CN106908402B - 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法 - Google Patents

蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106908402B
CN106908402B CN201710159164.2A CN201710159164A CN106908402B CN 106908402 B CN106908402 B CN 106908402B CN 201710159164 A CN201710159164 A CN 201710159164A CN 106908402 B CN106908402 B CN 106908402B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
protein
broad bean
solution
volume
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710159164.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106908402A (zh
Inventor
李萍
刘玉皎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Original Assignee
Qinghai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qinghai University filed Critical Qinghai University
Priority to CN201710159164.2A priority Critical patent/CN106908402B/zh
Publication of CN106908402A publication Critical patent/CN106908402A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106908402B publication Critical patent/CN106908402B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N21/314—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry with comparison of measurements at specific and non-specific wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2866—Grinding or homogeneising
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N2021/3185—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry typically monochromatic or band-limited

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本申请公开了蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法：取新鲜蚕豆根系；液氮研磨；酚抽提液；Tris平衡酚饱和溶液；离心收集上层酚；0.1mol/L醋酸铵‑甲醇溶液；离心收集沉淀；甲醇清洗；离心收集沉淀；真空干燥沉淀；加入样品裂解液；离心取上清；蛋白定量；分装冷冻；样品水化；样品制备完成。本发明以蚕豆根系为实验材料，填补了蚕豆根系双向电泳技术的空白。本发明中实验步骤简单，易于操作，重复性好，有实验背景的技术人员易学、易掌握。本发明中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。

Description

蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法
技术领域
本申请属于生物化学领域，具体涉及一种蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法。
背景技术
随着人类基因组计划的全面实施与推进，生命科学已经进入了后基因组时代，其主要研究对象已转变为功能基因组学的研究。
蛋白质组学(Proteomics)是以活细胞内基因组编码的全部蛋白质为研究对象，其研究被认为是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一且日趋成为研究热点而备受关注。
双向电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)可以对生物细胞或组织全蛋白质表达进行定性或定量的综合分析，尤其是用于揭示不同条件下蛋白质表达的变化。蛋白质样品的制备是双向电泳的第一步，也是最重要的一步，样品制备的好坏直接影响到随后蛋白的分离及最后分析结果的可靠性。作物不同器官的蛋白质组成特征是有差异的，样品制备方法要根据不同实验材料进行选择，针对材料选择特异的提取方法可以得到更好的分离效果。样品制备分为蛋白质的提取、裂解液配方的选择、杂质的去除等步骤，在处理样品的时候，如果这些步骤中的任何一步没有充分完成，分离可能不完全或失败，并且，一些信息也可能丢失。因此样品的制备极为关键，而建立有效的样品制备方法，高分辨地分离蛋白质一直是植物蛋白质组学研究中双向凝胶电泳技术不断改进的方向。
有关植物组织蛋白质提取方法的研究有很多，然而，没有一种方法适用于所有植物组织。由于根系组成成分复杂、研磨困难，影响根系中色素类、酚类和醌类等物质的清除，故根系蛋白提取方法不同于其他器官的蛋白提取方法。在已报道的作物根系蛋白提取方法中，三氯醋酸/丙酮法、普通的酚抽提法、Tris-HCl法、TCA/丙酮法均有使用，但不同作物其根系的蛋白质组成特征是有差异的，针对材料选择特异的提取方法可以得到更好的分离效果。三氯醋酸/丙酮法是进行蛋白质组学分析最常用的提取方法，提取过程中损失较少，具有广泛的适用性，在拟南芥中取得了很好的分离效果；普通的酚抽提法在油菜、紫花苜蓿根系的蛋白提取中效果最佳；改良后的TCA/丙酮法在水稻、黄瓜、西瓜等作物的根系蛋白提取中提取效果最好，为适宜的蛋白提取方法。
有关豆科植物根系蛋白质提取方法鲜有报道，而适合于蛋白质组学分析的蚕豆根系总蛋白提取方法更是未见报道，已报道的豆科植物根系总蛋白提取方法中发现不同的豆科作物在提取根系总蛋白时采用的方法也不同，紫花苜蓿采用酚抽提法(王继峰，2007)、籽粒苋根系采用Tris-HCl法(晋海军，2015)。
蚕豆关于蛋白方面研究起步较晚，主要研究集中在食品加工级别的蛋白提取、分离、功能特性研究等方面，而在蛋白质组学方面只有理论综述，而没有实质性的工作进展。为了加快蚕豆蛋白质组学研究步伐，为蚕豆蛋白质组学研究奠定理论基础和技术指导需要建立适合于蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，为开展蚕豆双向电泳技术迈出第一步。
发明内容
有鉴于此，本申请所要解决的技术问题是现有技术中没有通用、有效、适合于蚕豆的蛋白质组学分析样品的制备方法。提供一种适合蛋白质组学分析的蚕豆根系样品制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜蚕豆根系；
(2)将所取样品置于预冷至-20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；
(3)研磨好的粉末中加入10倍体积酚抽提液，不定时涡旋混匀等待20min后，加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液(pH8.0)，4℃放置30min，期间每5min摇晃混匀一次；离心后收集上层酚液；
(4)向步骤(3)所述的上层酚液中加入预冷的0.1mol/L醋酸铵-甲醇溶液，-20℃沉淀过夜后，离心收集沉淀；
(5)步骤(4)所述的沉淀中加入预冷甲醇，轻微混合后，4℃离心，弃上清液，沉淀中加入预冷丙酮，轻微混合，4℃离心，收集沉淀；
(6)步骤(5)所得的沉淀真空干燥至水分≤8％，得粉末；
(7)步骤(6)所得粉末溶解液于样品裂解液，23℃下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次；
(8)裂解结束后，离心取上清液，上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；
(9)绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光值，根据标准曲线测定待分析溶液中蛋白质的浓度；
样品蛋白浓度(μg/μl)＝X/样品体积(μl)；
(10)按根系蛋白总上样量200μg，上样总体积350μl，计算蛋白体积，并分装后-80℃保存；
样品蛋白体积(μl)＝200μg/样品蛋白浓度
(11)从-80℃取出蛋白样品，自然溶解后按上样总体350μl和蛋白体积，计算出水化液体积，加入蛋白样品水化液，离心，即得蚕豆根系蛋白质组学分析样品；
水化液体积＝350μl-蛋白体积。
进一步的，步骤(3)中所述的酚抽提液为0.7mol/L蔗糖、0.1mol/L NaCl、0.5mol/LTris-HCl(PH7.5)、50mmol/L EDTA-2Na和0.2％DTT的混合溶液；所述的离心条件为5000×g，10min。
进一步的，步骤(4)中加入的醋酸铵-甲醇溶液的量为上层酚液体积的5倍；预冷至-20℃。
进一步的，步骤(4)中所述的离心条件为12000×g，10min。
进一步的，步骤(5)中所述的离心条件都为12000×g，10min。
进一步的，步骤(7)中所述的样品裂解液为8mol/L尿素、2％聚乙二醇辛基苯基醚、60mmol/L二硫苏糖醇的混合溶液。
进一步的，步骤(9)中所述蛋白浓度标准曲线以牛血清蛋白为标准蛋白，以Bradford方法绘制。
进一步的，步骤(9)中所述考马斯亮蓝蛋白试剂包括：质量浓度为0.01％的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75％的乙醇和质量浓度为8.5％的磷酸；所述反应时间为5min，检测波长为595nm。
进一步的，步骤(11)中所述蛋白样品水化液包括：7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L二硫苏糖醇，0.2％载体两性电解质和0.001％溴酚蓝。
进一步的，步骤(8)和步骤(11)中的离心条件均为4℃、20000×g下离心20min。
对三氯醋酸/丙酮法、普通的酚抽提法、Tris-HCl法、TCA/丙酮法4种植物根系蛋白提取方法进行了比较，发现普通的酚抽提法主要针对于干扰物比例较大的植物材料，是最适于蚕豆根系蛋白提取。同时，根据蚕豆根系特点，对普通酚抽提法进行了方法改进，使改进后的酚抽提法更适合于蚕豆根系的蛋白质提取。
在沉淀洗涤过程中增加了用5倍体积预冷甲醇清洗沉淀。清洗离心后再用预冷丙酮清洗沉淀。目的是醋酸铵在甲醇、丙酮等有机溶剂中有较好的溶解度，先用甲醇洗净残留在沉淀中的醋酸铵，然后再用丙酮将甲醇去除干净，避免重新引入离子。
将普通酚抽提法中在样品粉末中一次性加入蛋白提取液以及等体积的Tris-饱和酚，振荡混匀，调整为分步加入：样品粉末中加入蛋白提取液混合等待20min，期间不定时混匀，然后再加入等体积Tris-饱和酚混合30min以上，期间每5min钟摇晃混匀一次。原因：植物组织中的干扰物质主要有酚类化合物、蛋白水解酶、蛋白氧化酶、萜类、色素、有机酸、盐离子、多糖、脂类、多种次生代谢产物，这些干扰物质可导致2-DE图上横向和纵向的条纹，背景模糊降低蛋白点的分辨率。将样本研磨破碎成粉末后先加入蛋白提取液使两者充分混合反应20min，使蛋白提取液中的EDTA能充分、有效地抑制金属酶类和多酚氧化酶活性；NaCl能充分发挥其盐效应更有利于蛋白质的抽提。20min混合反应后，再加入Tris-饱和酚，使其在4℃环境下最少混合30min，并确保每5min摇晃混匀一次，目的是蛋白提取液中的蔗糖主要起到反相的作用，与Tris-饱和酚充分反应，有效去除样品中的可溶性杂质。同时在4℃环境下操作是因为在低温下蛋白酶活性低，防止蛋白质变性，提高样品的蛋白浓度。
本发明的有益效果：
1.本发明以蚕豆根系为实验材料，以获得符合蛋白质组学分析的样品制备方法为目的，填补了蚕豆根系双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。
2.本发明中实验步骤简单，易于操作，重复性好，有实验背景的技术人员易学、易掌握。
3.本发明中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。
实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本发明蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法实施例1的蛋白浓度标准曲线图；
图2为本发明蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法实施例1得到的蛋白样品的2-DE电泳图。
图3为4种根系蛋白提取方法单向SDS-PAGE电泳图谱。
图中Mark为标记；1、2为TCA/丙酮法提取的根系蛋白；3、4为三氯醋酸/丙酮法提取的根系蛋白；5、6为酚抽提法提取的根系蛋白；7、8为Tris/HCl法提取的根系蛋白。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法
本申请公开的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，包括以下步骤：
称取蚕豆根系→液氮研磨→酚抽提液→Tris平衡酚饱和溶液→离心收集上层酚→0.1mol/L醋酸铵-甲醇溶液→离心收集沉淀→甲醇清洗→离心收集沉淀→真空干燥沉淀→加入样品裂解液→离心取上清→蛋白定量→分装冷冻→样品水化→样品制备完成
(1)称取鲜样：用电子天平准确称取蚕豆根系鲜样1g。
(2)研磨：将研钵提前放置-20℃冰箱预冷，称取样品放置在预冷的研钵中用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉。
(3)酚抽提液：将研磨好的粉末快速转移到20mL离心管中，加入10倍体积(10mL/g)酚抽提液(0.7mol/L蔗糖，0.1mol/L NaCl，0.5mol/L Tris-HCL(PH7.5)，50mmol/L EDTA-2Na，0.2％DTT)，不定时涡旋混匀等待20min。
酚抽提液的配制：称取2.4g蔗糖，0.058g NaCl，5mL 1M Tris-HCl(pH8.0)，0.146gEDTA-2Na，0.02g DTT，用去离子水定容至10ml。
(4)加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液(pH8.0)，4℃混匀放置30min，期间每5min摇晃混匀一次。
(5)4℃，6688r/min(5000×g)离心10分钟，收集酚上层。
(6)加入5倍体积的-20℃预冷的0.1mol/L醋酸铵-甲醇溶液(3.9g醋酸铵+500ml甲醇)，-20℃沉淀过夜。
(7)4℃，10360r/min(12000×g)离心10分钟，收集沉淀。
(8)加入预冷甲醇，轻微混合后4℃，10360r/min(12000×g)离心10分钟。弃上清液后加入预冷丙酮，轻微混合后4℃，10360r/min(12000×g)离心10分钟，收集沉淀。
(9)沉淀真空干燥。
(10)裂解：将干燥后的粉末溶解液于2mL样品裂解液(8mol/L尿素、2％Tritionx-100、60mmol/L DTT)在23℃环境下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次，使沉淀裂解充分。
(11)离心取上清：裂解结束后，在4℃、10360r/min(12000×g)离心10min，吸取上清液，并再次同等条件下离心取上清，充分去除不溶性杂质。
(12)蛋白定量：参考Bradford的方法进行蛋白定量，以牛血清蛋白为标准蛋白绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂(质量浓度为0.01％的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75％的乙醇和质量浓度为8.5％的磷酸)反应5min，在595nm波长下测定吸光值，根据标准曲线测定上清液中蛋白质的浓度。制作标准曲线的数据如表1所示，标准曲线图如图1所示。
表1标准曲线的制作
编号 1 2 3 4 5 6 7 8
蛋白试剂 3000μl 3000μl 3000μl 3000μl 3000μl 3000μl 3000μl 3000μl
ddH<sub>2</sub>O 300μl 295μl 290μl 285μl 280μl 270μl 260μl 250μl
BSA 0μl 5μl 10μl 15μl 20μl 30μl 40μl 50μl
OD595 0 0.062 0.178 0.228 0.330 0.478 0.626 0.727
样品蛋白含量X(μg)＝(Y-0.0108)/0.015
样品蛋白浓度(μg/μl)＝X/样品体积(μl)
(13)分装冷冻：按根系蛋白总上样量200μg，上样总体350μl，计算蛋白体积，并分装后-80℃保存。
样品蛋白体积(μl)＝200μg/样品蛋白浓度
(14)样品水化：从-80℃取出蛋白样品，自然溶解后按蛋白体积计算出水化液体积(350μl-蛋白体积)，加入适量体积的蛋白样品水化液(7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L DTT，0.2％IPGbuffer，0.001％溴酚蓝)，在4℃、10360r/min(12000×g)离心15min。
实施例2
4种根系蛋白提取方法比较
1.三氯醋酸/丙酮法制备蚕豆根系蛋白质组学分析的样品
称取0.5g根样于液氮预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，将粉末移至10mL离心管中，加入5ml提取液1，涡旋震荡1min，-20℃静置2h或过夜。然后在4℃下35000r/min离心15min，弃上清。所得沉淀再用预冷的丙酮清洗3～5次，-20℃下冷冻干燥备用。提取液1(100ml)配方：苯甲基磺酰氟(PMSF)：0.0174g；β-巯基乙醇:70μl；用10％TCA/丙酮定容至100mL。
2.Tris-Hcl法制备蚕豆根系蛋白质组学分析的样品
取2g根样研磨，称取1g样品，加入10ml预冷的0.2mol/L Tris-HCl，PH8.0，4℃，浸提6h，4℃，4000r/min离心15min，取上清液测定总蛋白含量。
3.本发明方法制备蚕豆根系蛋白质组学分析的样品参考实施例1。
4.TCA/丙酮法制备蚕豆根系蛋白质组学分析的样品
称取0.5g根样于液氮预冷的研钵中，加液氮研磨至粉末状，将粉末移至10mL离心管中，加入10倍体积的提取液(10％TCA/丙酮，1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.07％2-巯基乙醇)，涡旋震荡1min，-20℃静置2h或过夜。然后在4℃下35 000r/min离心15min，弃上清。所得沉淀再用预冷的丙酮清洗3～5次，-20℃下冷冻干燥备用。
本发明制备方法、TCA/丙酮法、三氯醋酸/丙酮法和Tris/HCl法制备蚕豆根系蛋白质组学分析的样品比较结果见表2和图3。
表2 4种根系蛋白提取方法浓度
方法 蛋白质浓度μg/μl
TCA/丙酮法 1.82
三氯醋酸/丙酮法 1.94
本发明方法 2.24
Tris/HCl法 0.37
从表2和4种根系蛋白提取方法单向SDS-PAGE电泳图谱(图3)可以看出，本发明方法提取的蛋白样品出现较多清晰的条带，单向SDS-PAGE检测结果为阳性，说明蛋白样品适宜进行双向凝胶电泳。
本发明采用方法制备得到的蛋白样品进行双向电泳，结果如图3所示。本发明采用方法提取的蛋白样品符合双向电泳蛋白浓度6-9μg/μl的浓度范围，获得的双向电泳图谱蛋白质点多且清晰。
本发明根据蚕豆根系特点，对普通酚抽提法进行了方法改进，使改进后的酚抽提法更适合于蚕豆根系的蛋白质提取。
在沉淀洗涤过程中增加了用5倍体积预冷甲醇清洗沉淀。清洗离心后再用预冷丙酮清洗沉淀。目的是醋酸铵在甲醇、丙酮等有机溶剂中有较好的溶解度，先用甲醇洗净残留在沉淀中的醋酸铵，然后再用丙酮将甲醇去除干净，避免重新引入离子。
将普通酚抽提法中在样品粉末中一次性加入蛋白提取液以及等体积的Tris-饱和酚，振荡混匀，调整为分步加入：样品粉末中加入蛋白提取液混合等待20min，期间不定时混匀，然后再加入等体积Tris-饱和酚混合30min以上，期间每5min钟摇晃混匀一次。原因：植物组织中的干扰物质主要有酚类化合物、蛋白水解酶、蛋白氧化酶、萜类、色素、有机酸、盐离子、多糖、脂类、多种次生代谢产物，这些干扰物质可导致2-DE图上横向和纵向的条纹，背景模糊降低蛋白点的分辨率。将样本研磨破碎成粉末后先加入蛋白提取液使两者充分混合反应20min，使蛋白提取液中的EDTA能充分、有效地抑制金属酶类和多酚氧化酶活性；NaCl能充分发挥其盐效应更有利于蛋白质的抽提。20min混合反应后，再加入Tris-饱和酚，使其在4℃环境下最少混合30min，并确保每5min摇晃混匀一次，目的是蛋白提取液中的蔗糖主要起到反相的作用，与Tris-饱和酚充分反应，有效去除样品中的可溶性杂质。同时在4℃环境下操作是因为在低温下蛋白酶活性低，防止蛋白质变性，提高样品的蛋白浓度。
本发明以蚕豆根系为实验材料，以获得符合蛋白质组学分析的样品制备方法为目的，填补了蚕豆根系双向电泳技术的空白，为深入开展蚕豆蛋白质组学提供技术支持。本发明中实验步骤简单，易于操作，重复性好，有实验背景的技术人员易学、易掌握。本发明中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。

Claims (8)

1.蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取新鲜蚕豆根系；
(2)将所取样品置于预冷至-20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；
(3)研磨好的粉末中加入10倍体积酚抽提液，不定时涡旋混匀等待20min后，加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液pH8.0，4℃放置30min，期间每5min摇晃混匀一次；离心后收集上层酚液；
(4)向步骤(3)所述的上层酚液中加入预冷的0.1mol/L醋酸铵-甲醇溶液，-20℃沉淀过夜后，离心收集沉淀；
(5)步骤(4)所述的沉淀中加入5倍体积的预冷甲醇，轻微混合后，4℃离心，弃上清液，沉淀中加入预冷丙酮，轻微混合，4℃离心，收集沉淀；
(6)步骤(5)所得的沉淀真空干燥至水分≤8％，得粉末；
(7)步骤(6)所得粉末溶解液于样品裂解液，23℃下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次；
(8)裂解结束后，离心取上清液，上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；
(9)绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光值，根据标准曲线测定待分析溶液中蛋白质的浓度；
样品蛋白浓度μg/μl＝X/样品体积μl；
样品蛋白含量Xμg＝(Y-0.0108)/0.015；
式中，X为样品蛋白含量，Y为样品的吸光值；
(10)按根系蛋白总上样量200μg，上样总体积 350μl，计算蛋白体积，并分装后-80℃保存；
样品蛋白体积μl＝200μg/样品蛋白浓度
(11)从-80℃取出蛋白样品，自然溶解后按上样总体积 350μl和蛋白体积，计算出水化液体积，加入蛋白样品水化液，离心，即得蚕豆根系蛋白质组学分析样品；
水化液体积＝350μl-蛋白体积；
步骤(3)中所述的酚抽提液为0.7mol/L蔗糖、0.1mol/LNaCl、0.5mol/L Tris-HClPH7.5、50mmol/L EDTA-2Na和0.2％DTT的混合溶液；所述的离心条件为5000×g，10min；
步骤(4)中加入的醋酸铵-甲醇溶液的量为上层酚液体积的5倍；预冷至-20℃。
2.根据权利要求1所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的离心条件为12000×g，10min。
3.根据权利要求1所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的离心条件都为12000×g，10min。
4.根据权利要求1所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述的样品裂解液为8mol/L尿素、2％聚乙二醇辛基苯基醚、60mmol/L二硫苏糖醇的混合溶液。
5.根据权利要求4所述 的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(9)中蛋白浓度标准曲线以牛血清蛋白为标准蛋白，以Bradford方法绘制。
6.根据权利要求5所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(9)中所述考马斯亮蓝蛋白试剂包括：质量浓度为0.01％的考马斯亮蓝G-250，质量浓度为4.75％的乙醇和质量浓度为8.5％的磷酸；反应时间为5min，检测波长为595nm。
7.根据权利要求6所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(11)中所述蛋白样品水化液包括：7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L二硫苏糖醇，0.2％载体两性电解质和0.001％溴酚蓝。
8.根据权利要求7所述的蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，步骤(8)和步骤(11)中的离心条件均为4℃、20000×g下离心20min。
CN201710159164.2A 2017-03-17 2017-03-17 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法 Active CN106908402B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710159164.2A CN106908402B (zh) 2017-03-17 2017-03-17 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710159164.2A CN106908402B (zh) 2017-03-17 2017-03-17 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106908402A CN106908402A (zh) 2017-06-30
CN106908402B true CN106908402B (zh) 2020-03-24

Family

ID=59187451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710159164.2A Active CN106908402B (zh) 2017-03-17 2017-03-17 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106908402B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107722105B (zh) * 2017-11-09 2020-06-09 江南大学 一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法
CN114539348B (zh) * 2022-01-25 2024-04-05 四川省农业科学院水稻高粱研究所 一种用于酒醅微生物宏蛋白组学检测的蛋白提取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103900881A (zh) * 2014-04-01 2014-07-02 淮阴师范学院 适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法
CN105241720A (zh) * 2015-10-20 2016-01-13 中国科学院南海海洋研究所 一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法
CN105486561A (zh) * 2016-01-14 2016-04-13 青海省农林科学院 蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2829500B1 (fr) * 2001-09-13 2003-12-12 Hemosystem Procede de concentration et de detection de germes pathogenes a partir de produits sanguins et/ou de leurs derives et dispositif pour le mettre en oeuvre
US20070077573A1 (en) * 2005-10-03 2007-04-05 Shinshu University Method for extracting DNA from sample of organism

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103900881A (zh) * 2014-04-01 2014-07-02 淮阴师范学院 适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法
CN105241720A (zh) * 2015-10-20 2016-01-13 中国科学院南海海洋研究所 一种适合双向电泳的红树植物秋茄叶片总蛋白提取方法
CN105486561A (zh) * 2016-01-14 2016-04-13 青海省农林科学院 蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"山定子根系蛋白质提取及双向电泳技术体系的建立";李丽杰等;《沈阳农业大学学报》;20151231;第5卷(第46期);第532-537页 *
"棉花根系总蛋白质提取及双向电泳方法的改良";王曼等;《华北农学报》;20151231;第30卷(第6期);第128-133页 *
"甘蓝型油菜根系可溶性蛋白的提取";王振华等;《华中农业大学学报》;20110430;第30卷(第2期);第219-224页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106908402A (zh) 2017-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
McKiernan et al. A comparison of automated and traditional methods for the extraction of arsenicals from fish
Casiot et al. Sample preparation and HPLC separation approaches to speciation analysis of selenium in yeast by ICP-MS
Komorowicz et al. Arsenic speciation in mushrooms using dimensional chromatography coupled to ICP-MS detector
Dernovics et al. Improving selenium extraction by sequential enzymatic processes for Se-speciation of selenium-enriched Agaricus bisporus
Mir et al. Extraction and speciation of arsenic in plants grown on arsenic contaminated soils
CN106908402B (zh) 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法
Wojcieszek et al. Elucidation of the fate of zinc in model plants using single particle ICP-MS and ESI tandem MS
CN105486561A (zh) 蚕豆叶片蛋白质组学分析的样品制备方法
Moreda-Piñeiro et al. Multi-element determinations in foods from Amazon region by ICP-MS after enzymatic hydrolysis assisted by pressurisation and microwave energy
CN106324115B (zh) 一种基于二级质谱的全离子监测定量方法
CN109541105B (zh) 一种鉴别半夏中是否掺杂虎掌南星的方法
Watkins et al. Cadmium-binding serum protein
Bhadauria et al. Optimization of a protein extraction technique for fungal proteomics
Pusztai Studies on the extraction of nitrogenous and phosphorus-containing materials from the seeds of kidney beans (Phaseolus vulgaris)
CN108828126B (zh) 基于二维液相色谱串联质谱定性鉴定草莓柱头蛋白的方法
CN110333307A (zh) Hplc-icp-ms联用测定土壤中砷形态的方法
CN112213164A (zh) 一种总蛋白提取试剂盒及提取方法
CN112321671A (zh) 一种酚抽法提取橡胶树和海马齿植物蛋白质方法
Barrett et al. Disease-Resistance Factors in Wheat, Electrophoretic and Chromatographic Analysis of Protein Extracts of Wheat Seedlings
CN110261204B (zh) 一种鱼类和贝类海产品中不同形态砷化合物的提取方法
CN112595785A (zh) 水稻籽粒中一种高毒性的砷形态二甲基单巯基砷的分析方法
CN113325105A (zh) 一种富硒鱼中硒代蛋氨酸的检测方法
CN100580414C (zh) 一种蛋白质凝胶内酶解的方法
JP2005241424A (ja) プロテオーム解析用試料の調製方法
CN110551207A (zh) 一种脂蛋白纯化方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20201211

Address after: No.253, ningzhang Road, Chengbei District, Xining City, Qinghai Province

Patentee after: QINGHAI ACADEMY OF AGRICULTURAL AND FORESTRY

Address before: 810016 No. 251 Ning Road, Qinghai, Xining

Patentee before: Qinghai University

TR01 Transfer of patent right