CN1290497C - 一种含有蕨麻素的抗病毒药及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属天然药物技术领域。具体涉及一种含有蕨麻素的抗病毒药及制备方法。本发明的药物经药效学研究对HbsAg和HbeAg有抑制作用，对乙型肝炎病毒有明显抑制作用，同时具有保护肝细胞，促进受损肝细胞得修复之作用，极有希望成为具有广泛市场潜力的新一代抗乙肝病毒药物。

Description

一种含有蕨麻素的抗病毒药及制备方法

技术领域

本发明属天然药物技术领域。具体涉及一种由蕨麻提取的含蕨麻素的抗病毒药及制备方法。

背景技术

目前，关于天然药物植物蕨麻的研究；国内、外仅有少量关于蕨麻植物生药学、蕨麻植物化学成分方面的研究以及蕨麻原药材与其它中药配方进行高原耐缺氧方面研究的文献报道。关于抗病毒、抗肝炎药理药效学方面的系统研究、蕨麻抗病毒活性有效部位与有效成分方面的系统研究等尚无文献报道。到目前为止，北京302医院新药研究中心完成的对新药蕨麻活性部位抗肝炎、抗病毒的系统研究、小样本的临床试验以及抗病毒活性成分方面的研究等，在国内、外均为首次公开报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于解决上述技术问题，创制一种含由蕨麻中获得的有效活性成分的抗病毒药。

本发明提供了一种含有蕨麻素的抗病毒药，该药是由蕨麻素作为活性成分与药用载体组成的，并且该制剂中每片含蕨麻素150-300mg，其中载体为淀粉、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、90％乙醇。

本发明的另一所要解决的技术问题是提供了上述一种含有蕨麻素的抗病毒药的制备方法，该方法包括下列步骤：

I.蕨麻素的提取和制备：

取蕨麻药材粗粉，以70％--95％乙醇回流提取3次，每次溶剂量5-10倍，时间0.5-2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩，加入纯化水或适当浓度的乙醇使成为0.5-1.5g(生药)/ml。药液离心后，上清液上D101大孔吸附树脂柱，(中性氧化铝层析工艺流程：蕨麻提取物以适当浓度乙醇溶解后直接上氧化铝柱，然后以适当浓度乙醇进行洗脱)以还原糖阴性反应判定终点；30％乙醇洗脱，将洗脱液浓缩后以TLC检测蕨麻素I出现为终点，收集洗脱液，TLC检测蕨麻III不再出现来判定终点，回收乙醇，＞70℃真空干燥，即得。

II.制备成品

①处方

原料蕨麻素粉150mg、淀粉105g、羧甲基淀粉钠20g、硬脂酸镁0.75g、90％乙醇200ml制成1000片；

②制法

取原料，加适量的淀粉和羧甲基淀粉钠，拌匀，以适量90％乙醇制粒，70℃干燥，加入少量的硬脂酸镁，压成椭圆形片，包薄膜衣，即得。

本发明的一种含有蕨麻素的抗病毒药的药效学研究如下：

(一)西部药物植物资源-JM活性部位，JMS的提取、分离与抗乙肝病毒药效学的研究

1.材料

1.1.原药材

由甘肃省兰州市春秋土特产品有限公司提供(秋季采挖其块根，除去泥沙，晾干即可)；供试药物  JMS浅棕黄色粉末(解放军第302医院药学部药物研究室制备，批号：0010112)。无环鸟苷(ACV)粉剂，规格250mg/支，(英国Wellcome fumdation产品，批号：990812)；大孔吸附树脂(由天津市农药股份有限公司树脂分公司购买，规格：型号D101，粒度：16～60目；批号：2000612)。

1.2.仪器

高效液相色谱仪HP1100(美国惠普公司)；自动进样器。

1.3.试剂

甲醇色谱纯(美国FISHER公司)；DMEM(美国Gibco公司产品)；胎牛血清(美国Gibco公司产品)；G-418(美国Sigma公司产品)；HBeAg，HBsAg固定相放射免疫测定盒(中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品)；a-³²P-dCTP(北京福瑞生物技术工程公司，批号：981206)；缺口翻译药盒(Promega公司，批号：990426)；鸭乙型肝炎病毒为鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性上海麻鸭血清(中国医学科学院北京医科大学医药生物技术研究所病毒室提供，-70℃保存)。

1.4.2.2.15细胞

为转染了HBV(Aayw亚基)全基因组，能分泌HBsAg、HBeAg、HBV-DNA颗粒的人肝母瘤细胞系，美国Mount sinai医学中心构建，中国医学科学院医药生物技术所病毒室传代培养)。

1.5.动物1日龄北京维鸭购自北京南苑养鸭场

2.方法

2.1.JM活性部位JMS的提取分离

2.1.1.JM粗提物的制备：

取原药材JM粉碎过20目筛---70％乙醇浸润6小时-5倍量70％乙醇回流提取二次(每次2小时)---合并回流提取液，减压回收溶剂---浸膏置真空干燥-得JM粗提物(含量为生药的25～30％)。

2.1.2.JM粗提物中活性部位JMS的分离、纯化

2.1.2.1.D-101型大孔树脂的予处理与装柱：

取D-101大孔树脂以95％乙醇活化处理12小时，装柱。继续以95％乙醇冲洗洗至醇液由混浊变澄明---改以纯水冲洗至水洗液无醇味即可。

2.2.3.样品洗脱：

取JM粗提物，按0.5G/ML之浓度比，以水为溶剂，均匀溶解，使成溶液→将样品溶液与大孔树脂混合上样→按以下程序洗脱纯化→7倍量纯水冲洗(流速＞200ml/min，以HPLC监控)，水洗液弃除→7倍量30％乙醇冲洗(溶液由混变清，以HPLC监控)洗脱液弃除→7倍量70％乙醇洗脱(流速＞200ml/min)，收集70％醇洗脱液(以HPLC进行终点监控)→减压浓缩、回收溶剂→得JMS粗品→置真空干燥，得JMS干粉。

2.2.4.活性部位JMS的纯化处理：

取上述JMS粗品以无水乙醇进行纯化处理---得JMS纯化产物，JMS总含量＞50％。

3.活性部位JMS中主要活性成分的结构鉴定与含量分析(另发)

4.药物对细胞的毒性试验：

4.1.将不同浓度含药培养液加入96孔细胞培养板，每浓度4孔，每4d换同浓度药液，设无药细胞对照组。以观察细胞病变为指标，第8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％破坏为3；50％破坏为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制率。按ReedMeuench法计算TC₅₀，TC₀。

B＝1g＞50％抑制百分率；C＝1g稀释倍数

4.2.2.2.15细胞培养及药物应用

2.2.15细胞用含10％胎牛血清及G418(380ug/m1)的DMEM培养基按常规方法培养。开始实验时，用0.25％胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，3×10⁵个·L^-1，24h后换用含药培养液，每4d换新鲜含药培养液，收集4d、8d上清液，-20℃保存，待检。

4.3.鸭乙型肝炎病毒感染及药物治疗

1日龄北京雏鸭经胫静脉注射DHBV-DNA鸭血清毒种，每只0.3ml。7天后取血，分离血清，-70℃保存，待检。雏鸭DHBV感染7d血清检测为阳性后，随机分组，每组6只，进行药物治疗试验，疗程10d。JMS分高、中低3个剂量组，即6g.·kg^-1·d^-1、3g·kg^-1·d^-1、1.5g·kg^-1·d^-1，ig，bid；无环鸟苷(ACV)为阳性对照组，0.1g·kg^-1·d^-1，ig，bid；设生理盐水组为DHBV对照组，ig，bid。分别于用药后5天(T₅)、10天(T₁₀)和停药后3天(P₃)自鸭胫静脉取血，分离血清，-70℃保存，待测。

4.4.2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg检测

采用北方免疫试剂研究所生产的固相放射免疫测定盒检测，方法按说明书用γ-计数器测定每孔药液min^-1(cpm)值。

4.5.鸭血清DHBV-DNA的检测

按缺口翻译试剂说明书方法，用³²P标记DHBV-DNA探针，按陈渊清等方法做血清直接斑点杂交及放射自显影，用酶联免疫检测仪(滤光片入为490nm)测定放射自显影膜片杂交斑点的OD值，以此作为鸭血清标本DHBV-DNA水平值。将同组鸭用药前后血清DHBV-DNA的平均OD值及不同组鸭同一时间血清DHBV-DNA平均抑制率进行比较，判断药物疗效。DHBV-DNA抑制率计算公式：

5.结果

5.1.JMS对体外病毒标志物分泌的抑制

5.1.1.JMS对2.2.15细胞的毒性作用

分别以含JMS 2，1.51，0.5，0.25mg/ml的培养基与2.2.15细胞共同培养，观察不同浓度药物对细胞的毒性作用。结果表明，FGN的最大无毒浓度为1mg/ml，对细胞产生50％毒性的浓度为1.38mg/ml。(见表1)

表1 JMS对2.2.15细胞的毒性作用

Table 1.Toxic effects of FGN in different concentration on 2.2.15 cells

药物浓度mg/ml	细胞病变	破坏百分率％	TC50	TC0
					2.01.510.50.25	4    4    4    43    2    2    30    0    0    00    0    0    00    0    0    0	10062.5000	1.38	1

5.1.2.JMS对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用

小剂量JMS(250μg·ml^-1)对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率在4d，8d两个时相分别为16.5％和51％，中剂量JMS(500μg·ml^-1)在4d，8d两个时相的抑制率分别为26.5％和44.8％。与生理盐水对照组比较，小剂量和中剂量JMS组在8d时对HBsAg的抑制率有显著性意义(P＜0.05)。大剂量JMS(1000μg·ml^-1)在两个时相均可显著抑制HBsAg的复制和表达。(P＜0.05，P＜0.01)。(见表2)

表2 JMS对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用.x±s

Table 2.Inhibitory effects of JMSon HBsAg level of 2.2.15 cells

组别	剂量(ug.ml-1)	P/N	抑制率(％)	P/N	抑制率％
						4d		8d
		细胞对照组FGN组	2505001000	3.78±0.193.51±0.12a3.33±0.21a2.54±0.13b	16.526.573.9					3.92±0.222.99±0.16c3.11±0.09b2.38±0.16d	51.044.884.6

注：与细胞对照组比较^aP＞0.05；^bp＜0.05；P^c＜0.01；^dP＜0.001

Notes：compared with control，^aP＞0.05；^bP＜0.05；P^c＜0.01；^dP＜0.001

5.1.3.JMS对2.2.15细胞分泌的HBeAg的抑制作用

除小剂量JMS(250μg·ml^-1)在4d时对2.2.15细胞分泌的HBeAg无明显抑制作用(P＞0.05)，其余各剂量组对HBeAg的分泌均有显著性抑制作用。(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。同时具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。(见表3)

表3 JMS对2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率作用.x±s

Table 3.Inhibitory effects of JMSon HBeAg level of 2.2.15 cells x±s

组别	剂量(ug.ml-1)	P/N	抑制率(％)	P/N	抑制率(％)
						4d		8d
		细胞对照组JMS组	2505001000	4.93±0.214.43±0.21a3.98±0.17b2.73±0.13c	17.532.977.6					5.06±0.114.06±0.126b3.17±0.11c2.35±0.14d	33.663.891.6

注：与细胞对照组比较^ap＞0.05；^bP＜0.05；^cP＜0.01；^dP＜0.001

Notes：compared with control，^ap＞0.05；^bP＜0.05；^cP＜0.01；^dP＜0.001

5.2.JMS对DHBV-DNA复制的抑制作用

雏鸭感染乙肝病毒后DHBV-DNA全部阳性。JMS高、中剂量组在给药5天(T₅)、10天(T₁₀)，无论给药前后比较(横向)还是与对照组比较(纵向)，鸭血清中DHBV-DNA水平都显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。并且呈一定的时间依赖性和剂量依赖性。低剂量组则无明显抑制作用(P＞0.05)，但停药3天后抑制率有所上升。抑制率升高程度与病毒对照组比较虽无显著性差异，但体现了JMS抑制DHBV-DNA复制的时间依赖性。阳性药无环鸟苷(ACV)在用药期间可显著抑制鸭DHBV-DNA，但停药后下降至18.63％，出现“反跳”现象。(见表4)

表4 JMS对鸭血清DHBVDNA的抑制作用x±s

Table 4.Inhibitory effects of JMS on level of DHBVDNA in duck serum x±s

组别	剂量g.kg-1.d-1)	治疗后天数
									0(T0)	5(T5)		10(T10)		停药后3天(P3)
		平均OD值	平均OD值	平均抑制率％	平均OD值	平均抑制率％	平均OD值	平均抑制率％
									病毒对照组JMSACV组	1.53.06.00.2	0.81±0.250.79±0.18a0.87±0.11a0.86±0.21a0.83±0.29a	0.87±0.190.72±0.22a0.61±0.18af0.399±0.19bf0.35±0.24bh	8.7331.0853.6157.61	0.79±0.230.68±0.19a0.20±0.18ch0.21±0.12ch0.16±0.10ch	14.2577.2176.2279.66	0.81±0.170.55±0.24a0.21±0.13ch0.17±0.11ch0.65±0.11ae	29.8777.0279.8918.63

注：与病毒对照组比较^aP＞0.0；^bP＜0.05；^cP＜0.01

与T₀组比较^eP＞0.05；^fP＜0.05；^hP＜0.01

5.3药物对鸭肝病理影响

鸭肝病理组织学观察，病毒对照组鸭肝细胞出现弥漫性水样变性，部分肝细胞呈气球样病变及脂肪变性，肝小叶有点、灶状坏死。汇管区内较多单核细胞浸润。(见图1)JMS中剂量及大剂量组鸭肝细胞见少数出现水样变性及脂肪变性，少数汇管区受累，肝小叶点状坏死明显减少，结构基本完整(见图2，3)。ACV组鸭肝组织内仅见少数散在点、灶状坏死，肝细胞变性改变较轻，多数肝小叶结构比较完整。

鸭乙型肝炎病毒实验动物模型是国家认可的评价抗肝炎病毒药物疗效模型。曾有研究证明，1日龄北京鸭感染DHBV后，外周血DHBV-DNA上升，于7天左右达到高峰，可持续3周左右。其病程较规律，因而是筛选具有抗肝炎病毒作用药物的理想模型。实验中ACV组在用药期间显著抑制乙肝病毒复制，但停药后病毒血症反跳到给药前水平，此现象与文献报道一致。实验结果提示：高剂量和中剂量JMS对鸭体内DHBV-DNA的复制有显著的抑制作用，停药后无反跳现象。有可能成为较好的乙型肝炎治疗的临床用药。

(二)JMS(赋肝能)对小鼠实验性肝损伤的保护作用

1.材料与方法：

1.1.材料

受试药物：

药物JMS(赋肝能)(棕褐色粉未，溶于乙醇，微溶于水，以蒸馏水配成适当浓度。临用时振摇。由中国人民解放军第302医院药学部药物研究室提供。批号：991222)；阳性对照药物：联苯双酯片(LB，1.5mg/粒，北京协和制药厂生产，批号990918)；茵栀黄口服液(YZH，0.4g·10ml^-1，北京第四制药厂生产，批号990824)；四氯化碳(CCl₄，分析纯，北京化工厂，批号980712)；α-萘异硫氰酸酯(ANIT，分析纯，中国人民解放军防化学院提供)；谷丙转氨酶试剂盒(北京北化精细化学品有限责任公司提供，批号2000321)；总胆红素测定试剂盒(北京中生生物工程高技术公司，批号2000301)

动物：

昆明种小白鼠，体重18-22g，军事医学科学院动物中心提供，合格证号：军医动字BDW-95007

仪器：

4010半自动生化分析仪(北京生化分析仪器厂)病理切片机，高倍显微镜(日本Olympus公司)

1.2.方法：

1.2.1.小鼠CCL4肝损伤模型

健康小鼠60只，设正常对照组、CCl₄肝损伤模型组、联苯双酯组(LB，0.058g·kg^-1·d^-1)和JMS(赋肝能)的高、中、低剂量3个组(0.33g·kg^-1·d^-1，0.165g·kg^-1·d^-1，0.0825g·kg^-1·d^-1)共6组，每组小鼠10只，各组均灌胃给药，每只每次0.4ml，bid。正常对照组和模型组给同体积生理盐水。给药第3天，除正常对照组外，各组小鼠均ip 0.1％CCl₄橄榄油200ml·kg^-11次，全部动物于实验第7天最后一次给药1h后(中毒后36-40h)，摘取小鼠眼球，取眼眶静脉丛血液，收集血样，以生化测定仪检测血清ALT水平，并切取肝脏标本作病理检查。

1.2.2.小鼠ANIT肝损伤模型

动物分组同CCl₄模型，阳性药对照组为茵栀黄口服液，0.4L·kg^-1·d^-1，给药第3天，除正常对照组外，各组均灌胃ANIT麻油液12mg·kg^-1。中毒24h后，取小鼠眼眶静脉丛血液，以生化分析仪测定测定血清中SB水平。

1.2.3.统计处理

实验结果以x±s表示，并进行t检验。

2.结果

2.1.JMS(赋肝能)对小鼠转氨酶水平影响

实验结果表明，与正常对照组相比，CCl₄模型组小鼠血清转氨酶明显升高(P＜0.01)。联苯双酯组和JMS(赋肝能)高剂量组(0.33g·kg^-1·d^-1)、中剂量组(0.165g·kg^-1·d^-1)可显著降低CCl₄肝损伤小鼠血中ALT水平(p＜0.01)，JMS(赋肝能)低剂量组(0.0825g·kg^-1·d^-1)对ALT没有影响(p＞0.05)。中、高剂量组JMS(赋肝能)对CCl₄致损伤小鼠肝脏具有明显保护作用。(结果见表6)

表6 JMS(赋肝能)对CCl₄肝损伤小鼠血清ALT含量的影响(x±s，n＝10)

组别	剂量(g·kg-1)	小鼠血清ALTIU·L-1	改善率(％)
				空白对照组CCL4模型组JMS(赋肝能组)LB组	0.02ml0.1650.08250.04130.029	22.12±5.43163.22±18.93c31.13±6.84d48.68±7.54f156.28±11.22g33.48±5.38d	80.92％70.18％4.25％79.49

注：与空白对照组比较，^cP＜0.01；与中毒组比较，^dP＜0.01 ^fP＜0.05^gP＞0.05

2.2.JMS(赋肝能)对小鼠胆红素水平影响

阳性药茵栀黄组、JMS(赋肝能)高剂量组(0.33g·kg^-1·d^-1)可显著降低ANIT所致的小鼠血清胆红素升高(P＜0.01)。JMS(赋肝能)中剂量组(0.165g·kg^-1·d^-1)、低剂量组(0.0825g·kg^-1·d^-1)对小鼠血清SB无显著影响(p＞0.05)。高剂量组JMS(赋肝能)对ANIT所致小鼠肝损伤具有保护作用(p＜0.05)。(结果见表7)

表7 JMS(赋肝能)对ANIT肝损伤小鼠血清SB含量的影响(x±s，n＝10)

组别	剂量(g·kg-1)	小鼠血清SB
				(umol.l-1)	改善率(％)
		空白对照组ANIT组成JMS(赋肝能组)茵栀黄组	0.0120.1650.08250.04130.2L			0.423±0.113.84±0.97c1.64±0.095d3.66±0.87g3.82±0.99g1.70±0.515d	57.3％4.69％0.52％55.7％

注：与空白组比较，^cP＜0.01；与中毒组比较，^dP＜0.01；^fP＜0.05；^gP＞0.05

2.3.病理组织学检查

于同一部位肝组织取材，中性福尔马林固定，石腊包埋、切片、HE染色、光镜下观察。CCL₄肝损伤模型组小鼠肝细胞带状坏死，小叶结构部分破坏，肝细胞坏死区域波及一个小叶区或连接于中央静脉与汇管区之间，肝细胞并呈弥漫性变性。JMS(赋肝能)高、中剂量组可使细胞脂肪变性减轻。高剂量组未见肝细胞坏死，中剂量组出现部分汇会区炎细胞侵润伴部分肝细胞胞浆疏松。ANIT损伤模型组可见小鼠肝细胞出现大范围浊肿、空泡、脂肪变性和灶状坏死，并伴有胆管细胞肿胀，坏死明显。JMS(赋肝能)高剂量给药组小鼠肝细胞可见肝小叶结构清晰完整，呈空泡变性的肝细胞少见。

3.讨论

有报道证明，CCl₄所致的肝损伤是通过CCl₄在肝脏被还原活化而产生氧自由基，后者与膜脂质和膜蛋白共价结合，引起肝细胞破坏。CCl₄导致肝细胞坏死的另一条途径是抑制肝细胞膜和微粒体膜上钙泵活性，Ca²⁺内流增加而引起肝细胞破坏，最终ALT释放入血，引起血中ALT升高。ANIT则通过损伤肝细胞尤其可使胆管上皮细胞肿坏死而损伤肝胆管，造成小鼠血中SB、ALT升高。

以小鼠为研究对象，通过采用CCl₄、ANIT肝毒剂分别诱导小鼠血清转氨酶和胆红素升高，结合防+治的实验原则，证明了新药JMS(赋肝能)的退黄降酶的保肝作用效果。通过生化指标测定和镜检结果证实，肝损伤组呈现广泛的肝细胞坏死，而给药组则不出现。病理组织形态学观察JMS(赋肝能)对CCl₄致肝细胞浊肿、脂肪变性和坏死有明显减轻作用。尤其是肝细胞坏死程度给药组与对照组的差异更为明显。当肝细胞出现广泛坏死时，网状纤维支架塌陷，当肝细胞再生时，由于失去原有支架而呈不规则结节状，丧失原有小叶的结构和功能，长期可发展为肝硬化。可见JMS(赋肝能)对两种肝毒剂所引起的肝损伤具有很好的保护治疗作用并对预防肝硬化的发生也具有重要意义。

研究结果显示：JMS(赋肝能)高剂量可显著CCl₄肝损伤小鼠血清ALT水平和小鼠ANIT肝损伤所导致的SB升高程度，尤其高剂量组降酶作用与联苯双脂作用相似。

(三)新药JMS(赋肝能)一般药理学研究

1.材料和方法

1.1.药品和试剂

JMS(赋肝能)：

(由302医院药学部新药研究中心提取制备  批号980923)

肝泰钠注射液：

(常州生化千红制药有限公司生产  批号980410)

戊巴比妥钠：

(佛州市化工实验厂生产  批号860910)

1.2.动物

猫：雌雄兼用  体重1.8-3.2kg

小鼠：昆明种  雌雄兼用  体重18-22kg北京医科大学实验动物学部提供(合格证号码01-3049)

2.仪器

四道生理记录仪：日本光电株式会社制造

XZ-4小鼠自由活动数据器：中国医学科学院药物研究所提供

3.方法

3.1.麻醉猫血压、心电、呼吸的观察

猫4只，戊巴比妥钠(40ml/kg)腹腔试醉。颈部手术分离左颈总动脉、气管，作动脉插管(预先充满0.1％肝素液)通过压力换能器与四道生理记录仪相连，作动脉插管通过热敏换能器与四道生理记录仪相连。腹部手术分离十二指肠，作十二指肠插管，而后缝全腹腔。连接II导联心电图至四道生理记录仪。记录正常血压(收缩压、舒张压、平均压)、心电图、心率、呼吸的频率和幅度后通过十二指插管给予JMS(赋肝能)水溶液(3g/kg)，记录上述各指标，每项15分钟记录一次，观察2小时。而后以相同途径给予大剂量药物(6g/kg)，重复上述实验步骤。

3.2.小鼠自由活动测定

昆明种小鼠30只，雌雄各半，随机分为3组，每组10只，分别灌胃给予JMS(赋肝能)水溶液3k/kg、6g/kg及同等体积蒸馏水，放小鼠于自由活动计数器中，每30分钟记录一次自由活动次数(5分钟/只)，持续观察2小时。

4.结果

4.1.JMS(赋肝能)对猫血压影响

实验结果表明：不同剂量JMS(赋肝能)(3g/kg、6g/kg)经十二指肠给药后，实验动物心血管系统、呼吸系统、中枢神经系统一般实验性指标均无明显改变。分别给与JMS(赋肝能)(3g/kg、6g/kg)后，猫的收缩压、舒张压、平均动脉压与给药前相比，没有差异。JMS(赋肝能)对猫的血压没有影响。(见表8)

4.2.JMS(赋肝能)对猫的心率、呼吸频率的影响

给药前，猫的心率及呼吸频率分别为134±43.57、11±3.97，给与JMS(赋肝能)后，猫的心率及呼吸频率没有改变。(见表8)

4.3 JMS(赋肝能)对小鼠的自由活动影响

从表8可看出，小鼠的自由活动时间与给药前相比没有变化。

表8 不同剂量JMS(赋肝能)(3g/kg、6g/kg)对猫的血压的影响。(n＝4，x±s)

		给药前	给药后
				3g/kg6g/kg	收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)平均压(mmHg)心率(次/分)呼吸(次/分)自由活动(次/分)收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)平均压(mmHg)心率(次/分)自由活动(次/分)	153±25.9798±26.84116±26.04134±43.5711±3.97235±98.1168±26.21108±38.06128±33.89133±51.43236±86.2	163±25.9798±34.53120±31.67136±52.4416±8.54282±89.8171±14.36111±21.99131±43.76133±43.76232±97.9

(四)JMS(赋肝能)对小鼠腹腔巨嗜细胞的影响

为评价JMS(赋肝能)的免疫调节作用，以小鼠为实验对象，以环磷酰胺造成免疫底下模型，对赋肝能的免疫调节作用进行了实验研究。

1.材料与方法：

1.1.材料

药物JMS(赋肝能)，棕褐色粉未，溶于乙醇，微溶于水，以蒸馏水配成适当浓度。临用时振摇。由中国人民解放军第302医院药学部药物研究室提供。批号：991222)；峰龄胶囊(中国医学科学院医药生物技术研究所北京北抗药厂生产，批号990918)

高倍显微镜(日本Olympus公司)

1.2.方法：

1.2.1.模型制作及药物治疗

健康小鼠60只，设对照组、阳性药峰龄组和JMS(赋肝能)的高、低剂量2个组(0.825g·kg^-1·d^-1，0.4125g·kg^-1·d^-1)共4组，每组小鼠10只，各组均腹腔注射环磷酰胺0.25ml，每天1次，连续4次，第5天开始，给药组小鼠均灌胃给药，每只每次0.4ml，bid。对照组给同体积生理盐水。

1.2.2.检测

给药第7天，各组小鼠均ip鸡红细胞悬液0.4ml/只。3小时后，取腹腔液涂于载玻片上，固定，姬姆萨染色，制片，高倍显微镜下观察巨嗜细胞吞噬鸡红细胞情况，计算吞噬率及吞噬指数。

1.2.3.统计处理  实验结果以x±s表示，并进行t检验。

2.结果

实验结果表明，与对照组相比，药物治疗组巨嗜细胞对鸡红细胞吞噬率明显高于对照组(p＜0.01)，赋肝能可提高小鼠免疫功能。(见表9)

表9

	空白	峰龄胶囊	JMS(赋肝能)	JMS(赋肝能)
						12.871214.4715.09	31.2533.7835.61	38.9934.0932.4	22.2226.0820
平均值标准差P值	13.611.422	33.552.19P＜0.05	35.163.42P＜0.01	22.763.07P＜0.05

本发明从天然蕨麻中提得蕨麻素的有效成分分析如下：

野鸦椿酸(JMS I)

Euscaphic acid

[异名]野鸦椿酸，2a，3a，19a-三羟基-12-乌苏烯-28-酸，2，3，19-Tric hydrouy-12-ursen-28-oic acid，Jacarandic acid，Acuminatic acid

[化学名]Urs-12-on-28-oic acid，2，3，19-trihydroxy-，(2a，3a)-

[CAS]53155-25-2

[结构式]

[分子式及分子量]C₃₀H₄₈O₅

[分子量]488

[化学分类]三萜triterpenoid

[物理性状]无色结晶粉未(caloress crystac lline powder)，mp270-271℃，[2]²³ _D12c＝1.00，MeOH，IRγmaxCM^-1：3400(OH)，1690(COOH)，1650-1630，820，805(trisubstituteddouble bond)，1030，1000(secondary OH)930(tertiary OH)。MSm/2：488(M⁺)^[1]。Mp264-266℃(乙酸乙脂)，[x]¹⁸ _D-18.6℃c＝0.1073，吡啶。Liebermann-Barchard反应阳性。UV max(EtoH)nm(log)：202(3.18)

IRVmax(KBR)CM^-1：3700-2400，1690，935(COOH)。HNMR[2]。白色无定形粉未(white amorphous powder)，mp271-272℃(甲醇-吡啶)，[x]_D+22.8℃IRVmax(kbr)cm-1：3591，3571-3000，2962，2862，1686，1458，1390，1378，1235，1159，1002，938EIMS(70EV)m/2(％)：488(M⁺，1.0)455(3)，443(5)，442(14)，264(10)，248(41)，218(21)，205(28)，203(39)，201(28)，189(15)，187(25)，146(100)，134(20)，131(17)；HRMS/2：488，3547。HNMR。¹³CNMR。无色结晶(colorlessneedle)(氯仿—甲醇)，mp262-264。

[活性]

1.K6：抗肿瘤活性，对p388细胞呈细胞毒活性，ED50为17.5ug/ml。对H9细胞有抑制生长作用，IC₅₀为37.5±2.9um。

2.VZC：免疫促进作用，能促进正常脾细胞的增殖，对PHA及ConA诱导的T细胞的增殖反应有明显增强作用。体外有增强LPS诱导细胞的增殖作用。本品对CD₄ ⁺，CD₈ ⁺及B细胞均有增殖作用。

3.J5A：抗受滋病毒病毒。有显著抗HIV-1活性。

命US5916919(1999，25pp)

具体实施方式

实施例1

蕨麻素                200mg

微晶纤维素            100mg

淀粉                  30mg

硬脂酸                2mg

单糖浆                10mg

制法：取蕨麻素和微晶纤维素混合25分钟，加入淀粉和单糖浆，混合10分钟，压片前加入硬脂酸，用13/32时标准冲或平压冲压片。

实施例2

蕨麻素                250mg

微晶纤维素            60mg

淀粉              30mg

硬脂酸            5mg

糖粉              15mg

制法：取微晶纤维素、淀粉和糖粉混合20分钟，加入蕨麻素和硬脂酸，以95％乙醇制粒，60℃真空减压干燥，以例1相同条件压片。

实施例3

蕨麻素            300mg

微晶纤维素        60mg

淀粉              30mg

硬脂酸            5mg

淀粉浆            20mg

制法：取蕨麻素、微晶纤维素、淀粉和淀粉浆混合30分钟，加入硬脂酸，以80％乙醇制粒，70℃常压干燥，以例1相同条件压片。

实施例4

蕨麻素            150mg

微晶纤维素        80mg

淀粉              25mg

硬脂酸            5mg

单糖浆            20mg

制法：取全部原料混合30分钟，以95％乙醇制粒，60℃真空减压干燥，以例1相同条件压片混合10分钟，压片前加入硬脂酸，用13/32时标准冲或平压冲压片。

Claims (2)

1.一种含有蕨麻素的抗病毒药，其特征在于该抗病毒药是由蕨麻素作为活性成分与药用载体组成的，并且该制剂中每片含蕨麻素150-300mg，其中载体为淀粉、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、90％乙醇；所述的蕨麻素是通过下列方法制得的：

(1)蕨麻粗提物的制备：

取原药材蕨麻粉碎过20目筛，70％乙醇浸润6小时，5倍量70％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流提取液，减压回收溶剂，浸膏置真空干燥得蕨麻粗提物，含量为生药的25～30％；

(2)蕨麻粗提物中活性部位蕨麻素的分离、纯化

①D-101型大孔树脂的予处理与装柱：

取D-101大孔树脂以95％乙醇活化处理12小时，装柱，继续以95％乙醇冲洗洗至醇液由混浊变澄明，改以纯水冲洗至水洗液无醇味；

②样品洗脱：

取蕨麻粗提物，按0.5G/ML之浓度比，以水为溶剂，均匀溶解，使成溶液，将样品溶液与大孔树脂混合上样，按以下程序洗脱纯化：7倍量纯水冲洗，流速＞200ml/min，以HPLC监控，水洗液弃除；7倍量30％乙醇冲洗，溶液由混变清，以HPLC监控，洗脱液弃除；7倍量70％乙醇洗脱，流速＞200ml/min，收集70％醇洗脱液，以HPLC进行终点监控，再减压浓缩、回收溶剂得蕨麻素粗品，置真空干燥，得蕨麻素干粉；

③活性部位蕨麻素的纯化处理：

取上述蕨麻素粗品以无水乙醇进行纯化处理得蕨麻素纯化产物。

2.一种含有蕨麻素的抗病毒药的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

I.蕨麻素的提取和制备：

(1)蕨麻粗提物的制备：

取原药材蕨麻粉碎过20目筛，70％乙醇浸润6小时，5倍量70％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并回流提取液，减压回收溶剂，浸膏置真空干燥得蕨麻粗提物，含量为生药的25～30％；

(2)蕨麻粗提物中活性部位蕨麻素的分离、纯化

①D-101型大孔树脂的予处理与装柱：

取D-101大孔树脂以95％乙醇活化处理12小时，装柱，继续以95％乙醇冲洗洗至醇液由混浊变澄明，改以纯水冲洗至水洗液无醇味；

②样品洗脱：

取蕨麻粗提物，按0.5G/ML之浓度比，以水为溶剂，均匀溶解，使成溶液，将样品溶液与大孔树脂混合上样，按以下程序洗脱纯化：7倍量纯水冲洗，流速＞200ml/min，以HPLC监控，水洗液弃除；7倍量30％乙醇冲洗，溶液由混变清，以HPLC监控，洗脱液弃除；7倍量70％乙醇洗脱，流速＞200ml/min，收集70％醇洗脱液，以HPLC进行终点监控，再减压浓缩、回收溶剂得蕨麻素粗品，置真空干燥，得蕨麻素干粉；③活性部位蕨麻素的纯化处理：

取上述蕨麻素粗品以无水乙醇进行纯化处理得蕨麻素纯化产物；

II.制备成品

①处方

原料蕨麻素粉150mg、淀粉105g、羧甲基淀粉钠20g、硬脂酸镁0.75g、90％乙醇200ml制成1000片；

②制法

取原料，加适量的淀粉和羧甲基淀粉钠，拌匀，以90％乙醇制粒，70℃干燥，加入硬脂酸镁，压成椭圆形片，包薄膜衣，即得。