CN112321671A - 一种酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法，包括采集植物组织后，把组织样本在液氮的环境下研磨，得到植物组织粉末；在植物组织粉末添加BPP提取缓冲液进行混合离心处理得到混合液，取所述混合液的上清液加入沉淀剂，所述上清液与沉淀剂按照1:5的体积进行添加后置于‑20℃过夜沉淀得到植物蛋白沉淀，将所述植物蛋白沉淀洗涤，提取蛋白质。本发明可以结合不同沉淀剂提取多糖多酚和盐生植物蛋白质，能够提取低浓度溶液中的蛋白质，既适于从多糖多酚类及高盐分含量的植物材料的蛋白质提取，还可用于顽拗植物获得较高产量蛋白。

Description

一种酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法

技术领域

本发明涉及生物蛋白提取领域，具体地说，是涉及一种酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法。

背景技术

蛋白质组学研究中，但是，由于各种植物或组织细胞中含有特定的物质能够降低提取蛋白的产率及质量，所以无法提取固定得率的蛋白质，需要针对特定的材料采取特定的提取处理方法，从而提高提取植物蛋白质的质量，这也是决定蛋白质组学后续比较分析的关键因素。

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是当前唯一大面积栽培生产天然橡胶的经济作物。橡胶树的叶片中除含多糖类物质、多酚和色素外，还含有氰化物和胶乳等物质，而这些物质会直接影响到提取蛋白质的纯度和质量，也会影响后续聚丙烯凝胶电泳和高通量质谱鉴定结果，影响蛋白质组学研究结果的准确性。红树林伴生植物海马齿(Sesuviumportulacastrum L.)属典型热带和亚热带海岸植物，双子叶植物纲，中央种子目番杏科属，分布生长于沿海地区的海岸流动沙丘、泥滩、岩砾地或鱼塘堤岸。海马齿是一种真盐生植物，叶片中含有高浓度的盐，在提取海马齿叶片蛋白质时高盐影响到了蛋白得率和质量，所以提取盐生植物海马齿高纯度蛋白质还存在一定的困难。由于橡胶树叶片、胶乳和海马齿叶片材料的特殊性，其含有多糖、多酚和高盐等多种干扰蛋白提取的物质，由于各种用于双向电泳的蛋白质提取方法，往往因为植物的种类和组织部位的不同而差别也很大，因此，提取高质量的蛋白质，成为双向电泳以及后期质谱鉴定工作中最具挑战性的工作之一。植物组织，特别是橡胶树组织通常含有大量顽拗性物质，如多糖、醌类和多酚等，如果植物蛋白浓度过低，会影响双向电泳分离蛋白的效果，进而干扰后期的质谱鉴定工作。因此需要一种能有效解决上述问题的酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法，

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明包括以下步骤：

A采集植物组织后，把组织样本在液氮速冻环境下研磨，得到植物组织粉末；

B在植物组织粉末添加BPP蛋白提取缓冲液进行混合离心处理得到混合液后取上清液；

C取所述上清液加入沉淀剂，所述上清液与沉淀剂按照体积的1:5进行添加后，置于-20℃过夜沉淀得到植物蛋白沉淀。

D将所述植物蛋白沉淀洗涤，提取蛋白。

进一步地，所述混合离心的方法包括将加入植物组织粉末的预冷BPP提取缓冲液，室温涡旋震荡12min。加入等体积Tris饱和酚，室温涡旋震荡12min。用BPP提取缓冲液配平，4℃16000g离心15min。吸取上清液后再次加入等体积BPP提取缓冲液，4℃涡旋震荡15min。再次加入BPP提取缓冲液，4℃，16000g，离心15min。

进一步地，所述BPP蛋白提取缓冲液包括100mmol/L EDTA,100mmol/L Tris,50mmol/L维生素C,50mmol/L硼砂,1％Triton X-100(V/V),1％PVPP(W/V),30％蔗糖(W/V)和2％β-巯基乙醇(V/V)，pH＝8.0。

进一步地，所述沉淀剂包括过饱和硫酸铵甲醇溶液、醋酸铵溶液和丙酮溶液，按照质量比为2:1:1进行混合添加。

进一步地，所述步骤A中加入1％PVPP粉末防止蛋白质氧化。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明可以结合不同沉淀剂提取多糖多酚和盐生植物蛋白，能够提取低浓度溶液中的蛋白质，既适于从多糖多酚类及高盐分含量的植物材料的蛋白质提取，还可用于顽拗植物获得较高产量蛋白。

附图说明

图1为本发明的流程示意图

图2为三种沉淀剂的总蛋白得率条形图；

具体实施方式

下面根据实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

如图1所示，本发明包括以下步骤：

A采集植物组织后，把组织样本在液氮速冻环境下研磨，得到植物组织粉末；

B在植物组织粉末添加BPP蛋白提取缓冲液进行混合离心处理得到混合液后取上清液；

C取所述上清液加入沉淀剂，所述上清液与沉淀剂按照体积的1:5进行添加后，置于-20℃过夜沉淀得到植物蛋白沉淀。

D将所述植物蛋白沉淀洗涤，提取蛋白。

在本实施例中，以中国热带农业科学院实验田内橡胶树(热研73-3-97)的新鲜叶片(Hevea leaves,HL)、橡胶树新鲜胶乳(Latex,LA)以及番杏科多年生匍匐草本植物海马齿新鲜叶片(Sesuvium L,SL)为实验材料。橡胶树切割先让胶乳流25滴以上，流尽树皮表面的杂质后开始取样，取样用的割刀和鸭舌需要高温灼烧消毒灭菌后使用，以免引起H.brasiliensis死皮病。用植物蛋白质BPP法(Borax/PVPP/Phenol)提取蛋白。参照Wang等的方法配置^[22]，BPP蛋白提取缓冲液:100mmol/L EDTA,100mmol/L Tris,50mmol/L维生素C,50mmol/L硼砂,1％Triton X-100(V/V),1％PVPP(W/V),30％蔗糖(W/V)和2％β-巯基乙醇(V/V)，pH＝8.0；蛋白裂解液:1％IPG buffer(V/V),2mol/L硫脲,2％

CHAPS(W/V),7mol/L尿素,13mmol/L DTT；标准Laemmli buffer:0.001％溴酚蓝(W/V),2％SDS(W/V),5％β-巯基乙醇(V/V),10％甘油,62.5mmol/L Tris-HCl；胶条平衡液:0.002％溴酚蓝(W/V),2％SDS(W/V),30％甘油(V/V),50mmol/L Tris-HCl,6mol/L尿素；GAP凝胶染色液:0.125％考马斯亮蓝G-250(W/V),5％磷酸(V/V),10％硫酸铵(W/V),10％甲醇(V/V),30％(V/V)乙醇；凝胶脱色液:5％乙酸(V/V),30％乙醇(V/V)；胰蛋白酶缓冲液:25mmol/L碳酸氢铵,1mmol/L氯化钙,pH＝8.5。

采集植物组织后，立即浸入液氮预冷研钵中速冻，并加入1％PVPP粉末防止氧化，充分研磨成干粉后，称取3g植物组织粉末，加入盛有12mL预冷BPP提取缓冲液50mL离心管中，室温涡旋震荡12min。加入等体积Tris饱和酚，室温涡旋震荡12min。用BPP提取缓冲液配平，4℃16000g离心15min。吸取上清液于新的50mL离心管中，再次加入等体积BPP提取缓冲液，4℃涡旋震荡15min。再次加入BPP提取缓冲液配平，4℃，16000g，离心15min。取上清液1mL，分装入含有5mL不同沉淀剂的10mL离心管中。沉淀剂均为上清液体积的5倍即：蛋白提取上清液:沉淀剂＝1:5，置于-20℃过夜沉淀。

预冷的过饱和硫酸铵甲醇溶液(Supersaturated ammonium sulfate methanol，SAM)可使蛋白质溶解性变小产生物理沉淀，称为蛋白质“盐析”现象。

丙酮溶液(Acetone solution,AS)通过有机溶剂丙酮溶液破坏蛋白质的水化层，降低介电常数，从而增强带电蛋白质分子之间的相互作用，促进蛋白颗粒聚集沉淀。为避免蛋白变性，丙酮溶液需要低温且操作时间尽量缩短；

预冷0.1mM/L的乙酸铵溶液(Ammonium acetate solution，AA)中性盐减少蛋白质变性，但可破坏蛋白质的水化膜，暴露出憎水区域，使蛋白质聚集沉淀，憎水区的多少决定沉淀量。

本发明既适于从多糖多酚类及高盐分含量的植物材料的蛋白质提取，还可用于顽拗植物获得较高产量蛋白。

蛋白定量

Bradford定量液：0.05g CBB G-250,95％乙醇25ml，50ml 85％磷酸，MilliQ水-定容500mL，滤纸过滤使用。在测定样品浓度前，先制作标准蛋白的标准曲线。样品要置于冰上保持低温，准备牛血清标准蛋白(Bull Serum Albumin，BSA)作为标准样品，裂解液LysisBuffer(LB)，紫外分光度仪器设定测样品蛋白OD＝595，测定每个样品至少重复3次。

SDS-PAGE凝胶电泳染色和图像采集

使用不连续胶SDS-PAGE法^[24]。运用聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量大小对蛋白质进行分离。分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为5％。25μL蛋白质样品上样体积：20μL(V样品+VLB)+5μL，蛋白Loading Buffer 5μL，Marker：10μL，蛋白质量约为30μg，与Laemmlibuffer混匀后上样。电泳条件为16℃恒温水浴下，电泳程序设定：10W，40min，20W，1.2h。凝胶的染色：考马斯亮蓝G-250染色液按照标准化配方提前一天配制。漂洗后的凝胶转入染色液中，摇床低速30rpm/min染色过夜。脱色：脱色液标准化配方现用现配。取出染色好的凝胶放入蒸馏水漂洗5min，转入脱色液中，按照标准化试剂配方中的方法进行脱色过程。脱色后的凝胶用ImageScannerⅢ扫描仪(GE Healthcare)进行扫描和图像采集扫描凝胶，扫描时保证图片分辨率，并保存。凝胶分析：利用ImageMaster 5.0软件分析蛋白电泳图谱条带数。

凝胶胶内蛋白酶解

选取目标差异蛋白，进行胶内酶解，具体参考简化胶内酶解方法^[25]。酶解后收集酶解上清液直接用于质谱鉴定。

质谱鉴定及蛋白数据库搜索

将上述酶解产物进行质谱鉴定，采用的是布鲁克公司基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(5800MALDI-TOF Bruker)，进行一级和二级质谱分析，此操作参考Shen等^[26]方法进行改进。所获得的蛋白数据通过Mascot Distiller软件分析肽的指纹图谱(Peptidemass fingerprinting,PMF)得出结果，再利用Matrix science网站(http://www.matrixscience.com)进行蛋白肽段匹配和数据库搜索鉴定。

结果与分析

橡胶树叶片、胶乳和海马齿叶片的总蛋白提取

酚抽法是植物蛋白提取的常用方法，而BPP法是本实验室在此法的基础上进一步优化改良的一种高效蛋白提取方法，既适于从多糖多酚类及高盐分含量的植物材料的蛋白质提取，还可用于顽拗植物获得较高产量蛋白。

利用BPP法可在橡胶树新鲜叶片、新鲜胶乳和海马齿新鲜叶片中提取到3-10mg/g不等的总蛋白，针对这三种材料在不同沉淀剂下提取总蛋白得率结果显示，每克材料的蛋白得率偏差比较大，其中HL在不同沉淀剂下的得率大小顺序为：AS-HL(10.64±0.06mg/g)>SAM-HL(5.10±0.06mg/g)>AA-HL(3.09±0.01mg/g)；LA的总蛋白得率在不同沉淀剂下的大小顺序为：AS-LA(5.35±0.02mg/g)>AA-LA(4.43±0.02mg/g)>SAM-LA(3.386±0.08mg/g)；SL总蛋白得率大小顺序为：SAM-SL(6.385±0.06mg/g)>AA-SL(5.371±0.04mg/g)>AS-SL(1.959±0.04mg/g)。比较结果显示，HL总蛋白得率在AS得率最高；LA在AS沉淀时总蛋白得率最高，SL在SAM沉淀剂下蛋白得率最高(图2)。

表1为聚丙烯酰氨凝胶电泳蛋白条带统计，表2为部分高丰度的蛋白质MALDI-TOF/TOF-MS质谱鉴定结果，在高分子量(>100kDa)区域和较低分子量(<20kDa)区域均可监测到明显的蛋白条带。应用ImageMaster 5.0软件对1-DE图谱进行蛋白的条带统计分析，不同沉淀剂下的结果检测出不同数目的蛋白条带。经过统计蛋白条带结果显示，SAM沉淀剂下的平均条带较多(39±1.41)，其次AS沉淀剂下的平均蛋白条带(36±1.41)，蛋白条带最少的是AA的1-DE平均蛋白条带较少(29±2.42)。而且橡胶树叶片和海马齿叶片组织的蛋白条带具有相似的图谱，在条带数和个别条带在丰度上出现一定的差异。

表1

表2

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法,其特征在于，包括以下步骤：

A采集植物组织后，把组织样本在液氮速冻条件下研磨，得到植物组织粉末；

B在植物组织粉末添加BPP蛋白提取缓冲液进行混合离心处理得到混合液后取上清液；

C取所述上清液加入沉淀剂，所述上清液与沉淀剂按照体积的1:5进行添加后，置于-20℃过夜沉淀得到植物蛋白沉淀。

D将所述植物蛋白沉淀洗涤，提取蛋白。

2.按照权利要求1所述的酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法，其特征在于：所述混合离心的方法包括将加入植物组织粉末的预冷BPP提取缓冲液抽提，室温涡旋震荡12min。加入等体积Tris饱和酚，室温涡旋震荡12min。用BPP提取缓冲液配平，4℃16000g离心15min。吸取上清液后再次加入等体积BPP提取缓冲液抽提，4℃涡旋震荡15min。再次加入BPP提取缓冲液，4℃，16000g，离心15min。

3.按照权利要求1所述的酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法，其特征在于：所述BPP蛋白提取缓冲液包括100mmol/L EDTA,100mmol/L Tris,50mmol/L维生素C,50mmol/L硼砂,1％Triton X-100(V/V),1％PVPP(W/V),30％蔗糖(W/V)和2％β-巯基乙醇(V/V)，pH＝8.0。

4.按照权利要求1所述的酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法，其特征在于：所述沉淀剂包括过饱和硫酸铵甲醇溶液、醋酸铵溶液和丙酮溶液，按照质量比为2:1:1进行混合添加。

5.按照权利要求1所述的酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法，其特征在于：所述步骤A中加入1％PVPP粉末防止蛋白质氧化。

Images