CN1686201A - 具有抗乙肝病毒等活性的中药胡黄连提取物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供中药胡黄连的乙醇提取物及其制备方法，所述提取物中胡黄连苷II的含量不少于70.0％；所述提取物具有抗乙肝病毒等活性。
Description
技术领域
本发明提供中药胡黄连的乙醇提取物及其制备方法，所述提取物中胡黄连苷II的含量不少于70.0％；所述提取物具有抗乙肝病毒等活性。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，在我国广泛流行，人群感染率高，在某些地区感染率达到35％以上。据有关资料，肝炎检测阳性的患者已经达到1.89亿，而应就诊未就诊人数(携带者)将近4亿。多见于儿童及青壮年。HBV携带者中50％-70％病毒复制活跃，为慢性乙肝。5年随访研究表明，慢性乙肝病人肝硬化发生率为2％-20％，代偿性肝硬化发展成失代偿性肝硬化为20％-23％，发展成肝癌的占6％-15％。因此，本病是当前危害人民健康最严重的疾病之一。
目前临床上治疗慢性乙型肝炎的药物主要有α-干扰素以及拉米夫定、更昔洛韦等核苷类药物。α干扰素(IFN-α)曾一度被认为是唯一有效的抗病毒治疗药物，其对于非硬化性且病程较短的患者反应性较好，而对于大多数慢性乙型肝炎患者，停药后复发，总体效果令人失望，另外，干扰素-α价格较昂贵，且会导致许多患者类似感冒样的副作用，甚至更严重的副作用；拉米夫定、更昔洛韦等核苷类药物具有很强的抗HBV作用，但长期使用产生耐药，特别是拉米夫定，停药后会产生严重的反弹，容易发生爆发性黄疸。因此，研制高效、低毒、价廉的慢性乙型肝炎治疗药物具有重要的社会、经济价值。
西黄总苷是从玄参科植物胡黄连Picrorhiza scrophulariifloraPennell的根茎中分离获得的有效部位，具有较强的抗乙肝病毒、肝损伤保护活性。
西黄总苷的主要成分为胡黄连苷-II、胡黄连苷-I等，其中胡黄连苷-II含量在70％以上，胡黄连苷-II、胡黄连苷-I的结构分别为：
发明内容
本发明提供中药胡黄连的乙醇提取物及其制备方法，所述提取物中胡黄连苷II的含量不少于70.0％；所述提取物具有抗乙肝病毒等活性。
确切而言，本发明提供：
1、中药胡黄连提取物的制备方法，其特征在于将胡黄连用乙醇提取，纯化后得到胡黄连提取物，所述提取物中胡黄连苷II的含量不少于70.0％；
2、1的方法，其特征在于：
(1)将胡黄连用浓度80％以上的乙醇渗漉提取；
(2)浓缩提取液，上大孔树脂色谱柱，依次用蒸馏水、20％乙醇、95％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分，浓缩，干燥；
(3)将干燥物溶于丙酮，过滤，减压浓缩至浸膏状；
3、由1或2的方法所得到的胡黄连提取物；
4、3的胡黄连提取物在制备治疗乙型肝炎、肺纤维化的药物中的用途；
5、治疗乙型肝炎、肺纤维化的药物，包含3的提取物作为活性成分，和药学上可接受的载体；
6、5的药物，其剂型为注射剂。
由本发明所提供的胡黄连提取物的胡黄连苷II含量高、稳定性好、具有优异的抗乙肝病毒等活性。
1质量标准研究
1.1胡黄连药材的指纹图谱
照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》一部，附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；以流动相A：甲醇，流动相B：0.3Mmol/L冰醋酸溶液，按下表进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；DIONEX P680泵，PDA-100二极管阵列检测器；柱温：25℃。理论塔板数按胡黄连苷II峰计算应不低于10,000。
时间(分钟) A(％) B(％)
0 10 90
20 30 70
45 35 65
60 40 60
参照物溶液的制备 取胡黄连苷II对照品，精密称定，以甲醇-水(1∶9)溶解并稀释至每1mL中含200μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 胡黄连药材干燥粉碎后，过14目筛，取药材粉末10g，精密称定，以80％乙醇50mL浸3h，渗漉，收集240mL渗漉液，浓缩至100mL，定容，取1.0ml，以水稀释并定容于100ml量瓶中，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录1h色谱。应有12个特征峰。
相对保留时间/min(特征峰序号)0.2564±10％(1)、0.3664±10％(2)、0.4546±10％(3)、0.5631±10％(4)、0.6886±10％(5)、0.8607±10％(6)、0.8951±10％(7)、1.0000(8[S])、1.1647±10％(9)、1.4181±10％(10)、1.4982±10％(11)、1.6375±10％(12)
非共有峰面积 胡黄连药材供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％。
供试品指纹图谱与对照指纹图谱比较，经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》(国家药典委员会)计算，相似度应大于0.9。
1.2半成品的质量标准研究
1.2.1鉴别 采用薄层色谱保留值法进行鉴别。
取本品，加甲醇制成每1mL中约含5mg的溶液，作为供试品溶液。另取胡黄连苷II对照品适量，加甲醇制成每1mL中约含5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同硅胶H薄层板上，以氯仿-甲醇(7∶3)为展开剂，展开后，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.2.2检查
澄明度 取本品适量，按照《澄明度检查细则和判断标准》的规定进行检查，应符合规定。
不溶性微粒 取本品适量，加水制成每1mL中约含1mg的溶液，用水做空白，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX R显微计数法)，应符合规定。
pH值 取本品，加水制成每1ml含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录VII G)，应为5.0～7.0。
干燥失重 取本品1.0g，在80℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(《中国药典》2000年版一部附录IX G)。
溶液颜色 取本品适量，加水制成每1mL中约含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录XI)，供试品管呈现的颜色应浅于橙黄色7号标准比色液。
蛋白质 取本品适量，加水制成每1mL中约含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX S)，应符合规定。
鞣质 取本品适量，加水制成每1mL中约含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX S)，应符合规定。
树脂 取本品适量，加水制成每1mL中约含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX S)，应符合规定。
草酸盐 取本品适量，加水制成每1mL中约含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX S)，应符合规定。
炽灼残渣 取本品1.0g，依法检查(《中国药典》2000年版一部附录IX J)，不得过0.5％。
重金属 取炽灼残渣项遗留的残渣，依法检查(《中国药典》2000年版一部附录IX E第二法)，含重金属不得过百万分之十。
砷盐 取炽灼残渣项遗留的残渣，依法检查(《中国药典》2000年版一部附录IX F第一法)，含砷盐不得过百万分之二。
钾离子 取本品适量，加水制成每1mL中约含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX S)，应符合规定。
大孔吸附树脂残留物 照气相色谱法(中国药典2000年版二部附录VE)测定。
色谱条件及系统适用性试验 色谱柱为聚乙二醇为固定液的交联键合毛细管柱(如HP-20M，25m×0.32mm×0.3μm)，氮气为载气；起始温度60℃，以每分钟3℃升至90℃，再以每分钟50℃升至180℃，保持3分钟。进样口温度180℃，FID检测器温度250℃。空白溶剂应无干扰，对照品溶液中各有机溶剂峰之间的分离度应符合规定。
测定法 精密量取正己烷30μl、苯2.3μl、甲苯20μl、对二甲苯20μl、邻二甲苯20μl、苯乙烯20μl、二乙基苯20μl，置10ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀。取混合溶液1.0ml，置50ml量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，取0.5ml，置10ml量瓶中，加DMF稀释至刻度，作为对照品溶液。
另取本品约1g，精密称定，置10ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别取对照品溶液和供试品溶液各2μl，进样，依法进行测定，按外标法以峰面积计算，即得。
供试品溶液中如有溶剂峰，其峰面积不得大于对照品溶液中的相应溶剂峰面积(苯限量2ppm，正己烷、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙基苯分别限量20ppm)。
1.2.3含量测定
胡黄连苷II照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.3Mmol/L冰醋酸溶液(30∶70)为流动相；检测波长为265nm。理论板数按胡黄连苷II峰计算，应不低于2000。
测定法 取胡黄连苷II对照品适量，精密称定，以甲醇配制成每1mL中约含100μg的胡黄连苷II溶液，作为对照品溶液。另取西黄总苷适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1mL含125μg的溶液，作为供试品溶液。分别取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
本品按干燥品计算，含胡黄连苷II不得少于70.0％。
胡黄连总苷 照分光光度法(中国药典2000版附录IV A)测定。
测定法 取胡黄连苷II对照品适量，精密称定，以甲醇配制成每1mL中约含20μg的胡黄连苷II溶液，作为对照品溶液。另取西黄总苷适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1mL含25μg的溶液，作为供试品溶液。照分光光度法(中国药典2000版附录IV A)，在264nm的波长处分别测定对照品溶液和供试品溶液的吸收度，以外标法计算，既得。
本品按干燥品计算，含胡黄连总苷以胡黄连苷II计，应不得少于80.0％。
1.2.4指纹图谱
照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；以流动相A：甲醇，流动B：0.3Mmol/L冰醋酸溶液，流速为0.8mL/min，按下表进行梯度洗脱。理论塔板数按胡黄连苷II峰计算应不低于10,000。
时间(分钟) A(％) B(％)
0 10 90
20 30 70
45 35 65
60 40 60
参照物溶液的制备 取胡黄连苷II对照品，精密称定，以蒸馏水溶解并稀释至每1ml中含200μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取注射用西黄总苷半成品，精密称定，用蒸馏水溶解并稀释至每1mL含200μg的溶液，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录1h色谱。应有6个特征峰。
相对保留时间/min(特征峰序号)0.3659±10％(1)、0.8600±10％(2)、0.89522±10％(3)、1.0000(4[S])、1.1639±10％(5)、1.4158±10％(6)。
非共有峰面积 注射用西黄总苷半成品供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％。
供试品指纹图谱与对照指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》(国家药典委员会)计算，相似度应大于0.9。
1.3成品(注射剂)的质量标准研究
1.3.1鉴别 采用薄层色谱保留值法进行鉴别。
取本品，加甲醇制成每1mL中约含5mg的溶液，作为供试品溶液。另取胡黄连苷II对照品适量，加甲醇制成每1mL中约含5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同硅胶H薄层板上，以氯仿-甲醇(7∶3)为展开剂，展开后，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.3.2检查
澄明度 在超净台内操作。取洁净具塞纳氏比色管5支，分别加入预先滤过的注射用水20mL，按《澄明度检查细则和判断标准》注射用无菌粉末项，于伞盆边沿处轻轻旋转，使溶剂形成旋流，随即用目检视，记录瓶中毛、点数，作为空白，然后分别加入1支供试品，使完全溶解，于伞盆边沿处横置观察，轻轻旋转或左右摆动，用目检视，记录毛、点数，扣除空白，即得。
本品不得检出500μm以上的不溶性异物。每支所含短于500μm的毛及200～500μm的白点、白块和色点总数不得超过10个。
不溶性微粒 取本品1瓶的内容物，用净化水80ml溶解，用净化水做空白，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX R显微计数法)，应符合规定。
pH值 取本品，加水制成每1ml含1mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录VII G)，应为5.0～7.0。
干燥失重 取本品1.0g，在80℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(《中国药典》2000年版一部附录IX G)。
溶液颜色 取本品适量，加水制成每1mL中约含5mg的溶液，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录XI)，供试品管呈现的颜色应浅于橙黄色7号标准比色液。
蛋白质 取本品30mg，加水10ml使溶解，取2ml，置试管中，滴加揉酸试液1～3滴，不得产生浑浊。
鞣质 取本品30mg，加水10ml使溶解，取1ml，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX S)，应符合规定。
树脂 取本品30mg，加水10ml使溶解，取5ml，置分液漏斗中，加氯仿10ml振摇提取，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IXS)，应符合规定。
草酸盐 取本品30mg，加水10ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至1～2，保温滤去沉淀，调节pH值至5～6，取2ml，加3％氯化钙溶液2～3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀。
重金属 取本品1.0g，依法检查(《中国药典》2000年版一部附录IX E第二法)，含重金属不得过百万分之十。
砷盐 取本品0.40g，加2％硝酸镁乙醇溶液3ml，点燃，燃尽后，先用小火炽的使炭化，再在500～600℃炽的至完全灰化，放冷，加盐酸5ml与水21ml使溶解，依法检查(《中国药典》2000年版一部附录IX F第一法)，含砷量不得过百万分之二。
钾离子 取本品30mg，依法测定(《中国药典》2000年版一部附录IX S)，应符合规定。
热原 取本品30mg，加0.9％氯化钠注射液10mL使溶解，剂量按家兔每1kg体重注射3mL，依法检查(《中国药典》2000年版一部附录XIII A)，应符合规定。
无菌 取本品适量，加灭菌注射用水制成每1ml含5mg的溶液，用直接接种法处理后，依法检查(《中国药典》2000年版一部附录XIIIB无菌检查法项下)，应符合规定。
其它 应符合注射剂项下有关的各项规定(《中国药典》2000年版一部附录IU)。
1.3.3含量测定
胡黄连苷II 照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.3Mmol/L冰醋酸溶液(30∶70)为流动相；检测波长为265nm。理论板数按胡黄连苷II峰计算，应不低于2000。
测定法 取胡黄连苷II对照品适量，精密称定，以甲醇配制成每1mL中约含100μg的胡黄连苷II溶液，作为对照品溶液。另取“装量差异”检查项下的本品适量(约相当于胡黄连总苷27mg)，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1mL含120μg的溶液，作为供试品溶液。分别取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
胡黄连总苷 照分光光度法(中国药典2000版附录IV A)测定。
测定法 取胡黄连苷II对照品适量，精密称定，以甲醇配制成每1mL中约含20μg的溶液，作为对照品溶液。另取“装量差异”检查项下的本品适量(约相当于胡黄连总苷27mg)，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1mL含25μg的溶液，作为供试品溶液。照分光光度法(中国药典2000版附录IV A)，在264nm的波长处分别测定对照品溶液和供试品溶液的吸收度，以外标法计算，既得。
本品每瓶含胡黄连苷-II不得低于21mg，含总苷以胡黄连苷-II计应为27mg。
1.3.4指纹图谱
照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；以流动相A：甲醇，流动相B：0.3Mmol/L冰醋酸溶液，按下表进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；检测波长为265nm。理论塔板数按胡黄连苷II峰计算应不低于10,000。
时间(分钟) A(％) B(％)
0 10 90
20 30 70
45 35 65
60 40 60
参照物溶液的制备 取胡黄连苷II对照品，精密称定，以甲醇-水(1∶9)溶解并稀释至每1mL中含200μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取注射用西黄总苷，精密称定，用甲醇-水(1∶9)溶解并稀释至每1mL含200μg的溶液，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录1h色谱。应有5个特征峰。
相对保留时间/min(特征峰序号)0.3671±10％(1)、0.8593±10％(2)、0.8949±10％(3)、1.0000(4[S])、1.4140±10％(5)
非共有峰面积 注射用西黄总苷供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10％。
供试品指纹图谱与对照指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》(国家药典委员会)计算，相似度应大于0.9。
2初步稳定性试验资料
2.1半成品的初步稳定性试验资料
本品在高温60℃，强光照射试验中，敞口放置10天，外观性状、澄明度、pH、含量测定基本没有变化。在湿度75％(25℃)和92.5％(25℃)下，十天考核，有一定的潮解，进而导致样品的干燥失重值增加及含量减少。
本品密闭于包装内，于温度40℃，相对湿度75％条件下，考核6个月，外观性状、澄明度、干燥失重及含量基本没有变化。本品密闭于包装内，于室温放置6个月，其外观性状、澄明度、干燥失重及含量基本没有变化。
以上稳定性考核表明，本品储存时应密封，防止空气中水分对它的潮解。本品的使用期暂定为二年。
根据以上稳定性考察结果，可初步制订本品的有效期为两年。
2.2成品的初步稳定性试验资料
取本品，除去外包装纸盒，放入有NaCl饱和溶液的干燥器(RH75％)内，并置于恒温烘箱内，温度为40±2℃条件下，进行加速稳定性试验。置于温度为25℃±2℃、湿度为60％±10％的条件下，进行长期稳定性试验。
本品于市售包装下于长期试验放置6个月和加速试验放置6个月，性质稳定，其外观性状、澄明度、pH值、含量等未见明显改变，其它项目也未见影响。根据以上稳定性考察结果，可初步制订本品的有效期为两年。
根据以上稳定性考察结果，可初步制订本品的有效期为两年。
因本品以从胡黄连中提取纯化所得的总苷为原料制成的冻干粉针剂，无其它活性物质，未使用辅料。故药理学研究采用原料给药。
3药效学研究
3.1对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的预防保护作用研究
采用腹腔注射0.2％CCl4花生油溶液0.1ml/10g，造成急性肝损伤模型，检测血清转氨酶ALT、AST的值。实验结果表明，西黄总苷小(4mg/kg)、中(8mg/kg)、大(16mg/kg)三个剂量组可明显降低CCl4引起的ALT、AST升高，与模型对照组比较，经统计学处理有显著性差异或非常显著性或极显著性差异(P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001)；阳性对照组ALT、AST亦明显降低，经统计学处理，有极显著性差异(P＜0.001)。表明西黄总苷对小鼠CCl4急性肝损伤有较好的保护作用。
3.2西黄总苷对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的预防保护作用研究
采用皮下注射25％CCl4花生油溶液5ml/kg，每周2次，共3周，造成慢性肝损伤模型，造模前3天预先静脉注射西黄总苷及阳性对照茵栀黄注射液，每日1次，连续给药3周。于末次给药后1h取血测血清AST、ALT、TP及ALB，处死动物取肝脏做病理组织学检查，观测其对CCl4所致慢性肝功能损伤的预保护作用。试验结果表明：西黄总苷小(3mg/kg)、中(6mg/kg)、大剂量组(12mg/kg)与模型组相比，可显著降低CCl4引起的血清AST、ALT升高，显著抑制CCl4引起的血清总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)降低，经统计学分析，均有非常或极显著性差异(P＜0.01或P＜0.001)，说明受试药物有显著抑制血清转氨酶升高及血清总蛋白和白蛋白降低的作用；阳性对照组与模型组相比，血清AST、ALT均有显著性降低(P＜0.01)，血清总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)也均有显著升高(P＜0.01)。
3.3西黄总苷对四氯化碳所致大鼠慢性肝损伤的治疗作用研究
采用皮下注射25％CCl4花生油溶液2ml/kg，每周二次，连续6周，造成慢性肝损伤模型。于造模2周后，眶后取血测血清ALT及AST，根据血清ALT及AST值，参考体重分组：模型对照、阳性对照、西黄总苷小(3mg/kg)、中(6mg/kg)和大(12mg/kg)剂量组。各给药组尾静脉注射给药，模型对照及正常对照组给予等体积生理盐水，每天一次，连续4周。于末次给药24小时后，取血，测血清ALT、AST、TP、ALB，取肝脏做病理组织学检查及测定羟脯氨酸及肝糖原值。试验结果表明：西黄总苷能显著降低CCl4致大鼠慢性肝损伤血清转氨酶(AST、ALT)的水平，升高血清总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平，亦能降低羟脯氨酸和升高肝糖原含量，肝脏病理组织学检查可见肝硬化明显减轻。提示西黄总苷对四氯化碳致实验性大鼠慢性肝损伤有一定的治疗作用。
3.4对大鼠胆汁分泌的影响
采用胆汁引流法检测西黄总苷对大鼠胆汁分泌的影响。结果显示，西黄总苷三个剂量组(3mg/kg、6mg/kg、12mg/kg)有明显的利胆作用。在给药后，与空白对照组比较在小剂量在60min后、中、高剂量从30-120min均有非常显著性差异(P＜0.01)，与自身给药前比较在0.5-2.0h有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，利胆作用可持续2h。茵栀黄注射液也有明显的利胆作用，其利胆作用在30min时最明显。
3.5注射用西黄总苷对小鼠非特异性免疫功能的影响
采用碳粒廓清法检测注射用西黄总苷对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响。结果显示：西黄总苷三个剂量组及茵栀黄注射液碳粒廓清指数K、吞噬指数α均有显著提高；西黄总苷高剂量胸腺指数与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。
3.6注射用西黄总苷对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的预防保护作用
采用昆明种小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖溶液800mg/kg，造成急性肝损伤模型，检测血清转氨酶ALT、AST的值。实验结果表明，D-氨基半乳糖肝损伤后小鼠血清ALT、AST明显升高，而西黄总苷各剂量均使升高的血清ALT、AST显著降低，与模型对照组比较，经统计学处理有显著性差异或非常显著性(P＜0.05、P＜0.0 1)；阳性对照药茵栀黄注射液亦可非常显著降低血清ALT、AST(P＜0.01)，中剂量组与阳性对照组效果相当；高剂量组肝损伤保护作用优于阳性对照茵栀黄注射液。
3.7注射用西黄总苷对D-氨基半乳糖所致大鼠慢性肝损伤的治疗作用
采用腹腔注射D-氨基半乳糖溶液400mg/kg，每周二次，连续6周，造成慢性肝损伤模型。于造模2周后，眶后取血测血清ALT及AST，根据血清ALT及AST值，参考体重分组：模型对照、阳性对照、西黄总苷小(3mg/kg)、中(6mg/kg)和大(12mg/kg)剂量组。各给药组尾静脉注射给药，模型对照及正常对照组给予等体积生理盐水，每天一次，连续4周。于末次给药24小时后，取血，测血清ALT、AST、TP、ALB，取肝脏做病理组织学检查及测定羟脯氨酸及肝糖原值。试验结果表明：西黄总苷能显著降低D-氨基半乳糖致大鼠慢性肝损伤血清转氨酶(AST、ALT)的水平，升高血清总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平，亦能降低羟脯氨酸和升高肝糖原含量，肝脏病理组织学检查可见肝硬化明显减轻。提示西黄总苷对D-氨基半乳糖致实验性大鼠慢性肝损伤有一定的治疗作用。
3.8注射用西黄总苷体内抗乙肝病毒作用
采用鸭胫静脉注射0.2ml上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，造成鸭乙型肝炎病毒模型，检测血清DHBV-DNA含量。三批实验结果表明，注射用西黄总苷高(120mg/kg)、中(60mg/kg)、低(30mg/kg)三个剂量组可降低DHBV-DNA感染鸭血清中DHBV-DNA含量。与模型对照组比较，经统计学处理有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；阳性药对照组DHBV-DNA亦明显降低。注射用西黄总苷对DHBV-DNA感染鸭有较好的治疗作用。
3.9注射用西黄总苷体外抗乙肝病毒作用研究
在注射用西黄总苷对2.2.15细胞的最大无毒浓度范围内，以含注射用西黄总苷500、250、125、62.5、31.25μg/ml的DMEM培养基加入2.2.15细胞共同培养8天。通过采用放免法、斑点杂交、和Southernblot等实验方法，检测药物对2.2.15细胞表面抗原、e抗原产物表达的作用情况，并分别观察2.2.15细胞极其含药培养液中HBV-DNA的复制程度。结果表明：含注射用西黄总苷药物培养基培养的2.2.15细胞HBsAg、HBeAg值低于空白对照组，细胞上清液及细胞内HBV-DNA载量低于细胞对照组。证明其具有良好的抗乙肝病毒活性。
3.10对实验性肺纤维化的治疗作用
特发性肺间质纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种原因未明的间质性肺疾病，肺组织病理学表现为寻常型间质性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)，发病机理复杂。肺纤维化是非典型性肺炎(SARS)重要的临床指症之一，肺结核、肺部放疗等疾病患者均有肺纤维化的临床表现，目前尚无有效的治疗手段。经气管注入博来霉素造成大鼠肺纤维化，其病理过程与人类IPF相似，作为肺纤维化的经典动物模型已被广泛应用。
3.10.1材料与方法
3.10.1.1动物和试药 SD二级大鼠80只，♂♀各半，体重200±20g(北京大学医学部实验动物科学部，许可证号：SCXK(京)2002-0001)，实验动物使用许可证号：SYXK11-00-0025。动物适应环境3目后进行试验。博来霉素(Bleomycin，BLMA5)：批号02010201，哈尔滨博来制药有限公司。
3.10.1.2实验方法
3.10.1.2.1动物模型的复制 常规麻醉大鼠，将其仰卧固定于大鼠实验台上，切开颈部皮肤，分离气管，用1ml注射器缓慢注入BLMA55mg/kg，注药后将大鼠直立并旋转，使药物在肺内均匀分布，尔后缝合皮肤，置实验室观察。空白对照组同法操作，注入生理盐水1ml/kg。
3.10.1.2.2实验分组 术后第3天，大鼠体态、饮食、粪便正常，创面无感染。模型动物随机分为3组：模型对照组、高剂量给药组、低剂量给药组，每组大鼠20只，♂♀各半，♂♀分笼饲养，每笼5只。空白对照组大鼠20只，同法操作。
3.1 0.1.2.3给药方法 空白对照组、模型对照组分别灌胃给予生理盐水2ml·200g-1；高、低剂量给药组分别灌胃给予等体积药液，每日一次，连续28天。
3.10.1.2.4样本处理 乙醚麻醉大鼠，断头处死，完整分离气管和肺，记录并观察。取大鼠左肺浸泡于10％中性甲醛溶液中固定，常规切片，HE染色，在光镜下观察肝细胞的病理组织学变化。根据肺损伤程度分级：1.肺整体形态：双肺呈粉红色，表面光滑，弹性良好记0分；双肺散在点状出血记1分；双肺见密集的点状出血、灶状瘀斑，肺体积增大记2分；双肺灰白色，局部见大小不等结节样改变，仍有陈旧出血点记3分；双肺苍白，体积缩小，硬度增加，表面结节样改变及条索状凹沟记4分。2.光镜观察：对照组大鼠肺结构清晰，未出现明显改变记0分；肺泡间隔轻微水肿，肺泡腔内有较多巨噬细胞(AM)及中性粒细胞(PMN)浸润记1分；肺泡间隔明显水肿，肺泡腔内可见大量以AM及PMN为主的炎性细胞浸润记2分；肺泡间隔增后厚，伴有AM、淋巴细胞(LYM)为主的细胞浸润，间质内成纤维细胞增多，病灶内肺泡萎缩记3分；肺泡间隔明显增宽，成纤维细胞和胶原基质明显增多记4分；肺泡结构破坏，肺泡壁显著增厚，肺间质纤维化瘢痕形成，毛细血管腔闭塞记5分。
3.10.1.3试验数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析
3.10.2结果
3.10.2.1肺整体形态观察可见模型对照组大鼠双肺呈灰白色，表面见大小不等结节样改变，硬度增加。给药二组均可见明显改善，P＜0.01，见表1。
3.10.2.2光镜观察可见模型对照组肺泡间隔明显增宽，成纤维细胞和胶原基质明显增多，部分肺泡结构破坏，肺泡壁显著增厚。给药二组均可见明显改善，P＜0.01，见下表。
| 组别 | 肺整体形态 | 光镜观察 | |||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 空白对照组 | 18 | 2 | 0 | 0 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 模型对照组 | 0 | 0 | 0 | 11 | 9 | 0 | 0 | 0 | 3 | 12 | 5 |
| 低剂量给药组** | 5 | 9 | 6 | 0 | 0 | 0 | 6 | 11 | 3 | 0 | 0 |
| 高剂量给药组** | 10 | 8 | 2 | 0 | 0 | 0 | 10 | 9 | 1 | 0 | 0 |
**与模型组比较P＜0.01，
4一般药理研究
用ICR小鼠、SD大鼠对注射用西黄总苷进行了一般药理学研究，主要观察了注射用西黄总苷对神经系统、心血管系统和呼吸系统的影响。结果表明，注射用西黄总苷以60mg/kg、180mg/kg和600mg/kg静脉注射给药后，在3小时内对小鼠的一般行为活动、协调运动以及阈下剂量戊巴比妥钠催眠作用无明显影响。注射用西黄总苷以30mg/kg、90mg/kg和300mg/kg静脉注射给药后，在3小时内对大鼠的探究活动(中央格停留时间、竖起和修饰次数)无明显影响；对大鼠方格间穿行次数无明显影响。注射用西黄总苷以30mg/kg、90mg/kg和300mg/kg静脉注射给药后，在4小时内，对麻醉大鼠心血管系统(血压、心率、心律、心电图)及呼吸系统(呼吸频率、呼吸节律、呼吸幅度)无明显影响。结果提示，注射用西黄总苷按推荐人体临床剂量给药时，对人体神经系统、循环系统和呼吸系统均无明显影响。
5急性毒性试验
采用ICR小鼠、SD大鼠对西黄总苷进行急性毒性试验，考察西黄总苷对小鼠单次尾静脉注射、对大鼠单次尾静脉注射给药半数致死量(LD50)。小鼠尾静脉注射给予西黄总苷的LD50为1 563.8mg/kg体重，相当于推荐人临床剂量0.5mg/kg体重的3127倍。大鼠尾静脉注射给予西黄总苷的LD50为963.4mg/kg体重，相当于推荐人临床剂量0.5mg/kg人体重的1927倍。
6长期毒性试验
根据《中药新药研究指南》、《新药审批办法——有关中药部分的修订与补充规定》等有关文件的要求，对注射用西黄总苷进行大鼠长期毒性试验，观察给大鼠腹腔注射3个月、Beagle犬静脉滴注西黄总苷3个月后由于蓄积作用对机体产生的毒性反应，提供在高剂量给药情况下出现毒副反应的靶器官及其损伤程度，了解毒性作用的延迟反应和可逆性，确定无毒性反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考。
取约6周龄SD大鼠、健康Beagle犬各随机分成四组，设大、中、小剂量组和对照组，大鼠低、中、高剂量和对照组大鼠各为30只，Beagle犬每组6只，雌雄各半。SD大鼠大剂量组按300mg/kg体重、中剂量组按90mg/kg体重、小剂量组按30mg/kg体重给药，对照组给予等容量生理盐水。大鼠每周给药6天，停药1天，连续给药3个月，每天观察一般状况，每周测量体重和进食量，在给药3个月和停药1个月后各取部分动物作全面检查。Beagle犬的给药大、中、小剂量分别为50、15和5mg·kg-1·d-1。Beagle犬每周给药6天，停药1天，连续给药3个月，停药后观察2周，观察检测的指标包括一般体征、食量、体重、血液学指标、血液生化指标、脏器重量及脏器系数、病理学检查。
结果显示，对照组及各用药组大鼠自始至终活动正常，生长良好，食欲正常。在血液学、尿常规、血液生化指标和病理检查等方面均未发现与药物呈剂量相关性的异常变化；病理学检查各剂量组动物均未发现与药物有关组织形态病理变化。Beagle犬给药3个月，各给药组Beagle犬饮食、活动正常，无明显毒性反应；食量、体重与空白对照组Beagle犬比，无显著差异；各给药组Beagle犬的血液生化指标和血液学指标与空白对照组Beagle犬比，部分指标有显著差异，但变化不大，且均在正常范围内，与给药无关。
7与全身给药相关的特殊安全性试验
根据《中药新药研究指南》、《新药审批办法——有关中药部分的修订与补充规定》等有关文件的要求，观察注射用西黄总苷静脉注射给药对血管的刺激性，采用新鲜兔血对注射用西黄总苷进行溶血性实验，采用豚鼠静脉注射给药进行过敏试验，采用豚鼠进行被动皮肤过敏试验，为临床合理用药提供依据。结果显示，家兔耳缘静脉注射剂量为10mg/kg、30mg/kg的西黄总苷，注射部位每次给药后，无明显变化，未见充血、红肿等情况，病理学观察显示其大体检查均未见异常，未见有明显的组织出血、坏死现象，各组织结构完好；新鲜兔血中加入西黄总苷在2小时内不出现溶血和红细胞凝聚，注射用西黄总苷溶血反应判为阴性；豚鼠静脉注射给药30mg/kg西黄总苷过敏反应为阴性；静脉注射30mg/kg西黄总苷未引起豚鼠被动皮肤过敏反应。表明，试验剂量西黄总苷静脉注射给药无明显的血管刺激性，无溶血作用，静脉注射给药不引起全身过敏反应，也不引起被动皮肤过敏反应。
本品为注射用冻干粉针，每瓶含注射用西黄总苷半成品30mg(总苷以胡黄连苷-II计24mg)，用于慢性乙型肝炎的治疗。静脉滴注，临用前以注射用蒸馏水溶解，推荐用法与用量为：一日1次，一次1～2瓶，以5～10％葡萄糖注射液250～500mL稀释后慢慢滴注；糖尿病患者用0.9％生理盐水代替葡萄糖注射液稀释后使用。
具体实施方式
将胡黄连药材粉碎成粗粉，以80％乙醇5∶1(溶剂体积∶药材重量)浸润6小时后渗漉提取，渗漉速度为1.2BV/h，收集24倍量渗漉液，即为提取液。提取液应用旋转薄膜浓缩仪(旋转薄膜浓缩仪(2L)，R205B型，上海申生科技有限公司生产)减压浓缩到浓度为1∶1(药材重量∶溶液体积)；浓缩液过滤，滤液即为上柱样品液。将样品液按0.6BV上样量通入ZTC-1型大孔树脂柱(ZTC-1型大孔树脂，南开大学研制，天津正天成澄清技术有限公司生产)中，依次用12BV的蒸馏水、12BV的20％乙醇、8BV的95％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分，减压浓缩，真空干燥并粉碎；粉末用2倍量丙酮溶解，再边振摇边缓缓加入8倍量丙酮，滤过，将滤液减压回收溶剂至浸膏状，真空干燥并粉碎，得淡黄色结晶状粉末，即为注射用西黄总苷半成品。
半成品为浅黄色粉末，无臭，有吸湿性。在甲醇中易溶，在水中溶解，在乙醚、氯仿中不溶。
本工艺从药材到注射用西黄总苷半成品，平均总得率为3.0％以上，成品中总苷含量在80％以上。本工艺适用于从胡黄连药材中分离纯化注射用西黄总苷半成品，具有稳定、快速、成品高得率等优点。
注射用西黄总苷的制剂处方如下：
注射用西黄总苷半成品 30g
注射用水 加至1000ml
共制成 1000瓶
按以上处方称取处方量西黄总苷，加入适量注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至全量；加入液体量的0.1％针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；灌装，半轧塞；冷冻干燥，压塞轧盖。各检测指标(如含量均匀度、装量差异等)均符合药典规定，加速稳定性试验表明，制剂在40℃、75％相对湿度条件下放置6个月，在室温下放置6个月，稳定性良好。
成品内容物外观为淡黄色粉末，在水中易溶。
Claims (6)
1、中药胡黄连提取物的制备方法，其特征在于将胡黄连用乙醇提取，纯化后得到胡黄连提取物，所述提取物中胡黄连苷II的含量不少于70.0％。
2、权利要求1的方法，其特征在于：
(4)将胡黄连用浓度80％以上的乙醇渗漉提取；
(5)浓缩提取液，上大孔树脂色谱柱，依次用蒸馏水、20％乙醇、95％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分，浓缩，干燥；
(6)将干燥物溶于丙酮，过滤，减压浓缩至浸膏状。
3、由权利要求1或2的方法所得到的胡黄连提取物。
4、权利要求3的胡黄连提取物在制备治疗乙型肝炎、肺纤维化的药物中的用途。
5、治疗乙型肝炎、肺纤维化的药物，包含权利要求3的提取物作为活性成分，和药学上可接受的载体。
6、权利要求5的药物，其剂型为注射剂。
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