JP6671300B2 - Ｔｆｆによる多層コーティング化コアの自動交互積層構築 - Google Patents

Description

［関連出願への相互参照］
本願は、2014年5月27日に出願された米国出願第62/003242号に基づく優先権を主張し、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

本開示は、タンジェンシャルフロー濾過（TFF：tangential flow filtration）による製品の交互積層（layer by layer）（「LBL」）製造等に関する。特に、本開示は、そのような手順そのものの自動化に関するものであり、また製品の製造の規模変更可能性に関するものであり、その製品は例示的な実施形態ではマイクロ粒子ワクチンのようなマイクロ粒子構築物を含む。

一般的に、交互積層技術とは、粒子を含む基質が、交互に起こる高分子電解質（polyelectrolytes）層のような層でコーティングされるものである。米国特許第7,615,530号に記述されるように、静電気的な交互積層多層薄膜は、例えばワクチンとして使用される免疫原性組成物のための構築基盤を提供する。静電気的交互積層（LBL）多層薄膜においては、例えば粒子のような表面上に、反対に荷電した高分子電解質を堆積することが、安定な多層構造を提供する。ポリペプチドエピトープを含むエピトープを、例えばポリペプチドのような荷電高分子電解質に組み入れることができ、ポリペプチドエピトープを薄膜中に組み入れることが可能になる。そのエピトープを含有する薄膜は免疫応答を誘発することに使用され、例えば病原体のような標的からの保護を提供し得る。

静電気的LBL製造のプロセスは本質的に反復性である。それには、マイクロ粒子またはナノ粒子のような固形支持体を高分子電解質の溶液に浸漬し、続いて、例えば透析のような単純な溶媒交換プロセスにより剰余の可溶性高分子電解質を除去することにより、固形支持体の表面をコーティングすることが関わる。一般的に、所望の特性（例えば十分な厚さまたは安定性）を有する交互積層薄膜が達成されるまで、複数の浸漬／除去サイクルが実行される。反復性LBL工程を実行するために多くの技術が使用できるが、そのほとんどは、望ましくない条件を有するか、または自動化することが困難である。LBLプロセスの自動化は非常に望ましい。製品変動の源であることが周知である人的行為に代わるものであるからである。加えて、LBL製品がヒトまたは動物における使用を意図するものである場合には、製品を損傷し得る最終滅菌工程を回避できるように、そのプロセスを無菌条件下で行うことが望ましい。

従って、ヒトおよび動物における使用に適した高品質製品を再現性よく一貫して製造できるLBL技術を使用して粒子をコーティングするための、自動化されたツールおよび方法に対する必要性が存在する。

先行技術の上記およびその他の問題および欠点は、本発明のタンジェンシャルフロー濾過（TFF）による製品の交互積層（「LBL」）構築等により克服および軽減され、これは、マイクロ粒子構築物の製造のためのそのような手順のコンピュータ制御された自動化を含む。

一側面において、基質コア上に堆積された少なくとも1つの高分子電解質層を含む粒子の自動合成のためのシステムは、
TFFループと浸透液バルブ（permeate valve）とを含むタンジェンシャルフロー濾過構成部であって、浸透液バルブはコンピュータ制御を介して浸透工程を選択的に実行するように構成され、TFFループは、基質コアのための粒子貯蔵部、TFFフィルター、および粒子貯蔵部とTFFフィルターとを接続するための手段を含むものと、
可溶性試薬添加マニフォールド構成部であって、可溶性試薬送達マニフォールド構成部からタンジェンシャルフロー濾過構成部への可溶性試薬の送達が、少なくとも1つのコンピュータ制御バルブにより制御され、可溶性試薬は高分子電解質を含むものと
を含む。

本開示の上記およびその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者により認識され理解されるであろう。
例示的な図面について述べるが、ここで、同様の要素は図面においても同様に番号を付けている。

図1Aは、TFF装置を備えた典型的LBLシステムの概略図を示す。

図1Bは、TFF循環ループの概略である。

図2は、Pierce（商標）660nmタンパク質アッセイにより測定された、反復的なPLL追加およびそれに続く浸透のサイクルの際の典型的なTFF循環ループPLL濃度を示すグラフである。

図3Aは、ホモポリマーPLLおよびPGAによるLBLコーティング後のマイクロ粒子上の段階的ゼータ電位測定を示す。交互の極性パターンがLBL実験の成功を示している。

図3Bは、アミノ酸分析（AAA：amino acid analysis）により測定された、典型的な段階的LBL薄膜堆積を示す。

図3Cは、層がホモポリペプチドである典型的な7層粒子バッチの分散を示す。

図4Aは、よく分散された8層粒子の顕微鏡画像を示す。

図4Bは、5.0μmのスケール表示と共に8層粒子の典型的SEM画像を示す。

図4Cは、2.0μmのスケール表示と共に8層粒子の別の典型的SEM画像を示す。

図4Dは、8層LBLマイクロ粒子の製造の際の粒子上で採られた段階的ゼータ電位測定を示し、これはLBL実験の成功を示す交互の極性パターンを有している。

図4Eは、AAAにより測定された、8層LBLマイクロ粒子バッチの製造の際の典型的な段階的LBL薄膜堆積を示す。

図4Fは、AAAにより測定された、8層LBLマイクロ粒子バッチの製造の際の別の典型的な段階的LBL薄膜堆積を示す。

図5は、TFFシステムによる別の典型的LBLを示す。

図6は、組み立てられて図5に示すシステム上に装備されるべき閉ループ管ネットワークの概略を提供する。

図7は、本発明の典型的実施形態による典型的システム図を示す。

図8は、典型的なコンピュータシステム図である。

図9は、本明細書に記述される典型的実施形態による典型的なコンピュータ使用可能媒体である。

図10は、別個のポンプを使用して各試薬をTFFループに送達する、別の典型的TFF式LBLシステムである。「off」の表示は、3方向ピンチバルブがオフ（off）位置にある場合の前方流路を表す。

図11は、図10に示された装置に装備されるように設計された別の閉ループ管ネットワークである。

図12は、手動の遠心分離／吸引／再懸濁法、またはTFF式LBL法のいずれかを使用してマイクロ粒子構築物に組み入れられた、PLL、PGA、およびDPの平均量を示す。

図13は、100 mL規模で7ホモポリマー層LBLマイクロ粒子のバッチを作るために使用された、別の典型的TFF式LBLシステムである（図にコンピュータは含まれていない）。

図14は、100 mL規模で7ホモポリマー層LBLマイクロ粒子のバッチを作るために使用された、実際のTFF式LBLシステムの写真である（図にコンピュータは含まれていない）。可溶性試薬の袋が示されている。

図15は、図13および図14に示された様々なピンチバルブおよびクランプに取り付けられる前に組み立てられ滅菌され得る、使い捨て管ネットワークの概略図である。

図16Aは、100 mL規模で作られた7層LBLマイクロ粒子バッチの製造の際にAAAによって測定された、典型的な段階的LBL薄膜堆積を示す。

図16Bは、100 mL規模で作られた7層LBLマイクロ粒子バッチの製造の際に採取されたサンプルで測定された、典型的な段階的ゼータ電位データを示す。

上記で提供された短い記述および付随する各図面の詳細文に加えて、以下の説明が、本開示の例示的実施態様のさらなる詳細を提供する。しかしながら、開示された特定の形態および特定の細部に例示的実施態様を限定する意図はないことが理解されるべきであり、それよりむしろ、例示的実施態様は、その範囲および特許請求の範囲に収まる全ての改変、等価物、および代替物を包含する。図の説明全体を通して、同様の要素は同様の番号で表す。

本明細書において、様々な工程や計算を記述するために第1、第2、等の用語が用いられ得るが、これらの工程や計算はこれらの用語によって限定されるべきではないことが理解されるであろう。これらの用語は、工程や計算を互いに区別するために用いられるだけである。例えば、本開示の範囲から逸脱することなく、第1の計算を、第2の計算と称することも可能であり、同様に、第2の工程を、第1の工程と称することも可能である。本明細書で用いられる場合、「および／または」という用語は、付随して列記された事項の1つまたは複数のあらゆる全ての組合せを包含する。

本明細書で用いられる場合、単数形の「a」、「an」、および 「the」は、文脈に明らかに反しない限り、複数形も包含することが意図される。「含む」「包含する」（「comprises」、「comprising」、「includes」、および／または「including」）という用語は、本明細書で用いられる場合、言及された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または成分の存在を特定するが、1つ以上のその他の特徴、整数、工程、操作、要素、成分、および／またはそれらの群の存在あるいは追加を排除するものではないことがさらに理解されるであろう。

いくつかの代替的実施態様においては、記載された機能／作用が、図面に記載されたものとは異なる順序で起こり得ることにも留意すべきである。例えば、続けて示された2つの図面、または所与の図面内に示された複数の工程は、関与する機能性／作用に応じて、実際には実質的に同時に実行され得、あるいは時には逆の順序で実行され得る。

以下、本発明の典型的実施形態を詳細に説明する。

交互積層（「LBL」）構築とは、反対に荷電した高分子電解質（ポリペプチドを含むがそれに限定されない）の交互の層から多層薄膜が製造されるプロセスである。高分子電解質多層薄膜は、従って、反対に荷電した高分子電解質の交互の層から構成される薄い複数の薄膜（フィルム）である（例えば、2〜3ナノメートルから数マイクロメートルの厚さ）。そのような薄膜は、適切な基質、例えば平坦基質または基質コア上における、交互積層の会合（assembly）によって形成され得る。静電気的交互積層（LBL）自己会合では、高分子電解質の会合の物理的原理は静電気的引力である。連続して層が堆積するごとに薄膜の表面電荷密度の極性が逆になるために、薄膜の集積が可能となる。ポリペプチド層を含有するマイクロ粒子構築物のLBL会合は、例えば米国公報第2012/0009254号に記述されており、これはポリペプチドを含有するLBL薄膜の開示に関して参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における典型的プロセスは荷電ポリペプチド層を利用するが、ポリペプチド以外の荷電高分子電解質も利用できる。

本手順によれば、LBL会合は、高分子電解質の溶液に基質コアのような固形支持体を浸漬することによって進行する。固形支持体は、正または負いずれかの実効表面電荷（net surface charge）を帯びており、高分子電解質は、固形支持体とは逆の実効電荷を帯びている。静電気的引力に誘導されながら、第1の高分子電解質が固形支持体表面上に会合する。十分な第1の高分子電解質が表面に吸着した場合、その表面は、第1の高分子電解質の極性（正または負いずれか）を呈するようになる。その状態が達成されたら、固形支持体を、第1の高分子電解質とは実効電荷が逆である第2の高分子電解質に浸漬することができる。第2の高分子電解質は静電気的引力によって固形支持体の表面上に会合し、十分な高分子電解質が吸着されると、固形支持体の実効表面電荷は先のものに戻る。上記工程は、所望の特性（例えば十分な厚さまたは安定性）を有するLBL薄膜が構築されるまで反復され得る。表面極性（表面電位あるいはゼータ電位と通常呼ばれる）の段階的反転は、動的光散乱（DLS：dynamic light scattering）のような分析技術によって監視され測定され得る。典型的な静電気的LBL薄膜構築についての、DLS測定による段階的な電位（ミリボルト（mV）表示）のグラフを図3Aに示す。下記に提示する典型的LBL構築物のほとんどは、7または8の高分子電解質層を有するが、高分子電解質層を2まで少なくしたり50以上まで多くした構築物も可能であることが理解されるべきである。

LBL会合の際に、固形支持体の表面を飽和させるために過剰の可溶性高分子電解質を用いることが通常の慣行である。反対に荷電した次の高分子電解質を導入できるようにする前に、浸漬溶液から、前の剰余高分子電解質を除去する必要がある。この作業を達成するためには、透析、減圧濾過、陽圧濾過、遠心分離後の吸引、その他を含め、様々なやり方がある。これらの技術は全て、製造過程における使用を望ましくないものにする様々な欠点を有している（特に、製品がヒトまたは動物における使用を意図したものである場合）。

透析の場合は、例えばマイクロ粒子またはナノ粒子であるLBL固形支持体を、各々のLBLコーティング工程の後に透析膜バッグまたは透析カセットに入れる必要が生じる。そのようなプロセスは面倒であり、時間がかかり、大きな規模で実行することが難しい。また、無菌条件下でそれを行うことも難しい。

膜濾過装置における反復的LBLプロセシングは文献に記述されている。このプロセスでは、基質コア懸濁液（例えばマイクロ粒子懸濁液）が、小さなポアサイズのフィルター膜上で穏やかに撹拌される。バッファーおよび可溶性試薬は、下方からの真空陰圧または上方からの圧縮ガスによる陽圧のどちらかによって膜を透過する一方、粒子は膜上に保持される。撹拌の目的は、粒子がケーキ層を形成することを防ぐこと、および粒子が膜に滞らないようにすることである（それは膜のポアを詰まらせ得る）。このプロセスは最小限の粒子凝集で行うことができるが、各工程が遅く面倒であり、また、このプロセスは大きな規模では実用的でない可能性が高い。

遠心分離後の上清の吸引およびバッファーへの再懸濁は、特に実験室においては、基質コア上のLBLを実行するためによく使用される技術である。これは、一般的に利用可能な広範な遠心分離機を用いて遠心分離チューブ中で行うことができるため、このアプローチの利点はその単純さにある。残念ながら、遠心分離の際の基質コアの圧縮化は、しばしば凝集につながる。さらに、遠心分離プロセスのスケールアップ化は、一般に、多数のチューブを並行して処理することを要する。この処理は手間がかかり、化学的および生物学的な汚染の可能性を生じさせる。

要約すると、基質コアの懸濁物について反復的LBLサイクルを行うために現在利用可能な方法は、凝集の傾向、時間のかかるバッファー交換工程、過剰な手間および／または工程間の粒子の移動、ならびに汚染の可能性を含む、1つ以上の望ましくない不利点を有している。さらに、発明者らの知る限り、上記方法はこれまで手動でのみ実行されてきており、大規模化および／または自動化することが困難である。このことはオペレーターに起因する変動性およびオペレーターエラーの可能性を増加させる。従って、オペレーターの直接的な関与を最小限にして閉じた系においてLBL粒子を合成するための規模変更可能なアプローチに対する必要性が存在する。

タンジェンシャルフロー濾過（TFF）は、横行性（transverse）フロー濾過としても知られるが、サイズの違いに基づいて液状混合物中の種を分離するための、確立された技術である。TFFにおいては、混合物は膜（メンブレン）表面を横切って循環されるか、または、わずかな陽圧下で中空の繊維フィルターを通して循環される。本明細書において、TFF膜およびTFF繊維フィルターという用語は互換的に使用される。この膜は規定されたサイズ範囲のポア（小孔）を含み、これが、溶媒がポアを通って混合物の流れに対してタンジェント方向に移動することを可能にする。ポアサイズより大きい溶解または懸濁された種（例えばタンパク質、粒子、または細胞）は保持される。膜のポアを通して浸透していく溶媒を持続的に補充することにより、混合物の体積を著しく変えることなく、ポアサイズより小さい種あるいは溶質が混合物から効率的に除去される。ポアサイズを慎重に選択することにより、TFFを使用して、タンパク質から低分子量溶質を、細胞から可溶性タンパク質を、あるいはマイクロ粒子およびナノ粒子から可溶性ポリマーを分離することができる。

TFF分離は、二次元的膜を使用して実行でき、その上を混合物が通される。あるいは、円筒状の繊維フィルターを使用して分離を実行することもできる。混合物はその円筒の内側表面を通して押し入れられる。圧力差に助けられて、溶媒は、小さな溶質を伴いながら、混合物の流れに対してタンジェント方向に繊維ポアを透過する一方、ポアサイズより大きい溶質または粒子は円筒内に保持される。円筒型繊維フィルターの一つの利点は、複数の繊維を並行に束ねて、合計フィルター表面積を増加させて浸透効率の上昇またはスケールの拡大を得ることができることである。繊維束またはその等価物は、一般的に、混合物がそこを通ってフィルターに入ることができる入口ポート（図1における21）、保持された画分がそこを通ってフィルターから出ることができる出口ポート（図1における23）、および浸透液がそこを通ってケースから出ることができる浸透液ポート（図1における29）を含むケースに収納される。

TFFの際に好まれる一つの慣習は、濾過が行われている混合物を連続的にフィルターを通して再循環させることである。これを達成するための便利な方法は、フィルターを含む循環系路を通して混合物を推進させることである。最も一般的な推進の方法はポンプによるものであり、例えば蠕動ポンプによるものである。この経路は、管（チューブ）、ホース、パイプ、あるいは類似の伝導手段から構成され得る。ほとんどの場合、濾過が行われる混合物の体積はフィルターの体積容量を超えるため、どの時点においてもフィルターを占めるのは混合物の一部分のみである。この経路は、追加的な体積を提供し下記においてより詳細に説明するように他の機能にも供される容器（vessel）も含み得る。本明細書において、この容器は、貯蔵部、より具体的には粒子貯蔵部と呼ばれる。TFFフィルターと貯蔵部は接続手段（例えばチューブ）と共に循環経路に組み入れられ得、この集合体を本明細書ではTFF循環ループと呼ぶ。TFF循環ループの一例を図1Bに示す。

TFF循環ループは、任意で他の要素によって補強され得る。例えば、ポンプ、弁（バルブ）、マルチバルブ、ポート、経路枝分かれポイント、計量器、測定器（圧力計を含む）、および特定のアプリケーションで必要とされる他の部分が挙げられる。並行もしくは一連に配置された複数のTFFフィルター、または複数のポンプ、または並行もしくは一連に配置された複数の貯蔵部を含むこともできる。TFFループとその様々な補強要素は本明細書においてTFF装置と呼ばれ、あるいは任意でTFF構成部と呼ばれ、一例が図1の項目12として示されている。下記においてより詳細に説明するように、TFFポンプ、およびプロセスの様々な側面を制御する1つ以上のバルブは、TFF循環ループの外部にあってもよい（すなわち、ループを通る混合物と直接接触することがない）。

TFF膜または繊維フィルターのポアを透過し循環ループを出る溶媒の画分は、浸透液（permeate）と呼ばれる。浸透液は多くの場合、溶質を循環ループから運び出すが、ただしそれら溶質がTFF膜のポアを透過できるほど十分に小さいことが条件である。上述したように、TFFフィルター繊維は通常ケースに入れられており、従って浸透液はケース内に集められ出口を通って排出され得る。出入口を通る浸透液の流れは、バルブまたはクランプを用いて制限または停止され得る。本明細書において、TFFフィルターからの浸透液の流れを制御するバルブは、浸透液バルブと呼ばれ、一例が図1の項目28として概略的に示されている。

TFFループに加えて、本明細書に記述されるタンジェンシャルフロー濾過装置は、浸透液バルブを含み、その浸透液バルブは、コンピュータ制御を介して浸透工程を選択的に実行するように構成される。

浸透は、TFF膜のポアを通過することによりTFF循環ループから溶媒が除かれるプロセスである。浸透は、浸透液バルブ（例えば図1における28）が開放されTFF膜を挟んで圧力差が存在する場合に起こる。膜を挟んだ圧力差は経膜圧（TMP：transmembrane pressure）と呼ばれる。TFF循環ループポンプにより、フィルターの上流管腔側に陽圧が産生され、これが浸透を引き起こすために十分であり得る。しかしながら、多くの場合、望ましい速度の浸透を発生させるためには圧力を増加させる必要がある。これは、循環ループ中に狭窄を導入することにより達成され得る（図1における22）。例えば、TFFフィルター（図1における20）の下流の循環チューブを部分的に挟むと、TMPの上昇が引き起こされ、浸透速度の上昇が引き起こされる。

一側面において、タンジェンシャルフロー濾過構成部は、特定の高分子電解質堆積サイクル工程のあいだにフィルターを通過する浸透液の量を測定しそのデータを制御コンピュータに送り返す、計量装置を含む。例えば、コンピュータ制御は、ユーザーにより指定された量の浸透液を測定すると高分子電解質堆積サイクル工程を自動的に終了させ得る。任意で、その指標は、タンジェンシャルフロー濾過ループを出る浸透液の量を連続的に測定する電子的計量器からの信号の形態をとる。

浸透液バルブが開けられ、かつ新たな置換バッファーが導入されない場合には、除去される浸透液の量により系の体積が減少する。これはしばしば濃縮工程と呼ばれる。浸透のあいだ新たなバッファーが連続的に系に導入される場合には、系の体積はほぼ一定に維持される。これはしばしば、バッファー交換工程あるいは洗浄工程とよばれる。

TFF膜を透過せず循環ループに保持される溶媒、溶質、および懸濁粒子の画分は、保持量（retentate）と呼ばれる。保持量は、出口、例えば図1の23を介してTFFフィルターから出て貯蔵部に帰ることができ、TFFフィルターを通って再循環され得る。

循環ループを通る溶媒、溶質、および懸濁固形物の連続的移動は、再循環と呼ばれる。この移動は、ポンプ、例えば蠕動ポンプ（例えば図1の18）により駆動される。溶媒が可溶性高分子電解質と懸濁基質（例えばマイクロ粒子）との両方を含有する場合には、これはLBLコーティング工程とも呼ばれ、あるいは任意で堆積工程と呼ばれる。高分子電解質（例えばホモポリペプチド）の基質コアへの吸着とそれに続く剰余高分子電解質の除去が、LBLサイクル、あるいは高分子電解質堆積サイクルを構成する。

本明細書において、溶媒は、溶質もしくは懸濁粒子、もしくは細胞、またはこれらの組合せの混合物を様々な経路を通して運ぶ液体または液体混合物として定義される。溶媒は多くの場合水性緩衝液であり、一般的には中性pHであるかまたは中性pHに近い。本明細書において、溶媒および緩衝液（バッファー）という用語は互換的に使用される。

TFF浸透バルブが閉じられた場合には、混合物は、管中を、貯蔵部からポンプを通りTFFフィルターを通り貯蔵部に戻って、すなわちTFF循環ループを通って、再循環することができ、多くの場合そのように再循環する。ほとんどの応用において、循環ループは、経膜圧を調節するための装置も通過する。連結部とバルブを使用して、効率的かつよく制御された態様で試薬を循環ループに導入することができる。例えば、高分子電解質またはポリペプチドの濃縮溶液が、このような態様で循環ループに送達され得る。試薬溶液は、再循環の動力学によりTFFループ全体に迅速に分散され、分散は貯蔵部の機械的撹拌により補助され得る。従って、循環ループは、混合物に対して化学的工程を行うこと、例えば、可溶性高分子電解質でマイクロ粒子をコーティングすることのための、便利かつ望ましい環境である。

TFFの鍵となる特徴は、循環ループ内の溶質および／または粒子が所望により定常的移動状態に維持され、かつそれが制御されたほぼ一定の体積で維持されることである。LBL製造の際にナノ粒子またはマイクロ粒子に高分子電解質を吸着させるという特定の応用においては、これが粒子表面の均等なコーティングを促進するため有利となる。それはさらに、粒子が互いに付着すること、および望ましくない凝集物を形成することを防ぐ一助となる。任意で、タンジェンシャルフロー濾過構成部は、TFF循環ループ体積データを制御コンピュータに報告するように構成された体積計量装置を含む。この実施形態では、システムは、バルブまたはマルチバルブを稼働して、試薬の追加により体積を増加させるかまたは浸透により体積を減少させることにより、タンジェンシャルフロー濾過構成部内部の混合物のループ体積を、設定された範囲内に維持するように構成された、制御コンピュータを任意で含む。

TFFのもう一つの鍵となる側面は、操作される混合物が、貯蔵部からポンプを通りTFFフィルターを横切りそして貯蔵部に戻って、ループ中を再循環することである。例えば蠕動ポンプの場合のように、ポンプが流れの外部にあってループの内容物と直接接触しない場合には、塵、化学物質、またはウイルス粒子、真菌もしくは細菌等の生物学的混入物のような外来混入物から混合物が保護される。同様に、ピンチバルブの場合のように、混合物の方向を制御し、経膜圧を調節し、浸透液を放出する様々なクランプおよびバルブが流れの外部にあれば、それらもまたループの内容物から物理的に分離され混合物は外来混入物から保護される。従って、TFF循環ループ貯蔵部、TFFフィルター、および接続手段は、その内容物が保護される閉鎖系を構成し得る。例えばヒトまたは動物における使用に適した製品を作るために、無菌条件下でTFF式LBLを行うことを望むのであれば、そのような閉じたループを構築して、それから熱、放射線、または化学物質を用いた処理により滅菌することができる。その無菌閉鎖ループはそれからTFFポンプおよびバルブに装着される。このアプローチの大きな利点は、無菌環境を達成するためにはループ材料のみが滅菌を要し、外部機器は滅菌を要しないことである。

下記においてより詳細に説明するように、TFFによりLBLを実施する目的のために、少なくとも1つのコンピュータ制御バルブを使用して、1つ以上の様々な試薬が、可溶性試薬添加マニフォールド構成部からTFF循環ループへと分配される。試薬送達は、様々なバルブおよび1つ以上のポンプによって制御される。やはり、ピンチバルブと蠕動ポンプが使用される場合には、それらは試薬と直接的には接触せず、試薬は外部混入物から保護される。試薬を運ぶ管ネットワークおよび試薬を保持する様々な容器は、組み立てられ、適切な処理によって滅菌され、それから試薬添加マニフォールド機器に設置され得る。本発明の主要な一実施形態は、試薬送達マニフォールドがTFF構成部に接続されることである。この接続は、試薬マニフォールドの排出物をTFF循環ループの一部分（例えばTFF貯蔵部）へと運ぶ単純なチューブまたはホースであり得る。

LBLを実施するためのプラットフォームとしてのTFFの使用は、他のアプローチに対してもう１つの利点を有すると見られる。例えば、薄膜に堆積されるホモポリペプチドPLLおよびPGAの量は、手動の遠心分離／吸引／再懸濁法を使用して観察されるものと比べてTFF法では100%〜250%高いことが複数の実験により示されている。TFFによるLBLのより高い効率は、一般的な現象であると見られ、実施例4および図12に示されている。より高い効率は、いくつかの理由で望ましい。第一に、ポリペプチド高分子電解質は高価である。これらの貴重な試薬をよりよく薄膜中に捕えることは、浸透液に失われ最終的に捨てられるペプチドがより少ないことを意味する。第二に、薄膜の安定性は薄膜堆積の程度（薄膜厚といわれることもある）と相関することが、非ペプチド高分子電解質の研究からよく知られている。より厚い薄膜は、より長い保存寿命および生物学的意義のあるその他の特性を有することが予測される。加えて、より効率的なLBLは、所望の薄膜厚がより速く達成され、TFFプロセスによる反復的LBLをおそらく1サイクルあるいは数サイクル分だけ短縮することが可能になることを意味する。TFFプロセスによるLBLの自動化は、薄膜堆積をより予測可能かつ再現可能にすることにより、この利点の影響を拡大させる。

関連する部分において、本開示は、タンジェンシャルフロー濾過（TFF）（横行性フロー濾過等としても知られる）による製品のLBL構築に関する。特に、本開示は、そのような手順そのものの自動化に関し、製品の製造の規模変更可能性に関し、その製品は、典型的実施形態では、マイクロ粒子性およびナノ粒子性構築物を含む。

下記において記述されるように、所望のマイクロ粒子性製品を提供するために、コンピュータシステムに従って、1つ以上の様々な試薬が、コンピュータ制御を用いてTFFループ中（例えば図1の貯蔵部16）に分配される。典型的実施形態において、TFF式LBLプロセスは、高品質マイクロ粒子ワクチン構築物を調製するために使用されるが、言うまでもなくこれは単に例示的な製品である。

典型的な実施形態では、各LBLサイクルは、コンピュータ制御下で行われる。全ての試薬分配が、自動化される、すなわち直接的なユーザー行為を伴わないものとして企図されるが、所望であれば、いくらかのユーザー介入が企図され得ることに留意すべきである。例えば、ユーザーは、別の目的（例えば、プロセスを継続させる前に、ある工程が満足に完了したことを確認するための分析のためにサンプルを採取すること）のためにプロセスを一時停止させることを望むかもしれない。

本開示では、プロセス、方法、およびシステムを、自動化または半自動化TFF式LBLと呼ぶが、これは1つまたは複数の工程がコンピュータ制御されることを意味する。

一側面では、タンジェンシャルフロー濾過構成部および前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部が、複数の反対に荷電した高分子電解質層を含有する多層薄膜の自動交互積層形成を実行するように構成され、ここで、少なくとも1つの高分子電解質堆積サイクルが、タンジェンシャルフロー濾過浸透工程のコンピュータ制御により、および前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部からの複数の試薬の送達のコンピュータ制御により、少なくとも部分的に自動化される。

具体的には、一側面において、基質コア上に堆積された少なくとも1つの高分子電解質層を含有する粒子の自動合成のためのシステムが、
TFFループおよびバルブを含むタンジェンシャルフロー濾過構成部であって、前記バルブはコンピュータ制御を介して浸透工程を選択的に実行するように構成されており、前記TFFループは、基質コアのための粒子貯蔵部、TFFフィルター、および前記粒子貯蔵部と前記TFFフィルターとを接続するための手段を含む、タンジェンシャルフロー濾過構成部と、
可溶性試薬添加マニフォールド構成部であって、前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部から前記タンジェンシャルフロー濾過構成部への可溶性試薬の送達が少なくとも1つのコンピュータ制御バルブにより制御され、前記可溶性試薬が前記高分子電解質を含む、可溶性試薬添加マニフォールド構成部と
を含む。

そのような態様では（ただしそれが本開示を限定するべきではないが）、2つの主要な構成部すなわちTFF循環ループと可溶性試薬添加マニフォールドとを含むものとして装置を考えることが有利となり得る。ここで図1を参照すると、そのような分割が見られ、TFFループは12において概略的に図示されており、試薬送達マニフォールドは14において概略的に図示されている。

一側面において、浸透液バルブおよび可溶性試薬添加マニフォールド構成部のコンピュータ制御されたバルブは、完全に自動化される。本明細書において、完全に自動化されたバルブとは、コンピュータ制御下でそしてユーザーによる始動なしで作動する、例えば開くあるいは閉じる、電子作動バルブである。

具体的には、本明細書に記述される実施形態において、図1を参照すると、典型的TFFループは、粒子貯蔵部16、TFFポンプ18、TFFフィルター20、TMP圧力制御装置22を含み、ループは貯蔵部16に戻る。浸透液バルブ28は、TFFフィルターから廃液容器26への浸透液の放出を制御する。典型的な実施形態において、TFFに付随するコンピュータが、フィルター圧および浸透液体積を監視し、そして装置に選択的に指示を出し得る。この図示された典型的実施形態におけるように、TMPから貯蔵部への経路は、サンプルポート24を含み得る。

一側面において、システムは、粒子の合成のための連続的流路を提供する。任意で、このシステムにおける浸透液バルブ、可溶性試薬添加マニフォールド構成部のコンピュータ制御されたバルブ、および任意のポンプは、連続的流路に対して外部にある。すなわち、これらの構成部は、TFF循環ループの内容物あるいは添加マニフォールドから送達される可溶性試薬と直接接触しない。連続的流路は、TFFフィルター、粒子貯蔵部、および接続手段から構成される。連続的流路は、任意で、チュービングセグメントおよび連結部（試薬をTFF循環ループに接続する3方向連結部を含む）を含む。図6、図11、および図15に示した閉ループ管ネットワークの例は、連続的流路の例でもある。

典型的な実施形態において、TFFループ12はCaCO₃粒子懸濁液で満たされ、これはプロセス全体を通して定常的な再循環モードに維持される。ループを通した粒子の流れにより生じる乱流が、よく分散された懸濁液を維持するために十分であり得る。あるいは、良好な分散を確保するために、粒子貯蔵部において懸濁液の機械的撹拌を加え得る。

可溶性試薬送達マニフォールド構成部からタンジェンシャルフロー濾過構成部への可溶性試薬の送達は、少なくとも1つのコンピュータ制御バルブによって制御される。図1において、コンピュータ制御バルブは(44)におけるV5である。一側面において、可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、複数の試薬の送達のための複数のコンピュータ制御バルブを含む。複数の可溶性試薬は、例えば、反対に荷電した高分子電解質を含む。ある側面において、可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、廃液、タンジェンシャルフロー濾過構成部、またはその両方への、洗浄バッファーのコンピュータ制御送達を含む。

LBL工程の前に手動で、あるいは典型的実施形態においては自動的に、導入され得るCaCO₃マイクロ粒子懸濁液の他に、段階的TFFの際に可溶性試薬添加マニフォールド構成部を介して添加される可溶性試薬は、例えば、濃縮高分子電解質ストック溶液、および洗浄バッファーであり得る。

（部分的にまたは全体的に自動化された）可溶性試薬添加マニフォールド構成部からTFF循環ループへと試薬を推進させる方法は複数あり、それらにはポンプ、重力、シリンジ、または加圧ガスが含まれる。これらの方法のうち、蠕動ポンプと重力は、無菌閉ループシステムとの良好な適合性を提供する。一側面では、可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、1つ以上のコンピュータ作動バルブを含む経路を通して可溶性試薬を粒子貯蔵部へと推進させるように構成された、少なくとも1つのポンプを含む。

試薬送達のために蠕動ポンプを使用する場合、各試薬について別個のポンプを使用するか、または、各試薬について、別個のポンプヘッドを有する単一ポンプもしくは単一ポンプヘッド上の別個チャンネルを使用することができる。別個のポンプを用いることの利点は、それぞれのものを他のものとは独立して作動することができ、ポンプ速度を独立に変動させ得るということである。別個のポンプを用いることの主たる短所は、そのコスト、サイズ、および個別の電子制御の必要性である。複数のヘッドまたは複数のチャンネルを有する単一ポンプを用いることの主たる利点は、試薬送達マニフォールドに追加する必要がある別個のポンプの数を減少させることである。これは装置のコストおよび全体的サイズ、プロセスの潜在的故障源を減少させるだけでなく、電子的設計およびコンピュータ制御指令を単純化させる。複数チャンネル構成においては、試薬をループ内で所望の速度で再循環させることができ、1つまたは複数のピンチバルブを一定時間開くことにより所望の時点で所望の量だけTFFループに送達することができる。これら2つのアプローチは互換的であり、実施者が目的に最も適したものを選ぶことができることが理解される。

典型的な実施形態に関して、そのシンプルさおよび異なるチューブサイズと材料への適合性のために、電動ピンチバルブ（例えばコール・パーマー社の2方向および3方向バルブ）が企図される。さらに、ピンチバルブは、管内を通って移動する溶液と接触することがなく、従って管の内容物を汚染し得ない。ピンチバルブは、約1 mLから100 Lまでの体積の送達または循環を制御するために秀でたバルブである。約0.1 L〜1000 Lあるいはそれを超えるより大きな体積の制御のためには、異なる設計のより大きなバルブで代えることができる。2方向バルブは、オン（On）とオフ（Off）、あるいは開と閉のあいだで切り替わる。慣習的に、2方向バルブを通るチューブは、オフの場合に締められ、または閉じられ、オンの場合に締められず、または開かれる。バルブにDC電力を供給することによりバルブはオンにされ、これは中継基板により、そして所望であればコンピュータにより、容易に制御される。3方向バルブでは、チューブを2つの方向のいずれかに分けるT連結部またはY連結部が存在する。バルブがオフのときは、1つの方向がピストンで締められて閉じ、他方の方向が開く。DC電力を供給することによりバルブがオンにされたときは、ピストンが動いて、第1のラインを開き第2のラインを閉じる。

一側面において、可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、送達される、あるいは送達されない可溶性試薬の体積または重量を表示するように構成された試薬計量装置を含む。計量装置は、任意で、可溶性試薬送達の時間および量を記録する目的のためにコンピュータにデータを送信するように構成される。

中継基板、電源、および蠕動ポンプは、典型的な試薬送達マニフォールドのために有用である。ピンチバルブがコンピュータで制御されるようにする、様々なピンチバルブの配線は、適切な電気的および技術的技能を有する人が、容易に利用可能な電子工学備品を使用して組み立てることができる。バルブと、バルブを動かすために必要なDC電力は、マルチチャンネル中継基板に配線され、次いでそれがUSBケーブルを介してコンピュータに接続する。中継基板とともに売られている容易に入手可能なソフトウェアを使用して、中継基板に送られる一連の指令が書かれ、それが特定のバルブを所望の時間系列でオン（On）またはオフ（Off）にする。

以下に、試薬送達のための可能な例示的構成を説明する。

反対に荷電したホモポリペプチド（HP：homopolypeptide）であるポリ-L-グルタミン酸（PGA：poly-L-glutamic acid）（図1における32）とポリ-L-リジン（PLL：poly-L-lysine）（図1における34）の送達に関し、1つの選択肢は、二重ポンプヘッドを有する単一の蠕動ポンプである（36）。これらのポンプヘッドは対になっているため、同じ速度で作動し、それぞれのヘッドが対応する試薬を所望の流速で押し出す（これは単に例示的な実施形態であることに注意）。各試薬のために2つの3方向バルブを使用して（例えば、PGAはバルブV3およびV4（図1における31および33）で制御され、PLLはバルブV1およびV2（図1における35および37）で制御される）、二重ヘッドポンプがTFFプロセス全体を通して単一速度で作動され得る。

LBLサイクルを開始する前に、HPすなわちPLLおよびPGAを運搬するラインがHPストック溶液でプライミング（装填）され得る。プライミングは、3方向バルブV1〜V5（31、33、35、37、44）を交互に開きそして閉じるコンピュータ指令によって達成される。

典型的な事例では、HPストックは、ほとんどの時間、ポンプヘッドを回って通る短いループを通して再循環している。次のLBL工程のためにHP溶液のアリコートが必要とされるときに、そのポンプヘッドについての3方向バルブがメインマニフォールドへと切り替えられ、試薬のボーラス量がTFFループ粒子貯蔵部（図1における16）に送られる。図1を参照すると、バルブV1〜V4（31、33、35、37）がオフに切り替えられているときには、ライン中の溶液はループを通って再循環している。TFFループへのPLL溶液アリコートの送達が必要とされるときには、バルブV1、V2、およびV5（35、37、44）がコンピュータ制御により作動され、出口を通って粒子貯蔵部へと流れるようにPLL溶液を方向転換させる。正しい量が送達されると、バルブはオフに切り替えられ、PLLは再循環モードに戻る。このアプローチの利点としては、コンピュータからポンプへ指令することなく、設定された速度で動く単一のマルチヘッドポンプを使用して4つまでの別個の試薬を送達することができるという事実が挙げられる。

所望の量の試薬が再循環ループに送達されるか否かを決定する要素は、ポンプの速度、管の直径、必要なポンプが送達のため開けられる時間の長さ、および、ポンプから再循環ループへの経路の長さである。この最後の要素は、しばしばデッドボリュームと呼ばれ、試薬送達のための方法を開発する場合に検討し考慮しなければならない。一般に、デッドボリュームは、試薬が循環ループに向けられるときに洗浄バッファーによって満たされあるいはプライミングされ、添加工程の際にV5およびV6（図1における42および44）によって試薬溶液で置き換えられる。この体積は、バッファーによってループへと送られるか、または、やはりバッファーによって、廃液容器に追い出され得る。一般に、デッドボリュームは、再循環体積を無用に希釈しないように廃液に流し出されるが、ただしそれが例えば化学合成されたポリペプチドのような特に高価な試薬である場合は除く。この場合は、それは適切なバルブを作動することによりバッファーで循環ループへと押し出すことができる。具体的なアプリケーションのために実用的であるような短い管長または小さい径の管を使用することによりデッドボリュームを最小限にし得る。ある事例では、デッドボリュームは、送達される全量のうちの小さな量、例えば1%〜5%に相当するだけであり得、無視できる場合もある。正確な体積の試薬が送達されることを確実にするために、ポンプ速度およびバルブは較正される。典型的には、ポンプ速度は、HP送達が短い時間（典型的には1分間未満）で達成され得るように選ばれる。例えば、PLLの 5.0 mLのアリコートが望まれる場合には、便利なポンプ速度は1分間あたり40 mL（1秒間あたり0.667 mL）を送達するものであり得る。そのポンプ率では、バルブV1、V2、およびV5（図1における35、37、44）が7.5秒間開かれると5.0 mLが貯蔵部に向かう経路へと送達されることになる。もちろん、貯蔵部に到達する実際の量は、経路途中のデッドボリュームのために5.0 mL未満となり得る。測定されたデッドボリュームがもし1.0 mLであるならば、バルブが開かれる時間を9.0秒に増加させることができ、そうすれば5.0 mLが貯蔵部に到達し、1.0 mLはデッドボリューム経路中に残り、最終的に廃液へと流し出される。あるいは、上述したように、送達体積と比べて取るに足りなくなるところまでデッドボリュームを最小限化することができる。

有利なことに、可溶性試薬（例えば高分子電解質）はタンジェンシャルフロー濾過構成部に送達されよく混合されて、高分子電解質濃度が予測可能かつ再現可能になる。システムのテストの際に、送達される実際の体積を任意で測定して、望まれる量とポンプ速度および／またはバルブ開放時間が相応に調節されていることを確認する。一般に、高分子電解質の送達を所望の量の+/-20%以内に較正することは簡単なことである。事実、+/-10%以内、あるいは+/-5%以内の正確度さえも容易に達成可能である。上述したように、例えばHPによる基質のLBLコーティングは、基質がHPで飽和でされるように、しばしば過剰のペプチドを用いて行われる。飽和条件下では、LBLコーティング工程の際に堆積されるHPの量は、HP溶液の濃度の変動に比較的影響されにくい。従って、製品の品質にとって試薬送達の正確度は多くの場合重要ではなく、約+/-20%の送達正確度が十分であり得る。他の工程、特に堆積が飽和未満の濃度で行われる工程については、より高いレベルの正確度が必要となり得る。いくつかの側面において、望まれる高分子電解質（例えばポリペプチド）の濃度は約0.2〜2.0 mg/mLである。

上記では二重ヘッドポンプおよび再循環ループを記述しているが、本明細書では、他の実施形態、例えば各試薬のために個別ポンプを設けること、再循環ループをなくすこと等々も企図される。より大きな製造規模においてはそのような構成が好ましくなり得る。どちらのアプローチについても鍵となる側面は、コンピュータ制御下で正しい試薬が所望の時間において所望の量でTFF循環ループ送達されることである。

TFF循環ループ（図1における12）は試薬送達マニフォールド（14）に連結される。この連結はループに沿ったどこにおいてでも起こり得、本発明のこのバージョンにおいては、連結はTFF貯蔵部（16）にある。TFF循環ループは、様々な入手可能な部品から当業者によって組み立てられるか、または販売会社から完全ユニットとして購入され得る。適切なシステムがSpectrum Labs（カリフォルニア州ランチョドミンゲス）またはPall Corporation（ニューヨーク州ポートワシントン）によって販売されており、これらのシステムは幅広い規模において稼働できる。例えば、Spectrum Labsによって販売されているKrosFlo（登録商標）Research IIシステムは0.002〜10 Lの規模に適している一方、KrosFlo（登録商標）Pilot Plusシステムは10〜5000 Lの規模に適している。

図1を参照すると、TFF装置の典型的構成要素は、TFFポンプ（18）、経膜圧装置（TMP、22）、浸透液バルブ（28）、ならびに、TFFフィルター（20）あるいはフィルター膜、浸透液出口（29）および粒子貯蔵部（16）を含むTFF循環ループである。TMP装置は、TFFフィルターの内側表面と外側表面との間の圧力差を創出し、フィルター繊維あるいは膜を横切る浸透液の流れを増強する。TMPを所望に応じて上昇または低減させて、小孔を通る浸透液流の率を上昇または低減させることができる。浸透液流の率は、しばしばフラックス率と呼ばれ、単位時間あたり、単位フィルター表面積あたりの単位体積に関して測定される。例えば、1時間あたり1平方メートルにつき1.0リットル（L/m²/h）あるいは1.0 LMHのフラックス率は、表面積1.0 m²の繊維フィルターが1.0時間に1.0 Lの浸透液を生じることを意味する。

浸透液ポート（図1の29）およびバルブ（28）は、浸透液がTFF循環ループを出ることを可能にする。浸透液バルブが閉じられたときには、TFFシステムの内容物は再循環し体積は通常一定に維持される。再循環体積はしばしば保持量（retentate）と呼ばれる。TFFループ体積とも呼ばれる。バルブが開けられたときには、浸透液がTFF繊維フィルターの小孔（図1の20）を通過することが可能となる。さらなる試薬またはバッファーがシステムに追加されないときには、保持量の総体積は、システムを出る浸透液の量によって減少する。これは濃縮工程と呼ばれ、HP溶液、DP溶液、またはバッファーの追加により増加したかもしれない総システム体積をLBLの際にその所望レベルに戻すために有用である。

TFFポンプは、TFF循環ループを通して保持量を移動させる。多くの場合それは調節可能なポンプ速度を有する蠕動ポンプである。保持量の均一な混合のような所望の効果のために、または、詰まり（fouling）が最小限になるような一定のフィルター表面剪断率を達成するために、速度を設定することができる。蠕動ポンプは、ループの外部にありループの内容物と直接接触せず、従って無菌的プロセシングのために有用であるため望ましい。シリンジポンプまたはピストンポンプも使用することができるが、これらはループ内容物に直接接触するため、一般的に、無菌的プロセシングに適するようにするために特別な洗浄および滅菌の手順を必要とする。

TFF循環ループ貯蔵部（図1における16）は様々な目的を果たす。第一に、貯蔵部体積は大きくても小さくてもよいが、多くの場合、その体積がTFF循環ループの他部分の体積よりも大きいことが有用となる。この条件下では、いかなる時点においても保持量の大部分が貯蔵部を占め、従ってそれは（特にLBL薄膜製造のような化学的工程を実行する目的のために）試薬を添加するための便利な場所となる。TFFポンプの流速が十分であれば、貯蔵部内で十分な乱流を生じさせてその内容物をよく混合された状態に維持することができるが、さらなる混合が望まれる場合には、例えば磁気撹拌棒（例として図6の撹拌棒76）、オーバーヘッド機械式撹拌装置、軌道振盪台その他のような機械的撹拌システムを備えさせて貯蔵部の内容物をよく混合された状態に維持することができる。さらに、TFFループの他部分は保持量で満たされていることから、貯蔵部がバラストを提供して、プロセシングのあいだに起る保持量体積の増加または減少に適応することができる。これらの体積変化は、下記で説明するように積極的に操作することができる。

TFFによる基質コアの自動コーティング（例えばLBL）の鍵となる一側面は、TFFループを通って循環する粒子懸濁液の体積を制御し維持する能力である。一般に、プロセス全体を通してこの体積を一定レベル近くに維持することが望ましい。実際には、TFF循環ループ総体積には変動が存在する。HP溶液のアリコートを TFFループに送達すると、その量だけ全体的体積が増加する。LBL工程全体を通して体積を累積的に増加させることは一般に望ましくなく、従って、例えば後続の浸透工程の最初の部分における濃縮工程の際にその体積を差し引くことを選択し得る。これは、体積が元の体積に戻るまで、洗浄バッファー供給バルブ（41）を閉じながら例示的な浸透液バルブ（図1における28）を開けることにより行うことができる。濃縮工程は、自動化LBLサイクルに組み入れられてコンピュータ制御下で実行され得る。

ループ体積は自己調節的であることが見出されたため、例示的な実験ではTFFループ体積のプログラム化された調節は回避される。この例が実施例3に記述されている。約20 mLのCaCO₃粒子初期体積に、PLL溶液の5.0 mLアリコートが添加された。この添加は浸透液バルブ（図1における28）が閉じられた間に行われたため、総保持量体積は約25 mLに増加した。5分間の再循環後、浸透液バルブV7（28）が開けられ、約5 mLの浸透液がフィルターから廃液へと出る。この浸透液の最初のボーラス量の駆動力は、PLL添加によって引き起こされた圧力のわずかな上昇である。それからバッファー供給バルブV5およびV6（44、42）が開けられてバッファーの流入が許容される。システムを去る浸透液は粒子貯蔵部に小さな真空を作り出し、これがバッファーを引き入れる。TFFループが排出化（ベント）されない限り、ループ圧力の一次的な変動が、TFFループ体積をサイクルごとに約18〜25 mLに調節するように作用する。

上述した自己調節的TFFループ体積は、より大きい製造規模においては不十分となり得る。濃縮工程またはバッファー添加工程によりTFFシステム体積を積極的に管理する必要が生じ得る場合もある。保持量体積の自動化された調節は、保持量体積を電子的に監視しコンピュータ制御へと報告することを要し得る。光学的センサーまたはデジタル計（例えば図10における94）を使用してTFFループ体積情報をコンピュータに報告することができる。するとコンピュータはリアルタイムで応答し、標的体積範囲に到達するまで適切なバルブを開け閉めすることにより保持量体積を増加または減少させる。そのような制御は、通常の技能を有する電気技師が提供することができるセンサーのための追加的配線およびコンピュータルーチンを要し得る。

無菌製品の製造のためには、細菌のような化学的および生物学的混入物を排除するように、これらの工程の全てを無菌閉ループ系で行うことが有利である。試薬添加工程、懸濁液濃縮工程、およびその他の操作のあいだ、TFFループ中の循環体積は増加または減少し得る。閉じたシステム条件下では、このことはシステム内部圧力の変動を起こし得、それが望ましくないかたちでTFFプロセスの動態を変化させ得る。そのような変化は方法の開発およびテストの際に明らかになり、管理することができる。例えば、タンジェンシャルフロー濾過構成部および／または可溶性試薬送達マニフォールドにベント（排出）ラインを追加して、ピンチバルブ（図1における46）を用いて操作することができる。任意で、これらのベントはコンピュータ制御ベントである。ベントは、滅菌フィルター膜を通して外部環境へとするものであってもよいし、または、ダイヤフラムもしくは折畳みバッグの形態のバラスト体積へと内部的にするものであってもよく、あるいは、システムを混入から防護する他のアプローチを工夫してもよい。内部的ベントの一例は、図13におけるバルブV10であり、これは過剰な圧力が廃液容器へと逃げることを可能にする。ベント工程は、所望の場合に予め定められた時間において自動化プロセスに加えることができる。あるいは、圧力トランスデューサーが制御コンピュータに実況的フィードバックを提供し得、その制御コンピュータが応答して、ベントバルブを開くまたは閉じることによって、ユーザー規定の範囲内に圧力を維持し得る。他の例では、圧力の変動は望ましく、ベントは必要とされない。例えば、上述した自己調節的システムにおいては、システムを出る浸透液がわずかな真空を作り出し、それが、ポンプや計量器を必要とすることなく、置き換わるバッファーを粒子貯蔵部へと引き入れる。すなわち、内部ループ圧の積極的な管理が必要か否かは、プロセスの視野および規模に依存する。

再び図1を参照すると、送達マニフォールド（14）およびTFF循環ループ（12）が典型的構成として図示されている。この典型的実施形態では、8つのバルブ（V1〜V8）は、コンピュータ制御され、特別に書かれた単純なコードにより動く。可溶性HPであるPGA（32）およびPLL（34）は、コンピュータによって呼び出されるまで、二重ヘッド蠕動ポンプ（36）により押されて短ループ（38、40）中を再循環し、そのコンピュータが適切な3方向バルブV1〜V4（31、33、35、および37）を作動する。洗浄バッファーは、この例では、重力によってバルブV6（42）を通り、廃液に送達されるか、またはバルブV5（44）を通じて吸引によって粒子貯蔵部に送達される。前に述べたように、DPは、入口ラインにおけるポート（30）において、最終LBL工程の際にシリンジを介して（または自動的に）送達され得る。TFFループ中で、粒子はプロセス全体を通して連続的に再循環することができる。浸透（洗浄）工程はバルブV7（28）により制御され得る。各LBL工程の際に、所望であれば、例示的サンプルポート（24）においてシリンジを介して粒子懸濁液サンプルを分析のために回収することができる。
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
基質コア上に堆積された少なくとも1つの高分子電解質層を含む粒子の自動合成のためのシステムであって、前記システムは、
TFFループと浸透液バルブとを含むタンジェンシャルフロー濾過構成部であって、前記浸透液バルブはコンピュータ制御を介して浸透工程を選択的に実行するように構成され、前記TFFループは、基質コアのための粒子貯蔵部、TFFフィルター、および前記粒子貯蔵部と前記TFFフィルターとを接続するための手段を含む、タンジェンシャルフロー濾過構成部と、
可溶性試薬添加マニフォールド構成部であって、前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部から前記タンジェンシャルフロー濾過構成部への可溶性試薬の送達が、少なくとも1つのコンピュータ制御されたバルブにより制御され、前記可溶性試薬は高分子電解質を含む、可溶性試薬添加マニフォールド構成部と
を含む、システム。
［２］
前記基質コア上に堆積された少なくとも1つの高分子電解質層を含む粒子の合成のための連続的流路を提供する、［1］に記載のシステム。
［３］
前記浸透液バルブ、前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部のコンピュータ制御されたバルブ、および前記システムにおける任意のポンプが、前記連続的流路に対して外部にある、［2］に記載のシステム。
［４］
前記浸透液バルブ、および前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部のコンピュータ制御されたバルブが、完全に自動化されている、［1］に記載のシステム。
［５］
前記タンジェンシャルフロー濾過構成部への、前記可溶性試薬の規定された体積の自動送達；
前記基質コアの粒子と共に前記可溶性試薬を規定された時間に渡り混合すること；
剰余の可溶性試薬を、規定された時間に渡り浸透により除去すること；および
前記可溶性試薬中の前記高分子電解質とは反対の極性を有する第2の試薬の規定された体積を送達すること
をさらに含む、［1］に記載のシステム。
［６］
前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、複数の試薬の送達のための複数のコンピュータ制御されたバルブを含む、［1］に記載のシステム。
［７］
前記複数の試薬は、反対に荷電した高分子電解質を含む、［6］に記載のシステム。
［８］
前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、廃液、タンジェンシャルフロー濾過構成部、またはその両方への、洗浄バッファーのコンピュータ制御送達を含む、［6］に記載のシステム。
［９］
前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、1つ以上のコンピュータ作動バルブを含む経路を通して前記可溶性試薬を前記粒子貯蔵部へと推進させるように構成された、少なくとも1つのポンプを含む、［1］に記載のシステム。
［１０］
前記タンジェンシャルフロー濾過構成部および前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部が、複数の反対に荷電した高分子電解質層を含有する多層薄膜の自動交互積層形成を実行するように構成され、ここで、少なくとも1つの高分子電解質堆積サイクルが、タンジェンシャルフロー濾過浸透工程のコンピュータ制御により、および前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部からの複数の試薬の送達のコンピュータ制御により、少なくとも部分的に自動化されている、［7］に記載のシステム。
［１１］
前記基質コアが50 nm〜50μmの直径を有する、［10］に記載のシステム。
［１２］
前記可溶性試薬が前記タンジェンシャルフロー濾過構成部に送達されよく混合されて、得られる高分子電解質濃度が予測可能かつ再現可能となっている、［1］に記載のシステム。
［１３］
前記高分子電解質濃度が、所望の高分子電解質濃度の+/-20%以内である、［12］に記載のシステム。
［１４］
前記所望の高分子電解質濃度が約0.2〜2.0 mg/mLである、［13］に記載のシステム。
［１５］
前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、ポンプ、重力、シリンジ、または加圧ガスにより推進される少なくとも1つの試薬を送達するように構成されている、［1］に記載のシステム。
［１６］
前記タンジェンシャルフロー濾過構成部および／または前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、少なくとも1つのコンピュータ制御されたベントをさらに含む、［1］に記載のシステム。
［１７］
前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、送達される可溶性試薬または送達されない可溶性試薬の体積または重量を表示するように構成された試薬計量装置を含む、［1］に記載のシステム。
［１８］
前記計量装置は、可溶性試薬送達の時間および量を記録する目的のためにコンピュータにデータを送信するように構成されている、［17］に記載のシステム。
［１９］
前記タンジェンシャルフロー濾過構成部は、TFF循環ループ体積データを制御コンピュータに報告するように構成された体積計量装置を含む、［1］に記載のシステム。
［２０］
バルブを作動して、試薬の追加により体積を増加させるかまたは浸透により体積を減少させることにより、前記タンジェンシャルフロー濾過構成部内部の混合物のループ体積を設定された範囲内に維持するように構成された、制御コンピュータを含む、［19］に記載のシステム。
［２１］
コンピュータ制御が、ユーザー行為のためのプロンプトをユーザーに提供するように構成されたユーザーインターフェースを含む、［1］に記載のシステム。
［２２］
前記プロンプトは、高分子電解質堆積サイクルを開始するための手動のユーザークリックが必要であることの表示を含む、［21］に記載のシステム。
［２３］
前記コンピュータ制御は、少なくとも1つの高分子電解質堆積サイクルの状態を表示するように構成されたユーザーインターフェースを含む、［1］に記載のシステム。
［２４］
前記タンジェンシャルフロー濾過構成部は、特定の高分子電解質堆積サイクル工程のあいだに前記フィルターを通過する浸透液の量を測定しそのデータを制御コンピュータに送り返す、計量装置を含む、［1］に記載のシステム。
［２５］
コンピュータ制御が、ユーザーにより指定された量の浸透液を測定すると高分子電解質堆積サイクル工程を自動的に終了させる、［24］に記載のシステム。
［２６］
指標が、前記タンジェンシャルフロー濾過ループを出る浸透液の量を連続的に測定する電子的計量器からの信号の形態をとる、［25］に記載のシステム。
［２７］
前記タンジェンシャルフロー濾過ループが、タンジェンシャルフロー濾過フィルター、粒子貯蔵部、および接続手段を含む無菌の閉ループ管ネットワークを含む、［1］に記載のシステム。
［２８］
前記閉ループ管ネットワークは、ガンマ線照射、またはエチレンオキシド、または熱による処理によって滅菌される、［27］に記載のシステム。
［２９］
前記閉ループ管ネットワークは、TFFポンプおよび少なくとも1つのコンピュータ制御されたバルブに取り付けられるように構成される、［27］に記載のシステム。
［３０］
前記閉ループ管ネットワークは、試薬を前記タンジェンシャルフロー濾過ループに分配する目的のために、前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部へと延長し少なくとも1つの試薬添加マニフォールドコンピュータ制御バルブに取り付けられている、［27］に記載のシステム。

以下は例示的なプロセスである。

実施例1：基質コアとして使用するためのCaCO₃マイクロ粒子の沈殿
当技術分野で知られる沈殿法の修正バージョンを使用した。1.0 mg/mLのポリ-L-グルタミン酸ナトリウム塩（シグマ・アルドリッチ、カタログ番号P4636）を含有する20 mLの0.33 M Na₂CO₃溶液を急速に撹拌したものに、20 mLの0.33 M CaCl₂を加えた。沈殿したCaCO₃マイクロ粒子混合物を40秒間700 rpmにおいて撹拌した。粒子は40x倍率における顕微鏡下で調べられ、直径3〜4μmのほぼ球状の粒子であることが見出された。この懸濁液を遠心分離チューブに移し、全ての目に見える粒子がペレットになるまで低速で回転させた。上清を吸引し、粒子を20 mLの10 mM HEPESバッファーpH 7に懸濁した。粒子を再び回転させ、上清が吸引され、それから再び20 mM HEPESバッファーに懸濁させた。得られた3% CaCO₃懸濁液は、後続のLBL実験において直接使用されたか、または、4℃で保存され数日以内に使用された。この手順により調製されたマイクロ粒子は第1のHP LBL層としてPGAを含み、このことは、pH 7.0バッファーに懸濁された粒子のゼータ表面電位を測定することにより（図3 A）、およびアミノ酸分析により（図3B）、確認された。典型的なゼータ電位値は、Malvern Instrumentsのゼータサイザーで測定した場合に約-15〜-30 mVである。

実施例2：HP PLL送達の半自動化制御およびそれに続くTFF浸透による剰余HPの除去
本質的に図1に記載した通りに構築された装置を使用した。ピンチバルブは中継基板を介してDC電力源に接続された。バルブへの電力の分配は、中継基板に接続されたコンピュータによって制御された。様々なバルブ指令を実行するためのコードを書いた。TFFループは、20 cm²、500 kD分子量カットオフ（MWCO）MicroKros（登録商標）修飾ポリエーテルスルホン（mPES）フィルターモジュール（20）が備えられたKrosFlo（登録商標）リサーチII TFFシステム（Spectrum Labs）から主になり、TFFポンプ（18）は40 mL/分に設定した。試薬送達マニフォールドの二重ヘッドポンプ（36）は40 mL/分に設定した。PLL送達工程の持続時間は7.9秒間あるいは5.3 mL（送達される5.0 mL + デッドボリュームのための0.3 mL）に設定した。オフラインにおけるテストでは、粒子貯蔵部（16）への実際の送達は+/- 3%まで正確であることが示された。これらの条件下で、LBL薄膜へのHP堆積は、1.0〜2.0 mg/mLの範囲内ではHP濃度には影響されず、従ってこのレベルの正確性がLBL工程のために十分である。TFFループが3% CaCO₃マイクロ粒子の20 mL懸濁液で充填されたモデル研究が行われた。TFFポンプ（18）は40 mL/分に設定され、懸濁液が5分間再循環された。コンピュータ制御によりバルブV5、V6、V7（41、44、28）を開くことによって、粒子を浸透バッファー（10 mM HEPES pH 7.0）で洗浄した。デジタル計測器上で浸透液体積を測定し、100 g（100 mL）の浸透液が回収されたときにコンピュータ制御によってバルブを閉じた。次に、コンピュータ制御がバルブV1、V2、V5（35、37、44）を7.9秒間開いて、TFFループへ12.5 mg/mL PLLの5.0 mLアリコートを送達した。5分後、浸透液バルブV7（28）が自動的に開かれて、120秒間の濃縮工程を開始し、TFFループ系の体積を20 mLに戻した。バッファー入口バルブV5およびV6（42、44）が自動的に開かれて浸透工程が開始され、懸濁物は100 mL（5x懸濁液体積）のバッファーで洗浄された。1 mL、50 mL、および100 mLの浸透体積点においてタンパク質アッセイのために浸透液サンプル（0.5 mL）を採取した。100 gの浸透液が回収されたときにV5、V6、V7を閉じた。最終粒子懸濁液の0.5 mLサンプルも採取され、遠心分離され、タンパク質アッセイのために上清を吸引した。

可溶性PLLはPierce^TM 660nmタンパク質アッセイにより測定し、その結果を図2に示す。最初の浸透液[PLL]は約0.85 mg/mLであった。50 mLの浸透（2.5懸濁液体積）後、可溶性[PLL]はほぼ65%減少し、100 mL（5.0懸濁液体積）後には> 95%が取り除かれていた。反復のPLL送達／浸透サイクルは同様の結果を生じ、当該コンピュータ制御送達は再現性を有すること、および、剰余HPの除去は5.0懸濁液体積に渡る浸透後にほぼ完了することが実証された。

PLLを用いたLBLの完全サイクルのために使用されたコンピュータ制御工程の典型的サンプルを表1に示す。
表1：TFFによる自動化LBLの1サイクルを実行するためのコンピュータ制御操作

表1に関しては、一層のPLLの追加のためのバルブの制御についてコンピュータコードの結果が表されている。ステップ1において、マウスクリックの形態におけるユーザープロンプトが配列を開始させる。100 gの浸透液が回収された後のステップ6の際の、次なるユーザープロンプトが、そのステップおよびサイクルを終了させる。変動し、しばしば低減するTFFフィルターフラックス率のために、浸透時間は、約4分から20分まで、あるいは例えば272秒から1172秒までで変動し得る。典型的な実施形態では、コンピュータは、浸透液回収容器からのフィードバックを使用して、100 gの浸透液が回収されたときに後続のサイクルを開始するように構成され得る。例えば、その回収容器は、コンピュータへの入力および出力接続を有するデジタル計量器上に設置され得る。コンピュータは、ステップ1のあいだに計量器に自動ゼロ較正（auto zero）するよう指令する。コンピュータへの計量器出力が100gを示したときに、コンピュータはステップ6を自動的に実行する。

上記例は、コンピュータ制御のHP送達および続く浸透工程が、望みどおりに、かつ信頼性を有する態様において、行われることを実証している。

実施例3：7 HP層LBLマイクロ粒子の半自動化製造
本明細書に記載されるシステムおよび方法を使用して、7層のLBL薄膜でコーティングされたCaCO₃マイクロ粒子のバッチを調製した。図1に示す装置を、実施例2で記述したように使用し操作した。コンピュータマウスのクリックの形態のユーザープロンプトで各周回を開始させながら、TFFによるLBLの複数の周回を遂行した。そのステップの浸透液体積が100 mL（あるいは、デジタル計量機で測定されて100 g）に到達するときに、ユーザーによるプロンプトが出される。上述したように、各浸透工程の持続時間は変動するので、例示の目的のために、表2では571.9秒の浸透工程が使用された。以下では製造プロセスの詳細を記載する。

図1を参照すると、TFFループには、20 cm²、500 kD（MWCO）MicroKros（登録商標）mPESフィルターモジュール（20）が備えられた。PGAナトリウム塩（10 mM HEPESバッファー中5.0 mg/mL、シグマ・アルドリッチ、カタログ番号P4636）およびPLL-HBr塩（10 mM HEPESバッファー中6.25 mg/mL、シグマ・アルドリッチ、カタログ番号P6516）のHPストック溶液を調製し、試薬送達マニフォールド上のそれぞれ第32および34ポジションにおける50 mLバイアル中に入れた。二重ヘッドポンプ（36）は40 mL/分に設定された。ループ（38および40）は、バルブV1〜V4を切り替えて開くことによってHP溶液で満たし、コンピュータ制御下で閉じ、バルブV5 （44）は廃液の方に開かれた。20 mLのCaCO₃マイクロ粒子の3%（wt/v）懸濁液（実施例1で記述したように調製した）を粒子貯蔵部（16）に入れ、40 mL/分でTFFループ中を再循環させた。表2に表示された工程を遂行することにより、TFFによる段階的自動化LBLを行った。ステップ6およびステップ12において、デジタル計量器から読まれる回収浸透液が100 gに到達した時点で、操作者によりユーザープロンプトが出された。ステップ1〜12を3回実行して、マイクロ粒子に6つの新たなHP層を堆積させ、合計7つのHP層を得た。
表2：TFFによる自動化LBLの2サイクルを実行するためのコンピュータ制御操作

ゼータ表面電位と薄膜堆積の測定のために、各浸透工程後に、サンプルポート（24）におけるシリンジを介して粒子サンプルを採取した。表面電位は、Malvern Instrumentsのゼータサイザーを使用してDLSにより測定し、そして図3Aに表示した結果は、予測された交互の表面極性パターンを示しており、LBL実験の成功が示唆された。段階的LBL薄膜堆積は、以下の手順により乾燥粒子試料に対して行ったアミノ酸分析により測定した。

約10 mgのLBL粒子を高真空下で乾燥させ、秤量した。粒子試料を、密閉バイアル内で120℃において16時間、0.30 mLの6.0 M HCl中で消化した。Agilent Technologiesにより提供された方法および材料を使用したオルト−フタルアルデヒド（OPA）によるアミノ酸誘導体化のために、真空化でHClを蒸発させ、残渣をホウ酸バッファーに溶解した。各アミノ酸（この場合はグルタミン酸とリジン）の量は、定量的HPLCアッセイを用いて測定した。図3Bにおける結果は、各LBL工程においてPLLとPGAが着実に蓄積するロバストな薄膜成長を示しており、この半自動化プロセスが望み通りに働くことを実証している。図3Cにおける粒子の明視野顕微鏡画像は、7 HP層粒子バッチはよく分散され、大きな凝集物を含まないことを示している。

図3A〜3Cに図示された例をさらに参照すると、TFFによる自動化（この場合は半自動化）LBLにより作製された7 HP層マイクロ粒子構築物の特徴付けが例として示されている。図3Aに関しては、段階的ゼータ電位測定が、交互極性の予測されたパターンを示している。図3Bは、AAAにより測定された段階的薄膜堆積を示しており、TFFによるLBLの成功が示唆されている。図3Cに示された完成粒子の顕微鏡画像は、粒子が、予測された球状形態を有してよく分散されていることを示している。

実施例4：LBLマイクロ粒子ワクチン構築物の半自動化製造

全てのデータはTFFによる自動化LBLがうまく働いていることを示していたので、米国特許公報第US20120009254号に以前記載されていたものと同様のマイクロ粒子ワクチン構築物のバッチを調製した。

無菌20 cm² 500 kD MWCO mPES TFFフィルターを使用しながら、実施例3において使用した装置および手順を繰り返した。7番目のHP（PGA）層の適用および続く浸透工程の後に、5.0 mLバッファー中12.5 mgのDPのボーラス量を、シリンジポート（図1における24）を介してTFFループに加えた。5分間の再循環後、コンピュータ制御により浸透バルブV5、V6、およびV7（図1における44、42、28）が開かれ、粒子は100 mLのバッファーで洗浄された。

粒子は顕微鏡（図4A）および走査型電子顕微鏡（SEM、図4Bおよび4C）により調べられた。前と同じく、よく分散された球状多孔質粒子が観察された（例えば図4A〜C参照）。それぞれの浸透工程の最後に採取された粒子サンプルについて行われた段階的表面電位測定は、LBLの成功を示唆する交互の電位極性を示した（図4D）。それぞれのLBLサイクルの後に採取された試料のAAAにより測定された段階的薄膜堆積は、LBL薄膜におけるHPの着実な蓄積を示した（図4E）。最終産物から採取されたAAAデータにより、この例示的バッチにおいて吸着された全DPは10.8 mgであることが決定され、これはDPの86%が薄膜中に回収されたことを示す。

本明細書に記述されるTFF法を使用したLBL薄膜蓄積の効率を、手動の遠心分離／吸引／再懸濁法の効率と比較した。このマイクロ粒子構築物の2つのさらなるバッチを上述のようにして調製し、薄膜に吸着されたHPおよびDPの総量をAAAにより測定した。また、米国公報第20120009254号に記述された手動的方法を使用して、同様の構築物を6バッチ調製し、全HPおよびDPの吸着量をAAAにより測定した。各構成成分（PLL、PGA、およびDP）の平均量を、乾燥されたCaCO₃1 mg当たりのペプチドのμgの関数として計算し、図12にグラフで示している。その結果は、TFF法による自動化LBLによって平均で2.5〜3.5倍多いペプチドが堆積されたことを示している。

このバッチ合成のためには無菌TFFフィルターが使用されたが、細菌あるいはその他の病原体による混入の可能性を防ぐために他の対策は取られなかった。システムから細菌を排除するための積極的な措置はなかったにも関わらず、Pierce LAL発色アッセイ（Thermo Scientific）により最終産物に対して行われたエンドトキシン測定は、抗原DPの1μg当たり0.04エンドトキシン単位を示した。このレベルは、実験動物の免疫化のために許容される範囲内に十分に入り、滅菌バッファーおよび優良製造規範（GMP：good manufacturing practice）グレード原材料の使用といった簡単な措置を取ることで、ヒトにおける使用のために許容されるレベルまでエンドトキシンが低減されるであろうことを強く示唆している。

実施例5：タンパク質抗原ハトシトクロムCを用いたLBLマイクロ粒子の合成
図1における装置および実施例4で用いた手順を、以下の変更と共に使用した。第一に、TFFループには20 cm² 750 kD MWCO mPES TFFフィルターが備えられた。第二に、最終DPストック溶液が、10 mM HEPES中のハトシトクロムC（pCC：pigeon cytochrome C、シグマ、カタログ番号C4011）の2.5 mg/mL溶液5.0 mLで置き換えられた。この実験は、完全な天然タンパク質がLBL薄膜中に効率よく組み入れられ得ることを実証するために行われた。実施例4から他に大きな変更は加えなかった。それぞれの浸透工程後に粒子懸濁液のサンプルを採取し、LBL薄膜をAAAにより定量化した。図4Fは、各LBL工程後におけるHPの着実な蓄積、およびタンパク質pCCの効率的な組み入れを示している。AAAにより、可溶性pCCの8.1 mg（66%）が薄膜中に捕捉されたことが決定された。

実施例6：無菌ワクチンマイクロ粒子の自動合成のためのTFF装置
図5を参照すると、図1に示された装置にいくつかの変更がなされている。第一に、試薬添加マニフォールドにおける二重ヘッドポンプが4チャンネル蠕動ポンプに置き換わっている。これにより、2つのさらなる試薬、すなわち洗浄バッファー（52）およびDP（54）が積極的に注入され、TFFループに送達されるか、または洗浄バッファーと共に廃液容器へと流し出されることが可能になる。第二に、いつ試薬が送達されるかということと送達の経路とを制御するために、さらなるコンピュータ制御バルブが追加されている。第三に、試薬溶液はプラスチックのIVバッグに入れられ、計量器からぶら下げられている。計量器は、正しい試薬が適切な時間に正しい量において引き出されたことを確認するために使用される。送達の記録は、認可されたコンピュータ上に保存されるか、または立ち会う技術者によって手書きで紙に記録され得る。

IVバッグが選ばれたのは、それが滅菌形態で容易に入手可能であり、無菌チューブ接合を行い得る補助製品を伴っていて、試薬を潜在的な混入物への曝露なくマニフォールドに接続できるようになっているからである。チューブとTFFフィルターが無菌であり、かつ可溶性試薬溶液が無菌であり、かつ出発CaCO₃マイクロ粒子が無菌であり、かつ全ての構成要素が適切に接続されていれば、最終製品は無菌となる。

一側面において、タンジェンシャルフロー濾過ループは、図1Bに示されているように、タンジェンシャルフロー濾過フィルターおよび粒子貯蔵部を含む無菌閉ループ管ネットワークを含む。閉ループ管ネットワークは、例えば、TFFフィルターおよび粒子貯蔵部を含み、ネットワークはTFFポンプとは別に組み立てられる。受取バッグおよびTFFフィルターを伴う管ネットワークは、任意で、単一回使用の使い捨て材料であることが意図される。閉ループ管ネットワークは、任意で、ガンマ線照射、またはエチレンオキシド、または熱による処理によって滅菌される。一側面において、閉ループ管ネットワークは、TFFポンプおよび少なくとも1つのコンピュータ制御バルブ（例えば浸透液バルブ）に取り付けられるように構成される。

いくつかの側面では、閉ループ管ネットワークは、試薬をタンジェンシャルフロー濾過ループに分配する目的のために、可溶性試薬添加マニフォールドへと延長し少なくとも1つのコンピュータ制御バルブに取り付けられる。任意で、延長された閉ループ管ネットワークは、試薬添加マニフォールドとは別に組み立てられ、滅菌され、それからTFFポンプ、TFF循環ループバルブ、および可溶性試薬添加マニフォールドバルブに取り付けられる。

無菌閉ループ管ネットワークは、ヒトにおける使用のための生物医薬の製造に適合しているとして保証されている材料で構築されるであろう。設計された単一使用の使い捨てネットワークの例を図6に示す。特定されたチューブ、例えば1/16インチ内径Tygon（登録商標）チューブを使用し得る。チューブは特定された長さに切られ、掛かり付き（barbed）ポリエチレン連結部によって繋げられる。クランプまたはケーブル「ジップ」タイを使用して全ての連結部を締めて漏れを防ぎ、閉じた系が維持されることを確実にすることができる。無菌TFFフィルター（72）、例えば20 cm²、750 kD MWCOのmPESフィルターを組み込み、全てのチューブ末端をキャップして、滅菌前に混入物を排除することができる。完成されたユニットを包装し、包み込んで、例えばガンマ線照射、エチレンオキシド処理、または熱による滅菌のために、オーソライズされ認可された施設に提出し得る。これらのユニットの無菌保存寿命は実験的に確認される必要があるが、>12ヶ月の寿命が予測される。

LBL粒子バッチ合成の実行に先立って、ネットワークを包みから出して、図5に示されているように、様々なピンチバルブおよびポンプヘッドの全てに取り付ける。オフラインで、IVバッグ中に、例えばPLL、PGA、洗浄バッファー、設計されたポリペプチド（designed polypeptide）およびCaCO₃マイクロ粒子の、無菌ストック溶液を調製する。これらの試薬の滅菌は、0.2 umフィルターを通したフィルター処理、加熱、あるいはその他の技術により達成され得る。これらのバッグは、市販されている無菌チューブ接合器具を用いて管ネットワークに繋げられる。

図5を参照すると、マルチヘッド蠕動ポンプ（50）およびTFFポンプ（67）の両方が40 mL/分に設定され、全ての計量器は0.0 gにリセットされる。この時点で、プロセスの全ての後続工程をコンピュータ制御により遠隔的に実行できる。最終製品を回収するときまで、装置に直接触れることは必要とされない。

表3は、典型的なマイクロ粒子ワクチンバッチの合成の際に実行される工程の例を提供する。上述したように、ここでは例示目的のために8層構築物が提示されるが、このプロセスは、少ないものでは2層、多いものでは50層以上を有する構築物を調製するために、短くあるいは長くすることができる。装置とユーザーのあいだの相互作用のレベルは、装置が上述したような電子的フィードバック機構を備えているか否か、またはある工程がユーザーからの続行プロンプトにより開始されるか否かに依存する。コンピュータに割り当てられ得る制御の量に制限はないが、実際的には、先行工程が規定通り実行されたことをユーザーが確認し記録できるように、そして所望の場合にテストのためのサンプルを回収するために、各段階の間に予定された一時中断を設けることが望ましい。

表3：マイクロ粒子ワクチンバッチの実行のためにコンピュータが出す指令

実施例7：複数の試薬添加マニフォールドポンプを有する自動化TFF式LBLシステム
図5に示された装置を、図10に示すようにポンプで押し出される全ての試薬が別個の蠕動ポンプから駆動されるように再構成した。この構成では、ポンプはシステムコンピュータにより個別に制御される。それらは、コンピュータにより所望の試薬を送達するよう指令されるまでは静止する。コンピュータは、ポンプの速度および各送達工程の持続時間の両方を制御する。例えば、25 mLのPLLストック溶液をTFFループに送達するために、コンピュータは、バルブV4およびV7（図10における95および93）を開く。それからポンプ4（図10における98）に、約38秒間にわたり40 mL/分にて作動するように指令する。コンピュータはそれからポンプ4を止めて、V4およびV7を閉じる。それからコンピュータは、V1を開いてポンプ1を15秒間40 mL/分にてオンにすることによって、残余PLL溶液を洗浄バッファーにより廃液へと洗い出す。コンピュータはまた、廃液バッグ（97）が吊り下がっている電子計量器（96）からの出力も受け取る。TFF繊維フィルターのフラックス率は変動するため、各浸透工程の長さは、固定された時間ではなく、回収された浸透液体積の重量により規定される。8層LBLマイクロ粒子構築物の100 mL規模バッチの製造のためのコマンドの典型的セットを表4に示す。

例えば図11に示されているようなレイアウトを有する無菌閉ループシステムが、図10に示すTFF式LBL装置に取り付けられる。この閉ループシステムには、300 mL粒子貯蔵部、5 L廃液バッグ、500 mL産物バッグ、および無菌115 cm² 750 kD MWCO mPES TFFフィルターが備え付けられる。CaCO₃マイクロ粒子の1.5 %懸濁液の200 mLバッチが無菌条件下で調製され、300 mL無菌バッグ（91）に回収される。そしてそのバッグは計量器（90）に取り付けられて管接合部（92）においてシステムに無菌接合される。同様に、4 Lの10 mM HEPESバッファーpH 7.0が調製され、0.2 umメンブレンを通して滅菌フィルター処理され、4 L無菌バッグ（85）に回収される。そのバッグは計量器から吊り下げられ、チューブの部位（84）および（86）において無菌接合される。HEPESバッファー中5.0 mg/mLのPGAナトリウム塩ストック溶液の150 mLと、HEPESバッファー中6.3 mg/mLのPLL HBr塩ストック溶液の150 mg/mLとを調製し、無菌バッグ中へ滅菌フィルター処理され、吊り下げ計量器に取り付けられ、それぞれ部位（88）および（89）において装置に無菌チューブ接合される。最後に、HEPESバッファー中に、設計されたポリペプチド（DP：designed polypeptide）の2.5 mg/mL溶液を40 mL調製し、100 mL無菌バッグ中へ滅菌フィルター処理され、計量器に取り付けられ、チューブの部位（87）において無菌接合される。

TFFループポンプは40 mL/分に設定される。粒子貯蔵部は磁力撹拌プレート上に載せられ、適度な速度で撹拌するように設定される。それからユーザーが、試薬送達マニフォールド上のラインを装填することをコンピュータに促す。装填後、ユーザーは適切な装填を確認するためにラインを点検し、それから、TFFループにCaCO₃粒子を送達することをコンピュータに促す。ユーザーは適切な送達を確認するためにシステムを点検し、それから、濃縮と洗浄のサイクルを開始することをコンピュータに促す。システムは、100 g（mL）の浸透液が回収されたところで濃縮を終了し、それから400 gを回収するために浸透を開始するようにプログラムされる。ユーザーは、所望の100 mL（+/- 10 mL）体積に到達したことを確認するためにTFFループを点検し、それから反復的LBLサイクルを開始することをコンピュータに促す。バッファー、PGA、PLL、およびDPの送達はコンピュータへのデジタルフィードバックにより記録され、ユーザーが視覚的に確認することができる。ユーザーは、次のLBL工程へと自動的に継続するかまたはサンプル採取および記録のために一時停止するようコンピュータに指令する選択肢を有する。約2.5時間後、最終的LBLマイクロ粒子懸濁液は500 mL産物バッグに自動的に送達される。産物バッグへのチューブは無菌ピンチ接合され、分析および製剤のために装置から外される。

実施例8：100 mLバッチ規模における無菌ワクチンマイクロ粒子の自動化合成のためのTFF装置
図5に示された装置を、図13に概略図が示され図14に写真で示されている、より能率化されたシステムに再設計した。示された配置において、1/8インチ内径（ID）および1/4インチ外径（OD）のチューブに適合する電動ソレノイドピンチバルブをペグ差し板に取り付けた。バルブV1、V2、V3、V4、V10、V11、およびV12は、通常閉じられている2方向ソレノイドピンチバルブである。バルブV5、V6、V7、V8、およびV9は、オンにされていないときには1つの出口が開かれ1つの出口が閉じられている3方向ピンチバルブである。静止している（電力供給されていない）間は、V5はV7に対して閉じられ、V6はV8に対して閉じられ、V7はV5に対して閉じられ、V8はV6に対して閉じられ、そして、V9は粒子貯蔵部に対して閉じられ廃液バッグに対して開かれる。各バルブは、中継基板上の専用の個別チャンネルに接続され、中継基板はコンピュータに接続されている。中継基板が使用するチャンネルには電源も接続され、これら様々なバルブを作動（開放）するための電力を配給する。コンピュータは、中継基板と相互作用することおよび表5に示された工程の配列を実行することを可能にするソフトウェアを含む。

図15に概略図を示したのと本質的に同じ管ネットワークを、1/8 ID 1/4 ODシリコーンチューブ、ポリプロピレンの掛かり付き連結部およびT字、3つのポートおよび撹拌棒が備えられたネジ蓋250 mL粒子貯蔵部容器、ならびに115 cm²、750 kD MWカットオフ修飾ポリエーテルスルホン（PES）TFFカラム（Spectrum Labs）、ならびに5 L廃液バッグから組み立てた。管長は、デッドボリュームを実際的な最小限にとどめるように設定された。可溶性試薬接合位置はキャップするかまたはクランプで閉じた。ネットワークは、そのまま使用されるか、または、無菌プロセシングが必要とされる場合には包装されて適切な施設においてガンマ放射線による処理で滅菌され得る。チュービングのセグメントは、どのバルブまたはポンプにそのセグメントが取り付けられるべきかを明確化するために任意で標識され得る。

組み立てられたネットワークは、様々なピンチバルブ、2つの蠕動ポンプ、および撹拌プレート上に粒子貯蔵部容器を固定するためのクランプ、ならびにTFFカラムに取り付けられる。TFFカラムには、TFF膜を経る圧力勾配を監視できるように圧力トランスデューサーを取り付けるためのポートが備えられる。トランスデューサーの出力はコンピュータにより記録され、モニター上に連続的に表示される。廃液バッグはデジタル計量器上に設置される。計量器の出力はコンピュータにより記録され、いつ十分な浸透液体積が回収されるかを測定するために使用される。

表5の工程を実行するために特別仕様のソフトウェアを書いた。このソフトウェアは、表に示された配列で特定のピンチバルブを作動（開放）する。固定体積の送達を要する工程は時間的に制約されており、持続時間の列に秒（sec）単位で示されている。浸透液バルブV11を介して一定体積のバッファーがシステムを出ることを要する工程は質量的に制約されており、グラム（g）単位で示されている。水性浸透液は1.0 g/mLの密度を有するため、そのグラム単位の質量は実質的にミリリットル単位の体積と等しくなる。体積的に制約される工程の開始時に、コンピュータは廃液バッグ計量器からのデジタル出力を読み取り、それが特定された量だけ増加するまでそれを監視する。例えば、500 mLの浸透バッファーがTFFループに入りそして出ることが求められる粒子洗浄工程のあいだは、コンピュータは、廃液バッグの質量が500 gだけ増加するまで計量器を監視し、それから表中の次工程に進む。

特別仕様のソフトウェアは、合成が、最初から最後までユーザーの介入がない完全自動モードで行われるか、または、各段階の最後にシステムが一時停止して、アラームもしくは電子メールの形態の通知がユーザーに送られ、その段階が完了しシステムが続行プロンプトを待っていることを彼／彼女に知らせる半自動モードで行われるかのいずれかを可能にする。このモードでは、ユーザーは、装置から離れることができ、かつ、
サンプルを採ったり適切に稼働しているか構成部を点検したりするための機会を失わない。

図13におけるバルブV10およびその対応するチュービングセグメントはベントとして追加され、粒子貯蔵部における余分な空気圧力が廃液へと排出されることを可能にする。ベントは通常は閉じられており、カラム洗浄工程と粒子添加／濃縮工程の際のみ開かれる。

実施例9：100 mL規模におけるTFFによる7 HP層LBLマイクロ粒子の半自動化製造
実施例8で記述され図13で示されたTFF式LBL装置を使用した。10 mM HEPESバッファーpH 7（5 L）、HEPESバッファー中のPGA（100 mL、5.0 mg/mL）、HEPESバッファー中のPLL（125 mL、6.25 mg/mL）、および実施例1の方法により調製されたPGA食塩水中1.6%のCaCO₃マイクロ粒子懸濁液（200 mL）のストック溶液を適切な大きさのバッグに入れ、それぞれバルブV1、V2、V3、およびV12の上流のチューブに、掛かり付きチューブ接続部により取り付けた。可溶性試薬バッグは、図14に示すように、重力による試薬の供給を促進するようにバルブの上に吊られた。粒子懸濁液バッグは、粒子の沈殿およびチューブポート（複数可）における粒子ダム形成を防ぐために逆さにしたままにした。無菌的稼働のために、HEPES、PGA、およびPLL溶液はまず0.2 umフィルターを通してフィルター滅菌し、無菌チューブ接合具を使用してネットワークに取り付けられる。

試薬送達蠕動ポンプは120 mL/分で動くように設定され、TFFループ蠕動ポンプは100 mL/分で動くように設定され、粒子貯蔵部の下の撹拌プレートは中スピードに設定された。表5に要約された工程を実行するソフトウェアは半手動モードに設定されたが、これは、各段階の最後にコンピュータがユーザーに通知電子メールを送り、続行するようにユーザーにより促されるまでその工程において一時停止することを意味する。

表5における装填およびカラム洗浄の段階が遂行された。1.6%粒子懸濁液を含有する試薬バッグは、沈殿した粒子を分散させるために数回穏やかにひっくり返して、直立位置において吊り下げ、表5における粒子の充填および濃縮のルーチンを実行させた。これらの工程の後、TFFループは、約3%の粒子懸濁液を約100 mL含んでいた。TFFループに設置されたインラインシリンジポートを介して粒子サンプル（約0.3 mL）を手動で採取した。

表5のPLL堆積工程が開始され、合計6ラウンドの自動化LBLが行われ、その各ラウンドは一時停止およびサンプル採取で終えられた。粒子サンプルは、風袋として差し引かれたガラスの消化容器中で高真空下で乾燥され、実施例3に記述したAAA手順に供した。図16AのAAAデータは、ホモポリマーPLLおよびPGAの着実な蓄積および頑強なLBL薄膜を示している。それに加えて、Malvern Instrumentsのゼータサイザーにおいてゼータ表面電位測定が行われ、図16Bに示されたそのデータは、PLL堆積工程後の正の方向またはPGA堆積工程後の負の方向のどちらかにおける、約15 mVの予測された変化を示している。顕微鏡により粒子を調べたところ、それらはよく分散され球状形態であることが示された。

この特定の合成は7層で止められた。2.5 mg/mLの設計されたペプチドの溶液を25 mL添加した後に表5の最終段階に示された工程を行えば、実施例4に記述されたようなワクチンマイクロ粒子薬剤物質がもたらされる。

ここに記載された実施例は、TFFによる自動化または半自動化LBLを使用して、優れたワクチンマイクロ粒子を調製することができることを実証している。

企図される追加的側面としては、部品（ピンチバルブ、ワイヤー、等々）の組立ておよび取付けを固定された垂直プラットフォーム上で行って、絡まり合うことなく追加的な側面を提供することが挙げられる。

自動化システムの別の例示的概略図が図5に示されている。この例示的実施形態は、HPに加えて洗浄バッファー52および設計されたポリペプチド54を送達する4チャンネル蠕動ポンプ50を提供する（図5におけるPGA 56、PLL 58、CaCO₃懸濁液60を参照）。可溶性試薬バッグはマニフォールドに無菌接合され（図5における62参照）、送達の時間および量を記録するデジタル計量器から吊り下げられ得る。例えば2方向または3方向ピンチバルブであるコンピュータ制御バルブは、64にて図示されている。例示的TFFループは66にて概略的に図示されている。例示的実施形態において、設計されたペプチドは注意深い計量を要しないかもしれない。その試薬の全部が単一ボーラス量において送達される可能性が高いからである。

典型的実施形態において、バッグ中の無菌試薬は、無菌チューブ接合（X）により、閉じた系に取り付けられる。CaCO₃粒子懸濁液は重力により貯蔵部容器に送達され、そこで機械的撹拌により穏やかに混合される。プロセシングのあいだ粒子はフィルターループを通って連続的に循環する。濃縮HPストック溶液、設計されたペプチド、および洗浄バッファーは、コンピュータ制御ピンチバルブを介して、制御された量で、かつ事前に設定された時間において、貯蔵部に導入される。計量器が重量の変化を記録して、正しい送達を確認する。LBL工程からの剰余の可溶性試薬は、TFFフィルターから廃液へとタンジェント方向に除去される。最終洗浄工程を経て、ワクチン粒子懸濁液が、オフライン放出試験および製剤のために産物バッグに送達される。

この設計に適合する典型的な閉ループ管ネットワークの概略を図6に示す。この実施形態は、固定長のチュービングセグメント68、掛かり付き連結部70、TFFフィルターカラム72、撹拌棒76またはその他の内部混合装置を伴う貯蔵部74、ならびに廃液78および産物80のための受け入れバッグを含む。各連結部に標識を付けて、装置への適切な取り付けおよび試薬の正しい接合を確実にすることができる。典型的な実施形態では、閉じたループは、チューブ、掛かり付き連結部、TFFフィルターカラム、撹拌棒を伴う囲まれた粒子貯蔵部、ならびに廃液および産物のための受け入れバッグのみからなる。

各試薬のための別個のポンプを伴って構成された試薬送達マニフォールドに適合する例示的な閉ループ管ネットワークについての概略を図11に示す。この実施形態は、図6に示すネットワークにおける全ての構成要素を含み、マニフォールドに無菌試薬を無菌接合するための部位を含む（図11における84、86、87、88、89、92）。前に説明したように、この閉じたループはGMP条件下で組み立てられ、包装され、滅菌され、そして使用時まで保存され得る。

図7は、TFFによる自動化LBLのための典型的システムを示している。システム100は、サーバー101（あるいは単にローカルコンピュータ）を含み得る。サーバー101は、情報とプロファイル、アルゴリズムとプロセシングモジュール、およびその他のデータ貯蔵を含むがこれらに限定されない複数の情報を含み得る。サーバー101は、コミュニケーションチャンネル110を介してネットワーク106と連絡し得る。

さらに、システム100は、追加的な外部データ源またはサーバー103にアクセスまたはインターフェース連結され得る。外部データ源103は、コミュニケーションチャンネル111を介してネットワーク106と連絡し得る。別々に図示されてはいるが、データ源103は、サーバー101と実質的に同様のサーバーを含み得ることが特記される。サーバー101またはデータ源103は、例えば携帯電話サービスプロバイダー、ビジネス情報プロバイダー、または何らかのその他の適切なプロバイダーもしくはリポジトリのようなデータサービスプロバイダーを含み得る。サーバー101またはデータ源103はまた、本明細書に記載されるインターフェース／方法論のいずれかを実行するアプリケーションおよび／またはコンピュータ実行可能コードを提供するアプリケーションサーバーも含み得る。サーバー101またはデータ源103は、アプリケーション上の複数のデフォールト、選択肢、設定、および／または構成を提示することができ、それに従って装置がアプリケーションを受け取り処理できるようにすることができる。サーバー101またはデータ源103は、装置のビューアーによって比較的容易に選択ができるように、装置のビューアーインターフェースまたはウェブブラウザー上にアプリケーションを提示し得る。アプリケーション選択のために提供されるビューアーインターフェースまたはウェブページは、アプリケーションストアおよび／またはアプリケーション市場（application marketplace）の形態であり得る。

あるいは、別のサーバー構成部またはローカルコンピュータ装置、例えば104、105、および／または106が、サーバー101またはデータ源103へのビューアーインターフェースおよび制御接続性を作り得る。また、サーバー101またはローカルコンピュータ装置104、105および106のうちの1つもしくは複数は、データ源103に定期的にアクセスして、本発明の実施形態において使用するデータに関係するデータをキャッシュするように構成され得る。

ネットワーク106は、インターネット、ワイドエリアネットワーク、および／またはローカルネットワークを含め、あらゆる適切なネットワークであり得る。サーバー101およびデータ源103は、コミュニケーションチャンネル110、111を介してネットワーク106と連絡し得る。コミュニケーションチャンネル110、111は、ワイヤレス、衛星、ワイヤー、あるいはそれ以外のものも含め、あらゆる適切なコミュニケーションチャンネルであり得る。

典型的システム100はさらに、コミュニケーションチャンネル112を介してネットワーク106と連絡するコンピュータ装置105を含む。コンピュータ装置105は、パーソナルコンピュータ（固定位置）、ラップトップもしくはポータブルコンピュータ、携帯情報端末、携帯電話、携帯タブレットコンピュータ、携帯オーディオプレイヤー、あるいはそれ以外のものも含め、あらゆる適切なコンピュータ装置であり得る。例えば、システム100は、それぞれ携帯電話およびタブレットとして具現化されたコンピュータ装置104および106を含むことができる。装置104および106はディスプレイ手段141、161、および／またはボタン／コントロール142を含み得る。コントロール142は、独立して、または上述されたコントロールのいずれかとの組合せで作用し得る。

さらに、装置104、105および106は、コミュニケーションチャンネル115、116（例えばワイヤー、ワイヤレス、ブルートゥース（登録商標）チャンネル等）を介して互いに連絡し得、さらにコミュニケーションチャンネル112、113、および114を介してネットワーク106と連絡し得る。

従って、装置104、105および106は全て、サーバー101およびデータ源103のうちの片方または両方と連絡し、お互いとも連絡し得る。これらの装置のそれぞれがネットワーク106およびお互いと切断可能に連絡し、ネットワーク106と常に通信することなく装置104、105および106が操作され得るようにしてもよい（例えばインターフェースのデータ接続制御を使用して）。例えば、利用可能なデータがない場合、またはビューアーが装置をオフラインで動くようにする場合（例えば直接のネットワーク接続がないとき）、装置104、105および106のいずれかにより使用されるデータは、貯蔵されたまたはキャッシュされた情報／パラメータに基づくものであり得る。装置104、105および106のそれぞれが、様々な例示的実施形態において記述された方法論を実行するように構成され得ることになる。

さらに、示された通信媒体のいずれかを使用して、装置104、105および106は、システム100の示された要素のいずれかで過去または現在において生産された異なるデータを操作し、共有し、伝達し、および／または受信することができる。例えば、データは、サーバー101および／またはデータ源103上に利用可能であり得る。さらに、装置104、105および106のいずれかのビューアーが、データを独立に操作、伝達等して、例えば所与の時点においてインデックスの現在値を別個に決定してもよい。

それに加えて、そして上述したように、本発明の例示的実施形態は、コンピュータ実行によるプロセスおよびそれらのプロセスを実施するための装置（例えばTFFによるLBLを制御するソフトウェア）の形態で具現化され得る。従って、例示的実施形態によって、本明細書中で先に記述した方法論が、コンピュータシステムまたは装置によって実行され得る。コンピュータシステムまたは装置は、上述した携帯デバイスおよびコンピュータ装置といくらか似ており、これは下記で記述する要素を含み得る。

図8は、例示的実施形態によるコンピュータ装置を示す。本明細書で記述した方法論の一部または全体が、コンピュータシステム200のプロセッサー202における指令として実行され得る。コンピュータシステム200は、指令および情報の貯蔵のためのメモリー201、コンピュータ通信のための入力装置（複数可）203、ならびに、ユーザーインターフェース205を表示し得る表示装置204を含む。ユーザーインターフェースは、例えば高分子電解質堆積サイクルを開始するための手動のユーザークリックが必要であるという表示を提供するなど、行為のプロンプトをユーザーに提供する。コンピュータシステム200はさらにネットワーク206に接続され得る。あるいは、コンピュータコントロールが、少なくとも1つの高分子電解質堆積サイクルの状態を表示するよう構成されたユーザーインターフェースを含む。

すなわち、本発明は、コンピュータシステム200といくらか類似したコンピュータシステム上のあらゆる適切なコンピュータプログラムとして、例えばソフトウェアにおいて、実施され得る。例えば、本発明によるプログラムは、本明細書に記述された例示的方法をコンピュータに実行させるコンピュータプログラム製品であり得る。

従って、実施形態は、コンピュータ実行によるプロセスおよびそれらのプロセスをコンピュータプログラム製品上で実施するための装置の形態で具現化され得る。実施形態は、図9に示すように、製造品としての有形媒体に具現化された、指令を含むコンピュータプログラムコード論理304を有する、コンピュータ使用可能媒体302上の、コンピュータプログラム製品300を含む。コンピュータ使用可能媒体302のための例示的製造品は、CD-ROM、ハードドライブ、ユニバーサルシリアルバス（USB）フラッシュドライブ、あるいはあらゆるその他のコンピュータ可読貯蔵媒体を含み得、そこでは、コンピュータプログラムコード論理304がコンピュータにロードされてコンピュータにより実行された場合に、そのコンピュータが本発明を実施するための装置となる。実施形態は、例えば、貯蔵媒体に貯蔵されているか、コンピュータにロードされおよび／またはコンピュータにより実行されるか、あるいは何らかの伝達媒体を介して（例えば電気的なワイヤーもしくはケーブルを介して、または光ファイバーを通して、または電磁放射を介して）伝達されるかである、コンピュータプログラムコード論理304を含み、そこでは、コンピュータプログラムコード論理304がコンピュータにロードされてコンピュータにより実行された場合に、そのコンピュータが本発明を実施するための装置となる。汎用マイクロプロセッサー上で実行される場合には、コンピュータプログラムコード論理304のセグメントが、特定の論理回路を創出するようにそのマイクロプロセッサーの構成を行う。

1つまたは複数のコンピュータ可読媒体のあらゆる組合せが利用され得る。コンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読シグナル媒体またはコンピュータ可読貯蔵媒体であり得る。コンピュータ可読貯蔵媒体は、例えば、電子的、磁気的、光学的、電磁気的、赤外的、もしくは半導体的なシステム、装置、もしくはデバイス、または上記のもののあらゆる適切な組合せであり得るが、これらに限定されない。コンピュータ可読貯蔵媒体のより具体的な例（非網羅的リスト）は、以下のものを含む：1つ以上のワイヤーを有する電気的接続、ポータブルコンピュータディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（RAM）、リードオンリーメモリ（ROM）、消去可能プログラム可能リードオンリーメモリ（EPROM、あるいはフラッシュメモリ）、光ファイバー、ポータブルコンパクトディスクリードオンリーメモリ（CD-ROM）、光学的貯蔵デバイス、磁気的貯蔵デバイス、または上記のもののあらゆる適切な組合せ。本明細書において、コンピュータ可読貯蔵媒体は、指令実行システム、装置、もしくはデバイスによる使用のためのまたはそれらに関係したプログラムを含有または貯蔵できるあらゆる有形媒体であり得る。

コンピュータ可読シグナル媒体は、例えばベースバンドにおけるまたは搬送波の一部としての、コンピュータ可読プログラムコードがそこに具現化された伝播データシグナル（propagated data signal）を含み得る。そのような伝播シグナルは、電磁的、光学的、またはそれらの適切な組合せを含むがそれに限定されない様々な形態のいずれかを取り得る。コンピュータ可読シグナル媒体は、コンピュータ可読貯蔵媒体ではなく、かつ指令実行システム、装置、もしくはデバイスによる使用のためのまたはそれらに関係したプログラムを通信し、伝播し、または輸送することができる、あらゆるコンピュータ可読媒体であり得る。

コンピュータ可読媒体上に具現化されるプログラムコードは、ワイヤレス、ワイヤーライン、光ファイバーケーブル、RF、等々、または上記のもののあらゆる適切な組合せを含むがそれに限定されない、あらゆる適切な媒体を使用して伝達され得る。

本発明の諸側面のための操作を実行するためのコンピュータプログラムコードは、1つまたは複数のプログラミング言語の組合せにより書かれてよく、それらの言語としては、Java（登録商標）、Smalltalk、C++等のオブジェクト指向プログラミング言語、および、「C」あるいは類似のプログラミング言語のような従来型の手続き型プログラミング言語が挙げられる。プログラムコードは、全てビューアーのコンピュータ上で、部分的にビューアーのコンピュータ上で、独立のソフトウェアパッケージとして、例えばネットワークシステムから、部分的にビューアーのコンピュータ上かつ部分的に遠隔コンピュータ上で、または全て遠隔のコンピュータもしくはサーバー上で、実行され得る。後者のシナリオでは、遠隔コンピュータは、ローカルエリアネットワーク（LAN）もしくはワイドエリアネットワーク（WAN）を含む任意の種類のネットワークを通じてビューアーのコンピュータに接続され得、または、外部コンピュータへの接続が設けられ得る（例えば、インターネットサービスプロバイダーを使用したインターネットを通じて）。

上述したように、例示的実施形態の特徴は、当技術分野で見られない他のユニークな特徴を含む。

本明細書に記述される方法および装置は、コアナノ粒子またはコアマイクロ粒子のような基質コア上に多層薄膜を堆積するために有用である。直径5ナノメートル（nm）から50マイクロメートル（μm）の規模のコアサイズが特に有用である。コアは、制御可能なサイズ分布を有し高分子電解質に結合するための十分な表面電荷（正または負のいずれか）を有することを条件として、多くの材料から作られ得る。無機材料から構成される典型的なコアとしては、CaCO₃マイクロ粒子、CaCO₃ナノ粒子、MgCO₃のようなその他の無機塩、リン酸カルシウム、シリカ粒子、および酸化鉄粒子が挙げられる。有機ポリマーから作られたコア粒子の例としては、ポリ乳酸（PLA）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリエチレングリコール（PEG）、キトサン、ラテックス、ヒアルロン酸、およびゼラチンから作られたナノ粒子およびマイクロ粒子が挙げられる。さらに、コアは、例えばポリ-L-グルタミン酸ナトリウム塩と共沈殿されたCaCO₃マイクロ粒子のように、無機材料と有機材料の両方からも構成され得る。

LBL薄膜プロセスの一般性および相対的単純性は、多数の異なる種類の高分子電解質を多数の異なる種類の表面上に堆積させることを可能にする。ポリペプチド多層薄膜は、高分子電解質多層薄膜のサブセットであり、例えば設計されたポリペプチドのような、荷電ポリペプチドを含む少なくとも1つの層を含むものである。他のポリマーから作られたフィルムに対して、ポリペプチド多層薄膜の重要な利点は、その生体適合性である。LBL薄膜はカプセル封入にも使用できる。ポリペプチド薄膜およびマイクロカプセルの応用としては、例えば、ナノリアクター、バイオセンサー、人工細胞、ワクチン、および薬剤送達担体が挙げられる。

「高分子電解質」という用語は、1,000より大きい分子量および分子当たり少なくとも5個の電荷を有するポリカチオン性またはポリアニオン性物質を包含する。適切なポリカチオン性物質としては、例えば、ポリペプチドおよびポリアミンが挙げられる。ポリペプチドとしては、例えば、ポリ-L-リジン（PLL）、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-オルニチン、ポリ- D-リジン、およびポリ- DL-リジンのようなポリペプチドが挙げられる。ポリアミンとしては、例えば、ポリビニルアミン、ポリ(アミノスチレン)、ポリ(アミノアクリレート)、ポリ(N-メチルアミノアクリレート)、ポリ(N-エチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノアクリレート)、ポリ(アミノメタクリレート)、ポリ(N-メチルアミノ-メタクリレート)、ポリ(N-エチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジメチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N-ジエチルアミノメタクリレート)、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド)、ポリ(N,N,N-トリメチルアミノアクリレートクロリド)、ポリ(メチアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド)、キトサン、および上記ポリカチオン性物質の1つまたは複数を含む組合せが挙げられる。適切なポリアニオン性物質としては、例えば、ポリ-L-グルタミン酸（PGA）のようなポリペプチド、ポリ-L-アスパラギン酸、ポリ-D-アスパラギン酸、ポリ-L-ガンマ-グルタミン酸、DNAおよびRNAのような核酸、アルギン酸、カラギーナン、ファーセレラン、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリ(メタ)アクリル酸、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、酸性多糖類、およびクロスカルメロース、側鎖カルボキシル基を含有する合成ポリマーおよびコポリマー、ならびに上記ポリアニオン性物質の1つまたは複数を含む組合せが挙げられる。一実施形態では、RSVエピトープと高分子電解質とが同じ符号の電荷を有する。

本明細書において、ホモポリマーとは、一種類の反復モノマーサブユニットから構成されるポリマーとして定義される。LBL製造の用途のためには、モノマーサブユニットは一般に少なくとも1つの電荷（正または負）を帯びている。すなわちLBL用途のためには、ホモポリマーは通常、高分子電解質である、LBLにおいて有用な、非常に多様なホモポリマーが存在する。特に重要なのは、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ-L-アスパラギン酸、ポリ-L-リジン、およびポリ-L-アルギニンに代表されるような重合体アミノ酸である。ホモポリマーが、反復するアミノ酸から構成される場合、それはホモポリペプチドとも呼ばれ得る。本明細書において、ホモポリペプチドについて使用される略記はHPである。

一実施形態では、薄膜の1つまたは複数の高分子電解質層が、設計されたポリペプチド（DP）を含む。任意で、簡便性のために、設計されたポリペプチドは化学合成される。一実施形態において、静電気的交互層堆積に適したポリペプチドのための設計原理は、米国特許公報第2005/0069950号に説明されており、この文献はそのポリペプチド多層薄膜の教示に関して参照により本明細書に組み入れられる。手短に述べると、主たる設計考慮点は、ポリペプチドの長さおよび荷電である。静電気性は、静電気的LBLの基礎であることから、最も重要な設計考慮点である。適切な荷電特性がないと、ポリペプチドはpH 4〜10の水溶液中で実質的に可溶性でなくなり得、静電気的LBLによる多層薄膜の製造のために容易に使用できなくなり得る。他の設計考慮点としては、ポリペプチドの物理的構造、ポリペプチドから形成された薄膜の物理的安定性、ならびに、薄膜および構成ポリペプチドの生体適合性および生理活性が挙げられる。特定の側面において、設計されたポリペプチドは、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌に関するエピトープを含み、免疫応答を誘導することに適している。

設計されたポリペプチドは、反対に荷電した表面への安定的結合のために十分な電荷を有するポリペプチド、すなわち、薄膜形成のための駆動力が静電気である多層フィルムの層中に堆積されることができるポリペプチドを意味する。短期安定薄膜とは、いったん形成されて、PBS中で37℃で24時間インキュベートされた後に、その成分の半分超を保持する薄膜である。特定の実施形態において、設計されたポリペプチドは、長さが少なくとも15アミノ酸であり、pH 7.0におけるポリペプチドの残基当たりの実効電荷（net charge）の大きさが0.1以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、または0.5以上である。pH 7.0において正に荷電する（塩基性の）天然アミノ酸は、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、オルニチン（Orn）、およびリジン（Lys）である。pH 7.0において負に荷電する（酸性の）天然アミノ酸残基は、グルタミン酸（Glu）およびアスパラギン酸（Asp）である。全体としての電荷の実効比率が特定される基準を満たす限り、反対の電荷のアミノ酸残基の混合物を利用することができる。一実施形態では、設計されたポリペプチドはホモポリマーではない。別の実施形態では、設計されたポリペプチドは分枝していない。

一実施形態において、設計されたポリペプチドは、2つの表面吸着領域、すなわちN末端表面吸着領域とC末端表面吸着領域とに挟まれた、単一の抗原性エピトープを含む。別の実施形態において、設計されたポリペプチドは、1つの表面吸着領域に隣接された単一の抗原性エピトープを含み、その表面吸着領域はそのエピトープのN末端に連結されている。別の実施形態において、設計されたポリペプチドは、1つの表面吸着領域に隣接された単一の抗原性エピトープを含み、その表面吸着領域はそのエピトープのC末端に連結されている。

設計されたポリペプチドのこれら独立した領域（例えばエピトープおよび表面吸着領域）のそれぞれが、液相ペプチド合成、固相ペプチド合成、または適切な宿主生物体の遺伝子操作により別々に合成され得る。液相ペプチド合成は、今日市場に出ている認可済みペプチド医薬品のほとんどの製造のために使用されている方法である。液相法と固相法の組合せを使用して、比較的長いペプチド、そして小さなタンパク質さえも合成することができる。ペプチド合成会社は、サービス手数料方式で難しいペプチドを合成するための専門知識および経験を有している。合成は優良製造規範（GMP）条件下で、臨床治験および商業的薬剤発売に適した規模において行われる。

あるいは、これら様々な独立した領域は、液相ペプチド合成、固相ペプチド合成、または適切な宿主生物体の遺伝子操作により、単一のポリペプチド鎖として一緒に合成され得る。具体的事例におけるアプローチの選択は、簡便性および経済性の問題であろう。

本発明の上述した実施形態、特に、特定の実施例の詳細な考察は、実施の可能な例に過ぎず、本発明の原理の明確な理解のために提示されているのだということが強調されるべきである。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の上述した実施形態（複数可）に多くの改変および修正が施され得る。そのような修正および改変の全てが、本明細書において本開示および本発明の範囲内に包含され、下記の特許請求の範囲により保護されることが意図される。

Claims (24)

1. 基質コア上に堆積された少なくとも1つの高分子電解質層を含む粒子の自動合成のためのシステムであって、前記システムは、
   コンピュータと、
   TFFループと浸透液バルブとを含むタンジェンシャルフロー濾過（TFF）構成部であって、前記浸透液バルブは前記コンピュータによる制御を介して浸透工程を選択的に実行するように構成され、前記TFFループは、前記基質コアの懸濁液を保持する粒子貯蔵部、TFFフィルター、前記粒子貯蔵部と前記TFFフィルターとを接続する接続手段、および産物バッグを含み、前記TFFループは、前記TFFフィルター、前記粒子貯蔵部、前記接続手段、および前記産物バッグを含む閉ループ管ネットワークを含み、前記粒子貯蔵部は前記基質コアの分散を維持するための機械的撹拌手段を備えている、タンジェンシャルフロー濾過構成部と、
   可溶性試薬添加マニフォールド構成部であって、前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部から前記タンジェンシャルフロー濾過構成部への可溶性試薬の送達が、前記コンピュータにより制御される少なくとも1つのバルブにより制御され、前記可溶性試薬は高分子電解質を含み、前記閉ループ管ネットワークは、試薬を前記タンジェンシャルフロー濾過ループに分配する目的のために、前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部へと延長し前記少なくとも1つのバルブに取り付けられている、可溶性試薬添加マニフォールド構成部と
   を含み、
   前記システムは、前記基質コア上に堆積された少なくとも1つの高分子電解質層を含む粒子の合成のための連続的流路を提供する循環ループを無菌的に提供し、
   前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、複数の試薬を前記TFF構成部に送達するための複数のコンピュータ制御されたバルブを含み、前記複数の試薬は、反対に荷電した高分子電解質を含み、
   前記タンジェンシャルフロー濾過構成部および前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部が、複数の反対に荷電した高分子電解質層を含有する多層薄膜の自動交互積層形成を実行するように構成され、ここで、少なくとも1つの高分子電解質堆積サイクルが、タンジェンシャルフロー濾過浸透工程のコンピュータ制御により、および前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部からの複数の試薬の送達のコンピュータ制御により、少なくとも部分的に自動化されている、
   システム。
2. 前記浸透液バルブ、および前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部の少なくとも1つのコンピュータ制御されたバルブが、前記連続的流路に対して外部にある、請求項１に記載のシステム。
3. 前記浸透液バルブ、および前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部の少なくとも1つのコンピュータ制御されたバルブが、コンピュータ制御下でかつユーザーによる始動なしで完全に自動化されている、請求項１に記載のシステム。
4. 前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部から前記タンジェンシャルフロー濾過構成部への、前記可溶性試薬の規定された体積の自動送達；
   前記TFFループ中で前記基質コアの粒子と共に前記可溶性試薬を規定された時間に渡り混合すること；
   前記TFFループ中で剰余の可溶性試薬を、規定された体積だけ浸透により除去すること；および
   前記可溶性試薬中の前記高分子電解質とは反対の極性を有する第2の試薬の規定された体積を、前記可溶性試薬添加マニフォールド構成部を介して送達すること
   を実行可能にするように構成されている、請求項１に記載のシステム。
5. 前記基質コアが5 nm〜50μmの直径を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシステム。
6. 前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、廃液構成部、タンジェンシャルフロー濾過構成部、またはその両方への、前記コンピュータにより制御された洗浄バッファーの送達を実行可能にしている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシステム。
7. 前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、1つ以上のコンピュータ作動バルブを含む経路を通して前記可溶性試薬を前記粒子貯蔵部へと推進させるように構成された、少なくとも1つのポンプを含む、請求項1に記載のシステム。
8. 前記可溶性試薬が前記試薬添加マニフォールド構成部から前記タンジェンシャルフロー濾過構成部に送達されよく混合されて、得られる高分子電解質濃度が予測可能かつ再現可能となっている、請求項１に記載のシステム。
9. 前記高分子電解質濃度が、所望の高分子電解質濃度の+/-20%以内である、請求項８に記載のシステム。
10. 前記所望の高分子電解質濃度が約0.2〜2.0 mg/mLである、請求項９に記載のシステム。
11. 前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、ポンプ、重力、シリンジ、または加圧ガスのうちの1つにより少なくとも1つの試薬を推進して前記TFF構成部に送達するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
12. 前記タンジェンシャルフロー濾過構成部および／または前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、少なくとも1つのコンピュータ制御されたベントをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
13. 前記可溶性試薬送達マニフォールド構成部は、送達される可溶性試薬または送達されない可溶性試薬の体積または重量を表示するように構成された試薬計量装置を含む、請求項１に記載のシステム。
14. 前記計量装置は、可溶性試薬送達の時間および量を記録する目的のために前記コンピュータにデータを送信するように構成されている、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記タンジェンシャルフロー濾過構成部は、TFF循環ループ体積データを前記コンピュータに報告するように構成された体積計量装置を含む、請求項１に記載のシステム。
16. 前記コンピュータが、バルブを作動して、試薬の追加により体積を増加させるかまたは浸透により体積を減少させることにより、前記タンジェンシャルフロー濾過構成部内部の混合物のループ体積を設定された範囲内に維持するように構成されている、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記コンピュータが、ユーザー行為のためのコンピュータプロンプトをユーザーに提供するように構成されたユーザーインターフェースを含む、請求項１に記載のシステム。
18. 前記プロンプトは、高分子電解質堆積サイクルを開始するための手動のユーザークリックが必要であることの表示を含む、請求項１７に記載のシステム。
19. 前記コンピュータは、少なくとも1つの高分子電解質堆積サイクルの状態を表示するように構成されたユーザーインターフェースを含む、請求項１に記載のシステム。
20. 前記タンジェンシャルフロー濾過構成部は、特定の高分子電解質堆積サイクル工程のあいだに前記フィルターを通過する浸透液の量を測定しそのデータを制御コンピュータに送り返す、計量装置を含む、請求項１に記載のシステム。
21. 前記コンピュータが、ユーザーにより指定された量の浸透液を測定すると高分子電解質堆積サイクル工程を自動的に終了させる、請求項２０に記載のシステム。
22. 前記ユーザーにより指定された量の浸透液が、前記タンジェンシャルフロー濾過ループを出る浸透液の量を連続的に測定する電子的計量器からの信号の形態をとる指標に基づいて測定される、請求項２１に記載のシステム。
23. 前記閉ループ管ネットワークは、ガンマ線照射、またはエチレンオキシド、または熱による処理によって滅菌される、請求項１に記載のシステム。
24. 前記閉ループ管ネットワークは、前記TFF構成部のポンプおよび少なくとも1つの前記コンピュータ制御されたバルブに取り付けられるように構成される、請求項１に記載のシステム。