CN104173383A - 蚯蚓提取物的药物用途 - Google Patents
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Abstract
蚯蚓提取物的药物用途。所述蚯蚓提取物由以下方法制备：新鲜广地龙（Pheretimaasperfillm）洗净，清水吐泥30min后，加入与清水等体积的0.02mol/LpH7.3磷酸缓冲液及3wt.%苯甲酸钠水溶液，37℃保温，4℃8000r/min离心30min，取上清加乙醇，4℃过夜，离心，沉淀物于真空干燥保存；用离子交换层析法纯化上述粗提取物，冻干保存。蚯蚓提取物与PFD相比，治疗和预防效果与其相当，通过本发明提取方法，单位重量蚯蚓提取物中蚓激酶活性高达220000U/mg，所以其发挥作用的有效剂量明显小于PFD的有效剂量。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和预防医学领域，具体涉及蚯蚓提取物的医药应用。
背景技术
尘肺是由于长期吸入生产性粉尘引起的以肺组织不可逆性纤维化为主的全身性疾病。在我国职业病中，无论是发病率还是死亡率，尘肺均占据首位。国家卫生计生委官方数字显示，2013年全国共报告的职业病26393例，尘肺并占总例数的87.72％，而尘肺中矽肺和煤工尘肺占95.24％。煤工尘肺包括煤肺，矽肺和煤矽肺三种，我国绝大多数煤工尘肺属于煤矽肺，大约占90％。流行病学调查显示，职业暴露是尘肺最常见的环境因素，尘肺发病与煤尘/矽尘中游离二氧化硅含量密切相关。据有关专家测算，我国每年因尘肺病造成的直接经济损失达80多亿元。矽肺是尘肺中最常见、进展最快、危害最严重的一种类型，是由于长期吸入大量含有游离二氧化硅(SiO2)粉尘所引起，以肺部广泛的结节性纤维化为主的疾病。此职业性肺疾患普遍地见于世界各国，在美国约有200万以上的工人从事发生矽肺危险的职业。在发展中国家，矽肺的患病率在8％～56％之间。在我国，矽肺是发病率较高的职业病之一，目前，我国矽肺的发病率呈不断上升趋势，其造成的身体危害及经济损失已被广泛关注，成为影响到社会健康持续发展的重大公共卫生和社会问题，矽肺防治形势十分严峻。因此，寻找新的治疗矽肺的有效药物成为全世界共同关注的热点。国内外学者应用动物模型重现矽肺发生发展的过程变化，并观察药物的疗效。
公认的游离二氧化硅粉尘导致的肺纤维化过程包括肺组织炎性损伤、结构破坏以及伴有基质细胞聚集的肺组织修复，主要病理特征为弥漫性肺泡炎致肺泡单位结构紊乱、成纤维细胞增殖伴随大量细胞外基质积聚，以及成纤维细胞经过上皮间质转化(EMT)为肌成纤维细胞也是肺纤维化核心的病理过程。随着对肺纤维化发生机制研究的不断深入，越来越多的证据表明很多重要的发病机制促进了纤维化。氧化应激、炎症体介导的炎症及纤溶酶原激活物/纤溶系统异常在肺纤维中起着重要作用。由于尘肺是一个包含多层面、多阶段、包括炎症因子、致纤维化因子、PAI-1等多种因素参与相互影响的复杂网络，阻断单个细胞因子来治疗肺纤维化很难达到良好的效果，需要寻求针对炎症，纤维化广谱的多个靶标的治疗。在这方面，蚯蚓提取物是很有潜力的预防和治疗肺纤维化的药物。
蚯蚓为一种常见的陆生环节动物，生活在土壤中，可使土壤疏松，将有机物转化为富有的腐殖质，提高土壤的肥沃程度。1340年已经有蚯蚓用于减轻病痛的记载，如蚯蚓用于治疗水痘、缓解风湿引起疼痛、不孕不育、精神疾病和抑郁等。由蚯蚓制作的蚯蚓膏有着多种生物学特性。有学者分析了蚯蚓膏抗溃疡和抗氧化特征，亦有学者通过比较蚯蚓提取物和抗炎药物消炎痛和抗热药物扑热息痛的疗效进行了比较，发现其能促进炎症及发热指标恢复正常，说明蚯蚓提取物具有抗炎、退热作用。1983年，国外学者从蚯蚓中分离出六种独立的蛋白水解酶，并将其命名为蚯蚓纤溶酶。此后，国内外对蚯蚓提取物进行了大量的研究，在对其分离纯化，理化性质，酶活性和临床应用价值评估方面都取得了很大的进展，1991年科学家们将从蚯蚓中提取的一组溶纤维蛋白酶统称为蚓激酶。蚓激酶可以特异性直接降解纤维蛋白，也可以通过诱导内源性tPA将纤溶酶原转变为纤溶酶来降解纤维蛋白，而且没有引发出血等副作用。
动物实验和临床观察均证明，蚯蚓提取物有着很多药理学功能，例如纤溶，抗凝，溶栓以及改善血液流变等等。它还有着安全性高，副作用小，生成成本低等优点。在1995年，国家卫生部批准了蚯蚓提取物的生产，在治疗心脑血管疾病上得到了广泛的应用。在日本，韩国，加拿大和美国等国家蚓激酶已经作为口服营养品来保持健康和循环系统功能。蚯蚓粉被认为是维持健康和血液循环系统的有效补充，科学家们正在试图用基因重组技术生产出可食用的含有蚓激酶基因的植物。近几年，随着蚯蚓提取物的药理作用和机制深入研究，蚯蚓提取物的临床应用范围也在不断延伸，发现了蚯蚓提取物在糖尿病、肾病、突发性耳聋、肺癌等疾病治疗中的潜在应用价值。
现有文献中没有公开蚯蚓提取物是否能够治疗肺纤维化，也就是说现有研究没有公开蚯蚓提取是否能够对生成性粉尘尤其是游离二氧化硅导致的呼吸系统功能障碍以及肺组织纤维化发生发展的干预作用。
发明内容
解决的技术问题：本发明的第一个目的为提供蚯蚓提取物的药物用途，公开蚯蚓提取物在防治矽尘诱导的肺纤维化药物中的应用，为其成为安全有效的预防和/或治疗矽肺病药物提供理论依据。
本发明的第二个目的是用国际上公认的治疗特发性肺纤维化的药物吡非尼酮作为阳性对照，对比蚯蚓提取物与吡非尼酮对矽肺纤维化效果的优劣。
技术方案：蚯蚓提取物在制备防治矽肺药物中的应用。
所述蚯蚓提取物由以下方法制备：新鲜广地龙(Pheretima asperfillm)洗净，清水吐泥30min后，快速冷冻。取冷冻地龙，加入与地龙等体积的0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液及3wt.％苯甲酸钠水溶液，匀浆5min，置于4℃冰箱4-6h；4℃、8000r/min离心30min，取上清加乙醇至肉眼能见沉淀析出，4℃过夜，离心，沉淀物为地龙粗提取物，于真空干燥并冻干保存。
防治矽肺的药物，有效成分为蚯蚓提取物。
所述蚯蚓提取物由以下方法制备：新鲜广地龙(Pheretima asperfillm)洗净，清水吐泥30min后，快速冷冻。取冷冻地龙，加入与地龙等体积的0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液及3wt.％苯甲酸钠水溶液，匀浆5min，4℃冰箱4-6h；4℃、8000r/min离心30min，取上清加乙醇至肉眼能见沉淀析出，4℃过夜，离心，沉淀物于真空干燥保存为地龙粗提取物；称取冻干的地龙粗提取物10g，充分溶于0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液中，4℃10000r/min离心20min，取上清上离子交换层析柱，用NaCl梯度洗脱，收集活性峰，上亲和柱，用0.2mol/L NaCl的0.02mol/LpH7.3磷酸缓冲液冲洗，亲和洗脱液解离透析得到纯化的蚯蚓提取物，冻干保存。
所述蚯蚓提取物中蚓激酶酶活按照国际方法检测为220000U/mg。
按药剂学方法，将本发明药物蚯蚓提取物可制备成多种临床药物剂型作为治疗尘肺纤维化的药物，包括胶丸、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
有益效果：蚯蚓提取物含有丰富的生物活性物质，包括纤溶酶、纤维素酶、胶原酶、纤溶酶激活剂等；蚯蚓提取物可通过影响氧化应激和炎症来抑制或减轻矽尘诱导的起始慢性肺部炎症反应，更重要的是它还可以通过直接降解细胞外基质或激活基质金属硫蛋白酶类及纤溶酶来降解细胞外基质，干预矽尘诱导的肺纤维化。申请人从动物模型研究中出乎意料的发现，用蚯蚓提取物预防和治疗矽肺纤维化取得了肯定的疗效：(1)蚯蚓提取物对矽肺动物模型的干预实验结果提示蚯蚓提取物在矽肺的发生发展的炎症阶段及纤维化阶段发挥抗纤维化作用，且低剂量的给药效果优于高剂量给药。(2)从预防实验和治疗实验来看，蚯蚓提取物和吡非尼酮的预防型用药对于预防矽肺的纤维化发展效果甚好，预防效果优于治疗效果。(3)蚯蚓提取物与PFD相比，治疗和预防效果与其相当，通过本发明提取方法，单位重量蚯蚓提取物中蚓激酶活性高达220000U/mg，所以其发挥作用的有效剂量明显小于PFD的有效剂量。
附图说明
图1：干预组小鼠肺脏μCT充气肺容积立体像素值图；小鼠肺部μCT立体像素值的变化：生理盐水组、矽尘组、低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值之间差异有统计学意义(F＝28.76，P＝0.0003)。矽尘组较生理盐水组小鼠充气肺容积立体像素值明显减少(P＝0.004)；与生理盐水组相比，低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值降低的差异有统计学意义(P值分别为0.005,0.006)；与矽尘组相比，低剂量组立体像素值的增高有统计学意义(P＝0.01)；高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值增高无统计学差异(P＝0.06)。
图2：干预组小鼠充气肺容积3D模型图；通过立体像素值构建小鼠肺部3D模型，生理盐水组小鼠呼气末充气肺容积与正常肺脏大小接近，无明显缺口；矽尘组充气肺容积3D模型有明显缺损，肺组织萎缩，提示呼气末肺内含气量减少，肺组织纤维化，结构破坏；蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组充气肺容积3D模型仍有部分缺损，但范围及程度均较矽尘组小，且低剂量肺结构形态优于高剂量组。
图3：干预组小鼠肺组织纤维化HE结果图；生理盐水组:肺内结构相对清晰，肺泡壁纤薄完整，肺泡间隔未见增厚，无水肿、炎症及纤维化表现，肺泡腔内无明显渗出。矽尘组:小鼠肺组织随着染尘时间可见有明显的渐进性炎症改变已经典型的纤维化表现。蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组：肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组明显减轻，干预7天组肺组织炎细胞浸润区域较模型组明显减少。干预14天组肺组织结构较模型组完整，成纤维细胞增殖减轻，细胞聚集范围减小，病变程度较同期模型组轻。干预28天组虽出现细胞性结节，但大小及数量均较同期模型组少。
图4：干预组小鼠肺组织Masson染色及α-SMA免疫组化结果图；结果显示蚯蚓提取物干预组的纤维沉积和上皮间质转化严重程度明显低于矽尘组，说明蚯蚓提取物的干预有一定的效果。
图5：预防组7天、14天及28天小鼠肺组织纤维化HE结果图；与肺纤维化发生发展过程较为典型的矽尘组相比，蚯蚓提取物预防组及PFD预防组肺泡炎及肺纤维化程度均较矽尘组明显减轻，在前期预防性给药的基础上，造模后继续治疗7天组肺组织炎细胞浸润区域较模型组明显减少；治疗14天组肺组织结构较模型组完整，成纤维细胞增殖减轻，细胞聚集范围减小，病变程度较同期模型组轻；治疗28天组仍未出现细胞性结节，只可见局部细胞的聚集，提示预防性用药的效果良好。
图6：治疗组小鼠肺组织纤维化HE结果图；按照典型的动物模型矽肺发展进程，在造模28天后肺组织大多呈纤维化改变，大部分正常的肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增厚。肺巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞明显减少，成纤维细胞增多，有细胞性矽结节形成，结节周围可见纤维增生及代偿性的肺气肿，胶质产生和胶原沉积更明显，偶见纤维性矽结节形成。在此阶段进行治疗一个月发现，蚯蚓提取物治疗组及PFD治疗组能不同程度地减轻纤维化程度，成纤维细胞增殖减轻，细胞聚集以及细胞结节范围减小，病变程度较同期模型组轻；然而，蚯蚓提取物治疗组和吡非尼酮治疗组也依然可见少量细胞结节，提示治疗性用药的效果尚可。
图7：治疗组小鼠肺脏μCT充气肺容积立体像素值图；生理盐水组、矽尘组、低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值之间差异有统计学意义(P＝0.014)。矽尘组较生理盐水组小鼠充气肺容积立体像素值明显减少(P＝0.014)；与生理盐水组相比，低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值差异无统计学意义(P值分别为0.264,0.451)；与矽尘组相比，低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值均无统计学差异(P值分别为0.149,0.086)。
图8：治疗组小鼠充气肺容积3D模型图；染尘28天后再行治疗28天，结果提示生理盐水组小鼠呼气末充气肺容积与正常肺脏大小接近，无明显缺口；矽尘组充气肺容积3D模型有明显缺损，肺组织萎缩，提示呼气末肺内含气量减少，肺组织纤维化，结构破坏；蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组充气肺容积3D模型仍有部分缺损，但范围及程度均较矽尘组小。
具体实施方式
本发明蚯蚓提取物是参与肺纤维化发生发展的多成分多靶点药物。以下结合实施例对本发明具体实施方式进行详细说明：本实施力在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
蚯蚓提取物的制备方法为：新鲜广地龙(Pheretima asperfillm)洗净，清水吐泥30min后，加入与清水等体积的0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液及3wt.％苯甲酸钠水溶液，匀浆5min，4℃冰箱4-6h。4℃离心(8000r/min)30min，取上清加乙醇至肉眼能见沉淀析出，4℃过夜，离心，沉淀物于真空干燥保存为地龙粗提取物。称取冻干的地龙粗提取物10g，充分溶于0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液中，4℃10000r/min离心20min，取上清上离子交换层析柱，用NaCl梯度洗脱，收集活性峰，上亲和柱，用0.2mol/L NaCl的0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液冲洗，亲和洗脱液解离透析得到纯化的蚯蚓提取物，冻干保存。
实验例1 蚯蚓提取物干预小鼠矽肺发生发展的效果评价
1、实验目的
观察蚯蚓提取物干预矽尘诱导肺纤维化中的作用，为临床应用提供理论依据。
2、实验材料
动物：SPF级健康成年雄性C57BL/6小鼠，4-6周龄，体重20-25克，购自南京医科大学动物中心，给药期间自由饮水进食；
试剂：结晶型二氧化硅标准品购自Sigma公司；75vt.％的酒精溶液；1wt.％的戊巴比妥钠；0.4wt.％的碘伏；生理盐水；75vt.％的乙醇；
药物：蚯蚓提取物为广地龙提取物(以蚓激酶活性代表各类酶的活性，约220000U/mg)。
3、实验方法
(1)小鼠矽肺模型的建立及治疗：C57BL/6小鼠称量体重后，编号，随机分组，具体分组见表1。用1％的戊巴比妥那0.2mL腹腔注射麻醉，仰卧固定在试验台上，颈部去毛后，75％的乙醇消毒。切开皮肤，钝性分离，逐层暴露气管，将1mL注射器经两气管软骨环间隙向心端刺入气管。空白对照组注射50μL生理盐水，其他各组小鼠均灌注50μL SiO2悬浊液(50g/L)。建模成功2天后开始腹腔给药，EE低剂量治疗组0.1μg/g/day，EE高剂量组1.0μg/g/day，对照组给予等量的生理盐水，根据每周体重调整给药剂量。具体处理方案见表1。
表1蚯蚓提取物治疗矽肺病方案
注释EE(Earthworm Extract)：蚯蚓提取物
(2)Micro CT：对治疗方案中建模28天每组5只小鼠进行micro CT扫描。具体步骤：用1％的戊巴比妥钠0.15mL麻醉，将其仰卧平放于小动物μCT机中进行扫描。μCT结果呈现为图像的扫描，图像的重建和充气肺组织的分割及其立体像素值的计算三部分。在扫描过程中采集图像时设置以下参数：X射线电源电压50kv峰值；180μA的电流；每次投影相机曝光时间为120ms；每个视野投影9次；视野为23*35mm；采集投影时每次增加0.7度；并应用视觉相机记录胸部呼吸运动。获取扫描图像后，选取呼气末图像进行下一步重建工作。应用NRecon(1.6.1.3版本，SkyScan)软件对X线断层照片进行重建，重建的参数是：平滑值设置为“2”；射束硬化校正设置为“31％”；重建图像的肺充气容积分割包含多次阈值转化和去除杂点过程，从而得到仅与我们所研究小鼠肺脏充气部分对应的ROI图像，最后应用CTVol软件(SkyScan，1.11.1.1版本)构建3D模型，并且计算充气肺容量的立体像素值。
(3)生物样本留存
①血清标本收集：用1％的戊巴比妥钠麻醉，采用摘除眼球的方式留取全血。离心分离血清，-70℃冰箱保存。
②肺泡灌洗液收集：小鼠取血后，用大头针将小鼠四肢仰卧位固定于实验台上，暴露出肺和气管，在气管上剪一个口，用5mL针管磨圆针头插管插入气管腔内，并用缝合线从近心端固定；2mL注射器每次吸取0.6mL温热的PBS缓冲溶液，缓慢经气管注入肺，间隔30s后抽取灌洗液，反复抽吸3次，约回收1.2mL肺泡灌洗液，离心，上清液-70℃冰箱保存，细胞沉淀按照常规方法对其进行计数与分类。
③肺组织：取左肺快速冷冻于液氮罐中，然后转入-70℃冰箱保存；取右下肺叶，用10％多聚甲醛固定，室温保存。
(4)统计学处理：采用SPSS 18.0统计软件包进行数据处理，实验数据均采用表示，组间比较采用t检验或方差分析；计数资料比较采用卡方检验，检验水准α＝0.05。
4、实验结果
(1)一般情况观察与体重变化：实验开始前生理盐水组、矽尘组、蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组小鼠的体重之间差异无统计学意义。实验期间，四组小鼠的体重都随着时间逐渐增加，但以生理盐水组上升幅度最大，但是第四周时各组小鼠体重差别无统计学意义。小鼠在接受气管灌注之后，切口恢复良好，在整个实验过程中各组小鼠皮毛色泽，活动度，食欲基本一致。
(2)小鼠肺泡灌洗液中白细胞总数的变化：染尘7天后，四组间差异有统计学意义(F＝4.63，P＝0.04)。矽尘组、低剂量组、高剂量组间无统计学差异；与生理盐水组相比，矽尘组、低剂量组、高剂量组小鼠BALF中白细胞总数均增加，差异有统计学意义(P值分别为0.011，0.018，0.023)。染尘14天后，四组间差异有统计学意义(F＝8.285，P＝0.011)。与生理盐水组相比，矽尘组、低剂量组小鼠BALF中白细胞总数均增加，差异有统计学意义(P值分别为0.002，0.031)；高剂量组与生理盐水组之间无统计学差异(P＝0.117)；高剂量组小鼠BALF中白细胞总数显著低于矽尘组(P＝0.012)。染尘28天后，四组间差异有统计学意义(F＝41.62，P＝0.0001)。与生理盐水组相比，矽尘组、低剂量组、高剂量组小鼠BALF中白细胞总数均显著增加(P值分别为0.001，0.009，0.003)；且低剂量组及高剂量组小鼠BALF中白细胞总数较矽尘组明显减少(P＝0.039)，见表2。
表2给予不同处理后小鼠BALF中白细胞总数变化情况(*104个/mL)
注：与生理盐水组相比，aP<0.05或0.01；与矽尘组相比，bP<0.05或0.01；
(3)小鼠肺部μCT立体像素值的变化：生理盐水组、矽尘组、低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值之间差异有统计学意义(F＝28.76，P＝0.0003)。矽尘组较生理盐水组小鼠充气肺容积立体像素值明显减少(P＝0.004)；与生理盐水组相比，低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值降低的差异有统计学意义(P值分别为0.005,0.006)；与矽尘组相比，低剂量组立体像素值的增高有统计学意义(P＝0.01)；高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值增高无统计学差异(P＝0.06)，见图1。通过立体像素值构建小鼠肺部3D模型，如图2所示，染尘28天再治疗结果显示，生理盐水组小鼠呼气末充气肺容积与正常肺脏大小接近，无明显缺口；矽尘组充气肺容积3D模型有明显缺损，肺组织萎缩，提示呼气末肺内含气量减少，肺组织纤维化，结构破坏；蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组充气肺容积3D模型仍有部分缺损，但范围及程度均较矽尘组小，且低剂量肺结构形态优于高剂量组。
(4)小鼠肺组织病理学变化：
①肺脏外观：生理盐水组小鼠肺叶轮廓清晰,呈淡粉红色，表面光滑，弹性好。矽尘组肉眼观察，粉尘处理7天、14天后，可见肺表面有暗红色出血点；粉尘处理28天后，可见肺脏萎缩、表面凹凸不平、弹性明显降低、颜色暗淡，个别小鼠肺脏表面可见散在的针头大小的灰白色结节。蚯蚓提取物各剂量组与矽尘组相比较，双肺色泽、硬度、弹性、结节样改变等情况有所好转，两肺颜色略暗红，双肺表面稍粗超，大部分动物肺脏弹性尚可，部分肺叶偶尔可见散在的点状灰白色斑块。
②肺组织病理切片：生理盐水组:肺内结构相对清晰，肺泡壁纤薄完整，肺泡间隔未见增厚，无水肿、炎症及纤维化表现，肺泡腔内无明显渗出。矽尘组:小鼠肺组织随着染尘时间可见有明显的渐进性炎症改变。染尘7天后，可见有明显的炎症细胞浸润，呈急性炎症反应的表现，肺组织实变，肺泡腔内分泌物增多伴轻度出血，肺泡间隔增宽。14天时，肺泡炎开始逐步减轻，部分肺泡腔破坏或消失，肺大泡形成，肺泡间隔增厚更明显，成纤维细胞增多，毛细血管增生，同时可见少量的胶质沉积。28天时，肺组织大多呈纤维化改变，大部分正常的肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增厚。肺巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞明显减少，成纤维细胞增多，有细胞性矽结节形成，结节周围可见纤维增生及代偿性的肺气肿，胶质产生和胶原沉积更明显，偶见纤维性矽结节形成。蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组：肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组明显减轻，干预7天组肺组织炎细胞浸润区域较模型组明显减少。干预14天组肺组织结构较模型组完整，成纤维细胞增殖减轻，细胞聚集范围减小，病变程度较同期模型组轻。干预28天组虽出现细胞性结节，但大小及数量均较同期模型组少，见图3(×200)。
(5)Masson染色及α-SMA免疫组化结果：Masson染色是用于显示组织中纤维的染色方法之一；上皮间质转化是肺纤维化的重要的病理过程，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，而α-SMA为间质肌成纤维细胞的重要标志物，通过免疫组化结果可判断肺组织上皮间质转化的发生发展状态。结果显示蚯蚓提取物干预组的纤维沉积和上皮间质转化严重程度明显低于矽尘组，说明干预有一定的效果，但是进一步病理学机制仍需研究，结果见图4(40倍)。
5、实验结论
小鼠矽肺纤维化干预模型结果显示，蚯蚓提取物能够在矽肺发生发展的炎症阶段以及纤维沉积阶段均发挥作用，表明对矽尘诱导的肺纤维化有着较好的抑制作用，而且低剂量的给药浓度相较于高剂量，其抗纤维化效果更佳。
实验例2 消化道给予蚯蚓提取物预防小鼠矽肺发生发展的效果评价
1、实验目的
观察蚯蚓提取物预防矽尘诱导肺纤维化中的作用，为临床应用提供理论依据。
2、实验材料
动物：同实验一
试剂：同实验一
药物：蚯蚓提取物为广地龙提取物(蚓激酶约220000U/g)；吡非尼酮
吡非尼酮是一种新型的靶向抗纤维化药物，吡非尼酮已经被用作治疗特发性肺纤维化IPF的临床推荐用药在欧洲国家和日本。尽管它确切的机制并不是十分清楚，比较明确的是其主要是通过靶向抑制TGF-β通路。研究发现吡非尼酮能够减轻成纤维细胞的增殖并且抑制激活状态的肌成纤维细胞产生以及分泌纤维化相关的介质和ECM组件。
3、实验方法
(1)小鼠矽肺模型的建立及治疗：C57BL/6小鼠称量体重后，编号，随机分组。用1％的戊巴比妥那0.2mL腹腔注射麻醉，仰卧固定在试验台上，颈部去毛后，75％的乙醇消毒。切开皮肤，钝性分离，逐层暴露气管，将1mL注射器经两气管软骨环间隙向心端刺入气管。空白对照组注射50μL生理盐水，其他各组小鼠均灌注50μL SiO2悬浊液(50g/L)。建模成功2天后开始灌胃给药，EE预防组选择EE提取物0.1μg/g/day，吡非尼酮0.4mg/g/day，对照组给予等量的生理盐水，根据每周体重调整给药剂量。按表3所示的方案组织实施蚯蚓提取物对小鼠矽肺纤维化的预防作用。建模前一周开始每天灌胃，给予预防方案中各组相应的溶液，建模成功2天后继续灌胃处理，在第7天、14天、28天分别处理小鼠，具体处理方案见表3。
(2)生物样本留存
同上
表3蚯蚓提取物预防矽肺病方案
注释EE：蚯蚓提取物；PFD：吡非尼酮
4、实验结果
(1)一般情况观察与体重变化：试验开始前生理盐水组、矽尘组、蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组小鼠的体重之间差异无统计学意义。试验期间，四组小鼠的体重都随着时间逐渐增加，但以生理盐水组上升幅度最大，但是第四周时各组小鼠体重差别无统计学意义。小鼠在接受气管灌注之后，切口恢复良好，在整个实验过程中各组小鼠皮毛色泽，活动度，食欲基本一致。
(2)小鼠肺组织病理学变化：与肺纤维化发生发展过程较为典型的矽尘组相比，蚯蚓提取物预防组及PFD预防组肺泡炎及肺纤维化程度均较矽尘组明显减轻，预防7天组肺组织炎细胞浸润区域较模型组明显减少；预防14天组肺组织结构较模型组完整，成纤维细胞增殖减轻，细胞聚集范围减小，病变程度较同期模型组轻；预防28天组仍未出现细胞性结节，只可见局部细胞的聚集，提示预防性用药的效果良好。预防效果展示见图5(40倍)。
5、实验结论
小鼠矽肺纤维化预防模型结果显示，蚯蚓提取物能够在矽肺发生发展过程中发挥预防纤维化作用，表明预防型给药对矽尘诱导的肺纤维化有着较好的抑制作用，而且灌胃给药亦可发挥蚯蚓提取物的药效。
实验例3 蚯蚓提取物治疗小鼠矽肺发生发展的效果评价
1、实验目的
观察蚯蚓提取物治疗矽尘诱导肺纤维化中的作用，为临床应用提供理论依据。
2、实验材料
同上
3、实验方法
(1)小鼠矽肺模型的建立及治疗：C57BL/6小鼠称量体重后，编号，随机分组，具体分组见表1。用1％的戊巴比妥那0.2mL腹腔注射麻醉，仰卧固定在试验台上，颈部去毛后，75％的乙醇消毒。切开皮肤，钝性分离，逐层暴露气管，将1mL注射器经两气管软骨环间隙向心端刺入气管。空白对照组注射50μL生理盐水，其他各组小鼠均灌注50μL SiO2悬浊液(50g/L)。建模成功2天后开始灌胃给药，给予低剂量及高剂量腹腔注射的等效灌胃剂量，即低剂量0.1μg/g/day，高剂量治疗组1.0μg/g/day；吡非尼酮0.4mg/g/day；对照组给予等量的生理盐水，根据每周体重调整给药剂量。具体处理方案见表4。
(2)Micro CT：对治疗方案中建模28天每组5只小鼠进行micro CT扫描。具体步骤见实验例1。
(3)生物样本留存
同上
表4蚯蚓提取物治疗矽肺病方案
注释EE：蚯蚓提取物；PFD：吡非尼酮
4、实验结果
(1)一般情况观察与体重变化：试验开始前生理盐水组、矽尘组、蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组小鼠以及吡非尼酮治疗组的体重之间差异无统计学意义。试验期间，五组小鼠的体重都随着时间逐渐增加，但以生理盐水组上升幅度最大，但是第四周时各组小鼠体重差别无统计学意义。小鼠在接受气管灌注之后，切口恢复良好，在整个实验过程中各组小鼠皮毛色泽，活动度，食欲基本一致。
(2)小鼠肺组织病理学变化：按照典型的动物模型矽肺发展进程，在造模28天后肺组织大多呈纤维化改变，大部分正常的肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增厚。肺巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞明显减少，成纤维细胞增多，有细胞性矽结节形成，结节周围可见纤维增生及代偿性的肺气肿，胶质产生和胶原沉积更明显，偶见纤维性矽结节形成。在此进行治疗一个月发现，蚯蚓提取物治疗组及PFD治疗组能不同程度地减轻纤维化程度，成纤维细胞增殖减轻，细胞聚集以及细胞结节范围减小，病变程度较同期模型组轻；然而，蚯蚓提取物治疗组和吡非尼酮治疗组也依然可见少量细胞结节，提示治疗性用药的效果尚可。治疗效果展示见图6(56天)。
(3)小鼠肺部μCT立体像素值的变化：生理盐水组、矽尘组、低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值之间差异有统计学意义(P＝0.014)。矽尘组较生理盐水组小鼠充气肺容积立体像素值明显减少(P＝0.014)；与生理盐水组相比，低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值差异无统计学意义(P值分别为0.264,0.451)；与矽尘组相比，低剂量组及高剂量组小鼠充气肺容积立体像素值均无统计学差异(P值分别为0.149,0.086)，见图7。通过立体像素值构建小鼠肺部3D模型，如图8所示，染尘28天后，生理盐水组小鼠呼气末充气肺容积与正常肺脏大小接近，无明显缺口；矽尘组充气肺容积3D模型有明显缺损，肺组织萎缩，提示呼气末肺内含气量减少，肺组织纤维化，结构破坏；蚯蚓提取物低剂量组及高剂量组充气肺容积3D模型仍有部分缺损，但范围及程度均较矽尘组小。
5、实验结论
小鼠矽肺纤维化治疗模型结果显示，蚯蚓提取物和吡非尼酮可发挥部分抗纤维化作用，但是无根治的效果。表明治疗型给药对矽尘诱导的肺纤维化的缓解作用，而且灌胃给药亦可发挥蚯蚓提取物的药效。
实验例4 蚯蚓提取物制作为胶囊
取蚯蚓提取物冻干粉，以医用级淀粉为充填粉加抗结剂二氧化硅，用胶囊充填机将药物充填入明胶胶囊中，使每个胶囊含25mg的蚯蚓冻干粉。
Claims (5)
1.蚯蚓提取物在制备防治矽肺药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述蚯蚓提取物由以下方法制备：新鲜广地龙（Pheretima asperfillm）洗净，清水吐泥30min后，快速冷冻；取冷冻地龙，加入与地龙等体积的0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液及3wt.%苯甲酸钠水溶液，匀浆5min，置于4℃冰箱4-6h；4℃、8000r/min离心30min，取上清加乙醇至肉眼能见沉淀析出，4℃过夜，离心，沉淀物为地龙粗提取物，于真空干燥并冻干保存。
3.防治矽肺的药物，其特征在于有效成分为蚯蚓提取物。
4.根据权利要求3所述的防治矽肺的药物，其特征在于所述蚯蚓提取物由以下方法制备：新鲜广地龙（Pheretima asperfillm）洗净，清水吐泥30min后，快速冷冻；取冷冻地龙，加入与地龙等体积的0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液及3wt.%苯甲酸钠水溶液，匀浆5min，4℃冰箱4-6h；4℃、8000r/min离心30min，取上清加乙醇至肉眼能见沉淀析出，4℃过夜，离心，沉淀物于真空干燥保存为地龙粗提取物；称取冻干的地龙粗提取物10g，充分溶于0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液中，4℃10000r/min离心20min，取上清上离子交换层析柱，用NaCl梯度洗脱，收集活性峰，上亲和柱，用0.2mol/L NaCl的0.02mol/L pH7.3磷酸缓冲液冲洗，亲和洗脱液解离透析得到纯化的蚯蚓提取物，冻干保存。
5.根据权利要求3所述的防治矽肺的药物，其特征在于所述蚯蚓提取物中蚓激酶酶活按照国际方法检测为220000U/mg。
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