；
(vi)10mM至50mM甲硫氨酸、10mM至50mM组氨酸和10mM至50mM抗坏血酸钠；或
(vii)5mM至45mM抗坏血酸钠、5mM至45mM甲硫氨酸、5mM至45mM甘露醇和5mM至45mM组氨酸。
9.权利要求1或8的方法，其中所述液体是缓冲的溶液。
10.权利要求1的方法，其中所述液体包含选自下组的至少一种螯合剂：乙二胺四乙酸(EDTA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸钠、二巯基琥珀酸(DMSA)、金属硫蛋白和去铁胺(desferroxamine)。
11.权利要求1的方法，其中所述润湿的固体混合物包含选自下组的至少一种层析树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
12.权利要求11的方法，其中所述润湿的固体混合物包含含有蛋白质配体的亲和层析树脂。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白质配体是蛋白A。
14.权利要求11的方法，其中所述润湿的固体混合物包含阴离子交换层析树脂。
15.权利要求14的方法，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
16.权利要求1的方法，其中所述剂量为15kGy至45kGy。
17.权利要求16的方法，其中所述剂量为20kGy至30kGy。
18.权利要求17的方法，其中所述剂量为23kGy至27kGy。
19.权利要求1的方法，其中暴露在-25℃至0℃之间，含端值，的温度下进行。
20.权利要求1的方法，其中暴露在0℃至25℃之间，含端值，的温度下进行。
21.一种通过权利要求3的方法产生的生物负荷降低的层析树脂。
22.权利要求21的生物负荷降低的层析树脂，其中所述树脂具有1x10-8至1x10-5的无菌性保证水平(SAL)。
23.权利要求22的生物负荷降低的层析树脂，其中所述树脂具有1x10-7至1x10-6的无菌性保证水平(SAL)。
24.权利要求21的生物负荷降低的层析树脂，其中所述层析树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
25.权利要求24的生物负荷降低的层析树脂，其中所述层析树脂包含含有蛋白质配体的亲和层析树脂。
26.权利要求25的生物负荷降低的层析树脂，其中所述蛋白质配体是蛋白A。
27.权利要求24的生物负荷降低的层析树脂，其中所述层析树脂包含阴离子交换层析树脂。
28.权利要求27的生物负荷降低的层析树脂，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
29.一种制备生物负荷降低的装填的层析树脂的方法，包括：
提供权利要求21的生物负荷降低的层析树脂；和
将所述层析树脂在无致病菌环境中装填至生物负荷降低的柱中。
30.一种通过权利要求29的方法产生的生物负荷降低的装填的层析柱。
31.权利要求30的生物负荷降低的装填的层析柱，其中在装填的柱中的树脂具有1x10-8至1x10-5的无菌性保证水平(SAL)。
32.权利要求31的生物负荷降低的装填的层析柱，其中在装填的柱中的树脂具有1x10-7至1x10-6的无菌性保证水平(SAL)。
33.权利要求30的生物负荷降低的装填的层析柱，其中在装填的柱中的树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
34.权利要求33的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述树脂包含含有蛋白质配体的亲和或伪亲和层析树脂。
35.权利要求34的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述配体是蛋白A。
36.权利要求33的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述树脂包含阴离子交换层析树脂。
37.权利要求36的生物负荷降低的装填的层析柱，其中所述阴离子交换层析树脂包含N-苄基-N-甲基-乙醇胺基团。
38.一种进行生物负荷降低的柱层析的方法，包括：
(a)提供权利要求30的生物负荷降低的装填的层析柱；和
(b)使用所述生物负荷降低的装填的层析柱和生物负荷降低的缓冲液在封闭系统中进行柱层析。
39.权利要求38的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少4天的一段时间。
40.权利要求39的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少5天的一段时间。
41.权利要求40的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少7天的一段时间。
42.权利要求41的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少14天的一段时间。
43.权利要求42的方法，其中使用生物负荷降低的装填的层析柱的生物负荷降低的柱层析连续进行至少28天的一段时间。
44.权利要求38的方法，其中(a)中的所述生物负荷降低的装填的层析柱中的树脂与未用γ-照射处理的相同树脂相比具有75％至100％的百分比结合能力。
45.权利要求38的方法，其中所述生物负荷降低的装填的层析柱中的树脂包含选自下组的至少一种树脂：阴离子交换层析树脂、阳离子交换层析树脂、亲和层析树脂、疏水相互作用层析树脂和尺寸排阻层析树脂。
46.权利要求45的方法，其中所述树脂包含亲和层析树脂。
47.权利要求46的方法，其中所述蛋白质配体是蛋白A。
48.权利要求45的方法，其中所述树脂包含阴离子交换层析树脂。
49.一种用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：
(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；和
(b)将所述液体培养基连续进料至包含至少一个权利要求30的生物负荷降低的装填的层析柱的多重柱层析系统(MCCS)中；
其中所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至MCCS的洗脱物，所述洗脱物是纯化的重组蛋白。
50.权利要求49的工艺，其中所述MCCS进行至少两种不同的单元操作。
51.权利要求49的工艺，其中所述工艺包括柱切换。
52.权利要求49的工艺，其中所述MCCS进行捕获重组蛋白和灭活病毒的单元操作。
53.权利要求49的工艺，其中所述MCCS进行捕获和纯化重组蛋白的单元操作。
54.权利要求49的工艺，其中所述MCCS包含至少两个生物负荷降低的装填的层析柱。
55.权利要求49的工艺，其中所述MCCS是周期性逆流层析系统。
56.权利要求49的工艺，其中所述MCCS包括用于亲和或伪亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合的多个柱。
57.权利要求56的工艺，其中所述MCCS包括用于亲和层析的柱，并且所述亲和层析使用具有选自下组的捕获机制的工艺进行：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
58.权利要求57的工艺，其中所述工艺中进行的亲和层析使用蛋白A结合捕获机制，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
59.一种用于纯化的重组蛋白的生物负荷降低的制造的一体化、封闭且连续的工艺，包括：
(a)提供基本上不含细胞的包含重组蛋白的液体培养基；
(b)将所述液体培养基连续进料至第一多重柱层析系统(MCCS1)中；
(c)使用所述MCCS1捕获所述液体培养基中的重组蛋白；
(d)产生包含所述重组蛋白的MCCS1的洗脱物并将所述洗脱物连续进料至第二多重柱层析树脂(MCCS2)中；
(e)将来自所述MCCS2的所述洗脱物的重组蛋白连续进料并随后将所述重组蛋白洗脱，由此产生纯化的重组蛋白，其中：
所述工艺使用生物负荷降低的缓冲液，是一体化的，并且从所述液体培养基连续运行至所述纯化的重组蛋白，并且
所述MCCS1和/或MCCS2中的至少一个柱含有权利要求30的生物负荷降低的装填的层析柱。
60.权利要求59的工艺，其中所述MCCS1和/或所述MCCS2进行至少两个不同的单元操作。
61.权利要求59的工艺，其中所述工艺涉及柱切换。
62.权利要求59的工艺，其中所述MCCS1进行捕获重组治疗性蛋白和灭活病毒的单元操作。
63.权利要求59的工艺，其中所述MCCS2进行纯化和精制所述重组蛋白的单元操作。
64.权利要求59的工艺，其中所述MCCS1和/或MCCS2包含至少两个层析柱。
65.权利要求59的工艺，其中所述MCCS1是第一周期性逆流层析系统(PCCS1)。
66.权利要求59的工艺，其中所述捕获使用亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或尺寸排阻层析或其任何组合进行。
67.权利要求66的工艺，其中所述亲和层析使用选自下组的捕获机制进行：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
68.权利要求67的工艺，其中所述亲和层析使用蛋白A结合捕获机制进行，并且所述重组蛋白是抗体或抗体片段。
69.权利要求59的工艺，其中所述MCCS2是第二周期性逆流层析系统(PCCS2)。
70.权利要求49或59的工艺，其中所述重组蛋白是治疗性重组蛋白。
71.权利要求70的工艺，进一步包括将所述纯化的治疗性重组蛋白配制成药物组合物。
72.权利要求49或59的工艺，其中将所述工艺连续进行至少4天的一段时间。
73.权利要求72的工艺，其中将工艺连续进行至少5天的一段时间。
74.权利要求73的工艺，其中将工艺连续进行至少7天的一段时间。
75.权利要求74的工艺，其中将工艺连续进行至少14天的一段时间。
76.权利要求75的工艺，其中将工艺连续进行至少28天的一段时间。
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US (4) US10071364B2 (zh)
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TW (1) TWI709569B (zh)
WO (1) WO2015109151A1 (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014218723B2 (en) 2013-02-22 2019-12-05 Genzyme Corporation Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof
AU2014218715B2 (en) 2013-02-22 2019-12-12 Genzyme Corporation Microcarrier perfusion culturing methods and uses thereof
CN105377874A (zh) 2013-03-08 2016-03-02 建新公司 治疗性蛋白药物物质的整合连续制造
TWI709569B (zh) * 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途
TWI671312B (zh) 2014-01-17 2019-09-11 美商健臻公司 無菌層析法及製法
TW202204596A (zh) 2014-06-06 2022-02-01 美商健臻公司 灌注培養方法及其用途
TWI776235B (zh) 2014-06-09 2022-09-01 美商健臻公司 種子罐培養法(seed train processes)及其用途
JP6843750B2 (ja) 2014-12-22 2021-03-17 ジェンザイム・コーポレーション 哺乳類細胞の培養方法
CN111587285B (zh) * 2017-11-30 2024-03-29 康宁股份有限公司 用于间歇式色谱的包
CN108776190B (zh) * 2018-04-19 2020-08-07 中国林业科学研究院林业研究所 沙棘中酚类物质定量检测方法
BR112021003420A2 (pt) * 2018-08-31 2021-05-18 Genzyme Corporation resina cromatográfica estéril e uso da mesma em processos de manufatura
JP2022553955A (ja) 2019-10-22 2022-12-27 ジェンザイム・コーポレーション 統合された連続的バイオ製造におけるインライン生成物監視
EP4351777A1 (en) * 2021-06-07 2024-04-17 The University of Massachusetts Apparatus and method for continuous production of rna
WO2023194944A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 Csl Behring Ag Methods of sanitizing and/or regenerating a chromatography medium
GB2626063A (en) * 2023-01-06 2024-07-10 Micronclean Ltd Disinfectant formulation
WO2024155768A1 (en) * 2023-01-18 2024-07-25 President And Fellows Of Harvard College Devices, chromatography columns, methods for automated chromatography in parallel and methods for purification of extracellular vesicles

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1146730A (zh) * 1994-02-22 1997-04-02 史密丝克莱恩比彻姆公司 抗体纯化
WO2003045546A1 (en) * 2001-11-27 2003-06-05 Prometic Biosciences Ltd. The use of metal-chelating adsorbents
CN1526732A (zh) * 1999-01-30 2004-09-08 \ 制备高纯度白蛋白溶液的方法
CN102947696A (zh) * 2010-06-03 2013-02-27 通用电气健康护理生物科学股份公司 层析柱模块的并联组件
CN103223333A (zh) * 2013-04-15 2013-07-31 河海大学 一种含双偕胺肟基的改性硅胶吸附剂及其制备方法
EP2682168A1 (en) * 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
CN106068150B (zh) * 2014-01-17 2018-02-27 建新公司 无菌层析树脂及其在制造工艺中的用途

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US533575A (en) 1895-02-05 wilkens
US4401108A (en) 1980-02-13 1983-08-30 Thomas Jefferson University Radioactive material loading, calibration and injection systems
SU1033181A1 (ru) 1982-02-02 1983-08-07 Томское Отделение Охтинского Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Производственного Объединения "Пластполимер" Способ обработки полимерного сорбента дл хроматографии
JPS6075530A (ja) 1983-09-30 1985-04-27 Asahi Chem Ind Co Ltd 金属元素の新しい分離精製方法
US4559175A (en) 1984-04-19 1985-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Halo-substituted diphospha-s-triazines and their derivatives
US4885250A (en) 1987-03-02 1989-12-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzyme immobilization and bioaffinity separations with perfluorocarbon polymer-based supports
US5612016A (en) 1988-04-01 1997-03-18 Immunomedics, Inc. Conjugates of antibodies and bifunctional ligands
US5169936A (en) 1989-04-14 1992-12-08 Biogen, Inc. Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand
US5226895A (en) 1989-06-05 1993-07-13 Eli Lilly And Company Multiple dose injection pen
AU6355790A (en) 1989-08-04 1991-03-11 Peter Grandics An integrated cell culture-protein purification system for the automated production and purification of cell culture products
US5244816A (en) 1989-10-11 1993-09-14 Akzo N.V. Method for purifying chelator conjugated compounds
GB9007113D0 (en) 1990-03-29 1990-05-30 Sams Bernard Dispensing device
AU1742092A (en) 1991-04-05 1992-11-02 Brigham Young University Support bonded polyalkylene-polyamine-poly(carboxylic acid) and extraction of metal ions therewith
ATE121953T1 (de) 1991-07-24 1995-05-15 Medico Dev Investment Co Injektor.
DK175491D0 (da) 1991-10-18 1991-10-18 Novo Nordisk As Apparat
US5279586A (en) 1992-02-04 1994-01-18 Becton, Dickinson And Company Reusable medication delivery pen
RU2034853C1 (ru) * 1992-07-14 1995-05-10 Научно-исследовательский институт строительных материалов при Томской государственной инженерно-строительной академии Способ получения полимерного сорбента для хроматографии
US5320609A (en) 1992-12-07 1994-06-14 Habley Medical Technology Corporation Automatic pharmaceutical dispensing syringe
US5383865A (en) 1993-03-15 1995-01-24 Eli Lilly And Company Medication dispensing device
ZA941881B (en) 1993-04-02 1995-09-18 Lilly Co Eli Manifold medication injection apparatus and method
JP2871435B2 (ja) 1993-04-22 1999-03-17 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックスの製造方法
JPH07110229A (ja) 1993-10-12 1995-04-25 Nkk Corp 金属ストリップループの最下点位置検出装置
US5478924A (en) 1994-02-16 1995-12-26 Cramer; Steven M. Displacement chromatography of proteins using low molecular weight displacers
US5856179A (en) 1994-03-10 1999-01-05 Genentech, Inc. Polypeptide production in animal cell culture
US5423982A (en) 1994-05-31 1995-06-13 Biosepra Inc. Liquid chromatography column adapted for in situ chemical sterilization
US5610285A (en) 1994-08-24 1997-03-11 Bayer Corporation Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions
US5582598A (en) 1994-09-19 1996-12-10 Becton Dickinson And Company Medication delivery pen with variable increment dose scale
NZ302558A (en) 1995-03-07 1999-11-29 Lilly Co Eli Dispensing apparatus with a medication cartridge with a manually adjustable metering mechanism
US6359114B1 (en) 1995-06-07 2002-03-19 Aphton Corp. System for method for the modification and purification of proteins
US5688251A (en) 1995-09-19 1997-11-18 Becton Dickinson And Company Cartridge loading and priming mechanism for a pen injector
US5674204A (en) 1995-09-19 1997-10-07 Becton Dickinson And Company Medication delivery pen cap actuated dose delivery clutch
US5691152A (en) 1995-11-09 1997-11-25 E. R. Squibb & Sons, Inc. Stable avidin composition
AR005035A1 (es) 1995-12-11 1999-04-07 Merck Patent Ges Mit Beschränkter Haftung Procedimiento para preparar proteinas recombinantes en e. coli, mediante fermentacion con gran concentracion de celulas.
PT950067E (pt) 1996-11-27 2007-12-06 Genentech Inc Purificação por afinidade de um polipéptido numa matriz de proteína a.
US5886154A (en) 1997-06-20 1999-03-23 Lebing; Wytold R. Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
US6955917B2 (en) 1997-06-20 2005-10-18 Bayer Healthcare Llc Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
DE19730999C1 (de) 1997-07-18 1998-12-10 Disetronic Licensing Ag Dosierknopfsicherung an einer Vorrichtung zur dosierten Verabreichung eines injizierbaren Produkts
US5921966A (en) 1997-08-11 1999-07-13 Becton Dickinson And Company Medication delivery pen having an improved clutch assembly
US6265542B1 (en) 1997-10-24 2001-07-24 Genentech, Inc. Purification of molecules
US7611831B2 (en) 1998-01-06 2009-11-03 Cerus Corporation Adsorbing pathogen-inactivating compounds with porous particles immobilized in a matrix
CA2305634C (en) 1998-01-30 2006-01-03 Novo Nordisk A/S An injection syringe
US6221053B1 (en) 1998-02-20 2001-04-24 Becton, Dickinson And Company Multi-featured medication delivery pen
US6096010A (en) 1998-02-20 2000-08-01 Becton, Dickinson And Company Repeat-dose medication delivery pen
US6248095B1 (en) 1998-02-23 2001-06-19 Becton, Dickinson And Company Low-cost medication delivery pen
ATE370961T1 (de) 1998-05-06 2007-09-15 Genentech Inc Reinigung von antikörpern durch ionenaustauschchromatographie
DE19858892A1 (de) 1998-12-19 2000-06-21 Merck Patent Gmbh Kontinuierliches Verfahren zur Trennung von Stoffen nach Molekülgröße
AU6892100A (en) 1999-08-05 2001-03-05 Becton Dickinson & Company Medication delivery pen
GB0007071D0 (en) 2000-03-24 2000-05-17 Sams Bernard One-way clutch mechanisms and injector devices
US6663602B2 (en) 2000-06-16 2003-12-16 Novo Nordisk A/S Injection device
GB0028879D0 (en) 2000-11-27 2001-01-10 Prometic Biosciences Ltd Adsorbents and their use
US6899699B2 (en) 2001-01-05 2005-05-31 Novo Nordisk A/S Automatic injection device with reset feature
CA2438094C (en) 2001-02-23 2011-10-11 Immunex Corporation Increased recovery of active proteins
ES2400055T3 (es) 2001-05-16 2013-04-05 Eli Lilly And Company Aparato inyector de medicamentos
ITBO20010426A1 (it) 2001-07-06 2003-01-06 Alfa Wassermann Spa Processo per la purificazione di proteine farmacologicamente attive mediante cromatografia in scambio cationico
US7252799B2 (en) 2001-08-31 2007-08-07 Clearant, Inc. Methods for sterilizing preparations containing albumin
US20030095890A1 (en) 2001-09-24 2003-05-22 Shirley Miekka Methods for sterilizing biological materials containing non-aqueous solvents
US6660172B2 (en) 2002-01-31 2003-12-09 Koslow Technologies Corporation Precoat filtration media and methods of making and using
DK1472275T3 (da) 2002-02-05 2009-04-14 Genentech Inc Proteinoprensning
US20060234226A1 (en) 2002-04-26 2006-10-19 Fahner Robert L Non-affinity purification of proteins
US6902909B2 (en) 2002-07-09 2005-06-07 Synthecon, Inc. Methods for efficient production of mammalian recombinant proteins
HUE033623T2 (en) 2002-09-11 2017-12-28 Genentech Inc protein purification
AU2003272368C1 (en) 2002-09-13 2009-07-23 Biogen Idec Inc. Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
GB0304822D0 (en) 2003-03-03 2003-04-09 Dca Internat Ltd Improvements in and relating to a pen-type injector
GB0304823D0 (en) 2003-03-03 2003-04-09 Dca Internat Ltd Improvements in and relating to a pen-type injector
US7157276B2 (en) 2003-06-20 2007-01-02 Biogen Idec Inc. Use of depth filtration in series with continuous centrifugation to clarify mammalian cell cultures
EP1718675B2 (en) 2004-02-27 2017-01-25 Octapharma AG A method of providing a purified, virus safe antibody preparation
CA2552639C (en) 2004-02-27 2012-05-01 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab A process for the purification of antibodies
AU2005250500B2 (en) 2004-06-04 2011-06-23 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Disposable bioreactor systems and methods
US20060004621A1 (en) 2004-06-30 2006-01-05 Malek Kamal M Real-time selection of survey candidates
WO2006026248A1 (en) 2004-08-25 2006-03-09 Sigma-Aldrich Co. Compositions and methods employing zwitterionic detergent combinations
US20060153861A1 (en) 2004-09-30 2006-07-13 Scheinberg David A BCR-ABL imatinib resistance-associated peptides and methods of use thereof
KR101238798B1 (ko) 2004-09-30 2013-03-04 바이엘 헬스케어, 엘엘씨 생물학적 분자의 통합된 연속 제조를 위한 장치 및 방법
RU2389552C2 (ru) * 2004-10-21 2010-05-20 Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ Способ очистки антител
RU2007118954A (ru) 2004-10-22 2008-11-27 Эмджен Инк. (Us) Способ рефолдинга рекомбинантных антител
NZ555206A (en) 2004-12-22 2010-09-30 Ambrx Inc Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
DE102004063644A1 (de) 2004-12-31 2006-07-20 Tecpharma Licensing Ag Vorrichtung zur dosierten Verabreichung eines fluiden Produkts mit Drehfederantrieb
JP5021610B2 (ja) 2005-03-07 2012-09-12 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 滅菌法
CN1923290A (zh) 2005-04-29 2007-03-07 成都夸常医学工业有限公司 一种病毒灭活方法、其中所用的处理系统以及装置
WO2007055789A2 (en) 2005-10-31 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Expression of soluble therapeutic proteins
WO2007075283A2 (en) 2005-12-06 2007-07-05 Amgen Inc. Polishing steps used in multi-step protein purification processes
US7673757B2 (en) 2006-02-17 2010-03-09 Millipore Corporation Adsorbent filter media for removal of biological contaminants in process liquids
AU2007237133A1 (en) 2006-02-17 2007-10-18 Novartis Ag Purification of bacterial antigens
EP2027252A4 (en) 2006-04-21 2012-10-03 Bayer Corp APPARATUS, SYSTEM AND METHOD FOR IN SITU MEASUREMENTS
WO2008036899A2 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Amgen Inc. Methods for removing viral contaminants during protein purification
US20080207487A1 (en) 2006-11-02 2008-08-28 Neose Technologies, Inc. Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines
KR101496477B1 (ko) 2007-02-01 2015-02-26 아반토르 퍼포먼스 머티리얼스, 인크. 크로마토그래피 매질 및 크로마토그래피 장치 보관 용액 및 이들의 용도
GB0704603D0 (en) 2007-03-09 2007-04-18 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Packing system and method for chromatography columns
US9597610B2 (en) 2007-03-09 2017-03-21 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Packing system and method for chromatography columns
DK2155347T3 (da) 2007-04-17 2013-10-21 Xendo Holding B V Fremgangsmåde og apparat til kontinuerlig membranadsorption
US7901581B2 (en) 2007-06-15 2011-03-08 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Chromatography method
US7809258B2 (en) 2007-07-06 2010-10-05 Flir Systems Ab Camera and method for use with camera
US9109193B2 (en) 2007-07-30 2015-08-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Continuous perfusion bioreactor system
EP3441402A1 (en) 2007-10-30 2019-02-13 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
CN101952417B (zh) 2007-12-27 2015-04-29 大塚制药株式会社 与雌马酚合成有关的酶
US8647309B2 (en) 2008-05-02 2014-02-11 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Medication delivery device
RU2567811C2 (ru) 2008-06-24 2015-11-10 Октафарма Аг Способ очистки фактора свертывания крови viii
CA2932207A1 (en) 2008-10-20 2010-12-09 Abbvie Inc. Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
US9441028B2 (en) 2008-12-08 2016-09-13 Novo Nordisk A/S Counter current purification of polypeptides
WO2010120514A2 (en) 2009-03-31 2010-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antigen-binding proteins comprising recombinant protein scaffolds
EP2236617A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-06 Leukocare Ag Methods of terminal sterilization of biofunctional compositions
US8877060B2 (en) * 2010-11-23 2014-11-04 Biovec Transfusion, Llc Methods for removing pathogens from a platelet preparation
KR20120102575A (ko) 2009-06-22 2012-09-18 메르크 파텐트 게엠베하 도전성 조성물
US8580554B2 (en) 2009-07-31 2013-11-12 Baxter International Inc. Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
AU2010311421B2 (en) * 2009-10-29 2014-11-20 Ascendis Pharma A/S Sterilization of biodegradable hydrogels
US9958421B2 (en) 2009-12-22 2018-05-01 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method for dry packing chromatography columns
GB0922426D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Containers for chromatography media
WO2011147762A2 (en) * 2010-05-25 2011-12-01 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Stabilized radiopharmaceutical composition
KR101821842B1 (ko) 2010-10-15 2018-01-24 스트라우만 홀딩 에이쥐 Ｐｇａ를 포함하는 새로운 ｅｍｄ 제제
JP5132838B2 (ja) 2010-11-29 2013-01-30 三菱電機株式会社 レーザ加工機の光路構造
JP5802760B2 (ja) 2010-12-03 2015-11-04 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 生体高分子クロマトグラフィーのためのシステム及びプロセス
EP2649016B1 (en) * 2010-12-06 2020-06-10 Pall Corporation Continuous processing methods for biological products
CN102321316B (zh) 2011-08-25 2013-04-24 上海恒方大高分子材料科技有限公司 一种适用于γ射线辐照消毒的医用PVC材料及其制备方法
US9458277B2 (en) 2011-09-30 2016-10-04 Covestro Deutschland Ag Homogeneous extruded articles made from thermoplastically processable polyurethanes based on polyester diols formed from succinic acid and 1,3-propanediol
EP2656892A1 (en) 2012-04-23 2013-10-30 Merck Patent GmbH Chromatography method
US20140154270A1 (en) 2012-05-21 2014-06-05 Chen Wang Purification of non-human antibodies using kosmotropic salt enhanced protein a affinity chromatography
JP6182210B2 (ja) 2012-06-29 2017-08-16 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン タンパク質精製プロセス中のウイルスの不活性化方法
CN104884147A (zh) 2012-10-24 2015-09-02 建新公司 使用mes和mops作为流动相改性剂从多峰树脂洗脱生物分子
CN105377874A (zh) 2013-03-08 2016-03-02 建新公司 治疗性蛋白药物物质的整合连续制造
US10610807B2 (en) 2014-01-17 2020-04-07 Repligen Corporation Sterilizing chromatography columns
TWI671312B (zh) 2014-01-17 2019-09-11 美商健臻公司 無菌層析法及製法
US20240100450A9 (en) 2014-01-17 2024-03-28 Repligen Corporation Sterilizing chromatography columns
SG11201905510XA (en) 2017-01-30 2019-08-27 Regeneron Pharma Compositions and methods for reducing bioburden in chromatography
BR112021003420A2 (pt) 2018-08-31 2021-05-18 Genzyme Corporation resina cromatográfica estéril e uso da mesma em processos de manufatura

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1146730A (zh) * 1994-02-22 1997-04-02 史密丝克莱恩比彻姆公司 抗体纯化
CN1526732A (zh) * 1999-01-30 2004-09-08 \ 制备高纯度白蛋白溶液的方法
WO2003045546A1 (en) * 2001-11-27 2003-06-05 Prometic Biosciences Ltd. The use of metal-chelating adsorbents
CN102947696A (zh) * 2010-06-03 2013-02-27 通用电气健康护理生物科学股份公司 层析柱模块的并联组件
EP2682168A1 (en) * 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
CN103223333A (zh) * 2013-04-15 2013-07-31 河海大学 一种含双偕胺肟基的改性硅胶吸附剂及其制备方法
CN106068150B (zh) * 2014-01-17 2018-02-27 建新公司 无菌层析树脂及其在制造工艺中的用途

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