CN101885755B

CN101885755B - 一种巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法

Info

Publication number: CN101885755B
Application number: CN 201010197868
Authority: CN
Inventors: 王旭初; 王海燕; 郭安平; 田维敏
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2010-06-09
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-06-09
Also published as: CN101885755A

Abstract

本发明公开一种巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法，含以下步骤：(1)以巴西橡胶胶乳、胶乳组份橡胶粒子、胶乳组份C-乳清或胶乳组份黄色体为原料，加入BPP蛋白提取液进行均质化，然后室温下漩涡振荡，再经超声和离心处理，收集下层纯化后原料；(2)在下层纯化后原料中加入Tris-饱和酚经漩涡振荡后离心处理，然后转移出上层相；(3)在所得上层相中加入BPP蛋白提取液，经漩涡振荡后离心处理，再次转移出上层相；(4)在所得上层相中加入硫酸铵沉淀蛋白，放置后离心取下层蛋白沉淀；(5)将所得下层蛋白沉淀洗涤后离心，在空气中风干，风干后的蛋白沉淀用裂解液重悬后即可。该方法蛋白提取效率高，可从橡胶胶乳不同组份中提取出蛋白。

Description

一种巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法

技术领域

本发明属于蛋白质组学领域，具体涉及一种巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法。

背景技术

胶乳是橡胶树次生韧皮部乳管细胞中特殊的细胞质，是一种含有液体乳清的奶状物，其中包含许多与橡胶生物合成相关的酶类。在新鲜的胶乳中天然橡胶占总重的20-60％。胶乳离心后分成了三层，上层是橡胶粒子，中间层是C-乳清，下层的颗粒状物是黄色体。

在天然橡胶胶乳中，C-乳清是胶乳细胞内含物中的水溶性成分，是胶乳细胞质中代谢活性成分存在的场所，其中蛋白含量占胶乳总蛋白的60％左右。黄色体是由单层膜包被的特化的液泡，里面含有大量的酸性水解酶类，在胶乳凝乳和植物抗逆反应中发挥着重要作用。橡胶粒子是被半单位膜包裹的均质圆形的橡胶核，可以分为两类，一类是小橡胶粒子(SRP)，另一类是大橡胶粒子(LRP)。LRP在胶乳中占大部分，SRP主要存在于Moir’s区。现在证明大多与橡胶生物合成相关的蛋白位于SRP上。当添加异戊烯焦磷酸时在二磷酸末端会形成顺式的聚异戊二烯链。但是在巴西橡胶中有关天然橡胶的生物合成仍然是一个长期的谜题。

随着蛋白组学技术的发展，越来越多的学者开始把注意力转向利用新技术来描述蛋白的一些新特征，概述橡胶胶乳中的橡胶生物合成的过程。二十世纪90年代中期利用蛋白组学技术鉴定出胶乳蛋白Hevb 9和Hevb 10是过敏原。在早期的研究中已有利用1-DE和2-DE对橡胶胶乳蛋白的不同组份进行研究的。首先，Martin(1991)发现巴西橡胶胶乳的颗粒组份和细胞质中含有大量的相关蛋白，在双向电泳图谱上只有一些高丰度的蛋白点是可见的，颗粒组份蛋白的25％是几丁质酶/溶菌酶(Martin 1991)。为了研究橡胶树死皮病(TPD)的分子机理，Dian等分析胶乳的差异蛋白鉴定出五个与TPD疾病相关的蛋白(Dian et al.1995)。其中一个26kDa蛋白的累积与该病的发生有很大关系，而乙烯可以抑制该蛋白的表达。最近，有一些关于巴西橡胶树的橡胶粒子、C-乳清、黄色体和种子的蛋白组学研究报道，其它产胶植物像牛角瓜、白屈菜和莴苣的蛋白组学研究也有报道。

然而，值得注意的是上述研究结果水平、垂直条带在双向电泳图谱上的质量差，尤其是高丰度蛋白区域，例如橡胶延伸因子和小橡胶粒子蛋白区。可能是因为胶乳与氧接触产生了不明化学成分使其变得更加粘稠，从而使分离出高质量的蛋白以进行蛋白组学研究变得困难。据我们所知，直到现在还没有能有效从胶乳亚细胞组份中获得高质量蛋白的方法。有人认为胶乳中富含大量的化合物，如盐，矿物质，脂类，碳水化合物，核酸，特别是其复杂的膜系统，它们能随蛋白一同被提取出来，而对双向电泳会产生很强的干扰。胶乳蛋白中橡胶延伸因子占10-60％，它严重影响双向电泳对胶乳蛋白的鉴定。因此将双向电泳技术应用于橡胶胶乳蛋白组的研究还是一项具有挑战性的工作，这主要是因为其蛋白组成和膜系统复杂性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法，该方法蛋白提取效率高，可从橡胶胶乳不同组份中提取出蛋白。

本发明提供的巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法，包括下述步骤：

(1)以巴西橡胶胶乳、胶乳组份橡胶粒子、胶乳组份C-乳清或胶乳组份黄色体为原料，其中对巴西橡胶胶乳、胶乳组份C-乳清，按体积比为1∶4.5～5.5，加入BPP蛋白提取液进行均质化；对胶乳组份橡胶粒子、胶乳组份黄色体，按重量体积比为1∶4.5～5.5，加入BPP蛋白提取液进行均质化；然后室温下漩涡振荡，再经超声和离心处理后，收集下层纯化后的原料；

(2)在步骤(1)中下层纯化后的原料中加入其1.5～3倍体积的pH为8.0的Tris-饱和酚经漩涡振荡后离心处理，然后转移出上层相；

(3)在步骤(2)所得上层相中加入与其等体积的BPP蛋白提取液，经漩涡振荡后离心处理，再次转移出上层相；

(4)在步骤(3)所得上层相中加入其4.0～6.0倍体积的硫酸铵沉淀蛋白，-22℃放置6h以上，离心取下层蛋白沉淀；

(5)将步骤(4)所得下层蛋白沉淀洗涤后离心，在空气中风干，风干后的蛋白沉淀用裂解缓冲液重悬后即可。

在上述步骤中：

步骤(1)中所述的胶乳组份橡胶粒子、胶乳组份C-乳清和胶乳组份黄色体的制备过程为：巴西橡胶胶乳经35000～45000g离心25～35min，样品分为三层，最上层为橡胶粒子，中间层为C-乳清，下层为黄色体，移去上层的橡胶粒子，余下的样品置于液氮中，冰柱出现后将C-乳清和黄色体分割开即可。

其中，在步骤(1)中：所述的胶乳组份橡胶粒子还需预处理，所述的预处理过程为：按橡胶粒子与洗涤溶剂的重量体积比为1∶8～12，将橡胶粒子悬浮在经-20℃预冷的洗涤溶剂中，漩涡振荡30min后，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集流动相即可。

其中，在步骤(1)中：所述的胶乳组份黄色体还需预处理，所述的预处理过程为：按黄色体与洗涤溶剂的重量体积比为1∶8～12，将粗提的黄色体加入经-20℃预冷的洗涤剂中，冰上放置10min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集下层沉淀即可。

在橡胶粒子和黄色体预处理的过程中，所述的洗涤溶剂的组成为20mMTris-HCl，300mM甘露醇和0.5mM DTT，所述洗涤溶剂的pH为7.2。

其中，在步骤(1)中：所述的胶乳组份C-乳清还需预处理，所述的预处理过程为：将粗提的C-乳清在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后即可。

步骤(1)和步骤(3)中所述的BPP蛋白提取液的组成为：100mM EDTA，100mMpH为8.0的Tris，50mM硼砂，50mM维生素C，重量百分含量为1％的PVPP，体积百分含量为1％的Triton X-100，体积百分含量为2％的β-巯基乙醇和重量百分含量为30％的蔗糖。

步骤(5)中裂解缓冲液的组成为7M尿素、2M硫脲、体积百分含量为2％的CHAPS、13mM DTT和体积百分含量为1％IPG buffer。

步骤(5)中下层蛋白沉淀的洗涤过程为：先采用在-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤1～2次，再采用-20℃预冷6h以上的丙酮洗涤2～3次。

步骤(1)-(5)中所述的离心的过程为：在3～5℃、25000～35000g离心10～20min。

上述纯化的过程是用于获得纯净的不同组份，粗提橡胶粒子和黄色体经洗涤过程能除去污染物，如脂类，盐离子，多糖，萜类，碳水化合物，核酸和其它有机溶剂；粗提C-乳清经离心可有效去除黄色体和其它有机化合物。

本发明的有益效果是：

(1)从橡胶乳管胶乳中可以提取出高产量的蛋白；

(2)从橡胶胶乳不同组份包括膜系统中提取蛋白进行蛋白组分析；

(3)从总胶乳和C-乳清中提取的蛋白，在考马斯亮蓝染色的2-DE胶上得到了上千个背景清晰无拖尾现象的蛋白点，从黄色体中得到了几百个蛋白点；

(4)它符合质谱分析的要求且能揭示出橡胶胶乳蛋白的新功能。

附图说明

图1是巴西橡胶胶乳的1-DE和2-DE蛋白图谱；

图2是巴西橡胶胶乳中的橡胶粒子(A)，C-乳清(B)，黄色体(C)和黄色体膜(D)的2-DE蛋白图谱；

图3和图4是橡胶胶乳中两个特殊蛋白点的质谱图；

图5和图6是橡胶粒子中两个特殊蛋白点的质谱图；

图7是本发明的流程图。

具体实施方式

第一部分巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法

实施例1

取收集的新鲜巴西橡胶胶乳1ml，加入BPP蛋白提取液5ml进行均质化，BPP蛋白提取液的组成为：100mM EDTA，100mM pH为8.0的Tris(三羟甲基氨基甲烷)，50mM硼砂，50mM维生素C，重量百分含量为1％的PVPP，体积百分含量为1％的Triton X-100，体积百分含量为2％的β-巯基乙醇和重量百分含量为30％的蔗糖，然后室温将混合物剧烈漩涡振荡30min，总胶乳混合物在UP200S超声处理器上70W/cm²低温超声5min，4℃、15000g离心15min，下层是我们要收集的纯化的总胶乳，收集下层纯化的总胶乳，加入其两倍体积Tris-饱和酚(pH8.0)，将各个混合物室温漩涡振荡15min，离心后(4℃，15min，15000g)，将上层相转移到新的离心管中，并加入与上层相等体积的BPP蛋白提取液，混合物漩涡振荡10min，在相同条件下离心，再将上层相转到新的离心管，分别加入上层相5倍体积的硫酸铵沉淀蛋白，-22℃放置6h或过夜，过夜后在4℃，15min，15000g条件下离心，倒去上清，沉淀用-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤一次，再在4℃，15min，15000g条件下离心，倒去上清，沉淀再用-20℃预冷6h以上的丙酮洗涤两次，每次洗涤后4℃，15000g离心15min，最后洗完倒去上清后在空气中风干，用裂解缓冲液重悬即得巴西橡胶蛋白，裂解缓冲液的组成为7M尿素、2M硫脲、体积百分含量为2％的CHAPS、13mM DTT(二硫苏糖醇)和体积百分含量为1％IPG buffer。

实施例2

巴西橡胶胶乳组份黄色体的制备过程为：鲜巴西橡胶胶乳经35000～45000g离心25～35min，样品分为三层，最上层为橡胶粒子，中间层为C-乳清，下层为黄色体，移去上层的橡胶粒子，余下的样品置于液氮中，冰柱出现后将C-乳清和黄色体分割开得粗提的黄色体，将所得粗提的黄色体预处理，预处理过程为：按黄色体与洗涤溶剂的重量体积比为1∶8～12，将粗提的黄色体加入经-20℃预冷的洗涤剂中，冰上放置10min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集下层沉淀即可，洗涤溶剂的组成为20mM Tris-HCl，300mM甘露醇mannitol和0.5mM DTT，且该洗涤溶剂的pH为7.2。

称取上述预处理后的黄色体1g，加入4.5ml的BPP蛋白提取液进行均质化，BPP蛋白提取液的组成为：100mM EDTA，100mM pH为8.0的Tris，50mM硼砂，50mM维生素C，重量百分含量为1％的PVPP，体积百分含量为1％的TritonX-100，体积百分含量为2％的β-巯基乙醇和重量百分含量为30％的蔗糖，然后在室温下将混合物剧烈漩涡振荡30min，混合物在UP200S超声处理器上70W/cm²低温超声5min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集下层纯化的黄色体，在纯化的黄色体中加入3倍体积Tris-饱和酚(pH 8.0)，将混合物室温漩涡振荡15min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，将上层相转移到新的离心管中，并加入等体积的BPP蛋白提取液，混合物漩涡振荡10min，在相同条件下离心，再将上层相转到新的离心管，分别加入4.5倍体积的硫酸铵沉淀蛋白，-22℃放置6h或过夜，放置后在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，倒去上清，蛋白沉淀用-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤一次，倒去上清，再用-20℃预冷6h以上的丙酮的洗涤两次，每次洗涤后在3～5℃、25000～35000g离心10～20min，并且倒去上清液，最后，将洗涤的蛋白在空气中风干，用裂解缓冲液重悬即得巴西橡胶蛋白，裂解缓冲液的组成为7M尿素、2M硫脲、体积百分含量为2％的CHAPS、13mM DTT和体积百分含量为1％IPG buffer。

实施例3

C-乳清的制备过程为：新鲜巴西橡胶胶乳经35000～45000g离心25～35min，样品分为三层，最上层为橡胶粒子，中间层为C-乳清，下层为黄色体，移去上层的橡胶粒子，余下的样品置于液氮中，冰柱出现后将C-乳清和黄色体分割开得粗提的C-乳清，将所得粗提的C-乳清经预处理，预处理过程为：将粗提的C-乳清在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后即可。

取上述预处理后的C-乳清1ml，加入BPP蛋白提取液5.5ml，BPP蛋白提取液的组成为：100mM EDTA，100mM pH为8.0的Tris，50mM硼砂，50mM维生素C，重量百分含量为1％的PVPP，体积百分含量为1％的Triton X-100，体积百分含量为2％的β-巯基乙醇和重量百分含量为30％的蔗糖，然后室温将混合物剧烈漩涡振荡30min，混合物在UP200S超声处理器上70W/cm²低温超声5min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集下层纯化的C-乳清。接下来，在提纯的C-乳清中加入1.5倍体积的Tris-饱和酚(pH 8.0)，将混合物室温漩涡振荡15min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，将上层相转移到新的离心管中，并加入与上层相等体积的BPP蛋白提取液，混合物漩涡振荡10min，在相同条件下离心，再将上层相转到新的离心管，分别加入5.5倍体积的硫酸铵沉淀蛋白，-22℃放置6h以上，按上述条件离心后，蛋白沉淀用-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤2次，用-20℃预冷6h以上的丙酮洗涤2次，每次洗涤后在3～5℃、25000～35000g离心10～20min，最后，将洗涤的蛋白在空气中风干，用裂解缓冲液重悬即得巴西橡胶蛋白，裂解缓冲液的组成为7M尿素、2M硫脲、体积百分含量为2％的CHAPS、13mM DTT和体积百分含量为1％IPG buffer。

实施例4

橡胶粒子的制备过程为：鲜巴西橡胶胶乳经35000～45000g离心25～35min，样品分为三层，最上层为橡胶粒子，中间层为C-乳清，下层为黄色体，上层即为粗提的橡胶粒子，该粗提的橡胶粒子还需经预处理，预处理过程为：按橡胶粒子和洗涤溶剂的重量体积比为1∶8～12，将橡胶粒子悬浮在经-20℃预冷的洗涤溶剂中，漩涡振荡30min后，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集流动相即可，其中，洗涤溶剂的组成为20mM Tris-HCl，300mM甘露醇mannitol和0.5mM DTT，且该洗涤溶剂的pH为7.2。

称取上述预处理过的橡胶粒子1g，加入BPP蛋白提取液5ml，BPP蛋白提取液的组成为：100mM EDTA，100mM pH为8.0的Tris，50mM硼砂，50mM维生素C，重量百分含量为1％的PVPP，体积百分含量为1％的Triton X-100，体积百分含量为2％的β-巯基乙醇和重量百分含量为30％的蔗糖，然后室温将混合物剧烈漩涡振荡30min，混合物在UP200S超声处理器上70W/cm²低温超声5min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集下层纯化的橡胶粒子，接下来，在提纯的橡胶粒子中加入两倍体积的Tris-饱和酚(pH 8.0)，将混合物室温漩涡振荡15min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，将上层相转移到新的离心管中，并加入等体积的BPP蛋白提取液，混合物漩涡振荡10min，在相同条件下离心。再将上层相转到新的离心管，分别加入5倍体积的硫酸铵沉淀蛋白，-22℃放置6h或过夜，按上述条件离心后，蛋白沉淀用-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤1次，用-20℃预冷6h以上的丙酮洗涤3次，每次洗涤后在3～5℃、25000～35000g离心10～20min，最后，将洗涤的蛋白在空气中风干，用裂解缓冲液重悬即得巴西橡胶蛋白，裂解缓冲液的组成为7M尿素、2M硫脲、体积百分含量为2％的CHAPS、13mM DTT和体积百分含量为1％IPG buffer。

第二部分本发明提取方法制备的巴西橡胶胶乳蛋白的性能测试

2.1提取的巴西橡胶胶乳蛋白含量的测定

用Bradford分光光度计(Shimadzu UV-160，Kyoto，Japan)测定蛋白浓度，用牛血清白蛋白作标准，利用上述方法从新鲜的总胶乳、黄色体和C-乳清中提取的蛋白含量分别为7035±314，5474±219，和7616±280μg/ml。从1ml新鲜胶乳中提取出7.0mg蛋白，占胶乳总蛋白的50％。提纯的C-乳清中可获得蛋白7.6mg/ml，如下表1所示。

表1橡胶胶乳中不同组份的蛋白产量和2-DE胶上的蛋白检测点

注：SE，标准误差；-，没有检测。

2.2提取的巴西橡胶蛋白的单向电泳和双向电泳图谱分析

单向电泳使用16厘米凝胶板，分离胶12.5％聚丙烯酰胺、浓缩胶4％聚丙烯酰胺。每个泳道加样30微克蛋白。

在双向电泳中，24cm的IPG胶条大约上样800μg蛋白。pH4-7线性梯度IPG胶条(GE Healthcare)，室温重泡涨24h。根据说明书(2-DE Manual，GE Healthcare)将胶条置于Ettan IPGphor等电聚焦系统中进行等电聚焦。

凝胶使用改进的考马斯亮蓝R250染色方法(Wang et al.2007b)进行染色，以每英寸600点扫描凝胶，用Image Master 2D Platinum Software(Version 5.0，GEHealthcare)分析。

如附图1所示，从巴西橡胶树胶乳中提取的胶乳蛋白的1-DE(A)和总胶乳的2-DE(B)结果显示，1-DE中的蛋白图谱依次是黄色体(泳道1)，C-乳清(泳道2)，橡胶粒子(泳道3)和总胶乳(泳道4)。M代表分子量标记蛋白。总胶乳蛋白中的许多蛋白点被显示在右边2-DE图谱的B中。有1350个蛋白点被检测出来，蛋白点的数量见表2。

图2中橡胶粒子(A)、C-乳清(B)、黄色体(C)和黄色体膜(D)的2-DE图谱上依次检测到583，1248，385和724个蛋白点。箭头指示的蛋白点用MS鉴定。蛋白点的数量见表2。

在1-DE胶的高低分子量区都观察到了特殊蛋白条带(图1，A，泳道1-4)，黄色体样品只观察到四条主带(图1，A，泳道1)，这与之前报道过的黄色体蛋白1-DE胶上只有几条主带结果相一致(Wei et al.2008；Wu et al.2008)，B-乳清中的蛋白只还不到20个，其中，蛋白hevein占B-乳清总可溶性蛋白的50-70％(Yeanget al.2002)，然而在总胶乳(图1，A，泳道4)、橡胶粒子(图1，A，泳道3)和C-乳清(图1A，泳道2)的1-DE图谱上有30多条蛋白条带。总胶乳(图1，A，泳道4)和C-乳清(图1，泳道2)的1-DE图谱非常相似，仅在低分子量区有几条差异带，说明胶乳中蛋白的种类与C-乳清中的相似。

得到蛋白点最多的是总胶乳(表1)，在其双向电泳胶上可见1358±65高度重复蛋白点(图1，B)。C-乳清蛋白的2-DE胶与总胶乳的相似，这和前面的1-DE结果一致(图1，A)，在它的2-DE胶上能看见1200多个背景清晰无拖尾的蛋白点。橡胶粒子中检测出583±25蛋白点(表1；图2，A)，黄色体得到的蛋白点最少385±15(表1；图2，C)，可能是由于它在1-DE胶上存在几种高丰度蛋白(图1，A，泳道1)，严重限制了目标蛋白和其他聚集的蛋白点转移到IPG胶条上，从而影响后续的等电聚焦，因此造成蛋白点位置的不精确和许多重要蛋白的鉴定。

2.3提取的橡胶蛋白在双向电泳胶上高丰区蛋白点的质谱分析

蛋白鉴定使用液相色谱-串联质谱方法(Wang et al.2009)。首先，将凝胶上的蛋白用牛胰蛋白酶酶解(Wang et al.2007c)。酶解后，收集多肽并在真空中干燥以用于质谱分析。用flexAnalysis软件(Version 3.2，Bruker-Daltonics，USA)分析图谱。将符合标准的胰蛋白酶肽转移到BioTool质谱程序(Bruker-Daltonics)，使用MASCOT软件在nonredundant NCBI数据库中进行分类检索。70分的高Mascot分数(阈值)、高肽覆盖率和其他的相关实验结果都证明2-DE胶上蛋白点的鉴定结果好。

鉴定结果如附图3-6所示，4个蛋白点(点1和3来自于总橡胶胶乳，点6和7来自于橡胶粒子)与表2中的是相对应的。PMF图谱显示(A，D，G，J)与肽序列中(B，E，H，K)划线部分相匹配，Mascot分数(C，F，I，L)是根据点1(A-C)，点3(D-F)，点6(G-I)和点7(J-L)分别覆盖的范围。点6和点7在PMF图谱中相似并且相匹配的序列被检测出来，它们在橡胶粒子中是2种REF的蛋白亚型。

为进一步确定此法适合质谱分析，切取胶乳不同组份在双向电泳胶上高丰区的蛋白点，点的标记如图(图1，B；图2，A-D)，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析鉴定出25个蛋白(详见附表2)。其中，挑出5个蛋白谱结果进行详细阐述(图3-6，A-L)，这些蛋白点分别是总胶乳(点1和3)、橡胶粒子(点6和7)，点1，点3，点6和点7的肽指纹谱图谱(图3-6，A，D，G，J)、肽序列(图3-6，B，E，H，K)及Mascot检索结果(图3-6，C，F，I，L)的注释也被分别表示出来了。Mascot检索结果说明它们分别是SRPP(点1)、β-1，3-葡聚糖酶(点3)、液泡H+-ATPase质子泵催化A蛋白亚单位(点24)、两个橡胶延伸因子亚型(点6和7)(表2)。

肽指纹谱图谱肽同位素质谱簇对应的峰范围为500～3000m/z，大部分低噪信比的峰分布在1000～2000m/z区域内(图3-6，A，D，G，J)。这些结果说明获得的PMF图谱质量高且肽质谱假象很少。胰蛋白酶的自吸峰或是角蛋白的混入都可造成肽质谱假象，严重影响质谱鉴定的准确性。有趣的是两个橡胶延伸因子亚型(点6和7)的肽指纹图谱极为相似。在点6和点7中都(图5-6，G和J)观察到了1046，1159，1606，1849m/z范围内多肽质谱主峰，说明胰蛋白酶的酶解过程很充分，使2-DE胶上蛋白亚型完全分离开了(图2，A)。因此高质量的肽指纹谱图谱增加了与确定蛋白相匹配的多肽的数量，而随后产生的Mascot检索结果和序列覆盖范围也非常高(图3-6；表2)。

在鉴定的25个蛋白中，有5个(点1，6，7，8和10)是橡胶粒子(图2，A)或总胶乳(图1，B)中的橡胶蛋白延伸因子或其亚型；有3个(点1，9，和11)是总胶乳(图1，B)、橡胶粒子(图2，A)和C-乳清(图.2，B)中的SRPP(表2)。仔细识别2-DE胶上的这些蛋白点的特殊位置，我们发现点1，9和11的图形很像，且电泳后在同一条带上。点2，6，7和8出现了相似的结果。总胶乳(图1，B)和黄色体(图2，C)中3个蛋白点(点3，16，和17)是β-1，3-葡聚糖酶(表2)。毫无疑问的，胶乳其他具有代表性的蛋白也被鉴定出来了(表2)：它们分别是胶乳过敏原(点5和12)，胶乳富集蛋白(点14)，铜/锌超氧化物歧化酶蛋白(点15)，几丁质酶A链晶体结构(点18)，羟基腈分解酶A链(点23)，热休克蛋白(HSP)70家族伴侣腔结合蛋白(BiP)前体(点25)，和其他蛋白(见表2)。

在研究中，鉴定出的高富集蛋白是橡胶粒子(图2，A)或总乳胶(图1，B)的REF(点1，6，7，8和10)。尽管橡胶延伸因子的提取原理仍在进一步研究中，但是这种蛋白在橡胶生物合成过程中起着至关重要的作用(Yeang et al.2002)。橡胶延伸因子又名Hevb1过敏原，是由Dennis和Light首次发现的(1989)。它与乳清游离橡胶粒子紧密结合，能催化异戊烯转移酶将大量顺式异戊二烯结合到橡胶分子上(Dennis and Light 1989；Sando et al.2009)。在此研究中，我们从橡胶粒子(点6，7，8和10)和总胶乳(点2)中鉴定出5种橡胶延伸因子亚型(表2；图1，B；图2，A)，这与Duan等的结果一致(Duan et al.2006)。另一个橡胶粒子结合蛋白是SRPP，又名Hevb3过敏原(Yeang et al.2002；Sando et al.2009)。有证据表明SRPP可能和Hevb1一样在橡胶生物合成中起重要作用(Oh et al.1999)。然而，在我们的研究中，我们从橡胶粒子和纯化的C-乳清中都分离出来了SRPP，这与Yan等从患有死皮病的橡胶树C-乳清中分离出3种SRPP亚型结果一致(Yan et al.2008)。以上结果表明SRPP不仅与橡胶粒子结合，其亚型也可能是胞质蛋白。

胶乳中另一典型蛋白是β-1，3-葡聚糖酶(又名Hevb3)，在我们的研究中(表2)总胶乳(图1，B)和黄色体(图2，C)中都含有它。与之前有报道的β-1，3-葡聚糖酶存在于胶乳黄色体中(Churngchow et al.1995；Oh et al.1999；Yeang et al.2002)结果一致。研究人员在研究β-1，3-葡聚糖酶时，通过胶乳过敏者的IgE鉴定出其是胶乳黄色体中36kDa的蛋白(Yeang et al.2002；Barre et al.2009)。微生物入侵高等植物，植物就会表达合成β-1，3-葡聚糖酶，它和几丁质酶一样是一种植物病程相关蛋白，属于物病程相关蛋白2家族(Churngchow et al.1995；Barre et al.2009)。创伤、乙烯和各种组织病菌感染及激发子都能诱导β-1，3-葡聚糖酶的合成，从而抑制真菌类的生长(Churngchow et al.1995)。

胶乳蛋白过敏原Hevb7是一个43kDa pI 5.0左右的蛋白，与patatin同源的橡胶生物合成抑制剂(Posch et al.1997；Yeang et al.2002；Barre et al.2009)。在总胶乳(图1，B)和C-乳清(图2，B)中鉴定出等电点5.01分子量43.0kDa(表2)的Hevb7蛋白(点5和12)。胶乳富集蛋白(gi：4235430)、几丁质酶A链(gi：157831407)、Cu/Zn超氧化物歧化酶(gi：27449246)、羟基腈分解酶(gi：124365253)、V型ATP酶亚单位A(gi：137460)和其他蛋白如结合蛋白(gi：62433284)、50S核糖体蛋白(gi：124021007)、肌动蛋白(gi：58013197)和氧化酶调节剂AOX3前体(gi：162463026)等都是胶乳典型蛋白并且都被鉴定出来了(表2)。

天然橡胶生物合成最重要的两种蛋白REF和SRPP都集中在胶乳粒子中(Yeang et al.2002；Sando et al.2009)。最近，Sando等报道REF主要分布在乳管细胞中，SRPP主要分布在韧皮部内部的乳管细胞而外部很少(Sando et al.2009)。因此，他们提出乳管细胞橡胶粒子的分布模式，认为SRPP在橡胶生物合成过程中起重要作用，而橡胶延伸因子可能与橡胶延伸的终止有关(Sando et al.2009)。在研究中，研究发现2种橡胶延伸因子，一种是与SRPP分子量(点9)相似的23kDa蛋白(点10)，另一种是至少有3种亚型(点6-8)的14kDa蛋白。一般来说，橡胶延伸因子的分子量大约为14kDa(Dennis and Light 1989；Yeang et al.2002；Barre etal.2009；Sando et al.2009)，SRPP是23-25kDa蛋白(Yeang et al.2002；Barre et al.2009；Sando et al.2009)，众所周知他们都应该是与橡胶粒子紧密结合在一起的(Yeang et al.2002；Sando et al.2009)。然而，在发明人的研究中，提出新的关于橡胶延伸因子分子量和SRPP亚细胞定位的见解。为证明乙烯在天然橡胶生物合成中的作用，申请人进一步用本发明提取方法从乙烯处理的橡胶树胶乳不同组份中提取蛋白，得到了高分辨率2-DE图谱。质谱分析鉴定出300多种蛋白，并且得到了乙烯反应蛋白。这些结果说明用本发明提取的蛋白的方法进行蛋白组学分析，能揭示出橡胶胶乳膜蛋白的一些新功能。

表2MALDI TOF MS对橡胶胶乳蛋白的鉴定结果

^a是确定蛋白点的数目，在图1和图2中被标明了

^b是依据NCBInr数据库确定的数字

^c，d是蛋白鉴定实验(c)和理论(d)质量(kDa)和等电点

^e是与PMF相匹配的多肽数和总的搜查多肽数

^f是蛋白鉴定的氨基酸覆盖范围

^g是MS针对NCBInr数据库的查询分数。

上述结果表明：本发明提取方法可以从橡胶胶乳不同组份包括膜系统中提取蛋白进行蛋白组份析，从总胶乳和C-乳清中提取的蛋白，在考马斯亮蓝染色的2-DE胶上得到了上千个背景清晰无拖尾现象的蛋白点，从黄色体中得到了几百个蛋白点。液相色谱-串联质谱鉴定出的25个胶乳蛋白，证明这种方法提取的蛋白适合做双向电泳和质谱分析，能得到更多具有新功能的胶乳蛋白，这种方法可在全球范围内用于不同乳胶组份蛋白组的比较蛋白组学研究。

如无特殊指明，上述所采用的试剂或方法均为常规试剂或常规方法。

以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法，其特征在于，包括下述步骤：

(5)将步骤(4)所得下层蛋白沉淀洗涤后离心，在空气中风干，风干后的蛋白沉淀用裂解缓冲液重悬后即可，

步骤(1)中所述的胶乳组份橡胶粒子、胶乳组份C-乳清和胶乳组份黄色体的制备过程为：巴西橡胶胶乳经35000～45000g离心25～35min，样品分为三层，最上层为橡胶粒子，中间层为C-乳清，下层为黄色体，移去上层的橡胶粒子，余下的样品置于液氮中，冰柱出现后将C-乳清和黄色体分割开即可；

所述的胶乳组份橡胶粒子还需预处理，所述的预处理过程为：按橡胶粒子与洗涤溶剂的重量体积比为1∶8～12，将橡胶粒子悬浮在经-20℃预冷的洗涤溶剂中，漩涡振荡30min后，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集流动相即可；

所述的胶乳组份黄色体还需预处理，所述的预处理过程为：按黄色体与洗涤溶剂的重量体积比为1∶8～12，将粗提的黄色体加入经-20℃预冷的洗涤剂中，冰上放置10min，在3～5℃、25000～35000g离心10～20min后，收集下层沉淀即可；

所述的洗涤溶剂的组成为20mM Tris-HCl，300mM甘露醇和0.5mM DTT，所述洗涤溶剂的pH为7.2；

步骤(1)和步骤(3)中所述的BPP蛋白提取液的组成为：100mM EDTA，100mMpH为8.0的Tris，50mM硼砂，50mM维生素C，重量百分含量为1％的PVPP，体积百分含量为1％的Triton X-100，体积百分含量为2％的β-巯基乙醇和重量百分含量为30％的蔗糖；

2.根据权利要求1所述的巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(5)中下层蛋白沉淀的洗涤过程为：先采用在-20℃预冷6h以上的甲醇洗涤1～2次，再采用-20℃预冷6h以上的丙酮洗涤2～3次。

3.根据权利要求1所述的巴西橡胶胶乳蛋白的提取方法，其特征在于，步骤(2)-(5)中所述的离心的过程为：在3～5℃、25000～35000g离心10～20min。