CN108676066B - 一种化合物Malformin C的应用及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供化合物Malformin C的应用及制备方法，涉及生物技术领域。其中，化合物Malformin C应用于抑藻或杀藻中。利用化合物Malformin C可以抑制赤潮中藻类的生长，使藻类细胞停止生长，甚至杀灭藻类细胞，以对大量爆发的赤潮进行治理。

Description

一种化合物Malformin C的应用及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种化合物Malformin C的应用及制备方法。

背景技术

赤潮(Red tide)，是指在某些特定气候条件下海洋中一些藻类、原生动物或细菌爆发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象。赤潮对海洋生物及人类造成的危害可以分为以下三个方面：其一，赤潮藻过度消耗海水中的溶解氧，或直接堵塞生物的呼吸器官而造成海洋鱼类的大量死亡；其二，部分产生毒素的赤潮藻直接导致海洋生物的死亡，某些毒素通过食物链的向上传递可造成人类食物中毒甚至死亡；其三，赤潮藻类的爆发性增殖造成海洋生态系统失衡，对局部海域物种多样性造成影响。

现有的赤潮治理方法包括物理方法、化学方法以及生物学方法。生物学方法主要通过生物之间的营养竞争关系来实现控藻，具体可分为以鱼类、以水生高等植物、及以微生物来控制藻类的生长。具有不会对环境造成污染的优点，成为最具发展前途的赤潮防治方法。其中由于微生物易于繁殖的特点，使得微生物控藻是生物控藻里最有前途的一种控藻方式。这些杀藻微生物主要是包括细菌(溶藻细菌)、病毒(噬菌体)、原生动物、真菌和放线菌等五类。多数溶藻菌能够分泌细胞外物质，对宿主藻类起抑制或杀灭作用，因此通过溶藻菌筛选高效、专一，能够生物降解的杀藻物质是灭杀赤潮藻的一个新的研究方向。

但是，自然存在的溶藻菌在海洋中存在的量比较少，对大量爆发赤潮不能发挥快速的治理作用。

发明内容

本发明提供一种化合物Malformin C的应用及制备方法，旨在解决生物防治赤潮方法不足的问题。

本发明提供化合物Malformin C的应用，所述Malformin C应用于抑藻或者杀藻。

本发明提供化合物Malformin C的制备方法，所述Malformin C的制备方法包括：

将曲霉菌丝(Aspergillus sp.SCSIOW2)接种到液体培养基中，在温度为 28～32℃，转速为180～250r/min的条件下摇床培养3～10天，得到发酵液；

利用乙酸乙酯对发酵液进行萃取，分离，得到化合物Malformin C。

本发明提供化合物Malformin C的应用及制备方法，利用曲霉菌丝CCTCC NO:M2015628制备溶藻活性化合物Malformin C，可以抑制赤潮中藻类的生长，使藻类细胞停止生长，甚至杀灭藻类细胞，以对大量爆发的赤潮进行治理。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。

图1是本发明实施例制备得到的化合物Malformin C的化学结构示意图；

图2是本发明实施例Malformin C对卡顿藻细胞数的影响的统计直方图；

图3是本发明实施例Malformin C对血红哈卡藻细胞数的影响的统计直方图；

图4是本发明实施例Malformin C在不同浓度下120分钟对卡顿藻与血红哈卡藻的抑制率图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例一种化合物Malformin C的应用，即，化合物Malformin C应用于抑藻或者杀藻。

本发明提供化合物Malformin C的应用，利用曲霉菌丝CCTCC NO: M2015628制备溶藻活性化合物Malformin C，可以抑制赤潮中藻类的生长，使藻类细胞停止生长，甚至杀灭藻类细胞，以对大量爆发的赤潮进行治理。

本发明还提供一种化合物Malformin C的制备方法，该方法包括：

步骤一、将曲霉菌丝(Aspergillus sp.SCSIOW2)接种到液体培养基中，在温度为28～32℃，转速为180～250r/min的条件下摇床培养3～10天，得到发酵液；

曲霉属真菌(Aspergillus sp.SCSIOW2)，已于【2015年10月21日】保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称：CCTCC，地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M2015628，命名为Aspergillussp.SCSIOW2)。

步骤二、利用乙酸乙酯对发酵液进行萃取，分离，得到化合物Malformin C。

具体地，液体培养基的配方为：质量百分比为3％的海盐、2％的葡萄糖、 1％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物。

具体地，萃取的方法包括：

将发酵液中加入乙酸乙酯，超声萃取10～50min，取上层乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物浸膏。

具体地，对乙酸乙酯层萃取物进行分离的方法包括：

将乙酸乙酯层萃取物浸膏溶于体积比为1:1的氯仿和甲醇的混合液中，并利用Sephadex LH20柱进行层析；

用洗脱溶剂进行等梯度洗脱，依次收集多个馏份，其中，洗脱剂为氯仿和甲醇按照4:1混合后的混合液；

将收集到的馏份进行高效液相色谱柱分离，得到化合物Malformin C。

本发明提供化合物Malformin C的制备方法，利用曲霉菌丝CCTCC NO: M2015628制备溶藻活性化合物Malformin C，可以抑制赤潮中藻类的生长，使藻类细胞停止生长，甚至杀灭藻类细胞，以对大量爆发的赤潮进行治理。

实施例

1、菌种培养

1)、配置LB固体培养基在去离子水中加入质量百分比为2％的琼脂、1％的蛋白胨、0.5％的NaCl、0.5％的酵母提取物，搅拌溶解，调节pH至7.5左右，于 121℃高压灭菌20min。

2)、菌种发酵待培养基冷却至50℃左右，倒平板。待平板凝成，用火灼烧接种环，冷却后挑取曲霉菌丝CCTCC NO:M2015628划平板，并置于隔水式恒温培养箱中28℃培养2-3天，保存于4℃冰箱中。

3)配置液体培养基：在去离子水中加入质量百分比为3％的海盐、2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母提取物，搅拌溶解后，调节pH至7.5左右，分装在锥形瓶，按每瓶约250mL分装于38个1L的锥形瓶中，于121℃高压灭菌20 min。

4)接种待液体培养基冷却至30℃左右，在超净工作台上用接种环从平板中刮取步骤2)中的微量菌落于液体培养基中，在转速为220r/min、28℃的条件下摇床培养7天。

2、活性化合物的提取分离

1)、向上述培养后的锥形瓶的培养产物中加入乙酸乙酯250mL，超声萃取 30min，将得到的上层乙酸乙酯层减压浓缩至干。重复萃取两次后得到乙酸乙酯萃取物浸膏。

2)、取乙酸乙酯萃取物浸膏约2.95g，使用Sephadex LH20凝胶柱色谱 (Pharmacia公司，柱直径3.5cm，柱长90cm)进行柱层析，以氯仿/甲醇(1:1) 溶液为洗脱剂进行洗脱分离，每10mL收集为一个馏份，共得30个馏分。

洗脱完毕后，对各馏分进行TLC检测以确定相似馏分。共得到馏分7，8的混合物700mg，取其中380mg，使用Sephadex LH20凝胶柱色谱(柱直径3.5cm，柱长90cm)进行第二次柱层析，以氯仿/甲醇(4:1)溶液为洗脱剂进行洗脱分离，每9mL收集为一个馏份，共收集36个馏分。

洗脱完毕后，对各馏分进行TLC检测以确定相似馏分。共得到馏分11-14的混合物103.6mg。取上述混合物约100mg,使用色谱纯甲醇1mL溶解进行高效液相色谱柱分离。其中，色谱柱：Angilent ZORBA RX-C18(4.6×150mm)；液相条件：60％MeOH等度洗脱；流速：1mL/min波长：210nm、254nm；柱温： 30℃；进样量：5uL/次。收集保留时间为13.5-15.5分钟的馏分，得到Malformin C 33.4mg。

3、结果测试

1)、对制备得到的产物进行核磁共振测试

上述制备得到产物为白色固体，遇硫酸香草醛试剂不显色。ESI-MS： 552.3[M+Na]⁺。样品使用AVANCE Ⅲ 600MHz超导核磁共振谱仪测定获得¹H、¹³C NMR(DMSO-d₆)数据。经过文献比对，确定化合物为环五肽类化合物 Malformin C，如图1所示的结构。其中，该文献的具体信息为：Kojima Y, Sunazuka T,Nagai K,et al.Solid-phase synthesis andbiological activity of malformin C and its derivatives[J].The Journal ofAntibiotics:An International Journal,2009,62(12):681-686.

上述制备得到的产物的核磁共振测试的数据如下表所示：

表1：化合物的NMR数据

2)、Malformin C的溶藻活性测试

实验藻种包括赤潮常见藻类卡顿藻与血红哈卡藻。使用f/2培养基于光照培养箱进行扩大培养，培养条件:温度20±2℃，光照强度2000lx，光暗周期 12h:12h。

通过浮游生物框对卡顿藻(Chattonella marina)与血红哈卡藻(Akashiwosanguinea)的藻液进行计数，测得藻浓度，摇匀并分装藻液。

用DMSO将Malformin C溶解成200μg/μl样品浓度，然后梯度稀释至100 μg/μL，50μg/μL，25μg/μL，和12.5μg/μL。以1mL/孔取藻液至24孔板中，分别加入1uL以上配制的样品至样品终浓度为200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL， 25μg/mL，12.5μg/mL。

对照组加入1μl DMSO，每个实验组和对照组分别设置3个重复实验，将 24孔板放至光照培养箱中培养，于15min和120min时用浮游计数板计数藻数量。

图2和图3分别显示了实验组和对照组中的样品对卡顿藻和血红哈卡藻细胞数的影响，图4为Malformin C在不同浓度下120分钟对卡顿藻与血红哈卡藻的抑制率，由图2～4可以看出，随着化合物浓度增加、处理时间增长抑藻活性加强，可见，本化合物具有溶藻、抑藻或杀藻活性，可以应用于抑藻和杀藻中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种化合物Malformin C的应用，其特征在于，所述Malformin C应用于抑藻或者杀藻。

2.根据权利要求1所述的Malformin C的应用，其特征在于，所述Malformin C的制备方法包括：

将曲霉菌丝SCSIOW2（Aspergillus sp.）接种到液体培养基中，在温度为28~32℃，转速为180~250 r/min的条件下摇床培养3~10天，得到发酵液；其中，所述曲霉菌丝SCSIOW2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M2015628；

利用乙酸乙酯对发酵液进行萃取，分离，得到化合物Malformin C。

3.根据权利要求2所述的Malformin C的应用，其特征在于，所述液体培养基的配方为：质量百分比为3%的海盐、2%的葡萄糖、1%的蛋白胨、0.5%的酵母提取物。

4.根据权利要求2所述的Malformin C的应用，其特征在于，萃取的方法包括：

将发酵液中加入乙酸乙酯，超声萃取10~50min，取上层乙酸乙酯层减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物浸膏。

5.根据权利要求4所述的Malformin C的应用，其特征在于，对乙酸乙酯层萃取物进行分离的方法包括：

将乙酸乙酯萃取物浸膏溶于体积比为1:1的氯仿和甲醇的混合液中，并利用SephadexLH20 柱进行层析；

用洗脱溶剂进行等梯度洗脱，依次收集多个馏份，其中，洗脱剂为氯仿和甲醇按照4:1混合后的混合液；

将收集到的馏份进行高效液相色谱柱分离，得到化合物Malformin C。

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