CN1264976C - 一种提取木瓜凝乳蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，涉及酶制剂领域。本发明所提供的方法，包括如下步骤：1)制备番木瓜幼果浆或番木瓜幼果浆干燥物的磷酸盐缓冲液溶液；2)加入壳聚糖溶液，沉淀后取上清液；3)加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为30-40%，保留上清液；4)加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为40-50%，保留上清液；5)加入过量的酒石酸使溶液的pH＜2.5，絮凝沉淀后，保留上清液；6)加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为65-70%，收集沉淀物；7)超滤，收集浓缩液；8)加入等量磷酸钠缓冲液，混均；9)用阳离子纤维素CM-C92层析柱分离木瓜凝乳蛋白酶；10)以截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩木瓜凝乳蛋白酶洗脱液，得到木瓜凝乳蛋白酶浓缩液。
Description
技术领域
本发明涉及酶制剂领域中酶的提取方法，特别是涉及一种木瓜凝乳蛋白酶的提取方法。
背景技术
“木瓜酶”来源于番木瓜(Carica Papaya)幼果的果浆中，是一种含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜蛋白酶III(Papaya Proteinase III)、木瓜蛋白酶IV(PapayaProteinase IV)、木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain)和木瓜溶菌酶(Papaya Lysozyme)的混合巯基酶。不同季节收获、以及经不同工艺生产的“木瓜酶”制剂，所含有的各种巯基酶的比例漂移较大，酶反应动力学为一非固定常数。
应用“木瓜酶”进行体外血型血清学检定实验已有近六十年的历史，近期的研究表明，酶试剂溶液中的木瓜蛋白酶III在使用与保存条件下发生了自我水解，产生了具有较高水解活力的酶分子片断，造成酶试剂溶液活力效价的不稳定；红细胞凝集实验表明，对偶氮化白蛋白未表现出水解活性的木瓜溶菌酶对红细胞产生了水解修饰作用。受上述酶学质量因素的影响，“木瓜酶”检定实验存在产生“试剂型——假阳性”检定结果的几率。
目前尚无一种具有明确酶反应动力学特征，适应细胞生理学、免疫化学需要的蛋白酶制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效提取木瓜凝乳蛋白酶的方法。
本发明所提供的提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，包括如下步骤：
1)将1公斤番木瓜幼果浆或番木瓜幼果浆干燥物溶解于磷酸盐缓冲液；
2)向番木瓜幼果果浆的磷酸盐缓冲液中加入壳聚糖溶液，沉淀后去除沉淀物，保留上清液，所述加入的壳聚糖的终浓度为0.05-0.1％；
3)向步骤2)中的上清液中加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为30-40％，去除沉淀，保留上清液；
4)向步骤3)中得到的上清液中加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为40-50％，去除沉淀，保留上清液；
5)向步骤4)中得到的上清液中加入过量的酒石酸使溶液的pH＜2.5，絮凝沉淀后，去除沉淀物，保留上清液；
6)向步骤5)中得到的上清液中加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为65-70％，收集沉淀物；
7)用纯水溶解沉淀物，以截留分子量为2万道尔顿的聚砜中空纤维超滤膜浓缩溶液，分次加入2-8℃纯水、在0.1兆帕条件下循环超滤，收集浓缩液；
8)向浓缩液中加入等量pH5.5的0.2mol/L磷酸钠缓冲液，混均；
9)用阳离子纤维素CM-C92层析柱分离步骤8)所得溶液中的木瓜凝乳蛋白酶，收集pH5.5的0.7mol/L磷酸钠缓冲液洗脱液；
10)以截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩木瓜凝乳蛋白酶洗脱液，得到木瓜凝乳蛋白酶浓缩液。
在超滤浓缩结束后，在木瓜凝乳蛋白酶浓缩液中加入普鲁兰和半胱氨酸作为保护剂，经冷冻干燥，制备木瓜凝乳蛋白酶干燥物。加入普鲁兰的量优选为0.05-0.1mmol；加入半胱氨酸的量优选为0.025-0.05mol。
本发明由于采用了以上技术方案，具有以下优点：
1、利用壳聚糖去除果胶、鞣质等杂质，可显著提高溶液透光度，去除溶液中的重金属，降低溶液色度。
2、利用酒石酸作为絮凝剂，显著提高对杂蛋白的絮凝—沉淀的分离效果。
3、利用硫酸铵30-40％、40-50％饱和度两次盐析工艺，可显著降低蛋白质的共沉淀效应，提高木瓜凝乳蛋白酶得率。
4、废除传统的碱中和、透析等工艺，利用截留分子量为1-2万道尔顿的聚砜中空纤维超滤器，对酶溶液直接进行脱酸、脱盐、去除小分子杂质、浓缩，可有效地降低工艺成本，保护酶活性。
5、采用弱酸阳离子纤维素CM-C92作为层析材料，具有吸附容量大、洗脱方便等特点，可显著提高工艺效果。
6、利用普鲁兰(一种直线型大分子物质)作为酶制剂的辅料，可提高酶制剂在加工、储存过程的稳定性。
本发明采用复合工艺方法，提高产品的生产工艺稳定，适合于木瓜凝乳蛋白酶试剂原料的规模化生产，制备的木瓜凝乳蛋白酶符合体外血型血清检定实验所需要的质量特征。
具体实施方式
实施例1、酶活力效价分析方法与条件
一、试剂
1)酶激活—稳定剂
配方
L-半胱氨酸 0.025mol
乙二胺四乙酸二钾 0.03mol
甘露醇 0.3mol
普鲁兰(10W) 0.05mmol
磷酸二氢钾 0.064mol
磷酸氢二钠 0.003mol
配制方法
将上述溶质溶解于适量纯水中，用纯水稀释至1000ml定容。
2)样品溶液
称取木瓜凝乳蛋白酶30mg，用酶激活-稳定剂溶解，稀释至100ml定容。
3)底物溶液
称取磷酸氢二钠0.93mol，磷酸二氢钠0.06mol，用蒸馏水溶解，稀释至1000ml定容。
称取偶氮化白蛋白2.0g，溶解于上述100ml磷酸盐溶液中。
二、酶活力效价测定方法
1、将样品溶液，底物溶液预热至37℃±0.5℃。
2、用加样器吸收底物溶液1.0ml，样品溶液100μl注入试管中，置37℃±0.5℃水浴箱反应10分钟。
3、加入5％三氯乙酸溶液lml，混合。
4、1000×g离心5分钟，吸取上清液lml。
5、加入0.5mol/L氢氧化钠溶液lml，混合。
6、测定样品430nm OD值。
7、酶活力定义：
在上述条件下，水解产物在430nm产生0.002的吸光值的改变为一个酶活力单位(PU)。
8、活力效价标示方法：
活力效价标示方法I：PU/min/mg＝每毫克酶样品1/10分钟所具有的相对酶活力效价。
活力效价标示方法II：PU/mg＝每毫克酶样品10分钟所具有的相对酶活力效价。
实施例2、木瓜凝乳蛋白酶的提取
1、取1000g的番木瓜幼果浆冰冻物，用微波加热融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)，在匀浆器中匀浆。
2、加入1％壳聚糖溶液100ml，匀浆搅拌，室温静置2小时后过滤，去除沉淀，保留滤液。
3、向滤液中加入硫酸铵至30％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；向离心上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀物，保留上清液。
4、向上清液加入过量酒石酸溶液，调节pH至＜2.5，室温静置60分钟，出现絮凝沉淀后，10000×g离心20分钟，弃去沉淀物，向上清液中加入硫酸铵至70％饱和度，室温静置60分钟，10000×g离心20分钟，收集沉淀物。
5、将沉淀物用500ml纯水溶解，然后用截留分子量为2万的聚砜中空纤维超滤膜超滤组件，在超滤过程中分次加入2-8℃纯水，在0.1兆帕的条件下循环超滤1h，得到超滤浓缩液。
6、向上述溶液中加入等量的0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)，混匀。用该磷酸钠缓冲液预先平衡颗粒型弱酸阳离子CM-C92层析柱，然后以5ml/min的速度，将溶液上柱，以0.7mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)为洗脱液，收集该洗脱液，用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩洗脱液。
7、向浓缩液加入普鲁兰(10W)0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷冻干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物30g。
8、用实施例1中测定方法测定产品酶活力。
用活力效价标示方法I得出的酶活力效价为1500PU/mg；
用活力效价标示方法II得出的酶活力效价为15000PU/mg。
实施例3、木瓜凝乳蛋白酶的提取
取番木瓜幼果的果浆干燥物600g，溶于0.3mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)2L，加入3％壳聚糖水溶液100ml，室温静置2小时后过滤，去除沉淀，保留滤液。
向滤液中加入硫酸铵至40％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀；向离心上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，室温静置60分钟，在2-8℃、10000×g离心20分钟，去除沉淀物，保留上清液。
向上清液加入过量酒石酸溶液，调节pH至＜2.5，室温静置60分钟，出现絮凝沉淀后，10000×g离心20分钟，弃去沉淀物；向上清液中加入硫酸铵至65％饱和度，室温静置60分钟，10000×g离心20分钟，收集沉淀物。
将沉淀物用500ml纯水溶解，然后用截留分子量为2万的聚砜中空纤维超滤膜超滤组件对酶溶液进行超滤，在超滤过程中分次加入2-8℃纯水，在0.1兆帕的条件下循环超滤1h，得到超滤浓缩液。
向上述超滤浓缩液中加入等量的0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)，混匀。用该磷酸钠缓冲液预先平衡颗粒型弱酸阳离子CM-C92层析柱，然后以5ml/min的速度，将溶液上柱，以0.7mol/L磷酸钠缓冲液(pH5.5)为洗脱液，收集该洗脱液。
用截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩洗脱液。向浓缩液加入普鲁兰0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷冻干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物20g。
用实施例1中测定方法测定产品活力效价。
用实施例1活力效价标示方法I得出的相对酶活力为1300PU/mg；
用实施例1活力效价标示方法II得出的相对酶活力为13000PU/mg。
实施例4、木瓜凝乳蛋白酶的应用
用上述制造方法的木瓜凝乳蛋白酶干燥物，作为原料，用于生产专用型的木瓜凝乳蛋白酶试剂，用于体外血型血清学检定实验。其工艺过程如下。
一、木瓜凝乳蛋白酶制剂
1、配方
普鲁兰 0.05mmol
甘露醇 0.3mol
海藻糖 0.02mol
抗坏血酸钠 0.02mol
L-半胱氨酸 0.05mol
木瓜凝乳蛋白酶 200000PU
2、制备工艺及过程
定量称取上述溶质，溶解于纯水中，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶10ml分装至洁净西林瓶。用冷冻干燥机迅速降温至-40℃，维持4小时；然后启动干燥程序，以每小时升温5℃速率减压干燥，将被冻结产品升温33℃维持3小时，停止减压，对成品进行密封包装，得到成品木瓜凝乳蛋白酶制剂。
二、木瓜凝乳蛋白酶溶剂
磷酸二氢钾 0.064mol
磷酸氢二钠 0.003mol
用纯水溶解上述溶质，稀释至1000ml定容，用0.2μm微孔滤膜过滤除菌，然后按每瓶10ml分装至至聚乙烯瓶内，密封。
使用前用木瓜凝乳蛋白酶溶剂溶解木瓜凝乳蛋白酶制剂，形成木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液，用2％偶蛋化白蛋白-磷酸盐溶液检测木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液的活力效价。
按照下述的活力效价标识方法I，每瓶木瓜凝乳蛋白酶制剂的活力效价为2000PU/瓶；按体外血型血清学实验检定灵敏度的评价标准，每50μl木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液应具备的活力效价为10-16PU。
按照下述的活力效价标识方法II，每瓶木瓜凝乳蛋白酶制剂的活力效价为20000PU/瓶；按体外血型血清学实验检定灵敏度的评价标准，每50μl木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液应具备的活力效价为100-160PU。
活力效价标识方法I：PU＝每50μl试剂溶液1/10分钟所具有的活力效价。
活力效价标识方法II：PU＝每50μl试剂溶液10分钟所具有的活力效价。
利用上述试剂进行血型抗体特异性鉴定实验的步骤为：
1、取试管，标记I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI，依次置试管架排列。
2、向上述试管加入与其标记相符合的3％血型谱细胞悬液50μl，木瓜凝乳蛋白酶试剂溶液50μl，混合均匀。
3、将试管移入37±0.5℃水浴孵育5分钟。
4、向全部试管各加入酶抑制剂-64试剂溶液50μl；向全部试管各加入血清标本50μl，或红细胞放散液100μl，混合均匀。
5、将试管移入37±0.5℃水浴孵育7分钟。
6、将试管移入离心机，120×g离心1分钟。
7、轻轻摇动试管，悬浮红细胞，肉眼观察实验鉴定结果。依据受检血清在不同血型谱细胞产生的凝集与否，判定受检血清的血型抗体特异性。
经采用室温盐水实验、37盐水实验、间接抗人球蛋白实验等血型抗体特异性鉴定实验方法与本发明的实验方法作为平行试验，对产自Immucor的人源型Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等血型抗体血清，以及临床样本血清进行抗体特异性鉴定。实验结果表明，本实验方法对上述血型抗体的实验鉴定准确率为100％。
Claims (4)
1、一种提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，包括如下步骤：
1)将1公斤番木瓜幼果浆或番木瓜幼果浆干燥物溶解于磷酸盐缓冲液；
2)向番木瓜幼果果浆的磷酸盐缓冲液中加入壳聚糖溶液，沉淀后去除沉淀物，保留上清液，所述加入的壳聚糖的终浓度为0.05-0.1％；
3)向步骤2)中的上清液中加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为30-40％，去除沉淀，保留上清液；
4)向步骤3)中得到的上清液中加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为40-50％，去除沉淀，保留上清液；
5)向步骤4)中得到的上清液中加入过量的酒石酸使溶液的pH＜2.5，絮凝沉淀后，去除沉淀物，保留上清液；
6)向步骤5)中得到的上清液中加入硫酸铵，至溶液中硫酸铵的饱和度为65-70％，收集沉淀物；
7)用纯水溶解沉淀物，以截留分子量为2万道尔顿的聚砜中空纤维超滤膜浓缩溶液，分次加入2-8℃纯水、在0.1兆帕条件下循环超滤，收集浓缩液；
8)向浓缩液中加入等量pH5.5的0.2mol/L磷酸钠缓冲液，混均；
9)用阳离子纤维素CM-C92层析柱分离步骤8)所得溶液中的木瓜凝乳蛋白酶，收集pH5.5的0.7mol/L磷酸钠缓冲液洗脱液；
10)以截留分子量为1万的聚砜中空纤维超滤膜浓缩木瓜凝乳蛋白酶洗脱液，得到木瓜凝乳蛋白酶浓缩液。
2、根据权利要求1所述的提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，其特征在于：还需在步骤10)得到的木瓜凝乳蛋白酶浓缩液中加入普鲁兰和半胱氨酸作为保护剂，经冷冻干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物。
3、根据权利要求2所述的提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，其特征在于：所述加入普鲁兰的量为0.05-0.1mmol；所述加入半胱氨酸的量为0.025-0.05mol。
4、根据权利要求1或2或3所述的提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，其特征在于：所述木瓜凝乳蛋白酶的活力效价为1/10分钟10-16PU/50μl，或10分钟100-160PU/50μl。
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