KR20120065383A - 폴리펩티드 정제를 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

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KR20120065383A
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마르크 알. 위크만
셈 맨소올
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론자 바이올로직스 피엘씨
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Abstract

본 발명은 정제 후 폴리펩티드를 함유한 용액의 직접적인 여과를 포함하는 폴리펩티드의 정제를 위한 방법 및 자동 시스템을 제공한다.

Description

폴리펩티드 정제를 위한 방법 및 시스템 {Method and System for Polypeptide Purification}
본 발명은, 폴리펩티드를 정제하기 위한 자동 시스템 및 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 혼합물로부터 폴리펩티드를 정제하는데 유용한 각각의 자동화 시스템 및 방법을 기반으로 하는 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)에 관한 것이다.
고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)체는 학술분야 및 산업분야에서 혼합물로부터 DNA 및 단백질과 같은 다량의 다양한 생체분자들을 분리 및/또는 정제하는데 광범위하게 사용되고 있다. 상기 FPLC에서, 친 생체분자를 포함하는 가용성 성분을 가진 혼합물은 정지상에서 액상 용액이 통과됨으로써 침투를 통해 분리되고, 이와 같은 방식으로, 상기 혼합물의 단일 성분이 분리된다. 상기 용출 방법의 사용에 따라, 상기 혼합물 내의 상기 성분들이 다른 속도를 가지고 상기 고정상을 통해 이동하거나, 서로 분리되는 고정상에서 상호 작용하는 특정 리간드(ligand)에 의해 유지된다.
간단한 설계 방식으로 인해 시스템들은 자동화FPLC로 개발되었다. 시스템들을 기반으로 하는 자동식 FPLC는 GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom에 의해 AKTAㄾ라는 상표로 제조되어 시장화 되었다.
비록 생체분자들의 정제는 단순화 되었으나, 정제 과정은 일단 시스템이 종료되도록 짧은 시간 내에서 포집된 친 생체분자들을 가진 통류(flow-through) 또는 용출액(eluate)을 제조하는 시스템을 기초로 오직 현재의 FPLC에서만 실행이 가능하다. 따라서, 통류 또는 용출액이 제조되는 시기를 정확하게 포착할 수 없고 오랜 시간 동안 노출될 수 밖에 없으므로, 부패 위험이 증가된다. 일단 셍체분자가 함유된 통류 또는 용출액에 부패가 시작되면 사용이 불가하고, 폐기하거나 대안으로 광범위하게 오염된 물질을 제거해야 하므로 시간과 비용이 요구된다. 따라서, 통류 또는 용출액의 부패를 방지해야 한다. 통류 또는 용출액의 부패를 피하는 작업은 최근에 증가되는 상기 시스템에서 나오는 통류 또는 용출되는 시점에, 특히, 장시간 실행되는 과정을 위해 생산성의 증가를 위한 노동 시간에 대한 개인 작업 참여가 추가적으로 요구된다. 결과적으로, 정제 과정의 실행은 시스템으로 분리된 통류 또는 용출되는 시점을 순차적으로 시간과 실행된 정제 과정의 수를 제한하도록 개인 작업의 일반적인 일과 시간 내로 정해진다.
따라서, 본 발명의 목적은 시스템을 기반으로 하는 현재의 FPLC의 단점을 극복하기 위한 수단을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 유연성 및 생산성이 향상된 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 상기와 같은 목적은 하기의 청구항들 제1항 내지 제23항에 기재된 내용에 의해 해결된다.
폴리펩티드를 정제하기 위한 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography: FPLC)에 기반한 방법으로서,
a) 폴리펩티드를 함유한 액상 용액(liquid solution)을 정지상(stationary phase)을 포함하는 크로마토그래피 수단에 부가하는 과정;
b) 크로마토그래피 수단의 정지상을 통해 액상 용액을 통과시킴으로써, 액상 용액에 포함되어 있는 다른 분자들로부터 폴리펩티드를 분리하는 과정;
c) 통류(flow-through) 또는 용출액(eluate)에서 크로마토그래피 수단으로부터 폴리펩티드를 회수하는 과정; 및
d) 여과에 의해 회수된 폴리펩티드를 포함하는 통류 또는 용출액을 살균하는 과정;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.
상기 b) 과정에서 상기 폴리펩티드가 정지상과 상호작용하며 정지상에 보존되고, 상기 c) 과정에서 상기 폴리펩티드가 용출에 의해 회수되는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.
상기 d) 과정에서 상기 여과는 진공식 여과인 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.
상기 a) 과정 내지 상기 d) 과정 중 적어도 하나의 과정은 자동적으로 제어되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제를 위한 정제방법일 수 있다.
또한, 상기 정지상은 바이오 고분자, 무기 고분자 또는 합성 고분자이고, 이들 각각은 결합된 작용기들을 선택적으로 가지고 있거나, 막(membrane) 또는 단일체(monolith)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제를 위한 정제방법일 수 있다.
본 발명은, 폴리펩티드를 정제하기 위해 구성되어 있는 자동화된 고속 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템으로서, i) 크로마토그래피 모듈 및 ii) 상기 크로마토그래피 모듈 뒤에 배치된 여과 모듈(filtration module)을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 여과 모듈은 크로마토그래피 모듈로부터 회수된 폴리펩티드를 함유하는 통류 또는 용출액을 무균 여과(sterile filtrating)하기 위한 적어도 하나의 여과 수단, 및 상기 적어도 하나의 여과 수단에 의한 무균 여과를 제어하기 위한 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 여과 모듈은 크로마토그래피 모듈로부터 회수된 폴리펩티드를 함유하는 통류 또는 용출액을 무균 여과하기 위한 2 이상의 여과 수단들, 및 각각의 여과 수단에 대해, 상기 여과 수단들에 의한 무균 여과를 제어하기 위해 기능적으로 연결되어 있는 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 무균 여과는 진공을 인가하여 구동되는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 제어 수단은 적어도 하나의 전기적 전력 계전기(electrically powered relay), 및 적어도 하나의 전기기계식 밸브(electromechanical valve)를 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있으며, 상기 전기적 전력 계전기는 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 입력단자 및 출력단자를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
각각의 제어 수단은 전기적 전력 계전기 및 전기기계식 밸브를 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 제어 수단은 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 입력단자 및 출력단자를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 전기기계식 밸브는 여과 수단에 진공의 공급 전달을 제어하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 전기기계식 밸브는 전기적 전력 계전기에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 전기기계식 밸브는 솔레노이드 밸브인 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 여과 수단은 필터 컵인 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
상기 여과 수단은 4개의 여과기와 4개의 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템일 수 있다.
본 발명은, 상기 자동화된 크로마토그래피 시스템을 위해 구성된 여과 모듈로서, 폴리펩티드가 포함된 용액을 무균 여과하기 위한 적어도 하나의 여과 수단과, 적어도 하나의 상기 여과 수단에 의한 무균 여과를 제어하는 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 여과 모듈일 수 있다.
상기 폴리펩티드를 포함하는 용액을 무균 여과하기 위한 2 이상의 여과 수단들, 및 각각의 여과 수단에 대해, 상기 여과 수단들에 의한 무균 여과를 제어하기 위해 기능적으로 연결된 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 여과 모듈일 수 있다.
상기 여과 모듈은 4개의 여과 수단과 4개의 제어 수단을 포함함으로써, 항상 하나의 여과 수단이 제어 수단에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 여과 모듈일 수 있다.
본 발명은, 여과 모듈을 위해 구성된 제어 수단으로서, 적어도 하나의 전기적 전력 계전기, 및 적어도 하나의 전기기계식 밸브를 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있으며, 상기 전기적 전력 계전기는 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 입력단자 및 출력단자를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제어 수단일 수 있다.
2 이상의 전기적 전력 계전기들, 및 적어도 2 이상의 전기기계식 밸브들을 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있으며, 상기 전기적 전력 계전기는 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 2 이상의 입력단자들 및 2 이상의 출력단자를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제어 수단일 수 있다.
상기 제어 수단은 4개의 계전기와 4개의 밸브를 포함함으로써, 항상 하나의 계전기는 하나의 밸브에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 제어 수단일 수 있다.
칼럼 정제와 같은 크로마토그래피 수단으로 일단 배출된 통류 또는 용출액을 직접적으로 살균하고, 상기 생체분자는 부패의 위험 없이 오랜 시간동안 잘 저장되도록 상기 생체분자를 함유한다 (예, 크로마토그래피 후 연속적으로 무균 여과를 직접 실행시킨다). 이러한 방법으로, 본 출원은 바람직하게 하나의 크로마토그래피 모듈과 연속적으로 다수 개 평면 여과 수단들(예, "둘 이상")을 포함하는 장치를 나타낸다. 상기와 같은 장치의 장점은 크로마토그래피 모듈이 주어진 시간 내에 더 많은 양의 액체를 여과하는 다수개의 평면 여과 수단들을 통과하여 투과된 후 용출액이 만들어 진다는 것이다.
따라서, 상기 방법 및 시스템은 상기 과정의 수행 시간을 탄력적으로 증가하도록 한다. 상기 시스템의 생산성이 증가됨으로써, 참관하지 않는 야간 작업이 가능하여 소요시간 및 근무시간을 모두 줄일 수 있다. 더욱이, 진공 여과 사용은 압력에 의한 직렬 여과 작동을 부가한 상기 시스템 동력을 바꾸지 않는다.
도 1은 하나의 전기적 전력 EUL 계전기 및 하나의 가스 솔레노이드 밸브를 포함하는 본 발명의 제어 수단의 모식도이다.
도 2는 배열된 4개의 전기적 전력 EUL 계전기 및 4개의 가스 솔레노이드 밸브를 포함하는 본 발명의 또 다른 제어 수단의 모식도이다.
용어 정의
특별히 언급되지 않는다면, "폴리펩티드"와 "단백질"은 적어도 두개의 아미노산으로부터 합성된 화합물을 나타낸다. 상기 "폴리펩티드"와 "단백질"은 촉매 또는 결합 능력을 가질 수 있다. 상기 "폴리펩티드"와 "단백질"은, 예를 들어, 도메인 또는 단일 도메인 항체와 같은 효소 또는 항체일 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 본원발명의 목적을 위해, 두 가지 용어는 상호 혼용되어 사용될 수 있다.
특별히 언급된 바 없으면, "아미노산"은 적어도 하나의 아미노기와 적어도 하나의 산성기를 포함하는 유기 화합물을 모두 포함한다. 상기 아미노산은 자연적으로 생성되는 화합물 또는 합성체의 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 아미노산은 적어도 하나의 프라이머리 아미노기 및/또는 적어도 하나의 카르복실산기를 함유하고 있다. 또한, "아미노산"은 아미노산 화합물로부터 추출된 펩티드와 단백질과 같은 더 큰 분자들에 함유된 잔유물을 나타내고, 펩티드 결합 또는 펩티드성 결합 방식에 의해 인접한 잔류물들의 결합에 의한 펩티드와 단백질과 같은 더 큰 분자들에 함유된 잔유물을 나타낸다.
특별히 언급된 바 없으면, "정지상(stationary phase)"은 액상 용액(liquid solution) 내의 물질들 간의 상호 작용하는 고체 물질을 나타낸다.
특별히 언급된 바 없으면, "용출액(eluate)"은 크로마토그래피 수단에 의해 추출된 액체를 나타내고, 정지상으로부터 정지상에 함유된 물질로부터 제거 또는 용해된다.
특별히 언급된 바 없으면, "통류(flow-through)"는 정지상으로부터 정지상에 함유된 물질로부터 제거 또는 용해되지 않고 크로마토그래피 수단으로부터 통과 및 추출되는 액체를 의미한다.
특별히 언급되 바 없으면, "무균 여과되는" 및 "무균 여과"는 통류 또는 용출액으로부터의 미생물들(예, 박테리아, 곰팡이 등)과 같은 오염물의 제거를 나타낸다. 여과 과정에서, 오염물들은 통류 또는 용출액에 함유된 다른 성분들로부터 오염물을 분리하는 여과에 의해 유지된다.
하나의 형태로, 본 발명은 폴리펩티드를 정제하기 위한 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography: FPLC)에 기반한 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 과정을 포함한다;
a) 폴리펩티드를 함유한 액상 용액을 정지상을 포함하는 크로마토그래피 수단에 부가하는 과정;
b) 크로마토그래피 수단의 정지상을 통해 액상 용액을 통과시킴으로써, 액상 용액에 포함되어 있는 다른 분자들로부터 폴리펩티드를 분리하는 과정;
c) 통류 또는 용출액에서 크로마토그래피 수단으로부터 폴리펩티드를 회수하는 과정; 및
d) 여과에 의해 회수된 폴리펩티드를 포함하는 통류 또는 용출액을 살균하는 과정.
본 발명에 따른 상기 크로마토그래피 수단은 일반적으로 칼럼 크로마토그래피, 막 크로마토그래피 또는 단일체 크로마토그래피 또는 단백질 및 폴리펩티드를 정제하는데 사용되는 수단을 나타낸다.
하나의 실시예로서, 상기 크로마토그래피 수단은 칼럼 정제를 나타낸다. 이러한 전형적으로 사용되는 상기 칼럼 정제는 정지상을 포함하는 다양한 크기와 내경을 가진 튜브를 나타낸다. 일반적으로, 상기 튜브의 크기와 내경은 각각 1 cm 내지 30 cm 및 0.1 내지 5 cm 범위이다. 그러나, 튜브의 크기는 2 m까지 일 수도 있다. 상기 튜브는 스테인리스 스틸와 같은 금속 또는 유리로 만들어질 수 있다. 상기 칼럼 정제는, 특별히 한정되지 않으며, 상업적으로 이용 가능한 Tr corn™ columns, MiniBeads™ columns, RESOURCE™ columns, HiTrapTK columns, HiLoad™ columns, HiPrep™ columns, Superdex™ columns and Superoselㅎ columns로부터 선택될 수 있다.
대안으로, 상기 칼럼 정제는 빈 칼럼 몸체에 선택된 정지상이 패킹된 실험실 세트를 통해 마련될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 하나의 예로서 칼럼 몸체는 the GE Healthcare XK series and the Millipore Vantage series일 수 있다.
상기 정지상은 고체 파일링(filling) 물질이고, 바이오 고분자, 합성 고분자 또는 무기 고분자일 수 있다. 바이오 고분자는 셀룰로스, 덱스트란 또는 아가로스로부터 선택될 수 있다. 상기 합성 고분자는 폴리아크릴아마이드, 메탈크릴레이트 또는 폴리비닐벤젠/폴리스틸렌으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 고분자는 실리카, 히드록시아파타이트(수산화인회석) 또는 다공성 유리 구슬일 수 있다. 바람직하게, 상기 파일링 물질에는 폴리펩티드와 특별한 상호 작용이 일어날 수 있는 작용기들이 더 연결될 수 있다. 이러한 작용기들은, 특별히 한정되지 않으며, quaternary hydroxypropyl diethyl aminoethyl (QAE), quaternary trimethyl aminoethyl (Q), diethyl aminoethyl (DEAE), carboxymethyl (CM), sulfomethyl (S), sulfopropyl (SP) 일 수 있다. 상기 작용기는 친 폴리펩티드에 특이성 결합 파트너와 같은 특이성 또는 단일 특이성 리간드 군일 수 있다.
또 다른 실시예로서, 상기 크로마토그래피 수단은 정지상으로서 막(membrane)을 포함하는 케이싱(casing) 또는 칼럼이다. 상기 칼럼은 상기에서 설명한 튜브일 수 있다.
크로마토그래피에 사용되는 막은 해당 분야에서 주지된 내용이다. 상기 막은, 예를 들어, 특별히 한정되지 않으며, 하나 또는 그 이상, 2, 3 또는 4개의 층(layer)으로 구성될 수 있다. 상기 막의 모조직은, 특별히 한정되지 않으며, 셀룰로스, 개질 셀룰로스, 가교 결합된 셀룰로스 및 니트로셀룰로스, 나이론, 폴리비닐크로라이드 또는 폴리비닐리덴 플로라이드와 같은 폴리아미드일 수 있다.
또 다른 예로서, 상기 크로마토그래피 수단은 정지상인 단일체를 함유한 칼럼 또는 케이싱일 수 있다.
상기 크로마토그래피에 사용되는 단일체는 해당 분야에서 주지된 내용이다.
구체적인 예로서, d) 과정에서 여과는 진공식 여과일 수 있다.
또 다른 형태로, 본 발명은 폴리펩티드를 정제하기 위해 구성되어 있는 자동화된 고속 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 상술한 방법에 따른 폴리펩티드를 정제하기 위한 구성된 자동화된 고속 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 제공한다. 본 발명에 따른 상기 시스템은 크로마토그래피 모듈 및 여과 모듈을 포함한다. 상기 여과 모듈은 상기 크로마토그래피 모듈 뒤에 배치된다.
본 발명의 상기 시스템에 따른 크로마토그래피 모듈은 크로마토그래피 수단, 펌프, 감지 시스템 및 제어 유닛을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 상기 크로마토그래피 모듈은 자동시료주입기(autosampler) 및/또는 자동 분주기(a fraction collector)를 포함하여 구성된다. 크로마토그래피 모듈로서, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom에 의해 제조 및 제공되는 AKTA™FPLC 장치는 본 발명에 사용될 수 있다.
상기 크로마토그래피 수단은 상술한 바와 같다.
상기 펌프는 상기 시스템을 통해 액체의 흐름을 지속시킨다. 상기 칼럼 크로마토그래피 모듈은 두 개 이상의 펌프, 예를 들어, 특별히 한정되지 않으며, 2, 3 또는 4개의 펌프를 포함할 수 있다. 상기 펌프는 연동 펌프일 수 있다. 또, 상기 펌프는 다이어프램, 체크식 피스톤(checked piston) 또는 로브 펌프(lobe pump)일 수 있다. 상기 펌프의 유속은 0.001에서 100 ml/min일 수 있다.
상기 감지 시스템은 상기 크로마토그래피 수단에 남아 있는 상기 분자(들)을 감지한다. 상기 감지 시스템은 분광 광도계(UV spectrophotometer)일 수 있다. 대안으로, 또한, 상기 감지 시스템은 전도성 유동 셀 또는 pH 전극일 수 있다.
상기 제어 유닛은 각각의 시스템 요소를 자동식으로 제어한다. 상기 제어 유닛은 각각의 시스템 요소를 제어하는 컴퓨터 프로그램을 실행하는 컴퓨터 수단일 수 있다. 상기 컴퓨터 수단은 컴퓨터 프로세서가 실행되어 컴퓨터 프로그램이 로딩되는 개인용 컴퓨터일 수 있다. 또한, 상기 컴퓨터 수단은 씬 클라이언트 네트워크(a network thin client)일 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom에서 이용 가능한 UNICORN*1 제어 소프트웨어일 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 UNICORN*1 제어 소프트웨어가 바람직하다.
본 발명의 시스템에 따른 상기 여과 모듈은 크로마토그래피 모듈로부터 회수된 통류 또는 용출액을 무균 여과하기 위한 적어도 하나의 여과 수단과, 상기 적어도 하나의 여과 수단에 의한 무균 여과를 제어하기 위한 제어 수단을 포함한다. 상기 여과 모듈은 2 이상의 여과 수단 및/또는 2 이상의 조절 수단, 예를 들어, 특별히 한정되지 않으며, 2, 3 또는 4개의 여과 수단 및/또는 2, 3 또는 4개의 조절 수단을 포함할 수 있다.
상기 여과 수단은 상기 통류 및 용출액을 무균 여과되도록 한다. 예를 들어, 미생물들과 같은 오염물들이 상기 통류 및 용출액으로부터 제거된다. 상기 여과 수단은 필터가 구비된 장치이다. 본 발명에 따른 하나의 예로서, 상기 여과 수단은 필터 컵이고, 또한, 진공식 바틀탑 필터(vacuum driven bottle top filter)이다. 상기 필터 컵은 해당 분야에서 주지된 내용이다. 필터 컵 사용으로 상기 통류 또는 용출액이 직접적으로 포집될 수 있고, 이 후에 유동 없이 무균 여과가 이루어질 수 있다. 상기 필터의 구멍 크기는, 0.45 내지 0.1 ㎛의 범위내로, 예들 들어, 0.45 ㎛, 0.22 ㎛ 또는 0.1 ㎛일 수 있다. 0.45 내지 0.1 ㎛ 범위의 구멍 크기에는 일반적으로 박테리아와 같은 미생물이 함유되어 있다. 구체적인 예로서, 상기 필터의 구멍 크기는 0.22 ㎛이다.
상술한 바와 같이, 상기 무균 여과는 진공에 의해 수행될 수 있다. 이 경우에, 진공은 부압이 인가된 상기 필터를 통해 액체와 공기를 촉진하는 여과 수단에 의해 제공된다. 이는 여과된 상기 액체가 홀딩된 면의 필터 반대쪽 면에 위치한 여과 수단에 형성된 진공 유입구를 통해 진공이 공급됨으로써 이루어진다. 상기 진공은 수요식 진공 펌프 또는 파이프식 진공 펌프인 진공 소스(source)에 의해 발생된다. 상기 여과 수단 및 진공 소스는 가스 튜브 및/또는 실리곤 실험용 튜브를 거쳐 연결된다.
본 발명의 상기 조절 수단은 여과 수단에 의한 무균 여과를 제어한다. 상기 조절 수단은 적어도 하나의 전기적 전력 계전기 또는 상응하는 고체를 포함한다. 그리고, 기능적으로 연결된 적어도 하나의 전기기계식 밸브를 포함한다. 상기 전기적 전력 계전기와 상기 전기기계식 밸브는 전기회로를 통해 기능적으로 연결되어 있다. 상기 전기회로는 이력 현상을 가진 입력 임피던스 전압 검출 계전기를 구성한다.
상기 제어 수단은 두 개 이상의 전기적 전력 계전기 및/또는 두 개 이상의 전기기계식 밸브를 포함하고, , 예를 들어, 특별히 한정되지 않으며, 2, 3 또는 4개의 전기적 전력 계전기 및/또는 2, 3 또는 4개의 전기기계식 밸브들을 포함한다. 구체적인 예로서, 본 발명의 상기 제어 수단은 4개의 계전기가 배치된 구조를 포함한다.
상기 전기적 전력 계전기는 저전력 계전기일 수 있다. 이는 계전기로서 동일 공간에 설치된 DC 24V 전력 공급 유닛에 의해 전력이 공급될 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 계전기는 DC 24V 전력 공급기에 의해 전력이 공급된다.
상기 전기적 전력 계전기는 제어 유닛에 의해 제어된다. 상기 제어 유닛은 상기 계전기의 스위치를 조절하는 컴퓨터 프로그램을 실행하는 컴퓨터 수단일 수 있다. 컴퓨터 수단에 의해 제어되도록, 상기 전기적 전력 계전기는 상기 컴퓨터 수단에 상기 계전기가 연결되도록 하는 입력 단자와 출력단자를 포함한다. 구체적인 예로서, 상기 전기적 전력 계전기는 상술한 크로마토그래피 모듈의 상기 제어 유닛에 의해 제어된다.
구체적인 예로서, 하나 이상의 전기기계식 밸브들은 솔레노이드 밸브다. 솔레노이드 밸브들은 밸브의 개폐로 솔레노이드를 통해 전기적 전류가 통전 또는 단전되도록 함으로써 액체 또는 가스를 사용하는 전기기계식 밸브다. 상기 솔레노이드는 코일 또는 와이어일 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 솔레노이드 밸브는 가스 솔레노이드 밸브다.
진공 여과가 수행되는 구체적인 예로서, 가스 솔레노이드 밸브는 여과 수단에 진공의 공급 전달을 제어하는데 사용된다. 이러한 예에서, 상기 가스 솔레노이드 밸브는 상기 여과 수단과 상기 진공 소스 사이에 배치된다.
실시예
상기 제어 수단이 구성된 하나의 예가 도 1에 나타나 있다. 도 1에 나타난 상기 제어 수단은 단일 공간에서 DC 24V, EUL 계전기 및 가스 솔레노이드 밸브로 구성되어 있다. 상기 구성 요소들은 전기적 와이어에 의해 연결되어 있다. 단자 E2 및 M을 경유하는 상기 계전기는 PIN 6 및 AKTA™ 정제 장치의 PINI 5에 각각 연결되어 있다. 상기 가스 솔레노이드 밸브는 상기 EUL 계전기의 단자 11 및 12에 연결되어 있다.
상기 제어 수단이 구성된 또 다른 하나의 예가 도 2에 나타나 있다. 도2에 나타난 상기 제어 수단은 단일 공간에서 DC 24V, 4개의 EUL 계전기 및 4개의 가스 솔레노이드 밸브로 구성되어 있다. 상기 구성 요소들은 전기적 와이어에 의해 연결되어 있다. 각각의 상기 계전기는, 단자 M을 경유하여 ATA™ 정제 장치의 PIN5에 연결된 상태에서, 이들 단자 E2를 경유하여 ATA™ 정제 장치의 PIN 6, PIN 7, PIN 8 또는 PIN 9에 각각 연결된다. 각각의 상기 가스 솔레노이드 밸브는 하나의 EUL 계전기의 단자 11 및 12에 연결되므로, 상기 ATA™ 정제 장치에 의해 독립적으로 제어된다.
상기와 같은 구조는 UNICORN™가 솔레노이드 밸브를 제어하는 소프트웨어를 제어할 수 있으므로, 진공을 공급 전달할 수 있다.
상기에서 설명된 상기 여과 모듈 및 제어 수단은 모두 본 발명의 형태들에 포함된다. 이들 형태에 따르면, 여과 모듈 및 제어 수단은 본 발명에 따른 구성에 의해 제공되고, 시스템을 기반으로 하는 고속 액체 크로마토그래피(FPLC)에 사용된다.
AKTK 진공 제어 장치
상기 AKTK 진공 제어 장치의 목적은 제품의 특징들이 품질 및 온전성을 유지하면서 시스템에 영향을 주지하고 무균 소독할 수 있는 AKTA 시스템으로부터 진공에 의한 용출 방법을 제공한다. 이러한 효과는, 매뉴얼 조정 조건들이 줄어듦으로써, 하루의 상당 부분을 상기 AKTA 시스템의 이용으로 가능하다. 효과를 논증하기 위해, 상기 장치의 유무에 따른 작동의 비교가 제공된다.
장치를 갖추지 않은 작동
상기 시스템은 일과 시작 과정에서 실험자가 설치한다. 이 경우에, 이러한 과정은 대략 8 시간 정도 필요하다. 대략 7 시간 이후에, 실험자는 분석 또는 추가 진행을 위해 용출액 샘플을 제거하고, 상기 시스템에 의해 이러한 과정이 완료된다. 상기 AKTA에 의해 3 과정이 완료되는 비감시 야간에도 수행을 가능하게 한다. 그러나, 첫 번째 과정에서 수행된 상기 산출량은 주위의 실온에서 16 시간 동안 수행되고, 두 번째 과정에서 수행된 상기 산출량은 주위의 실온에서 8 시간 동안 수행된다. 상기 AKTA는 멸균 시스템이 아니며, 상기 시스템 또는 실험실 공기에서의 오염 측정치로 본다. 고단백 용액은 포집된 샘플의 부패에 영향을 주는 세균의 증식을 조장하므로 결과적으로, 차후 분석 또는 추가 프로세싱에 부정적인 영향을 미친다.
장치를 갖춘 작동
상기 실험예는 상기 AKTA 정제 시스템을 사용하여 수행한 것이다. 상기 시스템은 실험자가 일과 시작시에 설치한다. 충분한 재료가 각각 대략 8 시간의 3번의 과정을 수행하는 기계에 제공된다. 8 시간 후의 상기 시스템은 하나의 과정으로부터 산출량을 포집하고, 상기 장치의 제어 하에서 멸균한다. 15 시간 후의 두 번째 과정으로부터의 상기 용출액은 멸균되고, 마찬가지로 뒤이은 23 시간 후의 세 번째 과정에서도 멸균된다. 상기 첫 번째 과정으로부터의 상기 용출액은 실온에서 16 시간 동안 보관되지만, 무균 여과에 의해 미생물이 제거되므로 세균의 증식은 발생하지 않으며, 두 번째 과정에서도 마찬가지이다.
요약
장치 없는 작동은 상기 AKTA에 의한 시료의 생산이 일과 내로 제한된다. 일과 이외에 장치 가동의 시도는 세균의 증식에 의한 손상 및 오염의 위험이 발생된 생산샘플을 가져온다.
장치를 갖춘 작동은 세균 증식의 위험 없는 자동화식 크로마토그래피 시스템이 만들어짐으로써, 최대 살균이 가능해 진다.
따라서, 상술된 본 발명의 몇 가지 형태를 가짐으로써, 상술한 구체적인 예들의 가능한 모든 조합들을 포함하는 본 발명의 본질 및 범위를 통해 이해할 수 있다. 또한, 다양한 치환, 조정 및 향상들이 당해 분야에서 꾸준히 발생할 것이다. 이러한 치환, 조정 및 향상들은 당해 분야의 한 부분으로 의미된 것이고, 본 발명의 본질 및 범위 내로 의미된 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 도면은 단지 하나의 예로서 나타낸 것이다.

Claims (23)

  1. 폴리펩티드를 정제하기 위한 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography: FPLC)에 기반한 방법으로서,
    a) 폴리펩티드를 함유한 액상 용액(liquid solution)을 정지상(stationary phase)을 포함하는 크로마토그래피 수단에 부가하는 과정;
    b) 크로마토그래피 수단의 정지상을 통해 액상 용액을 통과시킴으로써, 액상 용액에 포함되어 있는 다른 분자들로부터 폴리펩티드를 분리하는 과정;
    c) 통류(flow-through) 또는 용출액(eluate)에서 크로마토그래피 수단으로부터 폴리펩티드를 회수하는 과정; 및
    d) 여과에 의해 회수된 폴리펩티드를 포함하는 통류 또는 용출액을 살균하는 과정;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, b) 과정에서 상기 폴리펩티드가 정지상과 상호작용하며 정지상에 보존되고, c) 과정에서 상기 폴리펩티드가 용출에 의해 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, d) 과정에서 상기 여과는 진공식 여과인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나에 있어서, a) 과정 내지 d) 과정 중 적어도 하나의 과정은 자동적으로 제어되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제를 위한 정제방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 정지상은 바이오 고분자, 무기 고분자 또는 합성 고분자이고, 이들 각각은 결합된 작용기들을 선택적으로 가지고 있거나, 막(membrane) 또는 단일체(monolith)인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 정제를 위한 정제방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 정제하기 위해 구성되어 있는 자동화된 고속 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템으로서, i) 크로마토그래피 모듈() 및 ii) 상기 크로마토그래피 모듈 뒤에 배치된 여과 모듈(filtration module)을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 여과 모듈은 크로마토그래피 모듈로부터 회수된 폴리펩티드를 함유하는 통류 또는 용출액을 무균 여과(sterile filtrating)하기 위한 적어도 하나의 여과 수단, 및 상기 적어도 하나의 여과 수단에 의한 무균 여과를 제어하기 위한 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 여과 모듈은 크로마토그래피 모듈로부터 회수된 폴리펩티드를 함유하는 통류 또는 용출액을 무균 여과하기 위한 2 이상의 여과 수단들, 및 각각의 여과 수단에 대해, 상기 여과 수단들에 의한 무균 여과를 제어하기 위해 기능적으로 연결되어 있는 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 무균 여과는 진공을 인가하여 구동되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 제어 수단은 적어도 하나의 전기적 전력 계전기(electrically powered relay), 및 적어도 하나의 전기기계식 밸브(electromechanical valve)를 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있으며, 상기 전기적 전력 계전기는 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 입력단자 및 출력단자를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 하나에 있어서, 각각의 제어 수단은 전기적 전력 계전기 및 전기기계식 밸브를 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 제어 수단은 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 입력단자 및 출력단자를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기기계식 밸브는 여과 수단에 진공의 공급 전달을 제어하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기기계식 밸브는 전기적 전력 계전기에 의해 제어되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기기계식 밸브는 솔레노이드 밸브인 것을 특징으로 하는 시스템.
  16. 제 6 항 내지 제 15 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 여과 수단은 필터 컵인 것을 특징으로 하는 시스템.
  17. 제 6 항 내지 제 16 항 중 어느 하나에 있어서, 상기 여과 수단은 4개의 여과기와 4개의 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  18. 제 6 항 내지 제 17 항 중 어느 하나에 따른 자동화된 크로마토그래피 시스템을 위해 구성된 여과 모듈로서, 폴리펩티드가 포함된 용액을 무균 여과하기 위한 적어도 하나의 여과 수단과, 적어도 하나의 상기 여과 수단에 의한 무균 여과를 제어하는 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 여과 모듈.
  19. 제 18 항에 있어서, 폴리펩티드를 포함하는 용액을 무균 여과하기 위한 2 이상의 여과 수단들, 및 각각의 여과 수단에 대해, 상기 여과 수단들에 의한 무균 여과를 제어하기 위해 기능적으로 연결된 제어 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 여과 모듈.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 여과 모듈은 4개의 여과 수단과 4개의 제어 수단을 포함함으로써, 항상 하나의 여과 수단이 제어 수단에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 여과 모듈.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 하나에 따른 여과 모듈을 위해 구성된 제어 수단으로서, 적어도 하나의 전기적 전력 계전기, 및 적어도 하나의 전기기계식 밸브를 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있으며, 상기 전기적 전력 계전기는 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 입력단자 및 출력단자를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제어 수단.
  22. 제 21 항에 있어서, 2 이상의 전기적 전력 계전기들, 및 적어도 2 이상의 전기기계식 밸브들을 포함하고 있고, 이들은 기능적으로 연결되어 있으며, 상기 전기적 전력 계전기는 컴퓨터 수단에 의한 제어를 위해 2 이상의 입력단자들 및 2 이상의 출력단자를 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제어 수단.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 제어 수단은 4개의 계전기와 4개의 밸브를 포함함으로써, 항상 하나의 계전기는 하나의 밸브에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 제어 수단.
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