CN104152389A - 高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用 - Google Patents
高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104152389A CN104152389A CN201410437123.1A CN201410437123A CN104152389A CN 104152389 A CN104152389 A CN 104152389A CN 201410437123 A CN201410437123 A CN 201410437123A CN 104152389 A CN104152389 A CN 104152389A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- evaporated
- algistatic activity
- efficient
- algal
- einoxanthin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用，涉及一株抑藻细菌及抑藻活性化合物。化合物为C40H54O3。将Y35接种于平板上划线分离，培养后挑取单菌落再培养后即得发酵液，离心去上清，所得菌体萃取，离心，上清液真空蒸干，萃取，减压浓缩，干燥得粗提取物，再溶于甲醇中，上样于葡聚糖凝胶柱，洗脱，层析，显色，合并相似组分得到合并洗脱液，再真空蒸干后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取具有抑藻活性的组分，再溶于乙酸乙酯中，上样于硅胶柱，洗脱，间隔收集洗脱液，层析，显色后合并相似组分得到合并洗脱液，真空蒸干，再溶于DMSO验证抑藻活性，选取具有抑藻活性组分，用高效液相色谱分析，即得产物。
Description
技术领域
本发明涉及一株抑藻细菌及抑藻活性化合物，尤其是涉及一种高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用。
背景技术
海洋藻类过度繁殖会形成赤潮，赤潮的爆发往往引起海洋环境的改变，破坏了原有的生态平衡[1]。特别是有毒藻引发的赤潮，其分泌的藻毒素造成了海洋生物的死亡，进而产生了巨大的经济问题和健康危机[2,3]。塔玛亚历山大藻是一种全球分布的有毒涡鞭毛藻，而且其具有的毒素经食物链传递后形成麻痹性贝毒对水域环境和人类健康都具有极大的危害，在厦门海域常引发赤潮[4,5]，是一种急需处理和控制的有毒藻。
在控制海洋藻类生长的方法中，常用的有物理法[6]、化学法[7]和生物法。物理法主要是通过超声波、紫外线或者活性炭杀死藻细胞，化学法是化学药品、絮凝剂等抑制藻类生长，但是这两种方法成本较高，不易操作，危害生态环境及非赤潮生物[8]。相对于这两种方法，生物法更加专一、高效，具有生物安全性。近年来，围绕海洋细菌在赤潮生消过程中的作用，科学家做了大量关于“以菌治藻”的研究[9-11]。研究表明，细菌可以通过直接或间接的作用抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞，从而表现为杀藻效应。藻菌共培养的研究结果表明杀藻细菌的作用方式可以归结为两种：一是细菌同藻细胞直接接触、导致藻细胞死亡的直接杀藻作用，Furusawa等从日本的Kagoshima海湾里筛选出1株细菌SS98-5，超薄部分的电子显微照片中发现了滑行运动的现象，并观察到滑行的细胞中具有类微管结构[12]，说明该细菌通过这种滑动作用与藻细胞接触；二是细菌不同藻细胞直接接触，而通过释放某种化学物质导致藻细胞死亡的间接杀藻作用[13,14]。目前所发现的杀藻细菌多数属于该类，其一般是通过分泌溶解性杀藻物质杀死藻细胞。Li等从杀藻弧菌BS02中分离到一种脂肪酸类物质，能有效的抑制塔玛亚历山大藻的生长[15]；Wang等发现从厦门海域分离出的溶藻菌DHQ25，可通过分泌胞外蛋白来抑制和杀死赤潮藻[16]。
为了有效地控制塔玛亚历山大藻的生长，我们继续从不同生境进行杀藻细菌的分离，从而不断地扩大和丰富杀藻微生物资源。其中本研究所采用的细菌——耐辐射球菌(Deinococcus)来自于水生环境，Deinococcus属的细菌是一类极端环境微生物，不但能够对引起细胞致死效应的福射有极强抵抗能力，而且还能忍受强烈的高温、干燥、低温、氧化剂等极端环境；球状菌多为革兰氏阳性菌，杆状菌则为革兰氏阴性，菌落颜色呈红色至橘红色，不同菌种对培养温度要求有所差别，大部分的生长最适温度在30℃到37℃之间，而从热泉中分离到的D.geothermalis和D.mwrayi是中度嗜热，它们的最适生长温度在45℃到55℃之间。但是迄今为止，还没有任何一篇报道称该属的细菌可以分泌杀藻活性物质，因此我们是首次证实并成功分离到一种色素类的可以高效抑制塔玛亚历山大藻的生长的活性物质。
迄今为止，大多数筛选到的抑藻微生物是通过分泌特异的具有抑藻活性的物质来起抑藻作用的。已经报道的抑藻活性化合物包括：蛋白质(含胞外酶)、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物等其他尚未定性的抑藻化合物[17-22]。通过筛选高效、专一的抑藻活性化合物成为开发抑藻剂用于赤潮治理的一个新思路。然而目前国内菌藻关系的研究落后于国外，在抑藻物质的提取、纯化、鉴定等研究方面仍处于起步阶段，已被分离鉴定的抑藻物质还远远不足以满足有害赤潮的防控。
参考文献：
[1]D.M.Anderson,Turning back the harmful red tide,Nature,388(1997)513-514.
[2]N.Madhu,P.Reny,M.Paul,N.Ullas,P.Resmi,Occurrence of red tide caused by Kareniamikimotoi(toxic dinoflagellate)in the Southwest coast of India,40(2011)821-825.
[3]H.J.Jeong,S.K.Kim,J.S.Kim,S.T.Kim,Y.D.YOO,J.Y.Yoon,Growth and grazing ratesof the heterotrophic dinoflagellate polykrikos kofoidii on Red-Tide and toxic dinoflagellates,Journalof Eukaryotic Microbiology,48(2001)298-308.
[4]J.I.Carreto,M.O.Carignan,N.G.Montoya,Comparative studies on mycosporine-likeamino acids,paralytic shellfish toxins and pigment profiles of the toxic dinoflagellates Alexandriumtamarense,A.catenella and A.minutum,Marine Ecology Progress Series,223(2001)49-60.
[5]K.Ichimi,M.Yamasaki,Y.Okumura,T.Suzuki,The growth and cyst formation of a toxicdinoflagellate,Alexandrium tamarense,at low water temperatures in northeastern Japan,Journal ofexperimental marine biology and ecology,261(2001)17-29.
[6]N.Laanaia,A.Vaquer,A.Fiandrino,B.Genovesi,A.Pastoureaud,P.Cecchi,Y.Collos,Wind and temperature controls on Alexandrium blooms(2000–2007)in Thau lagoon(WesternMediterranean),Harmful Algae,28(2013)31-36.
[7]J.M.Hathaway,T.L.Moore,J.M.Burkholder,W.F.Hunt,Temporal analysis of stormwatercontrol measure effluent based on windows of harmful algal bloom(HAB)sensitivity:Are annualnutrient EMCs appropriate during HAB-sensitive seasons？,Ecological Engineering,49(2012)41-47.
[8]T.Lee,K.Nakano,M.Matsumara,Ultrasonic irradiation for blue-green algae bloomcontrol,Environmental technology,22(2001)383-390.
[9]X.Zheng,B.Zhang,J.Zhang,L.Huang,J.Lin,X.Li,Y.Zhou,H.Wang,X.Yang,J.Su,Amarine algicidal actinomycete and its active substance against the harmful algal bloom speciesPhaeocystis globosa,Applied microbiology and biotechnology,97(2013)9207-9215.
[10]S.J.Bai,L.P.Huang,J.Q.Su,Y.Tian,T.L.Zheng,Algicidal effects of a novel marineactinomycete on the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense,Current microbiology,62(2011)1774-1781.
[11]J.Q.Su,X.R.Yang,T.L.Zheng,Y.Tian,N.Z.Jiao,L.Z.Cai,H.S.Hong,Isolation andcharacterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinoflagellate Alexandriumtamarense,Harmful Algae,6(2007)799-810.
[12]G.Furusawa,T.Yoshikawa,A.Yasuda,T.Sakata,Algicidal activity and gliding motilityof Saprospira sp.SS98-5,Canadian journal of microbiology,49(2003)92-100.
[13]李东,李祎,郑天凌,海洋溶藻功能菌作用机理研究的若干进展,地球科学进展,28(2013)243-252.
[14]郑天凌,吕静琳,周艳艳,苏建强,杨小茹,张金龙,田蕴,熊小京,章军,蔡明刚,海洋有害赤潮调控功能菌的发现与研究,厦门大学学报,50(2011)445-454.
[15]D.Li,H.Zhang,L.Fu,X.An,B.Zhang,Y.Li,Z.Chen,W.Zheng,L.Yi,T.Zheng,Anovel algicide:evidence of the effect of a fatty acid compound from the marine bacterium,Vibrio sp.BS02on the harmful dinoflagellate,Alexandrium tamarense,PloS one,9(2014)e91201.
[16]B.Wang,Y.Zhou,S.Bai,J.Su,Y.Tian,T.Zheng,X.Yang,A novel marine bacteriumalgicidal to the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense,Letters in applied microbiology,51(2010)552-557.
[17]K.Yoshikawa,K.Adachi,M.Nishijima,T.Takadera,S.Tamaki,K.Harada,K.Mochida,H.Sano,beta-cyanoalanine production by marine bacteria on cyanide-free medium and its specificinhibitory activity toward cyanobacteria,Appl.Environ.Microbiol.,66(2000)718-722.
[18]J.Kato,J.Amie,Y.Murata,A.Kuroda,A.Mitsutani,H.Ohtake,Development of agenetic transformation system for an alga-lysing bacterium,Appl.Environ.Microbiol.,64(1998)2061-2064.
[19]Y.Kawano,Y.Nagawa,H.Nakanishi,H.Nakajima,M.Matsuo,T.Higashihara,Production of thiotropocin by a marine bacterium,Caulobacter sp.and its antimicroalgal activities,J.Mar.Biotechnol.,5(1997)225-229.
[20]R.Hibayashi,N.Imamura,Action mechanism of a selective anti-cyanobacterialcompound,argimicin A,Journal of Antibiotics,56(2003)154-159.
[21]HaeyoungJeong,JoungHanYim,ChoonghwanLee,S.-H.et.,Genomic blueprint ofHahella chejuensis,amarine microbe producing analgicid alagent,Nucleic Acids Research,(2005).
[22]P.Berger,J.Rho,H.Gunner,Bacterial suppression of chlorella by hydroxylamineproduction,Water Research 13(1979)267-273.
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35。
本发明的第二目的在于提供一种高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种高效抑藻活性化合物Deinoxanthin在制备抑藻剂中的应用。
本发明的第四目的是提供一种耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35的筛选方法。
所述耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35已于2014年06月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072，保藏中心保藏编号为：CCTCCNO：M2014296。
所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的分子式为C40H54O3，名称为Deinoxanthin，结构式如下所示：
所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的制备方法，包括以下步骤：
1)将耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35接种于平板上划线分离，培养后挑取所述平板上的单菌落接种于蒸馏水配制的LB液体培养基中，再培养后即得发酵液；
2)将步骤1)得到的发酵液离心后去掉上清液，所得红色菌体用无水乙醇萃取，超声振荡，再次离心；
3)将步骤2)所得的上清液真空蒸干，加入乙酸乙酯萃取过夜，减压浓缩，干燥，得到粗提取物A；
4)将步骤3)所得的粗提物A溶于甲醇中，然后上样于葡聚糖凝胶柱，采用甲醇为流动相洗脱，在洗脱过程中，根据颜色不同收集洗脱液，并将洗脱液利用薄层层析(thin-layerchromatography，TLC)进行层析，展开剂按体积比的组成为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，采用碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液；
5)将步骤4)所得的合并洗脱液真空蒸干，然后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取经验证后具有抑藻活性的组分，记为组分B；
6)将步骤5)所得的组分B溶于乙酸乙酯中，然后上样于硅胶柱，采用流动相梯度浓度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，洗脱程序为体积比50∶1，黄色、红色杂质，30∶1，第一片红色组分，15∶1，第二片红色组分，洗脱流速为1mL/min；在洗脱过程中，间隔收集洗脱液，并将洗脱液进行层析，采用碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液，然后将合并洗脱液真空蒸干，再溶解于DMSO验证抑藻活性，选取经验证后具有抑藻活性的组分，记为活性组分C；
7)将步骤6)所得的活性组分C利用高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)分析，分析柱SunFireTm C18 5μm；流动相按体积比为甲醇∶乙腈∶水＝5∶4∶1，流速为1mL/min，柱温为35℃，检测波长为480nm，每次进样量为20μl；在HPLC结果中，样品只检测到一个独立的峰，所得化合物即为所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin，结构式为：
在步骤1)中，所述培养的条件可于28～37℃温度下培养2～3d；所述再培养的条件可于28～37℃，180～250rpm培养2～3d。
在步骤2)中，所述离心的条件可于12000～14000g离心10～20min；所述超声振荡的时间可为2～4h，所述再次离心的条件可于12000～14000g离心10～20min。
在步骤3)中，所述上清液真空蒸干的条件可将上清液置于旋转蒸发仪下30℃真空蒸干，所述乙酸乙酯的加入量可为200～400mL。
在步骤4)中，所述葡聚糖凝胶柱可采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。
在步骤5)中，所述合并洗脱液真空蒸干的条件可将合并洗脱液置于旋转蒸发仪下30℃真空蒸干。
在步骤6)中，所述硅胶柱可采用170mm×30mm，200～300目硅胶柱；所述合并洗脱液真空蒸干的条件可将合并洗脱液置于旋转蒸发仪30℃真空蒸干。
在步骤7)中，所述分析柱SunFireTm C18 5μm为4.6mm×250mm Column；在HPLC结果中，样品只检测到一个独立的峰，所述样品可通过Q Exactive LC-MS/MS系统和1H-NMR检测对化合物进行鉴定，该纯化合物即为本发明所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin。
本发明所制备的高效抑藻活性化合物Deinoxanthin可在制备抑藻剂中应用。
以下给出耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35的分离筛选方法：
1)取福建厦门大学翔安校区湖水样品，溶解于高压灭菌的90mL LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH 7.2，1L蒸馏水)，置于150～200rpm摇床震荡20～30min，使样品均匀分散；
2)用10倍稀释法，涂布均匀分散的样品于LB固体平板，置于28～37℃温度下培养3～5d；
3)挑取不同类型单菌落划线于LB固体平板，置于28～30℃温度下培养3～5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养；
4)接种分离出的纯培养物单菌落于4mL LB液体培养基，置于28～37℃摇床，180～250rpm震荡培养3～5d；
5)将1mL发酵液加入到20mL指数期塔玛亚历山大藻培养液中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下培养2d，LB培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻藻细胞是否死亡，从而筛选出抑藻活性菌株。将抑藻菌株于-80℃保藏，待用。
本发明运用常规方法筛选获得了一株Deinococcus xianganensis Y35，通过发酵培养，获得含有强抑藻活性化合物的发酵液，将所述发酵液离心，乙醇萃取红色菌体，然后离心后将上清液进行分离纯化，获得具有强抑藻活性的化合物。所述活性物质能够高效、专一地杀灭藻细胞，具有开发成抑藻剂的潜能，在生物降解藻类，治理赤潮方面具有广泛的应用。
附图说明
图1为Deinococcus xianganensis Y35的电镜照片图(在LB平板上37℃培养24h后观察)。
图2为Deinococcus xianganensis Y35的进化树(将与细菌Y35相似性最近的30株细菌的16S rRNA序列进行临接法(Neighbour-joining)构建进化树，只保留bootstrap values>70％，标尺为0.01核苷酸替换率Knuc)。
图3为活性组分高效液相图谱。
图4为本发明所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的质谱图谱。在图4中，横坐标代表质荷比(m/z)，纵坐标代表各个峰的相对丰度。
图5为本发明所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin抑藻效果图。在图5中，横坐标代表不同的处理时间Treatment time(h)，纵坐标代表藻细胞荧光强度(RFU)；Control：未经处理的对照组；本发明所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的溶剂为DMSO；用本发明所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin处理藻细胞时所使用的终浓度分别为：曲线a为1μg/mL，曲线b为对照，曲线c为5μg/mL，曲线d为10μg/mL，曲线e为20μg/mL，曲线f为30μg/mL，曲线g为50μg/mL，曲线h为70μg/mL。
图6为高效抑藻活性化合物Deinoxanthin处理下的塔玛亚历山大藻藻细胞裂解过程的电镜图(20μg/mL)。在图6中，a，d是正常生长的对照组细胞；b，c，e，f分别为不同处理时间的处理组；标尺是：a、b为2μm，c为1μm，d、e、f为0.5μm。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
实施例1：抑藻细菌菌株的分离筛选
1)取福建厦门大学翔安校区湖水样品，溶解于高压灭菌的90mL LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH 7.2，1L蒸馏水)，置于150～200rpm摇床震荡20～30min，使样品均匀分散；
2)10倍稀释法，涂布均匀分散的样品于LB固体平板，置于28～37℃温度下培养3～5d；
3)挑取不同类型单菌落划线于LB固体平板，置于28～30℃温度下培养3～5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养(图1，2)；
4)接种分离出的纯培养物单菌落于4mL LB液体培养基，置于28～37℃摇床，180～250rpm震荡培养3～5d；
5)将1mL发酵液加入到20mL指数期塔玛亚历山大藻培养液中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下培养2天，LB培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻藻细胞是否死亡，从而筛选出抑藻活性菌株。将抑藻菌株于-80℃保藏，待用。
实施例2：抑藻效果测定方法
1)塔玛亚历山大藻在20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下，于三角瓶中培养至指数期，然后分装到24孔细胞培养板中，每孔分装2mL藻细胞悬液，适应生长1天；
2)定量待测样品加入24孔板；
3)每隔一定时间取塔玛亚历山大藻培养液，200μL样品于24孔板，用酶标仪检测440nm激发光激发下680nm处的荧光强度，根据测定的对照组和处理组的藻细胞荧光强度，同时藻细胞形态变化进行观察。
实施例3：抑藻活性化合物的分离和鉴定
1)将耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35接种于平板上划线分离，于28～37℃温度下培养2～3d；挑取所述平板上的单菌落接种于蒸馏水配制的LB液体培养基中，于28～37℃，180～250rpm培养2～3d后即得发酵液；
2)将步骤1)中的发酵液于12000～14000g离心10～20min；
3)去掉步骤2)中的上清液，用无水乙醇萃取步骤2)中获得的红色菌体，超声振荡2～4h后，于12000～14000g离心10～20min；
4)将在步骤3)所得的上清置于旋转蒸发仪下30℃真空蒸干，加入200～400mL乙酸乙酯萃取过夜，减压浓缩，干燥，得到粗提取物A；
5)将步骤4)所得的粗提物A溶于甲醇中，然后上样于葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)，采用甲醇为流动相洗脱，在洗脱过程中，根据颜色不同收集洗脱液，并将洗脱液利用薄层层析(thin-layer chromatography，TLC)进行层析，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，采用碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液；
6)将在步骤5)所得的合并洗脱液置于旋转蒸发仪下30℃真空蒸干，然后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取经验证后具有抑藻活性组分的组分B；
7)将步骤6)所得的组分B溶于乙酸乙酯中，然后上样于硅胶柱(170mm×30mm，200～300目)，采用流动相梯度浓度洗脱，洗脱剂：二氯甲烷和甲醇的混合物，洗脱程序：体积比50∶1,黄色、红色杂质，30∶1,第一片红色组分，15∶1，第二片红色组分，洗脱流速：1mL/min；在洗脱过程中，间隔收集洗脱液，并将洗脱液进行层析，采用碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液，然后将合并洗脱液置于旋转蒸发仪30℃真空蒸干，再溶解于DMSO验证抑藻活性，选取经验证后具有抑藻活性组分的活性物质C；
8)将步骤7)所得的活性组分C利用高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)分析，分析柱SunFireTm C185μm(4.6mm×250mm Column)；流动相：甲醇∶乙腈∶水(5∶4∶1,v:v:v)；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长480nm；每次进样20μl。在HPLC结果中，样品只检测到一个独立的峰(图3)，说明该组分是一个比较纯的化合物，同时将样品通过Q Exactive LC-MS/MS系统进行质谱鉴定，其中[M+H]+正离子加合峰为583.4126，于是确定该物质的分子量为582(图4)，和1H-NMR检测对化合结构进行鉴定(表1)，通过将其化学位移和耦合常数经Scifinder数据库检索、与相应文献比对[23]，确定该纯化合物即为本发明所述的Deinoxanthin，分子式为：
表1 为Deinoxanthin的化学位移和耦合常数。
a数据来自于文献[23]。
实施例4：Deinoxanthin抑藻效果验证
1)塔玛亚历山大藻在20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下，于三角瓶中培养至指数期，然后分装到24孔细胞培养板中，每孔分装2mL藻细胞悬液，适应生长1天；
2)分别按照1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL的添加量将分离得到的活性物质Deinoxanthin加入到藻培养液中；
3)每隔2h取藻培养液用酶标仪检测440nm激发光激发下680nm处的荧光强度，以此来反映活性物质对藻细胞生长的抑制效果(图5)。
其中1μg/mL的添加量对塔玛亚历山大藻生长没有产生抑制效果，甚至还稍微促进了藻细胞的生长；但是从5μg/mL添加量开始，Deinoxanthin对藻细胞的生长产生了抑制效果，并且表现出剂量依赖性，抑制效果随着添加量的增加而升高。在处理6h的时候，20μg/mL及以上的添加量，Deinoxanthin抑藻率能够超过50％，而5μg/mL添加量需要处理12h才能够达到50％的抑藻率。因此我们确定Deinoxanthin有非常迅速的抑藻效果，在短时间就能达到对藻细胞生长的抑制作用，并且当处理6h时候的EC50是21.727μg/ml。
实施例5：Deinoxanthin抑藻过程观察
1)将经过Deinoxanthin处理不同时间后的塔玛亚历山大藻及未处理的对照组3000rpm离心10min，去上清后，用迅速加入含2.5％戊二醛的PBS缓冲液(8g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于1L蒸馏水中，pH＝7.4)进行前固定，室温固定过夜；
2)用PBS洗涤3次，每次20～30min，往离心管内滴入融化的1.5％低熔点琼脂，并将藻细胞悬浮在其中，倒入小称量瓶内，于冰箱使琼脂凝固，用刀片将包有藻细胞的琼脂块切成1mm3大小的若干块；
3)再次加入前固定液，室温固定过夜；
4)再次用PBS洗涤藻细胞，用1％OsO4固定2h，用乙醇梯度脱水，用环氧树脂包埋细胞样品，通过超薄切片机获得超薄细胞切片，经染色后于JEM2100HC透射电镜观察。图6a是未经过Deinoxanthin处理的正常生长的藻细胞，质膜无明显分离界限，胞内各细胞器分布均匀，清晰可见；图6b，图6c是经过Deinoxanthin处理的藻细胞，可以看出叶绿体等细胞器变得非常稀疏，并出现了大量的空泡，细胞质和细胞壁发生破裂现象，说明藻细胞在活性物质作用下不能正常生长；图6d～图6f是藻细胞的叶绿体的放大图，其中图6d是正常生长藻细胞的叶绿体，叶绿体呈典型的立体梭状，线粒体结实饱满；而经过Deinoxanthin处理的藻细胞的叶绿体变得十分稀疏，并且形态发生变化，呈椭圆形，最终叶绿体膜破裂。这说明藻细胞在Deinoxanthin作用下叶绿体被破坏，光合系统损坏，不能正常生长。
Claims (10)
1.耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35，已于2014年06月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO：M2014296。
2.高效抑藻活性化合物Deinoxanthin，其特征在于，其分子式为C40H54O3，名称为Deinoxanthin，结构式如下所示：
3.如权利要求2所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
1)将耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35接种于平板上划线分离，培养后挑取所述平板上的单菌落接种于蒸馏水配制的LB液体培养基中，再培养后即得发酵液；
2)将步骤1)得到的发酵液离心后去掉上清液，所得红色菌体用无水乙醇萃取，超声振荡，再次离心；
3)将步骤2)所得的上清液真空蒸干，加入乙酸乙酯萃取过夜，减压浓缩，干燥，得到粗提取物A；
4)将步骤3)所得的粗提物A溶于甲醇中，然后上样于葡聚糖凝胶柱，采用甲醇为流动相洗脱，在洗脱过程中，根据颜色不同收集洗脱液，并将洗脱液利用薄层层析进行层析，展开剂按体积比的组成为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1，采用碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液；
5)将步骤4)所得的合并洗脱液真空蒸干，然后溶解于DMSO进行抑藻活性验证，选取经验证后具有抑藻活性的组分，记为组分B；
6)将步骤5)所得的组分B溶于乙酸乙酯中，然后上样于硅胶柱，采用流动相梯度浓度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，洗脱程序为体积比50∶1，黄色、红色杂质，30∶1，第一片红色组分，15∶1，第二片红色组分，洗脱流速为1mL/min；在洗脱过程中，间隔收集洗脱液，并将洗脱液进行层析，采用碘蒸气显色和硫酸铵乙醇显色，然后合并相似组分，得到合并洗脱液，然后将合并洗脱液真空蒸干，再溶解于DMSO验证抑藻活性，选取经验证后具有抑藻活性的组分，记为活性组分C；
7)将步骤6)所得的活性组分C利用高效液相色谱分析，分析柱SunFireTm C18 5μm；流动相按体积比为甲醇∶乙腈∶水＝5∶4∶1，流速为1mL/min，柱温为35℃，检测波长为480nm，每次进样量为20μl；在HPLC结果中，样品只检测到一个独立的峰，所得化合物即为所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin，结构式为：
4.如权利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的制备方法，其特征在于，
在步骤1)中，所述培养的条件是于28～37℃温度下培养2～3d；所述再培养的条件可于28～37℃，180～250rpm培养2～3d；
在步骤2)中，所述离心的条件可于12000～14000g离心10～20min；所述超声振荡的时间可为2～4h，所述再次离心的条件可于12000～14000g离心10～20min。
5.如权利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的制备方法，其特征在于，
在步骤3)中，所述上清液真空蒸干的条件是将上清液置于旋转蒸发仪下30℃真空蒸干，所述乙酸乙酯的加入量可为200～400mL；
在步骤4)中，所述葡聚糖凝胶柱可采用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱。
6.如权利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的制备方法，其特征在于，
在步骤5)中，所述合并洗脱液真空蒸干的条件是将合并洗脱液置于旋转蒸发仪下30℃真空蒸干；
在步骤6)中，所述硅胶柱可采用170mm×30mm，200～300目硅胶柱；所述合并洗脱液真空蒸干的条件可将合并洗脱液置于旋转蒸发仪30℃真空蒸干。
7.如权利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的制备方法，其特征在于，
在步骤7)中，所述分析柱SunFireTm C18 5μm为4.6mm×250mm Column。
8.如权利要求3所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin的制备方法，其特征在于，
在步骤7)中，在HPLC结果中，样品只检测到一个独立的峰，所述样品通过Q ExactiveLC-MS/MS系统和1H-NMR检测对化合物进行鉴定，纯化合物即为所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin。
9.如权利要求2所述高效抑藻活性化合物Deinoxanthin在制备抑藻剂中应用。
10.如权利要求1所述耐辐射球菌(Deinococcus xianganensis)Y35的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取福建厦门大学翔安校区湖水样品，溶解于高压灭菌的90mL LB培养基，置于150～200rpm摇床震荡20～30min，使样品均匀分散；所述LB培养基的组成为胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，pH 7.2，1L蒸馏水；
2)用10倍稀释法，涂布均匀分散的样品于LB固体平板，置于28～37℃温度下培养3～5d；
3)挑取不同类型单菌落划线于LB固体平板，置于28～30℃温度下培养3～5d，验证是否纯培养，重复该步骤直到得到纯培养；
4)接种分离出的纯培养物单菌落于4mL LB液体培养基，置于28～37℃摇床，180～250rpm震荡培养3～5d；
5)将1mL发酵液加入到20mL指数期塔玛亚历山大藻培养液中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m-2s-1光照强度条件下培养2d，LB培养基为对照加入藻液中，分别设置3个平行；观察塔玛亚历山大藻藻细胞是否死亡，从而筛选出抑藻活性菌株；将抑藻菌株于-80℃保藏，待用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410437123.1A CN104152389B (zh) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410437123.1A CN104152389B (zh) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104152389A true CN104152389A (zh) | 2014-11-19 |
| CN104152389B CN104152389B (zh) | 2017-02-08 |
Family
ID=51878018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410437123.1A Expired - Fee Related CN104152389B (zh) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104152389B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108676066A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-10-19 | 深圳大学 | 一种化合物Malformin C的应用及制备方法 |
| CN110093278A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-08-06 | 河南师范大学 | 一种强效抑藻活性物质的提取方法及其应用 |
| WO2021256703A1 (ko) * | 2020-06-15 | 2021-12-23 | 서울시립대학교산학협력단 | 데이노잔틴 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 온도제어를 이용한 데이노잔틴 대량생산 방법 |
| KR20220080709A (ko) * | 2020-12-07 | 2022-06-14 | 고려대학교 산학협력단 | 빛 조사 및 농부산물을 이용한 다이노잔틴의 대량생산방법 및 상기 방법으로 제조된 다이노잔틴을 유효성분으로 포함하는 녹조 제거용 조성물 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1563407A (zh) * | 2004-03-16 | 2005-01-12 | 浙江大学 | 利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺 |
| CN102308852A (zh) * | 2010-07-01 | 2012-01-11 | 四川大学 | 一种可抑制水中游离或成膜微藻的微生物抑藻剂及制备方法 |
| WO2013092967A1 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Deinove | Bacteria and the uses thereof |
-
2014
- 2014-08-29 CN CN201410437123.1A patent/CN104152389B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1563407A (zh) * | 2004-03-16 | 2005-01-12 | 浙江大学 | 利用耐辐射球菌生产天然类胡萝卜素的生产工艺 |
| CN102308852A (zh) * | 2010-07-01 | 2012-01-11 | 四川大学 | 一种可抑制水中游离或成膜微藻的微生物抑藻剂及制备方法 |
| WO2013092967A1 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | Deinove | Bacteria and the uses thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LAURANT LEMEE等: "Deinoxanthin: A New Carotenoid Isolated from Deinococcus radiodurans", 《TETRAHEDRON》, vol. 53, no. 3, 31 December 1997 (1997-12-31), pages 923 - 4 * |
| YI LI等: "The first evidence of deinoxanthin from Deinococcus sp. Y35 with strong algicidal effect on the toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense", 《JOURNAL OF HAZARDOUS MATERIALS》, vol. 290, 27 February 2015 (2015-02-27), pages 87 - 95 * |
| 李东 等: "海洋溶藻功能菌作用机理研究的若干进展", 《地球科学进展》, vol. 28, no. 2, 28 February 2013 (2013-02-28), pages 243 - 252 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108676066A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-10-19 | 深圳大学 | 一种化合物Malformin C的应用及制备方法 |
| CN108676066B (zh) * | 2018-05-29 | 2021-09-10 | 深圳大学 | 一种化合物Malformin C的应用及制备方法 |
| CN110093278A (zh) * | 2019-05-20 | 2019-08-06 | 河南师范大学 | 一种强效抑藻活性物质的提取方法及其应用 |
| WO2021256703A1 (ko) * | 2020-06-15 | 2021-12-23 | 서울시립대학교산학협력단 | 데이노잔틴 고생산능을 갖는 변이 균주의 제조방법 및 온도제어를 이용한 데이노잔틴 대량생산 방법 |
| KR20220080709A (ko) * | 2020-12-07 | 2022-06-14 | 고려대학교 산학협력단 | 빛 조사 및 농부산물을 이용한 다이노잔틴의 대량생산방법 및 상기 방법으로 제조된 다이노잔틴을 유효성분으로 포함하는 녹조 제거용 조성물 |
| KR102633212B1 (ko) | 2020-12-07 | 2024-02-02 | 고려대학교 산학협력단 | 빛 조사 및 농부산물을 이용한 다이노잔틴의 대량생산방법 및 상기 방법으로 제조된 다이노잔틴을 유효성분으로 포함하는 녹조 제거용 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104152389B (zh) | 2017-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Surfactin and fengycin contribute to the protection of a Bacillus subtilis strain against grape downy mildew by both direct effect and defence stimulation | |
| Musa et al. | Salt-adapted moulds and yeasts: Potentials in industrial and environmental biotechnology | |
| CN103497980B (zh) | 尼日利亚菌素的制备方法 | |
| CN103380211B (zh) | 高角鲨烯生产能力的新型微生物及角鲨烯生产的方法 | |
| CN104152389B (zh) | 高效抑藻活性化合物Deinoxanthin及其制备方法与应用 | |
| Kulkarni et al. | Production, characterization and optimization of actinomycin D from Streptomyces hydrogenans IB310, a (n antagonistic bacterium against phytopathogens | |
| He et al. | Sesquiterpenyl epoxy-cyclohexenoids and their signaling functions in nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora | |
| Xu et al. | A novel and effective Streptomyces sp. N2 against various phytopathogenic fungi | |
| CN108300677A (zh) | 一株白色链霉菌及其在制备微生物源防腐剂中的应用 | |
| CN103695342B (zh) | 一株具有溶藻活性的芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105950500A (zh) | 一株溶藻气单胞菌及其在控制蓝藻水华中的应用 | |
| Gągała-Borowska et al. | Cyanobacterial cell-wall components as emerging environmental toxicants-detection and holistic monitoring by cellular signaling biosensors | |
| CN104804071B (zh) | 一种缩酚酸肽类化合物及其制备方法和应用 | |
| CN104109642B (zh) | 一种粘质沙雷氏菌及其筛选方法和应用 | |
| CN104630119B (zh) | 抑藻活性物质紫色杆菌素及其制备方法 | |
| CN105218670B (zh) | 一种来源于坚强芽孢杆菌的发酵产物免疫蛋白及其制备工艺 | |
| CN105779363B (zh) | 一种液化沙雷氏菌及其转化合成洋茉莉醛的方法 | |
| Cheng et al. | Antifungal activity and identification of active compounds of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum against Botryosphaeria dothidea | |
| CN103333835A (zh) | 一株降解除草剂杂草焚的细菌及其用途 | |
| CN104232524B (zh) | 抑藻活性物质灵菌红素及其制备方法 | |
| CN106496115A (zh) | 一种混源单萜生物碱类化合物及其制备方法与作为海洋防污剂的应用 | |
| CN103478149A (zh) | 尼日利亚菌素在制备抑藻剂中的应用 | |
| CN103484409A (zh) | 一种源于海洋细菌抑藻活性物质棕榈油酸及其制备方法 | |
| CN102911972B (zh) | 抑藻活性物质二异丁氧基苯基胺的制备方法 | |
| CN102919286A (zh) | 用乙酸乙酯从大麦提取具有抑藻活性化感细分组分的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHENZHEN RESEARCH INSTITUTE OF XIAMEN UNIVERSITY Effective date: 20141115 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20141115 Address after: Xiamen City, Fujian Province, 361005 South Siming Road No. 422 Applicant after: XIAMEN University Applicant after: SHENZHEN RESEARCH INSTITUTE OF XIAMEN University Address before: Xiamen City, Fujian Province, 361005 South Siming Road No. 422 Applicant before: Xiamen University |
|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170208 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |