KR20180055888A

KR20180055888A - 변형된 라이소좀 단백질 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20180055888A
Application number: KR1020187011617A
Authority: KR
Inventors: 에릭 노들링; 패트릭 스트로엠베르그; 게리우스 스테판 스벤손
Original assignee: 스위디쉬 오르펀 바이오비트럼 에이비 (피유비엘)
Priority date: 2015-10-01
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-05-25
Also published as: JP2018535654A; IL258369A; WO2017055570A1; MX2018003985A; PH12018500604A1; BR112018006278A2; CN108291246A; CA3000289A1; EP3356542A1; AU2016329442A1; US20180258408A1

Abstract

변형된 라이소좀 단백질, 변형된 라이소좀 단백질의 제조방법 및 그러한 변형된 단백질의 치료 용도가 본원에 개시되어 있다. 라이소좀 저장병에 걸린 포유 동물을 치료하는 방법이 본원에 추가로 더 개시되어 있다. 구체적으로, 본 발명은 변형된 라이소좀 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트(periodate)와 반응시키고, 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드(borohydride)와 2시간 이하의 시간 동안 반응시켜, 그로써 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키는 것을 포함한다.

Description

변형된 라이소좀 단백질 및 그의 제조 방법

본 개시내용은 변형된 라이소좀 단백질, 변형된 라이소좀 단백질을 포함하는 조성물 및 변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 예를 들어 라이소좀 저장병(lysosomal storage disease)의 치료와 같이 변형된 라이소좀 단백질의 치료법에서의 용도가 개시되어 있다.

배경 기술

라이소좀 저장병(lysosomal storage disease)

라이소좀 세포 소기관은 세포의 폐기 물질을 분해하는 이화작용 기관으로 기능한다. 라이소좀에 특이적으로 구획화된(compartmentalized) 다수의 하이드로레이즈(hydrolase) 및 트랜스포터(transporter)에 의해 분해가 이루어진다. 오늘날, 라이소좀 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이와 질병 사이에 연관성이 확립된 40종 이상의 확인된 유전 질환들이 존재한다. 이 질병들은 LSD(lysosomal storage disease)로 정의되며, 불충분한 분해 능력으로 인해 분해될 수 없는 대사 산물 (또는 대사 산물들)의 축적을 특징으로 한다. 대사 산물의 과도한 라이소좀 저장의 결과로서, 라이소좀의 크기가 증가한다. 축적된 저장 물질이 병리를 어떻게 유발하는지는 완전히 이해되지 않으나 자식 작용(autophagy) 및 세포 아폽토시스(apoptosis)의 유도의 억제와 같은 메커니즘을 포함할 수 있다(Cox & Cachon-Gonzalez, J Pathol 226: 241-254 (2012)).

효소/단백질 대체 치료법

돌연변이된 또는 손실된 단백질에 의해 유발되는 기능 손실은 돌연변이된/손실된 단백질을 이종(heterologous) 공급원으로부터 온 단백질을 투여 및 그와 같이 대체함으로써 복구될 수 있다. 이것은 다양한 질병 영역에서 나타나 왔다. 혈우병(hemophilia) 분야에서, 응고(coagulation) 경로의 활성화 복합체의 일부인 효소 양자 모두, 예를 들어, 인자 Ⅸ 및 인자 Ⅶ, 및 단백질, 예를 들어 인자 Ⅷ의 투여는 성공적으로 사용되었다. 이러한 구성요소들은 당연히 혈액 내에 존재하며, 따라서 이의 작용 부위에 단백질을 투여하는 것은 용이하다.

라이소좀 저장병(lysosomal storage disease) 분야에서, 저장은 이종 공급원으로부터 라이소좀 효소를 투여함으로써 감소될 수 있다. 라이소좀 효소의 정맥내 투여는 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)으로 불리는 메커니즘을 통해 세포에 의한 그것의 빠른 흡수로 이어진다는 것이 잘 알려져 있다. 이 세포내이입은 세포 표면의 수용체에 의해 매개되며, 특히 2개의 M6PR(mannose-6 phosphate receptor)이 특정 라이소좀 효소의 흡수에 중추적 역할을 하는 것으로 나타났다(Neufeld; Birth Defects Orig Artic Ser 16: 77-84 (1980)). M6PR은 라이소좀 단백질의 특징인 인산화된 올리고만노오스(oligomannose) 글라이칸(glycan)을 인식한다.

수용체 매개 세포내이입의 원리에 기반하여, ERT(enzyme replacement therapy)가 오늘날 7개의 LSD(Gaucher, Fabrys, Pompe 및 Mucopolysaccharidosis 유형 I, II, IVA 및 VI)에 이용 가능하다. 이러한 치료법은 다양한 말초 기관에서의 라이소좀 저장을 감소시키고 그로써 병리와 관련된 일부 증상을 개선하는 데에 효과적이다. Elaprase® 및 Aldurazyme®은 헌터 증후군(Hunter syndrome) 환자의 장기 치료(Mucopolysaccharidosis II, MPSII) 및 헐러(Hurler)/샤이에(Scheie) 증후군 환자의 비-신경적 증상을 위한(Mucopolysaccharidosis I, MPS I) 희귀 의약품(orphan medicinal product)의 예시이다. 두 효소 모두 필수적으로 GAG(glycosaminoglycan)인 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate) 및 헤파란(heparan) 설페이트의 가수분해에 의해 라이소좀 저장을 감소시키는 기능을 한다. 이들 효소 중 어느 하나의 감소되거나 결핍된 활성은 이들 GAG의 세포내 축적으로 이어지며, 이것은 다수의 장기 및 조직 침입을 포함하는 진행성 및 임상적으로 이질적인 장애를 유발한다.

LSD의 대부분은 그러나 CNS(central nervous system) 내에 라이소좀 저장의 증강을 유발하여 결과적으로 CNS 관련 징후 및 증상의 레파토리를 나타낸다. 정맥내 주사로 투여된 ERT의 주요 결점은 CNS로의 불량한 분포이다. CNS는 CNS 내피(endothelium)에 의해 형성된 BBB(blood brain barrier)에 의해 혈액 매개 화합물에 대한 노출으로부터 보호된다. BBB의 내피 세포는 세포 사이 통로(paracellular passage)를 막는 밀착 연접(tight junction)을 나타내며, 제한된 수동적 세포내이입을 보이며 추가로 다른 조직에서 볼 수 있는 수용체 매개 트랜스사이토시스(transcytosis) 능력이 결핍된다. 특히, 마우스에서 BBB를 관통하는 M6PR 매개 운반은 출생 후 2주까지만 관찰된다(Urayama et al, Mol Ther 16: 1261-1266 (2008)).

LSD의 신경적 구성 요소 외에도, 말초 병리는 또한 현재의 효소 대체 치료법에서 어느 정도 차선책으로 언급된다. 환자는 빈번하게 임상적으로 관절 통증 및 뻣뻣함을 나타내어 움직임의 심각한 제한으로 이어지는 관절증으로 고통받는다. 또한, 흉곽 골격의 점차적인 변화는 호흡 제한을 유발할 수 있다.

심장의 벽과 함께 심장 판막이 두꺼워지도록 하는 우세한 저장은 심장 기능의 점차적인 감소로 이어질 수 있다. 또한, 폐 기능은 효소 대체 치료법에도 불구하고 추가로 더 퇴행할 수 있다.

라이소좀 효소의 글라이코실화(Glycosylation)

일반적으로, N-글라이코실화는 Asn-X-Ser/Thr 서열 모티프(motif)에서 일어날 수 있다. 망막 내강 내에서 N-글라이칸의 초기 코어 구조가 글라이코실트랜스퍼라아제 올리고사카릴트랜스퍼라아제(glycosyltransferase oligosaccharyltransferase)에 의해 이 모티프에 전달된다. 모든 N-연결된 글라이칸의 이러한 공통적인 기반은 14개의 잔사로 이루어져 있다; 3개의 글루코오스(glucose), 9개의 만노오스(mannose), 및 2 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine). 이 전구체는 그리고 나서 초기 코어를 줄이고 새로운 당 잔기를 더하는 여러 개의 효소의 작용에 의해 N-글라이칸의 3개의 일반적인 유형으로 전환된다; 올리고만노오스, 복합체(complex) 및 하이브리드(hybrid) (도 7). 성숙한 N-글라이칸 각각은 공통 코어 Man(Man)2-GlcNAc-GlcNAc-Asn을 포함하며, 상기 Asn은 단백질에 부착되는 지점을 나타낸다. 효모에서, 올리고만노오스 글라이칸은 도 7의 가장 오른쪽에 도시된 반복적인 방식으로 최대 200개의 만노오스 잔기를 포함하도록 확장될 수 있다(Dean, Biochimica et Biophysica Acta 1426:309-322 (1999)).

또한, 라이소좀에 전달되는 단백질들은 인산화되는 하나 또는 그 이상의 N-글라이칸을 가지고 있다. 인산화는 골지(Golgi)에서 일어나며 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트(N-acetylglucosamine-1-phosphate)를 올리고만노오스 유형 N-글라이칸의 만노오스 잔사의 C-6에 더함으로써 개시된다. N-아세틸글루코사민은 절단되어 M6PR에 의해 인식되고 라이소좀 단백질의 라이소좀으로의 운반을 개시할 M6P(Mannose-6-phospate) 잔사를 생성한다. 수득되는 N-글라이칸은 그리고 나서 M6P가 N-글라이칸 사슬의 말단 그룹인 지점으로 절단된다(Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al, editors. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009.).

당 잔기 및 포스페이트 그룹 양자 모두가 수용체의 결합에 관여하기 때문에 M6PR의 결합 부위는 완전한 말단 M6P 그룹을 필요로 한다(Kim et al, Curr Opin Struct Biol 19(5):534-42 (2009)).

글라이칸 변형에 의한 뇌를 타겟으로 하는 효소 대체 치료법

CNS에서의 라이소좀 효소의 분포를 증가시키는 잠재적인 전략이 WO 2008/109677에 개시되어 있다. 상기 공개된 출원에서, 나트륨 메타-퍼아이오데이트(sodium meta-periodate) 및 나트륨 보로하이드라이드(sodium borohydride)를 이용한 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)의 화학적 변형이 설명되어 있다(Grubb et al, Proc Natl Acad Sci USA 105: 2616-2621 (2008) 또한 참고하라). 20mM 나트륨 퍼아이오데이트로 6.5시간 동안 산화, 이어서 ??칭(quenching), 투석(dialysis) 및 100mM 나트륨 보로하이드라이드로 하룻밤 동안(overnight) 환원하는 것으로 구성된 이러한 변형(본원에서 이하 공지된 방법이라고 지칭함)은, 대체로 β-글루쿠로니다아제의 CNS 분포를 개선시켰으며 LSD 점액다당류증(mucopolysaccharidosis) VII의 뮤린(murine) 모델에서의 신경성 저장의 클리어런스(clearance)로 이어졌다. 비록 뇌 분포의 기저에 있는 메커니즘은 불분명하지만, 화학적 변형은 β-글루쿠로니다아제 상의 글라이칸 구조를 파괴했다는 것이 주목되었으며, M6PR에 의한 수용체 매개 세포내이입이 강하게 감소된다는 것이 추가적으로 증명되었다.

다른 라이소좀 효소에 대한 화학적 변형 전략이 조사되어 왔다. 예를 들어, 공지된 방법에 따른 화학적 변형은 정맥내 주사로 투여된 프로테아제 트리펩티딜 펩티다아제 I(protease tripeptidyl peptidase I)의 분포를 개선하지 못했다(Meng et al, PLoS One (2012)). 어느 것도 설파아미다아제에 대해 만족스러운 결과를 증명하지 못했다. 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제는 실제로 마우스에서 증가된 반감기를 나타내기는 했으나, MPS-IIIIA 마우스의 뇌에서는 효과가 나타나지 않았다. 화학적으로 변형된 설파아미다아제는 정맥내 주사 투여에 의해 반복적으로 투여되었을 때 뇌 실질(parenchyma)에 분포하지 않았다(Rozaklis et al, Exp Neurol 230: 123-130 (2011)).

따라서, 신경적 관련을 갖는 LSD의 치료를 위한 효과적인 ERT가 여전히 요구된다. 기능적으로 활성 상태를 유지하면서 BBB를 관통하여 운반될 수 있는 신규한 단백질은 CNS 관련 병리를 갖는 LSD의 치료를 위한 효소/단백질 대체 치료법의 전신적인 투여에 적합한 화합물의 개발에 큰 가치가 있을 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 목적은 상이한 LSD에 대한 효소 대체 치료법의 개발을 가능하게 하는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 포유동물에서 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)을 관통하여 운반될 수 있는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다. 또한, 상기 단백질은 상기 포유동물의 뇌 내에서 유리하게 생물학적 활성을 가질 것이며, 예를 들어 포유동물의 뇌 내에서 효소(촉매) 활성을 가질 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 말초 조직, 특히 LSD의 말초 병리에 관련된 말초 조직 내에서 촉매 활성을 갖는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 개선된 품질 및 안전성, 예를 들어 선행기술의 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질에 비하여 개선된 구조적 완전성을 나타내는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다.

본 개시내용으로부터 통상의 기술자에게 명백하게 될 이들 및 다른 목적은 첨부된 청구범위에서 정의되고 본원에 일반적으로 개시된 본 발명의 상이한 실시 양태에 의해 달성된다.

본 발명의 한 실시 양태에서는, 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태와 비교하여 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 50% 이하가 손상되지 않은 상태로 잔류하는 것을 특징으로 하는, 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 감소한 함량을 갖는 변형된 라이소좀 단백질로써, 상기 단백질은 그로써 글라이칸 인식 수용체에 대한 감소된 활성을 가지며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌, 라이소좀 단백질을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 단백질은 β-글루쿠로니다아제가 아니다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 TPP1(tripeptidyl peptidase 1)이 아니다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 알파 L-이두로니다아제가 아니다.

글라이칸 인식 수용체라는 용어는 주로 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 통해 라이소좀 단백질을 인식하고 결합하는 수용체를 의미한다. 그러한 수용체들은 만노오스 6-포스페이트(mannose 6-phosphate) 수용체 외에도, 글라이칸이 노출된 말단 만노오스 잔사를 나타내는 단백질을 선택적으로 결합하는, 만노오스 수용체에 의해 예시될 수 있다. 렉틴(Lectin)은 글라이칸의 말단 갈락토오스 잔사를 인식하는 아시알로당단백질(asialoglycoprotein)을 인식하는 말단 갈락토오스에 의해 예시될 수 있는 글라이칸 인식 수용체의 다른 거대한 군을 구성한다.

변형되지 않은 또는 천연의 글라이칸 잔기는 한 실시양태에서 진핵 세포의 소포체(endoplasmatic reticulum) 및 골지체(golgi compartment)에서 해독 후 변형(post-translational modification)이 일어난 라이소좀 단백질에서 천연적으로 발생하는 글라이칸 잔기로 이해된다. 변형되지 않은 또는 천연의 글라이칸 잔기가 “없는(absent)”것으로 설명되는 경우, 또는 글라이칸 잔기의 상대적인 양이 주어질 때, 이것은 손상되지 않은(또는 완전한) 천연적인 글라이칸 잔기를 검출할 수 없다는 것을 의미한다. 첨부된 실시예에서 증명되는 바와 같이, 글라이코펩티드의 상대적인 정량화는 LC-MS 및 재구성된 이온 크로마토그램으로부터의 피크에 기반할 수 있다. 대안적인 정량화 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있다.

본 발명에 따르는 변형된 라이소좀 단백질은 그와 같이 천연 글라이칸 잔기가 제거된 것으로 변형된다. 특히, 상기 라이소좀 단백질은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프(epitope)가 글라이칸 잔기로부터 제거되어 변형된다. 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프는 본원에서 구조적으로 만노오스, 만노오스 6 포스페이트, n-아세틸글루코사민 또는 N-글라이칸의 말단 끝의 갈락토오스 유래의 것으로 설명되는 그러한 수용체로부터 인식되는 글라이칸 잔기(의 일부)를 나타내는 것으로 이해된다. 천연의 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 적어도 부분적인 부재는 글라이칸 인식 수용체에 대한 변형된 라이소좀 단백질의 활성을 감소시킨다. 그 결과로서, 말초 조직 내의 변형된 라이소좀 단백질의 수용체 매개 세포내이입은 감소할 수 있으며, 이는 예를 들어, 포유동물에게 정맥내 주사로 투여된 경우, 혈장으로부터 변형된 단백질의 감소된 클리어런스로 이어질 수 있다. 첨부된 실시예에서 특정 예시적 라이소좀 단백질에 입증된 바와 같이, 본원에 설명된 변형된 라이소좀 단백질은 세포 흡수를 덜 받으며 그 결과로 글라이칸 인식 수용체, 예를 들어 2개의 M6PR(mannose-6 phosphate receptors)에 대한 에피토프의 제거로 이어질 수 있다(참고 : 실시예 5 및 6).

투여량의 측면에서 볼 때, 변형된 라이소좀 단백질의 감소된 클리어런스는 환자들에게 덜 자주 투여될 수 있는 유리하게 장기-작용하는(long-acting) 의약품의 개발을 허용할 수 있다. 추가로, 상기 단백질의 변형은 CNS에 변형된 라이소좀 단백질의 분포를 허용할 수 있다. 본원에 설명된 것과 같은 변형된 단백질은 혈액 뇌 장벽을 관통하여 그리고 그 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 뇌 내로 운반될 수 있다. 이러한 변형된 단백질의 유리한 특성은 다수의 LSD에서 임상적 결과를 잠재적으로 개선할 수 있다.

한 구현예에서, 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태와 비교하여 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 45% 이하가 잔류하며, 예를 들어 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태와 비교하여 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하의 글라이칸 잔기가 잔류한다. 그와 같이, 일부 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 실질적으로 손상되지 않은 천연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기를 포함하지 않으며 결과적으로 실질적으로 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 포함하지 않는다. 이것은 글라이칸 인식 에피토프의 거의 완전한 부재로 이해될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 글라이칸 인식 수용체에 대한 (검출 가능한) 에피토프를 포함하지 않는다. 일부 경우, 상기 에피토프의 완전한 부재는 추가로 변형된 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키고 혈장 반감기를 연장시킬 수 있다. 이것은 아마 적어도 일부는 (실시예 5의 세포 흡수 연구에 증명된 것과 같이) 단백질의 화학적 변형에 따른 말초 조직에서의 수용체 매개 흡수 억제로 인한 것이다.

특히, 변형된 라이소좀 단백질은 세포내이입성(endocytic) M6PR 유형 1 및 2, 만노오스 수용체, n-아세틸글루코사민 결합 렉틴 및 갈락토오스 수용체의 에피토프를 각각 구성하는 (검출 가능한) 만노오스-6-포스페이트 잔기, 만노오스 잔기, n-아세틸글루코사민 잔기 또는 갈락토오스 잔기를 갖지 않는다. 상기 정의한 것과 같이, 천연적 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기에서 발견되는 상기 에피토프는 만노오스-6-포스페이트 잔기, 만노오스 잔기, n-아세틸글루코사민 잔기 및 갈락토오스 잔기에서 선택될 수 있다. 특별한 구현예에서, 이들은 본원에 개시된 것과 같이 변형된 라이소좀 단백질에 부재한다.

상기 변형된 라이소좀 단백질의 천연적인 글라이칸 잔기는 상기 설명된 것과 같이 변형된 라이소좀 단백질에서 적어도 일부 부재한다. 이 부재는 상기 변형된 라이소좀 단백질의 천연적인 글라이칸 잔기 내의 단일 결합 절단 및 이중 결합 절단으로 구성된 붕괴(disruption)에 상응할 수 있다. 단일 결합 절단에 의한 글라이칸 붕괴가 전형적으로 우세할 수 있다. 특히, 상기 라이소좀 단백질의 천연적인 글라이칸 잔기는 단일 결합 절단 및 이중 결합 절단에 의해 붕괴될 수 있으며, 상기 단일 결합 절단의 정도는 올리고만노오스 글라이칸에서 적어도 60%일 수 있다. 특히, 단일 결합 절단의 정도는 글라이칸의 올리고만노오스 유형에서 적어도 65%, 예를 들어 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 85%일 수 있다. 단일 결합 절단 대 이중 결합 절단의 정도는 예시된 단백질(설파아미다아제)에 대해 실시예 9 및 10에 설명된 대로 결정될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 95% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 96% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 97% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 98% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 99% 이상의 분자량을 갖는다. 첨부된 실시예 4에서, SDS-PAGE 분석에서 본 발명에 따라 변형된 라이소좀 단백질이 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질과 구별할 수 없다는 것이 나타나 있으며, 이것은 도 8A에 도시된 것처럼 단일 결합 절단이 주로 일어난다는 것을 시사한다. 첨부된 실시예 2에서, SDS-PAGE 분석에서 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질은 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질보다 작다는 것이 나타나 있으며, 이것은 도 8A에 도시된 것처럼 이중 결합 절단의 정도가 더 높다는 것을 시사한다.

본원에 개시된 실시 양태 중 한 구현예에서, 상기 변형되지 않은 글라이칸 잔기가 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위에 적어도 1개가 존재하지 않으며, 예를 들어 상기 변형되지 않은 글라이칸 잔기가 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개가 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위에 존재하지 않으며, 바람직하게는 상기 글라이칸 잔기는 모든 N-글라이코실화 부위에 부재한다. 예를 들어, 이것은 2개의 N-글라이코실화 부위를 갖는 라이소좀 단백질에 있어서 2개의 부위 중 적어도 하나는 손상되지 않은 또는 완전한 글라이칸 잔기의 결여하고 있음을 의미한다.

본원에 개시된 실시 양태 중 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 비공유 결합된 형태로 존재한다. 유리하게는, 상기 라이소좀 단백질은 단백질의 응집(aggregation)을 유발하지 않고/않거나 더 작은 펩티드 단편으로의 단백질 골격(backbone)의 절단을 유발하지 않으면서 변형된다.

한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 촉매 활성을 보유하며, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 촉매 활성의 적어도 50%의 보유된 촉매 활성, 예를 들어 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의, 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 보유된 촉매 활성을 갖는다. 촉매 활성은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 촉매활성일 수 있다. 시험관내 촉매 활성을 측정하는 방법 및 적어도 50%의 촉매 활성을 갖는 변형된 라이소좀 단백질은 실시예 12에 개시되어 있다.

라이소좀 단백질은 일반적으로 정맥내 주사로 투여될 경우 순환으로부터 빠르게 제거된다. 상기 설명한 것과 같이, 세포외 구역으로부터의 세포 흡수는 라이소좀 단백질의 글라이칸에 풍부한 만노오스 및 만노오스-6-포스페이트를 인식하는 수용체에 의해 촉진된다. 그와 같이, 라이소좀 단백질의 분포는 전형적으로 상이한 세포 상의 이들 수용체의 밀도에 의해 조절된다. 만노오스를 인식하는 수용체는 간 내의 간 조직 대식세포(tissue-resident macrophage) 및 혈관내피세포(sinusoidal endothelial cells)에 풍부하게 존재하는 반면, 양이온 의존성 만노오스 6-포스페이트 수용체는 간세포에 풍부하다. 결과적으로, 정맥내 주사로 투여된 치료 효소 투여량의 대부분은 간에 분포할 것이며, 이는 대부분의 치료 응용 분야에 있어서 차선책이다. 예를 들어, 파브리병(Fabry disease)에 대해 치료제로 사용되는 2개의 α-갈락토시다아제(galactosidase) A 제제는 모두 마우스에서 1회 투여 후 간에서 투여량의 분포의 60-70%를 나타낸다(Lee et al, Glycobiology 13: 305-313 (2003)). 반면, 혈액에 의해 잘 공급되지 않는 수용체 및/또는 수용체 풍부도가 낮은 조직의 세포는 이러한 흡수 메커니즘을 통해서는 충분히 타겟이 되지 않는다. 글라이칸-의존성 경로를 통한 빠른 흡수를 억제함으로써, 순환으로부터의 클리어런스는 상당히 감소되며, 다른 더 느린 과정들이 상이한 분포 프로파일(profile)로 이어지는 세포 내로의 흡수를 촉진한다. 이것은 변형되지 않은 라이소좀 효소에 부족하게 노출되는 조직의 세포에 치료용 변형된 라이소좀 단백질의 분포를 가능하게 할 수 있다. 특별한 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 변형된 라이소좀 단백질은 정맥내 주사로 투여되었을 때 관절, 연결 조직(connective tissue), 연골(cartilage) 및 뼈에서 더 나은 분포를 제공할 수 있다. 또한 골격근(skeletal muscle), 심장 및 폐가 더 나은 타겟이 될 수 있다. 이들은 모두 라이소좀 저장의 결과로 심각한 병리가 공통적으로 나타나는 조직이다.

한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 포유동물에게 투여되었을 때 말초 조직에 분포한다. 말초 조직의 예는 상기에 제공되어 있다. 게다가, 상기 라이소좀 단백질은 (보유된) 생물학적 활성, 예를 들어 보유된 효소 또는 촉매적 활성을, 상기 말초 조직 내에서 나타낼 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 실시 양태에 따르는 변형된 라이소좀 단백질은 포유동물에게 투여되었을 때 뇌에 분포할 수 있으며, 또한 (보유된) 생물학적 활성, 예를 들어 보유된 효소 또는 촉매적 활성을, 상기 포유동물의 뇌 내에서 나타낼 수 있다. 한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 뇌 내에서 촉매 활성을 갖는다.

보유된 생물학적 활성이란, 변형된 라이소좀 단백질의 생물학적 활성이 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태로부터 적어도 부분적으로 보유되는 것을 의미한다. 변형시 라이소좀 단백질의 활성을 완전히 상실하지 않기 위해, 변형은 주의깊게 수행되어야 한다. 변형은 예를 들어 변형된 단백질이 불활성이 되는, 기능성 에피토프 또는 단백질의 활성 부위를 변경할 수 없다. 그와 같이, 본원에 개시된 것과 같은 변형된 라이소좀 단백질은 예를 들어 라이소좀 저장의 감소와 같이, 포유 동물의 뇌, 내장 기관(visceral organs) 및 말초 조직의 라이소좀 저장, 예를 들어 지질(lipid), GAG, 당지질(glycolipid), 당단백질(glycoprotein), 아미노산 또는 글라이코겐(glycogen)의 라이소좀 저장에 영향을 미칠 수 있다.

특별한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 설파타아제이며, 보유된 촉매 활성은 예를 들어 설파타아제의 활성 부위에서 촉매성 아미노산 잔사의 변형 대 보존의 수준에 의존할 수 있다. 설파타아제는 다양한 기질로부터의 설페이트(sulfate) 에스테르(ester) 결합의 가수분해를 촉매하는 공통된 진화적 기원의 단백질 군이다. 그러므로, 본원에 사용된 변형된 설파타아제의 “촉매 활성”은 설페이트 에스테르 결합의 가수분해를 지칭할 수 있으며, 바람직하게는 포유동물의 뇌에서 라이소좀 및/또는 말초 조직의 라이소좀이다. 변형된 설파타아제의 촉매 활성은 그와 같이 라이소좀, 예를 들어 라이소좀 저장병에 걸린 포유 동물의 뇌 내의, 데르마탄(dermatan) 설페이트, 콘드로이틴(chondroitin) 설페이트 및 헤파란(heparan) 설페이트, 저장의 감소로 이어질 수 있다. 촉매 활성은 예를 들어 동물 모델에서, 예를 들어 실시예 7에 설명된 것과 같이 측정될 수 있다. 예시적인 설페이트인 설파아미다아제의 글라이칸 변형은 선행 기술에 개시되어 있다(Rozaklis et al, supra). 그러나 설파아미다아제를 변형하는 공지된 방법의 결과물은 마우스의 뇌에서 촉매 활성이 부족한 변형된 설파아미다아제이다. 그와 같이, 이것은 효소의 변형이 촉매 활성을 망가뜨리지 않도록 주의깊게 수행되어야 한다는 것을 나타낸다. 설파타아제(sulfatase)의 활성 부위는 전형적으로 FGly(Cα-formylglycine)로 해독 후 변형되는 보존된 시스테인(cysteine)을 포함한다. 이 반응은 FGly 생성 효소에 의해 소포체에서 일어난다. 이러한 FGly 잔사는 효소 활성에 필수적인 것으로 보인다. 특히, 아릴설파타아제(arylsulfatase) A 및 B에서 보존된 시스테인의 Ser(serine)으로의 돌연변이는 FGly 형성을 예방하고 불활성 효소를 생산한다(Recksiek et al, J Biol Chem 13; 273(11):6096-103 (1998)). 설파타아제의 활성 부위의 보존이 본원에서 기재될 때, 이것은 상기 설파타아제에서의 해독 후 FGly의 보존으로서 우선적으로 이해되어야 한다.

한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 막 관통 나선이 결핍되고 적어도 하나의 N-글라이코실화 부위를 갖는 라이소좀 단백질이다. 그러한 라이소좀 단백질의 예시가 하기 표에 기재되어 있다:

표 1에 많은 라이소좀 단백질이 나열되어 있다. 단백질의 일부는 다른 이름으로 알려져 있을 수 있다. 상기 나열된 단백질은 또한 임의의 및 모든 대체 이름을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 데옥시리보뉴클레아제-2-알파; 베타-만노시다아제; 리보뉴클레아제 T2; 라이소좀 알파-만노시다아제(Laman); 트리펩티딜 펩티다아제 1(TPP-1); 히알루로니다아제-3(Hyal-3); 카텝신 L2; 세로이드 지질갈색소증 신경원성 단백질 5; 글루코실세라미다아제; 조직 알파-L-푸코시다아제; 미엘로퍼옥시다아제(MPO); 알파-갈락토시다아제 A; 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파; 카텝신 D; 프로사포신; 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 카텝신 L1; 카텝신 B; 베타-글루쿠로니다아제; 프로-카텝신 H; 카텝신 H; 비분비성 리보뉴클레아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제; 라이소좀 보호 단백질; 감마-인터페론-유도성 라이소좀 티올 리덕타아제; 타르트레이트-내성 산성 포스파타아제 유형 5(TR-AP); 아릴설파타아제 A(ASA); 전립선 산 포스파타아제(PAP); N-아세틸글루코사민-6-설파타아제; 아릴설파타아제 B(ASB); 베타-갈락토시다아제; 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제; 스핑고미엘린 포스포디에스테라아제; 강글리오시드 GM2 활성제; N(4)-(베타-N-아세틸글루코사미닐)-L-아스파라기나아제; 이두로네이트 2-설파타아제; 카텝신 S; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제; 알파-L-이두로니다아제; 라이소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 하이드로레이즈(LAL); 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제; 카텝신 O; 카텝신 K; 팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1(PPT-1); 설파아미다아제; 아릴설파타아제 D(ASD); 디펩티딜 펩티다아제 1; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제; 갈락토세레브로시다아제(GALCERase); 정소상체 분비 단백질 E1; 디-N-아세틸키토비아제; N-아실에탄올아민-가수분해 산 아미다아제; 히알루로니다아제-1(Hyal-1); 키토트리오시다아제-1; 산 세라미다아제(AC); 포스포리파아제 B-유사체 1; 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 유형 9; 그룹 XV 포스포리파아제 A2; 추정 포스포리파아제 B-유사체 2; 데옥시리보뉴클레아제-2-베타; 감마-글루타밀 하이드로레이즈; 아릴설파타아제 G(ASG); L-아미노산 옥시다아제(LAAO, LAO); 시알리다아제-1; 레구마인; 시알레이트 O-아세틸에스테라아제; 흉선-특이적 세린 프로타아제; 카텝신 Z; 카텝신 F(CATSF); 프레닐시스테인 옥시다아제 1; 디펩티딜 펩티다아제 2; 라이소좀 티오에스테라아제 PPT2(PPT-2); 헤파라나아제; 카르복시펩티다아제 Q; β-글루쿠로니다아제, 및 설파타아제-변형 인자 1로 구성된 군에서 선택된다.

본원에 기재된 실시 양태의 특정 구현에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 설파타아제이다. 상기 설파타아제는 바람직하게는 그의 활성 부위에 FGly 잔사를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 설파타아제는 아릴설파타아제 A; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제, 아릴설파타아제 B; 이두로네이트 2-설파타아제; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제; 설파아미다아제; 아릴설파타아제 D, 및 아릴설파타아제 G로부터 선택된 것이다. 특히, 상기 설파타아제는 아릴설파타아제 A; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제; 아릴설파타아제 B; 이두로네이트 2-설파타아제; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제 또는 설파아미다아제로부터 선택된 것이다. 바람직하게는, 상기 설파타아제는 아릴설파타아제 A이다. 설파아미다아제는 일부 구현예에서 배제될 수 있다.

본원에 개시된 실시 양태의 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 글라이코시드 하이드로레이즈이다. 일부 구현예에서, 상기 글라이코시드 하이드로레이즈는 알파-갈락토시다아제 A; 조직 알파-L-푸코시다아제; 글루코실세라미다아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제; 베타-갈락토시다아제; 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파; 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 갈락토세레브로시다아제; 라이소좀 알파-만노시다아제; 베타-만노시다아제; 알파-L-이두로니다아제; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제; 베타-글루쿠로니다아제; 히알루로니다아제-1(hyaluronidase-1); 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제; 시알리다아제-1; 디-N-아세틸키토비아제; 키토트리오시다아제-1; 히알루로니다아제-3. 및 헤파라나아제로부터 선택된 것이다. 바람직하게는, 상기 글라이코시드 하이드로레이즈는 알파-L-이두로니다아제 또는 라이소좀 알파-만노시다아제이다. 바람직하게는, 상기 글라이코시드 하이드로레이즈는 라이소좀 알파-만노시다아제이다.

본원에 개시된 실시 양태의 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제는 카텝신 D; 카텝신 L2; 카텝신 L1; 카텝신 B; 프로-카텝신 H; 카텝신 S; 카텝신 O; 카텝신 K; 디펩티딜 펩티다아제 1; 카텝신 Z; 카텝신 F; 레구마인; 감마-글루타밀 하이드로레이즈; 트리펩티딜-펩티다아제 1; 카르복시펩티다아제 Q; 라이소좀 보호 단백질; 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제; 흉선-특이적 세린 프로테아제; 디펩티딜 펩티다아제 2, 및 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 유형 9 중에서 선택된 것이다. 한 구현예에서, 상기 프로테아제는 트리펩티딜-펩티다아제 1이다. 다른 구현예에서, 트리펩티딜-펩티다아제는 상기 개시된 프로테아제 그룹에서 제외된다.

본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 서열번호 1-74 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드나, 또는 서열번호 1-74로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 비제한적 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1-74 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성, 예를 들어 서열번호 1-74 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성, 예를 들어 서열번호 1-74 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는다.

구체적인 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 설파타아제이고, 서열번호 26; 28; 29; 35; 37; 44; 45, 및 61 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 35; 서열번호 37 및 서열번호 44 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 26에 개시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.

다른 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 글라이코시드 하이드로레이즈이며, 서열번호 12; 서열번호 10; 서열번호 9; 서열번호 22; 서열번호 30; 서열번호 13; 서열번호 16; 서열번호 48; 서열번호 4; 서열번호 2; 서열번호 38; 서열번호 47; 서열번호 19; 서열번호 52; 서열번호 31; 서열번호 63; 서열번호 50; 서열번호 53; 서열번호 6, 및 서열번호 72 중에서 선택된 어느 한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 4 또는 서열번호 38에 개시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.

다른 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 프로테아제이고, 서열번호 14; 서열번호 68; 서열번호 5; 서열번호 23; 서열번호 56; 서열번호 46; 서열번호 42; 서열번호 7; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 20; 서열번호 36; 서열번호 41; 서열번호 67; 서열번호 64; 서열번호 60; 서열번호 73; 서열번호 40; 서열번호 66, 및 서열번호 70 중에서 선택된 어느 한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 5에 개시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.

추가적인 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 그러나, 하나 또는 그 이상의 C- 및/또는 N-말단 아미노산에 의해 연장되어 실제로 변형된 라이소좀 단백질을 서열번호 1-74의 서열보다 길게 만들 수 있다. 유사하게, 다른 예시에서 변형된 라이소좀 단백질은 서열의 특정 위치의 아미노산 잔사의 결실로 인해 서열번호 1-74의 아미노산 서열보다 짧은 아미노산 서열을 가질 수 있다.

한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 분리된 것이다.

한 구현예에서, 상기 라이소좀 단백질은 인간 라이소좀 단백질이다.

한 구현예에서, 상기 라이소좀 단백질은 변형 전에 글라이코실화된다.

한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 재조합된 것이다. 특히, 라이소좀 단백질은 연속적인 인간 세포주에서 재조합적으로 제조된 것일 수 있다.

한 구현예에서, 상기 변형된 단백질은 포유동물, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary), 식물 또는 효모 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 수득되는 단백질은, 변형 전에 하나 또는 그 이상의 올리고만노오스 N-글라이칸에 의해 글라이코실화된다.

한 실시 양태에서, 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 50% 이하의 천연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기가 잔류하고, 그로써 혈액 뇌 장벽을 관통하고 상기 변형된 라이소좀 단백질이 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 뇌 내로의 상기 라이소좀 단백질의 운반을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는, 천연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 양이 감소된 변형된 라이소좀 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 단백질은 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, 또는 TPP1(tripeptidyl peptidase 1)가 아니다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 알파-L-이두로니다아제가 아니다.

특별한 구현예에서 상기 라이소좀 단백질은 설파타아제이며, 상기 조성물은 상기 변형된 설파타아제의 활성 부위에서의 FGly(Cα-formylglycine) 대 Ser(serine)의 비율이 1보다 큰 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 서열번호 26; 28; 29; 35; 37; 44; 45, 및 61에 정의된 것과 같은 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; 또는 서열번호 26; 28; 29; 35; 37; 44; 45, 및 61에 정의된 것과 같은 폴리펩티드와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, FGly대 Ser 비율은 1.5를 초과하고, 더 바람직하게는 그것은 2.3을 초과하고, 더 바람직하게는 4, 가장 바람직하게는 상기 비율은 약 9이다. 더 큰 비율은 변형된 설파타아제의 촉매 활성이 변형되지 않은 설파타아제의 형태로부터 더 크게 보유될 수 있음을 나타낸다.

다른 실시 양태에 대해 개시된 이점은 또한 조성물의 실시 양태에 대해서도 적용된다. 유사하게, 다른 실시 양태에 대해 개시된 구현예는 또한 조성물의 실시 양태에 대해서도 적용된다. 특히, 글라이칸 잔기의 양, 단백질 활성, 및 라이소좀 단백질의 구체적인 예시(표 1 및 상기 기재를 참고하라)에 관련된 구현예들 또한 이러한 실시 양태에 적용할 수 있다.

조성물 실시 양태의 한 구현 예에서, 상기 변형된 단백질의 10% 이하, 예를 들어 7.5% 이하, 5% 이하, 2.5% 이하, 1% 이하(중량 기준)가 10¹⁰ kDa 이상의 분자량을 갖는 멀티머(multimer) 형태로 존재한다.

조성물 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질의 10% 이하(중량 기준)가 공유 결합된 올리고머(oligomer) 형태로 존재하며, 상기 올리고머 형태는 이량체(dimer), 삼량체(trimer), 사량체(tetramer), 오량체(pentamer), 육량체hiexamer), 칠량체(heptamer) 및 팔량체(octamer)로부터 선택된 것이다. 올리고머, 다량체, 또는 응집된 형태의 존재는, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering)에 의해 또는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 맥락에서, 응집된 형태는 천연적으로 접힌 것에서 접히지 않은 단량체 형태까지 다양한 구조로 구성된 더 높은 분자량 단백질 형태로 이해된다. 단백질의 응집된 형태는 단백질의 단량체 형태에 대한 면역 반응을 강화할 수 있다. 강화된 면역 반응에 대한 가장 가능성 있는 설명은 항원의 다가(multivalent) 제시가 B-세포 수용체를 가교결합시키고 그와 같이 면역 반응을 유도한다는 것이다. 이것은 높은 면역 반응을 보장하기 위해 항원이 응집된 형태로 숙주에게 제시되는 백신 제조에 이용될 수 있는 현상이다. 치료용 단백질에 이 이론은 반대가 된다; 면역 반응을 최소화하기 위해 높은 분자량 형태의 임의의 물질은 최소화되거나 회피되어야 한다(Rosenberg, AAPS J, 8:E501-7 (2006)). 따라서, 올리고머, 다량체 및/또는 응집된 형태의 제거는 그로써 치료에 사용하기에 더 적합한 효소 또는 단백질을 제공할 수 있다.

또한, 샘플 내의 응집된 단백질의 적은 양의 발생조차도 정상적으로 접힌 단백질의 응집을 추가로 더 유발할 수 있다. 응집된 물질은 일반적으로 잔류하는 활성이 낮거나 없으며 부족한 용해성을 갖는다. 응집의 발생은 생물학적 의약품의 유효 기간을 결정하는 요인 중 하나일 수 있다(Wang, Int J Pharm, 185:129-88 (1999)).

본원에 사용된 용어 “조성물”은 고체 및 액체 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 조성물은 바람직하게는 환자(예를 들어, 포유동물)에게 예를 들어 주사 또는 구두로 투여되는 데에 적합한, 약학적 조성물일 수 있다.

한 실시 양태에서, 변형된 라이소좀 단백질이 제공되는데, 상기 라이소좀 단백질은 알칼리 금속 퍼아이오데이트(periodate) 및 알칼리 금속 보로하이드라이드(borohydride)와의 일련의 반응에 의해 제조되고, 그로써 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 변형시키고 상기 글라이칸 인식 수용체에 관한 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키는 반면, 상기 라이소좀 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 변형된 라이소좀 단백질이 제공된다. 라이소좀 단백질은 그와 같이 변형되며, 변형 전에 천연적인, 글라이코실화된 형태로 존재하는 에피토프, 또는 글라이칸 잔기가 필수적으로 상기 변형에 의해 불활성화된다. 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 존재는 따라서 변형된 라이소좀 단백질에서 감소된다. 본원에 개시된 다른 실시 양태에 관해 개시된 구현예 및 그들의 이점은, 예를 들어 변형된 라이소좀 단백질, 조성물 및 제조 방법들은 또한 이 실시 양태의 구현예라는 것이 이해되어야 한다. 특히, 하기에 개시된 다양한 방법의 구현예는 구체적인 반응 조건의 측면에서 상기 변형된 라이소좀 단백질의 제조의 추가적인 예시적 정의를 추가로 더 제공한다. 유사하게, 상기 변형된 라이소좀 단백질 및 조성물 실시 양태에 관하여 개시된 구현예는 변형된 라이소좀 단백질의 예시적 정의를 추가로 더 제공한다.

한 실시 양태에서, a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 반응시키는 단계, 및 b) 상기 라이소좀 단백질과 알칼리 금속 보로하이드라이드를 2시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써, 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고 글라이칸 인식 수용체에 대한 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인 변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법이 제공된다.

한 가지 관련된 실시 양태에서, a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 4시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계, 및 b) 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드와 2시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써, 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고 글라이칸 인식 수용체에 대한 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인, 변형된 라이소좀 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

한 가지 관련된 실시 양태에서, a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 반응시키는 단계, 및 b) 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드와, 선택적으로 2시간 이하의 반응 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키며, 상기 라이소좀 단백질의 상기 활성 부위 또는 기능성 에피토프는 단계 a)및 b) 중 적어도 하나 동안 산화 및/또는 환원 반응에 접근 불가능하도록 만들어지는 것인, 변형된 라이소좀 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

이 문맥에서 용어 “기능성 에피토프”는 비록 그 단백질이 효소 활성이 없더라도 라이소좀에서 필수적인 기능을 갖는 단백질의 부분으로 이해되어야 한다. 필수적인 기능은 예를 들어 분해 효소에 기질을 제시하거나, 효소의 분류에 영향을 주거나 기능성 효소에 대한 결합 파트너로서 작용함으로써 제공될 수 있다. 문제의 단백질의 기능성 에피토프는 그의 기능에 관여하는 단백질의 잔사, 예를 들어 그 단백질의 기능을 정의하는 단백질-단백질 결합에 관여하는 결합 리간드 잔사 또는 잔사들에 의해 정의된다.

따라서, 상기 방법들은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 존재를 감소시키고, 상기 에피토프는 예를 들어 본원에 개시된 것과 같이 자연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기에 의해 제시되는 것인 라이소좀 단백질의 약한 화학적 변형을 제공한다. 이것은 유리하게는, 변형되지 않은 라이소좀 단백질이 불량하게 분포하는 포유동물의 뇌 및/또는 내장 기관 및/또는 말초 조직을 타겟으로 하기에 적합한 변형된 라이소좀 단백질을 제공할 수 있다. 특히, 방법은 예를 들어 정맥내 주사에 의해 투여될 경우 말초 조직, 예를 들어 관절, 연결 조직, 연골 및 뼈에 더 높은 노출을 갖는 라이소좀 단백질을 제공한다. 약한 방법은 또한 생물학적 활성의 완전한 손실로 이끌지 않으면서 유리하게 상기 에피토프를 변형한다. 특별한 구현예에서, 약한 방법은 라이소좀 단백질의 기능성 에피토프를 변형하지 않아 그의 생물학적 활성이 손실되지 않도록 한다. 상기 라이소좀 단백질이 설파타아제인 경우, 생물학적 활성은 변형된 라이소좀 단백질의 활성 부위에서 FGly를 보유함으로써 보유되는 촉매 활성일 수 있다. 따라서, 단백질 또는 효소의 분포 특성을 개선하는 반면, 상기 방법은 생물학적, 예를 들어, 촉매, 활성을 제거하지 않는다. 상기 설명한 것과 같은 약한 방법에 의해 제조된 라이소좀 단백질은, 예를 들어, 라이소좀 단백질 및 조성물 실시 양태에 대해 추가적인 장점을 더 제공한다.

글라이칸(탄수화물) 잔기의 2개의 인접한 하이드록실 그룹 사이의 탄소 결합을 퍼아이오데이트 절단함으로써 방법은 글라이칸 변형을 허용한다. 일반적으로, 퍼아이오데이트 산화적 절단은 인접한(vicinal) 디올(diol)이 존재할 때 발생한다. 상기 디올은 적도(equatorial)-적도 또는 축-적도 위치에 존재해야 한다. 만약 디올이 고정된 축-축 위치에 존재하면 반응이 일어나지 않는다 (Kristiansen et al, Car. Res (2010)). 퍼아이오데이트 처리는 M6P 잔기의 C2 및 C3 및/또는 C3 및 C4 사이의 결합을 절단할 것이며, 그와 같이 M6P-수용체에 결합하는 것이 불가능한 구조를 생성할 것이다. 일반적으로, 다른 말단 헥소오스는 유사한 방식으로 진행될 것이다. 비-말단 1-4 연결 잔사들은 C2 및 C3 간에만 절단될 것이며, 반면 비-말단 (1-3) 연결 잔사들은 절단되지 않을 것이다. 도 7에서, 3가지 N-글라이칸(올리고만노오스, 복합 및 하이브리드 N-글라이칸)의 일반적 유형 가능한 변형의 지점이 별표로 표시되어 있다. 첨부된 실시예에 추가로 더 증명된 것과 같이, 본원에 개시된 방법은 제한된 수의 결합 절단에 의해 변형된 자연적인 글라이칸 잔기를 갖는 변형된 단백질을 제공한다. 전형적으로, 공지된 방법의 사용에 의한 변형은 더 강한 변형을 야기하며, 이는 폴리펩타이드 설파아미다아제에 대한 대조 실험으로 증명되어 있다. 단계 a)에 사용된 퍼아이오데이트는 라이소좀 단백질에서 자연적으로 발생하는 글라이칸 잔기의 구조를 변형할 것이다. 변형된 라이소좀 단백질의 잔존하는 글라이칸 구조는 각 자연적으로 발생하는 글라이칸 잔기에서 적어도 하나의 퍼아이오데이트 촉매의 절단으로, 즉, 적어도 하나의 단일 결합 절단으로, 적어도 부분적으로 변형되었을 것이다. 본원에 개시된 방법은 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기의 당 잔기에서 결합 절단의 단일-유형을 우세하게 야기할 것이다(도 8을 참고하라). 2중 결합 절단 vs 단일 결합 절단의 경향성에 관한 공지된 방법 및 본원에 개시된 방법 사이의 차이점은 예를 들면 2중결합 절단이 우세한 경향성이 단량체 단백질의 분자량에 더 현저한 손실을 초래하는 SDS-PAGE 상에서 관찰될 수 있다. 글라이칸 잔기에서 단일결합 절단이 우세하게 발생한 변형된 단백질에서, 단량체 단백질의 분자량 손실은 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 덜 현저하거나 심지어 무시할 수 있는 수준이다. 결합 절단의 단일-유형을 우세하게 나타내는 변형된 글라이칸 잔기의 레파토리는 정맥내 주사 투여 이후 살아 있는 동물의 뇌에서 라이소좀 단백질의 변형 및 활성에 이로운 것으로 밝혀질 수 있다.

본원에 설명된 것과 같은 변형된 라이소좀 단백질 및 라이소좀 단백질을 제조하는 방법은 종래의 방법 및 화합물에 비해 개선된 것이다. 주로, 신규한 변형된 라이소좀 단백질은 포유동물 뇌 내에 분포하고 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 실시예 2 및 4는 또한 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질 및 본원에 개시된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질 사이의 비교를 제공한다. 이 실시예들의 결과는 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질은 아미노산 서열, 폴리펩티드 사슬 절단 및 단백질 응집의 변경을 나타낸다는 것을 나타낸다. 특히, 활성 부위에 촉매성 FGly 잔사를 포함하는 설파타아제에서 공지된 방법으로의 변형은 FGly 잔사를 Ser 잔사로 전환하도록 한다. 그와 같이, 본원에 개시된 것과 같은 발명은 또한 변형된 라이소좀 단백질이 예를 들어 구조적 완전성의 측면에서 개선된 질 및 안정성을 제공할 수 있다.

방법 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 글라이칸 잔기의 시스-글라이콜(cis-glycol) 그룹을 알데하이드 그룹으로 산화시킨다.

방법 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 알데하이드를 알코올로 환원시킨다.

방법 실시 양태의 한 구현예에서, 단계 a) 및 단계 b)는 반응 중간 단계(intermediate step)를 수행하지 않고 순서대로 수행된다. 단계 a) 이후 곧바로 단계 b)를 수행함으로써, 또는 하기에 설명된 것과 같이 선택적인 ??칭 a2) 이후, 반응성 반응물을 제거하기 위한 임의의 중간 단계, 예를 들어, 투석, 한외 여과, 석출 또는 완충액 교환, 은 생략되며, 반응성 알데하이드 중간체에 라이소좀 단백질을 오래 노출시키는 것은 그와 같이 회피된다. 단계 a) 이후 단계 b), 또는 선택적으로 a2)를 수행함으로써, 전체 반응 시간 또한 유리하게 감소된다.

하기 단락에서, 단계 a)의 구체적인 구현예가 개시되어 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 개시된 실시 양태의 구체적인 개시예는 조합될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이다.

한 구현예에서, 상기 반응 4시간 이하의 시간, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 a)의 반응은 0.5시간 이하, 예를 들어 약 20분 동안 수행된다. 반응은 바람직하게는 약 3시간, 2시간, 1시간, 또는 1시간 미만의 반응 시간을 갖는다. 4시간 이하의 단계 a)의 지속은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 효과적으로 불활성화시킬 수 있다. 추가로, 4시간 이하의 상대적으로 제한된 반응 시간은 폴리펩타이드 사슬의 스트랜드 절단(strand break)의 제한된 정도를 야기한다고 가정된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하의 (최종) 농도, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM으로 사용된다. 상기 퍼아이오데이트는 8-20mM, 바람직하게는 약 10mM의 농도로 사용된다. 대안으로, 퍼아이오데이트는 20mM 이하의 농도, 예를 들어 10과 19mM 사이로 사용된다. 알칼리 금속 퍼아이오데이트, 예를 들어 나트륨 메타-퍼아이오데이트의 낮은 농도는 아미노산 측면사슬(side-chain)의 관련된 산화, 예를 들어 메티오닌 잔사의 산화뿐만 아니라 폴리펩티드 사슬의 스트랜드 절단의 정도를 감소시킨다.

한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 주위(ambient) 온도에서, 바람직하게는 0과 22℃ 사이의 온도에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 0-8℃의 온도, 예를 들어 0-4℃의 온도에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 약 8℃의 온도, 약 4℃의 온도 또는 약 0℃의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 3 내지 7의 pH에서 수행된다. pH는 반응 개시시의 pH로서 이해되어야 한다. 특별한 구현예에서, 단계 a)에 사용된 pH는 3-6, 예를 들어 4-5이다. 구체적인 구현예에서, 단계 a)에서 사용된 pH는 약 6, 약 5, 또는 약 4이다. 단계 a)의 pH를 낮춤으로써, 단계 a)의 반응 시간 또는 퍼아이오데이트의 농도는 감소될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용된다. 한 구현예에서, 상기 나트륨 메타-퍼아이오데이트는 8-20mM의 농도로 사용된다. 바람직한 구현예에서, 나트륨 메타-퍼아이오데이트는 약 10mM의 농도로 사용된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되고, 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다. 20mM 퍼아이오데이트의 농도 및 4시간 이하의 반응 지속 시간은 유리하게 적은 스트랜드-절단 및 산화로 이어질 수 있다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되고, 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0과 22℃ 사이, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되고, 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0과 22℃ 사이의 온도, 예를 들어 0-8 ℃의 온도, 예를 들어 0-4 ℃의 온도, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0과 22℃ 사이의 온도, 예를 들어 0-8 ℃의 온도, 예를 들어 0-4 ℃의 온도, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 단계 a)의 반응은 0과 22℃ 사이의 온도, 예를 들어 0-8 ℃의 온도, 예를 들어 0-4 ℃의 온도, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 약 10mM의 농도로 사용되는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 단계 a)의 반응은 약 8 ℃의 온도에서 2시간 이하의 시간 동안 수행된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 약 10mM의 농도로 사용되는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 단계 a)의 반응은 0-8 ℃의 온도 및 3시간 이하의 시간 동안 수행된다.

하기 단락에서, 단계 b)의 구체적인 구현예가 개시되어 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 개시된 실시 양태의 구체적인 개시예, 특히 단계 a) 및 단계 b)의 구체적인 구현예는 조합될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 보로하이드라이드는 10과 80 mM 사이의 농도로 사용된다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드이다.

일부 예에서, 단계 b)에 사용된 조건은 단계 a)에 사용된 조건에 부분적으로 의존하는 것으로 밝혀졌다. 단계 b)에서 사용된 보로하이드라이드의 양이 바람직하게는 가능한 한 낮게 유지되는 반면, 보로하이드라이드 대 퍼아이오데이트의 몰 비율은 예를 들어 0.5-4 대 1이다. 따라서, 단계 b)의 보로하이드라이드는 단계 a)에 사용된 퍼아이오데이트의 몰 양의 4배를 초과할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 (최종)농도의 4배 이하의 몰 농도로 사용된다. 예를 들어, 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 3배 이하의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 1.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트 농도와 대략 상응하는 농도의 농도로 사용될 수 있다. 그러나, 특별한 실시예에서 보로하이드라이드는 퍼아이오데이트 농도의 반에 상응하거나, 퍼아이오데이트 농도의 0.5배의 농도로 사용될 수 있다. 그와 같이, 퍼아이오데이트가 약 20mM의 농도로 사용될 경우, 보로하이드라이드는 80mM 이하의 농도, 또는 심지어 10과 80mM 사이의 농도, 예를 들어 10과 50mM 사이의 농도로 사용될 수 있다. 만약 퍼아이오데이트가 10과 20mM 사이의 농도로 사용된다면, 보로하이드라이드는 5와 80mM 사이의 농도, 예를 들어 예시 50mM의 농도로 사용될 수 있다. 유사하게, 퍼아이오데이트가 약 10mM의 농도로 사용된다면, 보로하이드라이드는 40mM 이하의 농도, 예를 들어 25mM 이하의 농도로 사용될 수 있다. 또한, 그러한 구현예에서, 보로하이드라이드는 바람직하게는 12mM과 50mM 사이의 농도로 사용될 수 있다. 라이소좀 단백질이 설파타아제인 구현예에서, 보로하이드라이드의 농도는 활성 부위의 촉매성 아미노산 잔사의 보존 정도에 영향을 미칠 수 있다.

한 구현예에서, 상기 단계 b)의 반응은 1.5시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 0.75시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다. 반응 지속 시간은 바람직하게는 약 1시간, 또는 1시간 미만이다. 일부 예시에서, 단계 b)의 반응은 대략 0.25시간의 반응 지속 시간을 갖는다. 추가적인 구현예에서, 단계 b)의 반응은 0.25시간 내지 2시간의 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 설명한 것과 같이, 반응 단계의 지속 시간은 라이소좀 단백질의 생물학적 활성, 특히 효소, 예를 들어 설파타아제의 촉매 활성에 영향을 미칠 수 있다. 상대적으로 짧은 반응 지속 시간은 또한 단백질/효소의 전체적인 구조적 완전성에 유리하게 영향을 미칠 수 있다. 특히, 스트랜드 절단 발생 뿐만 아니라 라이소좀 단백질의 높은 분자량을 일으키는 단백질 응집은 반응 시간과 적어도 일부 관련될 수 있다.

한 구현예에서, 상기 단계 b)의 반응은 0℃와 8℃ 사이의 온도에서 수행된다. 단계 b)의 반응 온도는 반응 물질의 생물학적 활성에 적어도 일부 영향을 미칠 수 있다. 그와 같이, 단계 b)를 8 ℃ 이하의 온도에서 수행하는 것이 유리할 수 있다. 상기 온도는 바람직하게는 약 0 ℃이다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는, 나트륨 보로하이드라이드이다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되고, 상기 단계 b)의 반응은 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.

한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 약 0℃의 온도에서 약 0.5시간 동안 수행된다.

한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드이다.

한 구현예에서, 단계 a) 및 단계 b) 각각은 개별적으로 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 1시간 또는 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다. 선택적으로, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도로, 바람직하게는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-2.5배로 사용된다. 구체적인 구현예에서, 상기 보로하이드라이드는 퍼아이오데이트의 농도의 0.5배, 또는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배의 농도로 사용된다.

한 구현예에서, 단계 a)는 3시간 이하 및 단계 b)는 1시간 이하의 시간 동안 수행된다. 선택적으로, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 바람직하게는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용된다.

한 구현예에서, 단계 a)는 0.5시간 이하 및 단계 b)는 1.5시간 이하의 시간 동안 수행된다. 선택적으로, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 바람직하게는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용된다.

당업계의 통상의 기술자는 화학 반응의 반응 지속 시간, 예를 들어, 단계 a) 및 b) 각각의 반응 지속 시간을 조절하는 방법을 알고 있다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 방법 실시 양태는 단계 a)의 결과로 생성된 반응의 ??칭인 a2)를 추가로 더 포함한다. 상기 ??칭은 예를 들어 30분 이하, 예를 들어 15분 이하의 지속 시간을 갖는다. 일부 예시에서, 상기 ??칭은 단계 a) 이후 곧바로 수행된다. ??칭은 예를 들어 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol) 또는 다른 디올, 예를 들어 시스-사이클로-헵테인-1,2-디올(cis-cyclo-heptane-1,2-diol)을 가함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게, ??칭 이후에 곧바로 단계 b)가 이어진다. 이것은 라이소좀 단백질이 반응성 알데하이드에 노출되는 시간을 최소화할 수 있다. 반응성 알데하이드는 단백질의 불활성화 및 응집을 촉진할 수 있다.

한 구현예에서, 상기 방법은 단계 b)의 결과로 생성된 반응의 ??칭인 b2)를 추가로 더 포함한다. 이 ??칭은 예를 들어 케톤 또는 알데하이드 그룹을 포함하는 분자, 예를 들어 사이클로헥산온(cyclohexanone) 또는 아세톤(acetone)의 첨가로 수행될 수 있으며, 상기 분자는 바람직하게는 물에서, 또는 또는 아세트산 또는 다른 산의 첨가로 반응 혼합물의 pH를 6 이하로 낮춤으로써 가용성(soluble)인 것이다. 선택적인 ??칭 단계는 단계 b)의 반응 지속 시간의 정확한 조절을 허용한다.

그와 같이, 한 구현예에서, 단계 a) 및 b)의 적어도 하나는 보호 리간드의 존재 하에 수행된다. 특히, 단계 a)는 보호 리간드의 존재 하에 수행될 수 있다. 리간드, 예를 들어 상기 라이소좀 단백질의 기질은 산화 및 환원 단계, 및 선택적으로 ??칭 단계 동안 단백질의 기능성 에피토프 또는 활성 부위를 보호할 수 있다. 리간드는 선택적으로 단백질의 억제제일 수 있다.

다른 구현예에서, 방법의 단계 a) 및 b)는 라이소좀 단백질이 수지(resin) 상에 고정화되어 있는 동안 수행된다. 그와 같이, 라이소좀 단백질은 초기에 수지 또는 배지 상에 고정화될 수 있다. 이후에 단계 a) 및 b)의 반응, 및 선택적으로 a2) 및 b2)는 상기 단백질이 수지 또는 배지 상에 고정화되어 있는 동안 수행될 수 있다. 적합한 수지 또는 배지는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 이온 교환 배지 또는 친화성 배지(affinity media)가 사용될 수 있다.

방법 실시 양태의 한 구현예에서, 단계 a) 및 b)의 적어도 하나는 보호 리간드의 존재 하에 수행되며, 단계 a) 및 b)는 상기 라이소좀 단백질이 수지 상에 고정화되어 있는 동안 수행된다.

한 구현예에서, 방법의 단계 a) 및 b)는 연속적인 과정으로 수행된다. 특히, 단계 a), a2), b), 및 b2)는 연속적인 과정으로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 “연속적인 과정(continuous process)”은 연속적으로 작동되고 상기 반응물은 연속적으로 과정 단위에 주어지는 것인 과정으로 이해되어야 한다. 반응물, 예를 들어 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드라이드를 라이소좀 단백질을 포함하는 흐름(stream)에 첨가함으로써, 반응은 연속적인 형태로 수행될 수 있다. 연속적인 과정은 예를 들어 멀티-펌프 HPLC 시스템에서 수행될 수 있다.

따라서 본원에 개시된 것과 같은 방법은 개선된 특성을 갖는 변형된 단백질을 제공한다. 라이소좀 단백질의 화학적 변형의 조건은 라이소좀 단백질 폴리펩티드 사슬의 구조적 완전성에 최소한의 부정적 영향을 제공하며, 동시에 자연의 또는 변형되지 않은 글라이칸 에피토프의 실질적인 부재를 야기한다. 방법의 예시적인 구현예는 도 1B, 1C 및 1D에 도시되어 있다.

관련된 실시 양태에서, 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 단백질을 포유동물, 식물 또는 효모 세포에서 발현시킴으로써 글라이코실화된 단백질을 제공하는 단계; 및 상기 글라이코실화된 단백질 상의 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 변형시킴으로써 상기 글라이칸 인식 수용체에 대한 단백질의 활성 감소를 포함하는 방법이 제공된다.

한 구현예에서, 상기 변형은 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드라이드와 연속 반응시킴으로써 수행된다. 식물 및 효모 발현 시스템의 예시는 통상의 기술자에게 알려져 있으나 Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris 및 Ogataea minuta종(species)의 발현 시스템을 포함할 수 있다. 포유류 세포주의 예시는 CHO 세포주이다. 상기 방법의 다른 구현예는 상기에 개시되어 있다.

한 구현예에서, 상기 정의된 방법 실시 양태의 방법에 의해 수득할 수 있으나, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인 변형된 라이소좀 단백질이 제공된다.

본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질, 상기 라이소좀 단백질 조성물 또는 임의의 한 방법 실시 양태에 의해 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질은 치료에 사용하기 위한 것이다.

본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질, 어떠한 한 방법 실시 양태에 의해 수득할 수 있는 상기 라이소좀 단백질 조성물 또는 변형된 라이소좀 단백질은 라이소좀 저장병에 걸린 포유동물의 치료에 사용하기 위한 것이다.

본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 포유동물 뇌는 인간의 뇌일 수 있다. 관련된 구현예에서, 상기 포유동물은 따라서 인간이다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 포유동물 뇌는 마우스의 뇌이다. 관련된 구현예에서, 상기 포유동물은 따라서 마우스이다.

한 실시 양태에서, 포유동물의 뇌 내에서, 라이소좀 저장병을 치료하기 위해 혈액 뇌 장벽을 관통하는 변형된 라이소좀 단백질의 사용으로서, 상기 변형은 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드로 순차적으로 단백질을 처리함으로써 화학적으로 변형된 글라이칸 잔기를 갖는 것을 포함하며, 이에 따라 글라이칸 인식 수용체, 예를 들어 만노오스 및 만노오스-6-포스페이트 세포 수송 시스템에 관련된 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키는 반면, 상기 라이소좀 단백질의 생물학적 활성을 보유하며, 단 상기 라이소좀 단백질이 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, TPP1(트리펩티딜 펩티다아제) 또는 알파 L-이두로니다아제가 아니라는 조건 하에, 의약 제조에서 변형된 라이소좀 단백질의 사용이 제공된다.

한 실시 양태에서, 포유동물에서 영향을 받은 내장 기관 및/또는 말초 조직에서 라이소좀 저장병을 치료하기 위해 상기 영향을 받은 내장 기관 및/또는 말초 조직에 (강화된) 분포를 위한 의약 제조에서 변형된 라이소좀 단백질의 사용으로서, 상기 변형은 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드로 순차적으로 단백질을 처리함으로써 화학적으로 변형된 글라이칸 잔기를 갖는 것을 포함하며, 그로써 글라이칸 인식 수용체, 예를 들어 만노오스 및 만노오스-6-포스페이트 세포 수송 시스템에 관련된 변형된 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키는 반면, 상기 라이소좀 단백질의 생물학적 활성을 보유하며, 단 상기 라이소좀 단백질이 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, TPP1(트리펩티딜 펩티다아제) 또는 알파 L-이두로니다아제가 아니라는 조건 하에, 변형된 라이소좀 단백질의 사용이 제공된다.

본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 라이소좀 저장병은 만노사이드 축적증 베타 A; 라이소좀성; 거대뇌증이 없는; 낭성; 백색뇌병(LCWM); 만노사이드 축적증, 알파 B; 라이소좀성(MANSA); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성 2(CLN2); 척수소뇌성 실조증; 상염색체 열성 7(SCAR7); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성; 5(CLN5); 고쉐병(GD); 푸코사이드 축적증(FUCA1D); 미엘로퍼옥시다아제 결핍증(MPOD); 파브리병(FD); GM2-강글리오시드 축적증 1(GM2G1); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성, 10(CLN10); 복합 사포신 결핍증(CSAPD); 사포신-B 결핍으로 인한 이염색백색질장애(MLD-SAPB); 사포신 C 결핍으로 인한 비정형 고쉐병(AGD); 사포신 A 결핍으로 인한 비정형 크라베병(AKRD); 테이-삭스병 변종에서 PSAP 사포신-D 영역의 결함이 발견된다(GM2-강글리오시드 축적증); GM2-강글리오시드 축적증 2(GM2G2); 점액다당류증 7(MPS7); 당원축적병 2(GSD2); 갈락토시알리도시스(GSL); 면역조절장애 관련 척추내연골종형성이상(SPENCDI); 이염색백색질장애(MLD); 점액다당류증 3D(MPS3D); 점액다당류증 6(MPS6); GM1-강글리오시드 축적증 1(GM1G1); GM1-강글리오시드 축적증 2(GM1G2); GM1-강글리오시드 축적증 3(GM1G3); 점액다당류증 4B(MPS4B); 쉰들러병(SCHIND); 칸자키병(KANZD); 니만-피크병 A(NPDA); 니만-피크병 B(NPDB); GM2-강글리오시드 축적증 AB(GM2GAB); 아스파르틸글루코스아민뇨증(AGU); 점액다당류증 2(MPS2); 점액다당류증 4A(MPS4A); 점액다당류증 1H(MPS1H); 점액다당류증 1H/S(MPS1H/S); 점액다당류증 1S(MPS1S); 월만병(WOD); 콜레스테릴에스테르 축적병(CESD); 피크노디소토시스(PKND); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성, 1(CLN1); 점액다당류증 3A(MPS3A); 빠삐용-르페브르 증후군(PLS); 하임-멍크 증후군(HMS); 치주염, 급진성, 1(AP1); 점액다당류증 3B(MPS3B); 공세포백색질장애(GLD); 니만-피크병 C2(NPC2); 점액다당류증 9(MPS9); 파버 지방육아종증(FL); 진생성근간대성간질을 동반한 척수성근위축증(SMAPME); 고콜레스테롤혈증, 상염색체 우성, 3(HCHOLA3); 시알리도시스(SIALIDOSIS); 자가면역질환 6(AIS6); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성, 13(CLN13), 및 다중 설파타아제 결손증(MSD)으로부터 선택된 것이다.

한 구현예에서, 치료에 이용하기 위한 상기 변형된 라이소좀 단백질, 라이소좀 단백질 조성물, 또는 상기 방법 실시 양태에 의해 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질은 상기 포유 동물의 뇌에서 라이소좀 저장을 감소시킨다. 특히, 상기 저장은 예를 들어 동물 모델에서, 적어도 30%, 예를 들어 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60% 감소된다.

한 실시 양태에서 변형된 라이소좀 단백질의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 라이소좀 저장병에 걸린 포유동물의 치료 방법으로서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은

a) 본원에 개시된 구현예 및 실시 양태에 설명된 것과 같은, 또는 그로부터 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질, 및

b) 본원의 실시 양태 및 구현예에 설명된 것과 같은 라이소좀 단백질 조성물 로부터 선택되는 것인,

방법이 제공된다.

그의 한 구현예에서, 상기 치료는 70일간의 시간 동안 변형된 라이소좀 단백질의 10회 투여 이후 포유 동물의 뇌에서 적어도 약 50%의 라이소좀 저장의 클리어런스를 야기한다.

본 발명은 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 더 설명될 것이다.

도 1은 실시예 3에 개시된, 본 발명자들에 의해 발명된 화학적 변형을 위한 방법과, WO 2008/109677에 개시된, 공지된 방법 사이의 차이점의 개요를 나타낸 그림이다.
도 2A는 설파아미다아제(sulfamidase)(레인 1), 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제(레인 2), 이두로네이트 2-설파타아제(iduronate 2-sulfatase) (레인 3) 및 공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제(레인 4), 알파-L-이두로니다아제(alpha-L-iduronidase)(레인 5) 및 공지된 방법에 따라 변형된 알파-L-이두로니다아제(레인 6)의 SDS PAGE 겔이다. 설파아미다아제의 글라이칸 변형 절차에 따라 생성된 1-4로 표기된 4개의 단백질 밴드가 확인되었다(레인 2).
도 2B는 공지된 방법에 따라 변형된(레인 1,3 및 5) 및 본원에 개시된 새로운 방법에 따라 변형된(레인 2, 4, 6, 7 및 8) 설파아미다아제, 이두로니다아제 2-설파타아제 및 알파-L-이두로니다아제의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 3A는 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제의 SEC 크로마토그램(chromatogram)을 나타낸다.
도 3B는 본원에 개시된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 SEC 크로마토그램을 나타낸다. 화살표로 표시된 부분은 변형된 설파아미다아제의 다량체 형태의 피크(peak)이다.
도 4A는 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제의 동적 광산란(dynamic light scattering)에 의해 측정된 산란 강도(intensity)를 나타낸다.
도 4B는 본원에 설명된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 동적 관산란에 의해 측정된 산란 강도를 나타낸다.
도 5는 변형되지 않은 재조합 설파아미다아제, 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제 및 본원에 설명된 새로운 방법 1 및 4에 따라 변형된 설파아미다아제의 MEF-1 세포 내에서의 변형되지 않은 재조합 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 시각화한 도식이다.
도 6A는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg를 격일로 i.v. 투여(13회 투여)한 이후 마우스의 뇌 내에 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 6B는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg를 격일로 i.v.투여(13회 투여)한 이후 마우스의 간 내에 헤파란 설페이트 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 6C는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg 및 10 mg/kg를 각각 일주일에 1회 i.v.투여(10회 투여)한 이후 마우스의 뇌 내에 헤파란 설페이트 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 7은 포유동물 기원의 단백질에 일반적으로 존재하는 3개의 전형적인 N-글라이칸 구조 및 효모 단백질에 존재하는 전형적인 N-글라이칸의 개략도이다. 왼쪽 글라이칸은 올리고만노오스(oligomannose) 유형, 왼쪽에서 2번째는 복합체(complex) 유형, 오른쪽에서 2번째는 하이브리드(hybrid) 유형을 나타낸다. 가장 오른쪽에 있는 것은 효모 단백질의 폴리만노오스(polymannose) 유형이다. 도면 내에는 다음의 화합물이 도시되어 있다: 검정색으로 칠해진 다이아몬드는 N-아세틸뉴라민 산(N-acetylneuraminic acid)에 상응한다; 검정색으로 칠해진 원은 만노오스(mannose)에 상응한다; 사각형은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)에 상응한다; 검정색으로 칠해진 삼각형은 푸코오스(fucose)에 상응한다; 원은 갈락토오스(galactose)에 상응한다. 별표(asterisk)로 표시된 당(sugar) 잔기는 본원에 개시된 퍼아이오데이트(periodate)/보로하이드라이드(borohydride) 처리에 의해 변형될 수 있다.
도 8A는 화학적 변형 이후 만노오스 상에 예측되는 결합 절단을 나타내는 개략도이다.
도 8B는 Man-6 글라이칸의 모델을 나타내는 개략도이다. 퍼아이오데이트에 의한 산화 시 결합 절단될 수 있는 당 잔기가 표시되어 있다. 회색 원은 만노오스에 상응하며, 검정색 사각형은 N-아세틸글루코사민에 상응하며, T13은 N-글라이코실화 부위(N-glycosylation site) N(131)이 포함된 설파아미다아제의 트립틱(tryptic) 펩티드 NITR(서열번호 44)에 상응한다.
도 9는 화학적 변형 이전(A) 및 기존에 공지된 방법에 따른 화학적 변형 이후(B-D), N(131)에 부착된 Man-6 글라이칸을 포함한 설파아미다아제의 트립틱 펩티드 T13(서열번호 44)에 상응하는 이중 차지된 이온의 질량 스펙트럼을 나타낸다(S.= 단일 결합 절단; D. = 이중 결합 절단; 예를 들어, D.x3 = 3개의 이중 결합 절단).
도 10A는 기존에 공지된 방법(검정색 막대), 새로운 방법 1(검정색 점), 새로운 방법 3(흰색), 및 새로운 방법 4(체크무늬)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 이후 트립틱 펩티드 T13+Man-6 글라이칸(서열번호 44)의 결합 절단의 정도를 나타낸 도식이다.
도 10B는 기존에 공지된 방법(검정색 막대), 새로운 방법 1(검정색 점), 새로운 방법 3(흰색), 및 새로운 방법 4(체크무늬)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 이후 트립틱 펩티드 T13+Man-6 글라이칸(서열번호 44)에서의 단일 결합 절단의 상대적인 풍부함(abundance)을 시각화한 도식이다.
도 11은 이두로네이트 2-설파타아제 및 새로운 방법 10 및 11에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 활성을 나타낸 도식이다.

실시예

다음의 실시예는 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제(iduronate 2-sulfatase)에 의해 예시된, 변형된 라이소좀 단백질의 제조를 개시하고 있다.

재료 및 방법

하기의 실시예에 사용된 재조합 알파-L-이두로니다아제는 Aldurazyme®의 의약품이었으며, 반면 재조합 이두로네이트 2-설파타아제는 Elaprase®의 의약품이었다. 양자 모두 약국(Apoteket farmaci, Sweden)에서 구입하였으며, 제조업자의 지시에 따라 보관되었고, 무균 상태에서 처리되었다.

설파아미다아제는 pcDNA3.1(+) 벡터를 이용한 HEK293 세포 및 pQMCF1 벡터를 이용한 QMCF(Quattromed Cell Factory) 에피솜 발현 시스템(Icosagen AS)을 포함한 CHO에서의 일시적 발현을 통해 제조되었다. 설파아미다아제는 20mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0에서 평형화되고 NaCl에 의해 용리된(eluted) Q 세파로오스 컬럼(GE Healthcare)에서 AIEX(anion exchange chromatography)에 의해 배지로부터 포획되었다. 포획된 설파아미다아제는 MEP(4-Mercapto-Ethyl-Pyridine) 크로마토그래피에 의해 추가로 더 정제되었다; 설파아미다아제를 포함한 단편(fraction)들은 MEP 하이퍼셀 크로마토그래피 컬럼에 로드되었고 50 mM NaAc, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 4.6에서 등용매 용리(isocratic clution)에 의해 이어서 용리되었다. 최종 폴리싱(polishing)은 25 mM NaAc, 2 mM DTT, pH 4.5에서 평형화된 SP 세파로오스 FF(GE Healthcare) 컬럼에서 양이온 교환 크로마토그래피(CIEX)에 의해 수행되었다. NaCl 구배(gradient)가 용리에 이용되었다.

실시예 1: 기존에 공지된 방법에 따른 라이소좀 단백질 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제의 화학적 변형

WO 2008/109677에 따른 화학적 변형: 글라이칸 잔기를 변형하기 위해, 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 20 mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 6.5 시간 동안 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에서 초기에 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 4 ℃ 에서 20mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에 대해 하룻밤 동안(over night) 투석을 수행하기 전에 15분 동안 0 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 투석 이후, 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 더하여 최종 농도가 100mM이 되도록 하여 환원이 수행되었다. 환원 반응은 하룻밤 동안 진행되도록 허용되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20mM 나트륨 포스페이트, 137mM NaCl(pH 6.0)에 대하여 투석되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다.

실시예 2: 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트-2-설파타아제의 분석

재료 및 방법

SDS-PAGE 분석: 실시예 1에 설명된 것과 같은 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 효소는 NuPAGE 4-12 % Bis-Tris 겔에 단백질을 로드한 SDS-PAGE 분석의 대상이 되었다. Seeblue 2 plus 마커가 분자량 측정에 사용되었으며 겔은 Instant Blue(C.B.S Scientific)로 염색되었다.

트립틱 단편(tryptic fragment)의 LC/MS에 의한 글라이칸 분석: 실험예 1의 3개의 라이소좀 단백질의 트립틱 단편의 LC/MS에 의해 글라이코실화 패턴이 결정되었다. 글라이코펩티드 분석 전에, 단백질은 환원되고, 알킬화(alkylated)되고 트립신으로 분해되었다. 단백질의 환원은 60 ℃ (알파-L-이두로니다아제의 경우 70 ℃)에서 1시간 동안 50 mM NH₄HCO₃에서 5 μl DTT 10 mM에서 인큐베이션되었다. 순차적인 알킬화가 50 mM NH₄HCO₃ 에서 5 μl 아이오도아세트아미드(iodoacetamide) 55mM으로 RT(room temperature)에서 45분 동안 암실에서 수행되었다. 마지막으로, 트립틱 분해는 50 mM 아세트산에서 50 mM NH₄HCO₃, 5 mM CaCl₂, pH 8, 및 0.2 μg/μl 트립신의 30 μl를 더하여 수행되었다(프로테아제:단백질 비율 1:20(w/w)). 분해는 37 ℃에서 하룻밤 동안 수행되도록 허용되었다.

트립틱 펩티드 단편의 가능한 글라이코실화 변이체는 글라이코펩티드 분석을 이용해 조사되었다. 이것은 Agilent 1200 HPLC 시스템과 Agilent 6510 4중극 비행시간 질량분석기(Q-TOF-MS)를 결합한 LC-MS에 의해 수행되었다. 모든 시스템은 MassHunter Workstation에 의해 조절되었다. 컬럼 온도를 40 ℃로 설정하고, Waters XSELECT CSH 130 C18 컬럼(150 x 2.1 mm)을 사용해 LC 분리를 수행하였다. 이동상(Mobile phase) A는 5 % 아세토니트릴(acetonitrile), 0.1 % 프로피온산(propionic acid), 및 0.02 % TFA로 구성되었으며, 이동상 B는 95% 아세토니트릴, 0.1% 프로피온산 및 0.02% TFA로 구성되었다. 10 분 동안 0 % 내지 10 % B의 구배(gradient), 이어서 또 다른 25 분 동안 10 % 내지 70 % B의 구배가 0.2 mL/분의 유속으로 사용되었다. 주입 부피(injection volume)는 10 μl였다. Q-TOF는 양성 전기스프레이 이온 모드(positive-electrospray ion mode)로 작동되었다. 데이터 수집 과정에서, 프래그멘터(fragmentor) 전압, 스키머(skimmer) 전압, 옥토폴(octopole) RF는 각각 90, 65, 650V로 설정되었다. 질량 범위는 300과 2800 m/z 사이였다.

하기의 분석은 설파아미다아제 제제에 대해서만 수행되었다.

설파아미다아제의 동적 광산란(DLS) 분석: 변형된 설파아미다아제는 RT에서 3분 동안 12000 rpm으로 원심분리되어 내부 가스를 제거하였다. DLS 실험은 각각의 75 μL 의 복제본에 25% 레이저 파워를 이용하여 DynaPro Titan 장치(Wyatt Technology Corp)에서 수행되었다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 설파아미다아제의 분석: 변형된 효소는 AKTAmicro system(GE Healthcare)에서 분석적인 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 완충 제제의 40 μL/min의 유속을 갖는 Superdex 200 PC 3.2/30 컬럼이 사용되었다. 샘플 부피는 10 μL이고 10 μg의 효소를 포함하였다.

설파아미다아제의 겔 내(In-gel) 분해 및 MALDI-TOF MS 분석: SDS-PAGE 분석으로 일부 추가적인 밴드를 발견했으며, 이들을 절단하고, 탈색하고 트립신으로 겔 내 분해 처리하였다. 분해는 37 ℃에서 하룻밤 동안 수행되었다. 상청액은 새로운 튜브에 옮겨지고 RT에서 60 % 아세토니트릴, 0.1% TFA (3x20 min)로 추출되었다. 결과물인 상청액은 Speed Vac에서 거의 건조될 때까지 증발되었다. 증발된 용액은 알파-시아노-4-하이드록시신남산(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 용액과 1:1로 혼합되었고, 0.6 μL이 MALDI 플레이트에 가해졌다. 트립틱 펩티드 단편의 분자량은 Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF MS(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometer)를 사용하여 결정되었다. 분석은3550 레이저 에너지 및 400샷(shot)을 갖는 양이온 이온반사 모드(positive ion reflectron mode)로 수행되었다.

설파아미다아제 활성 부위의 보존: 설파아미다아제의 활성 부위에 대한 화학적 변형의 모든 효과를 LC-MS 및 LC-MS/MS 분석을 사용해 조사하였다. 샘플은 하기에 글리코실화 분석(Glycosylation analysis)섹션에서 설명한 LC-MS 방법에 따라 제조되었다. 시스테인 50 변이체(알킬화된 시스테인 50, 산화된 시스테인 50, FGly50 및 Ser50)를 포함하는 수득되는 트립틱 펩티드는 모두 재구성된 이온 크로마토그램으로부터 피크 영역을 계산하여 반정량화되었다. 펩티드의 동정은 MSMS 시퀀싱을 이용해 확정되었다. MSMS 파라미터는 다음과 같았다: 충돌 에너지는 10, 15, 및 20V, 스캔 범위는 100-1800 m/z, 및 스캔 속도는 1 scan/sec로 설정되었다.

결과

SDS-PAGE 분석에 의해 분명한 것과 같이, 공지된 방법에 따른 화학적 변형의 결과로서, 완전한 길이의(full length) 단백질과 구별되는 크기의 몇몇 주요 펩티드가 형성되었다(도 2A). 낮은 분자량의 펩티드 밴드는, 펩티드 절단 생성물을 나타내며, 설파아미다아제에서 가장 우세하지만 3개의 라이소좀 단백질 모두에서 분명히 나타난다. MALDI-TOF MS 분석에 의해, SDS-PAGE에서 관찰된 #1-4의 4개의 겔 밴드(도 2A, 2레인)는 화학 변형 동안 스트랜드(strand) 절단에 의해 생성된 설파아미다아제 단편으로 확인할 수 있었다. 겔 밴드 #1 및 #2는 6 kDa 및 30kDa의 분자량을 갖는 두 C-말단 절단(truncation)으로, 겔 밴드 #3은 41 kDa N-말단 절단임이 결정되었다.

또한, 공지된 방법에 따른 화학적 변형이 설파아미다아제 상의 몇몇 메티오닌 잔사(residue), 특히 거의 완전히 산화된 메티오닌 184 및 메티오닌 443에서의 산화를 일으킨다는 것이 발견되었다. 메티오닌 226(트립틱 펩티드의 아미노산 잔사 226-238에 상응하는 것으로 발견됨)은 더 낮은 정도로 산화되었으나, 이 산화는 41 kDa N-말단 절단을 유발하는 것과 같이 변형되지 않은 설파아미다아제보다 불안정한 단백질을 야기하는 것으로 나타났다. 따라서, 메티오닌 226의 산화 및 스트랜드 절단은 MS 분석에서 관찰된 것처럼 관련이 있는 것으로 보였다.

특히, 공지된 방법에 따른 화학적 변형의 결과로서 공유 다량체화(covalent multimerisation)를 나타내는 더 높은 분자량의 밴드는 3개의 라이소좀 단백질 모두에서 분명했다. 설파아미다아제에 있어서, 가장 우세한 밴드는 111 kDa 분자량의 이량체로 확인할 수 있다(도 2A, 레인 2, 밴드 #4). 더욱 심각한 다량체화는 알파-L-이두로니다아제에서 관찰되었다(도 2A, 레인 6).

따라서, 공지된 방법(WO 2008/109677)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형은 글라이칸을 변형할 뿐만 아니라 폴리펩티드 스트랜드 절단, 공유 다량체화 및 효소의 구조적 완전성에 중요한 아미노산 잔사의 산화를 생성한다는 것이 발견되었다.

SDS-PAGE 분석은 또한 변형되지 않은 단백질과 비교했을 때 모든 3개의 라이소좀 단백질에서 주요 단량체 밴드의 위치를 공통적으로 낮춘다는 것을 분명히 나타낸다(도 2A 레인 1 대 레인 2; 레인 3 대 레인 4; 레인 5 대 레인 6). 이것은 대략 500-1500 Da의 분자량의 손실을 시사하며, 이중결합 절단에 의해 글라이칸 잔기가 주로 변형되는 화학 반응으로 예상된다(도 8).

SEC에 의한 설파아미다아제의 추가적인 분석은, 도 3A의 크로마토그램에서의 프리-피크(pre-peak)로 증명된 것과 같이, 공지된 방법에 따른 화학적 변형 절차가 설파아미다아제의 응집(aggregation)을 촉진한다는 것을 밝혔다. 크로마토그램 내의 프리-피크의 피크 높이는 주 피크의 높이의 약 3% 정도인 것으로 나타났다. DLS 분석은 또한 동일한 물질이 높은 분자량 형태(즉, 10¹⁰ kDa 이상) 내의 전체 단백질 내용물의 15-20%의 단백질을 포함하고 있다는 것을 밝혔다(도 4A).

또한, LC-MSMS의 사용으로, 환원 단계(도 1A)가 설파아미다아제의 활성 부위 위치 50의 FGly 잔사를 Ser로 환원하는 것이 발견되었다(서열번호 44). 이 위치에서의 Ser은 효율적인 촉매 작용에 적합하지 않다(Recksiek et al, J Biol Chem 273(11):6096-103 (1998)). FGly로부터 생성된 Ser의 상대적인 양은 FGly50 및 Ser50을 포함하는 2개의 트립틱 펩티드 단편에 상응하는 질량 스펙트럼에서 2중으로 하전된(charged) 이온의 피크 영역 측정에 기반하여 계산되었다. 피크 영역은 이온화 효율에 대한 보정 없이 MS 반응에 기반하였다. 하기의 표 2는 공지된 방법에 따른 FGly의 Ser로의 전환은 약 56%임을 나타낸다(실시예 4, 표 3 또한 참고하라).

설파아미다아제의 화학적 변형	Ser 형성 (%)	FGly/Ser 비
없음	0
WO 2008/109677	56.0 ± 0.3 (n=3)	ca 0.79

그와 같이, 상기 언급한 변형에 추가로, 공지된 화학적 변형 절차는, 설파아미다아제의 촉매 활성에 중요한 아미노산의 환원을 유발한다. FGly 잔사는 모든 설파타아제에 존재하며 효소 활성에 중요하다.

트립틱 단편의 LC/MS에 의한 글라이칸 분석은, 화학 변형 이후 분석한 라이소좀 단백질에서 천연적인 글라이칸이 전혀 존재하지 않았다는 것을 확인하였으며, 글라이칸의 완전한 변형을 나타냈다.

실시예 3: 라이소좀 효소 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제, 및 이두로네이트-2-설파타아제의 화학적 변형을 위한 새로운 방법

새로운 방법 1에 따른 화학적 변형: 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 20 mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 암실에서 120분 동안 pH 6.0의 포스페이트 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 50mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 가하기 전에, 15분 동안 6 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0 ℃에서 120분 동안 암실에서 인큐베이션된 후, 수득되는 단백질 제제는 20mM 나트륨 포스페이트, 100mM NaCl, pH 6.0 에 대해 한외 여과되었다. 화학적 변형을 위한 새로운 방법 1은 도 1B에 도시되어 있다.

새로운 방법 2에 따른 화학적 변형: 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 15mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 0.5시간 동안 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl(pH 6.0)내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 96mM의 최종 농도로 ??칭되었다. ??칭은 15분 동안 0 ℃에서 진행되도록 허용되었다. 그리고 나서 나트륨 보로하이드라이드는 최종 농도가 38 mM이 되도록 반응 혼합물에 가해졌으며, 수득되는 혼합물은 0 ℃에서 0.5시간 동안 보관되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에 대해 한외 여과되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다. 화학적 변형을 위한 새로운 방법 2는 도 1C에 도시되어 있다.

새로운 방법 3에 따른 화학적 변형: 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 0.5시간 동안 20mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 96mM의 최종 농도로 ??칭되었다. ??칭은 15분 동안 0 ℃에서 진행되도록 허용되었다. 그리고 나서 나트륨 보로하이드라이드는 최종 농도가 15mM이 되도록 반응 혼합물에 가해졌으며, 수득되는 혼합물은 0 ℃에서 1시간 동안 보관되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에 대해 한외 여과되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다. 화학적 변형을 위한 새로운 방법 3은 도 1D에 도시되어 있다.

다음에 이어지는 새로운 방법의 예시들은 하나의 구체적인 라이소좀 단백질에 대해 측정되고 예시되었다.

새로운 방법 4: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 환원 단계의 나트륨 보로하이드라이드의 농도가 10mM이라는 것을 제외하고 방법 1과 같이 수행되었다.

새로운 방법 5: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 설파아미다아제는 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 암실에서 180분 동안 4.5와 6 사이의 최초 pH를 갖는 아세테이트(acetate) 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 25mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 가하기 전에, 15분 동안 6 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0 ℃에서 암실에서 60분 동안 인큐베이션된 후, 수득되는 설파아미다아제 제제는 10 mM 나트륨 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.4에 대해 한외 여과되었다.

새로운 방법 6: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 설파아미다아제는 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 8℃에서 암실에서 60분 동안 4.5의 최초 pH를 갖는 아세테이트 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 25mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 가하기 전에 15분 동안 6℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0℃에서 암실에서 60분 동안 인큐베이션된 후, 수득되는 설파아미다아제 제제는 10 mM 나트륨 포스페이트, 100mM NaCl, pH 7.4에 대해 한외 여과되었다.

새로운 방법 7: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 설파아미다아제는 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 8 ℃에서 암실에서 60분 동안 4.5의 최초 pH를 갖는 아세테이트 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 25mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드를 가하기 전에 15분 동안 6 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0 ℃에서 암실에서 30분 동안 인큐베이션된 후, 수득되는 설파아미다아제 제제는 10 mM 나트륨 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.4에 대해 한외 여과되었다.

새로운 방법 8: 알파-L-이두로니다아제에 대해 예시되었다. 알파-L-이두로니다아제는 15mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 20분 동안 20mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 96mM의 최종 농도로 ??칭되었다. ??칭은 15분 동안 0 ℃에서 진행되도록 허용되었다. 그리고 나서 나트륨 보로하이드라이드는 최종 농도가 37mM이 되도록 반응 혼합물에 가해졌으며 수득되는 혼합물은 0 ℃에서 1시간 동안 보관되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20mM 나트륨 포스페이트, 137mM NaCl(pH 6.0)에 대해 한외 여과되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다.

새로운 방법 9: 알파-L-이두로니다아제에 대해 예시되었다. 퍼아이오데이트 산화가 산화 단계 동안 보호 리간드로 작용하는 100 μM 4-메틸움벨리페론 이두로나이드(4-methylumbeliferone iduronide)의 존재 하에 수행되었다는 것 한 가지를 제외하고, 반응 조건은 새로운 방법 8에 설명된 것과 같다.

결과

본원의 다른 곳에서 이미 설명한 것과 같이, 나트륨 메타-퍼아이오데이트는 탄수화물의 시스(cis)-글라이콜 그룹을 알데하이드 그룹으로 변환시키는 산화제이며, 반면에 보로하이드라이드는 알데하이드를 더 반응성이 낮은 알코올로 환원시키는 환원제이다. 탄수화물 구조는 그와 같이 비가역적으로 파괴된다.

글라이칸의 화학적 변형을 위한 개선된 방법, 특히 개선된 특성을 갖는 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 절차를 제공하기 위해, 상당한 수의 반응 조건이 측정되었다. 나트륨 메타-퍼아이오데이트에 의한 산화 및 나트륨 보로하이드에 의한 환원 모두가 촉매 활성 및 면역원성 경향에 부정적인 영향을 미치는 특성인 폴리펩티드 변형 및 응집을 도입하였다고 결론내릴 수 있었다.

개선된 화학적 변형 절차를 위한 조건들이 발견되었다(새로운 방법 1-9에 의해 예시되었다). 놀랍게도, 나트륨 메타-퍼아이오데이트 산화 이후 곧바로 이어진 나트륨 보로하이드라이드 환원 단계 및 공지된 방법에 비해 균형이 유지되어 있으며 상당히 낮은/짧은 반응물 농도 및 반응 시간에 의해, 라이소좀 단백질의 구조적 완전성 및 활성이 보유될 수 있었다. 새로운 방법은 완충액 교환 및 라이소좀 단백질의 반응성 알데하이드 중간물질에 대한 긴 노출을 생략한다. 새로운 화학 변형 절차의 예시는 도 1B-1D에 도시되어 있다.

실시예 4: 새로운 방법에 따라 변형된 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제의 분석

실시예 2에 설명된 실험 방법은 새로운 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질을 분석하는 데에 사용되었다.

결과

펩티드 절단 생성물을 나타내는 낮은 분자량의 펩티드 밴드 역시 새로운 방법에 따라 변형된 물질에도 분명했으나 상당히 낮은 수준이었다(도 2B, 레인 1 대 레인 2; 레인 3 대 레인 4; 레인 5 대 레인 6, 7 및 8). 새로운 방법 8에 따라 변형된 알파-L-이두로니다아제에 있어서, 단량체 밴드만이 분명했다(도 2B 레인 7). 중요하게, 활성 부위를 보호하는 리간드(새로운 방법 9, 도 2B 레인 8)은 절차에 적합했으며 그 결과로 SDS-PAGE 분석에 의해 리간드가 생략되었는지 구별할 수 없는 변형된 알파-L-이두로니다아제를 생성하였다(새로운 방법 8).

결론적으로, 변형 방법에 의해 제조된 의약품의 품질 및 안전성을 제한하는, 공정 관련 불순물은, 기존에 공지된 방법에 비교하여 새로운 방법에서 상당히 감소된다.

선택된 트립틱 펩티드 단편의 글라이칸 분석은, 자연적으로 발생하는 글라이칸 구조가 화학적 변형 이후에도 잔류하는 것이 전혀 없거나 일부 사례에서 5% 미만으로 존재한다는 것을 나타냈으며, 이는 글라이칸의 완전한 변형 또는 거의 완전한 변형을 나타낸다.

SEC에 의한 설파아미다아제의 추가적인 분석은 공지된 방법에 의해 변형된 설파아미다아제와 비교하여 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제가 더 적은 응집을 포함했다는 것을 나타냈다. 이것은 높은 분자량 형태가 크로마토그램 내에 프리-피크로 존재하는 도 3의 크로마토그램에 증명되어 있다. 도 3B에서의 프리-피크의 피크 높이는 주 피크의 높이에 대해 0.5%이며, 그와 같이 도 3A의 피크 높이(3%)와 비교하여 감소를 나타낸다. 이것은 또한 새로운 방법 5 및 6에 의해 변형된 설파아미다아제의 경우에도 그러하다(데이터는 나타내지 않음). DLS 분석(도 4B)은 SEC 분석으로부터의 결과를 확인한다: 새로운 방법에 따라 제조된 설파아미다아제는 높은 분자량 형태(10¹⁰ kDa 이상) 내에서 5%의 단백질을 포함한다. 그와 같이 응집된 설파아미다아제의 형성은 새로운 방법에 의해 제한된다.

설파아미다아제는 활성 부위 보존의 정도를 평가하여 추가로 더 연구하였다: 설파아미다아제의 활성 부위에서 위치 50의 FGly로부터 Ser의 환원은 LC-MS/MS로 결정되었으며 FGly 및 Ser을 포함하는 트립틱 펩티드는 양성으로 확인되었다. 펩티드 단편의 상대적인 양은 2중으로 하전된 이온(이온화 효율에 대한 보정이 수행되지 않음)의 재구성된 이온 크로마토그램으로부터 피크 영역 측정을 통해 LC-MS로 분석되었다. 실시예 3에 설명된 화학적 변형을 위한 새로운 방법 4가지로 생성된 샘플들이 제조되었고 2중 또는 3중으로 분석되었다(표3).

설파아미다아제의 화학적 변형	Ser 형성(%)	FGly/Ser 비
없음
새로운 방법 1	45.4±0.9 (n=3)	1.2
새로운 방법 4	11.5±1 (n=3)	7.7
새로운 방법 5	44.1±2 (n=2)	1.2
새로운 방법 6	34.4±2 (n=2)	1.9

활성 부위 FGly의 손실이 새로운 방법에 의해 상당히 제한되었다. WO 2008/109677에 설명된 절차를 사용함으로써 56%로부터(표 2, 실시예 2를 참고하라), 45%, 44%, 및 34%까지(각각 새로운 방법 1, 5, 및 6, 표 3), 설파아미다아제의 글라이칸 변형의 4가지의 새로운 방법은 Ser 형성을 상당히 감소시켰다. 새로운 방법 4의 Ser 형성은 약 11%이었으며, 그와 같이 FGly로부터 Ser으로의 변환은 나트륨 보로하이드라이드 농도에 고도로 의존하였다는 것을 나타낸다.

실시예 5: 수용체 매개된 화학적으로 변형된 라이소좀 단백질의 시험관내 세포내이입(endocytosis)

재료 및 방법

공지된 방법 및 새로운 방법 1 및 4(실시예 1 및 3)에 따라 설파아미다아제는 설명된 것과 같이 제조되고 변형되었다. 세포내이입은 M6P 수용체를 발현하는 MEF-1 섬유아세포(fibroblast)에서 측정되었다. MEF-1 세포들은 75 nM의 설파아미다아제가 보충된 DMEM 배지에서 24시간 동안 인큐베이션되었다. 세포들은 DMEM에서 2회, 그리고 1% TritonX100을 이용한 세포 용해 전에 0.9 % NaCl에서 1회 세척되었다. 용해물 설파아미다아제 활성 및 전체 단백질 내용물이 결정되었으며 용해물 특이적 활성이 계산되었다. 활성은 디에틸바비튜릭 산(diethylbarbituric acid) 14.5 mM, 나트륨 아세테이트 14.5mM, 0.34 %(w/v) NaCl, 및 0.1% BSA 내에서 4-메틸움베리페릴-알파-D-N-설포글루코사미나이드(4-methylumbelliferyl-alpha-D-N-sulphoglucosaminide) 0.25 mM를 기질로 이용하여 형광 강도 460 nm에서 모니터되었다. 전체 단백질 농도는 BSA를 표준으로 하는 BCA 키트(Pierce)를 사용하여 결정되었다. 데이터는 평균+SD(n=4)로 제공된다.

결과

설파아미다아제 활성은 세포내이입 분석에서 측정된 모든 제제에 대한 세포 균질액(cell homogenate)에서 검출될 수 있다. 공지된 방법뿐만 아니라 새로운 방법 1 및 4 에 의해 제조된 변형된 설파아미다아제는 세포 균질액에서 변형되지 않은 재조합 설파아미다아제에서 수득할 수 있는 것의 10% 이하의 특이적 활성을 나타냈다. 처음으로 로드된 후 2일간 설파아미다아제 부재 하에 성장된 세포에 보유된 활성은 모든 제제에서 비교 가능했으며 화학적 변형이 라이소좀 안정성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냈다.

그러므로, 화학적 변형은 M6PR과 같은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 제거의 결과로서 설파아미다아제가 세포 흡수를 덜 일으키게 한다는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 거시적인 수준에서, 이러한 분자 상호작용의 손실은 정맥내 주사로 투여되었을 때 혈장(plasma)으로부터의 클리어런스를 감소시킨다. 단백질의 감소된 제거는 환자에게 덜 빈번한 투여를 허용한다. 유사한 결과가 변형된 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트-2-설파타아제로부터 수득될 수 있다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 6: 새로운 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질, 알파-L 이두로니다아제 및 이두로네이트 2 설파타아제의 생체내 혈장/혈청 클리어런스

재료 및 방법

In life 상(phase):변형되지 않은 및 변형된 라이소좀 단백질 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제에 대해 혈장/혈청(serum) 클리어런스(CL)가 마우스(C57BL/6J) 내에서 조사되었다. 마우스는 꼬리 정맥에 1회 용량을 투여받았다. 투여 이후 24시간까지 상이한 시점(시점 당 3개의 마우스)에서 혈액 샘플을 채취하였고 혈장/혈청이 제조되었다. 라이소좀 효소의 혈장/혈청 수준은 ECL(electrochemiluminescence) 면역분석을 통해 분석되었다. 혈장/혈청 클리어런스는 WinNonlin 소프트웨어 버전 6.3 (Non-compartmental analysis, Phoenix, Pharsight Corp., USA)를 이용하여 계산되었다. 설파아미다아제 및 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제에 대해 투여량은 2 mg/mL에서 제제된 10 mg/kg이었으며 5 mL/kg으로 투여되었다. 이두로네이트 2-설파타아제 및 새로운 방법 2에 따라 변형된 이두로네이트-2-설파타아제에 대해 투여량은 0.2 mg/mL에서 제제된 1 mg/kg이었으며 5 mL/kg으로 투여되었다. 알파-L-이두로니다아제 및 새로운 방법 3에 따라 변형된 알파-L-이두로니다아제에 대해 투여량은 0.6 mg/mL에서 제제된 3 mg/kg이었으며 5 mL/kg으로 투여되었다.

ECL에 의한 설파아미다아제 및 변형된 설파아미다아제의 정량화: 혈장 PK 샘플 내 설파아미다아제 및 변형된 설파아미다아제는 MSD(Meso Scale Discovery) 플랫폼을 사용하여 ECL면역분석을 통해 결정되었다. 스트렙타비딘(Streptavidin) 코팅된 MSD 플레이트는 PBS 내 5% Blocker로 블록되었다. 플레이트를 세척하고 PK 샘플 및 표준의 상이한 희석액을 플레이트에 분포시켰다. 바이오틴화된(biotnylated) 항-설파아미다아제 마우스 단일클론항체 및 Sulfo-Ru-태그된 토끼 항-설파아미다아제 항체의 혼합물이 가해졌으며 플레이트는 RT에서 인큐베이션되었다. 설파아미다아제 및 라벨링된 항체의 복합체는 바이오틴화된 mAB를 통해 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 결합할 것이다. 세척 이후, 결합된 복합체의 양은 판독 완충액(read buffer)을 가하여 결정하였으며, 플레이트는 MSD SI2400 기기에서 판독되었다. 기록된 ECL 카운트는 샘플 내의 설파아미다아제 양에 비례했으며 관련된 설파아미다아제 표준에 대해 측정되었다.

ECL에 의한 알파-L-이두로니다아제 및 변형된 알파-L-이두로니다아제의 정량화: 혈장 내 알파-L-이두로니다아제 및 변형된 알파-L-이두로니다아제 PK 샘플은 MSD(Meso Scale Discovery) 플랫폼을 사용하여 ECL 면역분석을 통해 결정되었다. 96웰 스트렙타비딘 골드 플레이트(#L15SA-1, MesoScaleDiscovery (MSD))의 웰은 PBS(Phosphate buffer saline) 내 1% 생선 젤라틴(Fish Gelatin)으로 블록되었고, 세척 완충액(PBS + 0.05% Tween-20)으로 세척되었으며, 바이오틴화, 친화도 정제된 염소-a-인간 알파-L-이두로니다아제 다클론 항체(BAF2449, R&D)와 함께 인큐베이션되고, 세척 이후 표준의 상이한 희석액 및 샘플 희석액(1% 생선 젤라틴이 포함된 PBS + 0.05% Tween 20 + 1% C57BL6혈청) 내의 PK 샘플이 RT에서 2시간 동안 700rpm 쉐이크(shake)로 인큐베이션되었다. 플레이트는 세척되었고 알파-L-이두로니다아제 특이적 루테니움(Rutenium) (SULFO-TAG, MSD)태그된 염소 다클론 항체(AF2449, R&D)가 가해졌으며 포획된 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제에 결합하는 것이 허용되었다. 플레이트는 세척되었고 2x Read Buffer(MSD)가 가해졌다. 플레이트 내용물은 MSD Sector 2400 Imager 기기를 이용하여 분석되었다. 상기 기기는 플레이트 전극에 전압을 가하며, 형성된 면역 복합체를 통해 전극에 결합한 SULFO-TAG 라벨은 빛을 방출할 것이다. 상기 기기는 방출된 빛의 강도(intensity)를 측정하며 이것은 샘플 내의 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제 양에 비례한다. 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제의 양은 상대적인 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제 표준에 대해 결정된다.

ECL에 의한 이두로네이트-2-설파타아제 및 변형된 이두로네이트-2-설파타아제의 정량화: 혈장 내 이두로네이트 2-설파타아제 및 변형된 이두로네이트 2-설파타아제 PK 샘플은 MSD(Meso Scale Discovery) 플랫폼을 사용하여 ECL 면역분석을 통해 결정되었다. 96웰 스트렙타비딘 골드 플레이트(#L15SA-1, MesoScaleDiscovery (MSD))의 웰은 PBS(Phosphate buffer saline) 내 1% 생선 젤라틴(Fish Gelatin)으로 블록되었고, 세척 완충액(PBS + 0.05% Tween-20)으로 세척되었으며, 바이오틴화, 친화도 정제된 염소-a-인간 이두로네이트 2-설파타아제 다클론 항체(BAF2449, R&D)와 함께 인큐베이션되고, 세척 이후 표준의 상이한 희석액 및 샘플 희석액(1% 생선 젤라틴이 포함된 PBS + 0.05% Tween 20 + 1% C57BL6혈청) 내의 PK 샘플이 RT에서 2시간 동안 700rpm 쉐이크(shake)로 인큐베이션되었다. 플레이트는 세척되었고 이두로네이트-2-설파타아제 특이적 루테니움(Rutenium) (SULFO-TAG, MSD)태그된 염소 다클론 항체(AF2449, R&D)가 가해졌으며 포획된 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제에 결합하는 것이 허용되었다. 플레이트는 세척되었고 2x Read Buffer(MSD)가 가해졌다. 플레이트 내용물은 MSD Sector 2400 Imager 기기를 이용하여 분석되었다. 상기 기기는 플레이트 전극에 전압을 가하며, 형성된 면역 복합체를 통해 전극에 결합한 SULFO-TAG 라벨은 빛을 방출할 것이다. 상기 기기는 방출된 빛의 세기를 측정하며 이것은 샘플 내의 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제 양에 비례한다. 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제의 양은 상대적인 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제 표준에 대해 결정된다.

결과

변형된 설파아미다아제, 이두로네이트 2-설파타아제 및 알파-L-이두로니다아제의 마우스에서의 혈장/혈청 클리어런스는 변형되지 않은 대응물에 비하여 상당히 감소했으며, 하기의 표 4에 나타나 있다. 이것은 아마도 적어도 부분적으로 화학적 변형에 따르는 말초 조직(peripheral tissue)에서의 수용체 매개 흡수의 억제로 인한 것일 수 있다.

라이소좀 단백질 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제의 혈장/혈청 클리어런스

테스트 품목	투여량(mg/kg)	혈장/혈청 CL (mL/(h·kg))
설파아미다아제 (서열번호 44)	10	170
변형된 설파아미다아제 (새로운 방법 1)	10	14
이두로네이트 2-설파타아제 (서열번호 35)	1	60
변형된 이두로네이트 2-설파타아제 (새로운 방법 2)	1	14
알파-L-이두로니다아제 (서열번호 38)	3	130
변형된 알파-L-이두로니다아제 (새로운 방법 3)	3	45

실시예 7: 변형된 설파아미다아제의 뇌 헤파란(heparan) 설페이트 저장에 대한 생체내 효과

재료 및 방법

QMCF(Quattromed Cell Factory) 에피솜 발현 시스템(Icosagen AS)내에서 일반적인 재료 및 방법 섹션에서 설명된 것과 같이 제조된 변형된 설파아미다아제 및 실시예 3의 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 정맥내 주사로의(i.v.) 투여의 뇌 헤파란 설페이트 저장에 대한 생체내 효과가 조사되었다.

테스트 품목 제조: 변형된 설파아미다아제는 6mg/mL로 제제화되었으며, 멸균 여과(sterile filtrate)되었으며, 사용할 때까지 -70 ℃에서 냉동되었다. 냉동된 변형된 설파아미다아제 및 상응하는 비히클(vehicle) 용액은 주사 당일에 사용 전 최소 1시간에서 최대 2시간까지 RT에서 해동되었다. 등장성 식염수에 클로르페니라민(Chlorpheniramine)을 0.5 mg/mL의 농도로 용해시켰으며 -20 ℃에서 보관하였다.

동물: mps3a 유전자, B6.Cg-Sgsh^mps3a/PstJ (MPS IIIA)(Jackson Laboratories, ME, USA)에서 자발적인 동형접합성(homozygous) 돌연변이를 갖는 수컷 마우스가 사용되었다. 동물은 23 ± 1 ℃ 및 40-60 % 습도에서 케이지에 단독으로 수용되었으며, 물 및 표준 실험실 먹이에 자유롭게 접근할 수 있었다. 12/12시간의 빛/어둠 주기는 오후 7시에 밝아지도록 설정되었다. 연구를 시작하기 적어도 2주 전 동물의 상태를 조절하였다. 동일한 육종 단위의 야생형 형제(sibling)도 대조군으로 포함되었다. 연구 A에서 마우스는 23-24주 된 것인 반면 연구 B에서 마우스는 9-10주 된 것이었다.

연구 A의 실험 과정: 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg(n=8) 및 비히클(n=7)이 MPS IIIA 마우스에 25일 동안 격일로 25일간 정맥내 주사로 투여되었다(13회 주사). 변형된 설파아미다아제 또는 비히클의 투여 30-45분 전 클로프레니라민(2.5 mg/kg)을 피하 투여하였다. 투여는 약 아침 07.00에 시작되었다. 테스트 품목 및 비히클은 5 mL/kg로 투여되었다. 최종 투여 부피는 매 투여 시의 실제 체중에 대해 보정되었다. 이러한 설계는 비히클에 대해 반복되었다. 연구는 마지막 주사 2시간 이후에 종결되었다. 처리되지 않은 연령 일치 야생형 마우스(n=5)는 테스트 품목 처리된 그룹에 연결하여 포함시켰다. 이소플루란으로 마우스를 마취시켰다. 안와정맥총(retro-orbital plexus) 혈액 채취 방법으로 혈액을 채취하였다. 관류 후 심장 좌심실을 통해 20 mL 식염수를 내보냈다. 조직을 해부하고(뇌, 간, 비장, 폐 및 심장), 중량을 측정하고 액체 질소로 급격히 냉동시켰다. 조직 및 혈액은 LC-MS/MS를 사용하여 헥소사민 설페이트 [α-1, 4] 우론산(HNS-UA) 수준을 측정하기 위해 준비되었다. HNS-UA는 헤파란 설페이트 저장의 디사카라이드(disaccharide) 마커이며, 그와 같이 HNS-UA 수준의 감소는 헤파란 설페이트의 분해를 나타낸다. HNS-UA 데이터는 상대적 단위 대 내부적 표준으로 계산되었으며, 조직 mg 당으로 표현되었으며 대조군의 평균으로 표준화되었다. 데이터는 일원배치분산분석(one-way ANOVA) 테스트에 의해 분석되었으며, 그룹 간의 유의성 테스트를 위해 Bonferroni의 다중 비교 사후 테스트(post-hoc test)에 의해서도 전반적인 유의성이 증명되었다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

연구 B의 실험 과정: 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg (n=6), 10 mg/kg (n=6) 및 비히클(n=6)이 MPS IIIA마우스에 10주 동안 일주일에 1회 정맥내 주사로 투여되었다(10회 주사). 변형된 설파아미다아제 또는 비히클의 투여 30-45분 전 클로프레니라민(2.5 mg/kg)을 피하투여하였다. 최종 투여 부피는 매 투여 시의 실제 체중에 대해 보정되었다. 이러한 설계는 비히클에 대해 반복되었다. 연구는 마지막 주사 2시간 이후에 종결되었다. 처리되지 않은 연령 일치 야생형 마우스(n=6)는 테스트 품목 처리된 그룹에 연결하여 포함시켰다. 이소플루란으로 마우스를 마취시켰다. 안와정맥총 혈액 채취 방법으로 혈액을 채취하였다. 관류 후 심장 좌심실을 통해 20 mL 식염수를 내보냈다. 조직을 해부하고(뇌, 간, 비장), 중량을 측정하고 액체 질소로 급격히 냉동시켰다. 조직 및 혈액은 LC-MS/MS를 사용하여 HNS-UA 수준을 측정하기 위해 준비되었다. HNS-UA 데이터는 상대적 단위 대 내부적 표준으로 계산되었으며, 조직 mg당으로 표현되었으며 대조군의 평균으로 표준화되었다. 데이터는 일원배치분산분석 테스트에 의해 분석되었으며, 그룹 간의 유의성 테스트를 위해 Bonferroni의 다중 비교 사후 테스트(post-hoc test)에 의해서도 전반적인 유의성이 증명되었다.

조직 샘플 내의 HNS-UA의 LC-MS/MS 분석: Fuller et al (Pediatr Res 56: 733-738 (2004) 및 Ramsay et al (Mol Genet Metab 78:193-204 (2003))에 설명된 방법을 부분적으로 따라 조직 샘플 내의 HNS-UA의 LC-MS/MS 분석이 수행되었다. 기질 완충액(29 mM 디에틸바비튜릭 산, 29 mM 나트륨 아세테이트, 0.68 % (w/v) NaCl, 100 mL 물, pH 6.5)에서 Lysing Matrix D 장치(MP Biomedicals, LLC, Ohio, US)를 사용해 조직(90-180 mg)을 균질화하였다. 균질화는 25초 동안 Savant FastPrep FP120/Bio101 균질기(LabWrench, ON, Canada)에서 수행되었으며 균질액은 이어서 10000 rcf에서 Eppendorf 원심분리기 5417R 내에서 원심분리되었다. 상청액은 거의 건조될 때까지 증발되었다. 150 μL의 유도체화(derivatizing) 용액(250 mM PMP(3 methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one), 400 mM NH3, pH 9.1) 및 5 μL의 내부 표준 콘드로이틴(Chondroitin) 디사카라이드 Δdi-4S 나트륨 (ΔUA-GalNAc4S, 0.1 mg/mL) 저장 용액을 가하였다. 유도체화는 70 ℃에서 90분 동안 교반 하에 수행되었으며, 그리고 나서 용액을 800mM 포름산(formic acid)으로 산성화시켰다. 최종 부피가 500 μL이 되도록 탈이온수를 샘플에 가하였으며, 추출은 과도한 PMP를 제거하기 위해 클로로포름(3x500 μL)으로 수행되었다. 원심분리는 13000 x g에서 5분간 수행되었으며 상부 상(upper phase)을 새로운 바이알에 옮겼다. 포름산 및 NH4COOH의 과량을 제거하기 위해, speed vac(Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY)에서 액체 상을 증발시켰다. 샘플은 총 100 μL의 5% 아세토니트릴/ 0.1% 아세트산/0.02% TFA으로 재구성되었다.

LC-MS/MS 분석은 Sciex API 4000 3중 4중극(triple quadrupole) 질량 분석기와 결합된 Waters UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)에서 수행되었다. 기기 조작, 데이터 수집 및 평가는 Analyst 소프트웨어를 이용하여 이루어졌다.

LC 분리는 Acquity C18 CSH 컬럼(50x2.1 mm, 1.7 μm)을 사용하여 수행되었다. 이동상 A는 5% 아세토니트릴/0.5% 포름산으로 구성되었으며, 이동상 B는 95% 아세토니트릴/0.5% 포름산으로 구성되었다. 7분 동안 1%에서 99% B의 구배가 0.35 mL/min의 유속으로 사용되었다. 주입 부피는 10 μL 였다. API4000은 전기스프레이 음이온 다중 반응 모니터링(MRM) 모드로 작동되었다. 이온 스프레이 전압은 4.5 kV에서 작동되었으며, 공급원 온도는 450 ℃였다. 아르곤이 충돌 가스(collision gas)로 사용되었다. 충돌 에너지는 34V였다. MRM 트랜지션(MRM transition)은 764.4/331.2 (PMP-HNS-UA) 및 788.3/534.3 (PMP-내부적 표준)이었다. HNS-UA의 상대적인 양은 내부적 표준의 수준에 대하여 계산되었다.

결과

도 6A에 나타난 연구 A로부터의 결과는 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 25일 동안 30 mg/kg로 격일로(13회 투여) 반복된 정맥내 주사 투여를 통해 뇌에서의 HNS-UA 수준을 30% 감소시켰다는 것을 나타낸다.

추가로, 변형된 설파아미다아제는 간(도 6B)및 폐(나타내지 않음)에서의 HNS-UA 수준을 완전히 제거시켰다.

도 6C에 나타난 연구 B로부터의 결과는 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제가 10주 동안 30 mg/kg 및 10 mg/kg 일주일에 1회 반복된 정맥내 주사 투여를 통해 뇌에서의 HNS-UA수준을 각각 48% 및 14% 감소시켰다는 것을 나타낸다.

이러한 결과는 그와 같이 본원에 설명된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 단백질이, 장기적인 처리 이후, 말초 장기에서의 HNS-UA 수준을 필수적으로 완전히 감소시킬 뿐만 아니라 뇌에서HNS-UA의 수준을 급격하게 감소시킨다는 것을 증명한다.

실시예 8: 설파아미다아제 변형의 최적화

화학적 변형 공정은 일반적으로 두 개의 파트로 나누어질 수 있으며, 첫 번째 단계는 산화 단계로, 본원에서 이하 R1이라고 표기하며, 두 번째 단계는 환원 단계로, R2로 표기한다. 2 단계를 최적화하하기 위하여 두 단계의 온도, 농도 및 시간의 영향을 조사하는 실험(DoE)의 전체 요소가 설계되었다.

재료 및 방법

QMCF(Quattromed Cell Factory) 에피솜 발현 시스템(Icosagen AS) 내에서 실시예 1에서 설명된 것과 같이 제조된 설파아미다아제는 실시예 3의 새로운 방법 1에 설명된 것과 같이 필수적으로 변형되었으나, 조사의 대상이 된 파라미터는 하기 표 5에 따라 변형되었다. R1의 조사는 실시예 3(새로운 방법 1)에 설명된 것과 동일한 환원 및 파라미터 워크업(work-up)으로 수행되었다. 분석의 종점은 실시예 2에 설명된 글라이칸의 산화의 정도, 및 실시예 5에 설명된, 변형된 단백질의 세포 흡수의 수준이다.

R1 및 R2에서 변형된 파라미터

변수	R1	R2
T (℃)	0, 8, 22	0, 8. 22
t(min)	30, 60, 120	30, 50, 120
c(mol/L)	10, 20, 40	1.2x(R1의 c), 2.5x(R1의 c), 5x(R1의 c)

파라미터의 수 및 선택된 설계 유형에 따라 각 단계마다 10번의 실험을 수행하였으며, 그 결과는 MODDE 10 소프트웨어(Umetrics AB)를 사용해 측정되었다.

추가로, 제2 ??칭 단계의 영향은 R1 파라미터 8 ℃, 60 분 및 20mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트로 제조된 설파아미다아제에 대해 테스트되었다. 2개의 추가적 반응이 DoE 실험과 병행하여 수행되었으며 0.1 M 아세톤을 이용하여 ??칭되거나 6.0 이하의 pH를 수득할 때까지 아세트산이 가해졌다. 최종 워크업은 다른 반응의 설계를 따랐다. 그와 같이 제조된 설파아미다아제는 실시예 2에 설명된 SDS-PAGE 방법을 사용하여 평가되었다.

R2 실험은 R1의 DoE 분석 후 최적인 것으로 발견된 파라미터에 따라 변형된 설파아미다아제로 수행되었다.

결과

R1 결과는 하기 표 6에 요약되어 있다:

추가로, 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제에 대하여 실시예 2에 따라 글라이코실화 분석을 수행하였다. N-글라이코실화 부위 N(21), N(131), N(244), 및 N(393)에서 원래의 N-글라이칸이 잔류하지 않는 것으로 검출되었다.

R1(산화)의 MODDE 평가는 온도는 약 8 ℃, 반응 지속 시간은 약 1시간, 나트륨 메타-퍼아이오데이트의 농도는 약 10 mmol/L이 최적임을 나타냈다. 글라이칸 인식 수용체를 통한 세포 흡수를 새로운 방법 1 수준으로 여전히 제한하는 최저 산화제 농도로부터(자세한 것은 실시예 5를 참고하라) 전체적인 단백질 건강(예를 들어, 구조적 완전성)은 이점을 얻는 것으로 보인다.

R1 반응 시간에 대해 개시된 다양한 조건은 글라이칸 변형의 정도에 있어 중요한 파라미터라고 여겨졌다. 추가로, 퍼아이오데이트 농도는 글라이칸 변형의 정도에 영향을 미칠 수 있다.

R2(환원) 설계는 그와 같이 상기 확인된 R1에 대한 바람직한 파라미터, 다시 말해 설파아미다아제의 산화에 사용된 것을 사용하였다. R2의 결정적인 종점은 변형된 설파아미다아제의 활성에 영향을 미치는 것이 밝혀진(참고: 실시예 2 및 4) FGly 함유량이다. 하기의 표 7은 결과를 나타낸다. FGly50 및 Ser50을 포함하는 펩티드 단편의 상대적인 양은 재구성된 이온 크로마토그램(이온화 효율에 대한 보정이 수행되지 않음)으로부터 피크 영역 측정을 통해 LC-MS로 분석되었다.

R2에 대한 DoE는 Ser 형성은 나트륨 보로하이드의 농도 및 온도에 관련되어 있다는 것을 나타낸다. Ser 형성 및 높은 분자량 형태의 존재를 고려하면, 약 0 ℃의 온도, 약 1 시간 또는 그 미만의 반응 지속 시간, 및 12 mmol/L 이상이고 50 mmol/L 이하인 나트륨 보로하이드라이드의 농도가 R2에 대한 바람직한 조건이다(데이터는 나타내지 않음, 결과는 실시예 3의 새로운 방법 4에 의해 얻어진 것과 유사하다).

환원 단계가 ??칭된 반응에서 제조된 설파아미다아제는 ??칭 없이 제조된 설파아미다아제와 호환 가능하다는 것이 SDS-PAGE(데이터는 나타내지 않음)에서 확인되었다. 이것은 0.1M 아세톤 또는 아세트산의 부가로 pH를 6 아래로 낮춤으로써 ??칭하는 제2 ??칭 단계의 도입은 재료의 품질에 부정적인 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 9: 기존에 공지된 방법에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 후의 글라이칸 구조의 분석

재료 및 방법

공지된 방법에 따른 화학적 변형: 공지된 방법에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형은 실시예 1에 설명된 것과 같이 수행되었다.

글라이코실화 분석: 화학적 변형 이후 설파아미다아제의 글라이칸 구조의 분석은 실시예 2에 설명된 LC-MS 방법에 따라 수행되었다.

실시예 2에 설명된 N 글라이코실화 부위 N(21), N(131), N(244) 및 N(393)를 포함하는 4개의 트립틱 펩티드 단편의 글라이칸 잔기의 수득되는 변형은 LC-MS 분석에 의해 조사되었다.

결과

글라이코실화 분석: (화학적 변형 이전의) 4개의 글라이코실화 부위에서의 글라이코실화의 유형은 주로 N(21) 및 N(393)에서 복합체 글라이칸(complex glycan), N(131) 및 N(244)에서 글라이칸의 올리고만노오스 유형인 것으로 밝혀졌다

화학적 변형 이후, 변형된 글라이칸 구조의 상세한 특성화는 가장 풍부한 화학적으로 변형된 글라이코펩티드에 대해 수행되었다(덜 풍부한 글라이칸은 화학적 변형 이후 증가한 글라이칸의 이종성의 결과로서 감수성(sensitivity)의 상당한 감소로 인하여 검출할 수 없었다). 본 실시예에서, 공지된 방법에 따른 화학적 변형 이후 Man-6 글라이칸에 대한 변형이 조사되었다.

글라이칸의 퍼아이오데이트 처리는 탄수화물 잔기의 2개의 인접한 하이드록시 그룹 사이의 탄소 결합을 절단하며 글라이칸 사슬의 분자량을 변경한다. 도 8A는 화학적 변형 이후 만노오스에서 예측된 결합 절단의 예이다. 도 8B는 나트륨 퍼아이오데이트로 산화시킨 후 일어나는 이론적인 결합 절단을 나타내는 Man-6 글라이칸의 모델을 도시한 것이다.

도 9에는 기존에 공지된 방법에 따라 화학적 변형을 수행하기 전 및 후의 N(131)이 부착되어 있는 Man-6 글라이칸 트립틱 펩티드 NITR(T13+Man-6 glycan)의 질량 스펙트럼이 나타나 있다. 다양한 정도로 결합이 절단된 화학적으로 변형된 글라이코펩티드에 상응하는 이온이 확인되었다. Man-6 글라이칸에 있어서, 이론적으로는 최대 3개의 이중 결합 절단 및 1개의 단일 결합 절단이 가능하다. 공지된 방법에 따른 변형이 수행될 경우, 질량 스펙트럼에서 가장 강한 이온 시그널은 2개의 이중 결합 절단 및 2개의 단일 결합 절단에 상응하는 것임이 밝혀졌으며, 2번째로 가장 강한 이온 시그널은 가능한 결합 절단 중 가장 강한 것으로, 3개의 이중 결합 절단 및 1개의 단일 결합 절단에 상응하는 것이었다. 공지된 방법에 따른 화학적 변형 이후 T13+Man-6 글라이칸에서 발견된 결합 절단의 정도를 시각화한 도식이 도 10A에 나타나 있다(관찰된 이온으로부터의 동위원소 분포로 인해, 결과는 근사값이지만 유사하다). 기존에 공지된 방법에 따라 제조된 화학적으로 변형된 설파아미다아제의 3개의 상이한 배치(batch)를 사용하여 화학적 변형의 재현성을 테스트하였다. 결합 절단의 상이한 정도에 상응하는 이온은 3개의 상이한 배치로부터의 MS 스펙트럼에서 매우 유사한 분포를 보였다.

실시예 10: 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 후의 글라이칸 구조의 분석

새로운 방법 1, 4, 및 5: 새로운 방법에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형은 실시예 3에 설명된 것과 같이 수행되었다.

글라이코실화 분석: 글라이코실화 분석은 실시예 2 에 설명된 LC-MS 방법에 따라 수행되었다. N 글라이코실화 부위 N(21), N(131), N(244) 및 N(393)를 포함하는 4개의 트립틱 펩티드 단편의 글라이칸 잔기의 변형 결과는 LC-MS 분석에 의해 조사되었다.

결과

글라이코실화 분석: 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제의 변형된 글라이칸 프로파일의 상세한 특성화는 가장 풍부한 화학적으로 변형된 글라이코펩티드에 대해 수행되었다. 본 실시예 10에서, 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따른 화학적 변형 이후 Man-6 글라이칸에 대한 변형이 조사되었다.

다양한 정도로 결합이 절단된 화학적으로 변형된 글라이코펩티드 T13+Man-6 글라이칸에 상응하는 이온이 확인되었다. 이론적으로는 최대 3개의 이중 결합 절단 및 1개의 단일 결합 절단이 가능하다(도 8B, 나트륨 퍼아이오데이트로 산화시킨 후 일어나는 이론적인 결합 절단을 나타내는 Man-6 글라이칸의 모델을 참고하라). 새로운 방법 1에 따른 변형이 수행된 경우, 질량 스펙트럼에서 가장 강한 이온 시그널은 1개의 이중 결합 절단 및 3개의 단일 결합 절단에 상응하는 것임이 밝혀졌으며, 2번째로 가장 강한 이온 시그널은 2개의 2중 결합 및 2개의 단일 결합 절단에 상응하는 것이었다. 새로운 방법 3 및 4에 따른 변형이 수행될 경우, Man-6 글리칸의 결합 절단은 단일 결합 분해를 선호하는 쪽으로 더 이동하였다. 화학적 변형 이후 T13+ Man-6 글라이칸의 결합 절단의 정도를 시각화한 도식이 도 10A에 나타나 있다.

화학적으로 변형된 설파아미다아제의 3중(새로운 방법 1) 또는 2중(새로운 방법)을 이용하여 화학적 변형의 재현성을 테스트하였다.

공지된 방법에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제로부터 생성되는 Man-6 글라이칸 변형과 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제에 의한 Man-6 글라이칸 변형을 비교했을 때, 결합 절단의 정도에 있어서 큰 차이가 있었다. 이것은 도 10A에 나타나 있으며, 4가지 방법에 대한 상이한 결합 절단 정도의 분포가 플롯되어 있다(관찰된 이온으로부터의 동위원소 분포로 인해, 결과는 근사값이지만 유사하다).

도 10B는 사용된 방법에 대한 단일 결합 절단의 상대적인 풍부함을 나타낸다. 기존에 공지된 방법은 조사된 Man-6-글라이칸에서 화학적 변형 이후 45%의 단일 결합 절단을 갖는 반면, 새로운 방법 1, 3, 및 4는 각각 70, 80, 및 82%의 단일 결합 절단을 갖는 변형된 설파아미다아제를 제공하였다.

실시예 11: 공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 효소 활성의 분석

재료 및 방법

실시예 1에 설명된 것과 같이 공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 촉매 활성은 기질 4-메틸움벨리페론 이두로나이드-설페이트(4-Methylumbeliferone iduronide-sulphate)와 이두로네이트 2-설파타아제의 제제를 인큐베이션함으로써 평가되었다. 반응 혼합물의 기질 농도는 50 μM이었으며 분석 완충액은 50 mM 나트륨 아세테이트, 0.005% Tween 20, 0.1% BSA, 0.025% Anapoe X-100, 1.5 mM 나트륨 아자이드(azide), pH 5였다. 인큐베이션 이후, 추가적인 데설페이션(desulphation)은 0.4 M 나트륨 포스페이트, 0.2 M 시트레이트(citrate) pH 4.5를 포함하는 정지 완충액의 부가에 의해 억제되었다. 생성물(4-메틸움벨리페론 이두로나이드)를 가수분해하고 4-메틸움벨리페론을 방출하는 이두로네이트 2-설파타아제(분석 농도 0.83 μg/mL)의 2차 24시간 인큐베이션이 수행되었으며, 반응을 0.5M 나트륨 카르보네이트(carbonate), 0.025% Trition X-100, pH 10.7로 ??칭한 후에 460nm 형광으로 모니터하였다.

결과

공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 활성은 변형되지 않은 이두로네이트 2-설파타아제의 활성의 50% 이하였다(결과는 나타내지 않음).

실시예 12: 새로운 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 효소 활성의 분석

재료 및 방법

이두로네이트 2-설파타아제는 새로운 방법 10 및 11에 따라 변형되었으며, 나트륨 보로하이드라이드 반응 혼합물이 0 ℃에서 0.5시간 동안 보관되었다는 차이점을 제외하고는 실시예 3과 동일하다. 새로운 방법 11에서, 0.5 mg/mL 헤파린(heparin)의 존재 하에 퍼아이오데이트 산화가 추가로 수행되었다. 새로운 방법 10 및 11에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 효소 활성은 실시예 11에서 설명된 절차에 따라 결정되었다.

결과

새로운 방법 10 및 11에 따라 제조된 이두로네이트 2-설파타아제는 변형되지 않은 이두로네이트 2-설파타아제의 활성과 유사한 활성을 나타냈다(도 11).

실시예 13: 활성 부위 보호 리간드의 존재 하에서 알파-L-이두로니다아제의 화학적 변형

실시예 3의 새로운 방법 9에 설명된 것과 같이, 상이한 리간드의 존재 하에 산화(단계 a))가 수행되었다. 사용된 리간드는 각각 4-메틸움베리페론 이두로나이드, 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드(5-fluoro-α-l-idopyranosyluronic acid fluoride), 헤파린, 헤파린 설페이트 및 D-사카린 산 1.4-락톤(D-Saccaric acid 1.4-lactone)이다.

효소 활성은 "Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3, and Chester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115"에 설명된 것과 같이 측정되었다.

결과

단계 a)동안 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드가 보호 리간드로 사용된 경우, 보호 리간드 없이, 즉 새로운 방법 8에 따라 단계 a)가 수행된 경우와 비교하여 변형된 알파-L-이두로니다아제에 대하여 52% 낮은 촉매 활성을 수득하였다. 문헌에 공지된 다른 억제제, 예를 들어 D-사카린 산 1.4-락톤이 사용된 경우 변형된 알파-L-이두로니다아제에 대하여 25% 감소된 촉매 활성을 수득하였다. 기질들, 예를 들어 4-MU-이두로나이드, 헤파린 또는 헤파린 설페이트에 대해 촉매 활성의 감소의 유사한 경향성이 기록되었다(데이터는 나타내지 않음).

실시예 14: 겔 매트릭스 상에 고정된 알파-L-이두로니다아제의 화학적 변형

본원에 설명된 것과 같은 변형 방법, 및 특히, 실시예 3의 새로운 방법 3은, 알파-L-이두로니다아제를 겔 매트릭스 상에 고정하여 수행되었다. 20 mM NaCl이 포함된 6.7의 pH를 갖는 20 mM 나트륨 포스페이트 완충액으로 SOURCE™ 15S Strong Cation Exchange 컬럼을 로딩함으로써 알파-L-이두로니다아제를 고정하였다. Aldurazyme은 250μL Source 15S 겔 매트릭스에 1시간 동안 인큐베이션되었다. 그 이후 겔 매트릭스는 부드럽게(gently) 펠렛화되었고 상청액 내의 단백질 농도는 겔 인큐베이션 전의 10% 이하인 것으로 결정되었다. 화학적 변형을 수행하기 1일 전 한 샘플을 냉동장치에 보관하였다. 제2 인큐베이션은 화학적 변형 직전에 이루어졌다.

알파-L-이두로나아제 로딩 이후, 컬럼은 연속적인 방식으로 단계 a)의 용액, 단계 a), 단계 b)의 ??칭, 및 단계 b)의 ??칭으로 평형화되었다. 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제의 용리는 컬럼을 pH 5.6의 100 mM 나트륨 포스페이트 및 700 mM 나트륨 클로라이드를 포함하는 완충액으로 세척함으로써 수행된다.

배치 모드에서 Source 15S에 결합하는 결과

Aldurazyme을 겔 매트릭스에 고정하고 화학적 변형을 수행한 결과 변형된 알파-L-이두로니다아제의 촉매 활성은 변형이 용액 내에서 수행된 경우에 비하여 8% 증가하였다.

실시예 15: 겔 매트릭스에 고정 및 보호 리간드 존재 하에 알파-L-이두로니다아제의 화학적 변형

본원에 설명된 것과 같은 변형 방법, 및 특히, 실시예 3의 새로운 방법 3은, 알파-L-이두로니다아제를 겔 매트릭스 상에 고정하고 리간드의 존재 하에 수행되었다. 사용된 리간드는 각각 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드 및 D-사카린 산 1.4-락톤이었다.

20 mM NaCl이 포함된 6.7의 pH를 갖는 20mM 나트륨 포스페이트 완충액으로 SOURCE™ 15S Strong Cation Exchange 컬럼을 로딩함으로써 알파-L-이두로니다아제를 고정하였다. Aldurazyme은 250μL Source 15S 겔 매트릭스에 1시간 동안 인큐베이션되었다. 그 이후 겔 매트릭스는 부드럽게(gently) 펠렛화되었고 상청액 내의 단백질 농도는 겔 인큐베이션 전의 10% 이하인 것으로 결정되었다. 화학적 변형을 수행하기 1일 전 한 샘플을 냉동장치에 보관하였다. 제2 인큐베이션은 화학적 변형 직전에 이루어졌다. 알파-L-이두로나아제 로딩 이후, 컬럼은 연속적인 방식으로 단계 a)의 용액, 단계 a), 단계b)의 ??칭, 및 단계 b)의 ??칭으로 평형화되었다. 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제의 용리는 컬럼을 pH 5.6의 100 mM 나트륨 포스페이트 및 700 mM 나트륨 클로라이드를 포함하는 완충액으로 세척함으로써 수행된다.

효소 활성은 “Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3, and Chester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115”에 설명된 것과 같이 측정되었다.

결과

활성 부위를 보호하기 위한 억제제의 사용과 더불어 겔 매트릭스에 Aldurazyme의 고정화를 결합한 접근 방법은 Source 15S Strong Cation Exchange 컬럼 상에 고정화와 더불어 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드를 사용한 결과 보호 리간드 없이 용액 내에서 변형이 수행된 경우와 비교하여 변형된 알파-L-이두로니다아제에서 촉매 활성이 37% 증가하는 놀라운 결과를 밝혀냈다. 억제제 D-사카린 산 1.4-락톤을 사용한 경우의 상응하는 결과는 보호 리간드 없이 용액 내에서 변형이 수행된 경우와 비교하여 촉매 활성이 25% 감소하는 것이었다.

실시예 16: 이두로네이트 2-설파타아제 결핍(deficiency) 마우스의 뇌에 대한 변형된 이두로네이트-2-설파타아제의 분포

재료 및 방법

정맥내 주사로(iv) 투여된 실시예 4의 새로운 방법 2에 따라 제조된 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 뇌에서의 생체내 분포가 조사되었다.

테스트 품목 제조: 변형된 이두로네이트 2-설파타아제는 2 mg/mL으로 제제화되었고, 멸균 여과되었으며, 사용될때까지 -70 ℃에서 냉동되었다.

동물: 수컷 마우스 IDS-KO (B6N.Cg-Idstm1Muen/J)(Jackson Laboratories, ME, USA)가 사용되었다. 동물은 23 ± 1 ℃ 및 40-60 % 습도에서 케이지에 단독으로 수용되었으며, 물 및 표준 실험실 먹이에 자유롭게 접근할 수 있었다. 12/12시간의 빛/어둠 주기는 오후 7시에 밝아지도록 설정되었다. 연구를 시작하기 적어도 2주 전 동물의 상태를 조절하였다. 마우스는 꼬리 정맥에 10 mg/kg의 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 정맥내 주사 투여를 받았다. 연구는 마지막 주사 24시간 이후에 종결되었다. 이소플루란으로 마우스를 마취시켰다. 안와정맥총 혈액 채취 방법으로 혈액을 채취하였다. 관류 후 심장 좌심실을 통해 20mL 식염수를 내보냈다. 뇌를 해부하고 중량을 측정하고 액체 질소로 급격히 냉동시켰다. 뇌 균질액을 제조하고 프로토콜에 대한 조정으로서 10mM 납(lead) 아세테이트를 분석 완충액에 가하여 실시예 2에 설명된 방법을 사용하여 활성을 평가하였다.

결과: IDS-KO 마우스의 관류된 뇌 균질액에서 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 활성을 확인할 수 있었다. 사용된 분석 조건 하에서 1.8±0.4 μM/min (n=4)의 평균 활성을 결정하였다.

<110> Swedish Orphan Biovitrum AB <120> MODIFIED LYSOSOMAL PROTEIN AND PRODUCTION THEREOF <130> IPA180344-SE <150> EP 15187877.4 <151> 2015-10-01 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 342 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 1 Cys Tyr Gly Asp Ser Gly Gln Pro Val Asp Trp Phe Val Val Tyr Lys 1 5 10 15 Leu Pro Ala Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ala Ala Gln Arg Gly Leu Gln 20 25 30 Tyr Lys Tyr Leu Asp Glu Ser Ser Gly Gly Trp Arg Asp Gly Arg Ala 35 40 45 Leu Ile Asn Ser Pro Glu Gly Ala Val Gly Arg Ser Leu Gln Pro Leu 50 55 60 Tyr Arg Ser Asn Thr Ser Gln Leu Ala Phe Leu Leu Tyr Asn Asp Gln 65 70 75 80 Pro Pro Gln Pro Ser Lys Ala Gln Asp Ser Ser Met Arg Gly His Thr 85 90 95 Lys Gly Val Leu Leu Leu Asp His Asp Gly Gly Phe Trp Leu Val His 100 105 110 Ser Val Pro Asn Phe Pro Pro Pro Ala Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Trp 115 120 125 Pro His Ser Ala Cys Thr Tyr Gly Gln Thr Leu Leu Cys Val Ser Phe 130 135 140 Pro Phe Ala Gln Phe Ser Lys Met Gly Lys Gln Leu Thr Tyr Thr Tyr 145 150 155 160 Pro Trp Val 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Asp Gln Asp Gly Leu Tyr Glu Lys Leu Lys Thr Glu Leu 465 470 475 <210> 70 <211> 471 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 70 Gly Ala Arg Arg Ala Pro Asp Pro Gly Phe Gln Glu Arg Phe Phe Gln 1 5 10 15 Gln Arg Leu Asp His Phe Asn Phe Glu Arg Phe Gly Asn Lys Thr Phe 20 25 30 Pro Gln Arg Phe Leu Val Ser Asp Arg Phe Trp Val Arg Gly Glu Gly 35 40 45 Pro Ile Phe Phe Tyr Thr Gly Asn Glu Gly Asp Val Trp Ala Phe Ala 50 55 60 Asn Asn Ser Ala Phe Val Ala Glu Leu Ala Ala Glu Arg Gly Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Phe Ala Glu His Arg Tyr Tyr Gly Lys Ser Leu Pro Phe Gly 85 90 95 Ala Gln Ser Thr Gln Arg Gly His Thr Glu Leu Leu Thr Val Glu Gln 100 105 110 Ala Leu Ala Asp Phe Ala Glu Leu Leu Arg Ala Leu Arg Arg Asp Leu 115 120 125 Gly Ala Gln Asp Ala Pro Ala Ile Ala Phe Gly Gly Ser Tyr Gly Gly 130 135 140 Met Leu Ser Ala Tyr Leu Arg Met Lys Tyr Pro His Leu Val Ala Gly 145 150 155 160 Ala Leu Ala Ala Ser Ala Pro Val Leu Ala Val Ala Gly Leu Gly Asp 165 170 175 Ser Asn Gln Phe Phe Arg Asp Val Thr Ala Asp Phe Glu 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Thr 115 120 125 Ser Met Arg Ser Asn Leu Tyr Arg Ile Cys Tyr Ser Pro Trp Gly Gln 130 135 140 Glu Phe Ser Ile Cys Asn Tyr Trp His Asp Pro His His Asp Asp Leu 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Ala Ser Ser Phe Leu Ala Leu Ile Asn Gly Glu Arg Asp 165 170 175 His Pro Asn Ala Thr Val Trp Arg Lys Asn Phe Leu Arg Val Gly His 180 185 190 Leu Val Leu Ile Gly Gly Pro Asp Asp Gly Val Ile Thr Pro Trp Gln 195 200 205 Ser Ser Phe Phe Gly Phe Tyr Asp Ala Asn Glu Thr Val Leu Glu Met 210 215 220 Glu Glu Gln Leu Val Tyr Leu Arg Asp Ser Phe Gly Leu Lys Thr Leu 225 230 235 240 Leu Ala Arg Gly Ala Ile Val Arg Cys Pro Met Ala Gly Ile Ser His 245 250 255 Thr Ala Trp His Ser Asn Arg Thr Leu Tyr Glu Thr Cys Ile Glu Pro 260 265 270 Trp Leu Ser 275 <210> 72 <211> 508 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 72 Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu 1 5 10 15 Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr 20 25 30 Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu 35 40 45 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Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Lys 260 265 270 Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val 275 280 285 Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val 290 295 300 Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu 305 310 315 320 Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu 325 330 335 Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe Gly 340 345 350 Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu Pro Asp 355 360 365 Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr Lys Val Leu 370 375 380 Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg Val Tyr Leu 385 390 395 400 His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly Asp Leu Thr 405 410 415 Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu Arg Leu Pro 420 425 430 Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu 435 440 445 Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu Thr 450 455 460 Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro 465 470 475 480 Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe 485 490 495 Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile 500 505 <210> 73 <211> 452 <212> PRT <213> HOMO SAPIENS <400> 73 Lys Ala Ile Cys Lys Asn Gly Ile Ser Lys Arg Thr Phe Glu Glu Ile 1 5 10 15 Lys Glu Glu Ile Ala Ser Cys Gly Asp Val Ala Lys Ala Ile Ile Asn 20 25 30 Leu Ala Val Tyr Gly Lys Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Glu Arg Leu Ala 35 40 45 Leu Leu Val Asp Thr Val Gly Pro Arg Leu Ser Gly Ser Lys Asn Leu 50 55 60 Glu Lys Ala Ile Gln Ile Met Tyr Gln Asn Leu Gln Gln Asp Gly Leu 65 70 75 80 Glu Lys Val His Leu Glu Pro Val Arg Ile Pro His Trp Glu Arg Gly 85 90 95 Glu Glu Ser Ala Val Met Leu Glu Pro Arg Ile His Lys Ile Ala Ile 100 105 110 Leu Gly Leu Gly Ser Ser Ile Gly Thr Pro Pro Glu Gly Ile Thr Ala 115 120 125 Glu Val Leu Val Val Thr Ser Phe Asp Glu Leu Gln Arg Arg Ala Ser 130 135 140 Glu Ala Arg Gly Lys Ile Val Val Tyr Asn Gln Pro Tyr Ile Asn Tyr 145 150 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Glu Lys Phe Gly Asp Ser Phe Val Phe Glu Gly Met 115 120 125 Leu Ser Glu Gln Val Lys Thr Asn Ile Gln Gln Ala Val Ala Ala Ala 130 135 140 Pro Trp Trp Leu Pro Val Lys Gly Ala Asn Trp Arg His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Pro Asp Ser Thr Ile Leu His Arg Pro Asp His Pro Val Leu His Val 165 170 175 Ser Trp Asn Asp Ala Val Ala Tyr Cys Thr Trp Ala Gly Lys Arg Leu 180 185 190 Pro Thr Glu Ala Glu Trp Glu Tyr Ser Cys Arg Gly Gly Leu His Asn 195 200 205 Arg Leu Phe Pro Trp Gly Asn Lys Leu Gln Pro Lys Gly Gln His Tyr 210 215 220 Ala Asn Ile Trp Gln Gly Glu Phe Pro Val Thr Asn Thr Gly Glu Asp 225 230 235 240 Gly Phe Gln Gly Thr Ala Pro Val Asp Ala Phe Pro Pro Asn Gly Tyr 245 250 255 Gly Leu Tyr Asn Ile Val Gly Asn Ala Trp Glu Trp Thr Ser Asp Trp 260 265 270 Trp Thr Val His His Ser Val Glu Glu Thr Leu Asn Pro Lys Gly Pro 275 280 285 Pro Ser Gly Lys Asp Arg Val Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Met Cys His 290 295 300 Arg Ser Tyr Cys Tyr Arg Tyr Arg Cys Ala Ala Arg Ser Gln Asn Thr 305 310 315 320 Pro Asp Ser Ser Ala Ser Asn Leu Gly Phe Arg Cys Ala Ala Asp Arg 325 330 335 Leu Pro Thr Met Asp 340

Claims

a) 글라이코실화된(glycosylated) 라이소좀 단백질(lysosomal protein)과 알칼리 금속 퍼아이오데이트(periodate)를 4시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계; 및
b) 상기 라이소좀 단백질과 알칼리 금속 보로하이드라이드(borohydride)를 2시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써,
상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기(glycan moietiy)를 변형시키고, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키며 , 단 상기 단백질은 설파아미다아제(sulfamidase)가 아닌 것인,
변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 b)는 예를 들어 적어도 2가지, 예를 들어 적어도 i) 내지 iv) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는 것인, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드(sodium borohydride)인 것;
ii) 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 3배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5배 내지 4배의 농도로 사용되는 것.
iii) 상기 반응은 2시간 이하, 예를 들어 1.5시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 0.75시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
iv) 상기 반응은 0 과 8℃ 사이의 온도에서 수행되는 것.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 a) 는 예를 들어 적어도 2가지, 예를 들어 적어도 3가지, 예를 들어 적어도 4가지, 예를 들어 적어도 i) 내지 v) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트(sodium meta-periodate)인 것;
ii) 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하의 농도, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 10mM로 사용되는 것;
iii) 상기 반응은 0 과 22 ℃ 사이, 예를 들어 0-8 ℃, 예를 들어 0-4 ℃, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행되는 것;
iv) 상기 반응은 3시간 이하, 예를 들어 2시간, 예를 들어 1시간, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
v) 상기 반응 단계 a)는 3-7의 pH에서 수행되는 것.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)는 3시간 이하의 시간 동안 수행되고, 단계 b)는 1시간 이하의 시간 동안 수행되고, 상기 보로하이드라이드는 선택적으로 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하로 사용되는 것인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a) 및 단계 b)는 어떠한 투석(dialysis), 한외 여과(ultrafiltration), 침전(precitipitation) 또는 완충액 교환(buffer exchange)도 수행하지 않고 순서대로 수행되는 것인, 방법.
a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 반응시키는 단계, 및
b) 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드와 반응시키는 단계를 포함함으로써 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키며, 상기 라이소좀 단백질의 상기 활성 부위 또는 기능성 에피토프는 단계 a)및 b) 중 적어도 하나 동안 산화 및/또는 환원 반응에 접근 불가능하도록 만들어지는 것인,
변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 단계 b)는 예를 들어 적어도 2가지, 예를 들어 i) 내지 iv) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는 것인, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드인 것;
ii) 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 3배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5배 내지 4배의 농도로 사용되는 것;
iii) 상기 반응은 2시간 이하, 예를 들어 1.5시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 0.75시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
iv) 상기 반응은 0 내지 8 ℃의 온도에서 수행되는 것.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 a) 단계는 예를 들어 적어도 2 가지, 예를 들어 적어도 3 가지, 예를 들어 적어도 4 가지, 예를 들어 적어도 i) 내지 v) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트인 것;
ii) 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 농도로 사용되는 것;
iii) 상기 반응은 0과 22 ℃ 사이, 예를 들어 0-8 ℃, 예를 들어 0-4 ℃, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행되는 것;
iv) 상기 반응은 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
v) 상기 단계 a)의 반응은 3-7의 pH에서 수행되는 것.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)는 3시간 이하의 시간 동안 수행되고, 상기 단계 b)는 1시간 이하 동안 수행되고, 상기 보로하이드라이드는 선택적으로 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하로 사용되는 것인, 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a) 및 단계 b) 는 어떠한 투석, 한외 여과, 침전 또는 완충액 교환도 수행하지 않고 순서대로 수행되는 것인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 설파타아제(sulfatase); 글라이코시드 하이드로레이즈(glycoside hydrolase), 또는 프로타아제(protease)인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서 상기 라이소좀 단백질은, 데옥시리보뉴클레아제-2-알파(deoxyribonuclease-2-alpha); 베타-만노시다아제(beta-mannosidase); 리보뉴클레아제 T2(ribonuclease T2); 라이소좀 알파-만노시다아제(lysosomal alpha-mannosidase); 알파 L-이두로니다아제(alpha L-iduronidase); 트리펩티딜-펩티다아제 1 (tripeptidyl-peptidase 1); 히알루로니다아제-3(hyaluronidase-3); 카텝신 L2 (cathepsin L2); 세로이드 지질갈색소증 신경원성 단백질(ceroid-lipofuscinosis neuronal protein) 5; 글루코실세라미다아제(glucosylceramidase); 조직 알파-L-푸코시다아제(tissue alpha-L-fucosidase); 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase); 알파-갈락토시다아제 A(alpha-galactosidase A); 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파(beta-hexosaminidase subunit alpha); 카텝신 D; 프로사포신(prosaposin); 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 카텝신 L1; 카텝신 B; 베타-글루쿠로니다아제(beta-glucuronidase); 프로-카텝신 H(pro-cathepsin H); 비분비성(non-secretory) 리보뉴클레아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제 (glucosidase); 라이소좀 보호 단백질(lysosomal protective protein); 감마-인터페론-유도성 라이소좀 티올 리덕타아제(gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase); 타르트레이트-내성 산성 포스파타아제 유형 5(tartrate-resistant acid phosphatase type 5); 아릴설파타아제 A(arylsulfatase A); 전립선 산(prostatic acid) 포스파타아제; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제(N-acetylglucosamine-6-sulfatase); 아릴설파타아제 B (arylsulfatase B); 베타-갈락토시다아제; 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제(alpha-N-acetylgalactosaminidase); 스핑고미엘린 포스포디에스테라아제(sphingomyelin phosphodiesterase); 강글리오시드 GM2 (ganglioside GM2) 활성제 (activator); N(4)-(베타-N-아세틸글루코사미닐)-L-아스파라기나아제(N(4)-(beta-N-acetylglucosaminyl)-L-asparaginase); 이두로네이트 2-설파타아제 (iduronate 2-sulfatase); 카텝신 S; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제(N-acetylgalactosamine-6-sulfatase); 라이소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 (lipase/cholesteryl ester) 하이드로레이즈; 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase); 카텝신 O; 카텝신 K; 팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1(palmitoyl-protein thioesterase 1); 아릴설파타아제 D(arylsulfatase D); 디펩티딜(dipeptidyl) 펩티다아제 1; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제(alpha-N-acetylglucosaminidase); 갈락토세레브로시다아제(galactocerebrosidase); 정소상체(epididymal) 분비 단백질 E1; 디-N-아세틸키토비아제(di-N-acetylchitobiase); N-아실에탄올아민-가수분해 산 아미다아제(N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase); 히알루로니다아제-1; 키토트리오시다아제-1(chitotriosidase-1); 산 세라미다아제(acid ceramidase); 포스포리파아제 B-유사체 1(phospholipase B-like 1); 전구단백질 전환효소(proprotein convertase) 섭틸리신/켁신 유형 9 (subtilisin/kexin type 9); 그룹 XV 포스포리파아제 A2; 추정(putative) 포스포리파아제 B-유사체 2; 데옥시리보뉴클레아제-2-베타; 감마-글루타밀 하이드로레이즈(gamma-glutamyl hydrolase); 아릴설파타아제 G; L-아미노산 옥시다아제; 시알리다아제-1(sialidase-1); 레구마인(legumain); 시알레이트 O-아세틸에스테라아제(sialate O-acetylesterase); 흉선-특이적(thymus-specific) 세린(serine) 프로타아제; 카텝신 Z; 카텝신 F; 프레닐시스테인(prenylcysteine) 옥시다아제 1; 디펩티딜 펩티다아제 2; 라이소좀 티오에스라아제 PPT2; 헤파라나아제(heparanase); 카르복시펩티다아제 Q; β-글루쿠로니다아제, 및 설파타아제-변형 인자 1(sulfatase-modifying factor 1)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 a) 및 b)단계의 적어도 하나는 보호 리간드의 존재 하에 수행되는 것인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계 a) 및 b) 는 라이소좀 단백질이 수지(resin) 상에 고정화되어 있는 동안 수행되는 것인, 방법.
라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 50% 이하의 글라이칸 잔기가 변형되지 않은 상태로 존재함으로써, 상기 단백질은 글라이칸 인식 수용체에 대한 감소된 활성을 가지며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, TPP1(tripeptidyl peptidase 1) 또는 알파 L-이두로니다아제가 아닌 것을 특징으로 하는, 감소된 함량의 변형되지 않은 글라이칸 잔기를 갖는 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
제 15항에 있어서, 상기 단백질은 데옥시리보뉴클레아제-2-알파; 베타-만노시다아제; 리보뉴클레아제 T2; 라이소좀 알파-만노시다아제; 히알루로니다아제-3; 카텝신 L2; 세로이드 지질갈색소증 신경원성 단백질 5; 글루코실세라미다아제; 조직 알파-L-푸코시다아제; 미엘로퍼옥시다아제; 알파-갈락토시다아제 A; 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파; 카텝신 D; 프로사포신; 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 카텝신 L1; 카텝신 B; 프로-카텝신 H; 비분비성 리보뉴클레아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제; 라이소좀 보호 단백질; 감마-인터페론-유도성 라이소좀 티올 리덕타아제; 타르트레이트-내성 산성 포스파타아제 유형 5; 아릴설파타아제 A; 전립선 산 포스파타아제; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제; 아릴설파타아제 B; 베타-갈락토시다아제; 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제; 스핑고미엘린 포스포디에스테라아제; 강글리오시드 GM2 활성제; N(4)-(베타-N-아세틸글루코사미닐)-L-아스파라기나아제; 이두로네이트 2-설파타아제; 카텝신 S; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제; 라이소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 하이드로레이즈; 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제; 카텝신 O; 카텝신 K; 팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1; 아릴설파타아제 D; 디펩티딜 펩티다아제 1; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제; 갈락토세레브로시다아제; 정소상체 분비 단백질 E1; 디-N-아세틸키토비아제; N-아실에탄올아민-가수분해 산 아미다아제; 히알루로니다아제-1; 키토트리오시다아제-1; 산 세라미다아제; 포스포리파아제 B-유사체 1; 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 유형 9; 그룹 XV 포스포리파아제 A2; 추정 포스포리파아제 B-유사체 2; 데옥시리보뉴클레아제-2-베타; 감마-글루타밀 하이드로레이즈; 아릴설파타아제 G; L-아미노산 옥시다아제; 시알리다아제-1; 레구마인; 시알레이트 O-아세틸에스터라아제; 카텝신 Z; 카텝신 F; 프레닐시스테인 옥시다아제 1; 디펩티딜 펩티다아제 2; 라이소좀 티오에스테라아제 PPT2; 헤파라나아제; 카르복시펩티다아제 Q, 및 설파타아제-변형 인자 1 로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여, 상기 글라이칸 잔기의 45% 이하가 변형되지 않은 상태로 존재하며, 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 예를 들어 40% 이하, 35% 이하, 30%이하, 35% 이하, 30%이하, 25%이하, 20%이하, 15%이하, 10%이하, 5%이하, 1% 이하가 상기 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태로부터 잔류하는 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 글라이칸 잔기는 단일 결합 분해 및 이중 결합 분해에 의해 파괴되고, 단일 결합 분해의 상기 정도가 올리고만노오스(oligomannose) 글라이칸에서 적어도 60%인 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위에 상기 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 적어도 1개가 존재하지 않고, 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위 중의 예를 들어 적어도 2개, 예를 들어 적어도 3개, 예를 들어 적어도 4개, 예를 들어 적어도 5개, 예를 들어 적어도 6개, 예를 들어 적어도 7개, 예를 들어 적어도 8개, 예를 들어 적어도 9개, 예를 들어 적어도 10개, 예를 들어 적어도 11개, 예를 들어 적어도 12개, 예를 들어 적어도 13개가 존재하지 않으며, 바람직하게는 상기 에피토프는 모든 N-글라이코실화 부위에 존재하지 않는 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질은 보유된 촉매 활성, 예를 들어, 상기 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 촉매 활성의 적어도 50%의 보유된 촉매 활성을 갖는, 변형된 라이소좀 단백질.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질로서, 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법에서 사용하는 변형된 라이소좀 단백질.
제22항에 있어서, 라이소좀 저장병(lysosomal storage disease)에 걸린 포유동물을 치료하기 위한, 변형된 라이소좀 단백질.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따르는 변형된 라이소좀 단백질의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 라이소좀 저장병에 걸린 포유동물을 치료하는, 방법.