CN102766205A - 一种载脂蛋白b的快速纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种载脂蛋白B的快速纯化方法，包括步骤：A）取人血浆，加入缓冲溶液稀释并混匀；B）将得到的稀释血浆样品置于65~75℃的第一水浴中加热后，离心，取上清液；C）往上清液中加入0.5~3%体积分数的表面活性剂，混匀，得到处理后的上清液；D）将处理后的上清液置于50~60℃的第二水浴中加热后，离心，弃上清液，收集沉淀；E）将沉淀用0.01~0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，抽滤，得到纯化后的载脂蛋白B。本发明提供的载脂蛋白B的快速纯化方法操作步骤简单，所需设备简单，纯化后的产物纯度高，有效降低了纯化成本。

Description

一种载脂蛋白B的快速纯化方法
技术领域
本发明涉载脂蛋白的纯化方法，尤其涉及一种载脂蛋白B的快速纯化方法。
背景技术
载脂蛋白B是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-CHOL）的主要结构蛋白，约占LDL-CHOL总蛋白含量的97%，载脂蛋白B的测定可直接反映LDL-CHOL的水平。载脂蛋白与脂类结合在一起，组成类似微胶束的球体，载脂蛋白在其中起到稳定球体结构和脂类转运的功能。载脂蛋白B与脂类组成的胶体球被称为低密度脂蛋白，直径为普通蛋白质20~40倍。载脂蛋白B被认为是动脉粥样硬化的危险因素，测定其浓度对动脉粥样硬化，心血管疾病的判断和预测提供有价值的指标，具有重要的诊断和预防意义。临床用以测量载脂蛋白B浓度的方法主要是免疫比浊法，需要消耗大量的载脂蛋白B及其多克隆抗体血清。
当前，载脂蛋白B的纯化方法包括高速梯度离心法、右旋硫酸葡萄糖苷沉淀法和高效液相色谱法等。高速梯度离心法存在处理量小，纯化效率低，纯化成本高的缺点。高效液相色谱法存在需要昂贵的设备以及熟练的操作人员，纯化成本高的缺点。右旋硫酸葡萄糖苷沉淀法是当前常用的纯化方法，但该方法存在试剂昂贵；操作繁琐，长时间透析，增加了纯化成本，延长了生产周期；纯化产品降解片段多，纯度不够高；且由于目前右旋硫酸葡萄糖苷沉淀载脂蛋白B的原理尚不明确，沉淀不能重新解离，即得到的沉淀为不可逆沉淀，沉淀复合物中载脂蛋白B的理化性质发生改变，严重干扰载脂蛋白B的进一步纯化。
因此，开发载脂蛋白B的简单快速纯化方法，对于降低载脂蛋白B和其抗体的制备成本具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，发明人在载脂蛋白B的纯化方面进行了大量的探索，预料不到地发现，通过热稳定性差异发展而来的两次加热沉淀技术可实现人血浆中载脂蛋白B的快速高效纯化，且具有操作步骤简单，无需昂贵设备，纯化后的产物纯度高，纯化得率高，可有效降低纯化成本的优点，从而实现本发明。
本发明提供一种载脂蛋白B的快速纯化方法，包括如下步骤：
A）  取人血浆，加入缓冲溶液稀释并混匀后得到稀释血浆样品；
B） 将所述稀释血浆样品置于65~75℃的第一水浴中加热，期间每隔5分钟轻轻混匀所述稀释血浆样品一次，以避免发生共沉淀，从而提高了载脂蛋白B的纯化得率；水浴加热15~25分钟后，将所述稀释血浆样品于7500~8500g条件下离心10~20分钟，取上清液；
C） 往所述上清液中加入0.5~3%体积分数的表面活性剂，混匀后静置3~5小时，得到处理后的上清液；
D）  将所述处理后的上清液置于50~60℃的第二水浴中加热，期间每隔5分钟轻轻混匀所述处理后的上清液一次，以避免发生共沉淀，从而提高了载脂蛋白B的纯化得率；水浴加热10~30分钟后，将所述处理后的上清液于7500~8500g条件下离心10~20分钟，弃上清液，收集沉淀；
E） 将所述沉淀用0.01~0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，抽滤，得到纯化后的载脂蛋白B。
采用上述技术方案，通过第一水浴的加热，使一些杂蛋白受热变性沉淀得以去除，而载脂蛋白B与脂类形成的低密度脂蛋白具有大的体积和更加复杂的胶体球结构，内部有更多的维持高级结构的分子间作用力，能耐受第一水浴的温度；当使用表面活性剂破坏低密度脂蛋白的胶体球结构后，被释放出来的载脂蛋白B无法耐受第二水浴的温度从而变性沉淀，沉淀经Tris-HCl缓冲液洗涤后，得到纯化后的载脂蛋白B。因此，本发明提供的载脂蛋白B的快速纯化方法操作步骤简单，主要为两次水浴加热、两次离心和一次表面活性剂处理步骤；所需设备简单，主要为水浴锅和离心机设备；纯化后的产物纯度高，纯化得率高，有效降低了载脂蛋白B的纯化成本。
作为本发明的进一步改进，所述缓冲溶液采用pH为5.0~6.5的磷酸缓冲溶液，可以保持载脂蛋白B的稳定，防止其提前变性。
作为本发明的进一步改进，所述第一水浴的温度为70℃，可使血浆中的大部分杂蛋白变性沉淀，且不会对低密度脂蛋白的胶体球结构造成影响。
作为本发明的进一步改进，所述表面活性剂采用曲拉通X-100，可破坏低密度脂蛋白的胶体球结构，从而释放出载脂蛋白B，且不会对载脂蛋白B的结构造成影响。
作为本发明的进一步改进，所述第二水浴的温度为55℃，可使载脂蛋白B变性沉淀，且不会导致其他蛋白的变性沉淀。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的载脂蛋白B的快速纯化方法操作步骤简单，主要为两次水浴加热、两次离心和一次表面活性剂处理步骤；所需设备简单，主要为水浴锅和离心机设备；纯化后的产物纯度高，纯化得率高，有效降低了载脂蛋白B的纯化成本。
附图说明
图1为本发明提供的方法纯化后的样品SDS-PAGE图谱。
图2为右旋硫酸葡萄糖苷沉淀法纯化后的样品SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一  载脂蛋白B的纯化。
取5mL人血浆，加入5mL pH 6.0的磷酸缓冲液进行体积比1：1的稀释，混匀，得到稀释血浆样品；将混匀后的稀释血浆样品置于70℃的第一水浴中加热，加热期间每隔5分钟轻轻混匀稀释血浆样品一次，加热20分钟后，将稀释血浆样品于8000g条件下离心15分钟，取上清液，变性的杂蛋白沉淀分离；往得到的上清液中加入0.1mL曲拉通X-100，混匀，静置4小时后，置于55℃的第二水浴中加热，加热期间每隔5分钟轻轻混匀上清液一次，加热20分钟后，将上清液于8000g条件下离心15分钟，弃上清液，收集沉淀；将收集的沉淀用0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，抽滤，得到纯化后的载脂蛋白B。将得到的纯化后的载脂蛋白B进行SDS-PAGE分析，结果如图1所示，纯化后的载脂蛋白B含量高，降解片段少（主要为2条），主要杂蛋白（人血清白蛋白）与载脂蛋白B分子量差别大，便于后期进一步纯化处理。
本实施例只是对本发明的一种说明，可以根据实际需要增加人血浆的处理量，以满足产业化的需求。
实施例二  载脂蛋白B的纯化。
取5mL人血浆，加入1%质量分数的右旋硫酸葡萄糖苷溶液300μL，震荡混匀。待血清颜色变成淡黄色后，再加入2mol/L的氯化钙300μL，反复颠倒混匀15min后，放入4°C冰箱中过夜。然后，于4°C环境下，4000g离心30min，弃上清液，沉淀溶解在5mL的12%质量分数的氯化钠中，加入pH7.4、0.2mol/L的Tris-HCl 缓冲液5mL离心10min，弃上清液，所得沉淀用0.02mol/L的Tris-HCl 洗涤一次；此步骤重复3次。沉淀溶解在10mL 1mol/L的草酸钾中，于4°C环境下，3000g离心30min，去沉淀。所得溶液在1%质量分数的氯化钠，1%质量分数的氯化钡中透析48h（4°C），透析后的溶液去沉淀，得到的上清液放入0.02mol/L的 Tris-HCl 缓冲液中透析72h，于4°C环境下，3000g离心10min，弃上清液，即得到纯化后的载脂蛋白B。将得到的纯化后的载脂蛋白B进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，与图1结果相比，右旋硫酸葡萄糖苷沉淀纯化后的载脂蛋白B含量较低，降解片段较图1多（主要为3条）。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种载脂蛋白B的快速纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：
A）取人血浆，加入缓冲溶液稀释并混匀后得到稀释血浆样品；
B）将所述稀释血浆样品置于65~75℃的第一水浴中加热，期间每隔5分钟轻轻混匀所述稀释血浆样品一次，水浴加热15~25分钟后，将所述稀释血浆样品于7500~8500g条件下离心10~20分钟，取上清液；
C）往所述上清液中加入0.5~3%体积分数的表面活性剂，混匀后静置3~5小时，得到处理后的上清液；
D）将所述处理后的上清液置于50~60℃的第二水浴中加热，期间每隔5分钟轻轻混匀所述处理后的上清液一次，水浴加热10~30分钟后，将所述处理后的上清液于7500~8500g条件下离心10~20分钟，弃上清液，收集沉淀；
E）将所述沉淀用0.01~0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，抽滤，得到纯化后的载脂蛋白B。
2.根据权利要求1所述的载脂蛋白B的快速纯化方法，其特征在于：所述缓冲溶液采用pH为5.0~6.5的磷酸缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的载脂蛋白B的快速纯化方法，其特征在于：所述第一水浴的温度为70℃。
4.根据权利要求1或2所述的载脂蛋白B的快速纯化方法，其特征在于：所述表面活性剂采用曲拉通X-100。
5.根据权利要求1或2所述的载脂蛋白B的快速纯化方法，其特征在于：所述第二水浴的温度为55℃。
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