CN1660145A - 一种疏血通冻干粉针制剂新制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种疏血通冻干粉针制剂新制备方法，其特征在于从水蛭、地龙中采用新的提取纯化方法得到有效部位，与药用辅料混合，制备成冻干粉针制剂，药理实验结果表明，本方法的疏血通冻干粉针剂具有更好的药理作用。
Description
所属技术领域
本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种疏血通冻干粉针制剂新制备方法。
背景技术
疏血通注射液由动物类中药水蛭和地龙经合理组方制成的注射剂，中医认为水蛭味咸、性平、破血逐瘀通络，用于症瘕痞块、血瘀经闭、跌打损伤，地龙味成、性寒、活血化瘀通络；疏血通注射液临床主要作用有：(1)缺血性脑血管疾病：脑动脉粥样硬化、脑血栓、短暂性脑缺血及机体功能障碍引起的反应迟钝、意识障碍、肢体麻木、半身不遂、口舌歪斜、语言蹇涩等；(2)心血管疾病：心绞痛、心肌梗死、冠状动脉硬化等；(3)因高血压、糖尿病、肝病、肾病等引发的血管血流障碍性疾病；(4)周围血管血流障碍性疾病：血栓闭塞性脉管炎、血栓性静脉炎等；(5)视网膜血管阻塞；(6)高血脂、高血粘度、高凝血症等。
水蛭配地龙，是通络化瘀法的最佳组合，其有效成分为水蛭素和蚓激酶样作用物质，经分析主要为小分子肽等，小分子肽在水溶液中容易聚合，易产生沉淀，影响疏血通注射液的药效，因此，在运输、储藏、使用疏血通注射液的过程中，对外界环境要求比其它注射液的要求更高。
发明内容
基于上述原因，本发明采用新的提取纯化方法得到水蛭、地龙活性部位，与药用辅料混合制备成疏血通冻干粉针剂，本发明冻干粉针剂有利于药品的运输、储存和使用，很好的保持了疏血通的药理药效，药理实验结果表明，本发明冻干粉针剂具有更好的药理作用。
本发明目的在于提供制备疏血通冻干粉针剂的新方法。
一.工艺制法
(1)本发明原料药重量配比为：
水蛭6-7.5重量份，地龙2.5-4重量份；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度0℃-5℃，低温超声裂解破碎15-30分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2-4倍的生理盐水中，于低温0-4℃浸渍15-30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐溶液盐析，取30％——60％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷有机溶剂溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经105-136℃流动相：0.01mol/L、PH值7.2的磷酸缓冲溶液(配制方法按照中国生物制品主要原辅材料质控标准2000年版，中国生物制品标准委员会编，化学工业出版社，P13-14配置)。
3.样品制备：取本发明动干粉针剂，加入注射用水溶解完全，用多肽纯化离心管，进行离心分离，取离心液体即为样品。
4.上样：取上述处理的样品用微量注射器吸取定量液体，注入进样器进行检测。
5.结果：经过计算本发明各种方法得到动干粉针剂中水蛭素、蚓激酶的占活性成分的含量超过91％。
三.本发明不同方法冻干粉针剂比活的检测
1.实验原理：天然水蛭素、蚓激酶的活性检测国家尚未公布标准的检测方法，根据凝血酶活性的检测方法(中国生物制品规程2000年版附录1)，依据水蛭素、蚓激酶与凝血酶是成比例结合，消耗一个凝血酶单位，相等于一个抗凝血单位(ATU)的原则，采用试管法(连续稀释法)检测水蛭素、蚓激酶的抗凝血单位的效价。
2.实验材料：5g/L纤维蛋白原的生理盐水溶液，注射用生理盐水(广东天之骄药物开发有限公司实验室实验室提供)冷冻干燥凝血酶(安徽桑原生物技术研究所购买，每瓶含量为500IU，用时用生理盐水稀释至每毫升含凝血酶0.5IU)
3.待测样品：本专利不同方法得到的冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
4.检测方法：取10×80mm试管8支，在每支试管中加入生理盐水0.2ml(第一管不加)，于第一管中加入待测样品0.2ml；第二管中加入0.2ml，充分混匀后吸取0.2ml加入第三管，以次例推，直至加到第7管，将热压10-45分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上亲和柱，用PH6-8的磷酸缓冲液洗脱，再用0.1-0.3mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上凝胶柱，用饱和中性盐进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品药用辅料，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂。
有机溶剂为丙酮或乙醇。
中性盐为氯化钠或硫酸氨。
亲和柱为gBenzamidine-Sepharose CL-6B、Trypsin-Sepharose CL-4B。凝胶柱为Sephadex G-25、Sephadex G-15、Sephadex G-10、Superose 12B、Superose6B Superose 4B。
水蛭和地龙是干品或鲜品。
二.检测分析
采用高效液相色谱法对水蛭素、蚓激酶(以黄嘌呤计)进行检测。
1.实验仪器：waters600E型高效液相色谱仪，996PDA检测器，色谱柱：日本TOSOHTSK2000SW 7.5*300
2.实验药物：本发明不同方法得到冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
2.色谱条件：工作站：millennium chromatogvaph多余的0.2ml混合液废弃，此时各试管都为0.2ml，但浓度依次为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，第8管因不含水蛭素、蚓激酶，作为试验对照，加样结束后，放到37℃水浴使样品与凝血酶作用5-10min，再于各试管中加入5g/l纤维蛋白原溶液0.2ml，再放入37℃水浴，观察记录1-24小时结果，并进行计算。计算方法为：发生凝固或沉淀的试管为无抗凝血酶活性(阴性)，不凝固或无沉淀产生的试管为具有抗凝血酶活性。
5.比活性计算：采用中国生物制品规程(一部)微量法，用BCATM Protein Assay测定分离组分的蛋白质含量，根据抗凝血酶活性测定结果计算每毫克蛋白质的抗凝血酶比活性。根据实验发现，天然水蛭素、蚓激酶体外测定结果与体内测定结果有正相关性。
6.实验结果：本发明冻干粉针剂的比活为203.1IU/mg.
四.不同制剂活性保持时间比较
实验药物：本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)
实验方法：将不同制剂放置在相同条件下0个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月，按照上述实验三的方法进行比活检测，检测结果见表1.
表1 不同制剂的比活比较
| 组别 | 0个月的比活(IU/mg) | 3个月的比活(IU/mg) | 6个月的比活(IU/mg) | 12个月的比活(IU/mg) | 18个月的比活(IU/mg) | 24个月的比活(IU/mg) |
| 本发明冻 | 204.9 | 203.1 | 199.2 | 191.8 | 187.4 | 180.1 |
| 干粉针剂疏血通注射液 | 132.1 | 122.9 | 108.7 | 90.3 | 78.2 | 64.8 |
结论：本发明冻干粉针剂在24个月时保持80％的活性，而疏血通注射液只保持了49％的活性，充分说明本发明冻干粉针剂具有实际意义。
五.药理实施例
实施例1
抑制血小板聚集的实验
实验动物：SD大鼠，体重200～250g，雌雄各半。
实验药物：疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)生理盐水
实验方法：取大鼠，分为本发明冻干粉针剂组、疏血通注射液组、生理盐水组，给药剂量40mg/kg，生理盐水等容不等量2次/日，次日给药1次后用1％戊巴比妥钠(剂量：0.5ml/100g)腹腔注射麻醉。按文献(朱益栋主编弥散性血管内凝血北京：人民卫生出版社，1982；279 293)的方法复制大鼠高凝血症模型。复制模型后即刻从颈动脉取血3ml，38％枸橼酸钠抗凝(1∶10)，制成富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，计算血小板凝集率，血小板聚集率用SPA-4型血小板聚集仪测定，促聚剂用二磷酸腺苷，(ADP)，浓度10μmol/L。测定指标有一分钟聚集率(A1，)、最大聚集率(Amax)和最大聚集时间(Tmax)。见表2：
表2不同制剂血小板凝集率的比较
| 组别 | 动物数(只) | A1(％) | Amax(％) | Tmax(s) |
| 生理盐水组疏血通注射液组本发明冻干粉针剂组 | 151515 | 29±612±9*7±2** | 25±1014±9*6±4** | 66±2761±2653±19 |
注：与生理盐水组比较**P＜0.01，*P＜0.05
实施例2
利用血栓法测定对大白鼠血栓形成的影响。
实验药物：生理盐水(空白组)
疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)
本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
实验动物：体重300-400克的大白鼠30只，雌雄不分。分成三组，每组10只。
实验方法：将大鼠给药，给药剂量40mg/kg，生理盐水等容不等量，给药后将大白鼠麻醉(戊巴比妥钠30-40mg/kg，ip)，仰卧位固定，分离气管，插入一塑料套管，并分离右颈总动脉及左颈外静脉，在聚乙烯管的中段放入一根长6厘米的丝线，以肝素生理盐水溶液，充满聚乙烯管，当聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确的注入肝素抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管，返回左颈外静脉，开放血流15分钟后断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量即得血栓重量。将空白组和另外两组给药组的动物血栓湿重进行记录，进行计算，如表3所示：
表3各给药组的血栓重量
| 组别 | 动物数(只) | 血栓湿重(mg) |
| 生理盐水组疏血通注射液组本发明冻干粉针剂组 | 151515 | 36.34 ±0.8725.01±0.36*11.22 ±0.08** |
注：与生理盐水组比较**P＜0.01，*P＜0.05
实施例3
对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响
实验药物：生理盐水(空白组)
疏血通注射液(牡丹江友搏药业有限责任公司)
本发明冻干粉针剂(广东天之骄药物开发有限公司实验室提供)
实验方法：取健康小鼠60只，雌雄各半，随机分成3组：生理盐水组、本发明冻干粉针剂组、市售疏血通注射液组每日尾静脉给药，给药量57mg/kg，连续7d，于末次给药后1h尾静脉注射ADP48.0mL/kg，记录动物死亡情况。见表4：
表4各组制剂对小鼠ADP诱导的血栓性死亡的影响比较
| 组别 | 总数/只 | 死亡数/只 | 死亡率 |
| 生理盐水组疏血通注射液组本发明冻干粉针剂组 | 202020 | 20157 | 100％75.0％35.0％ |
四.制备实施例
实施例1
(1)本发明原料药重量配比为：
鲜水蛭60000克，鲜地龙40000克；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度0℃，低温超声裂解破碎15分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2倍的生理盐水中，于低温0℃浸渍15小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻15小时后取出，于低温0℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐氯化钠溶液盐析，取30％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐氯化钠于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷乙醇溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经105℃热压10分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上gBenzamidine-Sepharose CL-6B亲和柱，用PH6的磷酸缓冲液洗脱，再用0.1mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上Sephadex G-25凝胶柱，用饱和中性盐氯化钠进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品30克，药用辅料甘露醇70克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000支。
注：本发明鲜地龙放入清水中饥饿数天，使地龙吐出体内杂质再进行提取分离。
实施例2
(1)本发明原料药重量配比为：
鲜水蛭75000克，鲜地龙25000克；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度5℃，低温超声裂解破碎30分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于4倍的生理盐水中，于低温4℃浸渍30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻30小时后取出，于低温4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐硫酸氨溶液盐析，取60％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐硫酸氨于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷丙酮溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经136℃热压45分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上Trypsin-Sepharose CL-4B亲和柱，用PH8的磷酸缓冲液洗脱，再用0.3mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上Sephadex G-15凝胶柱，用饱和中性盐硫酸氨进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品32.5克，药用辅料蔗糖67.5克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000支。
注：本发明鲜地龙放入清水中饥饿数天，使地龙吐出体内杂质再进行提取分离。
实施例3
(1)本发明原料药重量配比为：
鲜水蛭70000克，鲜地龙30000克；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度3℃，低温超声裂解破碎19分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于3倍的生理盐水中，于低温3℃浸渍25小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐氯化钠溶液盐析，取40％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐氯化钠于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷有机溶剂溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经120℃热压15分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上gBenzamidine-Sepharose CL-6B亲和柱，用PH7的磷酸缓冲液洗脱，再用0.2mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上Sephadex G-10凝胶柱，用饱和中性盐硫酸氨进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品31.8克，药用辅料乳糖68.2克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000支。
注：本发明鲜地龙放入清水中饥饿数天，使地龙吐出体内杂质再进行提取分离。
实施例4
(1)本发明原料药重量配比为：
干水蛭6000克，干地龙4000克；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度0℃，低温超声裂解破碎15分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2倍的生理盐水中，于低温0℃浸渍15小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻15小时后取出，于低温0℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐氯化钠溶液盐析，取30％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐氯化钠于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷乙醇溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经105℃热压10分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上gBenzamidine-Sepharose CL-6B亲和柱，用PH6的磷酸缓冲液洗脱，再用0.1mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上Sephadex G-25凝胶柱，用饱和中性盐氯化钠进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品27克，药用辅料甘露醇73克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000支。
注：本发明鲜地龙放入清水中饥饿数天，使地龙吐出体内杂质再进行提取分离。
实施例5
(1)本发明原料药重量配比为：
干水蛭7500克，干地龙2500克；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度5℃，低温超声裂解破碎30分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于4倍的生理盐水中，于低温4℃浸渍30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻30小时后取出，于低温4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐硫酸氨溶液盐析，取60％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐硫酸氨于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷丙酮溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经136℃热压45分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上Trypsin-Sepharose CL-4B亲和柱，用PH8的磷酸缓冲液洗脱，再用0.3mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上Superose 12B凝胶柱，用饱和中性盐硫酸氨进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品31.9克，药用辅料蔗糖68.1克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000支。
实施例6
(1)本发明原料药重量配比为：
干水蛭6500克，干地龙3500克；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度3℃，低温超声裂解破碎19分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于3倍的生理盐水中，于低温3℃浸渍25小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐氯化钠溶液盐析，取40％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐氯化钠于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷有机溶剂溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经120℃热压15分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上gBenzamidine-Sepharose CL-6B亲和柱，用PH7的磷酸缓冲液洗脱，再用0.2mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上Superose 6B凝胶柱，用饱和中性盐硫酸氨进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品28.9克，药用辅料乳糖71.1克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000支。
实施例7
(1)本发明原料药重量配比为：
干水蛭6800克，干地龙3200克；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度4℃，低温超声裂解破碎24分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于3倍的生理盐水中，于低温3℃浸渍25小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐氯化钠溶液盐析，取40％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐氯化钠于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷有机溶剂溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经120℃热压15分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上gBenzamidine-Sepharose CL-6B亲和柱，用PH7的磷酸缓冲液洗脱，再用0.2mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上Superose4B凝胶柱，用饱和中性盐硫酸氨进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品29.6克，药用辅料乳糖70.4克，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂1000支。
Claims (6)
1.一种疏血通冻干粉针制剂新的制备方法，其特征在于其特征包括以下步骤：
(1)本发明原料药重量配比为：
水蛭6-7.5重量份，地龙2.5-4重量份；
(2)提取：
方法一：取水蛭、地龙，放入超声提取器中，加水，控制提取器温度0℃-5℃，低温超声裂解破碎15-30分钟，冷冻离心机离心，吸取上清液备用；
方法二：在室温条件下，将水蛭和地龙分别用生理盐水浸泡，使其表面充分展开，再反复用生理盐水清洗至干净，将清洗至干净的水蛭和地龙分别置于2-4倍的生理盐水中，于低温0-4℃浸渍15-30小时，过滤，将滤液与药渣分别存放备用；将药渣采用高速组织捣碎机将组织切割破碎，而后再与上述滤液混合使用匀浆器磨碎成直径小于0.5um的匀浆液，将匀浆液在-15℃以下冷冻15-30小时后取出，于低温0-4℃条件下解融，再按上述条件冷冻和解融反复至少2次，将上述冷冻和解融液置于冷冻离心机离心，得到上清液备用；
方法三：取地龙、水蛭经过清洗、沥干和冰冻处理后，加等重量的水和0.1％苯甲酸钠，在37℃水浴恒温搅拌匀浆20h，6000r/min离心30min，得到上清液备用；
方法四：取冰冻地龙、水蛭解冻后剪碎，加磷酸盐缓冲溶液制成匀浆，离心取上清液，经饱和中性盐溶液盐析，取30％-60％饱和度沉淀，透析除盐，得到透析液备用；
方法五：取水蛭、地龙，放水中反复清洗，，加入中性盐于低温下制成匀浆，置4℃冰箱过夜，4000r/min，冷冻离心20min，取上清液加入预冷有机溶剂溶液沉淀，离心，沉淀物经冷冻干燥制成粉，溶于水中，静置，得到上清液备用；
(3)纯化：
方法一：将上清液通过分子量为50000的滤柱进行粗滤，滤液经105-136℃热压10-45分钟；再通过分子量为10000的超滤柱进一步过滤纯化，低温干燥，得到半成品；
方法二：取上清液上亲和柱，用PH6-8的磷酸缓冲液洗脱，再用0.1-0.3mol/l氨基己酸洗脱，收集洗脱液，低温干燥，得到半成品。
方法三：取上清液用0.1um的滤膜过滤，滤液用分子量50000的超滤柱进行超滤，滤液上凝胶柱，用饱和中性盐进行洗脱，洗脱液进行透析除盐，低温干燥，得到半成品
(4)制剂制备：
将半成品药用辅料，用注射用水调整浓度后，分装到西林瓶中，进行冷冻干燥，轧盖，检测，得到冻干粉针剂。
2.根据权利要求1所述的有机溶剂为丙酮或乙醇。
3.根据权利要求1所述的中性盐为氯化钠或硫酸氨。
4.根据权利要求1所述的亲和柱为gBenzamidine-Sepharose CL-6B、Trypsin-Sepharose CL-4B。
5.根据权利要求1所述的凝胶柱为Sephadex G-25、Sephadex G-15、SephadexG-10、Superose 12B、Superose 6B、Superose 4B。
6.根据权利要求1所述的水蛭和地龙是干品或鲜品。
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2005
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