CN101108874A - 一种载脂蛋白a-i的制备方法 - Google Patents

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本发明属生化药物制药领域，涉及载脂蛋白A－I的制备方法，具体涉及一种从废弃的人血浆F－IV组分分离制备载脂蛋白A－I(ApoA－I)的方法。本发明利用废弃人血浆F－IV组分经等电点沉淀、氯仿、乙醇处理获得纯度98％和按血浆F－IV ApoA－I含量计算收率高达23.5％，并保持天然ApoA－I生物活性的载脂蛋白A－I，每克湿重F－IV可制备3.1mg纯化ApoA－I，本发明为开发ApoA－I药用价值奠定了良好基础。提供了一种适合工业化生产的人血浆ApoA－I制备方法。

Description

一种载脂蛋白A-I的制备方法
技术领域
本发明属生化药物制药领域，涉及载脂蛋白A-I的制备方法，具体涉及一种从废弃的人血浆F-IV组分分离制备载脂蛋白A-I(ApoA-I)的方法。
背景技术
目前载脂蛋白A-I(ApoA-I)的制备仅有常规实验室制备方法。其方法是血浆以KBr调密度至1.34g/mL，加到铺有填液的离心管，经4℃，166000×g，20h超离心，取d1.063-1.021g/mL部分(HDL)，经透析、浓缩后，用乙醇/乙醚脱脂，离心分离沉淀(HDL载脂蛋白)，上清液用乙醚再次沉淀HDL载脂蛋白，合并两次沉淀，经Bio-CAD快速蛋白分离仪，POROS HQ-20强阴离子交换树脂分离，得电泳纯ApoA-I。
此方法缺点是：①原料是人血浆，资源严重短缺；②生产量小，每次分离量(100mL血浆)只得到25mg左右ApoA-I，不适合企业大规模生产；③对设备要求高，需超离心机等；④收率低，约为20％。
迄今，尚无适合企业大规模生产ApoA-I的方法。
发明内容
本发明的目的是提供适合企业大规模生产ApoA-I的新方法。
本发明利用废弃的人血浆F-IV组分，经等电点沉淀、氯仿、乙醇处理等，获得纯度98.4±2.06％的ApoA-I，收率达23.5％(按血浆F-IVApoA-I含量计算)。每克湿重F-IV可制备3.1mg纯化ApoA-I，并保持天然ApoA-I生物活性。
本发明方法克服了现有技术的缺陷，采用包括下述的关键技术，制成纯度和收率高，并保持天然ApoA-I生物活性的载脂蛋白A-I(ApoA-I)。
①pH7.3 65％乙醇-10mM NaHCO3抽提；
②pH5.5沉淀；
③pH8.6 100mMTris-HCl-6MUrea溶解沉淀；
④氯仿/乙醇(1∶1)脱脂；
⑤乙醇沉淀。
本发明所说的废弃的人血浆F-IV组分是本领域公知的有关生物制品企业制备血制品所废弃的人血浆F-IV组分。
本发明研究结果显示，人血浆ApoA-I是一种良好的抗内毒素(LPS)、抗炎化合物。经动物试验证实，ApoA-I对LPS血症及LPS诱导的急性炎症肺损伤具有优越的治疗作用。其作用机理是ApoA-I能结合、中和LPS毒性，阻断和抑制激活巨噬细胞和中性粒细胞释放的各种炎症介质。
本发明为开发ApoA-I药用价值奠定了良好基础。提供了一种适合工业化生产的人血浆ApoA-I制备方法。
本发明方法通过下述步骤实现。
①原料采用血制品企业中废弃的血浆F-IV组分，F-IV用4倍体积含乙醇、NaHCO3液于-20℃搅拌抽提，离心取上清液，
②上清液调pH5.5，离心收集沉淀，-4℃溶解于pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液，
③加等体积氯仿/乙醇液(1∶1)脱脂，-20℃静置，离心取上层液，
④加等体积乙醇，-20℃静置，离心取上清液，
⑤浓缩，经碳酸盐缓冲液透析，
⑥巴氏灭菌，除菌过滤。
⑦冻干，得ApoA-I干粉。
所制得的ApoA-I收率：按F-IV中ApoA-I含量计算为23.5±1.72％，ApoA-I纯度：SDS-PAGE凝胶扫描法达98.4±2.06％(见图1)，ApoA-I鉴定：SDS-PAGE分子量与天然ApoA-I相同为28.3kD(图1)，ApoA-I的Weston blotting检测呈阳性(见图2)。
本发明对所制得的ApoA-I进行生物活性检测，结果显示，
①体外酶标板上本方法制备的ApoA-I与天然ApoA-I即按常规超离心法从新鲜人血浆制备ApoA-I，在结合FITC标记内毒素能力上无显著性差异(表1)，
②体外细胞水平抑制内毒素激活的巨噬细胞释放细胞炎症因子对共培养L-929细胞杀伤率试验(MTT法)，本方法制备的ApoA-I与天然ApoA-I在抑制激活巨噬细胞细胞毒功能上无显著性差异(表2)。
表1.样品ApoA-I与天然ApoA-I与FITC-LPS在酶标板上体外结合能力比较
组别(n＝3) 结合FITC-LPS的荧光读数
天然ApoA-I+FITC-LPS样品ApoA-I+FITC-LPS  33.91±12.9446.09±18.91
两组之间结合FITC-LPS能力无显著性差异。
表2.样品ApoA-I与天然ApoA-I对LPS激活巨噬细胞细胞毒性抑制作用比较(MIT法)
组别(n＝3) L-929细胞存活率(％)
L-929细胞对照组LPS激活巨噬细胞组天然ApoA-I(10μg/mL)处理组样品ApoA-I(10μg/mL)处理组  100±12.4152.5±7.17▲▲105.6±15.48114.7±10.20
经Q检验，LPS激活巨噬细胞组与其余各组之间有极显著性差异(P＜0.01)，其余各组之间无差异。
本发明方法具有如下特点：
1)本方法操作简易，对设备要求低，适用企业大规模生产。
2)本方法利用工业废弃血浆F-IV，有利于血浆的综合利用，节省宝贵的血资源。
3)本方法ApoA-I收率23.5％，比从新鲜血浆按常规超离心方法的收率20％高。平均每克湿重F-IV(其中约70％是硅藻土)，可制备3.1mg ApoA-I。
附图说明
图1是样品ApoA-I纯度的SDS-PAGE鉴定，
其中，A：低分子量标准蛋白，
B：20μg样品ApoA-I，
C；40μg样品ApoA-I，
D：80μg样品ApoA-I。
图2是样品ApoA-I的Weston blotting鉴定，
其中，A：低分子量标准蛋白SDS-PAGE
B：样品ApoA-I SDS-PAGE
C：样品ApoA-I Weston blotting图谱
具体实施方式
实施例1
30g F-IV加120mL 65％乙醇-10mM NaHCO3(pH7.3)溶液，-20℃搅拌2h，离心分离上清液，调上清液pH至5.5，离心分离沉淀，沉淀完全溶解于50mL 100mM Tris-HCl-6M Urea(pH8.6)溶液。加等体积-20℃预冷的氯仿/乙醇(1∶1)液，振荡均匀，-20℃静置2h。离心，取上层液，加等体积-20℃预冷的乙醇，振荡均匀，-20℃静置2h，离心分离上清液。将上清液浓缩并对碳酸盐缓冲液(20mM)透析，巴氏灭菌，除菌过滤后，冻干，得ApoA-I干粉。

Claims (4)

1.一种载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是包括下述步骤：
①采用废弃的血浆F-IV组分为原料，采用含乙醇、NaHCO3液于-20℃搅拌抽提，离心取上清液，
②上清液调pH5.5，离心收集沉淀，-4℃溶解于pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液，
③加等体积氯仿/乙醇液脱脂，-20℃静置，离心取上层液，
④加等体积乙醇沉淀，-20℃静置，离心取上清液。
⑤浓缩，经碳酸盐缓冲液透析，
⑥巴氏灭菌，除菌过滤，
⑦冻干，得ApoA-I干粉。
2.按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述步骤1的抽提，其中采用的乙醇、NaHCO3液是4倍体积的含pH7.365％乙醇-10mM NaHCO3液。
3.按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述步骤2的pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液是pH8.6 100mMTris-HCl-6MUrea溶液。
4.按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述步骤3的氯仿/乙醇液其比为1∶1。
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