CN107722105B - 一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法 - Google Patents

一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107722105B
CN107722105B CN201711098470.6A CN201711098470A CN107722105B CN 107722105 B CN107722105 B CN 107722105B CN 201711098470 A CN201711098470 A CN 201711098470A CN 107722105 B CN107722105 B CN 107722105B
Authority
CN
China
Prior art keywords
yellow wine
sample
protein
dimensional electrophoresis
precipitate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711098470.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107722105A (zh
Inventor
孙军勇
陆健
齐小慧
谢广发
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201711098470.6A priority Critical patent/CN107722105B/zh
Publication of CN107722105A publication Critical patent/CN107722105A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107722105B publication Critical patent/CN107722105B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means
    • C07K1/26—Electrophoresis
    • C07K1/28—Isoelectric focusing
    • C07K1/285—Isoelectric focusing multi dimensional electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

本发明公开了一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法，属于黄酒检测技术领域。本发明提供的方法将黄酒样品的pH被调节至8.5，打开了多糖与蛋白之间结合的键，同时，将酒液中的多糖优先沉淀析出，通过离心作为杂质去除，避免了对双向电泳的干扰。接着采用0.1M的乙酸铵‑甲醇溶液沉淀酒液中的蛋白质，将其他干扰双向电泳的杂质留在了上清液中，是本发明制备黄酒酒体蛋白质二维电泳的样品制备方法的关键。

Description

一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法
技术领域
本发明涉及一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法，属于黄酒检测技术领域。
背景技术
黄酒发展至今，消费者对其品质的要求越来越高，澄清的黄酒更容易被接受。然而蛋白混浊仍然是黄酒行业亟待解决的质量问题之一。黄酒中蛋白质、多糖、多酚、金属离子等物质的存在使混浊机理相对复杂，但根据目前的研究结果，认为蛋白质是引起黄酒非生物混浊的主要原因。在黄酒的沉淀物中，蛋白质占有较大的比例，一般在50％左右。
黄酒样品中含有大量非淀粉多糖和淀粉多糖，以及金属离子。市售瓶装黄酒一般至少陈酿3年以上才会销售，因此很多黄酒蛋白在长期的陈酿过程中与多糖形成糖蛋白，影响了双向电泳时蛋白的分离效果。
而黄酒酒体蛋白质，尤其是黄酒沉淀样品的二维电泳样品的制备是研究其化学组成、分子结构特征及在储藏和运输过程中发生沉淀机理的先决条件。因此，瓶装黄酒蛋白质二维电泳的样品制备方法对研究和最终解决黄酒蛋白质混浊问题就显得非常重要。发明人采用饱和硫酸铵沉淀酒体蛋白时，发现只有少量蛋白质沉淀出来；采用TCA-丙酮沉淀时，发现在沉淀酒体蛋白质的同时，多糖等其他的杂质也同时沉淀出来，影响了双向电泳图谱中蛋白质的分离。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前现有技术中存在的上述不足，提供了一种黄酒酒体蛋白质二维电泳的样品制备方法。
所述方法包括如下步骤：
(1)取一定体积黄酒样品，加入1.0-2.0g/L的氯化钙，调pH至8.5，4℃冰箱过夜。
(2)0-4℃下，8000-10000g离心20-30min，将所得上清液用PEG 20000包埋截留分子量为3500Da的透析膜浓缩10倍。
(3)将浓缩后的酒液过脱盐柱，例如Sephacryl G25柱脱盐。向脱盐后的酒样中加入5倍体积0.1M的乙酸铵-甲醇溶液，置于﹣20℃冰箱中沉淀两小时以上。4℃下，12000g离心30min，收集沉淀。用-18—-20℃预冷的甲醇洗涤沉淀二次。
(4)将所得沉淀置于室温下10-15min，使甲醇全部挥发。将沉淀用水化液溶解，控制蛋白浓度在1mg/mL左右，进行双向电泳。
步骤(1)中黄酒样品的pH被调节至8.5，pH调节剂为氢氧化钠或氢氧化钾。pH被调节至8.5既可以打开多糖与蛋白之间结合的键，同时，酒液中的多糖沉淀析出，通过离心去除，避免了对双向电泳的干扰。
步骤(2)中，所述透析膜的截留分子量为3500Da。黄酒酒液中的蛋白分子量普遍偏小，采用截留分子量为3500Da的透析膜，最大程度地避免了黄酒酒体蛋白质在样品制备过程中的损失。
步骤(3)中，向脱盐后的酒液中加入的沉淀酒体蛋白的试剂为0.1M的乙酸铵-甲醇溶液，体积为酒液体积的5倍。0.1M的乙酸铵-甲醇溶液优先沉淀酒液中的蛋白质，将其他干扰双向电泳的杂质留在了上清液中，是本发明制备黄酒酒体蛋白质二维电泳的样品制备方法的关键。
本发明的有益效果：
本发明将黄酒样品的pH被调节至8.5，这样既可以打开多糖与蛋白之间结合的键，同时，酒液中的多糖沉淀析出，通过离心去除，避免了对双向电泳的干扰。接着采用0.1M的乙酸铵-甲醇溶液沉淀酒液中的蛋白质，将其他干扰双向电泳的杂质留在了上清液中，是本发明制备黄酒酒体蛋白质二维电泳的样品制备方法的关键。
附图说明
图1黄酒酒样采用本发明的方法处理后的2D电泳图谱，上样量125μL，总蛋白质含量为100μg。
图2黄酒酒样用4倍体积20％TCA-丙酮处理后的黄酒酒体蛋白质的2D电泳图谱，上样量125μL，总蛋白质含量为100μg。
具体实施方式
双向电泳条件：
(1)胶条的再水化
取125μL水化液加入到泡涨盘中，半小时后加入2～3mL矿物油防止水分蒸发尿素析出，在室温条件下水化12h左右。
(2)第一向等电聚焦(IEF)
水化结束后，将胶条取出用超纯水洗去矿物油，转移到等电聚焦仪的聚焦盘中，胶面朝上，加入4mL左右矿物油覆盖，按照表1设置等电聚焦程序。
表1等电聚焦程序
Figure BDA0001462825930000031
(3)胶条平衡
等电聚焦结束后，用超纯水洗去胶条表面的矿物油，加入平衡液I平衡15min，结束后同样方法用平衡液II平衡15min。
(4)第二向SDS-PAGE
将胶条放入已经制备好的12.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶中，用融化的琼脂糖封胶液进行密封，凝固后放入垂直电泳系统，电压先设为60V，待蛋白完全进入变性聚丙烯酰胺凝胶中后，电流改为120V，直到结束。
(5)染色和脱色
电泳结束后，将胶从玻璃板上剥离下来，然后用固定液固定30分钟，用胶体考马斯亮蓝染色30分钟，然后脱色，中间需经常更换脱色液，直至背景清晰。
实施例1乙酸铵-甲醇溶液对样品品质的影响
(1)取一定体积黄酒样品，加入2.0g/L的氯化钙，2.0M氢氧化钠调pH至8.5，4℃冰箱过夜。
(2)4℃下，10000g离心30min，将所得上清液用PEG20000包埋截留分子量为3500Da的透析膜浓缩10倍。
(3)将浓缩后的酒液过Sephacryl G25柱脱盐。向脱盐后的酒样中加入5倍体积0.1M的乙酸铵-甲醇溶液(甲醇为溶剂，乙酸铵为溶质)，置于﹣20℃冰箱中沉淀两小时以上。4℃下，12000g离心30min，收集沉淀。用-20℃预冷的甲醇洗涤沉淀二次。
(4)将所得沉淀置于室温下10-15min，使甲醇全部挥发。将沉淀用水化液溶解，控制蛋白浓度在1mg/mL左右，进行双向电泳。
采用本发明方法的黄酒酒体蛋白2D电泳图谱见图1。
从图1中可以看出，黄酒酒体中的蛋白得到了很好的分离，在图1的底部有很多明显的蛋白点，可以很好的帮助科研人员对图谱中的蛋白点进行分析，指导生产。
实施例2
TCA-丙酮法：
(1)取一定体积黄酒样品，加入4倍体积的20％的TCA丙酮溶液，于-20℃冰箱中过夜。
(2)4℃下，10000g离心30min，得到黄酒酒体蛋白的沉淀。
(3)将沉淀用-20℃预冷的丙醇洗涤沉淀二次。
(4)将所得沉淀置于室温下10-15min，使甲醇全部挥发。将沉淀用水化液溶解，控制蛋白浓度在1mg/mL左右，进行双向电泳。
采用TCA-丙酮法的黄酒酒体蛋白2D电泳图谱见图2。
从图2可以看出，在与实施例1采用相同的电泳条件的情况下，本实施例制备的黄酒酒体中的蛋白在电泳结束后堆积在一起，没有明显的蛋白点，无法对黄酒酒体中存在的蛋白进行鉴定。
实施例3饱和硫酸铵沉淀对样品品质的影响
采用传统的饱和硫酸铵法沉淀黄酒酒体中的蛋白时，发现仅有少量的蛋白析出，造成这一现象的原因未知，也就是说通过饱和硫酸铵沉淀无法制备黄酒酒体蛋白样品，也就无法进行双向电泳和酒体蛋白组成的分析。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种黄酒酒体蛋白质二维电泳样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取一定体积黄酒样品，加入1.0-2.0g/L的氯化钙，并调pH至8.5，冷藏过夜；
(2)低温离心后，将所得上清液用透析膜浓缩；
(3)将浓缩后的样品过脱盐柱，向脱盐后的样品中加入5倍体积0.1M的乙酸铵-甲醇溶液，置于-18℃至-20℃冰箱中沉淀两小时以上，离心收集沉淀，用-18℃至-20℃预冷的甲醇洗涤沉淀二次；
(4)将所得沉淀置于室温下挥发去除甲醇，将沉淀用水化液溶解后即可用于双向电泳。
2.根据权利要求1所述的一种黄酒酒体蛋白质二维电泳样品的制备方法，其特征在于，步骤(2)低温离心后，将所得上清液用PEG 20000包埋截留分子量为3500Da的透析膜浓缩。
3.根据权利要求1所述的一种黄酒酒体蛋白质二维电泳样品的制备方法，其特征在于，步骤(2)，0-4℃下，8000-10000g离心20-30min，将所得上清液用PEG 20000包埋截留分子量为3500Da的透析膜浓缩10倍。
CN201711098470.6A 2017-11-09 2017-11-09 一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法 Active CN107722105B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711098470.6A CN107722105B (zh) 2017-11-09 2017-11-09 一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711098470.6A CN107722105B (zh) 2017-11-09 2017-11-09 一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107722105A CN107722105A (zh) 2018-02-23
CN107722105B true CN107722105B (zh) 2020-06-09

Family

ID=61214864

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711098470.6A Active CN107722105B (zh) 2017-11-09 2017-11-09 一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107722105B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106908402A (zh) * 2017-03-17 2017-06-30 青海大学 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法
CN107219288A (zh) * 2016-11-22 2017-09-29 湖南省农业生物资源利用研究所 一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107219288A (zh) * 2016-11-22 2017-09-29 湖南省农业生物资源利用研究所 一种采用蛋白质比对鉴定栝楼籽的方法
CN106908402A (zh) * 2017-03-17 2017-06-30 青海大学 蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
植物多糖提取液脱蛋白方法的研究;王 珊;《食品科技》;20121231;第37卷(第9期);第1.1.7节 *
绍兴黄酒混浊蛋白的分离鉴定及其氨基酸组成、二级结构分析;孙军勇;《食品与发酵工业》;20161231;第42卷(第2期);第2.3节 *
适用于双向电泳的芒果叶片蛋白提取方法的建立;陈香玲;《西南农业学报》;20151231;第28 卷(第6 期);第2696-2700页 *
黄酒中蛋白质沉淀的研究进展;詹汉林;《食品研究与开发》;20140630;第35 卷(第12 期);第130-135页 *
黄酒麦曲浸提液中宏蛋白质组的制备;孔令琼1;《食品与发酵工业》;20121231;第38 卷(第3 期);第7-11页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107722105A (zh) 2018-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cohn et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins. I. Size and charge of proteins separating upon equilibration across membranes with ammonium sulfate solutions of controlled pH, ionic strength and temperature
Huneeus et al. Fibrillar proteins from squid axons: I. Neurofilament protein
Neucere Isolation of α-arachin, the major peanut globulin
CN105153297B (zh) 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法
Grant et al. Effects of sodium dodecyl sulfate and other dissociating reagents on the globulins of peas
Fried et al. [22] Water-soluble nonionic polymers in protein purification
DE19538625C2 (de) Verfahren zur Abtrennung von Albumin aus Serum durch Membranionenaustauschchromatographie
CN107722105B (zh) 一种黄酒酒体蛋白质的二维电泳样品的制备方法
DE2640387B2 (de) Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
Pepper Casein interactions as studied by gel chromatography and ultracentrifugation
US10377812B2 (en) Method for efficient purification of human serum albumin
CN110330565B (zh) 从血浆分离组分ⅰ和ⅲ中提取静注人免疫球蛋白的方法
CN102796193A (zh) 一种从鸡蛋清中提取卵转铁蛋白的方法
CN112063674B (zh) 一种基于电荷性及疏水性的锌离子配合肽的制备方法及其应用
CN106749626B (zh) 一种从牛血清中提取白蛋白和球蛋白的方法及利用牛血的方法
CN109385414B (zh) 菠萝蛋白酶的纯化方法
CN112707958B (zh) 一种提取l型和e型植物凝集素的方法
CN112979785B (zh) 一种制备高纯度乳铁蛋白的方法
US4297274A (en) Protein from red blood cells and process for isolating it
FR2351604B2 (zh)
CN106905412B (zh) 一种去除富硒茶蛋白中茶多糖、糖蛋白的方法
CN113801222A (zh) 一种实时监控的人免疫球蛋白的生产方法
CN113773381A (zh) 一种改进的人免疫球蛋白的生产方法
Hrazdina et al. Influence of molecular size of gelatin on reaction with tannic acid
Schmidt et al. Fractionation of yeast ribosomal proteins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant