CN101108874A - 一种载脂蛋白a-i的制备方法 - Google Patents

一种载脂蛋白a-i的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101108874A
CN101108874A CNA2006100291144A CN200610029114A CN101108874A CN 101108874 A CN101108874 A CN 101108874A CN A2006100291144 A CNA2006100291144 A CN A2006100291144A CN 200610029114 A CN200610029114 A CN 200610029114A CN 101108874 A CN101108874 A CN 101108874A
Authority
CN
China
Prior art keywords
apolipoprotein
ethanol
apoa
preparation
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006100291144A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101108874B (zh
Inventor
吴满平
廖雪玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Original Assignee
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University filed Critical Fudan University
Priority to CN2006100291144A priority Critical patent/CN101108874B/zh
Publication of CN101108874A publication Critical patent/CN101108874A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101108874B publication Critical patent/CN101108874B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属生化药物制药领域，涉及载脂蛋白A－I的制备方法，具体涉及一种从废弃的人血浆F－IV组分分离制备载脂蛋白A－I(ApoA－I)的方法。本发明利用废弃人血浆F－IV组分经等电点沉淀、氯仿、乙醇处理获得纯度98％和按血浆F－IV ApoA－I含量计算收率高达23.5％，并保持天然ApoA－I生物活性的载脂蛋白A－I，每克湿重F－IV可制备3.1mg纯化ApoA－I，本发明为开发ApoA－I药用价值奠定了良好基础。提供了一种适合工业化生产的人血浆ApoA－I制备方法。

Description

一种载脂蛋白A-I的制备方法
技术领域
本发明属生化药物制药领域，涉及载脂蛋白A-I的制备方法，具体涉及一种从废弃的人血浆F-IV组分分离制备载脂蛋白A-I(ApoA-I)的方法。
背景技术
目前载脂蛋白A-I(ApoA-I)的制备仅有常规实验室制备方法。其方法是血浆以KBr调密度至1.34g/mL，加到铺有填液的离心管，经4℃，166000×g，20h超离心，取d1.063-1.021g/mL部分(HDL)，经透析、浓缩后，用乙醇/乙醚脱脂，离心分离沉淀(HDL载脂蛋白)，上清液用乙醚再次沉淀HDL载脂蛋白，合并两次沉淀，经Bio-CAD快速蛋白分离仪，POROS HQ-20强阴离子交换树脂分离，得电泳纯ApoA-I。
此方法缺点是：①原料是人血浆，资源严重短缺；②生产量小，每次分离量(100mL血浆)只得到25mg左右ApoA-I，不适合企业大规模生产；③对设备要求高，需超离心机等；④收率低，约为20％。
迄今，尚无适合企业大规模生产ApoA-I的方法。
发明内容
本发明的目的是提供适合企业大规模生产ApoA-I的新方法。
本发明利用废弃的人血浆F-IV组分，经等电点沉淀、氯仿、乙醇处理等，获得纯度98.4±2.06％的ApoA-I，收率达23.5％(按血浆F-IVApoA-I含量计算)。每克湿重F-IV可制备3.1mg纯化ApoA-I，并保持天然ApoA-I生物活性。
本发明方法克服了现有技术的缺陷，采用包括下述的关键技术，制成纯度和收率高，并保持天然ApoA-I生物活性的载脂蛋白A-I(ApoA-I)。
①pH7.3 65％乙醇-10mM NaHCO3抽提；
②pH5.5沉淀；
③pH8.6 100mMTris-HCl-6MUrea溶解沉淀；
④氯仿/乙醇(1∶1)脱脂；
⑤乙醇沉淀。
本发明所说的废弃的人血浆F-IV组分是本领域公知的有关生物制品企业制备血制品所废弃的人血浆F-IV组分。
本发明研究结果显示，人血浆ApoA-I是一种良好的抗内毒素(LPS)、抗炎化合物。经动物试验证实，ApoA-I对LPS血症及LPS诱导的急性炎症肺损伤具有优越的治疗作用。其作用机理是ApoA-I能结合、中和LPS毒性，阻断和抑制激活巨噬细胞和中性粒细胞释放的各种炎症介质。
本发明为开发ApoA-I药用价值奠定了良好基础。提供了一种适合工业化生产的人血浆ApoA-I制备方法。
本发明方法通过下述步骤实现。
①原料采用血制品企业中废弃的血浆F-IV组分，F-IV用4倍体积含乙醇、NaHCO3液于-20℃搅拌抽提，离心取上清液，
②上清液调pH5.5，离心收集沉淀，-4℃溶解于pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液，
③加等体积氯仿/乙醇液(1∶1)脱脂，-20℃静置，离心取上层液，
④加等体积乙醇，-20℃静置，离心取上清液，
⑤浓缩，经碳酸盐缓冲液透析，
⑥巴氏灭菌，除菌过滤。
⑦冻干，得ApoA-I干粉。
所制得的ApoA-I收率：按F-IV中ApoA-I含量计算为23.5±1.72％，ApoA-I纯度：SDS-PAGE凝胶扫描法达98.4±2.06％(见图1)，ApoA-I鉴定：SDS-PAGE分子量与天然ApoA-I相同为28.3kD(图1)，ApoA-I的Weston blotting检测呈阳性(见图2)。
本发明对所制得的ApoA-I进行生物活性检测，结果显示，
①体外酶标板上本方法制备的ApoA-I与天然ApoA-I即按常规超离心法从新鲜人血浆制备ApoA-I，在结合FITC标记内毒素能力上无显著性差异(表1)，
②体外细胞水平抑制内毒素激活的巨噬细胞释放细胞炎症因子对共培养L-929细胞杀伤率试验(MTT法)，本方法制备的ApoA-I与天然ApoA-I在抑制激活巨噬细胞细胞毒功能上无显著性差异(表2)。
表1.样品ApoA-I与天然ApoA-I与FITC-LPS在酶标板上体外结合能力比较
组别(n＝3) 结合FITC-LPS的荧光读数
天然ApoA-I+FITC-LPS样品ApoA-I+FITC-LPS  33.91±12.9446.09±18.91
两组之间结合FITC-LPS能力无显著性差异。
表2.样品ApoA-I与天然ApoA-I对LPS激活巨噬细胞细胞毒性抑制作用比较(MIT法)
组别(n＝3) L-929细胞存活率(％)
L-929细胞对照组LPS激活巨噬细胞组天然ApoA-I(10μg/mL)处理组样品ApoA-I(10μg/mL)处理组  100±12.4152.5±7.17▲▲105.6±15.48114.7±10.20
经Q检验，LPS激活巨噬细胞组与其余各组之间有极显著性差异(P＜0.01)，其余各组之间无差异。
本发明方法具有如下特点：
1)本方法操作简易，对设备要求低，适用企业大规模生产。
2)本方法利用工业废弃血浆F-IV，有利于血浆的综合利用，节省宝贵的血资源。
3)本方法ApoA-I收率23.5％，比从新鲜血浆按常规超离心方法的收率20％高。平均每克湿重F-IV(其中约70％是硅藻土)，可制备3.1mg ApoA-I。
附图说明
图1是样品ApoA-I纯度的SDS-PAGE鉴定，
其中，A：低分子量标准蛋白，
B：20μg样品ApoA-I，
C；40μg样品ApoA-I，
D：80μg样品ApoA-I。
图2是样品ApoA-I的Weston blotting鉴定，
其中，A：低分子量标准蛋白SDS-PAGE
B：样品ApoA-I SDS-PAGE
C：样品ApoA-I Weston blotting图谱
具体实施方式
实施例1
30g F-IV加120mL 65％乙醇-10mM NaHCO3(pH7.3)溶液，-20℃搅拌2h，离心分离上清液，调上清液pH至5.5，离心分离沉淀，沉淀完全溶解于50mL 100mM Tris-HCl-6M Urea(pH8.6)溶液。加等体积-20℃预冷的氯仿/乙醇(1∶1)液，振荡均匀，-20℃静置2h。离心，取上层液，加等体积-20℃预冷的乙醇，振荡均匀，-20℃静置2h，离心分离上清液。将上清液浓缩并对碳酸盐缓冲液(20mM)透析，巴氏灭菌，除菌过滤后，冻干，得ApoA-I干粉。

Claims (4)

1.一种载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是包括下述步骤：
①采用废弃的血浆F-IV组分为原料，采用含乙醇、NaHCO3液于-20℃搅拌抽提，离心取上清液，
②上清液调pH5.5，离心收集沉淀，-4℃溶解于pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液，
③加等体积氯仿/乙醇液脱脂，-20℃静置，离心取上层液，
④加等体积乙醇沉淀，-20℃静置，离心取上清液。
⑤浓缩，经碳酸盐缓冲液透析，
⑥巴氏灭菌，除菌过滤，
⑦冻干，得ApoA-I干粉。
2.按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述步骤1的抽提，其中采用的乙醇、NaHCO3液是4倍体积的含pH7.365％乙醇-10mM NaHCO3液。
3.按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述步骤2的pH8.6的Tris-HCl-Urea溶液是pH8.6 100mMTris-HCl-6MUrea溶液。
4.按权利要求1所述的载脂蛋白A-I的制备方法，其特征是所述步骤3的氯仿/乙醇液其比为1∶1。
CN2006100291144A 2006-07-19 2006-07-19 一种载脂蛋白a-i的制备方法 Expired - Fee Related CN101108874B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006100291144A CN101108874B (zh) 2006-07-19 2006-07-19 一种载脂蛋白a-i的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006100291144A CN101108874B (zh) 2006-07-19 2006-07-19 一种载脂蛋白a-i的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101108874A true CN101108874A (zh) 2008-01-23
CN101108874B CN101108874B (zh) 2010-12-08

Family

ID=39041155

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006100291144A Expired - Fee Related CN101108874B (zh) 2006-07-19 2006-07-19 一种载脂蛋白a-i的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101108874B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766205A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 深圳市宝凯仑科技有限公司 一种载脂蛋白b的快速纯化方法
CN104020301A (zh) * 2014-01-06 2014-09-03 宁波博泰生物技术有限公司 用于校准载脂蛋白a1和载脂蛋白b的校准物的制备方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766205A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 深圳市宝凯仑科技有限公司 一种载脂蛋白b的快速纯化方法
CN102766205B (zh) * 2012-07-25 2013-10-02 深圳市宝凯仑科技有限公司 一种载脂蛋白b的快速纯化方法
CN104020301A (zh) * 2014-01-06 2014-09-03 宁波博泰生物技术有限公司 用于校准载脂蛋白a1和载脂蛋白b的校准物的制备方法
CN104020301B (zh) * 2014-01-06 2015-11-18 宁波博泰生物技术有限公司 用于校准载脂蛋白a1和载脂蛋白b的校准物的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101108874B (zh) 2010-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7122976B2 (ja) 医学に使用するためのヒト血小板溶解物由来細胞外小胞
Zhong et al. High-quality milk exosomes as oral drug delivery system
EP3074507B1 (en) Methods of mediating macrophage phenotypes
AU2014238305B2 (en) Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders
EP3351253B1 (en) Method for making an autologous protein solution comprising il-1ra
KR102183104B1 (ko) 식물 유래 세포밖 소포체의 정제 방법
CN108348555B (zh) 细胞扩增方法和治疗组合物
US20140099293A1 (en) Method for ex-vivo separation of apoptotic chromatin fragments from blood or plasma for prevention and treatment of diverse human diseases
CN113388122B (zh) 一种正电性表面外泌体及其制备方法与用途
CN101108874B (zh) 一种载脂蛋白a-i的制备方法
CN112156112A (zh) 一种动物骨髓有效部位的制备方法及其应用
CN1698652A (zh) 从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法
CN1625982A (zh) 一种海参超细粉体的制备方法
CN101037469A (zh) 从毛蚶中提取小分子活性多肽的方法
WO2019193614A2 (en) The process of achieving the highest degree of drug's purity of c-phycocyanin from spirulina alga
CN115192587B (zh) 一种枸杞子寡糖的新用途
CN110393731B (zh) 一种大血藤总酚提取物的制备方法及应用
CN110878129B (zh) 一种氨基葡萄糖肝素盐及其应用
CN109485711B (zh) 一种蚁狮小分子肽及其分离纯化方法和应用
JP7054956B2 (ja) リゾビウム属細菌由来のナノ小胞およびその用途
CN107837249A (zh) Orientin在制备治疗急性痛风药物中的应用
CN110669106B (zh) 一种成骨靶向肽修饰的查尔酮衍生物及其制备方法和应用
WO2010138024A2 (ru) Средство для защиты клеток мозга
RU2302868C1 (ru) Средство, нормализующее функции почек, и способ его получения
RU2302867C1 (ru) Средство, нормализующее тонус мочевого пузыря, и способ его получения

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20101208

Termination date: 20130719