BR112020000273A2

BR112020000273A2 - proteína de fusão de enzima e seu método de preparação, composição farmacêutica, polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de enzima, vetor de expressão, transformante

Info

Publication number: BR112020000273A2
Application number: BR112020000273-9A
Authority: BR
Inventors: Yong Ho HEO; Jin Young Kim; In Young Choi; Sung youb Jung
Original assignee: Hanmi Pharm. Co., Ltd.
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2020-07-14
Also published as: PH12020500054A1; SG11202000115SA; IL271837B2; US20200157172A1; EP3650539A4; KR102413686B1; KR102556411B1; TWI832818B; KR20220098092A; AU2018295994A1; MX2020000037A; JP2020530283A; JP2023085445A; IL271837A; WO2019009684A2; IL271837B1; EP3650539A2; TW201906872A; CA3069119A1; CN111094559A

Abstract

A presente invenção se refere a uma proteína de fusão entre uma enzima terapêutica e uma região de Fc de imunoglobulina, um método da mesma e uma composição que compreende a proteína de fusão.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROTEÍNA DE FUSÃO DE ENZIMA E SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, POLINUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA A PROTEÍNA DE FUSÃO DE ENZIMA, VETOR DE EXPRESSÃO, TRANSFORMANTE”

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão de enzima terapêutica na qual uma região de Fc de imunoglobulina é fusionada a uma enzima para o propósito de aumentar a meia-vida in vivo de enzimas terapêuticas, um método para preparação da mesma e uma composição que contém a mesma.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Lisossomas são organelas citoplasmáticas que funcionam para degradar macromoléculas tais como proteínas, polinucleotídeos, polissacarídeos e lipídios. O ambiente interno de lisossomas é ácido, e enzimas de hidrolase que promovem a hidrólise de macromoléculas biológicas são contidas nas mesmas. Também foi constatado que lisossomas têm uma determinada função na absorção de moléculas através de endocitose intracelular.

[003] Distúrbios de armazenamento lisossomal (doravante, LSDs) são distúrbios metabólicos hereditários caracterizados pela perda de funções lisossomais. LSDs são causados por uma deficiência de enzimas que degradam materiais, tais como lipídios, proteínas, polissacarídeos, etc., e os mesmos ocorrem geralmente com incidências de 1 em 100.000 e são herdados como traços recessivos autossomais. Os LSDs aparecem quando há uma deficiência ou falta de enzimas degradativas específicas, e quando essas enzimas degradativas são deficientes, os materiais em excesso resultantes se acumulam sem serem degradados, causando eventualmente problemas em funções celulares. Como muitos outros distúrbios genéticos, LSDs são herdados dos pais. Adicionalmente, cada uma dessas doenças ocorrem por uma mutação em muitos dos genes que são respectivamente envolvidos na tradução de diferentes enzimas. Enzimas que causam essas doenças têm geralmente propriedades bioquímicas similares, e todos os LSDs são causados por acúmulo anormal de materiais nos lisossomas. Atualmente, cerca de 50 tipos diferentes de LSDs são conhecidos (por exemplo, doença de Niemann-Pick, doença de Fabry, doença de Gaucher, síndrome de Hunter, síndrome de Maroteaux-Lamy, etc.). Um método representativo para tratar esses LSDs pode ser terapia de substituição de enzima (ERT), e muitos estudos relacionados são atualmente encaminhados (Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 26 de nov de 2012; 199 (5): 723 a 34).

[004] A síndrome de Hunter, um representativo de LSDs, é uma doença causada por uma deficiência de iduronato-2-sulfatase (IDS), na qual glicosaminoglicano (GAG) não é degradado devido à deficiência de iduronato-2-sulfatase e acumulado em lisossomas. Os sintomas de síndrome de Hunter incluem uma rudeza distintiva em características faciais, cabeça grande, inchaço abdominal devido a hepatomegalia e esplenomegalia, etc., e é também acompanhada por perda de audição, doença de válvula cardíaca, doença respiratória obstrutiva, apneia do sono, etc. A síndrome de Hunter é conhecida por ocorrer em 1 e 162.000 e é herdada como uma forma recessiva ligada a X associada com o cromossomo X. Elaprase ® (IDS recombinante, Shire Pharmaceuticals Group) é atualmente usada como uma terapia de substituição de enzima para o tratamento de síndrome de Hunter.

[005] Em geral, proteínas tais como enzimas terapêuticas têm baixa estabilidade e são, desse modo, facilmente desnaturadas e decompostas por proteases no sangue. Portanto, para manter a concentração sanguínea e potência dessas proteínas, administração frequente a pacientes é necessária. No entanto, no caso de fármacos de proteína administrados a pacientes na forma de injeções, injeções frequentes para manter a concentração sanguínea de polipeptídeos ativos podem causar dor significativa ao paciente. Para solucionar esses problemas, houve um esforço contínuo de maximizar a eficácia farmacológica aumentando a estabilidade sanguínea das enzimas terapêuticas e mantendo sua concentração sanguínea em um alto nível por um período maior de tempo. Tais formulações de longa ação de enzimas terapêuticas são necessárias para aumentar a estabilidade de enzimas terapêuticas e manter simultaneamente a potência dos fármacos por si só em um nível suficientemente alto, assim como para não causar reação imune em pacientes.

[006] Em particular, LSDs são distúrbios fatais causados por defeitos genéticos em enzimas particulares que podem causar morte, e terapia de substituição é essencial para o tratamento das enzimas defeituosas. A terapia de substituição de enzima é uma terapia padrão em LSDs, e a terapia tem um efeito de aliviar os sintomas existentes ou atrasar o progresso da doença substituindo-se a enzima deficiente. No entanto, devido à necessidade de administração intravenosa contínua de um fármaco uma vez a cada uma ou duas semanas para 2 a 6 horas, a vida diária dos pacientes e seus membros de família pode ser restringida.

[007] Visto que as meias-vidas das enzimas recombinantes usadas para o tratamento de LSDs em seres humanos são muito curtas, na faixa de 10 minutos a menos do que 3 horas, e as enzimas recombinantes precisam ser administradas pelo resto da vida da pessoa, desse modo, isso é inconveniente para pacientes. Consequentemente, há uma alta demanda para a extensão das meias-vidas das enzimas recombinantes.

[008] De modo a estabilizar proteínas e evitar que as mesmas sejam removidas dos rins, proteínas de fusão que usam uma região de Fc de imunoglobulina estão atualmente sendo ativamente estudadas.

[009] As imunoglobulinas são os constituintes mais importantes do sangue, e há cinco tipos diferentes (isto é, IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE). O tipo mais frequentemente usado para estudos de proteína de fusão é IgG, e é classificado em quatro subtipos (IgG1~IgG4). Proteínas de fusão preparadas com uso de um Fc de imunoglobulina podem aumentar seu tamanho e assim evitar que as mesmas sejam removidas nos rins e também se ligam a receptores de FcRn, e têm assim a função de aumentar a meia vida sanguínea através de endocitose e reciclar em células.

[010] No entanto, uma região de Fc de imunoglobulina tem uma desvantagem no fato de que a mesma pode causar uma resposta imune não-pretendida, tendo, então, funções efetoras, tais como citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e toxidade dependente de complemento (CDC). Essas funções ocorrem através da ligação de uma região de Fc de imunoglobulina a um receptor de Fc ou complemento, ou glicosilação da região de Fc. Adicionalmente, é altamente provável que instabilidade de Fc por si só possa ocorrer in vivo.

[011] Portanto, há uma desvantagem pelo fato de que a atividade da proteína fusionada não é mantida enquanto a duração da proteína de fusão desejada é aumentada de modo substancialmente estável in vivo.

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[012] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína de fusão de enzima na qual uma região de Fc de imunoglobulina é fusionada a uma enzima terapêutica de modo que a enzima terapêutica tenha duração in vivo aumentada em comparação a uma enzima terapêutica à qual uma região de Fc de imunoglobulina não é fusionada.

[013] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição farmacêutica que contém a proteína de fusão de enzima terapêutica.

[014] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de enzima terapêutica, um vetor de expressão que contém o polinucleotídeo, e um transformante no qual o vetor de expressão é introduzido.

[015] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para preparar uma proteína de fusão de enzima que inclui cultivar o transformante.

SOLUÇÃO DA TÉCNICA

[016] Um aspecto da presente invenção fornece uma proteína de fusão de enzima na qual uma enzima terapêutica e uma região de Fc de imunoglobulina são fusionadas.

[017] Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a uma proteína de fusão de enzima, na qual uma região de Fc de imunoglobulina é fusionada a uma enzima terapêutica de modo que a enzima terapêutica tenha duração in vivo aumentada em comparação a uma enzima terapêutica à qual uma região de Fc de imunoglobulina não é fusionada.

[018] O seguinte corresponde a uma modalidade adicional da presente invenção.

[019] Especificamente, como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em beta-glucosidase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, iduronidase, iduronato- 2-sulfatase, galactose-6-sulfatase, ácido alfa-glucosidase, ácido ceramidase, ácido esfingomielinsase, galactocerebrosidsase, arilsulfatase A, B, beta-hexosaminidase A, B, heparina N-sulfatase, alfa-D-manosidase, beta-glucuronidase, N- acetilgalactosamina-6 sulfatase, ácido licossomal lipase, alfa-N-acetil- glucosaminidase, glucocerebrosidase, butirilcolinesterase, quitinase, glutmamato decarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, fator de ativação de plaqueta acetilhidrolase, endopeptidase neutra e mieloperoxidase.

[020] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a enzima terapêutica e a região de Fc de imunoglobulina na proteína de fusão de enzima são fundidas por um ligante de peptídeo.

[021] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que uma molécula de região de Fc de imunoglobulina e uma enzima terapêutica dimérica são fusionadas.

[022] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de Fc de imunoglobulina tem uma variação selecionada a partir do grupo que consiste em substituição, adição, deleção, modificação, e uma combinação dos mesmos em pelo menos um aminoácido de uma região de Fc de imunoglobulina nativa.

[023] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que, na região de Fc de imunoglobulina que tem a sequência amino de SEQ ID NO: 8, o 2o aminoácido ser substituído por prolina; o 71o aminoácido ser substituído por glutamina; ou o 2o aminoácido ser substituído por prolina e o 71 o aminoácido ser substituído por glutamina.

[024] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que nenhuma troca de cadeia ocorre na região de Fc de imunoglobulina.

[025] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a mesma tem estabilidade aumentada e afinidade de ligação reduzida para receptores de lisossoma, tendo desse modo um alto grau de distribuição de tecido em comparação a uma enzima terapêutica à qual uma região de Fc de imunoglobulina não é fusionada.

[026] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de Fc de imunoglobulina é selecionada a partir do grupo que consiste em (um) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3, e um domínio CH4; (b) um domínio CH1 e um domínio CH2; (c) um domínio CH1 e um domínio CH3; (d) um domínio CH2 e um domínio CH3; (e) uma combinação de um ou dois ou mais domínios dentre um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3, e um domínio CH4 e uma região de dobradiça ou uma parte da região de dobradiça; e (f) um dímero entre cada domínio da região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve.

[027] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de Fc de imunoglobulina tem pelo menos uma característica selecionada a partir do grupo que consiste em (a) remoção de uma região com capacidade de formar uma ligação de dissulfeto, (b) remoção de um determinado resíduo de aminoácido na terminação N de um Fc nativo, (c) adição de um resíduo de metionina na terminação N de um Fc nativo, (d) remoção de um sítio de ligação complementar, ou (e) deleção de uma citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) site.

[028] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de Fc de imunoglobulina é aglicosilada.

[029] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de Fc de imunoglobulina é um fragmento de Fc derivado de IgG, IgA, IgD, IgE, ou IgM.

[030] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de Fc de imunoglobulina é um híbrido de domínios que têm origens diferentes derivadas de imunoglobulinas selecionadas a partir do grupo que consiste em IgG, IgA, IgD, IgE, e IgM.

[031] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de Fc de imunoglobulina é uma região de Fc de IgG4.

[032] Como uma proteína de fusão de enzima de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a proteína de fusão de enzima é caracterizada pelo fato de que a região de dobradiça da região de Fc de IgG4 é substituída por uma região de dobradiça de IgG1.

[033] Outro aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir e tratar distúrbio de armazenamento lisossomal (LSD).

[034] Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para prevenir e tratar LSD que contém a proteína de fusão de enzima.

[035] Como uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a composição é caracterizada pelo fato de que LSD é selecionado a partir do grupo que consiste em mucopolissacararidose (MPS), doença de armazenamento de glicogênio, esfingolipidose, doença de Niemann-Pick, doença de Fabry, doença de Gaucher, síndrome de Hunter, e síndrome de Maroteaux-Lamy.

[036] Como uma composição de acordo com as modalidades específicas anteriores, a composição é caracterizada pelo fato de que a enzima é iduronato-2- sulfatase (IDS) ou arilsulfatase B (ARSB).

[037] Como uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a composição é caracterizada pelo fato de que a mesma reduz a afinidade de ligação de uma enzima terapêutica para receptores de lisossoma.

[038] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de enzima.

[039] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um vetor de expressão que contém o polinucleotídeo.

[040] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um transformante no qual o vetor de expressão é introduzido.

[041] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar uma proteína de fusão de enzima.

[042] Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a um método para preparar uma proteína de fusão de enzima, que inclui cultivar o transformante para obter uma cultura; e recuperar uma proteína de fusão de enzima da cultura.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[043] A presente invenção se refere a uma proteína de fusão de enzima terapêutica de longa ação, e especificamente, a uma proteína de fusão de enzima na qual uma região de Fc de imunoglobulina é fusionada a uma enzima terapêutica de modo que a enzima terapêutica tenha estabilidade aumentada e o mecanismo de remoção de enzima pelos rins é reduzido. A proteína de fusão de enzima da presente invenção pode ser usada de modo eficaz por pacientes devido à duração de tempo aumentada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[044] A Figura 1 mostra um gráfico que confirma a expressão de uma proteína de fusão de IDS-Fc.

[045] A Figura 2 mostra um gráfico que confirma a expressão de uma proteína de fusão de ARSB-Fc.

[046] A Figura 3 mostra um gráfico que confirma os resultados de experimentos farmacocinéticos de proteína de fusão de IDS-Fc da presente invenção.

[047] A Figura 4 mostra um gráfico que confirma os resultados de experimentos farmacocinéticos de proteína de fusão de ARSB-Fc da presente invenção.

[048] A Figura 5 mostra um gráfico que confirma a atividade de enzima de in vitro de proteína de fusão de IDS-Fc da presente invenção.

[049] A Figura 6 mostra um gráfico que confirma a atividade de enzima in vitro de proteína de fusão de ARSB-Fc da presente invenção.

[050] A Figura 7 mostra um gráfico que ilustra os resultados de medição de níveis de glicosaminoglicano (GAG) em urina após injeção intravenosa ou subcutânea de proteína de fusão de IDS-Fc da presente invenção, em um camundongo com knockout de IDS.

[051] A Figura 8 mostra um gráfico que ilustra os resultados de medição de níveis de glicosaminoglicano (GAG) em tecido após injeção intravenosa ou subcutânea de proteína de fusão de IDS-Fc da presente invenção, em um camundongo com knockout de IDS.

[052] A Figura 9 mostra um gráfico que confirma o grau de distribuição de tecido de proteína de fusão de ARSB-Fc da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[053] No presente documento abaixo, as modalidades exemplificativas da presente invenção será descrita em detalhes. Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras explicações e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente invenção. Além disso, o escopo da presente invenção não deve ser limitado pela revelação específica fornecida no presente documento abaixo.

[054] Adicionalmente, os elementos versados na técnica poderão reconhecer ou confirmar, com base em experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da presente invenção descritas neste pedido, e tais equivalentes são destinados a serem incluídos na presente invenção.

[055] Por todo o relatório descritivo, não somente os códigos convencionais de uma letra ou três letras para aminoácidos naturalmente ocorrentes, mas também aqueles códigos de três letras geralmente permitidos para outros aminoácidos são usados, tais como ácido α-aminoisobutírico (Aib), Sar(N-metilglicina), ácido α-metil- glutâmico, etc. Adicionalmente, os aminoácidos mencionados em abreviações no presente documento são descritos de acordo com as regras IUPAC-IUB conforme a seguir: Alanina A; Arginina R; Asparagina N; Ácido D; aspártico Cisteína C; Ácido E; glutâmico Glutamina Q; Glicina G; Histidina H; Isoleucina I; Leucina L; Lisina K; Metionina M; Fenilalanina F; Prolina P; Serina S; Treonina T; Triptofano W; Tirosina Y; e V;

[056] Um aspecto da presente invenção fornece uma proteína de fusão de enzima na qual uma região de Fc de imunoglobulina é fusionada a uma enzima terapêutica de modo que a enzima terapêutica tenha duração de in vivo aumentada em comparação a uma enzima terapêutica à qual uma região de Fc de imunoglobulina não é fusionada.

[057] Na presente invenção, a proteína de fusão de enzima pode ser aquela na qual uma região de Fc de imunoglobulina é fusionada a uma enzima terapêutica de modo que a enzima terapêutica possa manter sua atividade enquanto sua afinidade de ligação para receptores de lisossoma é reduzida, em comparação a uma enzima terapêutica à qual uma região de Fc de imunoglobulina não é fusionada, aumentando assim sua meia vida sanguínea.

[058] Os presentes inventores prepararam uma proteína de fusão com uma região de Fc de imunoglobulina para aumentar a meia vida sanguínea de enzimas terapêuticas. Em particular, como a região de Fc, um análogo de Fc de IgG4 foi usado no qual uma sequência de glicosilação potencial é substituída para inibir a glicosilação e adicionalmente uma sequência de dobradiça de Fc de IgG4 é substituída para inibir troca de cadeia. Como resultado, os presentes inventores confirmaram que a meia vida sanguínea da proteína de fusão de enzima terapêutica fusionada a uma região de Fc de imunoglobulina tem uma meia vida sanguínea significativamente aumentada e tem capacidade de manter uma atividade similar a aquelas de enzimas conhecidas, fornecendo assim uma forma inovadora de estrutura de proteína de fusão no qual uma enzima terapêutica e uma região de Fc de imunoglobulina são fusionadas.

[059] A enzima terapêutica a ser incluída na proteína de fusão de enzima da presente invenção pode incluir qualquer enzima terapêutica que pode ter uma vantagem de duração in vivo estendida sobre um tipo de enzima terapêutica ao qual uma região de Fc de imunoglobulina não é fusionada, mas a enzima terapêutica não é particularmente limitada a isso. Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a proteína de fusão de enzima é uma proteína de fusão de uma enzima terapêutica.

[060] Adicionalmente, a proteína de fusão de enzima da presente invenção pode ser usada como um fármaco para terapia de substituição enzimática (ERT). A terapia de substituição enzimática pode prevenir ou tratar uma doença através de recuperação da função de uma enzima deteriorada suplementando-se a enzima defeituosa ou deficiente que causa a doença.

[061] Em uma modalidade específica, a enzima terapêutica pode ser uma enzima terapêutica selecionada a partir do grupo que consiste em beta-glucosidase, alfa- galactosidase, beta-galactosidase, iduronidase, iduronato-2-sulfatase, galactose-6- sulfatase, ácido alfa-glucosidase, ácido ceramidase, ácido esfingomielinsase, galactocerebrosidsase, arilsulfatase A, B, beta-hexosaminidase A, B, heparina N- sulfatase, alfa-D-manosidase, beta-glucuronidase, N-acetilgalactosamina-6 sulfatase, ácido licossomal lipase, alfa-N-acetil-glucosaminidase, glucocerebrosidase, butirilcolinesterase, quitinase, glutmamato decarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, fator de ativação de plaqueta acetilhidrolase, endopeptidase neutra, e mieloperoxidase, mas qualquer enzima terapêutica que tem um efeito terapêutico em doenças pode ser incluído na presente invenção independente de sua origem ou tipo.

[062] Na presente invenção, o termo “proteína de fusão de enzima” pode ser usado de modo intercambiável com “proteína de fusão de enzima de longa ação”.

[063] Conforme usado no presente documento, o termo “enzima terapêutica” se refere a uma enzima para tratar doenças que ocorrem devido à falta, deficiência, malfuncionamento, etc., e a enzima pode tratar um indivíduo com a doença por terapia de substituição de enzima, administração, etc. Especificamente, a enzima pode ser uma enzima para tratar LSDs que podem ocorrer devido à falta, deficiência, etc. de enzima lisossomal, mas a enzima não é limitada a isso.

[064] Especificamente, a enzima terapêutica da presente invenção pode ser arilsulfatase B (ARSB) ou iduronato-2-sulfatase, mas a enzima terapêutica não é limitada a isso visto que a mesma é uma enzima que exibe um efeito terapêutico em doenças-alvo.

[065] Conforme usado no presente documento, o termo “arilsulfatase B (ARSB)” se refere a uma arilsulfatase que está presente nos lisossomas do fígado, pâncreas, e rins, e a enzima tem a função de hidrolisar sulfatos decompondo-se glicosaminoglicano. A arilsulfatase B é conhecida por ser associada com mucopolissacararidose VI (síndrome de Maroteaux–Lamy). Na presente invenção, o termo arilsulfatase B pode ser usado de modo intercambiável com galsulfase. Especificamente, a arilsulfatase B pode incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que pode ser codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 3, mas a arilsulfatase B não é limitada a isso.

[066] Conforme usado no presente documento, o termo “iduronato-2-sulfatase” é uma sulfatase associada com síndrome de Hunter (MPS-II) e a mesma é uma enzima essencial para degradação lisossomal de sulfato de heparina e sulfato de dermatana. Na presente invenção, o termo iduronato-2-sulfatase pode ser usado de modo intercambiável com idursulfase. A idursulfase pode ser idursulfase alfa ou idursulfase beta, mas a idursulfase não é limitada a isso. Especificamente, a iduronato-2-sulfatase pode incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que pode ser codificada pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 1, mas a iduronato-2-sulfatase não é limitada a isso.

[067] A enzima terapêutica pode ser preparada ou fabricada por um método conhecido na técnica, e especificamente, a enzima pode ser purificada da cultura depois de cultivar células de animais nas quais um vetor de expressão de animal é inserido, ou pode ser usado depois de adquirir enzimas comercialmente disponíveis, mas a enzima não é limitada a isso.

[068] As proteínas de fusão de enzima da presente invenção podem estar em uma forma em que uma ou duas enzimas são ligadas a uma molécula de uma região de Fc que tem duas cadeias de imunoglobulina em forma dimérica, mas as proteínas de fusão de enzima não são limitadas a isso. Especificamente, as proteínas de fusão de enzima da presente invenção pode estar em uma forma em que uma região de Fc monomérica e uma enzima são fusionadas e expressas, e então, duas regiões de Fc monoméricas formam uma molécula de uma região de Fc dimérica através de uma ligação de dissulfeto, e cada uma das duas enzimas é ligada a cada uma das duas regiões de Fc, mas as proteínas de fusão de enzima não são limitadas a isso. As enzimas podem ser ligadas entre si através de uma ligação covalente ou não covalente, ou podem ser independentes uma da outra, mas as proteínas de fusão de enzima não são limitadas a isso.

[069] Especificamente, em uma modalidade da presente invenção, foi confirmado que uma proteína de fusão de enzima de longa ação, no qual um dímero de iduronato-2-sulfatase ou arilsulfatase B e uma molécula de região de Fc são fusionadas, exibe uma maior atividade de enzima in vitro em comparação a uma enzima a qual uma região de Fc não é fusionada, e foi confirmado que isso se deve às características estruturais de proteínas de fusão de enzima que incluem um dímero de enzimas terapêuticas (Exemplo 5).

[070] Adicionalmente, em outro aspecto, a proteína de fusão de enzima da presente invenção pode ser aquela no qual uma região de Fc de imunoglobulina é fusionada a uma enzima terapêutica através de um ligante de peptídeo.

[071] O ligante de peptídeo pode incluir um ou mais aminoácidos, por exemplo, 1 a 1.000 aminoácidos, mas o ligante de peptídeo não é particularmente limitado a isso. Na presente invenção, qualquer ligante de peptídeo conhecido (por exemplo, que inclui [GS]x ligante, [GGGS]x ligante, e [GGGGS]x ligante, etc., no qual x é um número natural de 1 ou maior (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou maior), e mais especificamente, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, mas os ligantes peptídicos não são limitados a isso.

[072] Para o propósito da presente invenção, a posição na qual um ligante de peptídeo é fusionado a uma enzima terapêutica e um Fc de imunoglobulina não é limitada visto que o ligante de peptídeo pode ligar a enzima terapêutica e o Fc de imunoglobulina enquanto mantém a atividade da enzima terapêutica, especificamente, ambas as extremidades da enzima terapêutica e a região de Fc de imunoglobulina, e mais especificamente, a terminação C da enzima terapêutica e a terminação N da região de Fc de imunoglobulina, mas a posição não é limitada a isso.

[073] Conforme usado no presente documento, os termos “terminação N” e “terminação C” se referem a uma extremidade amino e uma extremidade de carboxila de uma proteína, respectivamente. Por exemplo, “terminação N” ou “terminação C”

pode incluir não somente o resíduo de aminoácido mais terminal da terminação N ou terminação C, mas também os resíduos de aminoácido adjacente ao resíduo de aminoácido da terminação N ou terminação C, e especificamente, o 1 o resíduo de aminoácido ao 20o resíduo de aminoácido da terminação por si só, mas a terminação N ou terminação C não é particularmente limitada a isso.

[074] Em uma modalidade da presente invenção, proteínas de fusão (SEQ ID NO: 23 ou 25) no qual a terminação N de IgG4 é fusionada à terminação C de uma enzima terapêutica foram preparadas com uso da enzima terapêutica e um ligante (SEQ ID NO: 6)-IgG4 sobrepondo PCR, e a expressão das proteínas de fusão foram confirmadas (Exemplos 1 a 3).

[075] A enzima terapêutica incluída na proteína de fusão de enzima da presente invenção pode ser de um tipo naturalmente ocorrente, e um fragmento que consiste em uma parte da enzima terapêutica, ou um análogo da enzima terapêutica no qual uma variação selecionada a partir do grupo que consiste em substituição, adição, deleção, e modificação de alguns aminoácidos, e uma combinação das mesmas ocorreu, pode ser incluída na presente invenção sem limitação, visto que a mesma tem uma atividade equivalente a de um tipo de enzima terapêutica naturalmente ocorrente.

[076] Adicionalmente, o análogo da enzima terapêutica inclui todos aqueles em que um ou mais aminoácidos são adicionados à terminação amino e/ou carbóxi do tipo de enzima terapêutica naturalmente ocorrente.

[077] Para a substituição ou adição de aminoácidos, não somente os 20 aminoácidos comumente encontrados em proteínas humanas, mas também atípicas ou aminoácidos não-naturalmente ocorrentes podem ser usados. Fontes comerciais dos aminoácidos atípicos podem incluir Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., Genzyme Pharmaceuticals, etc. Os peptídeos que incluem esses aminoácidos e sequências de pepídeos atípicas podem ser sintetizados e adquiridos de fontes comerciais, por exemplo, American Peptide Company, Bachem (E.U.A), ou Anygen (Korea), mas as fontes comerciais não são limitadas a isso.

[078] Conforme usado no presente documento, o termo “fragmento” se refere a uma forma em que um ou mais aminoácidos na terminação amino ou carbóxi de uma enzima terapêutica nativa ou um análogo de uma enzima terapêutica nativa são removidos. A enzima terapêutica nativa ou um análogo da mesma pertence ao escopo da presente invenção independentemente do tamanho do fragmento ou o tipo de aminoácidos visto que os mesmos têm uma atividade de uma enzima terapêutica.

[079] Os análogos de enzima terapêutica pode incluir os biossimilares e biomelhores das enzimas terapêuticas correspondentes. Por exemplo, em relação a biossimilares, considerando a diferença em um hospedeiro para sua expressão em comparação a uma enzima terapêutica conhecida, a diferença de característica de glicosilação e o grau da mesma, e a diferença no grau de substituição em um resíduo de aminoácido particular da enzima correspondente em luz da sequência padrão em que o grau de substituição não é 100% de substituição, as mesmas pertencem às enzimas biossimilares a serem usadas como a proteína de fusão de enzima da presente invenção. As enzimas terapêuticas podem ser produzidas por um método conhecido na técnica, especificamente por recombinação genética em células de animais, E. coli, levedura, células de inseto, células vegetais, animais vivos, etc., e o método de preparação não é limitado a isso, e enzimas comercialmente disponíveis podem ser adquiridas e usadas, mas as enzimas não são limitadas a isso.

[080] Adicionalmente, as enzimas terapêuticas podem incluir uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia de pelo menos 80%, mais especificamente 90%, e ainda mais especificamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou maior a das enzimas acima ou análogos dos mesmos, e as enzimas terapêuticas podem ser obtidas de micro-organismos por tecnologia recombinante ou aquelas que são comercialmente disponíveis, mas as enzimas terapêuticas não são limitadas a isso.

[081] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” representa o grau de similaridade à sequência de aminoácidos de tipo selvagem ou uma sequência de nucleotídeos de tipo selvagem, e a comparação de homologia pode ser realizada a olho nu ou com uso de um programa de comparação que pode ser facilmente adquirido. As homologias entre duas ou mais sequências podem ser calculadas como uma porcentagem (%) com uso de um programa de computador comercial. A homologia (%) pode ser calculada para as sequências vizinhas.

[082] As informações sobre as sequências das enzimas terapêuticas ou análogos dos mesmos e as sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas podem ser obtidas a partir de um banco de dados conhecido (por exemplo, NCBI, etc.).

[083] Conforme usado no presente documento, o termo “região de Fc de imunoglobulina” se refere a uma região de uma molécula de imunoglobulina que inclui a região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e/ou a região constante de cadeia pesada 3 (CH3), excluindo as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves. Para o propósito da presente invenção, tal região de Fc de imunoglobulina pode incluir uma região de dobradiça modificada na região constante de cadeia pesada, mas não é limitada a isso.

[084] Tal região de Fc de imunoglobulina pode incluir uma região de dobradiça na região constante de cadeia pesada, mas não é limitada a isso. Adicionalmente, a região de Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser uma região de Fc estendida que inclui uma parte ou a totalidade da região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e/ou a região constante leve 1 (CL1), excluindo as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de uma imunoglobulina, visto que a região de Fc de imunoglobulina tem um efeito igual ou equivalente ao de seu tipo nativo. Adicionalmente, a região de Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser uma região no qual uma parte de uma sequência de aminoácidos significativamente longa correspondente a CH2 e/ou CH3 é removida.

[085] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma região de Fc de imunoglobulina que pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em 1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3, e um domínio CH4; 2) um domínio CH1 e um domínio CH2; 3) um domínio CH1 e um domínio CH3; 4) um domínio CH2 e um domínio CH3; 5) uma combinação entre um ou dois ou mais domínios dentre um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3, e um domínio CH4 e uma região de dobradiça (ou uma parte da região de dobradiça); e 6) um dímero entre cada domínio da região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve, mas a região de Fc de imunoglobulina não é limitada a isso.

[086] Conforme usado no presente documento, o termo “troca de cadeia” se refere a um problema no fato de que, quando um Fc de IgG4 é usada como um carreador de uma proteína de fusão, o Fc de IgG4 forma um híbrido com um IgG4 presente in vivo ou está presente como um monômero e altera a estrutura original para ter uma estrutura com uma baixa atividade terapêutica, e foi anteriormente relatado que há dificuldade significativa quando uma proteína de fusão, no qual uma proteína é fusionada, é usada para fins terapêuticos (van der Neut Kolfschoten, et al., Science, 317:1554 a 1557. 2007).

[087] Na presente invenção, os presentes inventores realizaram esforços para solucionar o problema acima substituindo-se a sequência de uma região de dobradiça em uma região de Fc de imunoglobulina. Especificamente, a região de Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser aquela na qual uma sequência de glicosilação potente é substituída para a regulação de glicosilação ou a sequência envolvida na troca de cadeia é substituída, ou pode corresponder a ambos os casos.

[088] Em uma modalidade específica, a região de Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser aquela na qual o 2o aminoácido e/ou o 71o aminoácido da região de Fc de imunoglobulina de SEQ ID NO: 8 é substituído por um diferente aminoácido para a prevenção de troca de cadeia e N-glicosilação. Mais especificamente, a região de Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser 1) aquela na qual o 2o aminoácido (isto é, serina) é substituído por prolina, 2) aquela na qual o 71o aminoácido (isto é, asparagina) é substituído por glutamina, mas a região de Fc de imunoglobulina não é limitada a isso. Adicionalmente às variações descritas acima, a região de Fc de imunoglobulina pode incluir uma variações apropriadas como um fármaco carreador para aumentar a estabilidade de uma enzima terapêutica.

[089] Especificamente, a região de Fc de imunoglobulina pode ser aquela na qual uma região de dobradiça de um imunoglobulina Fc de IgG4 é substituída por uma região de dobradiça de IgG1, mas a região de Fc de imunoglobulina não é limitada a isso.

[090] Em uma modalidade da presente invenção, o 2 o aminoácido da região de Fc de imunoglobulina de SEQ ID NO: 8 é substituído por prolina e o 71o aminoácido da região de Fc de imunoglobulina de SEQ ID NO: 8 é substituído por glutamina, e assim a troca de cadeia e N-glicosilação foram reduzidas. A sequência do Fc de imunoglobulina preparada tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (Exemplo 1).

[091] Em uma modalidade, a região de dobradiça pode ser aquela na qual uma parte da sequência de dobradiça que tem a seguinte sequência de aminoácidos é deletada ou modificada. Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 26)

[092] Especificamente, a região de dobradiça pode ser uma que tem uma variação em que uma parte da região de dobradiça é deletada para incluir somente um resíduo de cisteína (Cys); ou pode ser uma em que um resíduo de serina (Ser) envolvido em troca de cadeia é substituído por um resíduo de prolina (Pro), e mais especificamente, uma em que a 2a serina da sequência de dobradiça é substituída por um resíduo de prolina, mas a região de dobradiça não é limitada a isso.

[093] Na presente invenção, uma região de Fc de imunoglobulina pode aumentar a estabilidade de uma enzima terapêutica fusionada enquanto evita a troca de cadeia e formação de monômeros em uma região de Fc incluindo-se uma região de dobradiça em sua forma nativa ou uma região de dobradiça modificada.

[094] Adicionalmente, em outra modalidade específica, a região de Fc de imunoglobulina da presente invenção não somente inclui sequências de aminoácido nativa, mas também análogos de sequência das mesmas. Um análogo de aminoácido significa que uma variação selecionada a partir do grupo que consiste em substituição, adição, deleção, modificação, e uma combinação dos mesmos ocorreu em pelo menos um resíduo de aminoácido de uma sequência de aminoácidos nativa.

[095] Por exemplo, resíduos de aminoácido nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, ou 327 a 331 em IgG Fc, que são conhecidos como importantes para ligação, podem ser usados como os sítios adequados para variação. Adicionalmente, vários tipos de análogos são possíveis, por exemplo, um em que o sítio com capacidade de formar uma ligação de dissulfeto é removido, um em que vários aminoácidos de terminação N de Fc nativa são removidos, um em que um resíduo de metionina é adicionado à terminação N de Fc nativa, etc. Adicionalmente, sítios de ligação complementares (por exemplo, sítios de ligação de C1q) ou sítios de citotoxidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) podem ser removidos para remover a função efetora. As técnicas para preparar a sequência análogos de uma região de Fc de imunoglobulina são reveladas nos Pedidos Internacionais Nº WO 97/34631, WO 96/32478, etc.

[096] Substituições de aminoácido em uma proteína ou molécula peptídica que não alteram a atividade inteira de uma molécula conhecidas na técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque, 1979). As substituições mais importantes ocorrem entre resíduos de aminoácido de Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly. Em alguns casos, aminoácidos podem ser modificados por fosforilação, sulfatação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação, etc.

[097] Adicionalmente, os análogos de Fc descritos acima podem ser aqueles que exibem a mesma atividade biológica que da região de Fc da presente invenção, e têm estabilidade estrutural aumentada da região de Fc contra calor, pH, etc.

[098] Adicionalmente, tal região de Fc pode ser obtida a partir de um tipo nativo isolado de seres humanos ou animais, tais como vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos, porquinhos-da-índia porcos, etc., ou pode ser seus recombinantes ou análogos obtidos de células de animais ou micro- organismos transformados. No presente documento, o mesmo pode ser obtido a partir de um Fc nativo isolando-se todas as imunoglobulinas de organismos humanos ou animais e tratando os mesmos com uma protease. Paraína digere a região de Fc nativa em regiões de Fab e Fc, e tratamento de pepsina resulta na produção de fragmentos de pF′c e F(ab)2. Esses fragmentos podem ser submetidos a cromatografia de exclusão de tamanho para isolar Fc ou pF′c. Em um mais modalidade específica, a região de Fc pode ser uma região de Fc de imunoglobulina recombinante obtida de um micro-organismo, que é uma região de Fc derivada de ser humano.

[099] Adicionalmente, a região de Fc de imunoglobulina pode estar na forma de glicano nativo, glicanos aumentados ou diminuídos em comparação ao seu tipo nativo, ou em uma forma desglicosilada. O aumento, diminuição, ou remoção dos glicanos de Fc de imunoglobulina podem ser alcançados por métodos convencionais tais como um método químico, método enzimático, e método de manipulação genética com uso de um micro-organismo. Em particular, a região de Fc de imunoglobulina em que os glicanos são removidos da região de Fc mostra uma diminuição significativa in afinidade de ligação para o complemento (C1q) e uma diminuição ou remoção de citotoxidade dependente de anticorpo ou toxidade dependente de complemento, e desse modo, isso não induz repostas imunes desnecessárias in vivo. Em relação a isso, uma região de Fc de imunoglobulina em uma região de Fc de imunoglobulina desglicosilada ou aglicosilada pode ser uma forma mais adequada para atender ao objetivo original da presente invenção como um fármaco carreador.

[0100] Conforme usado no presente documento, o termo “desglicosilação” se refere a um remoção de porções de açúcar de uma região de Fc por uma enzima, e o termo “aglicosilação” se refere a uma região de Fc não-glicosilada produzida em procariotas, mais especificamente, E. coli.

[0101] Entrementes, a região de Fc de imunoglobulina pode ser derivada de seres humanos ou animais incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos, e porquinhos-da-índia porcos, e mais especificamente, a mesma pode ser derivada de seres humanos.

[0102] Adicionalmente, a região de Fc de imunoglobulina pode ser uma região de

Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, ou uma combinação ou híbrido das mesmas. Em um mais modalidade específica, a mesma pode ser derivada de IgG ou IgM, que estão entre as proteínas mais abundantes em sangue humano, e em um modalidade ainda mais específica, a mesma pode ser derivada de IgG, que é conhecida por intensificar as meias-vidas de proteínas de ligação de ligante. Em um mais modalidade específica, a região de Fc de imunoglobulina pode ser uma região de Fc de IgG4, em uma modalidade ainda mais específica, a mesma pode ser uma região de Fc aglicosilada derivada de um IgG4 humano, e em uma modalidade mais específica, a região de Fc de imunoglobulina pode ser uma região de Fc de IgG4 que inclui uma variação em que o 2o aminoácido que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 da região de Fc de imunoglobulina é substituída por prolina e/ou o 71o aminoácido é substituída por glutamina; ou a sequência de aminoácidos da região de Fc de imunoglobulina é SEQ ID NO: 9 e o polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos é SEQ ID NO: 7, mas a região de Fc de imunoglobulina não é limitada a isso.

[0103] Conforme usado no presente documento, o termo “combinação” significa que polipeptídeos que codificam regiões de Fc de imunoglobulina de cadeia única da mesma origem são ligados a um polipeptídeo de cadeia única de um origem diferente para formar um dímero ou multímero. Ou seja, um dímero ou multímero pode ser preparado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados a partir do grupo que consiste em fragmentos de Fc de IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, e IgE Fc.

[0104] Adicionalmente, as proteínas da presente invenção podem ser aquelas em que a terminação N e/ou terminação C das proteínas não são modificadas, mas, para proteger ou aumentar a estabilidade das enzimas terapêuticas de enzimas de clivagem de proteína in vivo, aquelas proteínas em que a terminação N e/ou terminação C das enzimas terapêuticas são quimicamente modificadas ou protegidas por grupo orgânico, ou a terminação amino das enzimas terapêuticas é modificada pela adição de um aminoácido, etc. são também incluídos no escopo das proteínas de acordo com a presente invenção. Quando a terminação C das enzimas terapêuticas não é modificada, as terminações das proteínas de acordo com a presente invenção podem ter uma terminação carboxila, mas as proteínas da presente invenção não são particularmente limitadas a isso.

[0105] Em particular, visto que a terminação N e terminação C das proteínas quimicamente sintetizadas têm mudanças, a terminação N pode ser acetilada e/ou terminação C pode ser amidada de modo a remover essas cargas, mas os métodos não são particularmente limitados a isso.

[0106] A menos que especificado de outro modo no presente relatório descritivo, as tecnologias em relação a “enzima” ou “proteína de fusão” de acordo com a presente invenção descrita na descrição detalhada ou reivindicações da presente invenção serão aplicadas não somente à enzima ou proteína de fusão em questão, mas também ao escopo que inclui todos os sais da enzima ou proteína de fusão em questão (por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável da proteína de fusão), ou um solvato dos mesmos. Consequentemente, embora a mesma seja simplesmente descrita como “enzima” ou “proteína de fusão” no relatório descritivo, a descrição em questão será aplicada de modo similar ao sal específico, o solvato específico, e o solvato específico do sal específico. Tais formas de sal podem estar em uma forma, por exemplo, com uso de qualquer sal farmaceuticamente aceitável, mas o tipo do sal não é particularmente limitado. Aquelas formas de sal, por exemplo, pode ser aquelas que são seguras e eficazes a mamíferos, mas as formas de sal não são particularmente limitadas a isso.

[0107] Conforme usado no presente documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a um material que pode ser usado de modo eficaz para o uso destinado sem causar toxidade excessiva, estímulo, ou reações alérgicas, etc. dentro da faixa de decisão médico-farmacêutica.

[0108] Conforme usado no presente documento, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a um sal derivado de sais inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis, sais orgânicos ou bases. Exemplos dos sais adequados podem incluir ácido clorídrico, ácido brômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido fosfórico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido salicílico, ácido succínico, ácido tolueno-p-sulfônico ácido, ácido tartárico, ácido acético, ácido cítrico, ácido metanossulfônico, ácido fórmico, ácido benzóico, ácido malônico, ácido naftaleno-2-sulfônico, ácido benzenosulfônico, etc. Exemplos dos sais derivados de bases adequadas podem incluir metais álcali tais como sódio, potássio, etc.; metais de terra álcali tais como magnésio; amônio, etc.

[0109] Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “solvato” se refere a um complexo formado entre a enzima, proteína de fusão de acordo com a presente invenção ou um sal do mesmo e uma molécula de solvente.

[0110] A proteína de fusão de enzima da presente invenção pode ser preparada por um método conhecido na técnica.

[0111] Em uma modalidade da presente invenção, um vetor recombinante foi preparado em que cada um dentre iduronato-2-sulfatase (IDS) e arilsulfatase B (ARSB) (isto é, enzimas terapêuticas) pode ser expresso em uma forma fusionada a um ligante de peptídeo-Fc de imunoglobulina, e essas enzimas terapêuticas foram preparadas expressando-se as mesmas em uma linhagem celular de CHO (Exemplos 1 a 3).

[0112] No entanto, a proteína de fusão de enzima da presente invenção podem ser preparadas por métodos diferentes daqueles descritos nas modalidades acima. A proteína de fusão de enzima pode incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 ou 25, mas as sequências de aminoácido não são limitadas a isso.

[0113] A proteína de fusão de enzima de acordo com a presente invenção pode aumentar a meia-vida de uma enzima terapêutica que exibe um efeito terapêutico em LSDs enquanto mantém a atividade da enzima terapêutica, fundindo-se a enzima terapêutica a uma região de Fc de imunoglobulina. Em particular, uma enzima terapêutica fusionada a uma região de Fc modificada de imunoglobulina tem troca de cadeia reduzida e glicosilação, e desse modo, pode ter uma afinidade de ligação inferior para receptores de lisossoma em comparação a uma enzima terapêutica a qual um Fc não é fusionado, e pode ter assim alta duração, confirmando que tal enzima terapêutica é eficaz para o tratamento de LSDs.

[0114] Em uma modalidade da presente invenção, foi confirmado que a proteína de fusão de enzima de acordo com a presente invenção pode manter in vitro atividade de enzima (Exemplo 5) enquanto tem um meia-vida significativamente excelente (T1/2), concentração de fármaco máxima no sangue (Cmax), e disponibilidade in vivo (AUC) (Exemplo 4) em comparação a uma enzima naturalmente ocorrente a qual uma região de Fc não é fusionada, e a partir desses resultados, foi confirmado que o fármaco pode ser usado mesmo em baixas doses em comparação a fármacos convencionais (Exemplo 6).

[0115] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir e tratar distúrbios de armazenamento lisossomal (LSDs) que contém uma proteína de fusão de enzima, que é preparada de acordo com o método para preparar uma proteína de fusão de enzima ou proteína de fusão de enzima.

[0116] A composição de acordo com a presente invenção é caracterizada pelo fato de que a duração in vivo e estabilidade de uma enzima terapêutica são aumentadas.

[0117] Em uma modalidade específica, a proteína de fusão de enzima de uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser aquela em que iduronato-2- sulfatase (IDS) ou arilsulfatase B (ARSB) é fusionada a uma região de Fc de imunoglobulina, mas a proteína de fusão de enzima não é limitada a isso.

[0118] Conforme usado no presente documento, o termo “lisossoma”, que é uma das organelas presentes no citoplasma, contém muitas hidrolases e desse modo, decompõe materiais indesejados no corpo tais como macromoléculas, bactérias, etc., e ajuda os produtos decompostos a serem utilizados em outras partes das células. As funções de um lisossoma podem ser realizadas por muitas enzimas. Quando uma enzima particular perde sua função devido a uma mutação, deficiência, etc., isso causa a perda da função de decomposição do lisossoma e resulta no acúmulo de macromoléculas, etc., que precisam ser decompostas, na célula e induzem danos celulares, etc. causando assim uma doença.

[0119] Conforme usado no presente documento, o termo “doença de armazenamento lisossomal (LSD)” se refere a uma doença genética rara devido à perda de funções lisossomais descritas acima, e terapia de substituição enzimática com uso de uma enzima defeituosa é essencial. De acordo com a enzima deficiente, LSD pode incluir mucopolissacararidose (MPS), doença de armazenamento de glicogênio, esfingolipidose, doença de Niemann-Pick, doença de Fabry, doença de Gaucher, síndrome de Hunter, síndrome de Maroteaux-Lamy, etc.

[0120] Doravante, LSD será descrito em detalhes de acordo com sua classificação.

[0121] Conforme usado no presente documento, o termo “síndrome de Maroteaux- Lamy”, que pertence a doenças mucopolissacararidose tipo IV (MPS), é uma doença genética recessiva autossomal que ocorre devido à deficiência de arilsulfatase B (N- acetilgalactosamina-4-sulfatase) necessária para a quebra de glicosaminoglicano. A síndrome de Maroteaux-Lamy é uma doença que ocorre pelo depósito de sulfato de dermatana que não foi decomposto devido à deficiência da enzima nos ossos, válvulas cardíacas, baço, fígado, córnea, etc.

[0122] Conforme usado no presente documento, o termo “arilsulfatase B (ARSB)” se refere a uma arilsulfatase que está presente nos lisossomas do fígado, pâncreas, e rins, e a enzima tem a função de hidrolisar sulfatos decompondo-se glicosaminoglicano. A arilsulfatase B é conhecida por ser associada a mucopolissacararidose VI (síndrome de Maroteaux-Lamy). Na presente invenção, o termo arilsulfatase B pode ser usado de modo intercambiável com galsulfase.

[0123] Conforme usado no presente documento, o termo “síndrome de Hunter (Hunter doença)” é uma doença genética recessiva ligada a X que ocorre devido à deficiência de iduronato-2-sulfatase (IDS), e é conhecido que sulfato de heparana e sulfato de dermatana são acumuladas devido à deficiência da enzima. Sintomas de síndrome de Hunter incluem a deterioração de funções, perda progressiva de audição, retinite pigmentosa, papilledema, hidrocéfalo, etc. Na presente invenção, o termo “mucopolissacararidose II” pode ser usado de modo intercambiável com “síndrome de

Hunter”.

[0124] Conforme usado no presente documento, o termo “iduronato-2-sulfatase”, que é uma enzima de sulfatase relacionada à síndrome de Hunter (MPS-II), é uma enzima necessária para degradação lisossomal de sulfato de heparina e sulfato de dermatana. Na presente invenção, o termo “iduronato-2-sulfatase” pode ser usado de modo intercambiável com “idursulfase”. A idursulfase pode ser, por exemplo, idursulfase alfa ou idursulfase beta, mas a idursulfase não é limitada a isso.

[0125] A enzima terapêutica pode ser preparada ou fabricada por um método conhecido na técnica, e especificamente, a enzima pode ser purificada da cultura depois de cultivar células de animais nas quais um vetor de expressão de animal é inserido, ou pode ser usado depois de adquirir enzimas comercialmente disponíveis, mas a enzima não é limitada a isso.

[0126] A proteína de fusão de enzima contida na composição da presente invenção pode aumentar a meia-vida de uma enzima terapêutica que exibe um efeito terapêutico em LSDs enquanto mantém a atividade da enzima terapêutica fundindo- se a enzima terapêutica a uma região de Fc de imunoglobulina. Em particular, uma enzima terapêutica fusionada a uma região de Fc modificada de imunoglobulina tem troca de cadeia reduzida e glicosilação, e desse modo, pode ter uma afinidade de ligação inferior para receptores de lisossoma em comparação a uma enzima terapêutica a qual um Fc não é fusionado, e pode ter assim alta duração, confirmando que tal enzima terapêutica é eficaz para o tratamento de LSDs.

[0127] Em uma modalidade da presente invenção, foi confirmado que a proteína de fusão de enzima da presente invenção, mesmo coma um frequência de administração inferior em comparação a de uma enzima a qual uma região de Fc não é fusionada, reduziu o valor de glicosaminoglicano (GAG) em um camundongo com knockout de IDS (Exemplo 6).

[0128] Adicionalmente, em outra modalidade da presente invenção, foi confirmado que a proteína de fusão de enzima da presente invenção não somente mostrou um alto grau de distribuição na medula óssea e baço em comparação a uma enzima nativa a qual uma região de Fc não é fusionada, mas também mostrou sua distribuição nos pulmões, rins, coração, etc., enquanto a distribuição da enzima nativa não foi confirmada nos tecidos em questão (Exemplo 7).

[0129] Esses resultados sugerem que a proteína de fusão de enzima da presente invenção, quando administrada com base em alta estabilidade, pode não somente aumentar a conveniência do paciente diminuindo-se a frequência de administração, mas também pode permitir uma administração subcutânea devido ao seu alto grau de distribuição em tecidos.

[0130] Conforme usado no presente documento, o termo “prevenção” se refere a todas as atividades que inibem ou atrasam a ocorrência de LSD administrando-se a proteína de fusão de enzima ou composição que contém a proteína de fusão de enzima, e o termo “tratamento” se refere a todas as atividades que aprimoram ou mudam de modo vantajoso os sintomas de LSD administrando-se a proteína de fusão de enzima ou composição que contém a proteína de fusão de enzima.

[0131] Conforme usado no presente documento, o termo “administração” se refere à introdução de uma substância particular em um paciente por qualquer método apropriado, e a rota de administração da composição pode ser qualquer rota convencional que permite a entrega da composição ao alvo in vivo, por exemplo, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intradérmica, administração oral, administração local, administração intranasal, administração intrapulmonar, administração intrarretal, etc. No entanto, visto que peptídeos são digeridos mediante administração oral, ingredientes ativos de uma composição para administração oral são preferencialmente revestidos ou formulados para proteção contra degradação no estômago, e especificamente, podem ser administrados em uma forma injetável. Adicionalmente, a composição farmacêutica pode ser administrada com uso de um determinado dispositivo com capacidade de transportar os ingredientes ativos em uma célula alvo.

[0132] A dose eficaz total da composição da presente invenção pode ser administrada a um paciente em uma única dose ou pode ser administrada por um longo período de tempo em múltiplas doses de acordo com a um protocolo de tratamento fracionado. Na composição farmacêutica da presente invenção, o conteúdo do ingrediente ativo pode variar dependendo da severidade da doença. Especificamente, a dose diária total da proteína de fusão da presente invenção pode ser cerca de 0,0001 mg a 500 mg por 1 kg de peso corporal de um paciente. No entanto, a dose eficaz da proteína de fusão é determinada considerando vários fatores incluindo a idade do paciente, peso corporal, condições de saúde, sexo, severidade da doença, dieta, taxa de excreção, etc. adicionalmente à rota de administração e frequência de tratamento da composição farmacêutica. Em relação a isso, os elementos versados na técnica podem determinar facilmente a dose eficaz adequada para o uso particular da composição farmacêutica da presente invenção. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não é particularmente limitada à população, rota de administração, e método, visto que isso mostra os efeitos da presente invenção.

[0133] Na presente invenção, a dose real da proteína de fusão de enzima pode ser determinada com base nos tipos da enzima terapêutica usada como um ingrediente ativo junto com vários fatores tais como a doença a ser tratada, rota de administração, idade, sexo, e peso de um paciente, severidade da doença, etc. Visto que a proteína de fusão de enzima da presente invenção tem duração in vivo e atividade significativamente excelente, a dose, número, e frequência de administração da formulação farmacêutica que contêm a proteína de fusão de enzima da presente invenção podem ser significativamente reduzidos.

[0134] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter adicionalmente um carreador, excipiente, ou diluente farmaceuticamente aceitável. O carreador farmaceuticamente aceitável pode ser naturalmente não ocorrente.

[0135] Conforme usado no presente documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere às propriedades de ter uma quantidade suficiente para exibir um efeito terapêutico e não causam efeitos adversos, e podem ser facilmente determinados pelos elementos versados na técnica com base em fatores conhecidos no campo médico, tais como o tipo de doença, idade, peso, condições de saúde, sexo, sensitividade de fármaco de um paciente, rota de administração, administração método, frequência de administração, duração de tratamento, um fármaco (ou fármacos) a serem misturados ou administrados simultaneamente, etc.

[0136] O carreador farmaceuticamente aceitável pode incluir, para administração oral, um aglutinante, um agente antiaderente, um agente desintegrante, um excipiente, um agente de solubilização, um agente dispersante, um agente de estabilização, um agente de suspensão, um agente de coloração, um agente flavorizante, etc.; para injeções, um agente de tamponação, um agente de preservação, um analgésico, um agente de solubilização, um agente isotônico, um agente de estabilização, etc., que pode ser combinado para ser usado; e para administrações tópicas, uma base, um excipiente, um lubrificante, um agente de preservação, etc., mas os carreadores farmaceuticamente aceitáveis não são limitados a isso.

[0137] O tipo de formulação da composição da presente invenção pode ser preparado de forma variada combinando com um carreador farmaceuticamente aceitável descrito acima. Por exemplo, para administração oral, a composição pode ser formulada em tabletes, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, obreias, etc. Para injeções, a composição pode ser formulada em ampolas de dose unitária ou recipientes de múltiplas doses. Adicionalmente, a composição também pode ser formulada em soluções, suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongada, etc.

[0138] Entrementes, exemplos de carreadores adequados, excipientes, e diluentes podem incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, celulose de metila, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, hidrobenzoato de metila, hidrobenzoato de propila, talco, estearato de magnésio, óleo mineral, etc. Adicionalmente, a composição pode conter adicionalmente uma carga,

um anticoagulante, um lubrificante, um agente umidificante, um agente flavorizante, um conservante, etc.

[0139] Adicionalmente, a proteína de fusão de enzima pode ser usada misturando- se com vários carreadores farmaceuticamente aceitáveis aprovados como fármacos farmacêuticos tais como salino fisiológico ou solventes orgânicos. Para aumentar a estabilidade ou capacidade de absorção, carboidratos tais como glucose, sacarose, ou dextranos, e antioxidantes tais como ácido ascórbico ou glutationa, agentes de quelação, proteínas de baixo peso molecular, ou outros estabilizadores podem ser usados como fármacos farmacêuticos.

[0140] A composição farmacêutica pode conter os ingredientes acima (ingredientes ativos) em uma quantidade de 0,01% a 99% (p/v), mas a quantidade não é limitada a isso.

[0141] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de enzima de acordo com a presente invenção.

[0142] O polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de enzima de acordo com a presente invenção pode ser um polinucleotídeo em uma forma em que uma região que codifica uma enzima terapêutica e uma região que codifica um ligante de peptídeo-região de Fc de imunoglobulina é ligada, e especificamente, um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão em que a terminação N de uma região de Fc de imunoglobulina é ligada à terminação C de uma enzima terapêutica através de um ligante GGGGS, mas o polinucleotídeo não é limitado a isso. Mais especificamente, o polinucleotídeo da presente invenção pode incluir a sequência de SEQ ID NO: 1 ou 3, mas a sequência não é limitado a isso visto que o polinucleotídeo pode codificar a proteína de fusão que compreende uma enzima terapêutica e uma região de Fc de imunoglobulina.

[0143] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um vetor de expressão recombinante que inclui o polinucleotídeo.

[0144] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor recombinante” se refere a um construto de DNA em que um peptídeo alvo (por exemplo, proteína de fusão de enzima) é ligado de modo operável a uma sequência de controle apropriada para permitir a expressão do peptídeo alvo (por exemplo, proteína de fusão de enzima) em um hospedeiro apropriado. O vetor recombinante de acordo com a presente invenção pode ser construído como um vetor para clonagem típica ou como um vetor para expressão, e pode ser construído com uso de uma célula procariótica ou célula eucariótica como uma célula hospedeira.

[0145] A sequência de controle inclui um promotor com capacidade de iniciar transcrição, qualquer sequência de operador para o controle da transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação ribossômica de mRNA apropriado, e uma sequência que controla a terminação da transcrição e translação. O vetor recombinante, depois de ser transformado em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicada ou funcionar independente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado ao próprio genoma hospedeiro.

[0146] O vetor recombinante usado na presente invenção pode não ser particularmente limitado visto que o vetor tem capacidade de se replicar em uma célula hospedeira, e o mesmo pode ser construído com uso de qualquer vetor conhecido na técnica. Exemplos do vetor pode incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus, e bacteriófagos. O vetor que pode ser usado na presente invenção não é particularmente limitado, mas qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado.

[0147] O vetor recombinante é usado para a transformação de uma célula hospedeira para produzir a proteína de fusão de enzima da presente invenção. Adicionalmente, essas células transformadas, como uma parte da presente invenção, pode ser usada para a amplificação de fragmentos de ácido nucleico e vetores, ou as mesmas podem ser células cultivadas ou linhagens celulares usadas na produção recombinante da proteína de fusão de enzima da presente invenção.

[0148] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” se refere a um processo de introduzir um vetor recombinante que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira, permitindo assim a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se o mesmo é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado fora do cromossomo, desde que o mesmo possa ser expresso na célula hospedeira e ambos os casos são usados.

[0149] Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido em qualquer forma visto que o mesmo pode ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto de gene que inclui todos os elementos essenciais exigidos para autoexpressão. O cassete de expressão pode incluir convencionalmente um promotor ligado de modo operável ao polinucleotídeo, um sinal de terminação de transcrição, um domínio de ligação de ribossomo, e um sinal de ligação de translação. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão com capacidade de autorreplicação. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira como é e ligado de modo operável a uma sequência essencial para sua expressão na célula hospedeira, mas o polinucleotídeo não é limitado a isso.

[0150] Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “ligado de modo operável” se refere a uma ligação funcional entre uma sequência promotora, que inicia e media a transcrição do polinucleotídeo que codifica o peptídeo-alvo da presente invenção, e a sequência de genes acima.

[0151] Um hospedeiro apropriado a ser usado na presente invenção pode não ser particularmente limitado visto que o mesmo pode expressar o polinucleotídeo da presente invenção. Exemplos do hospedeiro apropriado pode incluir bactérias pertencentes ao gênero Escherichia tais como E. coli; bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, tais como Bacillus subtilis; bactérias pertencentes ao gênero Pseudomonas, tais como Pseudomonas putida; leveduras, tais como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, e Schizosaccharomyces pombe; células de inseto, tais como Spodoptera frugiperda (Sf9); e células de animais, tais como CHO, COS, BSC, etc.

[0152] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um transformante no qual o vetor de expressão é introduzido.

[0153] Para o propósito da presente invenção, o transformante no qual o vetor de expressão da presente invenção é introduzido pode não ser limitado visto que o transformante pode expressar e produzir a proteína de fusão de enzima, mas o transformante pode ser bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, tais como E. coli; bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, tais como Bacillus subtilis; bactérias pertencentes ao gênero Pseudomonas, tais como Pseudomonas putida; leveduras tais como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, e Schizosaccharomyces pombe; células de inseto, tais como Spodoptera frugiperda (Sf9); e células de animais, tais como CHO, COS, BSC, etc.

[0154] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar a proteína de fusão de enzima de acordo com a presente invenção.

[0155] Especificamente, o método pode incluir (a) cultivar um transformante para obter uma cultura; e (b) recuperar uma proteína de fusão de enzima da cultura, mas o método não é limitado a isso.

[0156] Na presente invenção, o meio usado em cultivar o transformante precisa atender aos requisitos para cultivo em célula hospedeira de maneira apropriada. As fontes de carbono que podem ser contidas no meio para o crescimento de uma célula hospedeira pode ser apropriadamente selecionado pela decisão dos elementos versados na técnica de acordo com o tipo do transformante preparado do mesmo, e cultivações de cultivo apropriadas podem ser selecionadas de modo a controlar o período e quantidade do cultivo.

[0157] Exemplos da fonte de açúcar a ser usada no meio podem incluir açúcares e carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amida, e celulose; óleos tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino, e óleo de coco; ácidos graxos tais como ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico; álcoois tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético. Esses materiais podem ser usados por si só ou em combinação.

[0158] Exemplos da fonte de nitrogênio a ser usada pode incluir peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de milhocina, farinha de soja, e ureia, ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. A fonte de nitrogênio também pode ser usada por si só ou em combinação.

[0159] Exemplos da fonte fosforosa a ser usada pode incluir fosfato de dehidrogênio de potássio ou fosfato de hidrogênio de dipotássio ou um sal que contém sódio correspondente. Adicionalmente, o meio de cultura pode conter um sal de metal tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro necessário para crescimento.

[0160] Por fim, os materiais de crescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas podem ser usados. Adicionalmente, percursores apropriados para meio de cultura também podem ser usados. As fontes acima podem ser apropriadamente adicionados a uma cultura durante cultivo por uma cultura de batelada ou cultura contínua. O pH da cultura pode ser apropriadamente ajustado com uso de um composto básico, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, e amônia, ou um composto de ácido, tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Adicionalmente, um agente antiespumante, tal como éster de poliglicol de ácido graxo pode ser adicionado para evitar geração de espuma. Adicionalmente, de modo a manter o estado aeróbico da cultura, oxigênio ou um gás que contém oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado na cultura.

[0161] O transformante da presente invenção pode ser cultivado em 20° C a 45° C, e especificamente, 25° C a 40° C. Adicionalmente, o cultivo é continuado até que a quantidade máxima de produção da proteína de fusão desejada enzimática seja obtida e, em relação a isso, o cultivo pode ser normalmente continuado por 10 horas a 160 horas.

[0162] Conforme descrito acima, o transformante da presente invenção pode produzir proteína de fusão de enzima quando condições de cultura apropriadas são fornecidas de acordo com a uma célula hospedeira, e a proteína de fusão de enzima produzidas de acordo com a constituição de vetor e características de uma célula hospedeira pode ser secretada dentro do citoplasma ou ao espaço periplásmico da célula hospedeira ou de modo extracelular.

[0163] As proteínas expressas dentro ou fora da célula hospedeira podem ser purificadas por um método convencional. Exemplos do método de purificação pode incluir precipitação (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio, precipitação de fosfato de sódio, etc.), precipitação de solvente (por exemplo, precipitação de fração de proteína com uso de acetona ou etanol, etc.), diálise, filtração de gel, troca de íons, ou cromatografia, tal como cromatografia de coluna reversa, ultrafiltração, etc., e esses métodos podem ser usados por si só ou em combinação.

[0164] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para a prevenção ou tratamento de LSD a um indivíduo, incluindo administrar a proteína de fusão de enzima ou uma composição que contém a proteína de fusão de enzima.

[0165] Visto que a proteína de fusão de enzima da presente invenção contém uma enzima terapêutica que pode prevenir ou tratar LSD, um indivíduo com suspeita de ter LSD pode ser prevenido ou tratado pela administração de uma proteína de fusão de enzima que contém a enzima terapêutica ou uma composição farmacêutica que contém a proteína de fusão de enzima.

[0166] Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” se refere a um indivíduo com suspeita de ter LSD, e o indivíduo com suspeita de ter LSD se refere a mamíferos que incluem seres humanos, ratos, gado, etc., que têm ou são estão em risco de desenvolver o LSD, mas qualquer indivíduo que pode ser tratado com a proteína de fusão de enzima da presente invenção ou composição que contém a proteína de fusão de enzima é incluído sem limitação.

[0167] O método da presente invenção pode incluir administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição farmacêutica que contém uma proteína de fusão de enzima. Um dose diária total apropriada da composição pode ser determinada dentro do escopo de julgamento médico correto por um profissional, e a composição pode ser administrada uma vez ou várias vezes em doses divididas. No entanto, para o propósito da presente invenção, preferencialmente, a dose terapeuticamente eficaz específica da composição para qualquer particular indivíduo é aplicada de modo diferente dependendo de vários fatores que incluem o tipo e grau de respostas a serem alcançadas, composições específicas incluindo se outros agentes são ocasionalmente usados com o mesmo, a idade do indivíduo, peso, condições de saúde, sexo e dieta, administração time, rota de administração, taxa de excreção da composição, duração de tratamento, outros fármacos usados em combinação ou simultaneamente com as composições específicas, e fatores similares conhecidos no campo médico.

[0168] Entrementes, o método para a prevenção ou tratamento da LSD pode ser uma terapia de combinação que inclui adicionalmente administrar um composto ou material que tem um efeito terapêutico para pelo menos uma das LSDs, mas o método não é limitado a isso.

[0169] Conforme usado no presente documento, o termo “combinação” precisa ser entendido como se referindo a uma administração simultânea, separada, ou sequencial. Quando a administração é sequencial ou separada, o intervalo permitido para a administração de um segundo ingrediente precisa ser um que não perca os efeitos vantajosos da combinação.

[0170] A administração dose da proteína de fusão de enzima que tem uma atividade terapêutica para a LSD pode ser cerca de 0,0001 μg a 500 mg por 1 kg de peso corporal de um indivíduo, mas a dose não é particularmente limitada.

[0171] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um uso da proteína de fusão de enzima, ou uma composição que contém a proteína de fusão de enzima na preparação de um medicamento (ou uma composição farmacêutica) para a prevenção ou tratamento de LSDs.

[0172] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, esses Exemplos são para fins ilustrativos somente e o escopo da invenção não é limitado por esses Exemplos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO PARA

PROTEÍNA DE FUSÃO

[0173] Para a produção de proteínas de fusão de enzima, um vetor de expressão para proteínas de fusão foi preparado sobrepondo-se PCR com uso de um vetor de expressão (IDS cDNA, Cat Nº EX-C0003-M02, Gencopoeia; ARSB cDNA, Cat Nº EX- C0073-M02, Genecopoeia), em que iduronato-2-sulfatase (IDS, SEQ ID NO: 1) naturalmente ocorrente e arilsulfatase B (ARSB, SEQ ID NO: 3) são inseridos, respectivamente, um ligante sintetizado (SEQ ID NO: 5), e uma região de Fc de IgG4 (SEQ ID NO: 7). Visto que a técnica de PCR de sobreposição inclui sequências que se sobrepõem com os iniciadores ao amplificar cada da enzima e o ligante-Fc, os produtos de PCR produzidos incluirão as sequências de sobreposição. Para a amplificação da proteína de fusão, PCR foi realizado conforme a seguir: 1) PCR primário (25 ciclos que consistem em 95° C por 1 min; 57° C por 30 seg; e 68° C por 3 min) e 2) PCR secundário (25 ciclos que consistem em 95° C por 1 min; 57° C por 30 seg; e 68° C para 4 min).

[0174] Especificamente, para IDS, PCR foi realizado com uso dos iniciadores das SEQ ID NOS: 10 e 11; e para o ligante-Fc, PCR foi realizado com uso dos iniciadores das SEQ ID NOS: 12 e 13. Como resultado, o produto de PCR de IDS incluiu a sequência de ligante-Fc na extremidade 3′ e o ligante-Fc PCR incluiu a sequência de IDS na extremidade 5′.

[0175] O PCR secundário foi realizado com uso dos dois produtos de PCR obtidos no PCR primário como modelos junto com os iniciadores (SEQ ID NOS: 10 e 13) e então o produto de PCR tendo a sequência de IDS-Fc foi obtido. A sequência de sobreposição no produto tendo a sequência de IDS-Fc foi digerida com enzimas de restrição (KpnI e XhoI) e o produto de PCR resultante foi inserido no vetor X0GC para preparar um vetor de expressão (pX0GC-Enzima-Fc).

[0176] Da mesma maneira, um produto de PCR que tem a sequência ARSB-Fc foi obtido com uso dos iniciadores (SEQ ID NOS: 14, 15, 16, e 17). O produto de PCR resultante foi digerido com as enzimas de restrição (KpnI e XhoI) e inserido com o vetor X0GC, que já foi digerido com as mesmas enzimas de restrição (KpnI e XhoI), para preparar um vetor de expressão para proteínas de fusão. [TABELA 1] INICIADOR DE PCR DE SOBREPOSIÇÃO

SEQ Sequência ID

NO IDS-F (KpnI) 5′-CAGGTACCATGCCGCCACCCCGGACC-3′ 10 5′- IDS-R TGAACCGCCTCCACCAGGCATCAACAACTGGAAAAGA 11 (sobreposição) TCTCCAC-3′ 5′-CAGTTGTTGATGCCTGGTGGAGGCGGTTCAGGCG- L15Fc (IDS)-F 12 3′ L15Fc-R (XhoI) 5′-GACTCGAGTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAGG-3′ 13 ARSB-F (KpnI) 5′-CAGGTACCATGGGTCCGCGCGGCGCG-3′ 14 ARSB-R 5′- 15 (sobreposição) TGAACCGCCTCCACCCATCCAAGGGCCCCACACCC-3′ 5′-TGGGGCCCTTGGATGGGTGGAGGCGGTTCAGGCG- L15Fc(ARSB)-F 16 3′ L15Fc-R (XhoI) 5′-GACTCGAGTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAGG-3′ 17

[0177] A troca de cadeia e o sítio de N-glicosilação na região de Fe das sequências das proteínas de fusão preparadas foram removidas pela técnica de PCR de mutagênese direcionada a sítio.

[0178] Especificamente, o 2o aminoácido da região de Fc (isto é, serina) envolvido na troca de cadeia foi substituído por prolina com uso dos iniciadores (SEQ ID NOS: 18 e 19), e o 71o aminoácido da região de Fc (isto é, asparagina) envolvido na N- glicosilação foi substituído por glutamina. Nas sequências de proteínas mostradas na

Tabela 3 abaixo, cada uma das letras em itálico indica que o aminoácido em questão foi substituído e aquelas em itálico indicam ligantes. [TABELA 2] INICIADOR DE MUTAGÊNESE

SEQ ID Iniciador Sequência

NO 5′- Fc(S2P)_F CTGGCGGTGGCGGATCGCCACCATGCCCAGCACCTGA 18 GTTCCT-3′ 5′- Fc(S2P)_R AGGAACTCAGGTGCTGGGCATGGTGGCGATCCGCCACC 19 GCCAG-3′ 5′- Fc(N71Q)_ AGCCGCGGGAGGAGCAGTTCCAAAGCACGTACCGTGTG 20

F GTCAG-3′ 5′- Fc(N71Q)_ CTGACCACACGGTACGTGCTTTGGAACTGCTCCTCCCG 21

R CGGCT-3′

[0179] Os vetores de expressão para proteínas de fusão de enzima preparadas em Exemplos acima foram designados como vetor IDS-Fc e vetor ARSB-Fc, respectivamente. Alternativamente, esses vetores podem ser usados de modo intercambiável com a pX0GC-Enzima-Fc.

SEQ Nome Sequência

ID NO IDS- ATGCCGCCACCCCGGACCGGCCGAGGCCTTCTCT DNA 22 Fc G GCTGGGTCTG GTTCTGAGCT CCGTCTGCGT

SEQ Nome Sequência

ID NO CGCCCTCGGA TCCGAAACGC AGGCCAACTC GACCACAGAT GCTCTGAACG TTCTTCTCAT CATCGTGGAT GACCTGCGCC CCTCCCTGGG CTGTTATGGG GATAAGCTGG TGAGGTCCCC AAATATTGAC CAACTGGCAT CCCACAGCCT CCTCTTCCAG AATGCCTTTG CGCAGCAAGC AGTGTGCGCC CCGAGCCGCG TTTCTTTCCT CACTGGCAGG AGACCTGACA CCACCCGCCT GTACGACTTC AACTCCTACT GGAGGGTGCA CGCTGGAAAC TTCTCCACCA TCCCCCAGTA CTTCAAGGAG AATGGCTATG TGACCATGTC GGTGGGAAAA GTCTTTCACC CTGGGATATC TTCTAACCAT ACCGATGATT CTCCGTATAG CTGGTCTTTT CCACCTTATC ATCCTTCCTC TGAGAAGTAT GAAAACACTA AGACATGTCG AGGGCCAGAT GGAGAACTCC ATGCCAACCT GCTTTGCCCT GTGGATGTGC TGGATGTTCC CGAGGGCACC TTGCCTGACA AACAGAGCAC TGAGCAAGCC ATACAGTTGT TGGAAAAGAT GAAAACGTCA GCCAGTCCTT TCTTCCTGGC CGTTGGGTAT CATAAGCCAC ACATCCCCTT CAGATACCCC AAGGAATTTC AGAAGTTGTA TCCCTTGGAG AACATCACCC TGGCCCCCGA TCCCGAGGTC CCTGATGGCC TACCCCCTGT GGCCTACAAC CCCTGGATGG ACATCAGGCA ACGGGAAGAC GTCCAAGCCT TAAACATCAG TGTGCCGTAT GGTCCAATTC CTGTGGACTT

SEQ Nome Sequência

ID NO TCAGCGGAAA ATCCGCCAGA GCTACTTTGC CTCTGTGTCA TATTTGGATA CACAGGTCGG CCGCCTCTTG AGTGCTTTGG ACGATCTTCA GCTGGCCAAC AGCACCATCA TTGCATTTAC CTCGGATCAT GGGTGGGCTC TAGGTGAACA TGGAGAATGG GCCAAATACA GCAATTTTGA TGTTGCTACC CATGTTCCCC TGATATTCTA TGTTCCTGGA AGGACGGCTT CACTTCCGGA GGCAGGCGAG AAGCTTTTCC CTTACCTCGA CCCTTTTGAT TCCGCCTCAC AGTTGATGGA GCCAGGCAGG CAATCCATGG ACCTTGTGGA ACTTGTGTCT CTTTTTCCCA CGCTGGCTGG ACTTGCAGGA CTGCAGGTTC CACCTCGCTG CCCCGTTCCT TCATTTCACG TTGAGCTGTG CAGAGAAGGC AAGAACCTTC TGAAGCATTT TCGATTCCGT GACTTGGAAG AGGATCCGTA CCTCCCTGGT AATCCCCGTG AACTGATTGC CTATAGCCAG TATCCCCGGC CTTCAGACAT CCCTCAGTGG AATTCTGACA AGCCGAGTTT AAAAGATATA AAGATCATGG GCTATTCCAT ACGCACCATA GACTATAGGT ATACTGTGTG GGTTGGCTTC AATCCTGATG AATTTCTAGC TAACTTTTCT GACATCCATG CAGGGGAACT GTATTTTGTG GATTCTGACC CATTGCAGGA TCACAATATG TATAATGATT CCCAAGGTGG AGATCTTTTC CAGTTGTTGA TGCCTGGTGG AGGCGGTTCA GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG

SEQ Nome Sequência

ID NO TGGCGGATCG CCATCATGCC CAGCACCTGA GTTCCTGGGG GGACCATCAG TCTTCCTGTT CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCAGGAAG ACCCTGAGGT CCAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAT CCTCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCAGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAGGC TAACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGGAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCTGGGT AAATGA

MPPPR TGRGLLWLGL VLSSVCVALG SETQANSTTD Proteína ALNVLLIIVD DLRPSLGCYG DKLVRSPNID 23

QLASHSLLFQ NAFAQQAVCA PSRVSFLTGR

SEQ Nome Sequência

ID NO RPDTTRLYDF NSYWRVHAGN FSTIPQYFKE NGYVTMSVGK VFHPGISSNH TDDSPYSWSF PPYHPSSEKY ENTKTCRGPD GELHANLLCP VDVLDVPEGT LPDKQSTEQA IQLLEKMKTS ASPFFLAVGY HKPHIPFRYP KEFQKLYPLE NITLAPDPEV PDGLPPVAYN PWMDIRQRED VQALNISVPY GPIPVDFQRK IRQSYFASVS YLDTQVGRLL SALDDLQLAN STIIAFTSDH GWALGEHGEW AKYSNFDVAT HVPLIFYVPG RTASLPEAGE KLFPYLDPFD SASQLMEPGR QSMDLVELVS LFPTLAGLAG LQVPPRCPVP SFHVELCREG KNLLKHFRFR DLEEDPYLPG NPRELIAYSQ YPRPSDIPQW NSDKPSLKDI KIMGYSIRTI DYRYTVWVGF NPDEFLANFS DIHAGELYFV DSDPLQDHNM YNDSQGGDLF QLLMPGGGGS GGGGSGGGGS PPCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF QSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K

ATGGGTCC GCGCGGCGCG GCGAGCTTGC ARSB- DNA CCCGAGGCCC CGGTCCTCGG CGGCTGCTTC 24 Fc

TCCCCGTCGT CCTCCCGCTG CTGCTGCTGC

SEQ Nome Sequência

ID NO TGTTGTTGGC GCCGCCGGGC TCGGGCGCCG GGGCCAGCCG GCCGCCCCAC CTGGTCTTCT TGCTGGCAGA CGACCTAGGC TGGAACGACG TCGGCTTCCA CGGCTCCCGC ATCCGCACGC CGCACCTGGA CGCGCTGGCG GCCGGCGGGG TGCTCCTGGA CAACTACTAC ACGCAGCCGC TGTGCACGCC GTCGCGGAGC CAGCTGCTCA CTGGCCGCTA CCAGATCCGT ACAGGTTTAC AGCACCAAAT AATCTGGCCC TGTCAGCCCA GCTGTGTTCC TCTGGATGAA AAACTCCTGC CCCAGCTCCT AAAAGAAGCA GGTTATACTA CCCATATGGT CGGAAAATGG CACCTGGGAA TGTACCGGAA AGAATGCCTT CCAACCCGCC GAGGATTTGA TACCTACTTT GGATATCTCC TGGGTAGTGA AGATTATTAT TCCCATGAAC GCTGTACATT AATTGACGCT CTGAATGTCA CACGATGTGC TCTTGATTTT CGAGATGGCG AAGAAGTTGC AACAGGATAT AAAAATATGT ATTCAACAAA CATATTCACC AAAAGGGCTA TAGCCCTCAT AACTAACCAT CCACCAGAGA AGCCTCTGTT TCTCTACCTT GCTCTCCAGT CTGTGCATGA GCCCCTTCAG GTCCCTGAGG AATACTTGAA GCCATATGAC TTTATCCAAG ACAAGAACAG GCATCACTAT GCAGGAATGG TGTCCCTTAT GGATGAAGCA GTAGGAAATG TCACTGCAGC TTTAAAAAGC AGTGGGCTCT GGAACAACAC GGTGTTCATC TTTTCTACAG

SEQ Nome Sequência

ID NO ATAACGGAGG GCAGACTTTG GCAGGGGGTA ATAACTGGCC CCTTCGAGGA AGAAAATGGA GCCTGTGGGA AGGAGGCGTC CGAGGGGTGG GCTTTGTGGC AAGCCCCTTG CTGAAGCAGA AGGGCGTGAA GAACCGGGAG CTCATCCACA TCTCTGACTG GCTGCCAACA CTCGTGAAGC TGGCCAGGGG ACACACCAAT GGCACAAAGC CTCTGGATGG CTTCGACGTG TGGAAAACCA TCAGTGAAGG AAGCCCATCC CCCAGAATTG AGCTACTGCA TAATATTGAC CCGAACTTCG TGGACTCTTC ACCGTGTCCC AGGAACAGCA TGGCTCCAGC AAAGGATGAC TCTTCTCTTC CAGAATATTC AGCCTTTAAC ACATCTGTCC ATGCTGCAAT TAGACATGGA AATTGGAAAC TCCTCACGGG CTACCCAGGC TGTGGTTACT GGTTCCCTCC ACCGTCTCAA TACAATGTTT CTGAGATACC CTCATCAGAC CCACCAACCA AGACCCTCTG GCTCTTTGAT ATTGATCGGG ACCCTGAAGA AAGACATGAC CTGTCCAGAG AATATCCTCA CATCGTCACA AAGCTCCTGT CCCGCCTACA GTTCTACCAT AAACACTCAG TCCCCGTGTA CTTCCCTGCA CAGGACCCCC GCTGTGATCC CAAGGCCACT GGGGTGTGGG GCCCTTGGAT GGGTGGAGGC GGTTCAGGCG GAGGTGGCTC TGGCGGTGGC GGATCGCCAT CATGCCCAGC ACCTGAGTTC CTGGGGGGAC CATCAGTCTT CCTGTTCCCC CCAAAACCCA

SEQ Nome Sequência

ID NO AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC AGGAAGACCC TGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAAGGCC TCCCATCCTC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CAGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAGGCTAAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGGAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CTGGGTAAAT GA MGPRGA ASLPRGPGPR RLLLPVVLPL LLLLLLAPPG SGAGASRPPH LVFLLADDLG WNDVGFHGSR

IRTPHLDALA AGGVLLDNYY TQPLCTPSRS Proteína 25

QLLTGRYQIR TGLQHQIIWP CQPSCVPLDE KLLPQLLKEA GYTTHMVGKW HLGMYRKECL PTRRGFDTYF GYLLGSEDYY SHERCTLIDA

SEQ Nome Sequência

ID NO LNVTRCALDF RDGEEVATGY KNMYSTNIFT KRAIALITNH PPEKPLFLYL ALQSVHEPLQ VPEEYLKPYD FIQDKNRHHY AGMVSLMDEA VGNVTAALKS SGLWNNTVFI FSTDNGGQTL AGGNNWPLRG RKWSLWEGGV RGVGFVASPL LKQKGVKNRE LIHISDWLPT LVKLARGHTN GTKPLDGFDV WKTISEGSPS PRIELLHNID PNFVDSSPCP RNSMAPAKDD SSLPEYSAFN TSVHAAIRHG NWKLLTGYPG CGYWFPPPSQ YNVSEIPSSD PPTKTLWLFD IDRDPEERHD LSREYPHIVT KLLSRLQFYH KHSVPVYFPA QDPRCDPKAT GVWGPWMGGG GSGGGGSGGG GSPPCPAPEF LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSQEDPEVQ FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFQSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS QEEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSRLTVDK SRWQEGNVFS CSVMHEALHN

HYTQKSLSLS LGK EXEMPLO 2: TRANSFORMAÇÃO DE LINHAGEM CELULAR DE CHO

COM USO DE VETOR DE EXPRESSÃO PARA PROTEÍNA DE FUSÃO

[0180] O vetor de expressão recombinante pX0GC-Enzima-Fc preparado no Exemplo 1 foi introduzido na linhagem celular de DG44/CHO (CHO/dhfr-) (Urlaub et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 12, 555 a 566, 1986), no qual o gene DHFR é danificado e desse modo, seu processo de biossíntese de ácido nucleico é imperfeito, para obter um transformante, e a proteína de fusão de enzima (Enzima-Fc) foi expressa no transformante.

[0181] Especificamente, a linhagem celular de DG44/CHO foi cultivada a uma confluência de modo que as células cubram cerca de 80% a cerca de 90% do fundo do recipiente, e as células foram lavadas 3 vezes com Opti-MEM (Gibco, Cat. no 51985034).

[0182] Entrementes, uma mistura de Opti-MEM (3 ml) e pX0GC-Enzima-Fc (um vetor de expressão, 5 µg) e uma mistura de Opti-MEM (3 ml) e lipofectamina 2000 (Gibco, Cat. Nº 11668-019, 20 µL) foram colocadas em temperatura ambiente por 30 minutos. Então, as duas misturas foram misturadas em conjunto e a linhagem celular de DG44/CHODG44 cultivada foi adicionada às mesmas e cultivada a condições de 37° C e 5% de CO2 por cerca de 18 horas para introduzir o vetor de expressão pX0GC- Enzima-Fc em linhagem celular de DG44/CHO.

[0183] Então, as células cultivadas foram lavadas 3 vezes com meio DMEM-F12 contendo 10% FBS (Gibco, Cat. Nº 11330) e o meio foi adicionado ao mesmo e cultivado novamente por 48 horas. Tripsina foi adicionada às células cultivadas para separar as células cultivadas, e essas células separadas foram inoculadas em um meio de seleção (o meio α-MEM (WELGENE, Cat. Nº LM008-02) que não continha suplemento de HT (hipoxantina-timidina), mas continha FBS a 10% e 1 mg/ml de G418 (Cellgro, Cat. Nº 61-234-RG)). As células transformadas foram selecionadas do meio de seleção cultivando-se as células enquanto substitui o meio em intervalos de 2 dias ou 3 dias até que somente as células transformadas tenham sobrevivido e formado colônias. Em particular, para o aprimoramento dos níveis de expressão das proteínas de fusão de enzima nas células transformadas selecionadas, 10 nM de MTX (Sigma, Cat. Nº M8407) foi adicionado ao meio de seleção e as concentrações foram gradualmente aumentadas, e assim as quantidades de MTX dessas células transformadas foram aumentadas para 20 nM um a duas semanas em seguida. EXEMPLO 3: CONFIRMAÇÃO DE EXPRESSÃO DE IDS-Fc, ARSB-Fc

PROTEÍNAS DE FUSÃO POR ELISA

[0184] Parte das células transformadas preparadas no Exemplo 2 foram transferidas a cada um dos frascos de cultura celular 175-T em uma concentração de 1  107 células e cultivadas até que as células quase cobrissem o fundo do recipiente de cultura, e então 15 ml de meio Ex-cell livre de soro (adquirido da Sigma por ordem personalizada, Cat. nº 14360C) carregado com butirato de sódio a 1 mM (Sigma, Cat. Nº B5887) foi adicionado a cada frasco, e esses foram cultivados em um incubador (33° C, 5% de CO2) por 48 horas. Cada cultura celular foi transferida a um tubo de 50 ml, centrifugado, e os sobrenadantes foram coletados novamente e os níveis de expressão das proteínas de fusão (IDS-Fc e ARSB-Fc) foram medidos.

[0185] Primeiro, o nível de expressão da IDS-Fc foi realizado aplicando-se o método ELISA indireto. Anticorpos alfa-IDS (R&D Systems, Cat. Nº AF2449) diluídos em PBS em uma concentração de 1 µg/ml foram adicionados a uma placa de ELISA de 96 poços (Nunk, Cat. Nº 44-2404-21) em uma quantidade de 100 µL/poço e foram reagidos em um refrigerador (4° C) de um dia para o outro. No dia seguinte, o resultante foi lavado 5 vezes com tampão de PBS-T, e as amostras de cultura e o produto padrão de IDS (Shire Pharmaceuticals Group, Elaprase®, Lot Nº TEPE09A17), que foi diluído em várias concentrações, foram cada dispensados em uma quantidade de 100 µL/poço, e reagido em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, a placa foi lavada e anticorpos alfa-IDS rotulados com biotina (R&D Systems, Cat. nº BAF 2449) foram adicionados à mesma e a mistura foi reagida em temperatura ambiente por uma hora. Por fim, streptavidin-HRP (GE Healthcare, Cat. nº RPN440IV) foi diluído em uma razão de 1:30,000 e a mistura diluída foi adicionada em uma quantidade de 100 µL/poço, e reagida por uma hora. O resultante foi lavado e uma solução de substrato foi adicionado ao mesmo e reagido por cerca de 10 minutos. Depois de interromper a reação com uma solução de interrupção de reação, a absorvência do resultante foi medido a 450 nm. Depois de obter curvas padrão e funções com uso das concentrações do produto padrão de IDS humano e valores de absorvência, as quantidades das proteínas de fusão IDS-Fc humano foram quantificadas. Como resultado, foi confirmado que a proteína de fusão de IDS-Fc humana foi expressa em um determinada quantidade das células transformadas selecionadas (Figura 1).

[0186] Adicionalmente, o nível de expressão da proteína de fusão de ARSB-Fc foi medido pela imunoensaio de enzima (Bethyl, Cat Nº E80-104) que pode quantificar IgG humano Os anticorpos IgG-Fc humanos (Bethyl, Cat. Nº A80-104A-9), que foram diluídos em uma concentração de 10 µg/ml em um tampão de carbonato (0,05 M de carbonato-bicarbonato, pH 9,6), foram adicionados a uma placa de ELISA de 96 poços (Nunk, Cat. Nº 44-2404-21) em uma quantidade de 100 µL/poço, e foi reagido em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, a placa de ELISA foi lavada 5 vezes com uma solução de lavagem, e cada uma das amostras de cultura e o produto padrão de IgG Humano incluído no kit de quantificação de IgG humano (Bethyl, Cat. Nº RS10-110-4) foi diluída em várias concentrações e cada uma dispensada em uma quantidade de 100 µL/poço, e reagida em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, a placa foi lavada e anticorpos IgG-Fc humanos rotulados com HRP (Bethyl, Cat. Nº A80-104P-87) diluídos em uma razão de 1:150,000 foram adicionados ao mesmo, e reagidos em temperatura ambiente por uma hora. Por fim, estreptavidina- HRP (GE Healthcare, Cat. Nº RPN440IV) foi diluída em uma razão de 1:30,000 e foi adicionado em uma quantidade de 100 µL/poço, e reagido por uma hora. O resultante foi lavado e uma solução de substrato foi adicionado ao mesmo e reagido por cerca de 15 minutos. Depois de interromper a reação com uma solução de interrupção de reação, a absorvência do resultante foi medido a 450 nm.

[0187] Depois de obter curvas padrão e funções com uso das concentrações do produto padrão de IgG humano e valores de absorvência, as quantidades das proteínas de fusão ARSB-Fc humano foram quantificadas. Como resultado, foi confirmado que a proteína de fusão de ARSB-Fc humana foi expressa em um determinada quantidade das células transformadas selecionadas (Figura 2). EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DE FARMACOCINÉTICA DE PROTEÍNA

DE FUSÃO DE ENZIMA DE LONGA AÇÃO

[0188] Os efeitos de preparação de proteínas de fusão foram comparados examinando-se a farmacocinética das proteínas de fusão de enzima de longa ação preparadas acima e a enzima a qual uma região de Fc não é fusionada. EXEMPLO 4-1: EXPERIMENTO EM FARMACOCINÉTICA DE PROTEÍNA DE FUSÃO DE IDURONATO-2-SULFATASE DE LONGA AÇÃO

[0189] Os presentes inventores realizaram uma tentativa de confirmar a duração terapêutica das proteínas de fusão da presente invenção examinando-se a farmacocinética da proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase preparada nos Exemplos acima.

[0190] Para esse propósito, iduronato-2-sulfatase (idursulfase, grupo de controle) e a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase (proteína de fusão de IDS-Fc, grupo experimental) foram administradas a 3 camundongos de ICR, respectivamente, e a estabilidade no sangue e coeficientes de farmacocinética por coleta de amostra sanguínea de acordo com cada grupo foram em comparação.

[0191] Especificamente, com base em concentração de iduronato-2-sulfatase, as proteínas foram administradas aos camundongos de ICR do grupo de controle e do grupo experimental por injeções intravenosas e subcutâneas em concentrações de 0,5 mg/kg e 1,0 mg/kg, respectivamente. Amostras sanguíneas foram coletadas do grupo administrado por injeção intravenosa a 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, e 168 horas após a injeção, e a partir do grupo administrado por injeção subcutânea a 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, e 216 horas após a injeção. As quantidades de proteínas no soro sanguíneo foram medidas com uso de anticorpos anti-iduronato-2-sulfatase específicos humanos pelo método ELISA. Os resultados de análise são mostrados na Figura 3 e na Tabela 4. TABELA 4 Perfil PK IDS Proteína de fusão de IDS-Fc Conc. de administração 0,5 mg/kg (IV) 1,0 mg/kg, IV 1,0 mg/kg, SC Grau de exposição in vivo 6047,0 67766,8 43974,4 (ng/ml*h)

Perfil PK IDS Proteína de fusão de IDS-Fc Conc de Fármaco Máxima no 67670,8 28592,2 687,7 sangue (ng/ml) Meia-vida do sangue (h) 4,4 NA 45,3 Biodisponibilidade In vivo (%) - - 64,9

[0192] Conforme pode ser visto nos resultados acima, a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase de acordo com a presente invenção mostrou características farmacocinéticas significativamente excelente em comparação aos do grupo de controle. Esses resultados sugerem que a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase da presente invenção tem a vantagem de reduzir os intervalos de administração de fármaco na administração real do fármaco através do efeito de longa ação em comparação às enzimas que não são proteínas de fusão de longa ação.

[0193] Conforme pode ser visto nos resultados de farmacocinética da Figura 3 e Tabela 4, no caso da proteína de fusão de longa ação do iduronato-2-sulfatase, toda a meia-vida (T1/2), concentração de fármaco máxima no sangue (Cmax), e biodisponibilidade in vivo (AUC) foram aumentadas. Em particular, a biodisponibilidade in vivo da proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase foi de 64,9%, mostrando desse modo excelente biodisponibilidade in vivo em comparação a enzimas que não são proteínas de fusão de longa ação. EXEMPLO 4-2: O EXPERIMENTO DE FARMACOCINÉTICA DE

PROTEÍNA DE FUSÃO DE ARILSULFATASE B DE LONGA AÇÃO

[0194] Os presentes inventores realizaram uma tentativa de examinar a farmacocinética da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B (proteína de fusão de ARSB-Fc) preparada nos Exemplos acima e, sendo assim, medida a farmacocinética da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B e em comparação aos resultados com aqueles de arilsulfatase B.

[0195] Especificamente, com base em concentração de arilsulfatase B, as proteínas foram administradas aos camundongos de ICR do grupo de controle (arilsulfatase B naturalmente ocorrente: Naglazyme®, BioMarin) e o grupo experimental (proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B) por injeções intravenosas e subcutâneas em uma concentração de 5,0 mg/kg cada. Amostras sanguíneas foram coletadas do grupo de controle a 0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 4, 8, e 24 horas após a injeção independentemente do método de administração. No grupo experimental, dos camundongos de ICR administrados por injeção intravenosa, amostras sanguíneas foram coletadas a 0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 8, 24, 48, 96, e 168 horas após a injeção, e daqueles administrados por injeção subcutânea, amostras sanguíneas foram coletadas a 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, e 168 horas após a injeção.

[0196] As amostras sanguíneas coletadas em cada grupo foram centrifugadas e separadas em soros, e as quantidades da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B e a arilsulfatase B naturalmente ocorrente no sangue foram quantificadas pelo método de imunoensaio de enzima, e os resultados de análise são mostrados na Figura 4 e na Tabela 5. TABELA 5 Perfil PK ARSB Proteína de Fusão de ARSB-Fc Conc. de administração 5,0 mg/kg (IV) 5,0 mg/kg, IV 5,0 mg/kg (SC) Grau de exposição in vivo 30776,9 1230279,1 809176,0 (ng/ml*h) Conc. de Fármaco Máxima no 241588,2 166838,7 11679,2 sangue (ng/ml) Não foi Meia-vida do sangue (h) possível 74,2 33,4 calcular* Biodisponibilidade In vivo (%) - - 65,8

Perfil PK ARSB Proteína de Fusão de ARSB-Fc Não foi possível calcular: T1/2 não pode ser calculado devido à meia-vida extremamente curta.

[0197] Conforme pode ser visto nos resultados acima, a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B de acordo com a presente invenção mostrou características farmacocinéticas significativamente excelentes em comparação a Naglazyme® (isto é, arilsulfatase B naturalmente ocorrente). Esses resultados sugerem que a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B da presente invenção tem a vantagem de reduzir os intervalos de administração de fármaco na administração real do fármaco através do efeito de longa ação em comparação a enzimas.

[0198] Conforme pode ser visto nos resultados de farmacocinética da Figura 4 e Tabela 5, no caso da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B, toda a meia- vida (T1/2), concentração de fármaco máxima no sangue (Cmax), e biodisponibilidade in vivo (AUC) foram aumentadas. Em particular, a biodisponibilidade in vivo da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B foi de 65,8%, mostrando desse modo excelente biodisponibilidade in vivo em comparação a enzimas que não são proteínas de fusão de longa ação.

[0199] Como resultado da examinação da farmacocinética de proteínas de fusão de enzima nos Exemplos 4-1 e 4-2, foi confirmado que essas proteínas de fusão de enzima mostraram meia-vidas significativamente aumentadas, biodisponibilidade in vivo, etc. em comparação a aquelas enzimas as quais uma região de Fc não é fusionada, e desse modo, os efeitos de longa ação de essas proteínas de fusão de enzima podem ser esperados. EXEMPLO 5: CONFIRMAÇÃO DE ATIVIDADE DE ENZIMA DE

PROTEÍNA DE FUSÃO DE ENZIMA DE LONGA AÇÃO

[0200] As atividades das enzimas incluídas nas proteínas de fusão de enzima preparadas acima foram comparadas a enzimas não fusionadas com uma região de

Fc. EXEMPLO 5-1: ATIVIDADE DE ENZIMA IN VITRO DE PROTEÍNA DE FUSÃO DE IDURONATO-2-SULFATASE DE LONGA AÇÃO

[0201] Os presentes inventores realizaram uma tentativa de medir as mudanças in atividade de enzima de acordo com a preparação da proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase preparada nos Exemplos acima e, sendo assim, a atividade de enzima in vitro foi medida.

[0202] Especificamente, sal de sódio de ácido-2-sulfato 4-metilumbelliferil alfa-L- idopiranosidurônico (4MU-α-IdopiraA-2), que é conhecido como um substrato de enzima, foi reagido com iduronato-2-sulfatase e a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase a 37° C por 4 horas, e então reagido com alfa-iduronidase (isto é, uma enzima de reação secundária) a 37° C por 24 horas. Então, a fluorescência do produto final, 4-metilumbelliferona (4MU), foi medida para medir a atividade de enzima para o material correspondente.

[0203] Como resultado, foi confirmado que iduronato-2-sulfatase e a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase teve uma atividade de enzima (atividade específica) de 32,0 ± 1,58 nmol/min/mM e 87,3 ± 6,49 nmol/min/mM, respectivamente. Visto que a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase tem uma estrutura na qual duas iduronato-2-sulfatases são ligadas a uma molécula de Fc, que é uma forma dimérica de duas cadeia de Fc, o resultado de medição mostrou que a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase tem cerca de atividade de enzima in vitro 2,7 vezes maior em comparação a iduronato-2-sulfatase, que não é uma proteína de fusão. Esses resultados sugerem que a característica estrutural de proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase, que tem duas iduronato-2- sulfatases, tem uma vantagem no aspecto de atividade de enzima sobe a iduronato- 2-sulfatase, que não forma uma proteína de fusão (Figura 5). EXEMPLO 5-2: ATIVIDADE DE ENZIMA IN VITRO DE PROTEÍNA DE

FUSÃO DE ARILSULFATASE B DE LONGA AÇÃO

[0204] Os presentes inventores compararam e mediram a atividade de enzima da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B preparadas nos Exemplos acima com a da enzima naturalmente ocorrente, arilsulfatase B (Naglazyme®, BioMarin).

[0205] Especificamente, a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B e arilsulfatase B foram reagidos com sulfato de 4-metilumbelliferila a 37° C por 20 minutos, e a atividade de enzima in vitro da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B foi medida medindo-se a fluorescência da 4-metilumbelliferila formada após um grupo sulfato ter sido clivado.

[0206] Como resultado, foi confirmado que foi confirmado que arilsulfatase B e a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B teve uma atividade de enzima (atividade específica) de 438,5 ± 29,4 nmol/min/mM e 823,8 ± 37,0 nmol/min/μM, respectivamente. Visto que a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B tem uma estrutura no qual duas arilsulfatases B são ligadas a uma molécula de Fc, que é uma forma dimérica de duas cadeias de Fc, o resultado de medição mostrou que a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B tem cerca de atividade de enzima in vitro 1,9 vez maior em comparação a arilsulfatase B, que não é uma proteína de fusão. Esses resultados confirmou que a característica estrutural distinguida da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B no nível molecular sobre o da arilsulfatase B é atribuída à excelente atividade de enzima (Figura 6).

[0207] Como resultado da examinação da farmacocinética de proteínas de fusão de enzima nos Exemplos 5-1 e 5-2, foi confirmado que essas proteínas de fusão de enzima mostraram alta atividade de enzima in vitro em comparação a aquelas enzimas às quais uma região de Fc não é fusionada. EXEMPLO 6: CONFIRMAÇÃO DE EFICÁCIA DE ADMINISTRAÇÃO DE PROTEÍNA DE FUSÃO DE IDURONATO-2-SULFATASE DE LONGA AÇÃO

[0208] A eficácia de administração da proteína de fusão de enzima da presente invenção foi examinada estudando-se as mudanças na quantidade de glicosaminoglicano (GAG) nos tecidos e urina após a administração de fármacos a camundongos com knockout de iduronato-2-sulfatase (IDS).

[0209] Especificamente, adicionalmente a camundongos normais como o grupo de controle negativo, camundongos com knockout de IDS com 7 a 14 semanas de idade foram divididos em um total de quatro grupos com base no teor de GAG na urina. A iduronato-2-sulfatase (Elaprase®, Genzyme) foi administrada em um total de 4 vezes (dia 0, dia 7, dia 14, e dia 21) à veia caudal em uma concentração de 0,5 mg/kg (grupo de controle). A administração da proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase prosseguida pela divisão em dois grupos: um grupo foi administrado uma vez com a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase à veia caudal em uma concentração de 2,0 mg/kg (dia 0), e o outro grupo foi administrado de modo subcutâneo uma vez com a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase em uma concentração de 4,0 mg/kg (dia 0).

[0210] As amostras de urina foram coletadas de cada grupo antes da administração e, nos dias 7, 14, 21, e 28 após a administração de fármaco. Todos os tecidos do fígado, baço, coração, e medula óssea foram coletados no dia 28 após a administração de fármaco. Então, o tampão de pulverização de tecido (PBS que contém aprotinina (1 µg/ml), PMSF a 1 mM, e EDTA a 2 mM) foi adicionado a cada tecido em uma quantidade de 5 volumes (9 volumes para medula óssea), e a mistura foi pulverizada com uso de um sonicador e centrifugada, e cada sobrenadante foi usada para a análise de teor de GAG.

[0211] Então, 50 µL do sobrenadante obtido após a pulverização das amostras de urina coletadas e cada tecido foi adicionado a uma placa de 96 poços, e a solução d dimetilmetileno azul (250 µL) foi adicionado e misturado, e o teor de GAG foram quantificados em um comprimento de onda de 525 nm. No caso do teor de GAG na urina, os valores foram calculados por ajuste com referência à quantidade de creatina. Análise estatística foi realizada entre os grupos de controle e de teste com uso da ANOVA unidirecional com uso dos valores calculados. O teor de GAG medido na urina e cada tecido são mostrados na Figura. 7 e 8, respectivamente.

[0212] Conforme mostrado nas Figuras 7 e 8, foi confirmado que a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase, mesmo com uma administração intravenosa ou subcutânea única por mês, reduziu significativamente os valores de

GAG na urina e cada tecido a um nível a similar a uma terapia em que Elaprase ®, que é uma enzima a qual uma região de Fc não é fusionada, é administrada de modo intravenoso uma vez por semana, em comparação aos camundongos com knockout de IDS.

[0213] Através desse Exemplo, foi confirmado que, à meia vida sanguínea estendida, a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase, mesmo com uma administração intravenosa ou subcutânea única por mês, pode exibir um efeito equivalente à terapia de fármaco existente em que o fármaco é administrado uma vez por semana. Adicionalmente, os resultados de que a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase exibiram um efeito de reduzir os valores de GAG no grupo em que a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase foi administrada de modo subcutâneo uma vez por mês, confirmou que a proteína de fusão de longa ação de iduronato-2-sulfatase tem o potencial de ser usado para a injeção subcutânea como uma rota de administração das proteínas de fusão da presente invenção. Consequentemente, foi sugerido que a proteína de fusão de longa ação de iduronato- 2-sulfatase de acordo com a presente invenção pode ser usado para tratar pacientes com síndrome de Hunter através da administração ou administração subcutânea uma vez por mês. EXEMPLO 7: CONFIRMAÇÃO DE DISTRIBUIÇÃO DE TECIDO DE PROTEÍNA DE FUSÃO DE LONGA AÇÃO (ARILSULFATASE B)

[0214] Os presentes inventores realizaram uma tentativa de confirmar o grau de distribuição das proteínas de fusão de enzima da presente invenção preparada nos Exemplos acima.

[0215] Em relação a isso, o grau de distribuição da arilsulfatase B (grupo de controle) e a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B (grupo experimental) em tecidos e órgãos de 3 camundongos de ICR foi comparado cada coleta de amostra e de acordo com cada grupo.

[0216] Especificamente, o grupo de controle e o grupo experimental foram administrados por injeção intravenosa em uma concentração de 5.0 mg/kg, com base na concentração de arilsulfatase B.

[0217] Em relação ao arilsulfatase B naturalmente ocorrente (Naglazyme ®) do grupo de controle e a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B do grupo experimental, a concentração de cada material em tecidos (medula óssea, fígados, baço, pulmões, rins, e corações) foi medida e comparada pela imunoensaio de enzima após os órgãos dos camundongos terem sido removidos seguindo a administração da arilsulfatase B naturalmente ocorrente (Naglazyme®) e a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B.

[0218] Como resultado, a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B mostrou um resultado que a mesma é distribuída em um grau maior ou por um período maior de tempo na mesma seção de tempo em todos os tecidos, em comparação à arilsulfatase B naturalmente ocorrente, que foi usada como o grupo de controle e a qual uma região de Fc não é fusionada.

[0219] Em particular, foi confirmado que a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B tem um grau de distribuição significativamente alta na medula óssea e baço, em comparação à arilsulfatase B naturalmente ocorrente. Adicionalmente, foi confirmado que a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B foi distribuída nos pulmões, rins, e corações enquanto arilsulfatase B não foi detectada naqueles tecidos (Figura 9).

[0220] A partir desses resultados experimentais, foi confirmado que a proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B tem excelentes características farmacocinéticas sobre Naglazyme® (isto é, uma arilsulfatase B naturalmente ocorrente). Em particular, o uso potencial da proteína de fusão de longa ação de arilsulfatase B para administração de uma vez por mês, em comparação à terapia de administração intravenosa de uma vez por semana existente, pode não somente reduzir a frequência de administração, mas também pode contribuir para o aprimoramento da qualidade de vida dos pacientes através da conversão em administração subcutânea.

[0221] A partir do que foi mencionado anteriormente, uma pessoa versada na técnica a quem a presente invenção se refere terá a capacidade de entender que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente invenção.

Em relação a isso, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitadoras do escopo da presente invenção.

Pelo contrário, a presente invenção é destinada a abranger não só as modalidades exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes, e outras modalidades que podem estar incluídas dentro do espírito e escopo da presente invenção conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão de enzima caracterizada por uma região de Fc de imunoglobulina ser fusionada a uma enzima terapêutica, e a enzima terapêutica aumentou a duração in vivo em comparação a uma enzima terapêutica à qual uma região de Fc de imunoglobulina não é fusionada.

2. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a enzima terapêutica ser selecionada a partir do grupo que consiste em beta-glucosidase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, iduronidase, iduronato-2-sulfatase, galactose-6-sulfatase, alfa-glucosidase ácida, ceramidase ácida, esfingomielinase ácida, galactocerebrosidase, arilsulfatase A, B, beta-hexosaminidase A, B, heparina N-sulfatase, alfa-D- manosidase, beta-glucuronidase, N-acetilgalactosamina-6 sulfatase, lipase ácida lisossomal, alfa-N-acetil-glucosaminidase, glucocerebrosidase, butirilcolinesterase, quitinase, descarboxilase de glutamato, imiglucerase, lipase, uricase, acetil-hidrolase de fator ativador de plaqueta, endopeptidase neutra e mieloperoxidase.

3. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma enzima terapêutica e uma região de Fc de imunoglobulina serem fundidas por um ligante de peptídeo.

4. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a proteína de fusão de enzima é caracterizada por ser uma fusão de uma molécula da região de Fc de imunoglobulina e uma enzima terapêutica dimérica.

5. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a região de Fc de imunoglobulina ter uma variação selecionada a partir do grupo que consiste em substituição, adição, deleção, modificação e uma combinação das mesmas em pelo menos um aminoácido de uma região Fc de imunoglobulina nativa.

6. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a região de Fc de imunoglobulina ter a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, o 2º aminoácido é substituído por prolina; o 71º aminoácido é substituído por glutamina; ou o 2º aminoácido é substituído por prolina e o 71º aminoácido é substituído por glutamina.

7. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 6,

caracterizada por não ocorrer troca de cadeia na região de Fc de imunoglobulina.

8. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a proteína de fusão de enzima ter estabilidade aumentada e afinidade de ligação reduzida para receptores de lisossoma, tendo, então, um alto grau de distribuição de tecido, em comparação a uma enzima terapêutica à qual uma região de Fc de imunoglobulina não está fusionada.

9. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a região de Fc de imunoglobulina ser selecionada a partir do grupo que consiste em (a) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4; (b) um domínio CH1 e um domínio CH2; (c) um domínio CH1 e um domínio CH3; (d) um domínio CH2 e um domínio CH3; (e) uma combinação entre um ou dois ou mais domínios dentre um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4 e uma região de articulação de imunoglobulina ou uma parte da região de articulação; e (f) um dímero entre cada domínio da região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve.

10. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a região de Fc de imunoglobulina ser selecionada a partir do grupo que consiste em (a) uma região com capacidade para formar uma ligação de dissulfeto que ser removida, (b) um determinado resíduo de aminoácido ser removido na extremidade N de um Fc nativo, (c) um resíduo de metionina ser adicionado na extremidade N de uma forma nativa de Fc, (d) um sítio de ligação ao complemento ser removido ou (e) um sítio de citotoxicidade mediado por célula dependente de anticorpo (ADCC) ser deletado.

11. Proteína de fusão de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por a região de Fc de imunoglobulina ser aglicosilada.

12. Proteína de fusão de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por a região de Fc de imunoglobulina ser um fragmento Fc derivado de rom IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.

13. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a região de Fc de imunoglobulina ser um híbrido de domínios que têm diferentes origens derivadas de imunoglobulinas selecionadas a partir do grupo que consiste em IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.

14. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por região de Fc de imunoglobulina ser uma região Fc de IgG4.

15. Proteína de fusão de enzima, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a região de articulação da região Fc de IgG4 ser substituída por uma região de articulação de IgG1.

16. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar transtorno de armazenamento lisossomal (LSD) caracterizada por compreender a proteína de fusão de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o transtorno de armazenamento lisossomal (LSD) ser selecionado a partir do grupo que consiste em mucopolissacaridose (MPS), doença do armazenamento de glicogênio, esfingolipidose, doença de Niemann- Pick Fabry, doença de Gaucher, síndrome de Hunter e síndrome Maroteaux- Lamy.

18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por a enzima ser iduronato-2-sulfatase (IDS) ou arilsulfatase B (ARSB).

19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, sendo que a composição é caracterizada por reduzir a afinidade de ligação de uma enzima para receptores de lisossoma.

20. Polinucleotídeo caracterizado por codificar a proteína de fusão de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

21. Vetor de expressão caracterizado por compreender o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 20.

22. Transformante caracterizado por sofrer introdução do vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 21.

23. Método para preparar uma proteína de fusão de enzima caracterizado por compreender: (a) cultivar o transformante, de acordo com a reivindicação 22, para obter uma cultura; e (b) recuperar uma n proteína de fusão de enzima da cultura.