TW201906872A - 新穎的治療性酵素融合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關一種治療性酵素與免疫球蛋白Fc區之間之融合蛋白、其方法、及包含該融合蛋白之組成物。
Description
本發明係有關一種治療性酵素融合蛋白、其製造方法、及含其之組成物,其中為了延長治療性酵素之活體內半衰期的目的,而使免疫球蛋白Fc區與酵素融合。
溶酶體為細胞質胞器,其功能在於降解諸如蛋白質、聚核苷酸、多醣、與脂質之大分子。溶酶體之內部環境為酸性,且其內包含促進生物性大分子水解之水解酵素。已發現溶酶體在透過細胞內胞吞作用吸收分子時扮演某種角色。
溶酶體儲積症(下文中稱為LSDs)為一種遺傳代謝疾病,其特徵在於溶酶體功能喪失。LSDs係因降解諸如脂質、蛋白質、多醣,等等物質之酵素缺陷所造成,且其等發生率通常為100,000分之一,並隨著體染色體的隱性遺傳特性遺傳。當特定的降解性酵素缺陷或缺乏時,即出現LSDs,且當此等降解性酵素不足時,所造成過量的物質未被降解而累積,最後使細胞功能產生問題。 如同許多其他遺傳疾患,LSDs係遺傳自雙親。此外,此等個別疾病係由分別涉及不同酵素轉譯之任何基因突變所造成。造成此等疾病之酵素通常具有類似生化特性,且所有的LSDs均由物質在溶酶體中異常累積所造成。目前,已知約50種不同LSDs類型(例如:尼曼匹克症、Fabry氏病、高雪氏症、Hunter氏症候群、Maroteaux-Lamy二氏症候群,等等)。治療此等LSDs之代表性方法可為酵素置換療法(ERT),且許多相關研究目前都在進行中(Frances M.Platt等人,J Cell Biol.2012 Nov 26;199(5):723至34)。
Hunter氏症候群為LSDs之代表,係一種因艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)缺陷所引起之疾病,其中糖胺聚醣(GAG)因為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺陷而無法被降解並累積在溶酶體中。Hunter氏症候群之症狀包括在臉部出現不同的粗糙度特徵、大頭、腹部因肝腫大及脾腫大而膨脹,等等,且其亦伴隨聽力喪失、心臟瓣膜疾病、阻塞性呼吸疾病、睡眠呼吸中止,等等。已知每162,000個人中有一個人會發生Hunter氏症候群,且係以與X染色體相關之X-連鎖隱性形式的遺傳。目前已使用Elaprase®(重組的IDS,夏爾製藥集團)作為治療Hunter氏症候群之酵素置換療法。
通常,如:治療性酵素之蛋白質具有低安定性,且因此容易變性以及被血液內的蛋白酶分解。因此,為了維持此等蛋白質之血液濃度與效力,經常投予至患者 係必要的。然而,若以注射型式將蛋白質藥物投予患者,為了維持活性多肽之血液濃度而經常注射時,可能會給患者帶來很大的痛苦。為了解決此等問題,已持續努力藉由提高治療性酵素之血液安定性,並於更長的期間維持其高水平之血液濃度,以使醫藥效力最大化。需要此種治療性酵素之長效製劑,以提高治療性酵素之安定性,且同時使藥物本身之效力維持在足夠高的水平,並且不會引起患者的免疫反應。
特定言之,LSDs係一種由特定酵素之遺傳缺陷所引起之致命性疾病,且置換療法對於治療該缺陷的酵素係必要的。酵素置換療法為LSDs之標準療法,且該療法之功效在於藉由置換該缺陷之酵素來減緩已出現之症狀或延遲該疾病之進展。然而,由於需要每1或2週連續靜脈投藥2小時至6小時,因此患者與其家屬的日常生活可能會受到限制。
由於用於治療人類LSDs之重組酵素之半衰期係在10分鐘至3小時以內之非常短的範圍內,因此必需終生投予重組酵素,從而造成患者不便。因此,極需要延長該重組酵素之半衰期。
為了安定蛋白質及防止被腎臟被排出,目前積極研究利用免疫球蛋白Fc區之融合蛋白。
免疫球蛋白為血液之主要成分,且有5種不同類型(即,IgG、IgM、IgA、IgD、及IgE)。最常用於融合蛋白研究之類型為IgG,且其分為四種亞型 (IgG1~IgG4)。使用免疫球蛋白Fc所製備之融合蛋白可增加其尺寸,並從而防止其被腎臟排出,且亦結合至FcRn受體,從而透過胞吞作用及再循環至細胞中而具有延長血液半衰期之作用。
然而,免疫球蛋白Fc區之缺點在於其會引起意外的免疫反應,從而具有效應因子功能,如:抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。此等功能係透過免疫球蛋白Fc區與Fc受體或補體之結合,或Fc區之糖基化而進行。此外,Fc本身極可能在活體內出現不穩定性。
因此,其缺點在於無法在所需之融合蛋白於活體內穩定增加之期間內同時維持融合蛋白之活性。
本發明之目的係提供一種酵素融合蛋白,其中免疫球蛋白Fc區係與治療性酵素融合,以使該治療性酵素相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素,於活體內之持續時間增加。
本發明之另一個目的係提供一種包含治療性酵素融合蛋白之醫藥組成物。
本發明之又另一個目的係提供一種編碼該治療性酵素融合蛋白之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之表現載體、及引進該表現載體之轉形體。
本發明之又另一個目的係提供一種製備酵 素融合蛋白之方法,其包括培養該轉形體。
本發明係有關一種長效治療性酵素融合蛋白,及具體而言,係有關一種酵素融合蛋白,其中免疫球蛋白Fc區係與治療性酵素融合,以提高治療性酵素之安定性,及降低酵素被腎臟排出之機轉。本發明之酵素融合蛋白由於持續時間之延長,因此可被患者有效利用。
第1圖顯示確認IDS-Fc融合蛋白表現之圖表。
第2圖顯示確認ARSB-Fc融合蛋白表現之圖表。
第3圖顯示確認本發明之IDS-Fc融合蛋白之藥物動力學實驗結果之圖表。
第4圖顯示確認本發明之ARSB-Fc融合蛋白之藥物動力學實驗結果之圖表。
第5圖顯示確認本發明之IDS-Fc融合蛋白之活體外酵素活性之圖表。
第6圖顯示確認本發明之ARSB-Fc融合蛋白之活體外酵素活性之圖表。
第7圖顯示說明在IDS-剔除小鼠內經靜脈或皮下注射本發明之IDS-Fc融合蛋白後,尿液中糖胺聚醣(GAG)水平之測定結果之圖表。
第8圖顯示說明在IDS-剔除小鼠內經靜脈或皮下注射本發明之IDS-Fc融合蛋白後,組織中糖胺聚醣(GAG) 水平之測定結果之圖表。
第9圖顯示確認本發明之ARSB-Fc融合蛋白之組織分佈程度之圖表。
本發明之一方面提供一種酵素融合蛋白,其中治療性酵素係與免疫球蛋白Fc區融合。
在具體實施例中,本發明係有關一種酵素融合蛋白,其中免疫球蛋白Fc區係與治療性酵素融合,以使該治療性酵素相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素,於活體內之持續時間增加。
下文對應於本發明之其他實施例。
具體而言,根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於酵素係選自由下列所組成之群組:β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己糖胺酶A、B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N-乙醯基-胺基葡萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯膽鹼酯酶、殼糖酶、麩胺酸脫羧基酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內肽酶、與骨髓過氧化酶。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於酵素融合蛋白中之治療性酵素與免疫球蛋白Fc區係藉由肽連接子融合。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於由一免疫球蛋白Fc區分子與二聚合的治療性酵素融合。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區在天然免疫球蛋白Fc區之至少一個胺基酸具有一個選自由:取代、添加、刪除、修飾、與其組合所組成之群組中之變異。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於具有胺基序列SEQ ID NO:8之免疫球蛋白Fc區中,第2個胺基酸係被脯胺酸取代;第71個胺基酸係被麩醯胺取代;或第2個胺基酸係被脯胺酸取代且第71個胺基酸係被麩醯胺取代。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區內並未發生鏈交換。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素具有提高之安定性及降低對溶酶體受體之結合親合力,因此具有高度的組織分佈性。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區係選自由以 下所組成之群組:(a)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、與CH4結構域;(b)CH1結構域與CH2結構域;(c)CH1結構域與CH3結構域;(d)CH2結構域與CH3結構域;(e)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、及CH4結構域中的一個或兩個或多個結構域與免疫球蛋白鉸鏈區或鉸鏈區的一部分之組合;及(f)在重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各結構域之間之二聚體。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區具有選自由以下所組成之群組之至少一項特徵:(a)移除可以形成雙硫鍵之區、(b)移除天然Fc之N-末端上某些胺基酸殘基、(c)在天然Fc之N-末端添加甲硫胺酸殘基、(d)移除補體-結合位置、或(e)刪除抗體-依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位置。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區係無糖基化。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM之Fc片段。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區係具有衍生自選自由IgG、IgA、IgD、IgE、及IgM所組成之群組之免疫球蛋白之不同來源之結構域的雜合體。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於免疫球蛋白Fc區係IgG4 Fc區。
根據前述任一具體實施例之酵素融合蛋白,該酵素融合蛋白之特徵在於IgG4 Fc區之鉸鏈區係被IgG1鉸鏈區取代。
本發明之另一方面提供一種預防或治療溶酶體儲積症(LSD)之醫藥組成物。
在具體實施例中,本發明係有關一種預防或治療LSD之醫藥組成物,包含酵素融合蛋白。
根據前述任一具體實施例之組成物,該組成物之特徵在於LSD係選自由以下所組成之群組:黏多醣症(MPS)、肝醣儲積症、神經鞘脂質病、尼曼匹克症、Fabry氏病、高雪氏症、Hunter氏症候群、與Maroteaux-Lamy二氏症候群。
根據前述具體實施例之組成物,該組成物之特徵在於酵素係艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)或芳基硫酸酯酶B(ARSB)。
根據前述任一具體實施例之組成物,該組成物之特徵在於其降低治療性酵素對溶酶體受體之結合親合力。
本發明之又另一方面提供一種編碼酵素融合蛋白之聚核苷酸。
本發明之又另一方面提供一種包含聚核苷 酸之表現載體。
本發明之又另一方面提供一種引進表現載體之轉形體。
本發明之又另一方面提供一種製備酵素融合蛋白之方法。
在具體實施例中,本發明係有關一種製備酵素融合蛋白之方法,包括培養轉形體,以獲得培養物;及從培養物中回收酵素融合蛋白。
下文將詳細說明本發明之例示性實施例。同時,本文所揭示之各說明與例示性實施例均可應用於其他的說明與例示性實施例。亦即本文所揭示各種不同要素之所有組合均屬於本發明之範圍。此外,本發明之範圍不應受限於下文所提供之具體內容之限制。
此外,彼等所屬技術領域中具有通常知識者基於例行實驗即咸了解或證實本申請案所說明之本發明之具體實施例的許多等效物,且此等等效物均意圖包括在本發明中。
本說明全文中,對於天然存在的胺基酸不僅使用習知的單一字母或三個字母的編碼,亦使用通常允許使用其他胺基酸之彼等三個字母的編碼,如:α-胺基異丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘胺酸)、α-甲基-麩胺酸,等等。此外,本文中以縮寫表示之胺基酸係依據如下說明之IUPAC-IUB規則: 丙胺酸 A; 精胺酸 R;天冬醯胺 N; 天冬胺酸 D;半胱胺酸 C; 麩胺酸 E;麩醯胺 Q; 甘胺酸 G;組胺酸 H; 異白胺酸 I;白胺酸 L; 離胺酸 K;甲硫胺酸 M; 苯基丙胺酸 F;脯胺酸 P; 絲胺酸 S;蘇胺酸 T; 色胺酸 W;酪胺酸 Y;與 纈胺酸 V。
本發明之一方面提供一種酵素融合蛋白,其中免疫球蛋白Fc區係與治療性酵素融合,以使該治療性酵素相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素,具有增加之活體內持續時間。
本發明中,酵素融合蛋白可為其中免疫球蛋白Fc區與治療性酵素融合者,因此該治療性酵素相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素,可維持其活性,同時降低其對溶酶體受體之結合親合力,從而延長其血液半衰期。
本案發明人已製備一種具有免疫球蛋白Fc區之融合蛋白,以延長治療性酵素之血液半衰期。特 定言之,使用IgG4 Fc類似物作為Fc區,其中潛在之糖基化序列被取代,以抑制糖基化,及額外的IgG4 Fc之鉸鏈序列被取代,以抑制鏈交換。結果,本案發明人已證實,與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素融合蛋白之血液半衰期具有顯著增加之血液半衰期,且可維持類似彼等已知酵素之活性,從而提供其中由治療性酵素與免疫球蛋白Fc區融合之新型融合蛋白結構。
包含在本發明之酵素融合蛋白中之治療性酵素可包括任何比未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素類型具有延長的活體內持續時間之優點的治療性酵素,但該治療性酵素並未特別限制於此。在本發明之例示性實施例中,酵素融合蛋白係治療性酵素之融合蛋白。
此外,可使用本發明之酵素融合蛋白作為酵素性置換療法(ERT)之藥物。酵素性置換療法可以藉由補充引起疾病之缺陷或缺少之酵素,透過恢復已破壞之酵素功能來預防或治療疾病。
在具體實施例中,治療性酵素可為選自由以下所組成之群組之治療性酵素:β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己糖胺酶A、B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N-乙醯基--胺基葡 萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯膽鹼酯酶、殼糖酶、麩胺酸脫羧基酶、伊米苷酶、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內肽酶、與骨髓過氧化酶,但任何具有治療疾病功效之治療性酵素,不論其來源或類型均可涵蓋在本發明內。
在本發明中,術語「酵素融合蛋白」可與「長效酵素融合蛋白」互換使用。
如本文中所使用,術語「治療性酵素」係指用於治療因缺失、不足、功能失效等原因所引發之疾病的酵素,該酵素可藉由酵素置換療法、投藥法等以治療罹患該疾病之個體。具體而言,該酵素可為治療由於溶酶體酵素之缺失、不足等而引發LSDs之酵素,但該酵素不限於此。
具體而言,本發明之治療性酵素可為芳基硫酸酯酶B(ARSB)或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶,但該治療性酵素不限於此,只要其為對目標疾病具有治療功效之酵素即可。
如本文中所使用,術語「芳基硫酸酯酶B(ARSB)」係指存在於肝臟、胰臟、及腎臟之溶酶體中的芳基硫酸酯酶,且該酵素之角色為藉由分解糖胺聚醣來水解硫酸酯。已知芳基硫酸酯酶B與黏多醣症VI(Maroteaux-Lamy二氏症候群)有關。在本發明中,術語芳基硫酸酯酶B可與加硫酶(galsulfase)互換使用。具體而言,芳基硫酸酯酶B可包括胺基酸序列SEQ ID NO:4,其可由聚核苷酸序列SEQ ID NO:3編碼而得,但該芳基硫酸酯酶B不受限於此。
如本文中所使用,術語「艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶」係與Hunter氏症候群(MPS-II)有關之硫酸酯酶,且其為溶酶體降解硫酸肝素及硫酸皮膚素所必要之酵素。在本發明中,術語艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可與艾杜硫酸酯酶(idursulfase)互換使用。艾杜硫酸酯酶可為α-艾杜糖硫酸酯酶或β-艾杜硫酸酯酶,但該艾杜硫酸酯酶不受限於此。具體而言,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可包括胺基酸序列SEQ ID NO:2,其可由聚核苷酸序列SEQ ID NO:1編碼而得,但該艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶不受限於此。
治療性酵素可藉由本領域習知之方法製備或製造,且具體而言,在培養嵌入有動物表現載體之動物細胞後,可從培養物中純化該酵素,或可購自市售酵素後使用,但該酵素不受限於此。
本發明之酵素融合蛋白之形式可為其中一個或兩個酵素與具有兩個免疫球蛋白鏈之Fc區的一個分子結合以形成二聚體形式,但該酵素融合蛋白不受限於此。具體而言,本發明之酵素融合蛋白之形式可為其中由單體Fc區與酵素融合並表現,然後,兩個單體Fc區透過雙硫鍵以形成一分子之二聚體Fc區,而該兩個酵素分別連接這兩個Fc區中之各一個,但該酵素融合蛋白不受限於此。酵素可能透過共價鍵或非共價鍵彼此連接,或可彼此分別 獨立,但該酵素融合蛋白不受限於此。
具體而言,在本發明之實施例中,已證實長效酵素融合蛋白(其中艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶或芳基硫酸酯酶B之二聚體與一分子之Fc區融合,相較於未與Fc區融合之酵素具有更高之活體外酵素活性,且已證實其係歸因於酵素融合蛋白中包含治療性酵素之二聚體之結構特性(實例5)。
此外,在另一方面,本發明之酵素融合蛋白可為免疫球蛋白Fc區與治療性酵素透過肽連接子融合者。
肽連接子可包括一個或多個胺基酸,例如:1至1,000個胺基酸,但肽連接子不特別受限於此。在本發明中,任何已知的肽連接子(例如:包括[GS]x連接子、[GGGS]x連接子、及[GGGGS]x連接子等,其中x為自然數1或更大(例如:1、2、3、4、5、或更大),且更具體而言,胺基酸序列SEQ ID NO:6,但肽連接子不受限於此。
為了本發明之目的,與治療性酵素及免疫球蛋白Fc融合之肽連接子的位置並沒有限制,只要可連接治療性酵素及免疫球蛋白Fc之肽連接子並同時維持治療性酵素之活性即可,具體而言,在治療性酵素與免疫球蛋白Fc區之兩端,及更具體而言,在治療性酵素之C-末端與免疫球蛋白Fc區之N-末端,但位置不受限於此。
如本文中所使用,術語「N-末端」及「C- 末端」係分別指蛋白質之胺基端與羧基端。例如:「N-末端」或「C-末端」可能不僅包括N-末端或C-末端最後一個胺基酸殘基,亦可包括鄰接於N-末端或C-末端胺基酸殘基之胺基酸殘基,且具體而言,從末端本身起算之第1個胺基酸殘基至第20個胺基酸殘基,但N-末端或C-末端不特別受限於此。
在本發明之實施例中,IgG4之N-末端與治療性酵素之C-末端融合之融合蛋白(SEQ ID NO:23或25),係利用治療性酵素與連接子(SEQ ID NO:6)-IgG4經由重疊PCR而製備,並證實融合蛋白之表現(實例1至3)。
包含於本發明之酵素融合蛋白的治療性酵素可為天然發生的類型,及由治療性酵素之一部份所組成之片段、或已發生選自由取代、添加、刪除、與修飾所組成之群組之變異的一些胺基酸、及其組合之治療性酵素的類似物,均可不受限地包含於本發明內,只要其具有等同於天然發生類型之治療性酵素之活性即可。
此外,治療性酵素之類似物包括所有彼等在天然發生類型之治療性酵素之胺基與/或羧基末端添加一個或多個胺基酸者。
對於胺基酸之取代或添加,不僅可使用常見於人類蛋白質中之20種胺基酸,亦可使用非典型或非天然發生的胺基酸。非典型胺基酸之商品來源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.、Genzyme Pharmaceuticals等。包括此等胺基酸及非典型肽序列之肽可被合成及購自商品供應商,例如:American Peptide Company、Bachem(美國)、或Anygen(韓國),但商品來源不受限於此。
如本文中所使用,術語「片段」係指已去除天然的治療性酵素或天然的治療性酵素之類似物之胺基或羧基末端中的一個或多個胺基酸。天然的治療性酵素或其類似物不論片段大小或胺基酸種類,只要其等具有治療性酵素之活性,均屬於本發明之範圍內。
治療性酵素之類似物可包括相應治療性酵素之生物仿製藥與生物改良藥(biobetters)。例如:在生物仿製藥方面,考量相較於已知的治療性酵素,其在宿主中之表現之差異、醣基化特徵及其程度之差異、以及在相應酵素之特定胺基酸殘基依據標準序列之取代程度非為100%取代之取代程度的差異,其等屬於生物仿製藥酵素,可被使用作為本發明之酵素融合蛋白。治療性酵素可採用本領域已知的方法製造,具體而言,藉由在動物細胞、大腸桿菌(E.coli)、酵母菌、昆蟲細胞、植物細胞、活體動物等中進行基因重組,且製造方法並不限於此,且可自市售商品購買酵素及使用,但酵素不限於此。
此外,治療性酵素可包括與上述酵素或其類似物具有至少80%,更具體而言90%,及甚至更具體而言91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高同源性之胺基酸序列,且治療性酵素可藉由 採用重組技術自微生物製得或可自商品取得,但治療性酵素不限於此。
如本文中所使用,術語「同源性」代表與野生型胺基酸序列或野生型核苷酸序列之相似度,且可藉由肉眼或使用容易購得之比對程式進行同源性比對。兩個或多個序列之間之同源性可藉由使用市面上之電腦程式以計算百分比(%)。可以計算相鄰序列之同源性(%)。
治療性酵素或其類似物之序列及編碼其等之核苷酸序列之資訊可從已知的資料庫獲得(例如:NCBI等)。
如本文中所使用,術語「免疫球蛋白Fc區」係指免疫球蛋白分子中包括重鏈恆定區2(CH2)與/或重鏈恆定區3(CH3)的區域,且排除重鏈與輕鏈之可變區。為了本發明之目的,此等免疫球蛋白Fc區可包括在重鏈恆定區之經修飾的鉸鏈區,但不限於此。
此等免疫球蛋白Fc區可包括重鏈恆定區之鉸鏈區,但不限於此。此外,本發明之免疫球蛋白Fc區可為延長之Fc區,包括重鏈恆定區1(CH1)與/或輕鏈恆定區1(CL1)的一部份或全部,且排除免疫球蛋白之重鏈與輕鏈之可變區,只要免疫球蛋白Fc區具有與其天然的類型相同或同等攻效即可。此外,本發明之免疫球蛋白Fc區可為其中已移除對應於CH2與/或CH3之相當長胺基酸序列部分的區域。
在另一方面中,本發明提供一種免疫球蛋 白Fc區,其可選自由以下所組成之群組:1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、與CH4結構域;2)CH1結構域與CH2結構域;3)CH1結構域與CH3結構域;4)CH2結構域與CH3結構域;5)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、與CH4結構域中一個或兩個或多個結構域與免疫球蛋白鉸鏈區(或鉸鏈區之一部份)之間的組合;及6)重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各結構域之間的二聚體,但免疫球蛋白Fc區不受限於此。
如本文中所使用,術語「鏈交換」係指當使用IgG4 Fc作為融合蛋白之載體時的問題,IgG4 Fc會與存在於活體內之IgG4形成雜合體,或以單體呈現並改變原始結構而成為具有治療活性低之結構,過去曾有報告指出已與蛋白質融合之融合蛋白很難用於治療目的(van der Neut Kolfschoten等人,Science,317:1554至1557.2007)。
在本發明中,本案發明人已藉由取代免疫球蛋白Fc區中鉸鏈區之序列,努力解決上述問題。具體而言,本發明之免疫球蛋白Fc區可為其中有效力之醣基化序列被取代以調節醣基化或涉及鏈交換之序列被取代者,或可能對應於這兩種例子。
在具體實施例中,本發明之免疫球蛋白Fc區可為其中在SEQ ID NO:8之免疫球蛋白Fc區之第2個胺基酸與/或第71個胺基酸被不同胺基酸取代者,以防止鏈交換及N-醣基化。更具體而言,本發明之免疫球蛋 白Fc區可為1)其中第2個胺基酸(即,絲胺酸)被脯胺酸取代者,2)其中第71個胺基酸(即,天冬醯胺)被麩醯胺取代者,但免疫球蛋白Fc區不限於此。除了上述變異外,免疫球蛋白Fc區可包括適當的變異作為藥物載劑,以提高治療性酵素之安定性。
具體而言,免疫球蛋白Fc區可為其中免疫球蛋白IgG4 Fc之鉸鏈區被IgG1鉸鏈區取代者,但免疫球蛋白Fc區不受限於此。
在本發明之實施例中,SEQ ID NO:8之免疫球蛋白Fc區之第2個胺基酸被脯胺酸取代,及SEQ ID NO:8之免疫球蛋白Fc區之第71個胺基酸被麩醯胺取代,藉以降低鏈交換及N-醣基化。所製備之免疫球蛋白Fc之序列具有胺基酸序列SEQ ID NO:9(實例1)。
在一實施例中,鉸鏈區可為其中具有下列胺基酸序列之一部份的鉸鏈序列已被刪除或修飾。
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO:26)
具體而言,鉸鏈區可為具有其中一部份的鉸鏈區已被刪除,而僅包括一個半胱胺酸(Cys)殘基之變異;或可為其中涉及鏈交換之絲胺酸(Ser)殘基被脯胺酸(Pro)殘基取代者,及更具體而言,為其中鉸鏈序列之第2個絲胺酸被脯胺酸殘基取代者,但鉸鏈區不限於此。
在本發明中,免疫球蛋白Fc區可藉由包含在其天然形式中的鉸鏈區或經修飾的鉸鏈區來提高融合之治療性酵素之安定性,同時防止在Fc區中出現鏈交換及形成單體。
此外,在另一項具體之實施例中,本發明之免疫球蛋白Fc區不僅包括天然的胺基酸序列,而且包括其序列類似物。胺基酸類似物係指在天然的胺基酸序列中的至少一個胺基酸殘基發生選自由以下所組成之群組之變異:取代、添加、刪除、修飾、及其組合。
例如:已知對連結具有重要性之IgG Fc的位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基可被用為適合於變異之位點。此外,可能有各種不同類型之類似物,例如:其中已移除能夠形成雙硫鍵之位點者、已移除來自天然Fc之數個N-末端胺基酸者、或在天然Fc之N-末端增加甲硫胺酸殘基者。此外,可移除補體結合位點(例如:C1q結合位點)或抗體-依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位點,以去除效應因子之功能。製備免疫球蛋白Fc區之序列類似物之技術已揭示於國際專利公開案WO 97/34631、WO 96/32478等。
蛋白質或肽分子中,不改變分子之整體活性之胺基酸取代法係本領域習知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。在胺基酸殘基之間最常見之取代法為Ala/Ser、 Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu,及Asp/Gly。在一些案例中,胺基酸可藉由磷酸化、硫酸化、丙烯醯化、醣基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙醯基化、醯胺化等修飾。
此外,上述之Fc類似物可為彼等具有與本發明之Fc區相同生物活性者,且具有提高對抗熱、pH等之Fc區的結構安定性。
此外,此等Fc區可從單離自人類或動物(如:牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等)之天然類型而取得,或可為獲取自轉形的動物細胞或微生物之重組體或類似物。在本文中,可自人類或動物生物體中,藉由單離完整的免疫球蛋白,並經蛋白酶處理後所得到的天然型Fc而獲得。木瓜酵素可消化天然的Fc區以形成Fab與Fc區,而處理胃蛋白酶則會產生pF'c與F(ab)2片段。此等片段可經過分子尺寸篩選層析法,以單離出Fc或pF'c。在更具體的實施例中,Fc區可為獲取自微生物之重組的免疫球蛋白Fc區,其係人類衍生之Fc區。
此外,免疫球蛋白Fc區可為天然的聚醣形式,相較於其天然類型增加或減少聚醣、或以去醣基化形式。可採用諸如化學法、酵素法、及利用微生物之遺傳工程方法的習知方法以實現增加、減少、或移除免疫球蛋白Fc聚醣。尤其,其中已移除Fc區之聚醣之免疫球蛋白 Fc區顯示顯著降低對補體(C1q)之結合親合力,及降低或排除抗體-依賴性細胞毒性或補體-依賴性細胞毒性,而因此不會誘發活體內不必要之免疫反應。在此方面,在去醣基化或無醣基化之免疫球蛋白Fc區中的免疫球蛋白Fc區可為符合作為藥物載劑之本發明之原始目的之更適合的形式。
如本文中所使用,術語「去醣基化」係指藉由酵素以移除Fc區之糖官能基,及術語「無醣基化」係指在原核生物(更具體而言,大腸桿菌(E.coli))中產生之未醣基化之Fc區。
同時,免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或動物,包括:牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、與天竺鼠,且更具體而言,可衍生自人類。
此外,免疫球蛋白Fc區可為衍生自:IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其組合或雜化體之Fc區。在更具體之實施例中,其可衍生自IgG或IgM,其等為人類血液中最豐富的蛋白質之一,且在甚至更具體之實施例中,其可衍生自IgG,已知其可加強配體結合蛋白質之半衰期。在更具體之實施例中,免疫球蛋白Fc區可為IgG4 Fc區,在一甚至更具體之實施例中,其可為衍生自人類IgG4之無醣基化的Fc區,及在最具體之實施例中,免疫球蛋白Fc區可為包括變異之IgG4 Fc區,其中免疫球蛋白Fc區之胺基酸序列SEQ ID NO:8中的第2個胺基酸被脯胺酸取代及/或第71個胺基酸被麩醯胺取代;或免 疫球蛋白Fc區之胺基酸序列為SEQ ID NO:9,且編碼該胺基酸序列之聚核苷酸為SEQ ID NO:7,但免疫球蛋白Fc區並不限於此。
如本文中所使用,術語「組合」意指編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽與不同來源之單鏈多肽連接,以形成二聚體或多聚體。亦即,該二聚體或多聚體可從選自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、與IgE Fc之Fc片段所組成之群組中之兩個或更多個片段製成。
此外,本發明之蛋白質可為彼等其中蛋白質之N-末端與/或C-末端未經修飾者,但為了保護及提高治療性酵素之安定性,免於被活體內蛋白質裂解酵素裂解,彼等其中治療性酵素之N-末端與/或C-末端藉由化學修飾或被有機基團保護、或治療性酵素之胺基末端藉由添加胺基酸而修飾等之蛋白質亦包括在根據本發明之蛋白質範圍內。當治療性酵素之C-末端未經修飾時,根據本發明之蛋白質之末端可能具有羧基末端,但本發明之蛋白質不特別受限於此。
特定言之,由於化學合成蛋白質之N-末端及C-末端帶有電荷,因此N-末端可藉由乙醯化及/或C-末端可藉由醯胺化,以去除此等電荷,但方法不特別受限於此。
除非本說明書中另有其他說明,否則有關本發明之詳細說明書或申請專利範圍中所記載之根據本 發明之「酵素」或「融合蛋白」之技術不僅可應用於本發明之標的酵素或融合蛋白,亦可應用於包括該標的酵素或融合蛋白之所有鹽(例如:融合蛋白之醫藥上可接受之鹽),或其溶劑合物之範圍。因此,雖然本說明書中僅簡單記載「酵素」或「融合蛋白」,但本說明書同時適用於特定鹽類、特定溶劑合物、及特定鹽類之特定溶劑合物。此等鹽之形式可呈例如:使用任何醫藥上可接受之鹽之形式,但鹽的種類沒有特別限制。彼等鹽之形式,例如,可為對哺乳動物安全且有效之形式,但鹽之形式不特別受限於此。
如本文中所使用,術語「醫藥上可接受的」係指在醫學-藥學判斷之範圍內,可以有效用於所意欲之用途,而不會引起過度毒性、刺激性、或過敏反應等之物質。
如本文中所使用,術語「醫藥上可接受之鹽」係指衍生自醫藥上可接受之無機鹽、有機鹽、或鹼類之鹽類。合適之鹽類的實例可包括鹽酸、溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自合適鹼類之鹽類的實例可包括諸如鈉、鉀等之鹼金屬;諸如鎂、銨等之鹼土金屬。
此外,如本文中所使用,術語「溶劑合物」係指由酵素、根據本發明之融合蛋白或其鹽與溶劑分子之間所形成之複合物。
本發明之酵素融合蛋白可採用本領域習知之方法製備。
本發明之實施例中,重組載體之製備係使艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)及芳基硫酸酯酶B(ARSB)(即,治療性酵素)分別以與肽連接子-免疫球蛋白Fc融合之形式表現,且此等治療性酵素之製備係藉由其等在CHO細胞株中表現(實例1至3)。
然而,本發明之酵素融合蛋白可採用上述實施例中所記載之彼等方法以外之其他方法製備。酵素融合蛋白可包括胺基酸序列SEQ ID NO:23或25,但胺基酸序列不受限於此。
根據本發明之酵素融合蛋白可以藉由將治療性酵素與免疫球蛋白Fc區融合,以延長治療性酵素之半衰期,其在維持治療性酵素之活性的同時,展現對LSDs之治療功效。特定言之,與經修飾的免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素已降低鏈交換及醣基化,因此相較於未與Fc融合之治療性酵素,對於溶酶體受體具有較低的結合親合力,且從而具有高持續性,證實此等治療性酵素可以有效治療LSDs。
在本發明之實施例中,相較於未與Fc區融合之天然發生的酵素,已證實根據本發明之酵素融合蛋白可以維持活體外酵素活性(實例5),同時具有顯著優異之半衰期(T1/2)、最高之血液內藥物濃度(Cmax)、及活體內可利用率(AUC)(實例4),且從此等結果證實該藥物甚至 可使用相較於習知藥物更低之劑量(實例6)。
本發明再另一方面提供一種包含酵素融合蛋白之用於預防或治療溶酶體儲積症(LSDs)之醫藥組成物,其係依據製備酵素融合蛋白或酵素融合蛋白之方法所製備。
根據本發明之組成物之特徵在於延長活體內持續時間及提高治療性酵素之安定性。
在具體的實施例中,本發明之醫藥組成物之酵素融合蛋白可為彼等其中艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)或芳基硫酸酯酶B(ARSB)與免疫球蛋白Fc區融合,但酵素融合蛋白不受限於此。
如本文中所使用,術語「溶酶體」係一種存在於細胞質中之胞器,包含許多種水解酶,因此會分解身體內不需要之物質,如:大分子、細菌等,並協助細胞中的其他部份利用該分解產物。溶酶體之功能可由許多種酵素執行。當特定酵素因突變、缺失等而喪失其功能時,其會造成溶酶體喪失分解功能,並導致必需被分解之大分子等累積在細胞中,且誘發細胞損傷等,從而引發疾病。
如本文中所使用,術語「溶酶體儲積症(LSD)」係指因上述溶酶體功能喪失所引起,且需要利用缺陷酵素之酵素置換療法之罕見遺傳疾病。依據缺失之酵素,LSD可包括;黏多醣症(MPS)、肝醣儲積症、神經鞘脂質代謝障礙症、尼曼匹克症、Fabry氏病、高雪氏症、Hunter氏症候群、Maroteaux-Lamy二氏症候群等。
在下文中,LSD將依據其分類法詳細說明。
如本文中所使用,術語「Maroteaux-Lamy二氏症候群」屬於第VI型黏多醣症(MPS)疾病,其因降解糖胺聚醣時所必要之芳基硫酸酯酶B(N-乙醯基半乳糖胺-4-硫酸酯酶)缺失所引起之體染色體隱性遺傳性疾病。Maroteaux-Lamy二氏症候群係因在骨骼、心臟瓣膜、脾臟、肝臟、角膜等中之硫酸皮膚素因酵素缺失而無法被分解,以致沉積所造成之疾病。
如本文中所使用,術語「芳基硫酸酯酶B(ARSB)」係指存在於肝臟、胰臟、與腎臟之溶酶體中之芳基硫酸酯酶,該酵素之角色在於藉由分解糖胺聚醣來水解硫酸酯。已知芳基硫酸酯酶B與黏多醣症VI(Maroteaux-Lamy二氏症候群)有關。在本發明中,術語芳基硫酸酯酶B可與加硫酶(galsulfase)互換使用。
如本文中所使用,術語「Hunter氏症候群(Hunter氏症(Hunter disease))」係一種因艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)缺失而發生之X-連鎖隱性遺傳疾病,且已知硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素會因該酵素缺失而累積。Hunter氏症候群之症狀包括功能惡化、聽力逐漸喪失、視網膜色素病變、視神經乳頭水腫、水腦症等。在本發明中,術語「黏多醣症II」可與「Hunter氏症候群」互換使用。
如本文中所使用,術語「艾杜糖醛酸-2- 硫酸酯酶」係一種與Hunter氏症候群(MPS-II)相關之硫酸酯酶酵素,係溶酶體降解硫酸肝素及硫酸皮膚素時所必要之酵素。在本發明中,術語「艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶」可與「艾杜硫酶(idursulfase)」互換使用。例如,艾杜硫酶可為α-艾杜硫酶或β-艾杜硫酶,但艾杜硫酶不受限於此。
治療性酵素可藉由本領域已知的方法製備或製造,且具體而言,可藉由在培養嵌入動物表現載體之動物細胞後,再從培養物中純化該酵素,或可從市售商品購得酵素後使用,但酵素不受限於此。
包含在本發明組成物中之酵素融合蛋白可藉由將治療性酵素與免疫球蛋白Fc區融合,以延長治療性酵素之半衰期,使其對LSDs具有治療功效且同時維持該治療性酵素之活性。特定言之,與經修飾的免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素已降低鏈交換及醣基化,因此相較於未與Fc融合之治療性酵素,對於溶酶體受體具有較低的結合親合力,且從而具有高持續性,證實此等治療性酵素可以有效治療LSDs。
在本發明之實施例中,已證實本發明之酵素融合蛋白即使相較於未與Fc區融合之酵素具有較低之投藥頻率,仍可降低IDS-剔除小鼠中的糖胺聚醣(GAG)值(實例6)。
此外,在另一本發明之實施例中,已證實相較於未與Fc區融合之天然酵素,本發明之酵素融合蛋 白不僅在骨髓及脾臟中顯示高度分佈,亦顯示其分佈在肺臟、腎臟、心臟內等,然而天然酵素則未被證實分佈在該等組織內(實例7)。
此等結果顯示,本發明之酵素融合蛋白當基於其高安定性投藥時,不僅可藉由降低投藥頻率來提高患者之便利性,而且基於其於組織中之高度分佈性,亦容許其經皮下投藥。
如本文中所使用,術語「預防」係指藉由投予酵素融合蛋白或包含該酵素融合蛋白之組成物來抑制或延緩LSD之發生的所有作用,且術語「治療」係指藉由投予酵素融合蛋白或包含該酵素融合蛋白之組成物來改善或有利地改變LSD之症狀的所有作用。
如本文中所使用,術語「投藥」係指採用任何適當之方法,將特定物質引入患者中,而組成物之投藥途徑可為任何可在活體內傳送組成物至標靶之習知途徑,例如:經腹膜內投藥、經靜脈內投藥、經肌內投藥、經皮下投藥、經皮內投藥、口服投藥、局部投藥、經鼻內投藥、經肺內投藥、經直腸內投藥等。然而,由於肽在口服投藥時即被消解,因此供口服投藥之組成物中之活性成份最好經過包覆或配製,以用防止胃內之降解,且具體而言,可以注射形式投藥。此外,該醫藥組成物可採用某些可以傳送活性成份至目標細胞之裝置投藥。
本發明之組成物之總有效劑量可以單一劑量投予患者,或可依據分段之治療療程,以多重劑量長期 投藥。在本發明之醫藥組成物中,活性成份之含量可隨疾病之嚴重性而變化。具體而言,本發明之融合蛋白之總每日劑量可為每1kg患者體重約0.0001mg至500mg。然而,該融合蛋白之有效劑量係考量各種不同因素而決定,其中除了醫藥組成物之投藥途徑與治療頻率之外,包括患者之年齡、體重、健康條件、性別、疾病嚴重性、膳食、與排泄速率等。在此方面,彼等所屬技術領域中具有通常知識很容易決定適合本發明之醫藥組成物之特定用途的有效劑量。根據本發明之醫藥組成物並未特別限制劑型、投藥途徑、與方法,只要其顯示本發明之功效即可。
在本發明中,酵素融合蛋白之實際劑量可依據使用為活性成份之治療性酵素的類型及各種不同因素而決定,諸如:所治療之疾病、投藥途徑、患者之年齡、性別、與體重、疾病之嚴重性等。由於本發明之酵素融合蛋白具有顯著優異之活體內持續時間及活性,因此可顯著降低包含本發明之酵素融合蛋白之醫藥製劑之投藥劑量、次數、與頻率。
本發明之醫藥組成物可進一步包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑、或稀釋劑。該醫藥上可接受之載劑可為非天然物。
如本文中所使用,術語「醫藥上可接受的」係指具有足量以展現治療功效且不會引起副作用之特性,且很容易由所屬技術領域中具有通常知識者依據醫學領域習知之因素而決定,諸如:疾病類別、患者之年齡、體 重、健康狀態、性別、藥物敏感性、投藥途徑、投藥方法、投藥頻率、治療持續時間、混合或同時投予之藥物(群)等。
醫藥上可接受之載劑可包括用於口服投藥之結合劑、助滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、矯味劑等;用於注射之緩衝劑、防腐劑、止痛劑、增溶劑、等滲劑、安定劑等,其等可組合使用;及用於局部投藥之基質、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等,但醫藥上可接受之載劑不受限於此。
本發明之組成物之製劑類型可藉由與上述各種不同的醫藥上可接受之載劑組合而製成。例如:用於口服投藥之組成物可配製成錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、藥片(wafer)等。注射用之組成物可配製於單位劑量之安瓿或多劑量之容器內。此外,組成物亦可配製成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放製劑等。
同時,合適之載劑、賦形劑、與稀釋劑之實例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。此外,組成物可進一步包含充填劑、抗凝聚劑、潤滑劑、保濕劑、矯味劑、防腐劑等。
此外,酵素融合蛋白可藉由與各種不同核 准用為製藥藥物之醫藥上可接受之載劑混合而使用,諸如:生理食鹽水或有機溶劑。為了提高安定性或吸收率,可使用諸如葡萄糖、蔗糖、或葡聚糖之碳水化合物、及諸如抗壞血酸或麩胱甘肽之抗氧化劑、螯合劑、低分子量蛋白質、或其他安定劑作為製藥藥物。
醫藥組成物可包含含量為0.01%至99%(w/v)之上述成份(活性成份),但含量不受限於此。
本發明又另一方面提供一種編碼根據本發明之融合蛋白之聚核苷酸。
編碼根據本發明之酵素融合蛋白之聚核苷酸可為一種聚核苷酸形式,其中由編碼治療性酵素的一區與編碼肽連接子-免疫球蛋白Fc區的一區連接,且具體而言,編碼融合蛋白之聚核苷酸中,由免疫球蛋白Fc區之N-末端透過GGGGS連接子連接治療性酵素之C-末端,但聚核苷酸不受限於此。更具體而言,本發明之聚核苷酸可包括序列SEQ ID NO:1或3,但序列不受限於此,只要該聚核苷酸可以編碼包含治療性酵素與免疫球蛋白Fc區之融合蛋白即可。
本發明又另一方面提供一種包括聚核苷酸之重組表現載體。
如本文中所使用,術語「重組載體」係指DNA建構體,其中目標肽(例如:酵素融合蛋白)係可操作地連接適當調控序列,以在適當之宿主中表現目標肽(例如:酵素融合蛋白)。根據本發明之重組體載體可以建 構成供典型選殖之載體或表作為現之載體,且可利用原核生物或真核生物作為宿主細胞以進行建構。
調控序列包括可以啟動轉錄之啟動子、任何調控轉錄之操縱序列、編碼適當mRNA核糖體-結合結構域之序列、及調控轉錄及轉譯之終止之序列。重組載體在轉形進入合適的宿主細胞內後,即可不受宿主基因體控制而進行複製或產生功能,或可嵌入宿主基因體本身。
本發明所使用之重組載體並未特別限制,只要該載體可以在宿主細胞內複製,而且可使用本領域已知的任何載體建構即可。載體之實例可包括天然的或重組的質體、黏質體、病毒、及噬菌體。本發明可使用之載體並未特別限制,任何已知的表現載體均可被使用。
重組載體係用於宿主細胞之轉形,以生產本發明之酵素融合蛋白。此外,此等經轉形的細胞(屬於本發明之一部份)可用於擴增核酸片段及載體,或其等可為用於重組生產本發明之酵素融合蛋白之經培養的細胞或細胞株。
如本文中所使用,術語「轉形」係指一種將含有編碼目標蛋白質之聚核苷酸之重組載體引入宿主細胞中之過程,從而使由聚核苷酸編碼之蛋白質能在宿主細胞中表現。對於轉形的聚核苷酸,只要其可在宿主細胞中表現即可,不論是否嵌入宿主細胞之染色體且位於染色體內部或位於染色體之外部。
此外,聚核苷酸包括編碼目標蛋白質之 DNA及RNA。聚核苷酸可以任何方式嵌入,只要其可引入宿主細胞中並在其內表現即可。例如:聚核苷酸可以表現卡匣形式引入宿主細胞中,該表現匣係一種包括自我表現所需之所有必要元素的基因建構體。表現卡匣一般包括可操作地與聚核苷酸連接之啟動子、轉錄終止訊號、核糖體結合結構域、及轉譯終止訊號。表現卡匣可呈能夠自我複製之表現載體形式。此外,聚核苷酸本身可引入宿主細胞並且可操作地連接至其在宿主細胞中表現時所必要之序列,但聚核苷酸不受限於此。
此外,如本文中所使用,術語「可操作地連接」係指啟動子序列與上述基因序列之間之功能性連結,該啟動子序列可啟動並介導編碼本發明之目標肽之聚核苷酸的轉錄。
適用於本發明之宿主並未特別限制,只要能表現本發明之聚核苷酸即可。適當宿主之實例包括屬於大腸桿菌屬(Escherichia)之細菌,如:大腸桿菌(E.coli);屬於桿菌屬(Bacillus)之細菌,如:枯草桿菌(Bacillus subtilis);屬於假單胞菌屬(Pseudomonas)之細菌,如:假單孢菌(Pseudomonas putida);酵母,如:畢赤酵母(Pichia pastoris)、啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)、及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);昆蟲細胞,如:秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)(Sf9);及動物細胞,如:CHO、COS、BSC等。
本發明又另一方面提供一種已引入表現載體之轉形體。
為了本發明之目的,已引進本發明之表現載體之轉形體並未限制,只要轉形體可以表現並生產酵素融合蛋白即可,但轉形體可為屬於大腸桿菌屬(Escherichia)之細菌,如:大腸桿菌(E.coli);屬於桿菌屬(Bacillus)之細菌,如:枯草桿菌(Bacillus subtilis);屬於假單胞菌屬(Pseudomonas)之細菌,如:假單孢菌(Pseudomonas putida);酵母,如:畢赤酵母(Pichia pastoris)、啤酒釀母菌(Saccharomyces cerevisiae)、及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);昆蟲細胞,如:秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)(Sf9);及動物細胞,如:CHO、COS、BSC等。
本發明又另一方面提供一種製備根據本發明之酵素融合蛋白之方法。
具體而言,該方法可包括(a)培養轉形體,以得到培養物;及(b)從培養物中回收酵素融合蛋白,但方法不受限於此。
在本發明中,用於培養轉形體之培養基必需符合以適當方式培養宿主細胞之要求。包含於可供宿主細胞生長之培養基內的碳源可由彼等所屬技術領域中具有通常知識者依據其所製備之轉形體類型作適當地選擇,且可選擇適當培養條件來控制培養期間與培養量。
使用於培養基內之糖源的實例可包括糖類及碳水化合物,如:葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、及纖維素;油與脂肪,如:大豆油、葵花油、蓖麻油、及椰子油;脂肪酸,如:棕櫚酸、硬脂酸、及亞麻油酸;醇類,如:甘油及乙醇;及有機酸,如:乙酸。此等物質可單獨使用或組合使用。
所使用之氮源的實例可包括蛋白腖、酵母抽出物、肉汁、麥芽精、玉米浸液、大豆粉、與尿素,或無機化合物,如:硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、與硝酸銨。氮源亦可單獨使用或組合使用。
所使用之磷源的實例可包括磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應之含鈉鹽。此外,培養基可包含金屬鹽,如:生長所需之硫酸鎂或硫酸鐵。
最後,可使用必要的生長物質,如:胺基酸及維生素。此外,亦可使用培養基之適當的前驅物。上述來源可在培養期間內,採用批式培養或連續培養,適當加至培養物中。培養物之pH可使用鹼性化合物(如:氫氧化鈉、氫氧化鉀、及氨)或酸性化合物(如:磷酸或硫酸)適當調整。此外,可添加消泡劑(如:脂肪酸聚二醇酯)來防止起泡。此外,為了維持培養物之有氧狀態,可在培養物中注入氧氣或含氧氣體(例如:空氣)。
本發明之轉形體可在20℃至45℃下培養,且具體地,25℃至40℃。此外,持續培養至得到最大產量之所需的酵素融合蛋白為止,而在此方面,通常 持續培養10小時至160小時。
如上所述,當根據宿主細胞提供適當的培養條件時,本發明之轉形體可產生酵素融合蛋白,且根據載體組成及宿主細胞之特性所產生之酵素融合蛋白,可分泌至細胞質中或分泌至宿主細胞之周質空間或細胞外。
表現在宿主細胞內部或外部之蛋白質可藉由習知的方法純化。純化方法的實例可包括鹽析法(例如:硫酸銨沉澱法、磷酸鈉沉澱法等)、溶劑沉澱法(例如:使用丙酮或乙醇之蛋白質分段沉澱法等)、透析法、凝膠過濾法、離子交換法、或層析法(如:逆向管柱層析法)、超過濾法等,且此等方法可單獨使用或組合使用。
本發明又另一方面提供一種預防或治療個體之LSD之方法,包括投予酵素融合蛋白或包含酵素融合蛋白之組成物。
由於本發明之酵素融合蛋白包含可以預防或治療LSD之治療性酵素,因此疑似罹患LSD之個體可藉由投予包含治療性酵素之酵素融合蛋白或包含酵素融合蛋白之醫藥組成物以進行預防或治療。
如本文中所使用,術語「個體」係指疑似罹患LSD之個體,且該疑似罹患LSD之個體係指已罹患LSD或有發展出LSD之風險的哺乳動物,包括人類、大鼠、牛等,但任何可接受本發明之酵素融合蛋白或包含該酵素融合蛋白之組成物治療之任何個體無限制地包含在內。
本發明之方法可包括投予醫藥有效量之包 含酵素融合蛋白之醫藥組成物。組成物之適當的總每日劑量可由醫師在正確醫學判斷之範圍內決定,且組成物可以投藥一次或分成小劑量投藥數次。然而,針對本發明之目的,該組成物針對任何特定之患者的具體治療有效劑量,較佳地係依各種不同因素而有差別地施予,包括欲達成之反應的種類與程度、包括是否併用之其他偶爾使用之藥劑的特定組成物、患者之年齡、體重、健康條件、性別與膳食、投藥時間、投藥途徑、組成物之排出速率、治療持續時間、與特定組成物組合使用或同時使用之其他藥物、及醫學界習知之類似因素。
同時,預防或治療LSD之方法可為組合療法,其進一步包括投予對至少一種LSD具有治療效力之化合物或物質,但方法不受限於此。
如本文中所使用,術語「組合」必需理解為指同時、分開、或連續投藥。當連續或分開投藥時,允許投予第二種成份之投藥間隔必須不會損失組合之有利功效。
具有LSD治療活性之酵素融合蛋白之投藥劑量可為每1kg患者體重約0.0001μg至500mg,但劑量並未特別限制。
本發明又另一方面提供一種酵素融合蛋白、或包含酵素融合蛋白之組成物用於製備預防或治療LSDs之醫藥(或醫藥組成物)之用途。
在下文中,以下列實例提供參考,以更詳 細說明本發明。然而,此等實例僅供說明目的,且本發明之範圍並不受限於此等實例。
實例1:融合蛋白之表現載體之製備
對於製備酵素融合蛋白,融合蛋白之表現載體係藉由使用表現載體(IDS cDNA,目錄編號EX-C0003-M02,Gencopoeia;ARSB cDNA,目錄編號EX-C0073-M02,Genecopoeia)進行重疊PCR而製備,其中分別嵌入天然艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS,SEQ ID NO:1)與芳基硫酸酯酶B(ARSB,SEQ ID NO:3)、合成之連接子(SEQ ID NO:5)及IgG4 Fc區(SEQ ID NO:7)。由於重疊PCR技術包括與在擴增各酵素與連接子-Fc時之引子重疊的序列,因此,所生成之PCR產物將包括重疊序列。為了擴增融合蛋白,依下列方式進行PCR:1)第一次PCR(25個循環,由95℃下1min;57℃下30sec;及68℃下3min所組成)及2)第二次PCR(25個循環,由95℃下1min;57℃下30sec;及68℃下4min所組成)。
具體而言,針對IDS之PCR係使用SEQ ID NO:10及11之引子進行;及針對連接子-Fc之PCR係使用SEQ ID NO:12及13之引子進行。結果,IDS PCR產物包括在3'端之連接子-Fc序列,及連接子-Fc PCR包括在5'端之IDS序列。
第二次PCR係利用第一次PCR得到之兩 個PCR產物作為模板及利用引子(SEQ ID NO:10及13)進行,然後得到具有IDS-Fc序列之PCR產物。具有IDS-Fc序列之產物中的重疊序列經過限制酵素(KpnI及XhoI)水解,而所得之PCR產物嵌入X0GC載體中,以製備表現載體(pX0GC-酵素-Fc)。
以相同的方法,利用引子(SEQ ID NO:14、15、16、及17)得到具有ARSB-Fc序列之PCR產物。所得之PCR產物經過限制酵素(KpnI及XhoI)水解,並嵌入已經過相同的限制酵素(KpnI及XhoI)水解之X0GC載體中,以製備融合蛋白之表現載體。
藉由定點誘變PCR技術去除所製備之融合蛋白之Fe區序列中的鏈交換及N-醣基化位點。
具體而言,涉及鏈交換之Fc區中的第2個胺基酸(即,絲胺酸)係利用引子(SEQ ID NO:18及19),以脯胺酸取代,而涉及N-醣基化之Fc區中的第71個胺基酸(即,天冬醯胺)係被麩醯胺取代。在下表3所示蛋白質序列中,各粗體字母表示該胺基酸被取代,且彼等斜體字表示連接子。
上述實例所製備之酵素融合蛋白之表現載體分別命名為IDS-Fc載體及ARSB-Fc載體。或者,此等載體可與pX0GC-酵素-Fc交換使用。
實例2:利用融合蛋白之表現載體以轉形CHO細胞
將實例1所製備之重組體表現載體pX0GC-酵素-Fc引入DG44/CHO細胞株(CHO/dhfr-)中(Urlaub等人,Somat.Cell.Mol.Genet.,12,555至566,1986),其中DHFR基因受損,因此其核酸生合成過程不完全,以得到轉形體,並於該轉形體中表現酵素融合蛋白(酵素-Fc)。
具體而言,將DG44/CHO細胞株培養至匯合為止,以使細胞覆蓋容器底部約80%至約90%,並使用Opti-MEM(Gibco,目錄編號51985034)洗滌細胞3次。
同時,將Opti-MEM(3mL)與pX0GC-酵素-Fc(表現載體,5μg)之混合物及Opti-MEM(3mL)與脂轉染胺2000(lipofectamine 2000)(Gibco,目錄編號11668-019,20μL)之混合物置於室溫下30分鐘。然後混合這兩批混合物,並加入培養的DG44/CHO細胞株,於37℃及5% CO2條件下培養約 18小時,以使pX0GC-酵素-Fc表現載體引入DG44/CHO細胞株中。
然後,利用含有10% FBS之DMEM-F12培養基(Gibco,目錄編號11330)洗滌所培養的細胞3次,並加入培養基,且再培養48小時。將胰蛋白酶加至培養的細胞中,以使培養之細胞分離,而此等分離之細胞再接種至不含HT添加劑(次黃嘌呤-胸苷),但包含10% FBS及1mg/mL G418(Cellgro,目錄編號61-234-RG)之選擇性培養基(α-MEM培養基(WELGENE,目錄編號LM008-02))中。在選擇性培養基中培養細胞,同時每隔2天或3天置換培養基,直到僅有轉形細胞存活並形成菌落為止,並從選擇性培養基中篩選出轉形細胞。特定言之,為了改善酵素融合蛋白在篩選之轉形細胞中的表現程度,添加10nM MTX(Sigma,目錄編號M8407)至選擇性培養基中,並逐漸提高濃度,從而在1至2週之後,此等轉形細胞之MTX量提高至20nM。
實例3:藉由ELISA證實IDS-Fc、ARSB-Fc融合蛋白之表現
將實例2所製備之一部份的轉形細胞,以1×107個細胞之濃度移至各175-T細胞培養燒瓶中,並培養直到細胞幾乎覆蓋培養容器之底部為止,然後添加15mL無血清Ex-細胞培養基(客製訂購自Sigma,目錄編號 14360C)(其中已添加1mM丁酸鈉(Sigma,目錄編號B5887))至各燒瓶中,於培養箱中(33℃,5% CO2)培養48小時。各細胞培養物移至50mL試管中、離心、再度收集上清液,及測定融合蛋白(IDS-Fc及ARSB-Fc)之表現程度。
首先,採用間接ELISA法測定IDS-Fc之表現程度。將以PBS稀釋成濃度為1μg/mL之人類α-IDS抗體(R&D Systems,目錄編號AF2449),以100μL/孔之添加量加至96-孔ELISA盤(Nunk,目錄編號44-2404-21)中,並於冷箱(4℃)中反應隔夜。次日,所得之反應物利用PBS-T緩衝液洗滌5次,且將稀釋成各種不同濃度之培養物樣本與IDS標準產物(Shire Pharmaceuticals Group,Elaprase®,批號TEPE09A17)分別以100μL/孔的量加入各孔中,並於室溫下反應1小時。1小時後,洗滌分析板並加入已標記生物素之人類α-IDS抗體(R&D Systems,目錄編號BAF 2449),且混合物於室溫下反應1小時。最後,將鏈霉抗生物素蛋白-HRP(GE Healthcare,目錄編號RPN440IV)稀釋成1:30,000之比例,並稀釋後之混合物以100μL/孔之量加入各孔中,並反應1小時。洗滌生成物,並加入受質溶液,且反應約10分鐘。利用反應-中止溶液以中止反應後,於450nm下測定生成物之吸光度。利用人類IDS標準產物之濃度及吸光值而得到標準曲線及函數後,定量人類IDS-Fc融合蛋白量。結果證實, 所篩選的轉形細胞會表現一定量之人類IDS-Fc融合蛋白(第1圖)。
此外,藉由可定量人類IgG之酵素免疫分析法(Bethyl,目錄編號E80-104)測定ARSB-Fc融合蛋白之表現程度。將人類IgG-Fc抗體(Bethyl,目錄編號A80-104A-9)於碳酸鹽緩衝液(0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽,pH 9.6)中稀釋成10μg/mL,並加至96-孔ELISA盤(Nunk,目錄編號44-2404-21)中,添加量為100μL/孔中,且於室溫下反應1小時。1小時後,利用洗滌溶液洗滌ELISA盤5次,且將各培養物樣本及包含在人類IgG定量套組(Bethyl,目錄編號RS10-110-4)內之人類IgG標準產物稀釋成各種不同濃度,並以100μL/孔之量加入各孔中,並於室溫下反應1小時。1小時後,洗滌分析板,並加入已稀釋成1:150,000比例之已標記的HRP人類IgG-Fc抗體(Bethyl,目錄編號A80-104P-87),且於室溫下反應1小時。最後,取鏈霉抗生物素蛋白-HRP(GE Healthcare,目錄編號RPN440IV)稀釋成1:30,000之比例,並以100μL/孔之量加入各孔中,且反應1小時。洗滌生成物,並加入受質溶液,且反應約15分鐘。利用反應-中止溶液中止反應後,於450nm下測定生成物之吸光度。
利用人類IDS標準產物之濃度及吸光值而得到標準曲線及函數後,定量人類ARSB-Fc融合蛋白量。結果證實,所篩選的轉形細胞會表現一定量之人類 ARSB-Fc融合蛋白(第2圖)。
實例4:證實長效酵素融合蛋白之藥物動力學
藉由檢測如上製備之長效酵素融合蛋白及未與Fc區融合之酵素之藥物動力學,以比較融合蛋白製劑之功效。
實例4-1:長效艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶融合蛋白之藥物動力學實驗
本案發明人藉由檢測如上述實例所製備之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白之藥物動力學,以試圖證實本發明之融合蛋白之治療持續時間。
基於此目的,分別將艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(艾杜硫酸酯酶,對照組)及艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白(IDS-Fc融合蛋白,實驗組)投予3隻ICR小鼠,並根據各組所收集之血樣,比較血液中之安定性及藥物動力學系數。
具體而言,依據艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之濃度,將濃度為0.5mg/kg及1.0mg/kg之蛋白質,分別藉由靜脈內及皮下注射投予對照組與實驗組之ICR小鼠。靜脈注射投藥組在注射後0、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144、及168小時收集血樣,且皮下注射投藥組在注射後0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、及216小時收集血樣。藉由ELISA方法,利用人類專一性抗-艾杜糖醛酸-2-硫 酸酯酶抗體,檢測血清中之蛋白質量。分析結果如第3圖及表4所示。
由上述結果可見,相較於彼等對照組,根據本發明之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白顯示顯著優異之藥物動力學特性。此等結果表示本發明之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白具有之優點為透過長效作用,在實際投予藥物時,相較於非長效融合蛋白之酵素可減少藥物投藥之間隔。
由第3圖與表4之藥物動力學結果可見,以艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白為例,半衰期(T1/2)、血液中最高藥物濃度(Cmax)、及活體內生體可用率(AUC)均提高。特定言之,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白之活體內生體可用率為64.9%,因此表示其 相較於非長效融合蛋白之酵素顯示更優異之活體內生體可用率。
實例4-2:長效芳基硫酸酯酶B融合蛋白之藥物動力學實驗
本案發明人試圖檢測上述實例所製備之芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白(ARSB-Fc融合蛋白)之藥物動力學,因此,測定芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白之藥物動力學,並將其結果與彼等芳基硫酸酯酶B之結果比較。
具體而言,依據芳基硫酸酯酶B之濃度,取將濃度分別為5.0mg/kg之蛋白質分別經靜脈內與皮下注射投予對照組(天然芳基硫酸酯酶B:Naglazyme®,BioMarin),及實驗組(芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白)之ICR小鼠。在對照組中,不論以何種方式投藥,皆在注射後0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、4、8,及24小時收集血樣。在實驗組中,接受靜脈內注射投藥之ICR小鼠,在注射後0、0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、24、48、96、及168小時收集血樣,而彼等接受皮下注射投藥者係在注射後0、0.5、1、2、4、8、24、48、96、及168小時收集血樣。
將各組所收集之血樣離心及分離成血清,並藉由酵素免疫分析法定量血液中芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白及天然芳基硫酸酯酶B之含量,分析結果如第4圖及表5所示。
由上述結果可見,相較於Naglazyme®(即,天然芳基硫酸酯酶B),根據本發明芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白顯示顯著優異之藥物動力學特性。此等結果表示本發明芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白具有之優點為透過長效性作用,在實際投予藥物時,相較於酵素可減少藥物之投藥間隔。
由第4圖與表5之藥物動力學結果可見,以芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白為例,半衰期(T1/2)、血液中最高藥物濃度(Cmax)、及活體內生體可用率(AUC)皆提高。特定言之,芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白之活體內生體可用率為65.8%,因此表示其相較於非長效融合蛋白之酵素顯示更優異之活體內生體可用率。
如實例4-1與4-2中的酵素融合蛋白之藥物動力學檢測結果所示,已證實此等酵素融合蛋白相較於彼等未與Fc區融合之酵素,顯示顯著延長之半衰期、提高之活體內生體可用率等,因此可預期此等酵素融合蛋白之長效功效。
實例5:證實長效酵素融合蛋白之酵素活性
比較由如上述製備酵素融合蛋白中所包括酵素與未與Fc區融合之酵素之活性。
實例5-1:長效艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶融合蛋白之活體外酵素活性
本案發明人試圖檢測根據上述實例所製備之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白的酵素活性變化,因此,測定活體外酵素活性。
具體而言,將已知為酵素受質之4-甲基傘形基α-L-哌喃艾杜糖醛酸-2-硫酸酯鈉鹽(4MU-α-IdopyraA-2)與艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶及艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白於37℃下反應4小時,然後與α-艾杜糖醛酸酶(即,第二次反應酵素)於37℃下反應24小時。然後,測定終產物4-甲基傘形酮(umbelliferone)(4MU)之螢光,以測定對應物質之酵素活性。
結果證實艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶及艾杜 糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白具有32.0±1.58nmol/min/mM及87.3±6.49nmol/min/mM之酵素活性(比活性)。由於艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白的結構為其中兩個艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶連接一個Fc分子,其為兩條Fc鏈之二聚合型,因此,測定結果顯示艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白之活體外酵素活性相較於非為融合蛋白之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶高約2.7倍。此等結果表示具有兩個艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白之結構特性,在酵素活性方面優於未形成融合蛋白之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(第5圖)。
實例5-2:長效芳基硫酸酯酶B融合蛋白之活體外酵素活性
本案發明人比較及測定上述實例所製備芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白與天然酵素芳基硫酸酯酶B(Naglazyme®,BioMarin)之酵素活性。
具體而言,將芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白及芳基硫酸酯酶B與4-甲基傘形基酯硫酸酯於37℃下反應20分鐘,且藉由測定在裂解硫酸根基團後所形成之4-甲基傘形基之螢光,來決定芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白之活體外酵素活性。
結果證實芳基硫酸酯酶B與芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白分別具有438.5± 29.4nmol/min/mM及823.8±37.0nmol/min/μM之酵素活性(比活性)。由於芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白之結構為其中兩個芳基硫酸酯酶B連接一個Fc分子,其為兩條Fc鏈之二聚合型,因此,測定結果顯示芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白之活體外酵素活性相較於非為融合蛋白之芳基硫酸酯酶B高約1.9倍。此等結果證實芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白在分子層次上之獨特結構特性優於芳基硫酸酯酶B之結構,其歸因於優異的酵素活性(第6圖)。
如實例5-1與5-2檢測酵素融合蛋白之藥物動力學之結果,證實此等酵素融合蛋白相較於彼等未與Fc區融合之酵素,顯示高度的活體外酵素活性。
實例6:證實長效艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶融合蛋白之投藥功效
藉由在投予本發明之酵素融合蛋白之藥物至艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)-剔除小鼠後,探討組織與尿中糖胺聚醣(GAG)含量之變化,以檢測投藥功效。
具體而言,除了以正常小鼠為陰性對照組外,依據尿中GAG含量,將7-至14-週齡IDS-剔除小鼠分成四組。以0.5mg/kg(對照組)之濃度,一共在尾靜脈投予艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(Elaprase®,Genzyme)投予4次(第0天、第7天、第14天、及第21天)。將艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白之投藥過程分成 2組:一組在尾靜脈接受投予一次濃度為2.0mg/kg(第0天)之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白,及另一組經皮下投予一次濃度為4.0mg/kg(第0天)之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白。
在投藥前及投藥後第7、14、21、及28天收集各組尿液樣本。在投藥後28天,收集來自肝臟、脾臟、心臟、與骨髓之所有組織。然後在各組織中添加5倍體積(骨髓使用9倍體積)量之組織研碎緩衝液(含有抑肽酶(aprotinin)(1μg/mL)、1mM PMSF、與2mM EDTA之PBS),並使用超音波震盪儀將混合物研碎,及離心,取各上清液以用於分析GAG含量。
然後,將獲取自所收集尿液樣本及各組織研磨後之50μL上清液加至96-孔盤中,且加入二甲基亞甲基藍溶液(250μL)並混合,及在525nm波長下定量GAG含量。以尿液中GAG含量為例,藉由參照肌酸量作調整,以計算數值。採用單向ANOVA且使用計算值,進行對照組與試驗組之間之統計分析。尿液與各組織中所測定之GAG含量分別顯示於第7圖及第8圖。
如第7圖及第8圖所示,相較於IDS-剔除小鼠,已證實艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白即使以每個月一次經靜脈內或皮下投予,仍顯著降低尿液與各組織中GAG值至類似其中以Elaprase®(其係未與Fc區融合之酵素)一週一次經靜脈內投予之療法之水平。
透過此實例證實,即使每個月一次經靜脈 內或皮下投藥,由於艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白具有延長之血液半衰期,因此,能展現等同目前一週投藥一次之藥物療法之功效。此外,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白在一個月一次皮下投藥組中,由艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白具有降低GAG值之功效的結果證實,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白可使用於皮下注射,以作為本發明之融合蛋白之投藥途徑的潛力。因此,建議根據本發明之艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之長效融合蛋白可透過一個月一次經皮下投藥,以用於治療Hunter氏症候群患者。
實例7:證實長效融合蛋白(芳基硫酸酯酶B)之組織分佈
本案發明人試圖證實上述實例所製備之本發明之酵素融合蛋白之分佈程度。
在此方面,由各收集樣本及根據各組,比較芳基硫酸酯酶B(對照組)與芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白(實驗組)於3隻ICR小鼠之組織與器官中之分佈程度。
具體而言,依據芳基硫酸酯酶B之濃度,對照組與實驗組藉由接受濃度為5.0mg/kg之靜脈內注射而進行投藥。
對於對照組之天然芳基硫酸酯酶B(Naglazyme®)及實驗組之芳基硫酸酯酶B之長效融合 蛋白,在投予天然芳基硫酸酯酶B(Naglazyme®)及芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白後且取出小鼠器官後,藉由酵素免疫分析法,以測定並比較組織(骨髓、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、與心臟)內各物質之濃度。
結果顯示,相較於作為對照組之未與Fc區融合之天然芳基硫酸酯酶B,芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白顯示其在所有組織中之分佈程度較高或在同一段時間內之停留時間較長。
特定言之,相較於天然芳基硫酸酯酶B,已證實芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白顯著地高度分佈在骨髓與脾臟內。此外,已證實芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白係分佈在肺臟、腎臟、及心臟內,而彼等組織中則未檢測到芳基硫酸酯酶B(第9圖)。
由此等實驗結果證實,芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白具有比Naglazyme®(即,天然芳基硫酸酯酶B)優異之藥物動力學特性。特定言之,相較於目前一週一次之靜脈內投藥療法,一個月投予一次芳基硫酸酯酶B之長效融合蛋白之可能用法在透過轉換成皮下投藥,不僅能降低投藥頻率,而且能改善患者之生活品質。
承上文,所屬技術領域中具有者咸了解,本發明可能在沒有改變本發明之技術觀念或基本特徵下以其他特定形式實施。在此方面,本文所揭示之具體實施例僅供說明之目的,不應構成本發明範圍之限制。反之,本發明不僅計畫涵蓋具體實施例,而且涵蓋各種不同替代 物、修飾、等效物、及可能包括在由附錄之申請專利範圍所界定之本發明之本質與範圍內的其他具體實施例。
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Claims (23)
- 一種酵素融合蛋白,其中免疫球蛋白Fc區係與治療性酵素融合,且該治療性酵素相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素,具有增加之活體內持續時間。
- 如申請專利範圍第1項所述之酵素融合蛋白,其中該治療性酵素係選自由以下所組成之群組:β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖腦苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己糖胺酶A、B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶體酸性脂酶、α-N-乙醯基-胺基葡萄糖苷酶、葡萄糖腦苷脂酶、丁醯膽鹼酯酶、殼糖酶、麩胺酸脫羧基酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性內肽酶、與骨髓過氧化酶。
- 如申請專利範圍第1項所述之酵素融合蛋白,其中治療性酵素與免疫球蛋白Fc區係藉由肽連接子融合。
- 如申請專利範圍第1項所述之酵素融合蛋白,其中該酵素融合蛋白係由一分子的免疫球蛋白Fc區與二聚合的治療性酵素融合。
- 如申請專利範圍第1項所述之酵素融合蛋白,其中該免疫球蛋白Fc區在天然免疫球蛋白Fc區之至少一個胺基酸具有選自由以下所組成之群組中之變異:取代、 添加、刪除、修飾、及其組合。
- 如申請專利範圍第5項所述之酵素融合蛋白,其中在具有胺基序列SEQ ID NO:8之該免疫球蛋白Fc區中,第2個胺基酸係被脯胺酸取代;第71個胺基酸係被麩醯胺取代;或第2個胺基酸係被脯胺酸取代且第71個胺基酸係被麩醯胺取代。
- 如申請專利範圍第6項所述之酵素融合蛋白,其中在該免疫球蛋白Fc區內並未發生鏈交換。
- 如申請專利範圍第1項所述之酵素融合蛋白,其中該酵素融合蛋白相較於未與免疫球蛋白Fc區融合之治療性酵素具有提高之安定性及降低對溶酶體受體之結合親合力,從而具有高度的組織分佈性。
- 如申請專利範圍第1項所述之酵素融合蛋白,其中該免疫球蛋白Fc區係選自由以下所組成之群組:(a)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、與CH4結構域;(b)CH1結構域與CH2結構域;(c)CH1結構域與CH3結構域;(d)CH2結構域與CH3結構域;(e)在CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域、及CH4結構域中的一個或兩個或多個結構域與免疫球蛋白鉸鏈區或該鉸鏈區的一部份之組合;及(f)在重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各結構域之間之二聚體。
- 如申請專利範圍第1項所述之酵素融合蛋白,其中該免疫球蛋白Fc區係選自由以下所組成之群組:(a)移除可以形成雙硫鍵之區、(b)移除天然Fc之N-末端上某些胺基酸殘基、(c)在天然Fc型之N-末端添加甲硫胺酸殘基、(d)移除補體-結合位置、或(e)刪除抗體-依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)位置。
- 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之酵素融合蛋白,其中該免疫球蛋白Fc區係無糖基化。
- 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之酵素融合蛋白,其中該免疫球蛋白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM之Fc片段。
- 如申請專利範圍第12項所述之酵素融合蛋白,其中該免疫球蛋白Fc區係具有衍生自選自由IgG、IgA、IgD、IgE、及IgM所組成之群組之免疫球蛋白之不同來源之結構域的雜合體。
- 如申請專利範圍第13項所述之酵素融合蛋白,其中該免疫球蛋白Fc區係IgG4 Fc區。
- 如申請專利範圍第14項所述之酵素融合蛋白,其中該IgG4 Fc區之鉸鏈區係被IgG1鉸鏈區取代。
- 一種預防或治療溶酶體儲積症(LSD)之醫藥組成物,包含如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之酵素融合蛋白。
- 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組成物,其中該溶酶體儲積症(LSD)係選自由以下所組成之群組:黏多 醣症(MPS)、肝醣儲積症、神經鞘脂質代謝障礙症、尼曼匹克症、Fabry氏病、高雪氏症、Hunter氏症候群、與Maroteaux-Lamy二氏症候群。
- 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組成物,其中該酵素為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)或芳基硫酸酯酶B(ARSB)。
- 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組成物,其中該組成物降低酵素對溶酶體受體之結合親合力。
- 一種聚核苷酸,其編碼如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之酵素融合蛋白。
- 一種表現載體,其包含如申請專利範圍第20項所述之聚核苷酸。
- 一種轉形體,其引進如申請專利範圍第21項所述之表現載體。
- 一種製備酵素融合蛋白之方法,包括:(a)培養如申請專利範圍第22項所述之轉形體,以獲得培養物;及(b)從該培養物中回收酵素融合蛋白。
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