JP5021610B2 - 滅菌法 - Google Patents
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Description
図1は、本発明のプロセスの流れの概略図である。
クロマトグラフィーカラムに関して「充填」という用語は、容器が固定相(クロマトグラフィー樹脂、分離マトリックス又は媒体としても知られる。)で実質的に充填されていることを意味する。また、当業者には明らかであろうが、「充填」には、カラム全体で均質で一定の流れを示すと一般に認められる段数及び非対称性が想定される(例えば、“Protein Purification” Ed. Jan−Christer Jansson & Lars Ryden; and ”Practical High−Performance Liquid Chromatography”, Veronika R. Meyer , 2nd edition, 1993, Ed. John Wiley & Sons, p.39−40参照)。
イオン交換リガンド、マルチモーダルリガンド、チオフィリックリガンド及び疎水性クロマトグラフィー(HIC)リガンドからなる群から選択される。粒子に固定化されたリガンドは、デキストラン又は合成ポリマーのような「可撓性アーム」としても知られるエキステンダーを介して結合したものでもよい。
図1は、本発明のプロセスの概略を示す。簡潔に述べると、図1は、カラムを充填し、システムに連結して流れを開始し、最後に熱及び圧力を加えることを示す。
本例では、本発明の滅菌をSepharose 4 Fast FlowとANX Sepharose 4 Fast Flow(いずれもGE Healthcare社(スウェーデン、ウプサラ))の2種類の分離媒体で試験した。
本例では、高速溶媒抽出(ASE)と呼ばれる加圧流体抽出(PFE)に媒体を曝露した。ASEでは、図2に示すように、媒体をセルに充填し、セルに溶媒を満たしてから加熱・加圧し、温度及び圧力を所定時間保ち、清浄溶媒をセルに送液し、最後にN2ガスで溶媒をセルからパージする。
ANX Sepharose 4 Fast Flow(HS)に対しては、0.1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/HClを移動相として使用し、Sepharose 4 Fast Flowに対しては、0.1M NaClを使用した。
1.沈降媒体約50mLを、G3ガラスフィルター上で、5×50mlの緩衝液0.1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/HCl又は0.1M NaClで洗浄した。
2.ゲルをビーカーに移し、実際の緩衝液で希釈して50%ゲル混合物とした。
3.次いで33mL抽出セルに充填した。
充填セルをASEセルホルダーに配置した。緩衝液を溶媒ホルダーに配置した。システムを実際の溶媒で3回濯いだ。25個の試料バイアルを試料ホルダーに配置した。3回分の濯ぎバイアルもセルホルダーの濯ぎ位置に配置した。
材料
結果を図3a及び図3bに示す。図3a及び図3bから明らかな通り、本発明の滅菌はマトリックスに何ら実質的な影響を与えていない。
性能
標準及び滅菌(ASE処理)ANX Sepharose 4 Fast Flowを15分間2ml/min(2bar)の流速で4.6/50PEEKカラムに充填した。理論段相当高さ(HETP)を、0.2ml/minの10μl 2M NaClで測定した。次に、カラムを0.1ml/minの20mMピペラジンpH6.2で較正し、20mMピペラジンpH6.2中にGammabind(4mg/mL)とβ−ラクトグロブリンA(11mg/mL)とβ−ラクトグロブリンB(11mg/mL)のモデルタンパク質を含む100μL試料をカラムにロードした。溶出は21カラム体積を超える0.30M NaCl、20mMピペラジンpH6.2への線形勾配で行った。
結果を図4に示す。図4から明らかな通り、本発明の滅菌は媒体に何ら実質的な影響を与えていない。
装置
3Gガラスフィルター上で10mlのASE処理AnX Sepharose 4 Fast Flow(HS)T−304627を10×10mLのミリQ水で洗浄した。洗浄ゲルをビーカーに移し、ミリQ水で希釈して50%ゲル混合物とした。3.735mL試料の取得には「キューブ」を用いた。ゲル混合物を「キューブ」に流し込み、真空吸引を1分間行った。「キューブ」内の真空吸引したゲルをG3ガラスフィルターに移した。重複して分析を行った。2×20mLの0.1M HClをガラスフィルターに添加した。過剰のCl−は5×0.001M HClで除去した。ゲルを2分間真空吸引し、約80mLの0.1M NaNO3で滴定容器に定量的に移した。数滴のHNO3を各滴定容器に添加した。各滴定容器を0.0999M AgNO3で当量点まで滴定した。ASE処理していないANX Sepharose 4 Fast Flow(HS)T−304627をASE処理媒体と同様に処理し、滴定した。
以下の表に、塩素イオン容量の結果を示す。表1から明らかな通り、本発明の滅菌は媒体に何ら実質的な影響を与えていない。
本実施例で用いたシステムを図5に示す。本例では、本発明の滅菌を1種類の分離媒体Sepharose(商標)4 Fast Flow(GE Healthcare社(スウェーデン、ウプサラ))で試験した。電気加熱式ジャケットを備えたFine Line 100カラム(GE Healthcare社製)に媒体を充填した。12cmの沈降ベッド高さに相当する媒体をカラムに流し込み、カラムを満たすのに十分な精製水(PW)中に懸濁した。カラムアダプターの下に空気がトラップされないようにアダプターを懸濁中に浸漬した。アダプターを60cm/hの速度で下げ、過剰のPWをカラム底部から流出させた。充填媒体が10cmのベッド高さに達した時点で充填を中止した。HETPを実施例6に記載の通り試験した。カラムを図5に示すシステムに接続した。滅菌プロセス中食塩水(0.1M NaSO4)をカラムに送液した(120ml/min、90cm/h)。加熱電源を入れ、カラム出口の温度が121℃に達してから処理をさらに20分間続けた後、加熱電源が切った。カラムを流し続けながらシステムを放冷した。カラムが室温に達したら、再度HETPを試験した。
0.01カラム体積の2%アセトンを、実施例5に記載の通り処理したカラムに注入し、30cm/hの流速の精製水(PW)で溶出した。280nmのUVトレースをモニターして、評価に用いた。液体はアップフロー及びダウンフローで注入した。結果を図6及び図7に示す。
Claims (21)
- 分離マトリックスを充填した1以上のクロマトグラフィーカラムを滅菌する方法であって、カラムの充填材に、蒸気へと変換させずに沸点を超える温度に加熱された過熱水溶液を流して1以上の実質的に滅菌された充填クロマトグラフィーカラムを得ることを含んでなり、上記水溶液が緩衝液である、方法。
- 大気圧を0〜35bar超えるその場の支配的圧力下で過熱水溶液を与える温度に水溶液を加熱し、カラムの充填材に過熱水溶液を流して1以上の実質的に滅菌された充填クロマトグラフィーカラムを得ることを含む、請求項1記載の方法。
- 過熱水溶液を実質的に均一な流れでカラムの充填材に流すことを含む、請求項1又は請求項2記載の方法。
- カラム全体を通して過熱水溶液の温度及び圧力を実質的に維持する、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 過熱水溶液を充填クロマトグラフィーカラムの一端の入口に添加し、入口と実質的に反対側に位置する出口から取り出す、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 過熱水溶液を充填クロマトグラフィーカラムの中央に添加し、充填クロマトグラフィーカラムの外周から取り出す、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 前記溶液をヒーターからクロマトグラフィーカラムまで及び/又はクロマトグラフィーカラムを通して送液する、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。
- さらに、カラム出口で水溶液温度をモニターすることを含む、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
- 出口の温度に基づいて、カラム入口での温度を制御することを含む、請求項8記載の方法。
- 前記マトリックスが多孔質粒子からなる、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。
- 前記マトリックスが架橋多糖類粒子からなる、請求項1乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。
- 前記マトリックスが合成ポリマー粒子からなる、請求項1乃至請求項10のいずれ1項記載の方法。
- 前記マトリックスがモノリシック材料からなる、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。
- 前記多孔質粒子の表面が1以上のリガンドを呈する、請求項10記載の方法。
- 前記リガンドが感熱性ペプチド結合を実質的に含まない、請求項14記載の方法。
- 前記リガンドが、イオン交換リガンド、マルチモーダルリガンド、チオフィリックリガンド及び疎水性クロマトグラフィー(HIC)リガンドからなる群から選択される、請求項14又は請求項15記載の方法。
- 流体混合物から1種以上の生体分子を分離するための、請求項1乃至請求項16のいずれか1項記載の方法で滅菌された充填クロマトグラフィーカラムの使用。
- ウィルス及び/又は核酸を実質的に純粋な生成物として得るための、請求項17記載の使用。
- 水性緩衝液を含む液溜めと、過熱液体を与えるヒーターと、充填クロマトグラフィーカラムと、クロマトグラフィーカラムの一端に位置する1以上の温度センサーとを備える、クロマトグラフィーカラムの滅菌システム。
- 管材、ポンプ手段、弁、フィルター、容器及び緩衝液からなる群から選択される1以上の追加の構成要素を備える、請求項19記載のシステム。
- 滅菌処理中の温度及び圧力を制御する自動化手段を備える、請求項19又は請求項20記載のシステム。
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