KR20180055888A - 변형된 라이소좀 단백질 및 그의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
변형된 라이소좀 단백질, 변형된 라이소좀 단백질의 제조방법 및 그러한 변형된 단백질의 치료 용도가 본원에 개시되어 있다. 라이소좀 저장병에 걸린 포유 동물을 치료하는 방법이 본원에 추가로 더 개시되어 있다. 구체적으로, 본 발명은 변형된 라이소좀 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트(periodate)와 반응시키고, 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드(borohydride)와 2시간 이하의 시간 동안 반응시켜, 그로써 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키는 것을 포함한다.
Description
본 개시내용은 변형된 라이소좀 단백질, 변형된 라이소좀 단백질을 포함하는 조성물 및 변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 예를 들어 라이소좀 저장병(lysosomal storage disease)의 치료와 같이 변형된 라이소좀 단백질의 치료법에서의 용도가 개시되어 있다.
배경 기술
라이소좀 저장병(lysosomal storage disease)
라이소좀 세포 소기관은 세포의 폐기 물질을 분해하는 이화작용 기관으로 기능한다. 라이소좀에 특이적으로 구획화된(compartmentalized) 다수의 하이드로레이즈(hydrolase) 및 트랜스포터(transporter)에 의해 분해가 이루어진다. 오늘날, 라이소좀 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이와 질병 사이에 연관성이 확립된 40종 이상의 확인된 유전 질환들이 존재한다. 이 질병들은 LSD(lysosomal storage disease)로 정의되며, 불충분한 분해 능력으로 인해 분해될 수 없는 대사 산물 (또는 대사 산물들)의 축적을 특징으로 한다. 대사 산물의 과도한 라이소좀 저장의 결과로서, 라이소좀의 크기가 증가한다. 축적된 저장 물질이 병리를 어떻게 유발하는지는 완전히 이해되지 않으나 자식 작용(autophagy) 및 세포 아폽토시스(apoptosis)의 유도의 억제와 같은 메커니즘을 포함할 수 있다(Cox & Cachon-Gonzalez, J Pathol 226: 241-254 (2012)).
효소/단백질 대체 치료법
돌연변이된 또는 손실된 단백질에 의해 유발되는 기능 손실은 돌연변이된/손실된 단백질을 이종(heterologous) 공급원으로부터 온 단백질을 투여 및 그와 같이 대체함으로써 복구될 수 있다. 이것은 다양한 질병 영역에서 나타나 왔다. 혈우병(hemophilia) 분야에서, 응고(coagulation) 경로의 활성화 복합체의 일부인 효소 양자 모두, 예를 들어, 인자 Ⅸ 및 인자 Ⅶ, 및 단백질, 예를 들어 인자 Ⅷ의 투여는 성공적으로 사용되었다. 이러한 구성요소들은 당연히 혈액 내에 존재하며, 따라서 이의 작용 부위에 단백질을 투여하는 것은 용이하다.
라이소좀 저장병(lysosomal storage disease) 분야에서, 저장은 이종 공급원으로부터 라이소좀 효소를 투여함으로써 감소될 수 있다. 라이소좀 효소의 정맥내 투여는 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)으로 불리는 메커니즘을 통해 세포에 의한 그것의 빠른 흡수로 이어진다는 것이 잘 알려져 있다. 이 세포내이입은 세포 표면의 수용체에 의해 매개되며, 특히 2개의 M6PR(mannose-6 phosphate receptor)이 특정 라이소좀 효소의 흡수에 중추적 역할을 하는 것으로 나타났다(Neufeld; Birth Defects Orig Artic Ser 16: 77-84 (1980)). M6PR은 라이소좀 단백질의 특징인 인산화된 올리고만노오스(oligomannose) 글라이칸(glycan)을 인식한다.
수용체 매개 세포내이입의 원리에 기반하여, ERT(enzyme replacement therapy)가 오늘날 7개의 LSD(Gaucher, Fabrys, Pompe 및 Mucopolysaccharidosis 유형 I, II, IVA 및 VI)에 이용 가능하다. 이러한 치료법은 다양한 말초 기관에서의 라이소좀 저장을 감소시키고 그로써 병리와 관련된 일부 증상을 개선하는 데에 효과적이다. Elaprase® 및 Aldurazyme®은 헌터 증후군(Hunter syndrome) 환자의 장기 치료(Mucopolysaccharidosis II, MPSII) 및 헐러(Hurler)/샤이에(Scheie) 증후군 환자의 비-신경적 증상을 위한(Mucopolysaccharidosis I, MPS I) 희귀 의약품(orphan medicinal product)의 예시이다. 두 효소 모두 필수적으로 GAG(glycosaminoglycan)인 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate) 및 헤파란(heparan) 설페이트의 가수분해에 의해 라이소좀 저장을 감소시키는 기능을 한다. 이들 효소 중 어느 하나의 감소되거나 결핍된 활성은 이들 GAG의 세포내 축적으로 이어지며, 이것은 다수의 장기 및 조직 침입을 포함하는 진행성 및 임상적으로 이질적인 장애를 유발한다.
LSD의 대부분은 그러나 CNS(central nervous system) 내에 라이소좀 저장의 증강을 유발하여 결과적으로 CNS 관련 징후 및 증상의 레파토리를 나타낸다. 정맥내 주사로 투여된 ERT의 주요 결점은 CNS로의 불량한 분포이다. CNS는 CNS 내피(endothelium)에 의해 형성된 BBB(blood brain barrier)에 의해 혈액 매개 화합물에 대한 노출으로부터 보호된다. BBB의 내피 세포는 세포 사이 통로(paracellular passage)를 막는 밀착 연접(tight junction)을 나타내며, 제한된 수동적 세포내이입을 보이며 추가로 다른 조직에서 볼 수 있는 수용체 매개 트랜스사이토시스(transcytosis) 능력이 결핍된다. 특히, 마우스에서 BBB를 관통하는 M6PR 매개 운반은 출생 후 2주까지만 관찰된다(Urayama et al, Mol Ther 16: 1261-1266 (2008)).
LSD의 신경적 구성 요소 외에도, 말초 병리는 또한 현재의 효소 대체 치료법에서 어느 정도 차선책으로 언급된다. 환자는 빈번하게 임상적으로 관절 통증 및 뻣뻣함을 나타내어 움직임의 심각한 제한으로 이어지는 관절증으로 고통받는다. 또한, 흉곽 골격의 점차적인 변화는 호흡 제한을 유발할 수 있다.
심장의 벽과 함께 심장 판막이 두꺼워지도록 하는 우세한 저장은 심장 기능의 점차적인 감소로 이어질 수 있다. 또한, 폐 기능은 효소 대체 치료법에도 불구하고 추가로 더 퇴행할 수 있다.
라이소좀 효소의 글라이코실화(Glycosylation)
일반적으로, N-글라이코실화는 Asn-X-Ser/Thr 서열 모티프(motif)에서 일어날 수 있다. 망막 내강 내에서 N-글라이칸의 초기 코어 구조가 글라이코실트랜스퍼라아제 올리고사카릴트랜스퍼라아제(glycosyltransferase oligosaccharyltransferase)에 의해 이 모티프에 전달된다. 모든 N-연결된 글라이칸의 이러한 공통적인 기반은 14개의 잔사로 이루어져 있다; 3개의 글루코오스(glucose), 9개의 만노오스(mannose), 및 2 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine). 이 전구체는 그리고 나서 초기 코어를 줄이고 새로운 당 잔기를 더하는 여러 개의 효소의 작용에 의해 N-글라이칸의 3개의 일반적인 유형으로 전환된다; 올리고만노오스, 복합체(complex) 및 하이브리드(hybrid) (도 7). 성숙한 N-글라이칸 각각은 공통 코어 Man(Man)2-GlcNAc-GlcNAc-Asn을 포함하며, 상기 Asn은 단백질에 부착되는 지점을 나타낸다. 효모에서, 올리고만노오스 글라이칸은 도 7의 가장 오른쪽에 도시된 반복적인 방식으로 최대 200개의 만노오스 잔기를 포함하도록 확장될 수 있다(Dean, Biochimica et Biophysica Acta 1426:309-322 (1999)).
또한, 라이소좀에 전달되는 단백질들은 인산화되는 하나 또는 그 이상의 N-글라이칸을 가지고 있다. 인산화는 골지(Golgi)에서 일어나며 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트(N-acetylglucosamine-1-phosphate)를 올리고만노오스 유형 N-글라이칸의 만노오스 잔사의 C-6에 더함으로써 개시된다. N-아세틸글루코사민은 절단되어 M6PR에 의해 인식되고 라이소좀 단백질의 라이소좀으로의 운반을 개시할 M6P(Mannose-6-phospate) 잔사를 생성한다. 수득되는 N-글라이칸은 그리고 나서 M6P가 N-글라이칸 사슬의 말단 그룹인 지점으로 절단된다(Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al, editors. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009.).
당 잔기 및 포스페이트 그룹 양자 모두가 수용체의 결합에 관여하기 때문에 M6PR의 결합 부위는 완전한 말단 M6P 그룹을 필요로 한다(Kim et al, Curr Opin Struct Biol 19(5):534-42 (2009)).
글라이칸 변형에 의한 뇌를 타겟으로 하는 효소 대체 치료법
CNS에서의 라이소좀 효소의 분포를 증가시키는 잠재적인 전략이 WO 2008/109677에 개시되어 있다. 상기 공개된 출원에서, 나트륨 메타-퍼아이오데이트(sodium meta-periodate) 및 나트륨 보로하이드라이드(sodium borohydride)를 이용한 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)의 화학적 변형이 설명되어 있다(Grubb et al, Proc Natl Acad Sci USA 105: 2616-2621 (2008) 또한 참고하라). 20mM 나트륨 퍼아이오데이트로 6.5시간 동안 산화, 이어서 ??칭(quenching), 투석(dialysis) 및 100mM 나트륨 보로하이드라이드로 하룻밤 동안(overnight) 환원하는 것으로 구성된 이러한 변형(본원에서 이하 공지된 방법이라고 지칭함)은, 대체로 β-글루쿠로니다아제의 CNS 분포를 개선시켰으며 LSD 점액다당류증(mucopolysaccharidosis) VII의 뮤린(murine) 모델에서의 신경성 저장의 클리어런스(clearance)로 이어졌다. 비록 뇌 분포의 기저에 있는 메커니즘은 불분명하지만, 화학적 변형은 β-글루쿠로니다아제 상의 글라이칸 구조를 파괴했다는 것이 주목되었으며, M6PR에 의한 수용체 매개 세포내이입이 강하게 감소된다는 것이 추가적으로 증명되었다.
다른 라이소좀 효소에 대한 화학적 변형 전략이 조사되어 왔다. 예를 들어, 공지된 방법에 따른 화학적 변형은 정맥내 주사로 투여된 프로테아제 트리펩티딜 펩티다아제 I(protease tripeptidyl peptidase I)의 분포를 개선하지 못했다(Meng et al, PLoS One (2012)). 어느 것도 설파아미다아제에 대해 만족스러운 결과를 증명하지 못했다. 공지된 방법에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제는 실제로 마우스에서 증가된 반감기를 나타내기는 했으나, MPS-IIIIA 마우스의 뇌에서는 효과가 나타나지 않았다. 화학적으로 변형된 설파아미다아제는 정맥내 주사 투여에 의해 반복적으로 투여되었을 때 뇌 실질(parenchyma)에 분포하지 않았다(Rozaklis et al, Exp Neurol 230: 123-130 (2011)).
따라서, 신경적 관련을 갖는 LSD의 치료를 위한 효과적인 ERT가 여전히 요구된다. 기능적으로 활성 상태를 유지하면서 BBB를 관통하여 운반될 수 있는 신규한 단백질은 CNS 관련 병리를 갖는 LSD의 치료를 위한 효소/단백질 대체 치료법의 전신적인 투여에 적합한 화합물의 개발에 큰 가치가 있을 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 목적은 상이한 LSD에 대한 효소 대체 치료법의 개발을 가능하게 하는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포유동물에서 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)을 관통하여 운반될 수 있는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다. 또한, 상기 단백질은 상기 포유동물의 뇌 내에서 유리하게 생물학적 활성을 가질 것이며, 예를 들어 포유동물의 뇌 내에서 효소(촉매) 활성을 가질 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 말초 조직, 특히 LSD의 말초 병리에 관련된 말초 조직 내에서 촉매 활성을 갖는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 품질 및 안전성, 예를 들어 선행기술의 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질에 비하여 개선된 구조적 완전성을 나타내는 신규한 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 것이다.
본 개시내용으로부터 통상의 기술자에게 명백하게 될 이들 및 다른 목적은 첨부된 청구범위에서 정의되고 본원에 일반적으로 개시된 본 발명의 상이한 실시 양태에 의해 달성된다.
본 발명의 한 실시 양태에서는, 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태와 비교하여 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 50% 이하가 손상되지 않은 상태로 잔류하는 것을 특징으로 하는, 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 감소한 함량을 갖는 변형된 라이소좀 단백질로써, 상기 단백질은 그로써 글라이칸 인식 수용체에 대한 감소된 활성을 가지며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌, 라이소좀 단백질을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 단백질은 β-글루쿠로니다아제가 아니다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 TPP1(tripeptidyl peptidase 1)이 아니다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 알파 L-이두로니다아제가 아니다.
글라이칸 인식 수용체라는 용어는 주로 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 통해 라이소좀 단백질을 인식하고 결합하는 수용체를 의미한다. 그러한 수용체들은 만노오스 6-포스페이트(mannose 6-phosphate) 수용체 외에도, 글라이칸이 노출된 말단 만노오스 잔사를 나타내는 단백질을 선택적으로 결합하는, 만노오스 수용체에 의해 예시될 수 있다. 렉틴(Lectin)은 글라이칸의 말단 갈락토오스 잔사를 인식하는 아시알로당단백질(asialoglycoprotein)을 인식하는 말단 갈락토오스에 의해 예시될 수 있는 글라이칸 인식 수용체의 다른 거대한 군을 구성한다.
변형되지 않은 또는 천연의 글라이칸 잔기는 한 실시양태에서 진핵 세포의 소포체(endoplasmatic reticulum) 및 골지체(golgi compartment)에서 해독 후 변형(post-translational modification)이 일어난 라이소좀 단백질에서 천연적으로 발생하는 글라이칸 잔기로 이해된다. 변형되지 않은 또는 천연의 글라이칸 잔기가 “없는(absent)”것으로 설명되는 경우, 또는 글라이칸 잔기의 상대적인 양이 주어질 때, 이것은 손상되지 않은(또는 완전한) 천연적인 글라이칸 잔기를 검출할 수 없다는 것을 의미한다. 첨부된 실시예에서 증명되는 바와 같이, 글라이코펩티드의 상대적인 정량화는 LC-MS 및 재구성된 이온 크로마토그램으로부터의 피크에 기반할 수 있다. 대안적인 정량화 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
본 발명에 따르는 변형된 라이소좀 단백질은 그와 같이 천연 글라이칸 잔기가 제거된 것으로 변형된다. 특히, 상기 라이소좀 단백질은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프(epitope)가 글라이칸 잔기로부터 제거되어 변형된다. 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프는 본원에서 구조적으로 만노오스, 만노오스 6 포스페이트, n-아세틸글루코사민 또는 N-글라이칸의 말단 끝의 갈락토오스 유래의 것으로 설명되는 그러한 수용체로부터 인식되는 글라이칸 잔기(의 일부)를 나타내는 것으로 이해된다. 천연의 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 적어도 부분적인 부재는 글라이칸 인식 수용체에 대한 변형된 라이소좀 단백질의 활성을 감소시킨다. 그 결과로서, 말초 조직 내의 변형된 라이소좀 단백질의 수용체 매개 세포내이입은 감소할 수 있으며, 이는 예를 들어, 포유동물에게 정맥내 주사로 투여된 경우, 혈장으로부터 변형된 단백질의 감소된 클리어런스로 이어질 수 있다. 첨부된 실시예에서 특정 예시적 라이소좀 단백질에 입증된 바와 같이, 본원에 설명된 변형된 라이소좀 단백질은 세포 흡수를 덜 받으며 그 결과로 글라이칸 인식 수용체, 예를 들어 2개의 M6PR(mannose-6 phosphate receptors)에 대한 에피토프의 제거로 이어질 수 있다(참고 : 실시예 5 및 6).
투여량의 측면에서 볼 때, 변형된 라이소좀 단백질의 감소된 클리어런스는 환자들에게 덜 자주 투여될 수 있는 유리하게 장기-작용하는(long-acting) 의약품의 개발을 허용할 수 있다. 추가로, 상기 단백질의 변형은 CNS에 변형된 라이소좀 단백질의 분포를 허용할 수 있다. 본원에 설명된 것과 같은 변형된 단백질은 혈액 뇌 장벽을 관통하여 그리고 그 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 뇌 내로 운반될 수 있다. 이러한 변형된 단백질의 유리한 특성은 다수의 LSD에서 임상적 결과를 잠재적으로 개선할 수 있다.
한 구현예에서, 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태와 비교하여 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 45% 이하가 잔류하며, 예를 들어 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태와 비교하여 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하의 글라이칸 잔기가 잔류한다. 그와 같이, 일부 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 실질적으로 손상되지 않은 천연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기를 포함하지 않으며 결과적으로 실질적으로 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 포함하지 않는다. 이것은 글라이칸 인식 에피토프의 거의 완전한 부재로 이해될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 글라이칸 인식 수용체에 대한 (검출 가능한) 에피토프를 포함하지 않는다. 일부 경우, 상기 에피토프의 완전한 부재는 추가로 변형된 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키고 혈장 반감기를 연장시킬 수 있다. 이것은 아마 적어도 일부는 (실시예 5의 세포 흡수 연구에 증명된 것과 같이) 단백질의 화학적 변형에 따른 말초 조직에서의 수용체 매개 흡수 억제로 인한 것이다.
특히, 변형된 라이소좀 단백질은 세포내이입성(endocytic) M6PR 유형 1 및 2, 만노오스 수용체, n-아세틸글루코사민 결합 렉틴 및 갈락토오스 수용체의 에피토프를 각각 구성하는 (검출 가능한) 만노오스-6-포스페이트 잔기, 만노오스 잔기, n-아세틸글루코사민 잔기 또는 갈락토오스 잔기를 갖지 않는다. 상기 정의한 것과 같이, 천연적 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기에서 발견되는 상기 에피토프는 만노오스-6-포스페이트 잔기, 만노오스 잔기, n-아세틸글루코사민 잔기 및 갈락토오스 잔기에서 선택될 수 있다. 특별한 구현예에서, 이들은 본원에 개시된 것과 같이 변형된 라이소좀 단백질에 부재한다.
상기 변형된 라이소좀 단백질의 천연적인 글라이칸 잔기는 상기 설명된 것과 같이 변형된 라이소좀 단백질에서 적어도 일부 부재한다. 이 부재는 상기 변형된 라이소좀 단백질의 천연적인 글라이칸 잔기 내의 단일 결합 절단 및 이중 결합 절단으로 구성된 붕괴(disruption)에 상응할 수 있다. 단일 결합 절단에 의한 글라이칸 붕괴가 전형적으로 우세할 수 있다. 특히, 상기 라이소좀 단백질의 천연적인 글라이칸 잔기는 단일 결합 절단 및 이중 결합 절단에 의해 붕괴될 수 있으며, 상기 단일 결합 절단의 정도는 올리고만노오스 글라이칸에서 적어도 60%일 수 있다. 특히, 단일 결합 절단의 정도는 글라이칸의 올리고만노오스 유형에서 적어도 65%, 예를 들어 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 85%일 수 있다. 단일 결합 절단 대 이중 결합 절단의 정도는 예시된 단백질(설파아미다아제)에 대해 실시예 9 및 10에 설명된 대로 결정될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 95% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 96% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 97% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 98% 이상, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 분자량의 99% 이상의 분자량을 갖는다. 첨부된 실시예 4에서, SDS-PAGE 분석에서 본 발명에 따라 변형된 라이소좀 단백질이 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질과 구별할 수 없다는 것이 나타나 있으며, 이것은 도 8A에 도시된 것처럼 단일 결합 절단이 주로 일어난다는 것을 시사한다. 첨부된 실시예 2에서, SDS-PAGE 분석에서 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질은 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질보다 작다는 것이 나타나 있으며, 이것은 도 8A에 도시된 것처럼 이중 결합 절단의 정도가 더 높다는 것을 시사한다.
본원에 개시된 실시 양태 중 한 구현예에서, 상기 변형되지 않은 글라이칸 잔기가 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위에 적어도 1개가 존재하지 않으며, 예를 들어 상기 변형되지 않은 글라이칸 잔기가 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개가 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위에 존재하지 않으며, 바람직하게는 상기 글라이칸 잔기는 모든 N-글라이코실화 부위에 부재한다. 예를 들어, 이것은 2개의 N-글라이코실화 부위를 갖는 라이소좀 단백질에 있어서 2개의 부위 중 적어도 하나는 손상되지 않은 또는 완전한 글라이칸 잔기의 결여하고 있음을 의미한다.
본원에 개시된 실시 양태 중 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 비공유 결합된 형태로 존재한다. 유리하게는, 상기 라이소좀 단백질은 단백질의 응집(aggregation)을 유발하지 않고/않거나 더 작은 펩티드 단편으로의 단백질 골격(backbone)의 절단을 유발하지 않으면서 변형된다.
한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 촉매 활성을 보유하며, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 촉매 활성의 적어도 50%의 보유된 촉매 활성, 예를 들어 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의, 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 보유된 촉매 활성을 갖는다. 촉매 활성은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 촉매활성일 수 있다. 시험관내 촉매 활성을 측정하는 방법 및 적어도 50%의 촉매 활성을 갖는 변형된 라이소좀 단백질은 실시예 12에 개시되어 있다.
라이소좀 단백질은 일반적으로 정맥내 주사로 투여될 경우 순환으로부터 빠르게 제거된다. 상기 설명한 것과 같이, 세포외 구역으로부터의 세포 흡수는 라이소좀 단백질의 글라이칸에 풍부한 만노오스 및 만노오스-6-포스페이트를 인식하는 수용체에 의해 촉진된다. 그와 같이, 라이소좀 단백질의 분포는 전형적으로 상이한 세포 상의 이들 수용체의 밀도에 의해 조절된다. 만노오스를 인식하는 수용체는 간 내의 간 조직 대식세포(tissue-resident macrophage) 및 혈관내피세포(sinusoidal endothelial cells)에 풍부하게 존재하는 반면, 양이온 의존성 만노오스 6-포스페이트 수용체는 간세포에 풍부하다. 결과적으로, 정맥내 주사로 투여된 치료 효소 투여량의 대부분은 간에 분포할 것이며, 이는 대부분의 치료 응용 분야에 있어서 차선책이다. 예를 들어, 파브리병(Fabry disease)에 대해 치료제로 사용되는 2개의 α-갈락토시다아제(galactosidase) A 제제는 모두 마우스에서 1회 투여 후 간에서 투여량의 분포의 60-70%를 나타낸다(Lee et al, Glycobiology 13: 305-313 (2003)). 반면, 혈액에 의해 잘 공급되지 않는 수용체 및/또는 수용체 풍부도가 낮은 조직의 세포는 이러한 흡수 메커니즘을 통해서는 충분히 타겟이 되지 않는다. 글라이칸-의존성 경로를 통한 빠른 흡수를 억제함으로써, 순환으로부터의 클리어런스는 상당히 감소되며, 다른 더 느린 과정들이 상이한 분포 프로파일(profile)로 이어지는 세포 내로의 흡수를 촉진한다. 이것은 변형되지 않은 라이소좀 효소에 부족하게 노출되는 조직의 세포에 치료용 변형된 라이소좀 단백질의 분포를 가능하게 할 수 있다. 특별한 구현예에서, 본원에 개시된 것과 같은 변형된 라이소좀 단백질은 정맥내 주사로 투여되었을 때 관절, 연결 조직(connective tissue), 연골(cartilage) 및 뼈에서 더 나은 분포를 제공할 수 있다. 또한 골격근(skeletal muscle), 심장 및 폐가 더 나은 타겟이 될 수 있다. 이들은 모두 라이소좀 저장의 결과로 심각한 병리가 공통적으로 나타나는 조직이다.
한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 포유동물에게 투여되었을 때 말초 조직에 분포한다. 말초 조직의 예는 상기에 제공되어 있다. 게다가, 상기 라이소좀 단백질은 (보유된) 생물학적 활성, 예를 들어 보유된 효소 또는 촉매적 활성을, 상기 말초 조직 내에서 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 실시 양태에 따르는 변형된 라이소좀 단백질은 포유동물에게 투여되었을 때 뇌에 분포할 수 있으며, 또한 (보유된) 생물학적 활성, 예를 들어 보유된 효소 또는 촉매적 활성을, 상기 포유동물의 뇌 내에서 나타낼 수 있다. 한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 뇌 내에서 촉매 활성을 갖는다.
보유된 생물학적 활성이란, 변형된 라이소좀 단백질의 생물학적 활성이 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 형태로부터 적어도 부분적으로 보유되는 것을 의미한다. 변형시 라이소좀 단백질의 활성을 완전히 상실하지 않기 위해, 변형은 주의깊게 수행되어야 한다. 변형은 예를 들어 변형된 단백질이 불활성이 되는, 기능성 에피토프 또는 단백질의 활성 부위를 변경할 수 없다. 그와 같이, 본원에 개시된 것과 같은 변형된 라이소좀 단백질은 예를 들어 라이소좀 저장의 감소와 같이, 포유 동물의 뇌, 내장 기관(visceral organs) 및 말초 조직의 라이소좀 저장, 예를 들어 지질(lipid), GAG, 당지질(glycolipid), 당단백질(glycoprotein), 아미노산 또는 글라이코겐(glycogen)의 라이소좀 저장에 영향을 미칠 수 있다.
특별한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 설파타아제이며, 보유된 촉매 활성은 예를 들어 설파타아제의 활성 부위에서 촉매성 아미노산 잔사의 변형 대 보존의 수준에 의존할 수 있다. 설파타아제는 다양한 기질로부터의 설페이트(sulfate) 에스테르(ester) 결합의 가수분해를 촉매하는 공통된 진화적 기원의 단백질 군이다. 그러므로, 본원에 사용된 변형된 설파타아제의 “촉매 활성”은 설페이트 에스테르 결합의 가수분해를 지칭할 수 있으며, 바람직하게는 포유동물의 뇌에서 라이소좀 및/또는 말초 조직의 라이소좀이다. 변형된 설파타아제의 촉매 활성은 그와 같이 라이소좀, 예를 들어 라이소좀 저장병에 걸린 포유 동물의 뇌 내의, 데르마탄(dermatan) 설페이트, 콘드로이틴(chondroitin) 설페이트 및 헤파란(heparan) 설페이트, 저장의 감소로 이어질 수 있다. 촉매 활성은 예를 들어 동물 모델에서, 예를 들어 실시예 7에 설명된 것과 같이 측정될 수 있다. 예시적인 설페이트인 설파아미다아제의 글라이칸 변형은 선행 기술에 개시되어 있다(Rozaklis et al, supra). 그러나 설파아미다아제를 변형하는 공지된 방법의 결과물은 마우스의 뇌에서 촉매 활성이 부족한 변형된 설파아미다아제이다. 그와 같이, 이것은 효소의 변형이 촉매 활성을 망가뜨리지 않도록 주의깊게 수행되어야 한다는 것을 나타낸다. 설파타아제(sulfatase)의 활성 부위는 전형적으로 FGly(Cα-formylglycine)로 해독 후 변형되는 보존된 시스테인(cysteine)을 포함한다. 이 반응은 FGly 생성 효소에 의해 소포체에서 일어난다. 이러한 FGly 잔사는 효소 활성에 필수적인 것으로 보인다. 특히, 아릴설파타아제(arylsulfatase) A 및 B에서 보존된 시스테인의 Ser(serine)으로의 돌연변이는 FGly 형성을 예방하고 불활성 효소를 생산한다(Recksiek et al, J Biol Chem 13; 273(11):6096-103 (1998)). 설파타아제의 활성 부위의 보존이 본원에서 기재될 때, 이것은 상기 설파타아제에서의 해독 후 FGly의 보존으로서 우선적으로 이해되어야 한다.
한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 막 관통 나선이 결핍되고 적어도 하나의 N-글라이코실화 부위를 갖는 라이소좀 단백질이다. 그러한 라이소좀 단백질의 예시가 하기 표에 기재되어 있다:
표 1에 많은 라이소좀 단백질이 나열되어 있다. 단백질의 일부는 다른 이름으로 알려져 있을 수 있다. 상기 나열된 단백질은 또한 임의의 및 모든 대체 이름을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
한 구현예에서, 변형된 라이소좀 단백질은 데옥시리보뉴클레아제-2-알파; 베타-만노시다아제; 리보뉴클레아제 T2; 라이소좀 알파-만노시다아제(Laman); 트리펩티딜 펩티다아제 1(TPP-1); 히알루로니다아제-3(Hyal-3); 카텝신 L2; 세로이드 지질갈색소증 신경원성 단백질 5; 글루코실세라미다아제; 조직 알파-L-푸코시다아제; 미엘로퍼옥시다아제(MPO); 알파-갈락토시다아제 A; 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파; 카텝신 D; 프로사포신; 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 카텝신 L1; 카텝신 B; 베타-글루쿠로니다아제; 프로-카텝신 H; 카텝신 H; 비분비성 리보뉴클레아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제; 라이소좀 보호 단백질; 감마-인터페론-유도성 라이소좀 티올 리덕타아제; 타르트레이트-내성 산성 포스파타아제 유형 5(TR-AP); 아릴설파타아제 A(ASA); 전립선 산 포스파타아제(PAP); N-아세틸글루코사민-6-설파타아제; 아릴설파타아제 B(ASB); 베타-갈락토시다아제; 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제; 스핑고미엘린 포스포디에스테라아제; 강글리오시드 GM2 활성제; N(4)-(베타-N-아세틸글루코사미닐)-L-아스파라기나아제; 이두로네이트 2-설파타아제; 카텝신 S; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제; 알파-L-이두로니다아제; 라이소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 하이드로레이즈(LAL); 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제; 카텝신 O; 카텝신 K; 팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1(PPT-1); 설파아미다아제; 아릴설파타아제 D(ASD); 디펩티딜 펩티다아제 1; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제; 갈락토세레브로시다아제(GALCERase); 정소상체 분비 단백질 E1; 디-N-아세틸키토비아제; N-아실에탄올아민-가수분해 산 아미다아제; 히알루로니다아제-1(Hyal-1); 키토트리오시다아제-1; 산 세라미다아제(AC); 포스포리파아제 B-유사체 1; 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 유형 9; 그룹 XV 포스포리파아제 A2; 추정 포스포리파아제 B-유사체 2; 데옥시리보뉴클레아제-2-베타; 감마-글루타밀 하이드로레이즈; 아릴설파타아제 G(ASG); L-아미노산 옥시다아제(LAAO, LAO); 시알리다아제-1; 레구마인; 시알레이트 O-아세틸에스테라아제; 흉선-특이적 세린 프로타아제; 카텝신 Z; 카텝신 F(CATSF); 프레닐시스테인 옥시다아제 1; 디펩티딜 펩티다아제 2; 라이소좀 티오에스테라아제 PPT2(PPT-2); 헤파라나아제; 카르복시펩티다아제 Q; β-글루쿠로니다아제, 및 설파타아제-변형 인자 1로 구성된 군에서 선택된다.
본원에 기재된 실시 양태의 특정 구현에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 설파타아제이다. 상기 설파타아제는 바람직하게는 그의 활성 부위에 FGly 잔사를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 설파타아제는 아릴설파타아제 A; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제, 아릴설파타아제 B; 이두로네이트 2-설파타아제; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제; 설파아미다아제; 아릴설파타아제 D, 및 아릴설파타아제 G로부터 선택된 것이다. 특히, 상기 설파타아제는 아릴설파타아제 A; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제; 아릴설파타아제 B; 이두로네이트 2-설파타아제; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제 또는 설파아미다아제로부터 선택된 것이다. 바람직하게는, 상기 설파타아제는 아릴설파타아제 A이다. 설파아미다아제는 일부 구현예에서 배제될 수 있다.
본원에 개시된 실시 양태의 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 글라이코시드 하이드로레이즈이다. 일부 구현예에서, 상기 글라이코시드 하이드로레이즈는 알파-갈락토시다아제 A; 조직 알파-L-푸코시다아제; 글루코실세라미다아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제; 베타-갈락토시다아제; 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파; 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 갈락토세레브로시다아제; 라이소좀 알파-만노시다아제; 베타-만노시다아제; 알파-L-이두로니다아제; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제; 베타-글루쿠로니다아제; 히알루로니다아제-1(hyaluronidase-1); 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제; 시알리다아제-1; 디-N-아세틸키토비아제; 키토트리오시다아제-1; 히알루로니다아제-3. 및 헤파라나아제로부터 선택된 것이다. 바람직하게는, 상기 글라이코시드 하이드로레이즈는 알파-L-이두로니다아제 또는 라이소좀 알파-만노시다아제이다. 바람직하게는, 상기 글라이코시드 하이드로레이즈는 라이소좀 알파-만노시다아제이다.
본원에 개시된 실시 양태의 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 프로테아제이다. 일부 구현예에서, 상기 프로테아제는 카텝신 D; 카텝신 L2; 카텝신 L1; 카텝신 B; 프로-카텝신 H; 카텝신 S; 카텝신 O; 카텝신 K; 디펩티딜 펩티다아제 1; 카텝신 Z; 카텝신 F; 레구마인; 감마-글루타밀 하이드로레이즈; 트리펩티딜-펩티다아제 1; 카르복시펩티다아제 Q; 라이소좀 보호 단백질; 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제; 흉선-특이적 세린 프로테아제; 디펩티딜 펩티다아제 2, 및 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 유형 9 중에서 선택된 것이다. 한 구현예에서, 상기 프로테아제는 트리펩티딜-펩티다아제 1이다. 다른 구현예에서, 트리펩티딜-펩티다아제는 상기 개시된 프로테아제 그룹에서 제외된다.
본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 서열번호 1-74 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드나, 또는 서열번호 1-74로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 비제한적 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1-74 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성, 예를 들어 서열번호 1-74 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성, 예를 들어 서열번호 1-74 중에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 99%의 동일성을 갖는다.
구체적인 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 설파타아제이고, 서열번호 26; 28; 29; 35; 37; 44; 45, 및 61 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 26; 서열번호 28; 서열번호 29; 서열번호 35; 서열번호 37 및 서열번호 44 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 26에 개시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 글라이코시드 하이드로레이즈이며, 서열번호 12; 서열번호 10; 서열번호 9; 서열번호 22; 서열번호 30; 서열번호 13; 서열번호 16; 서열번호 48; 서열번호 4; 서열번호 2; 서열번호 38; 서열번호 47; 서열번호 19; 서열번호 52; 서열번호 31; 서열번호 63; 서열번호 50; 서열번호 53; 서열번호 6, 및 서열번호 72 중에서 선택된 어느 한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 4 또는 서열번호 38에 개시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 변형된 프로테아제이고, 서열번호 14; 서열번호 68; 서열번호 5; 서열번호 23; 서열번호 56; 서열번호 46; 서열번호 42; 서열번호 7; 서열번호 17; 서열번호 18; 서열번호 20; 서열번호 36; 서열번호 41; 서열번호 67; 서열번호 64; 서열번호 60; 서열번호 73; 서열번호 40; 서열번호 66, 및 서열번호 70 중에서 선택된 어느 한 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 5에 개시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다.
추가적인 구현예에서, 상기 폴리펩티드는 그러나, 하나 또는 그 이상의 C- 및/또는 N-말단 아미노산에 의해 연장되어 실제로 변형된 라이소좀 단백질을 서열번호 1-74의 서열보다 길게 만들 수 있다. 유사하게, 다른 예시에서 변형된 라이소좀 단백질은 서열의 특정 위치의 아미노산 잔사의 결실로 인해 서열번호 1-74의 아미노산 서열보다 짧은 아미노산 서열을 가질 수 있다.
한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 분리된 것이다.
한 구현예에서, 상기 라이소좀 단백질은 인간 라이소좀 단백질이다.
한 구현예에서, 상기 라이소좀 단백질은 변형 전에 글라이코실화된다.
한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 재조합된 것이다. 특히, 라이소좀 단백질은 연속적인 인간 세포주에서 재조합적으로 제조된 것일 수 있다.
한 구현예에서, 상기 변형된 단백질은 포유동물, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary), 식물 또는 효모 세포에서 발현될 수 있다. 따라서, 수득되는 단백질은, 변형 전에 하나 또는 그 이상의 올리고만노오스 N-글라이칸에 의해 글라이코실화된다.
한 실시 양태에서, 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 50% 이하의 천연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기가 잔류하고, 그로써 혈액 뇌 장벽을 관통하고 상기 변형된 라이소좀 단백질이 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 뇌 내로의 상기 라이소좀 단백질의 운반을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는, 천연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 양이 감소된 변형된 라이소좀 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 단백질은 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, 또는 TPP1(tripeptidyl peptidase 1)가 아니다. 다른 구현예에서, 상기 단백질은 알파-L-이두로니다아제가 아니다.
특별한 구현예에서 상기 라이소좀 단백질은 설파타아제이며, 상기 조성물은 상기 변형된 설파타아제의 활성 부위에서의 FGly(Cα-formylglycine) 대 Ser(serine)의 비율이 1보다 큰 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 서열번호 26; 28; 29; 35; 37; 44; 45, 및 61에 정의된 것과 같은 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; 또는 서열번호 26; 28; 29; 35; 37; 44; 45, 및 61에 정의된 것과 같은 폴리펩티드와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, FGly대 Ser 비율은 1.5를 초과하고, 더 바람직하게는 그것은 2.3을 초과하고, 더 바람직하게는 4, 가장 바람직하게는 상기 비율은 약 9이다. 더 큰 비율은 변형된 설파타아제의 촉매 활성이 변형되지 않은 설파타아제의 형태로부터 더 크게 보유될 수 있음을 나타낸다.
다른 실시 양태에 대해 개시된 이점은 또한 조성물의 실시 양태에 대해서도 적용된다. 유사하게, 다른 실시 양태에 대해 개시된 구현예는 또한 조성물의 실시 양태에 대해서도 적용된다. 특히, 글라이칸 잔기의 양, 단백질 활성, 및 라이소좀 단백질의 구체적인 예시(표 1 및 상기 기재를 참고하라)에 관련된 구현예들 또한 이러한 실시 양태에 적용할 수 있다.
조성물 실시 양태의 한 구현 예에서, 상기 변형된 단백질의 10% 이하, 예를 들어 7.5% 이하, 5% 이하, 2.5% 이하, 1% 이하(중량 기준)가 1010 kDa 이상의 분자량을 갖는 멀티머(multimer) 형태로 존재한다.
조성물 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질의 10% 이하(중량 기준)가 공유 결합된 올리고머(oligomer) 형태로 존재하며, 상기 올리고머 형태는 이량체(dimer), 삼량체(trimer), 사량체(tetramer), 오량체(pentamer), 육량체hiexamer), 칠량체(heptamer) 및 팔량체(octamer)로부터 선택된 것이다. 올리고머, 다량체, 또는 응집된 형태의 존재는, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering)에 의해 또는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 맥락에서, 응집된 형태는 천연적으로 접힌 것에서 접히지 않은 단량체 형태까지 다양한 구조로 구성된 더 높은 분자량 단백질 형태로 이해된다. 단백질의 응집된 형태는 단백질의 단량체 형태에 대한 면역 반응을 강화할 수 있다. 강화된 면역 반응에 대한 가장 가능성 있는 설명은 항원의 다가(multivalent) 제시가 B-세포 수용체를 가교결합시키고 그와 같이 면역 반응을 유도한다는 것이다. 이것은 높은 면역 반응을 보장하기 위해 항원이 응집된 형태로 숙주에게 제시되는 백신 제조에 이용될 수 있는 현상이다. 치료용 단백질에 이 이론은 반대가 된다; 면역 반응을 최소화하기 위해 높은 분자량 형태의 임의의 물질은 최소화되거나 회피되어야 한다(Rosenberg, AAPS J, 8:E501-7 (2006)). 따라서, 올리고머, 다량체 및/또는 응집된 형태의 제거는 그로써 치료에 사용하기에 더 적합한 효소 또는 단백질을 제공할 수 있다.
또한, 샘플 내의 응집된 단백질의 적은 양의 발생조차도 정상적으로 접힌 단백질의 응집을 추가로 더 유발할 수 있다. 응집된 물질은 일반적으로 잔류하는 활성이 낮거나 없으며 부족한 용해성을 갖는다. 응집의 발생은 생물학적 의약품의 유효 기간을 결정하는 요인 중 하나일 수 있다(Wang, Int J Pharm, 185:129-88 (1999)).
본원에 사용된 용어 “조성물”은 고체 및 액체 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 조성물은 바람직하게는 환자(예를 들어, 포유동물)에게 예를 들어 주사 또는 구두로 투여되는 데에 적합한, 약학적 조성물일 수 있다.
한 실시 양태에서, 변형된 라이소좀 단백질이 제공되는데, 상기 라이소좀 단백질은 알칼리 금속 퍼아이오데이트(periodate) 및 알칼리 금속 보로하이드라이드(borohydride)와의 일련의 반응에 의해 제조되고, 그로써 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 변형시키고 상기 글라이칸 인식 수용체에 관한 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키는 반면, 상기 라이소좀 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 변형된 라이소좀 단백질이 제공된다. 라이소좀 단백질은 그와 같이 변형되며, 변형 전에 천연적인, 글라이코실화된 형태로 존재하는 에피토프, 또는 글라이칸 잔기가 필수적으로 상기 변형에 의해 불활성화된다. 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 존재는 따라서 변형된 라이소좀 단백질에서 감소된다. 본원에 개시된 다른 실시 양태에 관해 개시된 구현예 및 그들의 이점은, 예를 들어 변형된 라이소좀 단백질, 조성물 및 제조 방법들은 또한 이 실시 양태의 구현예라는 것이 이해되어야 한다. 특히, 하기에 개시된 다양한 방법의 구현예는 구체적인 반응 조건의 측면에서 상기 변형된 라이소좀 단백질의 제조의 추가적인 예시적 정의를 추가로 더 제공한다. 유사하게, 상기 변형된 라이소좀 단백질 및 조성물 실시 양태에 관하여 개시된 구현예는 변형된 라이소좀 단백질의 예시적 정의를 추가로 더 제공한다.
한 실시 양태에서, a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 반응시키는 단계, 및 b) 상기 라이소좀 단백질과 알칼리 금속 보로하이드라이드를 2시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써, 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고 글라이칸 인식 수용체에 대한 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인 변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법이 제공된다.
한 가지 관련된 실시 양태에서, a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 4시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계, 및 b) 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드와 2시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써, 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고 글라이칸 인식 수용체에 대한 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인, 변형된 라이소좀 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
한 가지 관련된 실시 양태에서, a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 반응시키는 단계, 및 b) 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드와, 선택적으로 2시간 이하의 반응 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키며, 상기 라이소좀 단백질의 상기 활성 부위 또는 기능성 에피토프는 단계 a)및 b) 중 적어도 하나 동안 산화 및/또는 환원 반응에 접근 불가능하도록 만들어지는 것인, 변형된 라이소좀 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
이 문맥에서 용어 “기능성 에피토프”는 비록 그 단백질이 효소 활성이 없더라도 라이소좀에서 필수적인 기능을 갖는 단백질의 부분으로 이해되어야 한다. 필수적인 기능은 예를 들어 분해 효소에 기질을 제시하거나, 효소의 분류에 영향을 주거나 기능성 효소에 대한 결합 파트너로서 작용함으로써 제공될 수 있다. 문제의 단백질의 기능성 에피토프는 그의 기능에 관여하는 단백질의 잔사, 예를 들어 그 단백질의 기능을 정의하는 단백질-단백질 결합에 관여하는 결합 리간드 잔사 또는 잔사들에 의해 정의된다.
따라서, 상기 방법들은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 존재를 감소시키고, 상기 에피토프는 예를 들어 본원에 개시된 것과 같이 자연적인 또는 변형되지 않은 글라이칸 잔기에 의해 제시되는 것인 라이소좀 단백질의 약한 화학적 변형을 제공한다. 이것은 유리하게는, 변형되지 않은 라이소좀 단백질이 불량하게 분포하는 포유동물의 뇌 및/또는 내장 기관 및/또는 말초 조직을 타겟으로 하기에 적합한 변형된 라이소좀 단백질을 제공할 수 있다. 특히, 방법은 예를 들어 정맥내 주사에 의해 투여될 경우 말초 조직, 예를 들어 관절, 연결 조직, 연골 및 뼈에 더 높은 노출을 갖는 라이소좀 단백질을 제공한다. 약한 방법은 또한 생물학적 활성의 완전한 손실로 이끌지 않으면서 유리하게 상기 에피토프를 변형한다. 특별한 구현예에서, 약한 방법은 라이소좀 단백질의 기능성 에피토프를 변형하지 않아 그의 생물학적 활성이 손실되지 않도록 한다. 상기 라이소좀 단백질이 설파타아제인 경우, 생물학적 활성은 변형된 라이소좀 단백질의 활성 부위에서 FGly를 보유함으로써 보유되는 촉매 활성일 수 있다. 따라서, 단백질 또는 효소의 분포 특성을 개선하는 반면, 상기 방법은 생물학적, 예를 들어, 촉매, 활성을 제거하지 않는다. 상기 설명한 것과 같은 약한 방법에 의해 제조된 라이소좀 단백질은, 예를 들어, 라이소좀 단백질 및 조성물 실시 양태에 대해 추가적인 장점을 더 제공한다.
글라이칸(탄수화물) 잔기의 2개의 인접한 하이드록실 그룹 사이의 탄소 결합을 퍼아이오데이트 절단함으로써 방법은 글라이칸 변형을 허용한다. 일반적으로, 퍼아이오데이트 산화적 절단은 인접한(vicinal) 디올(diol)이 존재할 때 발생한다. 상기 디올은 적도(equatorial)-적도 또는 축-적도 위치에 존재해야 한다. 만약 디올이 고정된 축-축 위치에 존재하면 반응이 일어나지 않는다 (Kristiansen et al, Car. Res (2010)). 퍼아이오데이트 처리는 M6P 잔기의 C2 및 C3 및/또는 C3 및 C4 사이의 결합을 절단할 것이며, 그와 같이 M6P-수용체에 결합하는 것이 불가능한 구조를 생성할 것이다. 일반적으로, 다른 말단 헥소오스는 유사한 방식으로 진행될 것이다. 비-말단 1-4 연결 잔사들은 C2 및 C3 간에만 절단될 것이며, 반면 비-말단 (1-3) 연결 잔사들은 절단되지 않을 것이다. 도 7에서, 3가지 N-글라이칸(올리고만노오스, 복합 및 하이브리드 N-글라이칸)의 일반적 유형 가능한 변형의 지점이 별표로 표시되어 있다. 첨부된 실시예에 추가로 더 증명된 것과 같이, 본원에 개시된 방법은 제한된 수의 결합 절단에 의해 변형된 자연적인 글라이칸 잔기를 갖는 변형된 단백질을 제공한다. 전형적으로, 공지된 방법의 사용에 의한 변형은 더 강한 변형을 야기하며, 이는 폴리펩타이드 설파아미다아제에 대한 대조 실험으로 증명되어 있다. 단계 a)에 사용된 퍼아이오데이트는 라이소좀 단백질에서 자연적으로 발생하는 글라이칸 잔기의 구조를 변형할 것이다. 변형된 라이소좀 단백질의 잔존하는 글라이칸 구조는 각 자연적으로 발생하는 글라이칸 잔기에서 적어도 하나의 퍼아이오데이트 촉매의 절단으로, 즉, 적어도 하나의 단일 결합 절단으로, 적어도 부분적으로 변형되었을 것이다. 본원에 개시된 방법은 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기의 당 잔기에서 결합 절단의 단일-유형을 우세하게 야기할 것이다(도 8을 참고하라). 2중 결합 절단 vs 단일 결합 절단의 경향성에 관한 공지된 방법 및 본원에 개시된 방법 사이의 차이점은 예를 들면 2중결합 절단이 우세한 경향성이 단량체 단백질의 분자량에 더 현저한 손실을 초래하는 SDS-PAGE 상에서 관찰될 수 있다. 글라이칸 잔기에서 단일결합 절단이 우세하게 발생한 변형된 단백질에서, 단량체 단백질의 분자량 손실은 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 덜 현저하거나 심지어 무시할 수 있는 수준이다. 결합 절단의 단일-유형을 우세하게 나타내는 변형된 글라이칸 잔기의 레파토리는 정맥내 주사 투여 이후 살아 있는 동물의 뇌에서 라이소좀 단백질의 변형 및 활성에 이로운 것으로 밝혀질 수 있다.
본원에 설명된 것과 같은 변형된 라이소좀 단백질 및 라이소좀 단백질을 제조하는 방법은 종래의 방법 및 화합물에 비해 개선된 것이다. 주로, 신규한 변형된 라이소좀 단백질은 포유동물 뇌 내에 분포하고 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 실시예 2 및 4는 또한 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질 및 본원에 개시된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질 사이의 비교를 제공한다. 이 실시예들의 결과는 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질은 아미노산 서열, 폴리펩티드 사슬 절단 및 단백질 응집의 변경을 나타낸다는 것을 나타낸다. 특히, 활성 부위에 촉매성 FGly 잔사를 포함하는 설파타아제에서 공지된 방법으로의 변형은 FGly 잔사를 Ser 잔사로 전환하도록 한다. 그와 같이, 본원에 개시된 것과 같은 발명은 또한 변형된 라이소좀 단백질이 예를 들어 구조적 완전성의 측면에서 개선된 질 및 안정성을 제공할 수 있다.
방법 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 글라이칸 잔기의 시스-글라이콜(cis-glycol) 그룹을 알데하이드 그룹으로 산화시킨다.
방법 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 알데하이드를 알코올로 환원시킨다.
방법 실시 양태의 한 구현예에서, 단계 a) 및 단계 b)는 반응 중간 단계(intermediate step)를 수행하지 않고 순서대로 수행된다. 단계 a) 이후 곧바로 단계 b)를 수행함으로써, 또는 하기에 설명된 것과 같이 선택적인 ??칭 a2) 이후, 반응성 반응물을 제거하기 위한 임의의 중간 단계, 예를 들어, 투석, 한외 여과, 석출 또는 완충액 교환, 은 생략되며, 반응성 알데하이드 중간체에 라이소좀 단백질을 오래 노출시키는 것은 그와 같이 회피된다. 단계 a) 이후 단계 b), 또는 선택적으로 a2)를 수행함으로써, 전체 반응 시간 또한 유리하게 감소된다.
하기 단락에서, 단계 a)의 구체적인 구현예가 개시되어 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 개시된 실시 양태의 구체적인 개시예는 조합될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이다.
한 구현예에서, 상기 반응 4시간 이하의 시간, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 a)의 반응은 0.5시간 이하, 예를 들어 약 20분 동안 수행된다. 반응은 바람직하게는 약 3시간, 2시간, 1시간, 또는 1시간 미만의 반응 시간을 갖는다. 4시간 이하의 단계 a)의 지속은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 효과적으로 불활성화시킬 수 있다. 추가로, 4시간 이하의 상대적으로 제한된 반응 시간은 폴리펩타이드 사슬의 스트랜드 절단(strand break)의 제한된 정도를 야기한다고 가정된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하의 (최종) 농도, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM으로 사용된다. 상기 퍼아이오데이트는 8-20mM, 바람직하게는 약 10mM의 농도로 사용된다. 대안으로, 퍼아이오데이트는 20mM 이하의 농도, 예를 들어 10과 19mM 사이로 사용된다. 알칼리 금속 퍼아이오데이트, 예를 들어 나트륨 메타-퍼아이오데이트의 낮은 농도는 아미노산 측면사슬(side-chain)의 관련된 산화, 예를 들어 메티오닌 잔사의 산화뿐만 아니라 폴리펩티드 사슬의 스트랜드 절단의 정도를 감소시킨다.
한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 주위(ambient) 온도에서, 바람직하게는 0과 22℃ 사이의 온도에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 0-8℃의 온도, 예를 들어 0-4℃의 온도에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 약 8℃의 온도, 약 4℃의 온도 또는 약 0℃의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 단계 a)의 반응은 3 내지 7의 pH에서 수행된다. pH는 반응 개시시의 pH로서 이해되어야 한다. 특별한 구현예에서, 단계 a)에 사용된 pH는 3-6, 예를 들어 4-5이다. 구체적인 구현예에서, 단계 a)에서 사용된 pH는 약 6, 약 5, 또는 약 4이다. 단계 a)의 pH를 낮춤으로써, 단계 a)의 반응 시간 또는 퍼아이오데이트의 농도는 감소될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용된다. 한 구현예에서, 상기 나트륨 메타-퍼아이오데이트는 8-20mM의 농도로 사용된다. 바람직한 구현예에서, 나트륨 메타-퍼아이오데이트는 약 10mM의 농도로 사용된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되고, 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다. 20mM 퍼아이오데이트의 농도 및 4시간 이하의 반응 지속 시간은 유리하게 적은 스트랜드-절단 및 산화로 이어질 수 있다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되고, 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0과 22℃ 사이, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되고, 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0과 22℃ 사이의 온도, 예를 들어 0-8 ℃의 온도, 예를 들어 0-4 ℃의 온도, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고 상기 단계 a)의 반응은 4시간 이하, 예를 들어 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0과 22℃ 사이의 온도, 예를 들어 0-8 ℃의 온도, 예를 들어 0-4 ℃의 온도, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 (최종) 농도로 사용되는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 단계 a)의 반응은 0과 22℃ 사이의 온도, 예를 들어 0-8 ℃의 온도, 예를 들어 0-4 ℃의 온도, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 약 10mM의 농도로 사용되는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 단계 a)의 반응은 약 8 ℃의 온도에서 2시간 이하의 시간 동안 수행된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 약 10mM의 농도로 사용되는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 단계 a)의 반응은 0-8 ℃의 온도 및 3시간 이하의 시간 동안 수행된다.
하기 단락에서, 단계 b)의 구체적인 구현예가 개시되어 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 개시된 실시 양태의 구체적인 개시예, 특히 단계 a) 및 단계 b)의 구체적인 구현예는 조합될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 보로하이드라이드는 10과 80 mM 사이의 농도로 사용된다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드이다.
일부 예에서, 단계 b)에 사용된 조건은 단계 a)에 사용된 조건에 부분적으로 의존하는 것으로 밝혀졌다. 단계 b)에서 사용된 보로하이드라이드의 양이 바람직하게는 가능한 한 낮게 유지되는 반면, 보로하이드라이드 대 퍼아이오데이트의 몰 비율은 예를 들어 0.5-4 대 1이다. 따라서, 단계 b)의 보로하이드라이드는 단계 a)에 사용된 퍼아이오데이트의 몰 양의 4배를 초과할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 (최종)농도의 4배 이하의 몰 농도로 사용된다. 예를 들어, 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 3배 이하의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 1.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트 농도와 대략 상응하는 농도의 농도로 사용될 수 있다. 그러나, 특별한 실시예에서 보로하이드라이드는 퍼아이오데이트 농도의 반에 상응하거나, 퍼아이오데이트 농도의 0.5배의 농도로 사용될 수 있다. 그와 같이, 퍼아이오데이트가 약 20mM의 농도로 사용될 경우, 보로하이드라이드는 80mM 이하의 농도, 또는 심지어 10과 80mM 사이의 농도, 예를 들어 10과 50mM 사이의 농도로 사용될 수 있다. 만약 퍼아이오데이트가 10과 20mM 사이의 농도로 사용된다면, 보로하이드라이드는 5와 80mM 사이의 농도, 예를 들어 예시 50mM의 농도로 사용될 수 있다. 유사하게, 퍼아이오데이트가 약 10mM의 농도로 사용된다면, 보로하이드라이드는 40mM 이하의 농도, 예를 들어 25mM 이하의 농도로 사용될 수 있다. 또한, 그러한 구현예에서, 보로하이드라이드는 바람직하게는 12mM과 50mM 사이의 농도로 사용될 수 있다. 라이소좀 단백질이 설파타아제인 구현예에서, 보로하이드라이드의 농도는 활성 부위의 촉매성 아미노산 잔사의 보존 정도에 영향을 미칠 수 있다.
한 구현예에서, 상기 단계 b)의 반응은 1.5시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 0.75시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다. 반응 지속 시간은 바람직하게는 약 1시간, 또는 1시간 미만이다. 일부 예시에서, 단계 b)의 반응은 대략 0.25시간의 반응 지속 시간을 갖는다. 추가적인 구현예에서, 단계 b)의 반응은 0.25시간 내지 2시간의 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 설명한 것과 같이, 반응 단계의 지속 시간은 라이소좀 단백질의 생물학적 활성, 특히 효소, 예를 들어 설파타아제의 촉매 활성에 영향을 미칠 수 있다. 상대적으로 짧은 반응 지속 시간은 또한 단백질/효소의 전체적인 구조적 완전성에 유리하게 영향을 미칠 수 있다. 특히, 스트랜드 절단 발생 뿐만 아니라 라이소좀 단백질의 높은 분자량을 일으키는 단백질 응집은 반응 시간과 적어도 일부 관련될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 단계 b)의 반응은 0℃와 8℃ 사이의 온도에서 수행된다. 단계 b)의 반응 온도는 반응 물질의 생물학적 활성에 적어도 일부 영향을 미칠 수 있다. 그와 같이, 단계 b)를 8 ℃ 이하의 온도에서 수행하는 것이 유리할 수 있다. 상기 온도는 바람직하게는 약 0 ℃이다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는, 나트륨 보로하이드라이드이다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되고, 상기 단계 b)의 반응은 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되고, 상기 단계 b)의 반응은 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안, 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 0℃와 8 ℃ 사이의 온도에서 수행된다.
한 구현예에서, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용되는 나트륨 보로하이드라이드이고, 상기 단계 b)의 반응은 약 0℃의 온도에서 약 0.5시간 동안 수행된다.
한 구현예에서, 상기 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트이고, 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드이다.
한 구현예에서, 단계 a) 및 단계 b) 각각은 개별적으로 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 1시간 또는 약 0.5시간의 시간 동안 수행된다. 선택적으로, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-4배의 농도로, 바람직하게는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5-2.5배로 사용된다. 구체적인 구현예에서, 상기 보로하이드라이드는 퍼아이오데이트의 농도의 0.5배, 또는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배의 농도로 사용된다.
한 구현예에서, 단계 a)는 3시간 이하 및 단계 b)는 1시간 이하의 시간 동안 수행된다. 선택적으로, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 바람직하게는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용된다.
한 구현예에서, 단계 a)는 0.5시간 이하 및 단계 b)는 1.5시간 이하의 시간 동안 수행된다. 선택적으로, 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 바람직하게는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하의 농도로 사용된다.
당업계의 통상의 기술자는 화학 반응의 반응 지속 시간, 예를 들어, 단계 a) 및 b) 각각의 반응 지속 시간을 조절하는 방법을 알고 있다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 방법 실시 양태는 단계 a)의 결과로 생성된 반응의 ??칭인 a2)를 추가로 더 포함한다. 상기 ??칭은 예를 들어 30분 이하, 예를 들어 15분 이하의 지속 시간을 갖는다. 일부 예시에서, 상기 ??칭은 단계 a) 이후 곧바로 수행된다. ??칭은 예를 들어 에틸렌 글라이콜(ethylene glycol) 또는 다른 디올, 예를 들어 시스-사이클로-헵테인-1,2-디올(cis-cyclo-heptane-1,2-diol)을 가함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게, ??칭 이후에 곧바로 단계 b)가 이어진다. 이것은 라이소좀 단백질이 반응성 알데하이드에 노출되는 시간을 최소화할 수 있다. 반응성 알데하이드는 단백질의 불활성화 및 응집을 촉진할 수 있다.
한 구현예에서, 상기 방법은 단계 b)의 결과로 생성된 반응의 ??칭인 b2)를 추가로 더 포함한다. 이 ??칭은 예를 들어 케톤 또는 알데하이드 그룹을 포함하는 분자, 예를 들어 사이클로헥산온(cyclohexanone) 또는 아세톤(acetone)의 첨가로 수행될 수 있으며, 상기 분자는 바람직하게는 물에서, 또는 또는 아세트산 또는 다른 산의 첨가로 반응 혼합물의 pH를 6 이하로 낮춤으로써 가용성(soluble)인 것이다. 선택적인 ??칭 단계는 단계 b)의 반응 지속 시간의 정확한 조절을 허용한다.
그와 같이, 한 구현예에서, 단계 a) 및 b)의 적어도 하나는 보호 리간드의 존재 하에 수행된다. 특히, 단계 a)는 보호 리간드의 존재 하에 수행될 수 있다. 리간드, 예를 들어 상기 라이소좀 단백질의 기질은 산화 및 환원 단계, 및 선택적으로 ??칭 단계 동안 단백질의 기능성 에피토프 또는 활성 부위를 보호할 수 있다. 리간드는 선택적으로 단백질의 억제제일 수 있다.
다른 구현예에서, 방법의 단계 a) 및 b)는 라이소좀 단백질이 수지(resin) 상에 고정화되어 있는 동안 수행된다. 그와 같이, 라이소좀 단백질은 초기에 수지 또는 배지 상에 고정화될 수 있다. 이후에 단계 a) 및 b)의 반응, 및 선택적으로 a2) 및 b2)는 상기 단백질이 수지 또는 배지 상에 고정화되어 있는 동안 수행될 수 있다. 적합한 수지 또는 배지는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 이온 교환 배지 또는 친화성 배지(affinity media)가 사용될 수 있다.
방법 실시 양태의 한 구현예에서, 단계 a) 및 b)의 적어도 하나는 보호 리간드의 존재 하에 수행되며, 단계 a) 및 b)는 상기 라이소좀 단백질이 수지 상에 고정화되어 있는 동안 수행된다.
한 구현예에서, 방법의 단계 a) 및 b)는 연속적인 과정으로 수행된다. 특히, 단계 a), a2), b), 및 b2)는 연속적인 과정으로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 “연속적인 과정(continuous process)”은 연속적으로 작동되고 상기 반응물은 연속적으로 과정 단위에 주어지는 것인 과정으로 이해되어야 한다. 반응물, 예를 들어 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드라이드를 라이소좀 단백질을 포함하는 흐름(stream)에 첨가함으로써, 반응은 연속적인 형태로 수행될 수 있다. 연속적인 과정은 예를 들어 멀티-펌프 HPLC 시스템에서 수행될 수 있다.
따라서 본원에 개시된 것과 같은 방법은 개선된 특성을 갖는 변형된 단백질을 제공한다. 라이소좀 단백질의 화학적 변형의 조건은 라이소좀 단백질 폴리펩티드 사슬의 구조적 완전성에 최소한의 부정적 영향을 제공하며, 동시에 자연의 또는 변형되지 않은 글라이칸 에피토프의 실질적인 부재를 야기한다. 방법의 예시적인 구현예는 도 1B, 1C 및 1D에 도시되어 있다.
관련된 실시 양태에서, 단백질을 제조하는 방법으로서, 상기 단백질을 포유동물, 식물 또는 효모 세포에서 발현시킴으로써 글라이코실화된 단백질을 제공하는 단계; 및 상기 글라이코실화된 단백질 상의 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프를 변형시킴으로써 상기 글라이칸 인식 수용체에 대한 단백질의 활성 감소를 포함하는 방법이 제공된다.
한 구현예에서, 상기 변형은 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드라이드와 연속 반응시킴으로써 수행된다. 식물 및 효모 발현 시스템의 예시는 통상의 기술자에게 알려져 있으나 Saccharomyces cerevisiae, Pichia Pastoris 및 Ogataea minuta종(species)의 발현 시스템을 포함할 수 있다. 포유류 세포주의 예시는 CHO 세포주이다. 상기 방법의 다른 구현예는 상기에 개시되어 있다.
한 구현예에서, 상기 정의된 방법 실시 양태의 방법에 의해 수득할 수 있으나, 단 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인 변형된 라이소좀 단백질이 제공된다.
본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질, 상기 라이소좀 단백질 조성물 또는 임의의 한 방법 실시 양태에 의해 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질은 치료에 사용하기 위한 것이다.
본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 변형된 라이소좀 단백질, 어떠한 한 방법 실시 양태에 의해 수득할 수 있는 상기 라이소좀 단백질 조성물 또는 변형된 라이소좀 단백질은 라이소좀 저장병에 걸린 포유동물의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 포유동물 뇌는 인간의 뇌일 수 있다. 관련된 구현예에서, 상기 포유동물은 따라서 인간이다. 따라서, 한 구현예에서, 상기 포유동물 뇌는 마우스의 뇌이다. 관련된 구현예에서, 상기 포유동물은 따라서 마우스이다.
한 실시 양태에서, 포유동물의 뇌 내에서, 라이소좀 저장병을 치료하기 위해 혈액 뇌 장벽을 관통하는 변형된 라이소좀 단백질의 사용으로서, 상기 변형은 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드로 순차적으로 단백질을 처리함으로써 화학적으로 변형된 글라이칸 잔기를 갖는 것을 포함하며, 이에 따라 글라이칸 인식 수용체, 예를 들어 만노오스 및 만노오스-6-포스페이트 세포 수송 시스템에 관련된 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키는 반면, 상기 라이소좀 단백질의 생물학적 활성을 보유하며, 단 상기 라이소좀 단백질이 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, TPP1(트리펩티딜 펩티다아제) 또는 알파 L-이두로니다아제가 아니라는 조건 하에, 의약 제조에서 변형된 라이소좀 단백질의 사용이 제공된다.
한 실시 양태에서, 포유동물에서 영향을 받은 내장 기관 및/또는 말초 조직에서 라이소좀 저장병을 치료하기 위해 상기 영향을 받은 내장 기관 및/또는 말초 조직에 (강화된) 분포를 위한 의약 제조에서 변형된 라이소좀 단백질의 사용으로서, 상기 변형은 알칼리 금속 퍼아이오데이트 및 알칼리 금속 보로하이드로 순차적으로 단백질을 처리함으로써 화학적으로 변형된 글라이칸 잔기를 갖는 것을 포함하며, 그로써 글라이칸 인식 수용체, 예를 들어 만노오스 및 만노오스-6-포스페이트 세포 수송 시스템에 관련된 변형된 라이소좀 단백질의 활성을 감소시키는 반면, 상기 라이소좀 단백질의 생물학적 활성을 보유하며, 단 상기 라이소좀 단백질이 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, TPP1(트리펩티딜 펩티다아제) 또는 알파 L-이두로니다아제가 아니라는 조건 하에, 변형된 라이소좀 단백질의 사용이 제공된다.
본원에 개시된 실시 양태의 한 구현예에서, 상기 라이소좀 저장병은 만노사이드 축적증 베타 A; 라이소좀성; 거대뇌증이 없는; 낭성; 백색뇌병(LCWM); 만노사이드 축적증, 알파 B; 라이소좀성(MANSA); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성 2(CLN2); 척수소뇌성 실조증; 상염색체 열성 7(SCAR7); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성; 5(CLN5); 고쉐병(GD); 푸코사이드 축적증(FUCA1D); 미엘로퍼옥시다아제 결핍증(MPOD); 파브리병(FD); GM2-강글리오시드 축적증 1(GM2G1); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성, 10(CLN10); 복합 사포신 결핍증(CSAPD); 사포신-B 결핍으로 인한 이염색백색질장애(MLD-SAPB); 사포신 C 결핍으로 인한 비정형 고쉐병(AGD); 사포신 A 결핍으로 인한 비정형 크라베병(AKRD); 테이-삭스병 변종에서 PSAP 사포신-D 영역의 결함이 발견된다(GM2-강글리오시드 축적증); GM2-강글리오시드 축적증 2(GM2G2); 점액다당류증 7(MPS7); 당원축적병 2(GSD2); 갈락토시알리도시스(GSL); 면역조절장애 관련 척추내연골종형성이상(SPENCDI); 이염색백색질장애(MLD); 점액다당류증 3D(MPS3D); 점액다당류증 6(MPS6); GM1-강글리오시드 축적증 1(GM1G1); GM1-강글리오시드 축적증 2(GM1G2); GM1-강글리오시드 축적증 3(GM1G3); 점액다당류증 4B(MPS4B); 쉰들러병(SCHIND); 칸자키병(KANZD); 니만-피크병 A(NPDA); 니만-피크병 B(NPDB); GM2-강글리오시드 축적증 AB(GM2GAB); 아스파르틸글루코스아민뇨증(AGU); 점액다당류증 2(MPS2); 점액다당류증 4A(MPS4A); 점액다당류증 1H(MPS1H); 점액다당류증 1H/S(MPS1H/S); 점액다당류증 1S(MPS1S); 월만병(WOD); 콜레스테릴에스테르 축적병(CESD); 피크노디소토시스(PKND); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성, 1(CLN1); 점액다당류증 3A(MPS3A); 빠삐용-르페브르 증후군(PLS); 하임-멍크 증후군(HMS); 치주염, 급진성, 1(AP1); 점액다당류증 3B(MPS3B); 공세포백색질장애(GLD); 니만-피크병 C2(NPC2); 점액다당류증 9(MPS9); 파버 지방육아종증(FL); 진생성근간대성간질을 동반한 척수성근위축증(SMAPME); 고콜레스테롤혈증, 상염색체 우성, 3(HCHOLA3); 시알리도시스(SIALIDOSIS); 자가면역질환 6(AIS6); 세로이드 지질갈색소증, 신경원성, 13(CLN13), 및 다중 설파타아제 결손증(MSD)으로부터 선택된 것이다.
한 구현예에서, 치료에 이용하기 위한 상기 변형된 라이소좀 단백질, 라이소좀 단백질 조성물, 또는 상기 방법 실시 양태에 의해 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질은 상기 포유 동물의 뇌에서 라이소좀 저장을 감소시킨다. 특히, 상기 저장은 예를 들어 동물 모델에서, 적어도 30%, 예를 들어 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60% 감소된다.
한 실시 양태에서 변형된 라이소좀 단백질의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 라이소좀 저장병에 걸린 포유동물의 치료 방법으로서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은
a) 본원에 개시된 구현예 및 실시 양태에 설명된 것과 같은, 또는 그로부터 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질, 및
b) 본원의 실시 양태 및 구현예에 설명된 것과 같은 라이소좀 단백질 조성물 로부터 선택되는 것인,
방법이 제공된다.
그의 한 구현예에서, 상기 치료는 70일간의 시간 동안 변형된 라이소좀 단백질의 10회 투여 이후 포유 동물의 뇌에서 적어도 약 50%의 라이소좀 저장의 클리어런스를 야기한다.
본 발명은 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 더 설명될 것이다.
도 1은 실시예 3에 개시된, 본 발명자들에 의해 발명된 화학적 변형을 위한 방법과, WO 2008/109677에 개시된, 공지된 방법 사이의 차이점의 개요를 나타낸 그림이다.
도 2A는 설파아미다아제(sulfamidase)(레인 1), 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제(레인 2), 이두로네이트 2-설파타아제(iduronate 2-sulfatase) (레인 3) 및 공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제(레인 4), 알파-L-이두로니다아제(alpha-L-iduronidase)(레인 5) 및 공지된 방법에 따라 변형된 알파-L-이두로니다아제(레인 6)의 SDS PAGE 겔이다. 설파아미다아제의 글라이칸 변형 절차에 따라 생성된 1-4로 표기된 4개의 단백질 밴드가 확인되었다(레인 2).
도 2B는 공지된 방법에 따라 변형된(레인 1,3 및 5) 및 본원에 개시된 새로운 방법에 따라 변형된(레인 2, 4, 6, 7 및 8) 설파아미다아제, 이두로니다아제 2-설파타아제 및 알파-L-이두로니다아제의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 3A는 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제의 SEC 크로마토그램(chromatogram)을 나타낸다.
도 3B는 본원에 개시된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 SEC 크로마토그램을 나타낸다. 화살표로 표시된 부분은 변형된 설파아미다아제의 다량체 형태의 피크(peak)이다.
도 4A는 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제의 동적 광산란(dynamic light scattering)에 의해 측정된 산란 강도(intensity)를 나타낸다.
도 4B는 본원에 설명된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 동적 관산란에 의해 측정된 산란 강도를 나타낸다.
도 5는 변형되지 않은 재조합 설파아미다아제, 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제 및 본원에 설명된 새로운 방법 1 및 4에 따라 변형된 설파아미다아제의 MEF-1 세포 내에서의 변형되지 않은 재조합 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 시각화한 도식이다.
도 6A는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg를 격일로 i.v. 투여(13회 투여)한 이후 마우스의 뇌 내에 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 6B는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg를 격일로 i.v.투여(13회 투여)한 이후 마우스의 간 내에 헤파란 설페이트 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 6C는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg 및 10 mg/kg를 각각 일주일에 1회 i.v.투여(10회 투여)한 이후 마우스의 뇌 내에 헤파란 설페이트 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 7은 포유동물 기원의 단백질에 일반적으로 존재하는 3개의 전형적인 N-글라이칸 구조 및 효모 단백질에 존재하는 전형적인 N-글라이칸의 개략도이다. 왼쪽 글라이칸은 올리고만노오스(oligomannose) 유형, 왼쪽에서 2번째는 복합체(complex) 유형, 오른쪽에서 2번째는 하이브리드(hybrid) 유형을 나타낸다. 가장 오른쪽에 있는 것은 효모 단백질의 폴리만노오스(polymannose) 유형이다. 도면 내에는 다음의 화합물이 도시되어 있다: 검정색으로 칠해진 다이아몬드는 N-아세틸뉴라민 산(N-acetylneuraminic acid)에 상응한다; 검정색으로 칠해진 원은 만노오스(mannose)에 상응한다; 사각형은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)에 상응한다; 검정색으로 칠해진 삼각형은 푸코오스(fucose)에 상응한다; 원은 갈락토오스(galactose)에 상응한다. 별표(asterisk)로 표시된 당(sugar) 잔기는 본원에 개시된 퍼아이오데이트(periodate)/보로하이드라이드(borohydride) 처리에 의해 변형될 수 있다.
도 8A는 화학적 변형 이후 만노오스 상에 예측되는 결합 절단을 나타내는 개략도이다.
도 8B는 Man-6 글라이칸의 모델을 나타내는 개략도이다. 퍼아이오데이트에 의한 산화 시 결합 절단될 수 있는 당 잔기가 표시되어 있다. 회색 원은 만노오스에 상응하며, 검정색 사각형은 N-아세틸글루코사민에 상응하며, T13은 N-글라이코실화 부위(N-glycosylation site) N(131)이 포함된 설파아미다아제의 트립틱(tryptic) 펩티드 NITR(서열번호 44)에 상응한다.
도 9는 화학적 변형 이전(A) 및 기존에 공지된 방법에 따른 화학적 변형 이후(B-D), N(131)에 부착된 Man-6 글라이칸을 포함한 설파아미다아제의 트립틱 펩티드 T13(서열번호 44)에 상응하는 이중 차지된 이온의 질량 스펙트럼을 나타낸다(S.= 단일 결합 절단; D. = 이중 결합 절단; 예를 들어, D.x3 = 3개의 이중 결합 절단).
도 10A는 기존에 공지된 방법(검정색 막대), 새로운 방법 1(검정색 점), 새로운 방법 3(흰색), 및 새로운 방법 4(체크무늬)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 이후 트립틱 펩티드 T13+Man-6 글라이칸(서열번호 44)의 결합 절단의 정도를 나타낸 도식이다.
도 10B는 기존에 공지된 방법(검정색 막대), 새로운 방법 1(검정색 점), 새로운 방법 3(흰색), 및 새로운 방법 4(체크무늬)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 이후 트립틱 펩티드 T13+Man-6 글라이칸(서열번호 44)에서의 단일 결합 절단의 상대적인 풍부함(abundance)을 시각화한 도식이다.
도 11은 이두로네이트 2-설파타아제 및 새로운 방법 10 및 11에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 활성을 나타낸 도식이다.
도 2A는 설파아미다아제(sulfamidase)(레인 1), 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제(레인 2), 이두로네이트 2-설파타아제(iduronate 2-sulfatase) (레인 3) 및 공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제(레인 4), 알파-L-이두로니다아제(alpha-L-iduronidase)(레인 5) 및 공지된 방법에 따라 변형된 알파-L-이두로니다아제(레인 6)의 SDS PAGE 겔이다. 설파아미다아제의 글라이칸 변형 절차에 따라 생성된 1-4로 표기된 4개의 단백질 밴드가 확인되었다(레인 2).
도 2B는 공지된 방법에 따라 변형된(레인 1,3 및 5) 및 본원에 개시된 새로운 방법에 따라 변형된(레인 2, 4, 6, 7 및 8) 설파아미다아제, 이두로니다아제 2-설파타아제 및 알파-L-이두로니다아제의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 3A는 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제의 SEC 크로마토그램(chromatogram)을 나타낸다.
도 3B는 본원에 개시된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 SEC 크로마토그램을 나타낸다. 화살표로 표시된 부분은 변형된 설파아미다아제의 다량체 형태의 피크(peak)이다.
도 4A는 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제의 동적 광산란(dynamic light scattering)에 의해 측정된 산란 강도(intensity)를 나타낸다.
도 4B는 본원에 설명된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 동적 관산란에 의해 측정된 산란 강도를 나타낸다.
도 5는 변형되지 않은 재조합 설파아미다아제, 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제 및 본원에 설명된 새로운 방법 1 및 4에 따라 변형된 설파아미다아제의 MEF-1 세포 내에서의 변형되지 않은 재조합 수용체 매개 세포내이입(endocytosis)을 시각화한 도식이다.
도 6A는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg를 격일로 i.v. 투여(13회 투여)한 이후 마우스의 뇌 내에 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 6B는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg를 격일로 i.v.투여(13회 투여)한 이후 마우스의 간 내에 헤파란 설페이트 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 6C는 MPS IIIA 결핍 마우스의 생체내 처리의 결과이다. 도식은 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg 및 10 mg/kg를 각각 일주일에 1회 i.v.투여(10회 투여)한 이후 마우스의 뇌 내에 헤파란 설페이트 저장의 클리어런스를 나타낸다.
도 7은 포유동물 기원의 단백질에 일반적으로 존재하는 3개의 전형적인 N-글라이칸 구조 및 효모 단백질에 존재하는 전형적인 N-글라이칸의 개략도이다. 왼쪽 글라이칸은 올리고만노오스(oligomannose) 유형, 왼쪽에서 2번째는 복합체(complex) 유형, 오른쪽에서 2번째는 하이브리드(hybrid) 유형을 나타낸다. 가장 오른쪽에 있는 것은 효모 단백질의 폴리만노오스(polymannose) 유형이다. 도면 내에는 다음의 화합물이 도시되어 있다: 검정색으로 칠해진 다이아몬드는 N-아세틸뉴라민 산(N-acetylneuraminic acid)에 상응한다; 검정색으로 칠해진 원은 만노오스(mannose)에 상응한다; 사각형은 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)에 상응한다; 검정색으로 칠해진 삼각형은 푸코오스(fucose)에 상응한다; 원은 갈락토오스(galactose)에 상응한다. 별표(asterisk)로 표시된 당(sugar) 잔기는 본원에 개시된 퍼아이오데이트(periodate)/보로하이드라이드(borohydride) 처리에 의해 변형될 수 있다.
도 8A는 화학적 변형 이후 만노오스 상에 예측되는 결합 절단을 나타내는 개략도이다.
도 8B는 Man-6 글라이칸의 모델을 나타내는 개략도이다. 퍼아이오데이트에 의한 산화 시 결합 절단될 수 있는 당 잔기가 표시되어 있다. 회색 원은 만노오스에 상응하며, 검정색 사각형은 N-아세틸글루코사민에 상응하며, T13은 N-글라이코실화 부위(N-glycosylation site) N(131)이 포함된 설파아미다아제의 트립틱(tryptic) 펩티드 NITR(서열번호 44)에 상응한다.
도 9는 화학적 변형 이전(A) 및 기존에 공지된 방법에 따른 화학적 변형 이후(B-D), N(131)에 부착된 Man-6 글라이칸을 포함한 설파아미다아제의 트립틱 펩티드 T13(서열번호 44)에 상응하는 이중 차지된 이온의 질량 스펙트럼을 나타낸다(S.= 단일 결합 절단; D. = 이중 결합 절단; 예를 들어, D.x3 = 3개의 이중 결합 절단).
도 10A는 기존에 공지된 방법(검정색 막대), 새로운 방법 1(검정색 점), 새로운 방법 3(흰색), 및 새로운 방법 4(체크무늬)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 이후 트립틱 펩티드 T13+Man-6 글라이칸(서열번호 44)의 결합 절단의 정도를 나타낸 도식이다.
도 10B는 기존에 공지된 방법(검정색 막대), 새로운 방법 1(검정색 점), 새로운 방법 3(흰색), 및 새로운 방법 4(체크무늬)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 이후 트립틱 펩티드 T13+Man-6 글라이칸(서열번호 44)에서의 단일 결합 절단의 상대적인 풍부함(abundance)을 시각화한 도식이다.
도 11은 이두로네이트 2-설파타아제 및 새로운 방법 10 및 11에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 활성을 나타낸 도식이다.
실시예
다음의 실시예는 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제(iduronate 2-sulfatase)에 의해 예시된, 변형된 라이소좀 단백질의 제조를 개시하고 있다.
재료 및 방법
하기의 실시예에 사용된 재조합 알파-L-이두로니다아제는 Aldurazyme®의 의약품이었으며, 반면 재조합 이두로네이트 2-설파타아제는 Elaprase®의 의약품이었다. 양자 모두 약국(Apoteket farmaci, Sweden)에서 구입하였으며, 제조업자의 지시에 따라 보관되었고, 무균 상태에서 처리되었다.
설파아미다아제는 pcDNA3.1(+) 벡터를 이용한 HEK293 세포 및 pQMCF1 벡터를 이용한 QMCF(Quattromed Cell Factory) 에피솜 발현 시스템(Icosagen AS)을 포함한 CHO에서의 일시적 발현을 통해 제조되었다. 설파아미다아제는 20mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0에서 평형화되고 NaCl에 의해 용리된(eluted) Q 세파로오스 컬럼(GE Healthcare)에서 AIEX(anion exchange chromatography)에 의해 배지로부터 포획되었다. 포획된 설파아미다아제는 MEP(4-Mercapto-Ethyl-Pyridine) 크로마토그래피에 의해 추가로 더 정제되었다; 설파아미다아제를 포함한 단편(fraction)들은 MEP 하이퍼셀 크로마토그래피 컬럼에 로드되었고 50 mM NaAc, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 4.6에서 등용매 용리(isocratic clution)에 의해 이어서 용리되었다. 최종 폴리싱(polishing)은 25 mM NaAc, 2 mM DTT, pH 4.5에서 평형화된 SP 세파로오스 FF(GE Healthcare) 컬럼에서 양이온 교환 크로마토그래피(CIEX)에 의해 수행되었다. NaCl 구배(gradient)가 용리에 이용되었다.
실시예 1: 기존에 공지된 방법에 따른 라이소좀 단백질 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제의 화학적 변형
WO 2008/109677에 따른 화학적 변형: 글라이칸 잔기를 변형하기 위해, 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 20 mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 6.5 시간 동안 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에서 초기에 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 4 ℃ 에서 20mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에 대해 하룻밤 동안(over night) 투석을 수행하기 전에 15분 동안 0 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 투석 이후, 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 더하여 최종 농도가 100mM이 되도록 하여 환원이 수행되었다. 환원 반응은 하룻밤 동안 진행되도록 허용되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20mM 나트륨 포스페이트, 137mM NaCl(pH 6.0)에 대하여 투석되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다.
실시예 2: 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트-2-설파타아제의 분석
재료 및 방법
SDS-PAGE 분석: 실시예 1에 설명된 것과 같은 공지된 방법에 따라 변형된 라이소좀 효소는 NuPAGE 4-12 % Bis-Tris 겔에 단백질을 로드한 SDS-PAGE 분석의 대상이 되었다. Seeblue 2 plus 마커가 분자량 측정에 사용되었으며 겔은 Instant Blue(C.B.S Scientific)로 염색되었다.
트립틱 단편(tryptic fragment)의 LC/MS에 의한 글라이칸 분석: 실험예 1의 3개의 라이소좀 단백질의 트립틱 단편의 LC/MS에 의해 글라이코실화 패턴이 결정되었다. 글라이코펩티드 분석 전에, 단백질은 환원되고, 알킬화(alkylated)되고 트립신으로 분해되었다. 단백질의 환원은 60 ℃ (알파-L-이두로니다아제의 경우 70 ℃)에서 1시간 동안 50 mM NH4HCO3에서 5 μl DTT 10 mM에서 인큐베이션되었다. 순차적인 알킬화가 50 mM NH4HCO3 에서 5 μl 아이오도아세트아미드(iodoacetamide) 55mM으로 RT(room temperature)에서 45분 동안 암실에서 수행되었다. 마지막으로, 트립틱 분해는 50 mM 아세트산에서 50 mM NH4HCO3, 5 mM CaCl2, pH 8, 및 0.2 μg/μl 트립신의 30 μl를 더하여 수행되었다(프로테아제:단백질 비율 1:20(w/w)). 분해는 37 ℃에서 하룻밤 동안 수행되도록 허용되었다.
트립틱 펩티드 단편의 가능한 글라이코실화 변이체는 글라이코펩티드 분석을 이용해 조사되었다. 이것은 Agilent 1200 HPLC 시스템과 Agilent 6510 4중극 비행시간 질량분석기(Q-TOF-MS)를 결합한 LC-MS에 의해 수행되었다. 모든 시스템은 MassHunter Workstation에 의해 조절되었다. 컬럼 온도를 40 ℃로 설정하고, Waters XSELECT CSH 130 C18 컬럼(150 x 2.1 mm)을 사용해 LC 분리를 수행하였다. 이동상(Mobile phase) A는 5 % 아세토니트릴(acetonitrile), 0.1 % 프로피온산(propionic acid), 및 0.02 % TFA로 구성되었으며, 이동상 B는 95% 아세토니트릴, 0.1% 프로피온산 및 0.02% TFA로 구성되었다. 10 분 동안 0 % 내지 10 % B의 구배(gradient), 이어서 또 다른 25 분 동안 10 % 내지 70 % B의 구배가 0.2 mL/분의 유속으로 사용되었다. 주입 부피(injection volume)는 10 μl였다. Q-TOF는 양성 전기스프레이 이온 모드(positive-electrospray ion mode)로 작동되었다. 데이터 수집 과정에서, 프래그멘터(fragmentor) 전압, 스키머(skimmer) 전압, 옥토폴(octopole) RF는 각각 90, 65, 650V로 설정되었다. 질량 범위는 300과 2800 m/z 사이였다.
하기의 분석은 설파아미다아제 제제에 대해서만 수행되었다.
설파아미다아제의 동적 광산란(DLS) 분석: 변형된 설파아미다아제는 RT에서 3분 동안 12000 rpm으로 원심분리되어 내부 가스를 제거하였다. DLS 실험은 각각의 75 μL 의 복제본에 25% 레이저 파워를 이용하여 DynaPro Titan 장치(Wyatt Technology Corp)에서 수행되었다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 설파아미다아제의 분석: 변형된 효소는 AKTAmicro system(GE Healthcare)에서 분석적인 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 완충 제제의 40 μL/min의 유속을 갖는 Superdex 200 PC 3.2/30 컬럼이 사용되었다. 샘플 부피는 10 μL이고 10 μg의 효소를 포함하였다.
설파아미다아제의 겔 내(In-gel) 분해 및 MALDI-TOF MS 분석: SDS-PAGE 분석으로 일부 추가적인 밴드를 발견했으며, 이들을 절단하고, 탈색하고 트립신으로 겔 내 분해 처리하였다. 분해는 37 ℃에서 하룻밤 동안 수행되었다. 상청액은 새로운 튜브에 옮겨지고 RT에서 60 % 아세토니트릴, 0.1% TFA (3x20 min)로 추출되었다. 결과물인 상청액은 Speed Vac에서 거의 건조될 때까지 증발되었다. 증발된 용액은 알파-시아노-4-하이드록시신남산(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 용액과 1:1로 혼합되었고, 0.6 μL이 MALDI 플레이트에 가해졌다. 트립틱 펩티드 단편의 분자량은 Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF MS(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometer)를 사용하여 결정되었다. 분석은3550 레이저 에너지 및 400샷(shot)을 갖는 양이온 이온반사 모드(positive ion reflectron mode)로 수행되었다.
설파아미다아제 활성 부위의 보존: 설파아미다아제의 활성 부위에 대한 화학적 변형의 모든 효과를 LC-MS 및 LC-MS/MS 분석을 사용해 조사하였다. 샘플은 하기에 글리코실화 분석(Glycosylation analysis)섹션에서 설명한 LC-MS 방법에 따라 제조되었다. 시스테인 50 변이체(알킬화된 시스테인 50, 산화된 시스테인 50, FGly50 및 Ser50)를 포함하는 수득되는 트립틱 펩티드는 모두 재구성된 이온 크로마토그램으로부터 피크 영역을 계산하여 반정량화되었다. 펩티드의 동정은 MSMS 시퀀싱을 이용해 확정되었다. MSMS 파라미터는 다음과 같았다: 충돌 에너지는 10, 15, 및 20V, 스캔 범위는 100-1800 m/z, 및 스캔 속도는 1 scan/sec로 설정되었다.
결과
SDS-PAGE 분석에 의해 분명한 것과 같이, 공지된 방법에 따른 화학적 변형의 결과로서, 완전한 길이의(full length) 단백질과 구별되는 크기의 몇몇 주요 펩티드가 형성되었다(도 2A). 낮은 분자량의 펩티드 밴드는, 펩티드 절단 생성물을 나타내며, 설파아미다아제에서 가장 우세하지만 3개의 라이소좀 단백질 모두에서 분명히 나타난다. MALDI-TOF MS 분석에 의해, SDS-PAGE에서 관찰된 #1-4의 4개의 겔 밴드(도 2A, 2레인)는 화학 변형 동안 스트랜드(strand) 절단에 의해 생성된 설파아미다아제 단편으로 확인할 수 있었다. 겔 밴드 #1 및 #2는 6 kDa 및 30kDa의 분자량을 갖는 두 C-말단 절단(truncation)으로, 겔 밴드 #3은 41 kDa N-말단 절단임이 결정되었다.
또한, 공지된 방법에 따른 화학적 변형이 설파아미다아제 상의 몇몇 메티오닌 잔사(residue), 특히 거의 완전히 산화된 메티오닌 184 및 메티오닌 443에서의 산화를 일으킨다는 것이 발견되었다. 메티오닌 226(트립틱 펩티드의 아미노산 잔사 226-238에 상응하는 것으로 발견됨)은 더 낮은 정도로 산화되었으나, 이 산화는 41 kDa N-말단 절단을 유발하는 것과 같이 변형되지 않은 설파아미다아제보다 불안정한 단백질을 야기하는 것으로 나타났다. 따라서, 메티오닌 226의 산화 및 스트랜드 절단은 MS 분석에서 관찰된 것처럼 관련이 있는 것으로 보였다.
특히, 공지된 방법에 따른 화학적 변형의 결과로서 공유 다량체화(covalent multimerisation)를 나타내는 더 높은 분자량의 밴드는 3개의 라이소좀 단백질 모두에서 분명했다. 설파아미다아제에 있어서, 가장 우세한 밴드는 111 kDa 분자량의 이량체로 확인할 수 있다(도 2A, 레인 2, 밴드 #4). 더욱 심각한 다량체화는 알파-L-이두로니다아제에서 관찰되었다(도 2A, 레인 6).
따라서, 공지된 방법(WO 2008/109677)에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형은 글라이칸을 변형할 뿐만 아니라 폴리펩티드 스트랜드 절단, 공유 다량체화 및 효소의 구조적 완전성에 중요한 아미노산 잔사의 산화를 생성한다는 것이 발견되었다.
SDS-PAGE 분석은 또한 변형되지 않은 단백질과 비교했을 때 모든 3개의 라이소좀 단백질에서 주요 단량체 밴드의 위치를 공통적으로 낮춘다는 것을 분명히 나타낸다(도 2A 레인 1 대 레인 2; 레인 3 대 레인 4; 레인 5 대 레인 6). 이것은 대략 500-1500 Da의 분자량의 손실을 시사하며, 이중결합 절단에 의해 글라이칸 잔기가 주로 변형되는 화학 반응으로 예상된다(도 8).
SEC에 의한 설파아미다아제의 추가적인 분석은, 도 3A의 크로마토그램에서의 프리-피크(pre-peak)로 증명된 것과 같이, 공지된 방법에 따른 화학적 변형 절차가 설파아미다아제의 응집(aggregation)을 촉진한다는 것을 밝혔다. 크로마토그램 내의 프리-피크의 피크 높이는 주 피크의 높이의 약 3% 정도인 것으로 나타났다. DLS 분석은 또한 동일한 물질이 높은 분자량 형태(즉, 1010 kDa 이상) 내의 전체 단백질 내용물의 15-20%의 단백질을 포함하고 있다는 것을 밝혔다(도 4A).
또한, LC-MSMS의 사용으로, 환원 단계(도 1A)가 설파아미다아제의 활성 부위 위치 50의 FGly 잔사를 Ser로 환원하는 것이 발견되었다(서열번호 44). 이 위치에서의 Ser은 효율적인 촉매 작용에 적합하지 않다(Recksiek et al, J Biol Chem 273(11):6096-103 (1998)). FGly로부터 생성된 Ser의 상대적인 양은 FGly50 및 Ser50을 포함하는 2개의 트립틱 펩티드 단편에 상응하는 질량 스펙트럼에서 2중으로 하전된(charged) 이온의 피크 영역 측정에 기반하여 계산되었다. 피크 영역은 이온화 효율에 대한 보정 없이 MS 반응에 기반하였다. 하기의 표 2는 공지된 방법에 따른 FGly의 Ser로의 전환은 약 56%임을 나타낸다(실시예 4, 표 3 또한 참고하라).
설파아미다아제의 화학적 변형 | Ser 형성 (%) | FGly/Ser 비 |
없음 | 0 | |
WO 2008/109677 | 56.0 ± 0.3 (n=3) | ca 0.79 |
그와 같이, 상기 언급한 변형에 추가로, 공지된 화학적 변형 절차는, 설파아미다아제의 촉매 활성에 중요한 아미노산의 환원을 유발한다. FGly 잔사는 모든 설파타아제에 존재하며 효소 활성에 중요하다.
트립틱 단편의 LC/MS에 의한 글라이칸 분석은, 화학 변형 이후 분석한 라이소좀 단백질에서 천연적인 글라이칸이 전혀 존재하지 않았다는 것을 확인하였으며, 글라이칸의 완전한 변형을 나타냈다.
실시예 3: 라이소좀 효소 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제, 및 이두로네이트-2-설파타아제의 화학적 변형을 위한 새로운 방법
새로운 방법 1에 따른 화학적 변형: 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 20 mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 암실에서 120분 동안 pH 6.0의 포스페이트 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 50mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 가하기 전에, 15분 동안 6 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0 ℃에서 120분 동안 암실에서 인큐베이션된 후, 수득되는 단백질 제제는 20mM 나트륨 포스페이트, 100mM NaCl, pH 6.0 에 대해 한외 여과되었다. 화학적 변형을 위한 새로운 방법 1은 도 1B에 도시되어 있다.
새로운 방법 2에 따른 화학적 변형: 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 15mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 0.5시간 동안 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl(pH 6.0)내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 96mM의 최종 농도로 ??칭되었다. ??칭은 15분 동안 0 ℃에서 진행되도록 허용되었다. 그리고 나서 나트륨 보로하이드라이드는 최종 농도가 38 mM이 되도록 반응 혼합물에 가해졌으며, 수득되는 혼합물은 0 ℃에서 0.5시간 동안 보관되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에 대해 한외 여과되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다. 화학적 변형을 위한 새로운 방법 2는 도 1C에 도시되어 있다.
새로운 방법 3에 따른 화학적 변형: 상기 언급된 라이소좀 단백질은 처음에 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 0.5시간 동안 20mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 96mM의 최종 농도로 ??칭되었다. ??칭은 15분 동안 0 ℃에서 진행되도록 허용되었다. 그리고 나서 나트륨 보로하이드라이드는 최종 농도가 15mM이 되도록 반응 혼합물에 가해졌으며, 수득되는 혼합물은 0 ℃에서 1시간 동안 보관되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20 mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)에 대해 한외 여과되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다. 화학적 변형을 위한 새로운 방법 3은 도 1D에 도시되어 있다.
다음에 이어지는 새로운 방법의 예시들은 하나의 구체적인 라이소좀 단백질에 대해 측정되고 예시되었다.
새로운 방법 4: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 환원 단계의 나트륨 보로하이드라이드의 농도가 10mM이라는 것을 제외하고 방법 1과 같이 수행되었다.
새로운 방법 5: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 설파아미다아제는 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 암실에서 180분 동안 4.5와 6 사이의 최초 pH를 갖는 아세테이트(acetate) 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 25mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 가하기 전에, 15분 동안 6 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0 ℃에서 암실에서 60분 동안 인큐베이션된 후, 수득되는 설파아미다아제 제제는 10 mM 나트륨 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.4에 대해 한외 여과되었다.
새로운 방법 6: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 설파아미다아제는 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 8℃에서 암실에서 60분 동안 4.5의 최초 pH를 갖는 아세테이트 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 25mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드라이드를 가하기 전에 15분 동안 6℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0℃에서 암실에서 60분 동안 인큐베이션된 후, 수득되는 설파아미다아제 제제는 10 mM 나트륨 포스페이트, 100mM NaCl, pH 7.4에 대해 한외 여과되었다.
새로운 방법 7: 설파아미다아제에 대해 예시되었다. 설파아미다아제는 10mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 8 ℃에서 암실에서 60분 동안 4.5의 최초 pH를 갖는 아세테이트 완충액 내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 192mM의 최종 농도로 ??칭되었다. 최종 농도가 25mM이 되도록 반응 혼합물에 나트륨 보로하이드를 가하기 전에 15분 동안 6 ℃에서 ??칭이 진행되도록 허용되었다. 0 ℃에서 암실에서 30분 동안 인큐베이션된 후, 수득되는 설파아미다아제 제제는 10 mM 나트륨 포스페이트, 100 mM NaCl, pH 7.4에 대해 한외 여과되었다.
새로운 방법 8: 알파-L-이두로니다아제에 대해 예시되었다. 알파-L-이두로니다아제는 15mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 0 ℃에서 20분 동안 20mM 나트륨 포스페이트, 137 mM NaCl (pH 6.0)내에서 인큐베이션되었다. 글라이칸 산화는 에틸렌 글라이콜을 가함으로써 96mM의 최종 농도로 ??칭되었다. ??칭은 15분 동안 0 ℃에서 진행되도록 허용되었다. 그리고 나서 나트륨 보로하이드라이드는 최종 농도가 37mM이 되도록 반응 혼합물에 가해졌으며 수득되는 혼합물은 0 ℃에서 1시간 동안 보관되었다. 최종적으로, 효소 제제는 20mM 나트륨 포스페이트, 137mM NaCl(pH 6.0)에 대해 한외 여과되었다. 모든 인큐베이션은 암실에서 수행되었다.
새로운 방법 9: 알파-L-이두로니다아제에 대해 예시되었다. 퍼아이오데이트 산화가 산화 단계 동안 보호 리간드로 작용하는 100 μM 4-메틸움벨리페론 이두로나이드(4-methylumbeliferone iduronide)의 존재 하에 수행되었다는 것 한 가지를 제외하고, 반응 조건은 새로운 방법 8에 설명된 것과 같다.
결과
본원의 다른 곳에서 이미 설명한 것과 같이, 나트륨 메타-퍼아이오데이트는 탄수화물의 시스(cis)-글라이콜 그룹을 알데하이드 그룹으로 변환시키는 산화제이며, 반면에 보로하이드라이드는 알데하이드를 더 반응성이 낮은 알코올로 환원시키는 환원제이다. 탄수화물 구조는 그와 같이 비가역적으로 파괴된다.
글라이칸의 화학적 변형을 위한 개선된 방법, 특히 개선된 특성을 갖는 변형된 라이소좀 단백질을 제공하는 절차를 제공하기 위해, 상당한 수의 반응 조건이 측정되었다. 나트륨 메타-퍼아이오데이트에 의한 산화 및 나트륨 보로하이드에 의한 환원 모두가 촉매 활성 및 면역원성 경향에 부정적인 영향을 미치는 특성인 폴리펩티드 변형 및 응집을 도입하였다고 결론내릴 수 있었다.
개선된 화학적 변형 절차를 위한 조건들이 발견되었다(새로운 방법 1-9에 의해 예시되었다). 놀랍게도, 나트륨 메타-퍼아이오데이트 산화 이후 곧바로 이어진 나트륨 보로하이드라이드 환원 단계 및 공지된 방법에 비해 균형이 유지되어 있으며 상당히 낮은/짧은 반응물 농도 및 반응 시간에 의해, 라이소좀 단백질의 구조적 완전성 및 활성이 보유될 수 있었다. 새로운 방법은 완충액 교환 및 라이소좀 단백질의 반응성 알데하이드 중간물질에 대한 긴 노출을 생략한다. 새로운 화학 변형 절차의 예시는 도 1B-1D에 도시되어 있다.
실시예 4: 새로운 방법에 따라 변형된 설파아미다아제, 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제의 분석
실시예 2에 설명된 실험 방법은 새로운 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질을 분석하는 데에 사용되었다.
결과
펩티드 절단 생성물을 나타내는 낮은 분자량의 펩티드 밴드 역시 새로운 방법에 따라 변형된 물질에도 분명했으나 상당히 낮은 수준이었다(도 2B, 레인 1 대 레인 2; 레인 3 대 레인 4; 레인 5 대 레인 6, 7 및 8). 새로운 방법 8에 따라 변형된 알파-L-이두로니다아제에 있어서, 단량체 밴드만이 분명했다(도 2B 레인 7). 중요하게, 활성 부위를 보호하는 리간드(새로운 방법 9, 도 2B 레인 8)은 절차에 적합했으며 그 결과로 SDS-PAGE 분석에 의해 리간드가 생략되었는지 구별할 수 없는 변형된 알파-L-이두로니다아제를 생성하였다(새로운 방법 8).
결론적으로, 변형 방법에 의해 제조된 의약품의 품질 및 안전성을 제한하는, 공정 관련 불순물은, 기존에 공지된 방법에 비교하여 새로운 방법에서 상당히 감소된다.
선택된 트립틱 펩티드 단편의 글라이칸 분석은, 자연적으로 발생하는 글라이칸 구조가 화학적 변형 이후에도 잔류하는 것이 전혀 없거나 일부 사례에서 5% 미만으로 존재한다는 것을 나타냈으며, 이는 글라이칸의 완전한 변형 또는 거의 완전한 변형을 나타낸다.
SEC에 의한 설파아미다아제의 추가적인 분석은 공지된 방법에 의해 변형된 설파아미다아제와 비교하여 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제가 더 적은 응집을 포함했다는 것을 나타냈다. 이것은 높은 분자량 형태가 크로마토그램 내에 프리-피크로 존재하는 도 3의 크로마토그램에 증명되어 있다. 도 3B에서의 프리-피크의 피크 높이는 주 피크의 높이에 대해 0.5%이며, 그와 같이 도 3A의 피크 높이(3%)와 비교하여 감소를 나타낸다. 이것은 또한 새로운 방법 5 및 6에 의해 변형된 설파아미다아제의 경우에도 그러하다(데이터는 나타내지 않음). DLS 분석(도 4B)은 SEC 분석으로부터의 결과를 확인한다: 새로운 방법에 따라 제조된 설파아미다아제는 높은 분자량 형태(1010 kDa 이상) 내에서 5%의 단백질을 포함한다. 그와 같이 응집된 설파아미다아제의 형성은 새로운 방법에 의해 제한된다.
설파아미다아제는 활성 부위 보존의 정도를 평가하여 추가로 더 연구하였다: 설파아미다아제의 활성 부위에서 위치 50의 FGly로부터 Ser의 환원은 LC-MS/MS로 결정되었으며 FGly 및 Ser을 포함하는 트립틱 펩티드는 양성으로 확인되었다. 펩티드 단편의 상대적인 양은 2중으로 하전된 이온(이온화 효율에 대한 보정이 수행되지 않음)의 재구성된 이온 크로마토그램으로부터 피크 영역 측정을 통해 LC-MS로 분석되었다. 실시예 3에 설명된 화학적 변형을 위한 새로운 방법 4가지로 생성된 샘플들이 제조되었고 2중 또는 3중으로 분석되었다(표3).
설파아미다아제의 화학적 변형 | Ser 형성(%) | FGly/Ser 비 |
없음 | ||
새로운 방법 1 | 45.4±0.9 (n=3) | 1.2 |
새로운 방법 4 | 11.5±1 (n=3) | 7.7 |
새로운 방법 5 | 44.1±2 (n=2) | 1.2 |
새로운 방법 6 | 34.4±2 (n=2) | 1.9 |
활성 부위 FGly의 손실이 새로운 방법에 의해 상당히 제한되었다. WO 2008/109677에 설명된 절차를 사용함으로써 56%로부터(표 2, 실시예 2를 참고하라), 45%, 44%, 및 34%까지(각각 새로운 방법 1, 5, 및 6, 표 3), 설파아미다아제의 글라이칸 변형의 4가지의 새로운 방법은 Ser 형성을 상당히 감소시켰다. 새로운 방법 4의 Ser 형성은 약 11%이었으며, 그와 같이 FGly로부터 Ser으로의 변환은 나트륨 보로하이드라이드 농도에 고도로 의존하였다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 수용체 매개된 화학적으로 변형된 라이소좀 단백질의 시험관내 세포내이입(endocytosis)
재료 및 방법
공지된 방법 및 새로운 방법 1 및 4(실시예 1 및 3)에 따라 설파아미다아제는 설명된 것과 같이 제조되고 변형되었다. 세포내이입은 M6P 수용체를 발현하는 MEF-1 섬유아세포(fibroblast)에서 측정되었다. MEF-1 세포들은 75 nM의 설파아미다아제가 보충된 DMEM 배지에서 24시간 동안 인큐베이션되었다. 세포들은 DMEM에서 2회, 그리고 1% TritonX100을 이용한 세포 용해 전에 0.9 % NaCl에서 1회 세척되었다. 용해물 설파아미다아제 활성 및 전체 단백질 내용물이 결정되었으며 용해물 특이적 활성이 계산되었다. 활성은 디에틸바비튜릭 산(diethylbarbituric acid) 14.5 mM, 나트륨 아세테이트 14.5mM, 0.34 %(w/v) NaCl, 및 0.1% BSA 내에서 4-메틸움베리페릴-알파-D-N-설포글루코사미나이드(4-methylumbelliferyl-alpha-D-N-sulphoglucosaminide) 0.25 mM를 기질로 이용하여 형광 강도 460 nm에서 모니터되었다. 전체 단백질 농도는 BSA를 표준으로 하는 BCA 키트(Pierce)를 사용하여 결정되었다. 데이터는 평균+SD(n=4)로 제공된다.
결과
설파아미다아제 활성은 세포내이입 분석에서 측정된 모든 제제에 대한 세포 균질액(cell homogenate)에서 검출될 수 있다. 공지된 방법뿐만 아니라 새로운 방법 1 및 4 에 의해 제조된 변형된 설파아미다아제는 세포 균질액에서 변형되지 않은 재조합 설파아미다아제에서 수득할 수 있는 것의 10% 이하의 특이적 활성을 나타냈다. 처음으로 로드된 후 2일간 설파아미다아제 부재 하에 성장된 세포에 보유된 활성은 모든 제제에서 비교 가능했으며 화학적 변형이 라이소좀 안정성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냈다.
그러므로, 화학적 변형은 M6PR과 같은 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 제거의 결과로서 설파아미다아제가 세포 흡수를 덜 일으키게 한다는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 거시적인 수준에서, 이러한 분자 상호작용의 손실은 정맥내 주사로 투여되었을 때 혈장(plasma)으로부터의 클리어런스를 감소시킨다. 단백질의 감소된 제거는 환자에게 덜 빈번한 투여를 허용한다. 유사한 결과가 변형된 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트-2-설파타아제로부터 수득될 수 있다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 6: 새로운 방법에 따라 변형된 라이소좀 단백질, 알파-L 이두로니다아제 및 이두로네이트 2 설파타아제의 생체내 혈장/혈청 클리어런스
재료 및 방법
In life 상(phase):변형되지 않은 및 변형된 라이소좀 단백질 알파-L-이두로니다아제 및 이두로네이트 2-설파타아제에 대해 혈장/혈청(serum) 클리어런스(CL)가 마우스(C57BL/6J) 내에서 조사되었다. 마우스는 꼬리 정맥에 1회 용량을 투여받았다. 투여 이후 24시간까지 상이한 시점(시점 당 3개의 마우스)에서 혈액 샘플을 채취하였고 혈장/혈청이 제조되었다. 라이소좀 효소의 혈장/혈청 수준은 ECL(electrochemiluminescence) 면역분석을 통해 분석되었다. 혈장/혈청 클리어런스는 WinNonlin 소프트웨어 버전 6.3 (Non-compartmental analysis, Phoenix, Pharsight Corp., USA)를 이용하여 계산되었다. 설파아미다아제 및 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제에 대해 투여량은 2 mg/mL에서 제제된 10 mg/kg이었으며 5 mL/kg으로 투여되었다. 이두로네이트 2-설파타아제 및 새로운 방법 2에 따라 변형된 이두로네이트-2-설파타아제에 대해 투여량은 0.2 mg/mL에서 제제된 1 mg/kg이었으며 5 mL/kg으로 투여되었다. 알파-L-이두로니다아제 및 새로운 방법 3에 따라 변형된 알파-L-이두로니다아제에 대해 투여량은 0.6 mg/mL에서 제제된 3 mg/kg이었으며 5 mL/kg으로 투여되었다.
ECL에 의한 설파아미다아제 및 변형된 설파아미다아제의 정량화: 혈장 PK 샘플 내 설파아미다아제 및 변형된 설파아미다아제는 MSD(Meso Scale Discovery) 플랫폼을 사용하여 ECL면역분석을 통해 결정되었다. 스트렙타비딘(Streptavidin) 코팅된 MSD 플레이트는 PBS 내 5% Blocker로 블록되었다. 플레이트를 세척하고 PK 샘플 및 표준의 상이한 희석액을 플레이트에 분포시켰다. 바이오틴화된(biotnylated) 항-설파아미다아제 마우스 단일클론항체 및 Sulfo-Ru-태그된 토끼 항-설파아미다아제 항체의 혼합물이 가해졌으며 플레이트는 RT에서 인큐베이션되었다. 설파아미다아제 및 라벨링된 항체의 복합체는 바이오틴화된 mAB를 통해 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 결합할 것이다. 세척 이후, 결합된 복합체의 양은 판독 완충액(read buffer)을 가하여 결정하였으며, 플레이트는 MSD SI2400 기기에서 판독되었다. 기록된 ECL 카운트는 샘플 내의 설파아미다아제 양에 비례했으며 관련된 설파아미다아제 표준에 대해 측정되었다.
ECL에 의한 알파-L-이두로니다아제 및 변형된 알파-L-이두로니다아제의 정량화: 혈장 내 알파-L-이두로니다아제 및 변형된 알파-L-이두로니다아제 PK 샘플은 MSD(Meso Scale Discovery) 플랫폼을 사용하여 ECL 면역분석을 통해 결정되었다. 96웰 스트렙타비딘 골드 플레이트(#L15SA-1, MesoScaleDiscovery (MSD))의 웰은 PBS(Phosphate buffer saline) 내 1% 생선 젤라틴(Fish Gelatin)으로 블록되었고, 세척 완충액(PBS + 0.05% Tween-20)으로 세척되었으며, 바이오틴화, 친화도 정제된 염소-a-인간 알파-L-이두로니다아제 다클론 항체(BAF2449, R&D)와 함께 인큐베이션되고, 세척 이후 표준의 상이한 희석액 및 샘플 희석액(1% 생선 젤라틴이 포함된 PBS + 0.05% Tween 20 + 1% C57BL6혈청) 내의 PK 샘플이 RT에서 2시간 동안 700rpm 쉐이크(shake)로 인큐베이션되었다. 플레이트는 세척되었고 알파-L-이두로니다아제 특이적 루테니움(Rutenium) (SULFO-TAG, MSD)태그된 염소 다클론 항체(AF2449, R&D)가 가해졌으며 포획된 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제에 결합하는 것이 허용되었다. 플레이트는 세척되었고 2x Read Buffer(MSD)가 가해졌다. 플레이트 내용물은 MSD Sector 2400 Imager 기기를 이용하여 분석되었다. 상기 기기는 플레이트 전극에 전압을 가하며, 형성된 면역 복합체를 통해 전극에 결합한 SULFO-TAG 라벨은 빛을 방출할 것이다. 상기 기기는 방출된 빛의 강도(intensity)를 측정하며 이것은 샘플 내의 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제 양에 비례한다. 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제의 양은 상대적인 알파-L-이두로니다아제 또는 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제 표준에 대해 결정된다.
ECL에 의한 이두로네이트-2-설파타아제 및 변형된 이두로네이트-2-설파타아제의 정량화: 혈장 내 이두로네이트 2-설파타아제 및 변형된 이두로네이트 2-설파타아제 PK 샘플은 MSD(Meso Scale Discovery) 플랫폼을 사용하여 ECL 면역분석을 통해 결정되었다. 96웰 스트렙타비딘 골드 플레이트(#L15SA-1, MesoScaleDiscovery (MSD))의 웰은 PBS(Phosphate buffer saline) 내 1% 생선 젤라틴(Fish Gelatin)으로 블록되었고, 세척 완충액(PBS + 0.05% Tween-20)으로 세척되었으며, 바이오틴화, 친화도 정제된 염소-a-인간 이두로네이트 2-설파타아제 다클론 항체(BAF2449, R&D)와 함께 인큐베이션되고, 세척 이후 표준의 상이한 희석액 및 샘플 희석액(1% 생선 젤라틴이 포함된 PBS + 0.05% Tween 20 + 1% C57BL6혈청) 내의 PK 샘플이 RT에서 2시간 동안 700rpm 쉐이크(shake)로 인큐베이션되었다. 플레이트는 세척되었고 이두로네이트-2-설파타아제 특이적 루테니움(Rutenium) (SULFO-TAG, MSD)태그된 염소 다클론 항체(AF2449, R&D)가 가해졌으며 포획된 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제에 결합하는 것이 허용되었다. 플레이트는 세척되었고 2x Read Buffer(MSD)가 가해졌다. 플레이트 내용물은 MSD Sector 2400 Imager 기기를 이용하여 분석되었다. 상기 기기는 플레이트 전극에 전압을 가하며, 형성된 면역 복합체를 통해 전극에 결합한 SULFO-TAG 라벨은 빛을 방출할 것이다. 상기 기기는 방출된 빛의 세기를 측정하며 이것은 샘플 내의 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제 양에 비례한다. 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제의 양은 상대적인 이두로네이트-2-설파타아제 또는 화학적으로 변형된 이두로네이트-2-설파타아제 표준에 대해 결정된다.
결과
변형된 설파아미다아제, 이두로네이트 2-설파타아제 및 알파-L-이두로니다아제의 마우스에서의 혈장/혈청 클리어런스는 변형되지 않은 대응물에 비하여 상당히 감소했으며, 하기의 표 4에 나타나 있다. 이것은 아마도 적어도 부분적으로 화학적 변형에 따르는 말초 조직(peripheral tissue)에서의 수용체 매개 흡수의 억제로 인한 것일 수 있다.
테스트 품목 | 투여량(mg/kg) | 혈장/혈청 CL (mL/(h·kg)) |
설파아미다아제 (서열번호 44) | 10 | 170 |
변형된 설파아미다아제 (새로운 방법 1) | 10 | 14 |
이두로네이트 2-설파타아제 (서열번호 35) | 1 | 60 |
변형된 이두로네이트 2-설파타아제 (새로운 방법 2) | 1 | 14 |
알파-L-이두로니다아제 (서열번호 38) | 3 | 130 |
변형된 알파-L-이두로니다아제 (새로운 방법 3) | 3 | 45 |
실시예 7: 변형된 설파아미다아제의 뇌 헤파란(heparan) 설페이트 저장에 대한 생체내 효과
재료 및 방법
QMCF(Quattromed Cell Factory) 에피솜 발현 시스템(Icosagen AS)내에서 일반적인 재료 및 방법 섹션에서 설명된 것과 같이 제조된 변형된 설파아미다아제 및 실시예 3의 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 정맥내 주사로의(i.v.) 투여의 뇌 헤파란 설페이트 저장에 대한 생체내 효과가 조사되었다.
테스트 품목 제조: 변형된 설파아미다아제는 6mg/mL로 제제화되었으며, 멸균 여과(sterile filtrate)되었으며, 사용할 때까지 -70 ℃에서 냉동되었다. 냉동된 변형된 설파아미다아제 및 상응하는 비히클(vehicle) 용액은 주사 당일에 사용 전 최소 1시간에서 최대 2시간까지 RT에서 해동되었다. 등장성 식염수에 클로르페니라민(Chlorpheniramine)을 0.5 mg/mL의 농도로 용해시켰으며 -20 ℃에서 보관하였다.
동물: mps3a 유전자, B6.Cg-Sgshmps3a/PstJ (MPS IIIA)(Jackson Laboratories, ME, USA)에서 자발적인 동형접합성(homozygous) 돌연변이를 갖는 수컷 마우스가 사용되었다. 동물은 23 ± 1 ℃ 및 40-60 % 습도에서 케이지에 단독으로 수용되었으며, 물 및 표준 실험실 먹이에 자유롭게 접근할 수 있었다. 12/12시간의 빛/어둠 주기는 오후 7시에 밝아지도록 설정되었다. 연구를 시작하기 적어도 2주 전 동물의 상태를 조절하였다. 동일한 육종 단위의 야생형 형제(sibling)도 대조군으로 포함되었다. 연구 A에서 마우스는 23-24주 된 것인 반면 연구 B에서 마우스는 9-10주 된 것이었다.
연구 A의 실험 과정: 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg(n=8) 및 비히클(n=7)이 MPS IIIA 마우스에 25일 동안 격일로 25일간 정맥내 주사로 투여되었다(13회 주사). 변형된 설파아미다아제 또는 비히클의 투여 30-45분 전 클로프레니라민(2.5 mg/kg)을 피하 투여하였다. 투여는 약 아침 07.00에 시작되었다. 테스트 품목 및 비히클은 5 mL/kg로 투여되었다. 최종 투여 부피는 매 투여 시의 실제 체중에 대해 보정되었다. 이러한 설계는 비히클에 대해 반복되었다. 연구는 마지막 주사 2시간 이후에 종결되었다. 처리되지 않은 연령 일치 야생형 마우스(n=5)는 테스트 품목 처리된 그룹에 연결하여 포함시켰다. 이소플루란으로 마우스를 마취시켰다. 안와정맥총(retro-orbital plexus) 혈액 채취 방법으로 혈액을 채취하였다. 관류 후 심장 좌심실을 통해 20 mL 식염수를 내보냈다. 조직을 해부하고(뇌, 간, 비장, 폐 및 심장), 중량을 측정하고 액체 질소로 급격히 냉동시켰다. 조직 및 혈액은 LC-MS/MS를 사용하여 헥소사민 설페이트 [α-1, 4] 우론산(HNS-UA) 수준을 측정하기 위해 준비되었다. HNS-UA는 헤파란 설페이트 저장의 디사카라이드(disaccharide) 마커이며, 그와 같이 HNS-UA 수준의 감소는 헤파란 설페이트의 분해를 나타낸다. HNS-UA 데이터는 상대적 단위 대 내부적 표준으로 계산되었으며, 조직 mg 당으로 표현되었으며 대조군의 평균으로 표준화되었다. 데이터는 일원배치분산분석(one-way ANOVA) 테스트에 의해 분석되었으며, 그룹 간의 유의성 테스트를 위해 Bonferroni의 다중 비교 사후 테스트(post-hoc test)에 의해서도 전반적인 유의성이 증명되었다 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
연구 B의 실험 과정: 변형된 설파아미다아제 30 mg/kg (n=6), 10 mg/kg (n=6) 및 비히클(n=6)이 MPS IIIA마우스에 10주 동안 일주일에 1회 정맥내 주사로 투여되었다(10회 주사). 변형된 설파아미다아제 또는 비히클의 투여 30-45분 전 클로프레니라민(2.5 mg/kg)을 피하투여하였다. 최종 투여 부피는 매 투여 시의 실제 체중에 대해 보정되었다. 이러한 설계는 비히클에 대해 반복되었다. 연구는 마지막 주사 2시간 이후에 종결되었다. 처리되지 않은 연령 일치 야생형 마우스(n=6)는 테스트 품목 처리된 그룹에 연결하여 포함시켰다. 이소플루란으로 마우스를 마취시켰다. 안와정맥총 혈액 채취 방법으로 혈액을 채취하였다. 관류 후 심장 좌심실을 통해 20 mL 식염수를 내보냈다. 조직을 해부하고(뇌, 간, 비장), 중량을 측정하고 액체 질소로 급격히 냉동시켰다. 조직 및 혈액은 LC-MS/MS를 사용하여 HNS-UA 수준을 측정하기 위해 준비되었다. HNS-UA 데이터는 상대적 단위 대 내부적 표준으로 계산되었으며, 조직 mg당으로 표현되었으며 대조군의 평균으로 표준화되었다. 데이터는 일원배치분산분석 테스트에 의해 분석되었으며, 그룹 간의 유의성 테스트를 위해 Bonferroni의 다중 비교 사후 테스트(post-hoc test)에 의해서도 전반적인 유의성이 증명되었다.
조직 샘플 내의 HNS-UA의 LC-MS/MS 분석: Fuller et al (Pediatr Res 56: 733-738 (2004) 및 Ramsay et al (Mol Genet Metab 78:193-204 (2003))에 설명된 방법을 부분적으로 따라 조직 샘플 내의 HNS-UA의 LC-MS/MS 분석이 수행되었다. 기질 완충액(29 mM 디에틸바비튜릭 산, 29 mM 나트륨 아세테이트, 0.68 % (w/v) NaCl, 100 mL 물, pH 6.5)에서 Lysing Matrix D 장치(MP Biomedicals, LLC, Ohio, US)를 사용해 조직(90-180 mg)을 균질화하였다. 균질화는 25초 동안 Savant FastPrep FP120/Bio101 균질기(LabWrench, ON, Canada)에서 수행되었으며 균질액은 이어서 10000 rcf에서 Eppendorf 원심분리기 5417R 내에서 원심분리되었다. 상청액은 거의 건조될 때까지 증발되었다. 150 μL의 유도체화(derivatizing) 용액(250 mM PMP(3 methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one), 400 mM NH3, pH 9.1) 및 5 μL의 내부 표준 콘드로이틴(Chondroitin) 디사카라이드 Δdi-4S 나트륨 (ΔUA-GalNAc4S, 0.1 mg/mL) 저장 용액을 가하였다. 유도체화는 70 ℃에서 90분 동안 교반 하에 수행되었으며, 그리고 나서 용액을 800mM 포름산(formic acid)으로 산성화시켰다. 최종 부피가 500 μL이 되도록 탈이온수를 샘플에 가하였으며, 추출은 과도한 PMP를 제거하기 위해 클로로포름(3x500 μL)으로 수행되었다. 원심분리는 13000 x g에서 5분간 수행되었으며 상부 상(upper phase)을 새로운 바이알에 옮겼다. 포름산 및 NH4COOH의 과량을 제거하기 위해, speed vac(Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY)에서 액체 상을 증발시켰다. 샘플은 총 100 μL의 5% 아세토니트릴/ 0.1% 아세트산/0.02% TFA으로 재구성되었다.
LC-MS/MS 분석은 Sciex API 4000 3중 4중극(triple quadrupole) 질량 분석기와 결합된 Waters UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)에서 수행되었다. 기기 조작, 데이터 수집 및 평가는 Analyst 소프트웨어를 이용하여 이루어졌다.
LC 분리는 Acquity C18 CSH 컬럼(50x2.1 mm, 1.7 μm)을 사용하여 수행되었다. 이동상 A는 5% 아세토니트릴/0.5% 포름산으로 구성되었으며, 이동상 B는 95% 아세토니트릴/0.5% 포름산으로 구성되었다. 7분 동안 1%에서 99% B의 구배가 0.35 mL/min의 유속으로 사용되었다. 주입 부피는 10 μL 였다. API4000은 전기스프레이 음이온 다중 반응 모니터링(MRM) 모드로 작동되었다. 이온 스프레이 전압은 4.5 kV에서 작동되었으며, 공급원 온도는 450 ℃였다. 아르곤이 충돌 가스(collision gas)로 사용되었다. 충돌 에너지는 34V였다. MRM 트랜지션(MRM transition)은 764.4/331.2 (PMP-HNS-UA) 및 788.3/534.3 (PMP-내부적 표준)이었다. HNS-UA의 상대적인 양은 내부적 표준의 수준에 대하여 계산되었다.
결과
도 6A에 나타난 연구 A로부터의 결과는 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제의 25일 동안 30 mg/kg로 격일로(13회 투여) 반복된 정맥내 주사 투여를 통해 뇌에서의 HNS-UA 수준을 30% 감소시켰다는 것을 나타낸다.
추가로, 변형된 설파아미다아제는 간(도 6B)및 폐(나타내지 않음)에서의 HNS-UA 수준을 완전히 제거시켰다.
도 6C에 나타난 연구 B로부터의 결과는 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제가 10주 동안 30 mg/kg 및 10 mg/kg 일주일에 1회 반복된 정맥내 주사 투여를 통해 뇌에서의 HNS-UA수준을 각각 48% 및 14% 감소시켰다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는 그와 같이 본원에 설명된 새로운 방법 1에 따라 변형된 설파아미다아제 단백질이, 장기적인 처리 이후, 말초 장기에서의 HNS-UA 수준을 필수적으로 완전히 감소시킬 뿐만 아니라 뇌에서HNS-UA의 수준을 급격하게 감소시킨다는 것을 증명한다.
실시예 8: 설파아미다아제 변형의 최적화
화학적 변형 공정은 일반적으로 두 개의 파트로 나누어질 수 있으며, 첫 번째 단계는 산화 단계로, 본원에서 이하 R1이라고 표기하며, 두 번째 단계는 환원 단계로, R2로 표기한다. 2 단계를 최적화하하기 위하여 두 단계의 온도, 농도 및 시간의 영향을 조사하는 실험(DoE)의 전체 요소가 설계되었다.
재료 및 방법
QMCF(Quattromed Cell Factory) 에피솜 발현 시스템(Icosagen AS) 내에서 실시예 1에서 설명된 것과 같이 제조된 설파아미다아제는 실시예 3의 새로운 방법 1에 설명된 것과 같이 필수적으로 변형되었으나, 조사의 대상이 된 파라미터는 하기 표 5에 따라 변형되었다. R1의 조사는 실시예 3(새로운 방법 1)에 설명된 것과 동일한 환원 및 파라미터 워크업(work-up)으로 수행되었다. 분석의 종점은 실시예 2에 설명된 글라이칸의 산화의 정도, 및 실시예 5에 설명된, 변형된 단백질의 세포 흡수의 수준이다.
변수 | R1 | R2 |
T (℃) | 0, 8, 22 | 0, 8. 22 |
t(min) | 30, 60, 120 | 30, 50, 120 |
c(mol/L) | 10, 20, 40 | 1.2x(R1의 c), 2.5x(R1의 c), 5x(R1의 c) |
파라미터의 수 및 선택된 설계 유형에 따라 각 단계마다 10번의 실험을 수행하였으며, 그 결과는 MODDE 10 소프트웨어(Umetrics AB)를 사용해 측정되었다.
추가로, 제2 ??칭 단계의 영향은 R1 파라미터 8 ℃, 60 분 및 20mM 나트륨 메타-퍼아이오데이트로 제조된 설파아미다아제에 대해 테스트되었다. 2개의 추가적 반응이 DoE 실험과 병행하여 수행되었으며 0.1 M 아세톤을 이용하여 ??칭되거나 6.0 이하의 pH를 수득할 때까지 아세트산이 가해졌다. 최종 워크업은 다른 반응의 설계를 따랐다. 그와 같이 제조된 설파아미다아제는 실시예 2에 설명된 SDS-PAGE 방법을 사용하여 평가되었다.
R2 실험은 R1의 DoE 분석 후 최적인 것으로 발견된 파라미터에 따라 변형된 설파아미다아제로 수행되었다.
결과
R1 결과는 하기 표 6에 요약되어 있다:
추가로, 공지된 방법에 따라 변형된 설파아미다아제에 대하여 실시예 2에 따라 글라이코실화 분석을 수행하였다. N-글라이코실화 부위 N(21), N(131), N(244), 및 N(393)에서 원래의 N-글라이칸이 잔류하지 않는 것으로 검출되었다.
R1(산화)의 MODDE 평가는 온도는 약 8 ℃, 반응 지속 시간은 약 1시간, 나트륨 메타-퍼아이오데이트의 농도는 약 10 mmol/L이 최적임을 나타냈다. 글라이칸 인식 수용체를 통한 세포 흡수를 새로운 방법 1 수준으로 여전히 제한하는 최저 산화제 농도로부터(자세한 것은 실시예 5를 참고하라) 전체적인 단백질 건강(예를 들어, 구조적 완전성)은 이점을 얻는 것으로 보인다.
R1 반응 시간에 대해 개시된 다양한 조건은 글라이칸 변형의 정도에 있어 중요한 파라미터라고 여겨졌다. 추가로, 퍼아이오데이트 농도는 글라이칸 변형의 정도에 영향을 미칠 수 있다.
R2(환원) 설계는 그와 같이 상기 확인된 R1에 대한 바람직한 파라미터, 다시 말해 설파아미다아제의 산화에 사용된 것을 사용하였다. R2의 결정적인 종점은 변형된 설파아미다아제의 활성에 영향을 미치는 것이 밝혀진(참고: 실시예 2 및 4) FGly 함유량이다. 하기의 표 7은 결과를 나타낸다. FGly50 및 Ser50을 포함하는 펩티드 단편의 상대적인 양은 재구성된 이온 크로마토그램(이온화 효율에 대한 보정이 수행되지 않음)으로부터 피크 영역 측정을 통해 LC-MS로 분석되었다.
R2에 대한 DoE는 Ser 형성은 나트륨 보로하이드의 농도 및 온도에 관련되어 있다는 것을 나타낸다. Ser 형성 및 높은 분자량 형태의 존재를 고려하면, 약 0 ℃의 온도, 약 1 시간 또는 그 미만의 반응 지속 시간, 및 12 mmol/L 이상이고 50 mmol/L 이하인 나트륨 보로하이드라이드의 농도가 R2에 대한 바람직한 조건이다(데이터는 나타내지 않음, 결과는 실시예 3의 새로운 방법 4에 의해 얻어진 것과 유사하다).
환원 단계가 ??칭된 반응에서 제조된 설파아미다아제는 ??칭 없이 제조된 설파아미다아제와 호환 가능하다는 것이 SDS-PAGE(데이터는 나타내지 않음)에서 확인되었다. 이것은 0.1M 아세톤 또는 아세트산의 부가로 pH를 6 아래로 낮춤으로써 ??칭하는 제2 ??칭 단계의 도입은 재료의 품질에 부정적인 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 기존에 공지된 방법에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 후의 글라이칸 구조의 분석
재료 및 방법
공지된 방법에 따른 화학적 변형: 공지된 방법에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형은 실시예 1에 설명된 것과 같이 수행되었다.
글라이코실화 분석: 화학적 변형 이후 설파아미다아제의 글라이칸 구조의 분석은 실시예 2에 설명된 LC-MS 방법에 따라 수행되었다.
실시예 2에 설명된 N 글라이코실화 부위 N(21), N(131), N(244) 및 N(393)를 포함하는 4개의 트립틱 펩티드 단편의 글라이칸 잔기의 수득되는 변형은 LC-MS 분석에 의해 조사되었다.
결과
글라이코실화 분석: (화학적 변형 이전의) 4개의 글라이코실화 부위에서의 글라이코실화의 유형은 주로 N(21) 및 N(393)에서 복합체 글라이칸(complex glycan), N(131) 및 N(244)에서 글라이칸의 올리고만노오스 유형인 것으로 밝혀졌다
화학적 변형 이후, 변형된 글라이칸 구조의 상세한 특성화는 가장 풍부한 화학적으로 변형된 글라이코펩티드에 대해 수행되었다(덜 풍부한 글라이칸은 화학적 변형 이후 증가한 글라이칸의 이종성의 결과로서 감수성(sensitivity)의 상당한 감소로 인하여 검출할 수 없었다). 본 실시예에서, 공지된 방법에 따른 화학적 변형 이후 Man-6 글라이칸에 대한 변형이 조사되었다.
글라이칸의 퍼아이오데이트 처리는 탄수화물 잔기의 2개의 인접한 하이드록시 그룹 사이의 탄소 결합을 절단하며 글라이칸 사슬의 분자량을 변경한다. 도 8A는 화학적 변형 이후 만노오스에서 예측된 결합 절단의 예이다. 도 8B는 나트륨 퍼아이오데이트로 산화시킨 후 일어나는 이론적인 결합 절단을 나타내는 Man-6 글라이칸의 모델을 도시한 것이다.
도 9에는 기존에 공지된 방법에 따라 화학적 변형을 수행하기 전 및 후의 N(131)이 부착되어 있는 Man-6 글라이칸 트립틱 펩티드 NITR(T13+Man-6 glycan)의 질량 스펙트럼이 나타나 있다. 다양한 정도로 결합이 절단된 화학적으로 변형된 글라이코펩티드에 상응하는 이온이 확인되었다. Man-6 글라이칸에 있어서, 이론적으로는 최대 3개의 이중 결합 절단 및 1개의 단일 결합 절단이 가능하다. 공지된 방법에 따른 변형이 수행될 경우, 질량 스펙트럼에서 가장 강한 이온 시그널은 2개의 이중 결합 절단 및 2개의 단일 결합 절단에 상응하는 것임이 밝혀졌으며, 2번째로 가장 강한 이온 시그널은 가능한 결합 절단 중 가장 강한 것으로, 3개의 이중 결합 절단 및 1개의 단일 결합 절단에 상응하는 것이었다. 공지된 방법에 따른 화학적 변형 이후 T13+Man-6 글라이칸에서 발견된 결합 절단의 정도를 시각화한 도식이 도 10A에 나타나 있다(관찰된 이온으로부터의 동위원소 분포로 인해, 결과는 근사값이지만 유사하다). 기존에 공지된 방법에 따라 제조된 화학적으로 변형된 설파아미다아제의 3개의 상이한 배치(batch)를 사용하여 화학적 변형의 재현성을 테스트하였다. 결합 절단의 상이한 정도에 상응하는 이온은 3개의 상이한 배치로부터의 MS 스펙트럼에서 매우 유사한 분포를 보였다.
실시예 10: 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형 후의 글라이칸 구조의 분석
새로운 방법 1, 4, 및 5: 새로운 방법에 따른 설파아미다아제의 화학적 변형은 실시예 3에 설명된 것과 같이 수행되었다.
글라이코실화 분석: 글라이코실화 분석은 실시예 2 에 설명된 LC-MS 방법에 따라 수행되었다. N 글라이코실화 부위 N(21), N(131), N(244) 및 N(393)를 포함하는 4개의 트립틱 펩티드 단편의 글라이칸 잔기의 변형 결과는 LC-MS 분석에 의해 조사되었다.
결과
글라이코실화 분석: 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제의 변형된 글라이칸 프로파일의 상세한 특성화는 가장 풍부한 화학적으로 변형된 글라이코펩티드에 대해 수행되었다. 본 실시예 10에서, 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따른 화학적 변형 이후 Man-6 글라이칸에 대한 변형이 조사되었다.
다양한 정도로 결합이 절단된 화학적으로 변형된 글라이코펩티드 T13+Man-6 글라이칸에 상응하는 이온이 확인되었다. 이론적으로는 최대 3개의 이중 결합 절단 및 1개의 단일 결합 절단이 가능하다(도 8B, 나트륨 퍼아이오데이트로 산화시킨 후 일어나는 이론적인 결합 절단을 나타내는 Man-6 글라이칸의 모델을 참고하라). 새로운 방법 1에 따른 변형이 수행된 경우, 질량 스펙트럼에서 가장 강한 이온 시그널은 1개의 이중 결합 절단 및 3개의 단일 결합 절단에 상응하는 것임이 밝혀졌으며, 2번째로 가장 강한 이온 시그널은 2개의 2중 결합 및 2개의 단일 결합 절단에 상응하는 것이었다. 새로운 방법 3 및 4에 따른 변형이 수행될 경우, Man-6 글리칸의 결합 절단은 단일 결합 분해를 선호하는 쪽으로 더 이동하였다. 화학적 변형 이후 T13+ Man-6 글라이칸의 결합 절단의 정도를 시각화한 도식이 도 10A에 나타나 있다.
화학적으로 변형된 설파아미다아제의 3중(새로운 방법 1) 또는 2중(새로운 방법)을 이용하여 화학적 변형의 재현성을 테스트하였다.
공지된 방법에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제로부터 생성되는 Man-6 글라이칸 변형과 새로운 방법 1, 4, 및 5에 따라 화학적으로 변형된 설파아미다아제에 의한 Man-6 글라이칸 변형을 비교했을 때, 결합 절단의 정도에 있어서 큰 차이가 있었다. 이것은 도 10A에 나타나 있으며, 4가지 방법에 대한 상이한 결합 절단 정도의 분포가 플롯되어 있다(관찰된 이온으로부터의 동위원소 분포로 인해, 결과는 근사값이지만 유사하다).
도 10B는 사용된 방법에 대한 단일 결합 절단의 상대적인 풍부함을 나타낸다. 기존에 공지된 방법은 조사된 Man-6-글라이칸에서 화학적 변형 이후 45%의 단일 결합 절단을 갖는 반면, 새로운 방법 1, 3, 및 4는 각각 70, 80, 및 82%의 단일 결합 절단을 갖는 변형된 설파아미다아제를 제공하였다.
실시예 11: 공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 효소 활성의 분석
재료 및 방법
실시예 1에 설명된 것과 같이 공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 촉매 활성은 기질 4-메틸움벨리페론 이두로나이드-설페이트(4-Methylumbeliferone iduronide-sulphate)와 이두로네이트 2-설파타아제의 제제를 인큐베이션함으로써 평가되었다. 반응 혼합물의 기질 농도는 50 μM이었으며 분석 완충액은 50 mM 나트륨 아세테이트, 0.005% Tween 20, 0.1% BSA, 0.025% Anapoe X-100, 1.5 mM 나트륨 아자이드(azide), pH 5였다. 인큐베이션 이후, 추가적인 데설페이션(desulphation)은 0.4 M 나트륨 포스페이트, 0.2 M 시트레이트(citrate) pH 4.5를 포함하는 정지 완충액의 부가에 의해 억제되었다. 생성물(4-메틸움벨리페론 이두로나이드)를 가수분해하고 4-메틸움벨리페론을 방출하는 이두로네이트 2-설파타아제(분석 농도 0.83 μg/mL)의 2차 24시간 인큐베이션이 수행되었으며, 반응을 0.5M 나트륨 카르보네이트(carbonate), 0.025% Trition X-100, pH 10.7로 ??칭한 후에 460nm 형광으로 모니터하였다.
결과
공지된 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 활성은 변형되지 않은 이두로네이트 2-설파타아제의 활성의 50% 이하였다(결과는 나타내지 않음).
실시예 12: 새로운 방법에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 효소 활성의 분석
재료 및 방법
이두로네이트 2-설파타아제는 새로운 방법 10 및 11에 따라 변형되었으며, 나트륨 보로하이드라이드 반응 혼합물이 0 ℃에서 0.5시간 동안 보관되었다는 차이점을 제외하고는 실시예 3과 동일하다. 새로운 방법 11에서, 0.5 mg/mL 헤파린(heparin)의 존재 하에 퍼아이오데이트 산화가 추가로 수행되었다. 새로운 방법 10 및 11에 따라 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 효소 활성은 실시예 11에서 설명된 절차에 따라 결정되었다.
결과
새로운 방법 10 및 11에 따라 제조된 이두로네이트 2-설파타아제는 변형되지 않은 이두로네이트 2-설파타아제의 활성과 유사한 활성을 나타냈다(도 11).
실시예 13: 활성 부위 보호 리간드의 존재 하에서 알파-L-이두로니다아제의 화학적 변형
실시예 3의 새로운 방법 9에 설명된 것과 같이, 상이한 리간드의 존재 하에 산화(단계 a))가 수행되었다. 사용된 리간드는 각각 4-메틸움베리페론 이두로나이드, 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드(5-fluoro-α-l-idopyranosyluronic acid fluoride), 헤파린, 헤파린 설페이트 및 D-사카린 산 1.4-락톤(D-Saccaric acid 1.4-lactone)이다.
효소 활성은 "Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3, and Chester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115"에 설명된 것과 같이 측정되었다.
결과
단계 a)동안 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드가 보호 리간드로 사용된 경우, 보호 리간드 없이, 즉 새로운 방법 8에 따라 단계 a)가 수행된 경우와 비교하여 변형된 알파-L-이두로니다아제에 대하여 52% 낮은 촉매 활성을 수득하였다. 문헌에 공지된 다른 억제제, 예를 들어 D-사카린 산 1.4-락톤이 사용된 경우 변형된 알파-L-이두로니다아제에 대하여 25% 감소된 촉매 활성을 수득하였다. 기질들, 예를 들어 4-MU-이두로나이드, 헤파린 또는 헤파린 설페이트에 대해 촉매 활성의 감소의 유사한 경향성이 기록되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 14: 겔 매트릭스 상에 고정된 알파-L-이두로니다아제의 화학적 변형
본원에 설명된 것과 같은 변형 방법, 및 특히, 실시예 3의 새로운 방법 3은, 알파-L-이두로니다아제를 겔 매트릭스 상에 고정하여 수행되었다. 20 mM NaCl이 포함된 6.7의 pH를 갖는 20 mM 나트륨 포스페이트 완충액으로 SOURCE™ 15S Strong Cation Exchange 컬럼을 로딩함으로써 알파-L-이두로니다아제를 고정하였다. Aldurazyme은 250μL Source 15S 겔 매트릭스에 1시간 동안 인큐베이션되었다. 그 이후 겔 매트릭스는 부드럽게(gently) 펠렛화되었고 상청액 내의 단백질 농도는 겔 인큐베이션 전의 10% 이하인 것으로 결정되었다. 화학적 변형을 수행하기 1일 전 한 샘플을 냉동장치에 보관하였다. 제2 인큐베이션은 화학적 변형 직전에 이루어졌다.
알파-L-이두로나아제 로딩 이후, 컬럼은 연속적인 방식으로 단계 a)의 용액, 단계 a), 단계 b)의 ??칭, 및 단계 b)의 ??칭으로 평형화되었다. 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제의 용리는 컬럼을 pH 5.6의 100 mM 나트륨 포스페이트 및 700 mM 나트륨 클로라이드를 포함하는 완충액으로 세척함으로써 수행된다.
효소 활성은 "Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3, and Chester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115"에 설명된 것과 같이 측정되었다.
배치 모드에서 Source 15S에 결합하는 결과
Aldurazyme을 겔 매트릭스에 고정하고 화학적 변형을 수행한 결과 변형된 알파-L-이두로니다아제의 촉매 활성은 변형이 용액 내에서 수행된 경우에 비하여 8% 증가하였다.
실시예 15: 겔 매트릭스에 고정 및 보호 리간드 존재 하에 알파-L-이두로니다아제의 화학적 변형
본원에 설명된 것과 같은 변형 방법, 및 특히, 실시예 3의 새로운 방법 3은, 알파-L-이두로니다아제를 겔 매트릭스 상에 고정하고 리간드의 존재 하에 수행되었다. 사용된 리간드는 각각 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드 및 D-사카린 산 1.4-락톤이었다.
20 mM NaCl이 포함된 6.7의 pH를 갖는 20mM 나트륨 포스페이트 완충액으로 SOURCE™ 15S Strong Cation Exchange 컬럼을 로딩함으로써 알파-L-이두로니다아제를 고정하였다. Aldurazyme은 250μL Source 15S 겔 매트릭스에 1시간 동안 인큐베이션되었다. 그 이후 겔 매트릭스는 부드럽게(gently) 펠렛화되었고 상청액 내의 단백질 농도는 겔 인큐베이션 전의 10% 이하인 것으로 결정되었다. 화학적 변형을 수행하기 1일 전 한 샘플을 냉동장치에 보관하였다. 제2 인큐베이션은 화학적 변형 직전에 이루어졌다. 알파-L-이두로나아제 로딩 이후, 컬럼은 연속적인 방식으로 단계 a)의 용액, 단계 a), 단계b)의 ??칭, 및 단계 b)의 ??칭으로 평형화되었다. 화학적으로 변형된 알파-L-이두로니다아제의 용리는 컬럼을 pH 5.6의 100 mM 나트륨 포스페이트 및 700 mM 나트륨 클로라이드를 포함하는 완충액으로 세척함으로써 수행된다.
효소 활성은 “Standardization of α-L-iduronidase Enzyme Assay with Michaelis-Menten Kinetics. Ou L, Herzog TL, Carrie M. Wilmot CM3, and Chester B. Whitley CB. Mol Genet Metab. 2014 111: 113-115”에 설명된 것과 같이 측정되었다.
결과
활성 부위를 보호하기 위한 억제제의 사용과 더불어 겔 매트릭스에 Aldurazyme의 고정화를 결합한 접근 방법은 Source 15S Strong Cation Exchange 컬럼 상에 고정화와 더불어 5-플루오로-α-l-이도피라노실루론 산 플루오라이드를 사용한 결과 보호 리간드 없이 용액 내에서 변형이 수행된 경우와 비교하여 변형된 알파-L-이두로니다아제에서 촉매 활성이 37% 증가하는 놀라운 결과를 밝혀냈다. 억제제 D-사카린 산 1.4-락톤을 사용한 경우의 상응하는 결과는 보호 리간드 없이 용액 내에서 변형이 수행된 경우와 비교하여 촉매 활성이 25% 감소하는 것이었다.
실시예 16: 이두로네이트 2-설파타아제 결핍(deficiency) 마우스의 뇌에 대한 변형된 이두로네이트-2-설파타아제의 분포
재료 및 방법
정맥내 주사로(iv) 투여된 실시예 4의 새로운 방법 2에 따라 제조된 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 뇌에서의 생체내 분포가 조사되었다.
테스트 품목 제조: 변형된 이두로네이트 2-설파타아제는 2 mg/mL으로 제제화되었고, 멸균 여과되었으며, 사용될때까지 -70 ℃에서 냉동되었다.
동물: 수컷 마우스 IDS-KO (B6N.Cg-Idstm1Muen/J)(Jackson Laboratories, ME, USA)가 사용되었다. 동물은 23 ± 1 ℃ 및 40-60 % 습도에서 케이지에 단독으로 수용되었으며, 물 및 표준 실험실 먹이에 자유롭게 접근할 수 있었다. 12/12시간의 빛/어둠 주기는 오후 7시에 밝아지도록 설정되었다. 연구를 시작하기 적어도 2주 전 동물의 상태를 조절하였다. 마우스는 꼬리 정맥에 10 mg/kg의 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 정맥내 주사 투여를 받았다. 연구는 마지막 주사 24시간 이후에 종결되었다. 이소플루란으로 마우스를 마취시켰다. 안와정맥총 혈액 채취 방법으로 혈액을 채취하였다. 관류 후 심장 좌심실을 통해 20mL 식염수를 내보냈다. 뇌를 해부하고 중량을 측정하고 액체 질소로 급격히 냉동시켰다. 뇌 균질액을 제조하고 프로토콜에 대한 조정으로서 10mM 납(lead) 아세테이트를 분석 완충액에 가하여 실시예 2에 설명된 방법을 사용하여 활성을 평가하였다.
결과: IDS-KO 마우스의 관류된 뇌 균질액에서 변형된 이두로네이트 2-설파타아제의 활성을 확인할 수 있었다. 사용된 분석 조건 하에서 1.8±0.4 μM/min (n=4)의 평균 활성을 결정하였다.
<110> Swedish Orphan Biovitrum AB
<120> MODIFIED LYSOSOMAL PROTEIN AND PRODUCTION THEREOF
<130> IPA180344-SE
<150> EP 15187877.4
<151> 2015-10-01
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 342
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 1
Cys Tyr Gly Asp Ser Gly Gln Pro Val Asp Trp Phe Val Val Tyr Lys
1 5 10 15
Leu Pro Ala Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ala Ala Gln Arg Gly Leu Gln
20 25 30
Tyr Lys Tyr Leu Asp Glu Ser Ser Gly Gly Trp Arg Asp Gly Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Asn Ser Pro Glu Gly Ala Val Gly Arg Ser Leu Gln Pro Leu
50 55 60
Tyr Arg Ser Asn Thr Ser Gln Leu Ala Phe Leu Leu Tyr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Pro Pro Gln Pro Ser Lys Ala Gln Asp Ser Ser Met Arg Gly His Thr
85 90 95
Lys Gly Val Leu Leu Leu Asp His Asp Gly Gly Phe Trp Leu Val His
100 105 110
Ser Val Pro Asn Phe Pro Pro Pro Ala Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Trp
115 120 125
Pro His Ser Ala Cys Thr Tyr Gly Gln Thr Leu Leu Cys Val Ser Phe
130 135 140
Pro Phe Ala Gln Phe Ser Lys Met Gly Lys Gln Leu Thr Tyr Thr Tyr
145 150 155 160
Pro Trp Val Tyr Asn Tyr Gln Leu Glu Gly Ile Phe Ala Gln Glu Phe
165 170 175
Pro Asp Leu Glu Asn Val Val Lys Gly His His Val Ser Gln Glu Pro
180 185 190
Trp Asn Ser Ser Ile Thr Leu Thr Ser Gln Ala Gly Ala Val Phe Gln
195 200 205
Ser Phe Ala Lys Phe Ser Lys Phe Gly Asp Asp Leu Tyr Ser Gly Trp
210 215 220
Leu Ala Ala Ala Leu Gly Thr Asn Leu Gln Val Gln Phe Trp His Lys
225 230 235 240
Thr Val Gly Ile Leu Pro Ser Asn Cys Ser Asp Ile Trp Gln Val Leu
245 250 255
Asn Val Asn Gln Ile Ala Phe Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ser Phe Asn
260 265 270
Ser Thr Glu Asp His Ser Lys Trp Cys Val Ser Pro Lys Gly Pro Trp
275 280 285
Thr Cys Val Gly Asp Met Asn Arg Asn Gln Gly Glu Glu Gln Arg Gly
290 295 300
Gly Gly Thr Leu Cys Ala Gln Leu Pro Ala Leu Trp Lys Ala Phe Gln
305 310 315 320
Pro Leu Val Lys Asn Tyr Gln Pro Cys Asn Gly Met Ala Arg Lys Pro
325 330 335
Ser Arg Ala Tyr Lys Ile
340
<210> 2
<211> 862
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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Thr Leu Arg Val Trp Gly Gly Gly Ile Tyr Glu Gln Asp Glu Phe Tyr
370 375 380
Glu Leu Cys Asp Glu Leu Gly Ile Met Val Trp Gln Asp Phe Met Phe
385 390 395 400
Ala Cys Ala Leu Tyr Pro Thr Asp Gln Gly Phe Leu Asp Ser Val Thr
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Ala Glu Val Ala Tyr Gln Ile Lys Arg Leu Lys Ser His Pro Ser Ile
420 425 430
Ile Ile Trp Ser Gly Asn Asn Glu Asn Glu Glu Ala Leu Met Met Asn
435 440 445
Trp Tyr His Ile Ser Phe Thr Asp Arg Pro Ile Tyr Ile Lys Asp Tyr
450 455 460
Val Thr Leu Tyr Val Lys Asn Ile Arg Glu Leu Val Leu Ala Gly Asp
465 470 475 480
Lys Ser Arg Pro Phe Ile Thr Ser Ser Pro Thr Asn Gly Ala Glu Thr
485 490 495
Val Ala Glu Ala Trp Val Ser Gln Asn Pro Asn Ser Asn Tyr Phe Gly
500 505 510
Asp Val His Phe Tyr Asp Tyr Ile Ser Asp Cys Trp Asn Trp Lys Val
515 520 525
Phe Pro Lys Ala Arg Phe Ala Ser Glu Tyr Gly Tyr Gln Ser Trp Pro
530 535 540
Ser Phe Ser Thr Leu Glu Lys Val Ser Ser Thr Glu Asp Trp Ser Phe
545 550 555 560
Asn Ser Lys Phe Ser Leu His Arg Gln His His Glu Gly Gly Asn Lys
565 570 575
Gln Met Leu Tyr Gln Ala Gly Leu His Phe Lys Leu Pro Gln Ser Thr
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Gln Leu Asn Asp Ile Trp Gln Ala Pro Ser Trp Ala Ser Leu Glu Tyr
645 650 655
Gly Gly Lys Trp Lys Met Leu His Tyr Phe Ala Gln Asn Phe Phe Ala
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Pro Leu Leu Pro Val Gly Phe Glu Asn Glu Asn Thr Phe Tyr Ile Tyr
675 680 685
Gly Val Ser Asp Leu His Ser Asp Tyr Ser Met Thr Leu Ser Val Arg
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Val His Thr Trp Ser Ser Leu Glu Pro Val Cys Ser Arg Val Thr Glu
705 710 715 720
Arg Phe Val Met Lys Gly Gly Glu Ala Val Cys Leu Tyr Glu Glu Pro
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Val Val Ser Phe Tyr Leu Ser Ala Asp His Glu Leu Leu Ser Pro Thr
755 760 765
Asn Tyr His Phe Leu Ser Ser Pro Lys Glu Ala Val Gly Leu Cys Lys
770 775 780
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805 810 815
Ser Ile Pro Gly Arg Phe Ser Asp Asn Gly Phe Leu Met Thr Glu Lys
820 825 830
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 3
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Pro Asn Arg Ser Arg Phe Trp Lys His Glu Trp Glu Lys His Gly Thr
85 90 95
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100 105 110
Arg Ser Leu Glu Leu Tyr Arg Glu Leu Asp Leu Asn Ser Val Leu Leu
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
His Ile Asp Pro Phe Gly His Ser Arg Glu Gln Ala Ser Leu Phe Ala
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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Ser Ser Leu Arg Gln Arg Pro Glu Pro Gln Val Thr Gly Thr Val Gly
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Leu Pro Pro Ser Ser Tyr Phe Asn Ala Ser Gly Arg Ala Tyr Pro Asp
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Val Ala Ala Leu Ser Asp Gly Tyr Trp Val Val Ser Asn Arg Val Pro
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 6
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Asn Ala Leu Gly Ile Ile Ala Asn Arg Gly Gln His Phe His Gly Gln
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Gly Arg Phe Leu Ser Gln Asp Asp Leu Val Gln Ser Ile Gly Val Ser
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<213> HOMO SAPIENS
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<213> HOMO SAPIENS
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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260 265 270
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275 280 285
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Gln
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<213> HOMO SAPIENS
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Asn Trp Pro Ser Pro Val Ser Trp Asn Trp Asn Ser Lys Asp Val Gly
115 120 125
Pro His Arg Asp Leu Val Gly Glu Leu Gly Thr Ala Leu Arg Lys Arg
130 135 140
Asn Ile Arg Tyr Gly Leu Tyr His Ser Leu Leu Glu Trp Phe His Pro
145 150 155 160
Leu Tyr Leu Leu Asp Lys Lys Asn Gly Phe Lys Thr Gln His Phe Val
165 170 175
Ser Ala Lys Thr Met Pro Glu Leu Tyr Asp Leu Val Asn Ser Tyr Lys
180 185 190
Pro Asp Leu Ile Trp Ser Asp Gly Glu Trp Glu Cys Pro Asp Thr Tyr
195 200 205
Trp Asn Ser Thr Asn Phe Leu Ser Trp Leu Tyr Asn Asp Ser Pro Val
210 215 220
Lys Asp Glu Val Val Val Asn Asp Arg Trp Gly Gln Asn Cys Ser Cys
225 230 235 240
His His Gly Gly Tyr Tyr Asn Cys Glu Asp Lys Phe Lys Pro Gln Ser
245 250 255
Leu Pro Asp His Lys Trp Glu Met Cys Thr Ser Ile Asp Lys Phe Ser
260 265 270
Trp Gly Tyr Arg Arg Asp Met Ala Leu Ser Asp Val Thr Glu Glu Ser
275 280 285
Glu Ile Ile Ser Glu Leu Val Gln Thr Val Ser Leu Gly Gly Asn Tyr
290 295 300
Leu Leu Asn Ile Gly Pro Thr Lys Asp Gly Leu Ile Val Pro Ile Phe
305 310 315 320
Gln Glu Arg Leu Leu Ala Val Gly Lys Trp Leu Ser Ile Asn Gly Glu
325 330 335
Ala Ile Tyr Ala Ser Lys Pro Trp Arg Val Gln Trp Glu Lys Asn Thr
340 345 350
Thr Ser Val Trp Tyr Thr Ser Lys Gly Ser Ala Val Tyr Ala Ile Phe
355 360 365
Leu His Trp Pro Glu Asn Gly Val Leu Asn Leu Glu Ser Pro Ile Thr
370 375 380
Thr Ser Thr Thr Lys Ile Thr Met Leu Gly Ile Gln Gly Asp Leu Lys
385 390 395 400
Trp Ser Thr Asp Pro Asp Lys Gly Leu Phe Ile Ser Leu Pro Gln Leu
405 410 415
Pro Pro Ser Ala Val Pro Ala Glu Phe Ala Trp Thr Ile Lys Leu Thr
420 425 430
Gly Val Lys
435
<210> 11
<211> 697
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 11
Ala Ala Pro Ala Val Leu Gly Glu Val Asp Thr Ser Leu Val Leu Ser
1 5 10 15
Ser Met Glu Glu Ala Lys Gln Leu Val Asp Lys Ala Tyr Lys Glu Arg
20 25 30
Arg Glu Ser Ile Lys Gln Arg Leu Arg Ser Gly Ser Ala Ser Pro Met
35 40 45
Glu Leu Leu Ser Tyr Phe Lys Gln Pro Val Ala Ala Thr Arg Thr Ala
50 55 60
Val Arg Ala Ala Asp Tyr Leu His Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu Arg
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Leu Trp Arg Arg Pro Phe Asn Val Thr Asp Val Leu
85 90 95
Thr Pro Ala Gln Leu Asn Val Leu Ser Lys Ser Ser Gly Cys Ala Tyr
100 105 110
Gln Asp Val Gly Val Thr Cys Pro Glu Gln Asp Lys Tyr Arg Thr Ile
115 120 125
Thr Gly Met Cys Asn Asn Arg Arg Ser Pro Thr Leu Gly Ala Ser Asn
130 135 140
Arg Ala Phe Val Arg Trp Leu Pro Ala Glu Tyr Glu Asp Gly Phe Ser
145 150 155 160
Leu Pro Tyr Gly Trp Thr Pro Gly Val Lys Arg Asn Gly Phe Pro Val
165 170 175
Ala Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Glu Ile Val Arg Phe Pro Thr Asp
180 185 190
Gln Leu Thr Pro Asp Gln Glu Arg Ser Leu Met Phe Met Gln Trp Gly
195 200 205
Gln Leu Leu Asp His Asp Leu Asp Phe Thr Pro Glu Pro Ala Ala Arg
210 215 220
Ala Ser Phe Val Thr Gly Val Asn Cys Glu Thr Ser Cys Val Gln Gln
225 230 235 240
Pro Pro Cys Phe Pro Leu Lys Ile Pro Pro Asn Asp Pro Arg Ile Lys
245 250 255
Asn Gln Ala Asp Cys Ile Pro Phe Phe Arg Ser Cys Pro Ala Cys Pro
260 265 270
Gly Ser Asn Ile Thr Ile Arg Asn Gln Ile Asn Ala Leu Thr Ser Phe
275 280 285
Val Asp Ala Ser Met Val Tyr Gly Ser Glu Glu Pro Leu Ala Arg Asn
290 295 300
Leu Arg Asn Met Ser Asn Gln Leu Gly Leu Leu Ala Val Asn Gln Arg
305 310 315 320
Phe Gln Asp Asn Gly Arg Ala Leu Leu Pro Phe Asp Asn Leu His Asp
325 330 335
Asp Pro Cys Leu Leu Thr Asn Arg Ser Ala Arg Ile Pro Cys Phe Leu
340 345 350
Ala Gly Asp Thr Arg Ser Ser Glu Met Pro Glu Leu Thr Ser Met His
355 360 365
Thr Leu Leu Leu Arg Glu His Asn Arg Leu Ala Thr Glu Leu Lys Ser
370 375 380
Leu Asn Pro Arg Trp Asp Gly Glu Arg Leu Tyr Gln Glu Ala Arg Lys
385 390 395 400
Ile Val Gly Ala Met Val Gln Ile Ile Thr Tyr Arg Asp Tyr Leu Pro
405 410 415
Leu Val Leu Gly Pro Thr Ala Met Arg Lys Tyr Leu Pro Thr Tyr Arg
420 425 430
Ser Tyr Asn Asp Ser Val Asp Pro Arg Ile Ala Asn Val Phe Thr Asn
435 440 445
Ala Phe Arg Tyr Gly His Thr Leu Ile Gln Pro Phe Met Phe Arg Leu
450 455 460
Asp Asn Arg Tyr Gln Pro Met Glu Pro Asn Pro Arg Val Pro Leu Ser
465 470 475 480
Arg Val Phe Phe Ala Ser Trp Arg Val Val Leu Glu Gly Gly Ile Asp
485 490 495
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Asn Ser Tyr Pro Arg Asp Phe Val Asn Cys Ser Thr Leu Pro Ala Leu
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Asn Leu Ala Ser Trp Arg Glu Ala Ser
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 12
Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 13
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405 410 415
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Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Gly Ala Val Ala Glu Arg Leu Trp Ser
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 14
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Thr Met Ser Glu Val Gly Gly Ser Val Glu Asp Leu Ile Ala Lys Gly
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35 40 45
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Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Ile His Cys Lys Leu Leu Asp
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130 135 140
Ala Ser Ser Ala Ser Ala Leu Gly Gly Val Lys Val Glu Arg Gln Val
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165 170 175
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Asn Ile Phe Ser Phe Tyr Leu Ser Arg Asp Pro Asp Ala Gln Pro Gly
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325 330 335
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 15
Gly Pro Val Leu Gly Leu Lys Glu Cys Thr Arg Gly Ser Ala Val Trp
1 5 10 15
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Leu Ala Glu Leu Asn His Gln Lys Gln Leu Glu Ser Asn Lys Ile Pro
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Leu Leu Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Pro Arg Ser Lys Pro Gln Pro Lys
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Cys Lys Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met
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245 250 255
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Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Leu Glu Leu Val Glu Pro Ile Lys Lys
275 280 285
His Glu Val Pro Ala Lys Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe
290 295 300
Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys
305 310 315 320
Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile
340 345 350
Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met
355 360 365
Leu His Leu Cys Ser Gly Thr Arg Leu Pro Ala Leu Thr Val His Val
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Gly Tyr Leu Asp Arg Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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Gln Lys Gln Lys Gln Leu Phe Ile Gly Gly Glu Ala Cys Leu Trp Gly
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450 455 460
Ser Ala Val Gly Glu Arg Leu Trp Ser Ser Lys Asp Val Arg Asp Met
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Asn Met
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305 310 315
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 18
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180 185 190
Ile Cys Glu Pro Gly Tyr Ser Pro Thr Tyr Lys Gln Asp Lys His Tyr
195 200 205
Gly Tyr Asn Ser Tyr Ser Val Ser Asn Ser Glu Lys Asp Ile Met Ala
210 215 220
Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Ser Val Tyr Ser
225 230 235 240
Asp Phe Leu Leu Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Gln His Val Thr Gly Glu
245 250 255
Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val Glu Asn
260 265 270
Gly Thr Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp Asn Thr Asp Trp Gly
275 280 285
Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Arg Gly Gln Asp His Cys Gly Ile
290 295 300
Glu Ser Glu Val Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Gln Tyr Trp Glu
305 310 315 320
Lys Ile
<210> 19
<211> 629
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 19
Leu Gln Gly Gly Met Leu Tyr Pro Gln Glu Ser Pro Ser Arg Glu Cys
1 5 10 15
Lys Glu Leu Asp Gly Leu Trp Ser Phe Arg Ala Asp Phe Ser Asp Asn
20 25 30
Arg Arg Arg Gly Phe Glu Glu Gln Trp Tyr Arg Arg Pro Leu Trp Glu
35 40 45
Ser Gly Pro Thr Val Asp Met Pro Val Pro Ser Ser Phe Asn Asp Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Trp Arg Leu Arg His Phe Val Gly Trp Val Trp Tyr Glu
65 70 75 80
Arg Glu Val Ile Leu Pro Glu Arg Trp Thr Gln Asp Leu Arg Thr Arg
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Val Val Leu Arg Ile Gly Ser Ala His Ser Tyr Ala Ile Val Trp Val
100 105 110
Asn Gly Val Asp Thr Leu Glu His Glu Gly Gly Tyr Leu Pro Phe Glu
115 120 125
Ala Asp Ile Ser Asn Leu Val Gln Val Gly Pro Leu Pro Ser Arg Leu
130 135 140
Arg Ile Thr Ile Ala Ile Asn Asn Thr Leu Thr Pro Thr Thr Leu Pro
145 150 155 160
Pro Gly Thr Ile Gln Tyr Leu Thr Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Lys Gly
165 170 175
Tyr Phe Val Gln Asn Thr Tyr Phe Asp Phe Phe Asn Tyr Ala Gly Leu
180 185 190
Gln Arg Ser Val Leu Leu Tyr Thr Thr Pro Thr Thr Tyr Ile Asp Asp
195 200 205
Ile Thr Val Thr Thr Ser Val Glu Gln Asp Ser Gly Leu Val Asn Tyr
210 215 220
Gln Ile Ser Val Lys Gly Ser Asn Leu Phe Lys Leu Glu Val Arg Leu
225 230 235 240
Leu Asp Ala Glu Asn Lys Val Val Ala Asn Gly Thr Gly Thr Gln Gly
245 250 255
Gln Leu Lys Val Pro Gly Val Ser Leu Trp Trp Pro Tyr Leu Met His
260 265 270
Glu Arg Pro Ala Tyr Leu Tyr Ser Leu Glu Val Gln Leu Thr Ala Gln
275 280 285
Thr Ser Leu Gly Pro Val Ser Asp Phe Tyr Thr Leu Pro Val Gly Ile
290 295 300
Arg Thr Val Ala Val Thr Lys Ser Gln Phe Leu Ile Asn Gly Lys Pro
305 310 315 320
Phe Tyr Phe His Gly Val Asn Lys His Glu Asp Ala Asp Ile Arg Gly
325 330 335
Lys Gly Phe Asp Trp Pro Leu Leu Val Lys Asp Phe Asn Leu Leu Arg
340 345 350
Trp Leu Gly Ala Asn Ala Phe Arg Thr Ser His Tyr Pro Tyr Ala Glu
355 360 365
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370 375 380
Cys Pro Gly Val Gly Leu Ala Leu Pro Gln Phe Phe Asn Asn Val Ser
385 390 395 400
Leu His His His Met Gln Val Met Glu Glu Val Val Arg Arg Asp Lys
405 410 415
Asn His Pro Ala Val Val Met Trp Ser Val Ala Asn Glu Pro Ala Ser
420 425 430
His Leu Glu Ser Ala Gly Tyr Tyr Leu Lys Met Val Ile Ala His Thr
435 440 445
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450 455 460
Tyr Ala Ala Asp Lys Gly Ala Pro Tyr Val Asp Val Ile Cys Leu Asn
465 470 475 480
Ser Tyr Tyr Ser Trp Tyr His Asp Tyr Gly His Leu Glu Leu Ile Gln
485 490 495
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515 520 525
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595 600 605
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610 615 620
Asn Ser Leu Phe Thr
625
<210> 20
<211> 313
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 20
Ala Glu Leu Cys Val Asn Ser Leu Glu Lys Phe His Phe Lys Ser Trp
1 5 10 15
Met Ser Lys His Arg Lys Thr Tyr Ser Thr Glu Glu Tyr His His Arg
20 25 30
Leu Gln Thr Phe Ala Ser Asn Trp Arg Lys Ile Asn Ala His Asn Asn
35 40 45
Gly Asn His Thr Phe Lys Met Ala Leu Asn Gln Phe Ser Asp Met Ser
50 55 60
Phe Ala Glu Ile Lys His Lys Tyr Leu Trp Ser Glu Pro Gln Asn Cys
65 70 75 80
Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Leu Arg Gly Thr Gly Pro Tyr Pro Pro
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Ser Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Asn Phe Val Ser Pro Val Lys Asn
100 105 110
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115 120 125
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Gly Gly Leu Pro Ser Gln Ala Phe Glu Tyr Ile Leu Tyr Asn Lys Gly
165 170 175
Ile Met Gly Glu Asp Thr Tyr Pro Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Tyr Cys
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Lys Phe Gln Pro Gly Lys Ala Ile Gly Phe Val Lys Asp Val Ala Asn
195 200 205
Ile Thr Ile Tyr Asp Glu Glu Ala Met Val Glu Ala Val Ala Leu Tyr
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Asn Pro Val Ser Phe Ala Phe Glu Val Thr Gln Asp Phe Met Met Tyr
225 230 235 240
Arg Thr Gly Ile Tyr Ser Ser Thr Ser Cys His Lys Thr Pro Asp Lys
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Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Glu Lys Asn Gly Ile
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Pro Tyr Trp Ile Val Lys Asn Ser Trp Gly Pro Gln Trp Gly Met Asn
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Gly Tyr Phe Leu Ile Glu Arg Gly Lys Asn Met Cys Gly Leu Ala Ala
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Cys Ala Ser Tyr Pro Ile Pro Leu Val
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 21
Lys Pro Pro Gln Phe Thr Trp Ala Gln Trp Phe Glu Thr Gln His Ile
1 5 10 15
Asn Met Thr Ser Gln Gln Cys Thr Asn Ala Met Gln Val Ile Asn Asn
20 25 30
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Asn Arg Asp Gln Arg Arg Asp Pro Pro Gln Tyr Pro Val Val Pro Val
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His Leu Asp Arg Ile Ile
130
<210> 22
<211> 925
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 22
Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly
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Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu
100 105 110
Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr
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Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg
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Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr
195 200 205
Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser
210 215 220
Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu
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Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg
290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg
370 375 380
Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met
385 390 395 400
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405 410 415
Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp
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435 440 445
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Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His
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485 490 495
Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu
500 505 510
Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala
515 520 525
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530 535 540
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Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe
565 570 575
Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser
580 585 590
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595 600 605
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Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu
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Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu
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Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln
675 680 685
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Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly
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Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val
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Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu
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Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu
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Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln
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Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu
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Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val
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Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val
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Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
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<210> 23
<211> 452
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 23
Ala Pro Asp Gln Asp Glu Ile Gln Arg Leu Pro Gly Leu Ala Lys Gln
1 5 10 15
Pro Ser Phe Arg Gln Tyr Ser Gly Tyr Leu Lys Gly Ser Gly Ser Lys
20 25 30
His Leu His Tyr Trp Phe Val Glu Ser Gln Lys Asp Pro Glu Asn Ser
35 40 45
Pro Val Val Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Leu Asp
50 55 60
Gly Leu Leu Thr Glu His Gly Pro Phe Leu Val Gln Pro Asp Gly Val
65 70 75 80
Thr Leu Glu Tyr Asn Pro Tyr Ser Trp Asn Leu Ile Ala Asn Val Leu
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Tyr Leu Glu Ser Pro Ala Gly Val Gly Phe Ser Tyr Ser Asp Asp Lys
100 105 110
Phe Tyr Ala Thr Asn Asp Thr Glu Val Ala Gln Ser Asn Phe Glu Ala
115 120 125
Leu Gln Asp Phe Phe Arg Leu Phe Pro Glu Tyr Lys Asn Asn Lys Leu
130 135 140
Phe Leu Thr Gly Glu Ser Tyr Ala Gly Ile Tyr Ile Pro Thr Leu Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Met Gln Asp Pro Ser Met Asn Leu Gln Gly Leu Ala Val
165 170 175
Gly Asn Gly Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Asn Asp Asn Ser Leu Val Tyr
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Phe Ala Tyr Tyr His Gly Leu Leu Gly Asn Arg Leu Trp Ser Ser Leu
195 200 205
Gln Thr His Cys Cys Ser Gln Asn Lys Cys Asn Phe Tyr Asp Asn Lys
210 215 220
Asp Leu Glu Cys Val Thr Asn Leu Gln Glu Val Ala Arg Ile Val Gly
225 230 235 240
Asn Ser Gly Leu Asn Ile Tyr Asn Leu Tyr Ala Pro Cys Ala Gly Gly
245 250 255
Val Pro Ser His Phe Arg Tyr Glu Lys Asp Thr Val Val Val Gln Asp
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Leu Gly Asn Ile Phe Thr Arg Leu Pro Leu Lys Arg Met Trp His Gln
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Asn Thr Thr Ala Ala Ser Thr Tyr Leu Asn Asn Pro Tyr Val Arg Lys
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Ala Leu Asn Ile Pro Glu Gln Leu Pro Gln Trp Asp Met Cys Asn Phe
325 330 335
Leu Val Asn Leu Gln Tyr Arg Arg Leu Tyr Arg Ser Met Asn Ser Gln
340 345 350
Tyr Leu Lys Leu Leu Ser Ser Gln Lys Tyr Gln Ile Leu Leu Tyr Asn
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Gly Asp Val Asp Met Ala Cys Asn Phe Met Gly Asp Glu Trp Phe Val
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Asp Ser Leu Asn Gln Lys Met Glu Val Gln Arg Arg Pro Trp Leu Val
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Lys Tyr Gly Asp Ser Gly Glu Gln Ile Ala Gly Phe Val Lys Glu Phe
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Ser His Ile Ala Phe Leu Thr Ile Lys Gly Ala Gly His Met Val Pro
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Thr Asp Lys Pro Leu Ala Ala Phe Thr Met Phe Ser Arg Phe Leu Asn
435 440 445
Lys Gln Pro Tyr
450
<210> 24
<211> 224
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 24
Ser Pro Leu Gln Ala Leu Asp Phe Phe Gly Asn Gly Pro Pro Val Asn
1 5 10 15
Tyr Lys Thr Gly Asn Leu Tyr Leu Arg Gly Pro Leu Lys Lys Ser Asn
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Ala Pro Leu Val Asn Val Thr Leu Tyr Tyr Glu Ala Leu Cys Gly Gly
35 40 45
Cys Arg Ala Phe Leu Ile Arg Glu Leu Phe Pro Thr Trp Leu Leu Val
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65 70 75 80
Gln Asn Val Ser Gly Arg Trp Glu Phe Lys Cys Gln His Gly Glu Glu
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Glu Cys Lys Phe Asn Lys Val Glu Ala Cys Val Leu Asp Glu Leu Asp
100 105 110
Met Glu Leu Ala Phe Leu Thr Ile Val Cys Met Glu Glu Phe Glu Asp
115 120 125
Met Glu Arg Ser Leu Pro Leu Cys Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Gly Leu
130 135 140
Ser Pro Asp Thr Ile Met Glu Cys Ala Met Gly Asp Arg Gly Met Gln
145 150 155 160
Leu Met His Ala Asn Ala Gln Arg Thr Asp Ala Leu Gln Pro Pro His
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Thr Gln Leu Leu Thr Leu Val Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Lys Lys Pro
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Asp Val Cys Pro Ser Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Val Cys Phe Lys
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<210> 25
<211> 304
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 25
Ala Thr Pro Ala Leu Arg Phe Val Ala Val Gly Asp Trp Gly Gly Val
1 5 10 15
Pro Asn Ala Pro Phe His Thr Ala Arg Glu Met Ala Asn Ala Lys Glu
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Ile Ala Arg Thr Val Gln Ile Leu Gly Ala Asp Phe Ile Leu Ser Leu
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Gly Asp Asn Phe Tyr Phe Thr Gly Val Gln Asp Ile Asn Asp Lys Arg
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Val Pro Trp Tyr Val Leu Ala Gly Asn His Asp His Leu Gly Asn Val
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Ser Gly Lys Ser Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro Arg Arg Ala Arg Pro
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<210> 26
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 26
Arg Pro Pro Asn Ile Val Leu Ile Phe Ala Asp Asp Leu Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Asp Leu Gly Cys Tyr Gly His Pro Ser Ser Thr Thr Pro Asn Leu Asp
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Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Arg Phe Thr Asp Phe Tyr Val Pro Val
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Gly Tyr Leu Thr Gly Met Ala Gly Lys Trp His Leu Gly Val Gly Pro
100 105 110
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275 280 285
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290 295 300
Ala Pro Gly Val Thr His Glu Leu Ala Ser Ser Leu Asp Leu Leu Pro
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Ser Ala His Ser Asp Thr Thr Ala Asp Pro Ala Cys His Ala Ser Ser
385 390 395 400
Ser Leu Thr Ala His Glu Pro Pro Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Lys Asp
405 410 415
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420 425 430
Glu Val Leu Gln Ala Leu Lys Gln Leu Gln Leu Leu Lys Ala Gln Leu
435 440 445
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450 455 460
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 27
Lys Glu Leu Lys Phe Val Thr Leu Val Phe Arg His Gly Asp Arg Ser
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165 170 175
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Ser Trp Ala Thr Glu Asp Thr Met Thr Lys Leu Arg Glu Leu Ser Glu
195 200 205
Leu Ser Leu Leu Ser Leu Tyr Gly Ile His Lys Gln Lys Glu Lys Ser
210 215 220
Arg Leu Gln Gly Gly Val Leu Val Asn Glu Ile Leu Asn His Met Lys
225 230 235 240
Arg Ala Thr Gln Ile Pro Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Met Tyr Ser Ala
245 250 255
His Asp Thr Thr Val Ser Gly Leu Gln Met Ala Leu Asp Val Tyr Asn
260 265 270
Gly Leu Leu Pro Pro Tyr Ala Ser Cys His Leu Thr Glu Leu Tyr Phe
275 280 285
Glu Lys Gly Glu Tyr Phe Val Glu Met Tyr Tyr Arg Asn Glu Thr Gln
290 295 300
His Glu Pro Tyr Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Ser Pro Ser Cys Pro
305 310 315 320
Leu Glu Arg Phe Ala Glu Leu Val Gly Pro Val Ile Pro Gln Asp Trp
325 330 335
Ser Thr Glu Cys Met Thr Thr Asn Ser His Gln Gly Thr Glu Asp Ser
340 345 350
Thr Asp
<210> 28
<211> 516
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 28
Val Phe Gly Val Ala Ala Gly Thr Arg Arg Pro Asn Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Leu Thr Asp Asp Gln Asp Glu Val Leu Gly Gly Met Thr Pro Leu Lys
20 25 30
Lys Thr Lys Ala Leu Ile Gly Glu Met Gly Met Thr Phe Ser Ser Ala
35 40 45
Tyr Val Pro Ser Ala Leu Cys Cys Pro Ser Arg Ala Ser Ile Leu Thr
50 55 60
Gly Lys Tyr Pro His Asn His His Val Val Asn Asn Thr Leu Glu Gly
65 70 75 80
Asn Cys Ser Ser Lys Ser Trp Gln Lys Ile Gln Glu Pro Asn Thr Phe
85 90 95
Pro Ala Ile Leu Arg Ser Met Cys Gly Tyr Gln Thr Phe Phe Ala Gly
100 105 110
Lys Tyr Leu Asn Glu Tyr Gly Ala Pro Asp Ala Gly Gly Leu Glu His
115 120 125
Val Pro Leu Gly Trp Ser Tyr Trp Tyr Ala Leu Glu Lys Asn Ser Lys
130 135 140
Tyr Tyr Asn Tyr Thr Leu Ser Ile Asn Gly Lys Ala Arg Lys His Gly
145 150 155 160
Glu Asn Tyr Ser Val Asp Tyr Leu Thr Asp Val Leu Ala Asn Val Ser
165 170 175
Leu Asp Phe Leu Asp Tyr Lys Ser Asn Phe Glu Pro Phe Phe Met Met
180 185 190
Ile Ala Thr Pro Ala Pro His Ser Pro Trp Thr Ala Ala Pro Gln Tyr
195 200 205
Gln Lys Ala Phe Gln Asn Val Phe Ala Pro Arg Asn Lys Asn Phe Asn
210 215 220
Ile His Gly Thr Asn Lys His Trp Leu Ile Arg Gln Ala Lys Thr Pro
225 230 235 240
Met Thr Asn Ser Ser Ile Gln Phe Leu Asp Asn Ala Phe Arg Lys Arg
245 250 255
Trp Gln Thr Leu Leu Ser Val Asp Asp Leu Val Glu Lys Leu Val Lys
260 265 270
Arg Leu Glu Phe Thr Gly Glu Leu Asn Asn Thr Tyr Ile Phe Tyr Thr
275 280 285
Ser Asp Asn Gly Tyr His Thr Gly Gln Phe Ser Leu Pro Ile Asp Lys
290 295 300
Arg Gln Leu Tyr Glu Phe Asp Ile Lys Val Pro Leu Leu Val Arg Gly
305 310 315 320
Pro Gly Ile Lys Pro Asn Gln Thr Ser Lys Met Leu Val Ala Asn Ile
325 330 335
Asp Leu Gly Pro Thr Ile Leu Asp Ile Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys
340 345 350
Thr Gln Met Asp Gly Met Ser Leu Leu Pro Ile Leu Arg Gly Ala Ser
355 360 365
Asn Leu Thr Trp Arg Ser Asp Val Leu Val Glu Tyr Gln Gly Glu Gly
370 375 380
Arg Asn Val Thr Asp Pro Thr Cys Pro Ser Leu Ser Pro Gly Val Ser
385 390 395 400
Gln Cys Phe Pro Asp Cys Val Cys Glu Asp Ala Tyr Asn Asn Thr Tyr
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Pro Asp Gln Ile Thr Asn Ile Ala Lys Thr Ile Asp Pro Glu Leu Leu
450 455 460
Gly Lys Met Asn Tyr Arg Leu Met Met Leu Gln Ser Cys Ser Gly Pro
465 470 475 480
Thr Cys Arg Thr Pro Gly Val Phe Asp Pro Gly Tyr Arg Phe Asp Pro
485 490 495
Arg Leu Met Phe Ser Asn Arg Gly Ser Val Arg Thr Arg Arg Phe Ser
500 505 510
Lys His Leu Leu
515
<210> 29
<211> 497
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 29
Ser Gly Ala Gly Ala Ser Arg Pro Pro His Leu Val Phe Leu Leu Ala
1 5 10 15
Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asp Val Gly Phe His Gly Ser Arg Ile Arg
20 25 30
Thr Pro His Leu Asp Ala Leu Ala Ala Gly Gly Val Leu Leu Asp Asn
35 40 45
Tyr Tyr Thr Gln Pro Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ser Gln Leu Leu Thr
50 55 60
Gly Arg Tyr Gln Ile Arg Thr Gly Leu Gln His Gln Ile Ile Trp Pro
65 70 75 80
Cys Gln Pro Ser Cys Val Pro Leu Asp Glu Lys Leu Leu Pro Gln Leu
85 90 95
Leu Lys Glu Ala Gly Tyr Thr Thr His Met Val Gly Lys Trp His Leu
100 105 110
Gly Met Tyr Arg Lys Glu Cys Leu Pro Thr Arg Arg Gly Phe Asp Thr
115 120 125
Tyr Phe Gly Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Asp Tyr Tyr Ser His Glu Arg
130 135 140
Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Asn Val Thr Arg Cys Ala Leu Asp Phe
145 150 155 160
Arg Asp Gly Glu Glu Val Ala Thr Gly Tyr Lys Asn Met Tyr Ser Thr
165 170 175
Asn Ile Phe Thr Lys Arg Ala Ile Ala Leu Ile Thr Asn His Pro Pro
180 185 190
Glu Lys Pro Leu Phe Leu Tyr Leu Ala Leu Gln Ser Val His Glu Pro
195 200 205
Leu Gln Val Pro Glu Glu Tyr Leu Lys Pro Tyr Asp Phe Ile Gln Asp
210 215 220
Lys Asn Arg His His Tyr Ala Gly Met Val Ser Leu Met Asp Glu Ala
225 230 235 240
Val Gly Asn Val Thr Ala Ala Leu Lys Ser Ser Gly Leu Trp Asn Asn
245 250 255
Thr Val Phe Ile Phe Ser Thr Asp Asn Gly Gly Gln Thr Leu Ala Gly
260 265 270
Gly Asn Asn Trp Pro Leu Arg Gly Arg Lys Trp Ser Leu Trp Glu Gly
275 280 285
Gly Val Arg Gly Val Gly Phe Val Ala Ser Pro Leu Leu Lys Gln Lys
290 295 300
Gly Val Lys Asn Arg Glu Leu Ile His Ile Ser Asp Trp Leu Pro Thr
305 310 315 320
Leu Val Lys Leu Ala Arg Gly His Thr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Asp
325 330 335
Gly Phe Asp Val Trp Lys Thr Ile Ser Glu Gly Ser Pro Ser Pro Arg
340 345 350
Ile Glu Leu Leu His Asn Ile Asp Pro Asn Phe Val Asp Ser Ser Pro
355 360 365
Cys Pro Arg Asn Ser Met Ala Pro Ala Lys Asp Asp Ser Ser Leu Pro
370 375 380
Glu Tyr Ser Ala Phe Asn Thr Ser Val His Ala Ala Ile Arg His Gly
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Asn Trp Lys Leu Leu Thr Gly Tyr Pro Gly Cys Gly Tyr Trp Phe Pro
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420 425 430
Thr Lys Thr Leu Trp Leu Phe Asp Ile Asp Arg Asp Pro Glu Glu Arg
435 440 445
His Asp Leu Ser Arg Glu Tyr Pro His Ile Val Thr Lys Leu Leu Ser
450 455 460
Arg Leu Gln Phe Tyr His Lys His Ser Val Pro Val Tyr Phe Pro Ala
465 470 475 480
Gln Asp Pro Arg Cys Asp Pro Lys Ala Thr Gly Val Trp Gly Pro Trp
485 490 495
Met
<210> 30
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 30
Leu Arg Asn Ala Thr Gln Arg Met Phe Glu Ile Asp Tyr Ser Arg Asp
1 5 10 15
Ser Phe Leu Lys Asp Gly Gln Pro Phe Arg Tyr Ile Ser Gly Ser Ile
20 25 30
His Tyr Ser Arg Val Pro Arg Phe Tyr Trp Lys Asp Arg Leu Leu Lys
35 40 45
Met Lys Met Ala Gly Leu Asn Ala Ile Gln Thr Tyr Val Pro Trp Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Val Glu Tyr Phe Leu Arg Leu Ala His Glu Leu Gly Leu Leu Val Ile
85 90 95
Leu Arg Pro Gly Pro Tyr Ile Cys Ala Glu Trp Glu Met Gly Gly Leu
100 105 110
Pro Ala Trp Leu Leu Glu Lys Glu Ser Ile Leu Leu Arg Ser Ser Asp
115 120 125
Pro Asp Tyr Leu Ala Ala Val Asp Lys Trp Leu Gly Val Leu Leu Pro
130 135 140
Lys Met Lys Pro Leu Leu Tyr Gln Asn Gly Gly Pro Val Ile Thr Val
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Gln Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Tyr Phe Ala Cys Asp Phe Asp Tyr
165 170 175
Leu Arg Phe Leu Gln Lys Arg Phe Arg His His Leu Gly Asp Asp Val
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Val Leu Phe Thr Thr Asp Gly Ala His Lys Thr Phe Leu Lys Cys Gly
195 200 205
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Ile Thr Asp Ala Phe Leu Ser Gln Arg Lys Cys Glu Pro Lys Gly Pro
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Leu Ile Asn Ser Glu Phe Tyr Thr Gly Trp Leu Asp His Trp Gly Gln
245 250 255
Pro His Ser Thr Ile Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Ser Leu Tyr Asp
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Ile Leu Ala Arg Gly Ala Ser Val Asn Leu Tyr Met Phe Ile Gly Gly
275 280 285
Thr Asn Phe Ala Tyr Trp Asn Gly Ala Asn Ser Pro Tyr Ala Ala Gln
290 295 300
Pro Thr Ser Tyr Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Ser Glu Ala Gly Asp Leu
305 310 315 320
Thr Glu Lys Tyr Phe Ala Leu Arg Asn Ile Ile Gln Lys Phe Glu Lys
325 330 335
Val Pro Glu Gly Pro Ile Pro Pro Ser Thr Pro Lys Phe Ala Tyr Gly
340 345 350
Lys Val Thr Leu Glu Lys Leu Lys Thr Val Gly Ala Ala Leu Asp Ile
355 360 365
Leu Cys Pro Ser Gly Pro Ile Lys Ser Leu Tyr Pro Leu Thr Phe Ile
370 375 380
Gln Val Lys Gln His Tyr Gly Phe Val Leu Tyr Arg Thr Thr Leu Pro
385 390 395 400
Gln Asp Cys Ser Asn Pro Ala Pro Leu Ser Ser Pro Leu Asn Gly Val
405 410 415
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420 425 430
Glu Arg Asn Asn Val Ile Thr Leu Asn Ile Thr Gly Lys Ala Gly Ala
435 440 445
Thr Leu Asp Leu Leu Val Glu Asn Met Gly Arg Val Asn Tyr Gly Ala
450 455 460
Tyr Ile Asn Asp Phe Lys Gly Leu Val Ser Asn Leu Thr Leu Ser Ser
465 470 475 480
Asn Ile Leu Thr Asp Trp Thr Ile Phe Pro Leu Asp Thr Glu Asp Ala
485 490 495
Val Arg Ser His Leu Gly Gly Trp Gly His Arg Asp Ser Gly His His
500 505 510
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515 520 525
Tyr Met Gly Asn Phe Ser Ile Pro Ser Gly Ile Pro Asp Leu Pro Gln
530 535 540
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545 550 555 560
Asn Gly Phe Asn Leu Gly Arg Tyr Trp Pro Ala Arg Gly Pro Gln Leu
565 570 575
Thr Leu Phe Val Pro Gln His Ile Leu Met Thr Ser Ala Pro Asn Thr
580 585 590
Ile Thr Val Leu Glu Leu Glu Trp Ala Pro Cys Ser Ser Asp Asp Pro
595 600 605
Glu Leu Cys Ala Val Thr Phe Val Asp Arg Pro Val Ile Gly Ser Ser
610 615 620
Val Thr Tyr Asp His Pro Ser Lys Pro Val Glu Lys Arg Leu Met Pro
625 630 635 640
Pro Pro Pro Gln Lys Asn Lys Asp Ser Trp Leu Asp His Val
645 650
<210> 31
<211> 394
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 31
Leu Asp Asn Gly Leu Leu Gln Thr Pro Pro Met Gly Trp Leu Ala Trp
1 5 10 15
Glu Arg Phe Arg Cys Asn Ile Asn Cys Asp Glu Asp Pro Lys Asn Cys
20 25 30
Ile Ser Glu Gln Leu Phe Met Glu Met Ala Asp Arg Met Ala Gln Asp
35 40 45
Gly Trp Arg Asp Met Gly Tyr Thr Tyr Leu Asn Ile Asp Asp Cys Trp
50 55 60
Ile Gly Gly Arg Asp Ala Ser Gly Arg Leu Met Pro Asp Pro Lys Arg
65 70 75 80
Phe Pro His Gly Ile Pro Phe Leu Ala Asp Tyr Val His Ser Leu Gly
85 90 95
Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Met Gly Asn Phe Thr Cys Met Gly
100 105 110
Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Asp Lys Val Val Gln Asp Ala Gln Thr Phe
115 120 125
Ala Glu Trp Lys Val Asp Met Leu Lys Leu Asp Gly Cys Phe Ser Thr
130 135 140
Pro Glu Glu Arg Ala Gln Gly Tyr Pro Lys Met Ala Ala Ala Leu Asn
145 150 155 160
Ala Thr Gly Arg Pro Ile Ala Phe Ser Cys Ser Trp Pro Ala Tyr Glu
165 170 175
Gly Gly Leu Pro Pro Arg Val Asn Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Ile Cys
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Asn Leu Trp Arg Asn Tyr Asp Asp Ile Gln Asp Ser Trp Trp Ser Val
195 200 205
Leu Ser Ile Leu Asn Trp Phe Val Glu His Gln Asp Ile Leu Gln Pro
210 215 220
Val Ala Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Leu Ile Gly
225 230 235 240
Asn Phe Gly Leu Ser Leu Glu Gln Ser Arg Ala Gln Met Ala Leu Trp
245 250 255
Thr Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Met Ser Thr Asp Leu Arg Thr Ile
260 265 270
Ser Ala Gln Asn Met Asp Ile Leu Gln Asn Pro Leu Met Ile Lys Ile
275 280 285
Asn Gln Asp Pro Leu Gly Ile Gln Gly Arg Arg Ile His Lys Glu Lys
290 295 300
Ser Leu Ile Glu Val Tyr Met Arg Pro Leu Ser Asn Lys Ala Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Phe Phe Ser Cys Arg Thr Asp Met Pro Tyr Arg Tyr His Ser
325 330 335
Ser Leu Gly Gln Leu Asn Phe Thr Gly Ser Val Ile Tyr Glu Ala Gln
340 345 350
Asp Val Tyr Ser Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Arg Asp Glu Thr Asn
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Phe Thr Val Ile Ile Asn Pro Ser Gly Val Val Met Trp Tyr Leu Tyr
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Pro Ile Lys Asn Leu Glu Met Ser Gln Gln
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<211> 583
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 32
Leu Ser Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu
1 5 10 15
Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu
20 25 30
Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly
35 40 45
Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala
50 55 60
Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala
65 70 75 80
Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met
85 90 95
Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly
100 105 110
Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp
115 120 125
Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp
145 150 155 160
Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala
165 170 175
Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg
180 185 190
Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu
195 200 205
Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His
225 230 235 240
Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu
245 250 255
Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn
260 265 270
His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly
275 280 285
Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu
290 295 300
Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe
305 310 315 320
Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met
325 330 335
Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp
340 345 350
Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu
355 360 365
Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His
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Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr
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Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu
405 410 415
Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val
420 425 430
Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly
435 440 445
Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val
450 455 460
Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile
465 470 475 480
Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr
485 490 495
Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr
500 505 510
Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr
515 520 525
His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu
530 535 540
Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu
545 550 555 560
Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu
565 570 575
Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys
580
<210> 33
<211> 170
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 33
His Leu Lys Lys Pro Ser Gln Leu Ser Ser Phe Ser Trp Asp Asn Cys
1 5 10 15
Asp Glu Gly Lys Asp Pro Ala Val Ile Arg Ser Leu Thr Leu Glu Pro
20 25 30
Asp Pro Ile Ile Val Pro Gly Asn Val Thr Leu Ser Val Met Gly Ser
35 40 45
Thr Ser Val Pro Leu Ser Ser Pro Leu Lys Val Asp Leu Val Leu Glu
50 55 60
Lys Glu Val Ala Gly Leu Trp Ile Lys Ile Pro Cys Thr Asp Tyr Ile
65 70 75 80
Gly Ser Cys Thr Phe Glu His Phe Cys Asp Val Leu Asp Met Leu Ile
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Pro Thr Gly Glu Pro Cys Pro Glu Pro Leu Arg Thr Tyr Gly Leu Pro
100 105 110
Cys His Cys Pro Phe Lys Glu Gly Thr Tyr Ser Leu Pro Lys Ser Glu
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Phe Val Val Pro Asp Leu Glu Leu Pro Ser Trp Leu Thr Thr Gly Asn
130 135 140
Tyr Arg Ile Glu Ser Val Leu Ser Ser Ser Gly Lys Arg Leu Gly Cys
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Ile Lys Ile Ala Ala Ser Leu Lys Gly Ile
165 170
<210> 34
<211> 323
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 34
Ser Ser Pro Leu Pro Leu Val Val Asn Thr Trp Pro Phe Lys Asn Ala
1 5 10 15
Thr Glu Ala Ala Trp Arg Ala Leu Ala Ser Gly Gly Ser Ala Leu Asp
20 25 30
Ala Val Glu Ser Gly Cys Ala Met Cys Glu Arg Glu Gln Cys Asp Gly
35 40 45
Ser Val Gly Phe Gly Gly Ser Pro Asp Glu Leu Gly Glu Thr Thr Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Leu Arg Arg Ile Lys Asn Ala Ile Gly Val Ala Arg Lys Val Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Trp Arg Asn Val Ile Pro Asp Pro Ser Lys Tyr Cys Gly Pro Tyr Lys
145 150 155 160
Pro Pro Gly Ile Leu Lys Gln Asp Ile Pro Ile His Lys Glu Thr Glu
165 170 175
Asp Asp Arg Gly His Asp Thr Ile Gly Met Val Val Ile His Lys Thr
180 185 190
Gly His Ile Ala Ala Gly Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Phe Lys Ile
195 200 205
His Gly Arg Val Gly Asp Ser Pro Ile Pro Gly Ala Gly Ala Tyr Ala
210 215 220
Asp Asp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Asn Gly Asp Ile Leu
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
His Phe Pro Glu Phe Phe Gly Ala Val Ile Cys Ala Asn Val Thr Gly
275 280 285
Ser Tyr Gly Ala Ala Cys Asn Lys Leu Ser Thr Phe Thr Gln Phe Ser
290 295 300
Phe Met Val Tyr Asn Ser Glu Lys Asn Gln Pro Thr Glu Glu Lys Val
305 310 315 320
Asp Cys Ile
<210> 35
<211> 525
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 35
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
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<211> 315
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<213> HOMO SAPIENS
<400> 36
Gln Leu His Lys Asp Pro Thr Leu Asp His His Trp His Leu Trp Lys
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Arg Leu Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Phe Val Met Leu His Asn Leu
35 40 45
Glu His Ser Met Gly Met His Ser Tyr Asp Leu Gly Met Asn His Leu
50 55 60
Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Val Met Ser Leu Met Ser Ser Leu Arg
65 70 75 80
Val Pro Ser Gln Trp Gln Arg Asn Ile Thr Tyr Lys Ser Asn Pro Asn
85 90 95
Arg Ile Leu Pro Asp Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Cys Val Thr
100 105 110
Glu Val Lys Tyr Gln Gly Ser Cys Gly Ala Cys Trp Ala Phe Ser Ala
115 120 125
Val Gly Ala Leu Glu Ala Gln Leu Lys Leu Lys Thr Gly Lys Leu Val
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Thr Glu Lys Tyr Gly
145 150 155 160
Asn Lys Gly Cys Asn Gly Gly Phe Met Thr Thr Ala Phe Gln Tyr Ile
165 170 175
Ile Asp Asn Lys Gly Ile Asp Ser Asp Ala Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala
180 185 190
Met Asp Gln Lys Cys Gln Tyr Asp Ser Lys Tyr Arg Ala Ala Thr Cys
195 200 205
Ser Lys Tyr Thr Glu Leu Pro Tyr Gly Arg Glu Asp Val Leu Lys Glu
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Ala Val Ala Asn Lys Gly Pro Val Ser Val Gly Val Asp Ala Arg His
225 230 235 240
Pro Ser Phe Phe Leu Tyr Arg Ser Gly Val Tyr Tyr Glu Pro Ser Cys
245 250 255
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260 265 270
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Gly Glu Glu Gly Tyr Ile Arg Met Ala Arg Asn Lys Gly Asn His Cys
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Gly Ile Ala Ser Phe Pro Ser Tyr Pro Glu Ile
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<211> 496
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 37
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1 5 10 15
Trp Gly Asp Leu Gly Val Tyr Gly Glu Pro Ser Arg Glu Thr Pro Asn
20 25 30
Leu Asp Arg Met Ala Ala Glu Gly Leu Leu Phe Pro Asn Phe Tyr Ser
35 40 45
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50 55 60
Leu Pro Ile Arg Asn Gly Phe Tyr Thr Thr Asn Ala His Ala Arg Asn
65 70 75 80
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Leu Leu Pro Glu Leu Leu Lys Lys Ala Gly Tyr Val Ser Lys Ile Val
100 105 110
Gly Lys Trp His Leu Gly His Arg Pro Gln Phe His Pro Leu Lys His
115 120 125
Gly Phe Asp Glu Trp Phe Gly Ser Pro Asn Cys His Phe Gly Pro Tyr
130 135 140
Asp Asn Lys Ala Arg Pro Asn Ile Pro Val Tyr Arg Asp Trp Glu Met
145 150 155 160
Val Gly Arg Tyr Tyr Glu Glu Phe Pro Ile Asn Leu Lys Thr Gly Glu
165 170 175
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Arg Gln Ala Arg His His Pro Phe Phe Leu Tyr Trp Ala Val Asp Ala
195 200 205
Thr His Ala Pro Val Tyr Ala Ser Lys Pro Phe Leu Gly Thr Ser Gln
210 215 220
Arg Gly Arg Tyr Gly Asp Ala Val Arg Glu Ile Asp Asp Ser Ile Gly
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
Ile Asp Gly Leu Asn Leu Leu Pro Thr Leu Leu Gln Gly Arg Leu Met
340 345 350
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370 375 380
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385 390 395 400
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485 490 495
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 38
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Arg Arg Phe Trp Arg Ser Thr Gly Phe Cys Pro Pro Leu Pro His Ser
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
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Ser Ser Ile Ser Ile Leu Glu Gln Glu Lys Val Val Ala Gln Gln Ile
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Arg Gln Leu Phe Pro Lys Phe Ala Asp Thr Pro Ile Tyr Asn Asp Glu
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Leu Asp Asn Gly Leu Cys Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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Leu Gly Arg Leu Pro Asp His Leu Ile Lys Asp Leu Phe Gly Asp Lys
195 200 205
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<213> HOMO SAPIENS
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115 120 125
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Gly Met Leu Ala Ala Trp Phe Arg Met Lys Tyr Pro His Met Val Val
165 170 175
Gly Ala Leu Ala Ala Ser Ala Pro Ile Trp Gln Phe Glu Asp Leu Val
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Pro Cys Gly Val Phe Met Lys Ile Val Thr Thr Asp Phe Arg Lys Ser
195 200 205
Gly Pro His Cys Ser Glu Ser Ile His Arg Ser Trp Asp Ala Ile Asn
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Arg Leu Ser Asn Thr Gly Ser Gly Leu Gln Trp Leu Thr Gly Ala Leu
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His Leu Cys Ser Pro Leu Thr Ser Gln Asp Ile Gln His Leu Lys Asp
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Asn Ile Phe Gln Ala Leu Asn Val Tyr Tyr Asn Tyr Ser Gly Gln Val
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Gly Trp Ser Tyr Gln Ala Cys Thr Glu Val Val Met Pro Phe Cys Thr
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Asn Gly Val Asp Asp Met Phe Glu Pro His Ser Trp Asn Leu Lys Glu
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<210> 41
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 41
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Glu Ala Ala Ala Phe Arg Glu Ser Leu Asn Arg His Arg Tyr Leu Asn
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Ser Leu Phe Pro Ser Glu Asn Ser Thr Ala Phe Tyr Gly Ile Asn Gln
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Ser Val Val Gly Ala Val Glu Ser Ala Tyr Ala Ile Lys Gly Lys Pro
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Gly Val Asp Gly Tyr Ala His Val Lys Met Gly Ser Asn Val Cys Gly
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<211> 314
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 42
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Phe Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn Ser
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<211> 279
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 43
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Ser Cys Cys Asn Pro Leu Ser Met Gly Ala Ile Lys Lys Met Val Glu
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 44
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Pro Leu Leu Val Ser Ser Pro Glu His Pro Lys Arg Trp Gly Gln Val
275 280 285
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Ile His Leu Thr Gly Arg Ser Leu Leu Pro Ala Leu Glu Ala Glu Pro
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Ser Tyr Pro Met Arg Ser Val Gln His Arg His Phe Arg Leu Val His
355 360 365
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Gly Ile Leu Thr Leu Ala Ala Gly Gln Thr Cys Gly Phe Phe Ser Val
180 185 190
Ser Ala Arg Ala Val Thr Gly Met Ala Gly Val Gly Cys Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Ser Trp Tyr Ser Ser Phe Gly Phe Val Arg Arg Trp Asn Cys Ile
210 215 220
Leu Met Arg Asn His Asp Val Thr Glu Gln Pro Met Val Leu Glu Lys
225 230 235 240
Thr Ala Ser Leu Met Leu Lys Glu Ala Val Ser Tyr Ile Glu Arg His
245 250 255
Lys His Gly Pro Phe Leu Leu Phe Leu Ser Leu Leu His Val His Ile
260 265 270
Pro Leu Val Thr Thr Ser Ala Phe Leu Gly Lys Ser Gln His Gly Leu
275 280 285
Tyr Gly Asp Asn Val Glu Glu Met Asp Trp Leu Ile Gly Lys Val Leu
290 295 300
Asn Ala Ile Glu Asp Asn Gly Leu Lys Asn Ser Thr Phe Thr Tyr Phe
305 310 315 320
Thr Ser Asp His Gly Gly His Leu Glu Ala Arg Asp Gly His Ser Gln
325 330 335
Leu Gly Gly Trp Asn Gly Ile Tyr Lys Gly Gly Lys Gly Met Gly Gly
340 345 350
Trp Glu Gly Gly Ile Arg Val Pro Gly Ile Phe His Trp Pro Gly Val
355 360 365
Leu Pro Ala Gly Arg Val Ile Gly Glu Pro Thr Ser Leu Met Asp Val
370 375 380
Phe Pro Thr Val Val Gln Leu Val Gly Gly Glu Val Pro Gln Asp Arg
385 390 395 400
Val Ile Asp Gly His Ser Leu Val Pro Leu Leu Gln Gly Ala Glu Ala
405 410 415
Arg Ser Ala His Glu Phe Leu Phe His Tyr Cys Gly Gln His Leu His
420 425 430
Ala Ala Arg Trp His Gln Lys Asp Ser Gly Ser Val Trp Lys Val His
435 440 445
Tyr Thr Thr Pro Gln Phe His Pro Glu Gly Ala Gly Ala Cys Tyr Gly
450 455 460
Arg Gly Val Cys Pro Cys Ser Gly Glu Gly Val Thr His His Arg Pro
465 470 475 480
Pro Leu Leu Phe Asp Leu Ser Arg Asp Pro Ser Glu Ala Arg Pro Leu
485 490 495
Thr Pro Asp Ser Glu Pro Leu Tyr His Ala Val Ile Ala Arg Val Gly
500 505 510
Ala Ala Val Ser Glu His Arg Gln Thr Leu Ser Pro Val Pro Gln Gln
515 520 525
Phe Ser Met Ser Asn Ile Leu Trp Lys Pro Trp Leu Gln Pro Cys Cys
530 535 540
Gly His Phe Pro Phe Cys Ser Cys His Glu Asp Gly Asp Gly Thr Pro
545 550 555 560
<210> 46
<211> 439
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 46
Asp Thr Pro Ala Asn Cys Thr Tyr Leu Asp Leu Leu Gly Thr Trp Val
1 5 10 15
Phe Gln Val Gly Ser Ser Gly Ser Gln Arg Asp Val Asn Cys Ser Val
20 25 30
Met Gly Pro Gln Glu Lys Lys Val Val Val Tyr Leu Gln Lys Leu Asp
35 40 45
Thr Ala Tyr Asp Asp Leu Gly Asn Ser Gly His Phe Thr Ile Ile Tyr
50 55 60
Asn Gln Gly Phe Glu Ile Val Leu Asn Asp Tyr Lys Trp Phe Ala Phe
65 70 75 80
Phe Lys Tyr Lys Glu Glu Gly Ser Lys Val Thr Thr Tyr Cys Asn Glu
85 90 95
Thr Met Thr Gly Trp Val His Asp Val Leu Gly Arg Asn Trp Ala Cys
100 105 110
Phe Thr Gly Lys Lys Val Gly Thr Ala Ser Glu Asn Val Tyr Val Asn
115 120 125
Ile Ala His Leu Lys Asn Ser Gln Glu Lys Tyr Ser Asn Arg Leu Tyr
130 135 140
Lys Tyr Asp His Asn Phe Val Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gln Lys Ser
145 150 155 160
Trp Thr Ala Thr Thr Tyr Met Glu Tyr Glu Thr Leu Thr Leu Gly Asp
165 170 175
Met Ile Arg Arg Ser Gly Gly His Ser Arg Lys Ile Pro Arg Pro Lys
180 185 190
Pro Ala Pro Leu Thr Ala Glu Ile Gln Gln Lys Ile Leu His Leu Pro
195 200 205
Thr Ser Trp Asp Trp Arg Asn Val His Gly Ile Asn Phe Val Ser Pro
210 215 220
Val Arg Asn Gln Ala Ser Cys Gly Ser Cys Tyr Ser Phe Ala Ser Met
225 230 235 240
Gly Met Leu Glu Ala Arg Ile Arg Ile Leu Thr Asn Asn Ser Gln Thr
245 250 255
Pro Ile Leu Ser Pro Gln Glu Val Val Ser Cys Ser Gln Tyr Ala Gln
260 265 270
Gly Cys Glu Gly Gly Phe Pro Tyr Leu Ile Ala Gly Lys Tyr Ala Gln
275 280 285
Asp Phe Gly Leu Val Glu Glu Ala Cys Phe Pro Tyr Thr Gly Thr Asp
290 295 300
Ser Pro Cys Lys Met Lys Glu Asp Cys Phe Arg Tyr Tyr Ser Ser Glu
305 310 315 320
Tyr His Tyr Val Gly Gly Phe Tyr Gly Gly Cys Asn Glu Ala Leu Met
325 330 335
Lys Leu Glu Leu Val His His Gly Pro Met Ala Val Ala Phe Glu Val
340 345 350
Tyr Asp Asp Phe Leu His Tyr Lys Lys Gly Ile Tyr His His Thr Gly
355 360 365
Leu Arg Asp Pro Phe Asn Pro Phe Glu Leu Thr Asn His Ala Val Leu
370 375 380
Leu Val Gly Tyr Gly Thr Asp Ser Ala Ser Gly Met Asp Tyr Trp Ile
385 390 395 400
Val Lys Asn Ser Trp Gly Thr Gly Trp Gly Glu Asn Gly Tyr Phe Arg
405 410 415
Ile Arg Arg Gly Thr Asp Glu Cys Ala Ile Glu Ser Ile Ala Val Ala
420 425 430
Ala Thr Pro Ile Pro Lys Leu
435
<210> 47
<211> 720
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 47
Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu
1 5 10 15
Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe Ser Val Ser Val Glu Arg Ala
20 25 30
Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe Cys Gly Cys His Val Ala Trp
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly
85 90 95
Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val
100 105 110
Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu
115 120 125
Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala
130 135 140
Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly
145 150 155 160
Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu
165 170 175
Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro
180 185 190
Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr Leu Gln His Arg Val Leu Asp
195 200 205
Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly
210 215 220
His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val Phe Pro Gln Val Asn Val Thr
225 230 235 240
Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe
245 250 255
Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe
260 265 270
Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala
275 280 285
Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu
290 295 300
Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu Ala Met Thr Ala Val Asp Thr
305 310 315 320
Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp Leu Phe Gln His Gln Pro Gln
325 330 335
Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala Val Leu Gly Ala Val Pro Arg
340 345 350
Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr
355 360 365
Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu
370 375 380
His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val
385 390 395 400
Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu Phe Pro Asn Ser Thr Met Val
405 410 415
Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr
420 425 430
Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu
435 440 445
Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala Arg Arg Tyr Gly Val Ser His
450 455 460
Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn
465 470 475 480
Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg
485 490 495
Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp
500 505 510
Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala
515 520 525
Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala
530 535 540
Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr
545 550 555 560
Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala
565 570 575
Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg
580 585 590
Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser
595 600 605
Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr
610 615 620
Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu
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Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu
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Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln Gly Ile Pro Phe Gln Gln His
660 665 670
Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser
675 680 685
Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala
690 695 700
Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp
705 710 715 720
<210> 48
<211> 643
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 48
Tyr Val Leu Asp Asp Ser Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile
1 5 10 15
Gly Ala Val Ser Gly Gly Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr
20 25 30
Pro Glu Pro Tyr Arg Ser Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn
35 40 45
Phe Gly Ala Ser Leu His Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asn Tyr Phe Arg Gly Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys
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Lys Arg Asn Pro Asn Ile Thr Leu Ile Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro
100 105 110
Gly Trp Leu Gly Lys Gly Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu
115 120 125
Thr Ala Tyr Tyr Val Val Thr Trp Ile Val Gly Ala Lys Arg Tyr His
130 135 140
Asp Leu Asp Ile Asp Tyr Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Asn Tyr Ile Lys Ile Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu
165 170 175
Gln Arg Val Lys Ile Ile Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser
180 185 190
Ala Ser Met Leu Leu Asp Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val Ile
195 200 205
Gly Ala His Tyr Pro Gly Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr
210 215 220
Gly Lys Lys Leu Trp Ser Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp
225 230 235 240
Met Gly Ala Gly Cys Trp Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn
245 250 255
Gly Tyr Met Thr Ser Thr Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr
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275 280 285
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290 295 300
Thr Thr Gln Phe Thr Gln Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly
305 310 315 320
His Leu Glu Lys Gly Gly Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly
325 330 335
Asn Leu Thr Ile Ile Ile Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys
340 345 350
Ile Arg Pro Phe Leu Pro Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr
355 360 365
Phe Val Leu Lys Gly Ser Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp
370 375 380
Tyr Thr Lys Leu Gly Lys Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu
385 390 395 400
Asp Ser Leu Trp Leu Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu
405 410 415
His Glu Asp Glu Leu Phe Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys
420 425 430
Gly Ser Tyr Pro Leu Pro Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr
435 440 445
Lys Asp Asp Phe Asn Val Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn
450 455 460
Phe Ala Asp Gln Thr Gly Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn Ile Glu Asp
465 470 475 480
Pro Gly Glu His His Phe Thr Leu Arg Gln Val Leu Asn Gln Arg Pro
485 490 495
Ile Thr Trp Ala Ala Asp Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ile Ile Gly Asp
500 505 510
Tyr Asn Trp Thr Asn Leu Thr Ile Lys Cys Asp Val Tyr Ile Glu Thr
515 520 525
Pro Asp Thr Gly Gly Val Phe Ile Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly
530 535 540
Ile Leu Ile Arg Ser Ala Arg Gly Ile Phe Phe Trp Ile Phe Ala Asn
545 550 555 560
Gly Ser Tyr Arg Val Thr Gly Asp Leu Ala Gly Trp Ile Ile Tyr Ala
565 570 575
Leu Gly Arg Val Glu Val Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu
580 585 590
Thr Ile Lys Gly His Phe Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu
595 600 605
Trp Thr Asp Ile Pro Val Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala Ile
610 615 620
Gly Thr His Ser Phe Glu Phe Ala Gln Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu
625 630 635 640
Ala Thr Arg
<210> 49
<211> 132
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 49
Glu Pro Val Gln Phe Lys Asp Cys Gly Ser Val Asp Gly Val Ile Lys
1 5 10 15
Glu Val Asn Val Ser Pro Cys Pro Thr Gln Pro Cys Gln Leu Ser Lys
20 25 30
Gly Gln Ser Tyr Ser Val Asn Val Thr Phe Thr Ser Asn Ile Gln Ser
35 40 45
Lys Ser Ser Lys Ala Val Val His Gly Ile Leu Met Gly Val Pro Val
50 55 60
Pro Phe Pro Ile Pro Glu Pro Asp Gly Cys Lys Ser Gly Ile Asn Cys
65 70 75 80
Pro Ile Gln Lys Asp Lys Thr Tyr Ser Tyr Leu Asn Lys Leu Pro Val
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Lys Ser Glu Tyr Pro Ser Ile Lys Leu Val Val Glu Trp Gln Leu Gln
100 105 110
Asp Asp Lys Asn Gln Ser Leu Phe Cys Trp Glu Ile Pro Val Gln Ile
115 120 125
Val Ser His Leu
130
<210> 50
<211> 347
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 50
Thr Asp Cys Pro Cys Pro Glu Pro Glu Leu Cys Arg Pro Ile Arg His
1 5 10 15
His Pro Asp Phe Glu Val Phe Val Phe Asp Val Gly Gln Lys Thr Trp
20 25 30
Lys Ser Tyr Asp Trp Ser Gln Ile Thr Thr Val Ala Thr Phe Gly Lys
35 40 45
Tyr Asp Ser Glu Leu Met Cys Tyr Ala His Ser Lys Gly Ala Arg Val
50 55 60
Val Leu Lys Gly Asp Val Ser Leu Lys Asp Ile Ile Asp Pro Ala Phe
65 70 75 80
Arg Ala Ser Trp Ile Ala Gln Lys Leu Asn Leu Ala Lys Thr Gln Tyr
85 90 95
Met Asp Gly Ile Asn Ile Asp Ile Glu Gln Glu Val Asn Cys Leu Ser
100 105 110
Pro Glu Tyr Asp Ala Leu Thr Ala Leu Val Lys Glu Thr Thr Asp Ser
115 120 125
Phe His Arg Glu Ile Glu Gly Ser Gln Val Thr Phe Asp Val Ala Trp
130 135 140
Ser Pro Lys Asn Ile Asp Arg Arg Cys Tyr Asn Tyr Thr Gly Ile Ala
145 150 155 160
Asp Ala Cys Asp Phe Leu Phe Val Met Ser Tyr Asp Glu Gln Ser Gln
165 170 175
Ile Trp Ser Glu Cys Ile Ala Ala Ala Asn Ala Pro Tyr Asn Gln Thr
180 185 190
Leu Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Ile Lys Met Ser Ile Asn Pro Lys Lys
195 200 205
Leu Val Met Gly Val Pro Trp Tyr Gly Tyr Asp Tyr Thr Cys Leu Asn
210 215 220
Leu Ser Glu Asp His Val Cys Thr Ile Ala Lys Val Pro Phe Arg Gly
225 230 235 240
Ala Pro Cys Ser Asp Ala Ala Gly Arg Gln Val Pro Tyr Lys Thr Ile
245 250 255
Met Lys Gln Ile Asn Ser Ser Ile Ser Gly Asn Leu Trp Asp Lys Asp
260 265 270
Gln Arg Ala Pro Tyr Tyr Asn Tyr Lys Asp Pro Ala Gly His Phe His
275 280 285
Gln Val Trp Tyr Asp Asn Pro Gln Ser Ile Ser Leu Lys Ala Thr Tyr
290 295 300
Ile Gln Asn Tyr Arg Leu Arg Gly Ile Gly Met Trp Asn Ala Asn Cys
305 310 315 320
Leu Asp Tyr Ser Gly Asp Ala Val Ala Lys Gln Gln Thr Glu Glu Met
325 330 335
Trp Glu Val Leu Lys Pro Lys Leu Leu Gln Arg
340 345
<210> 51
<211> 331
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 51
Ser Pro Pro Ala Ala Pro Arg Phe Asn Val Ser Leu Asp Ser Val Pro
1 5 10 15
Glu Leu Arg Trp Leu Pro Val Leu Arg His Tyr Asp Leu Asp Leu Val
20 25 30
Arg Ala Ala Met Ala Gln Val Ile Gly Asp Arg Val Pro Lys Trp Val
35 40 45
His Val Leu Ile Gly Lys Val Val Leu Glu Leu Glu Arg Phe Leu Pro
50 55 60
Gln Pro Phe Thr Gly Glu Ile Arg Gly Met Cys Asp Phe Met Asn Leu
65 70 75 80
Ser Leu Ala Asp Cys Leu Leu Val Asn Leu Ala Tyr Glu Ser Ser Val
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Phe Cys Thr Ser Ile Val Ala Gln Asp Ser Arg Gly His Ile Tyr His
100 105 110
Gly Arg Asn Leu Asp Tyr Pro Phe Gly Asn Val Leu Arg Lys Leu Thr
115 120 125
Val Asp Val Gln Phe Leu Lys Asn Gly Gln Ile Ala Phe Thr Gly Thr
130 135 140
Thr Phe Ile Gly Tyr Val Gly Leu Trp Thr Gly Gln Ser Pro His Lys
145 150 155 160
Phe Thr Val Ser Gly Asp Glu Arg Asp Lys Gly Trp Trp Trp Glu Asn
165 170 175
Ala Ile Ala Ala Leu Phe Arg Arg His Ile Pro Val Ser Trp Leu Ile
180 185 190
Arg Ala Thr Leu Ser Glu Ser Glu Asn Phe Glu Ala Ala Val Gly Lys
195 200 205
Leu Ala Lys Thr Pro Leu Ile Ala Asp Val Tyr Tyr Ile Val Gly Gly
210 215 220
Thr Ser Pro Arg Glu Gly Val Val Ile Thr Arg Asn Arg Asp Gly Pro
225 230 235 240
Ala Asp Ile Trp Pro Leu Asp Pro Leu Asn Gly Ala Trp Phe Arg Val
245 250 255
Glu Thr Asn Tyr Asp His Trp Lys Pro Ala Pro Lys Glu Asp Asp Arg
260 265 270
Arg Thr Ser Ala Ile Lys Ala Leu Asn Ala Thr Gly Gln Ala Asn Leu
275 280 285
Ser Leu Glu Ala Leu Phe Gln Ile Leu Ser Val Val Pro Val Tyr Asn
290 295 300
Asn Phe Thr Ile Tyr Thr Thr Val Met Ser Ala Gly Ser Pro Asp Lys
305 310 315 320
Tyr Met Thr Arg Ile Arg Asn Pro Ser Arg Lys
325 330
<210> 52
<211> 414
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 52
Phe Arg Gly Pro Leu Leu Pro Asn Arg Pro Phe Thr Thr Val Trp Asn
1 5 10 15
Ala Asn Thr Gln Trp Cys Leu Glu Arg His Gly Val Asp Val Asp Val
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Ser Val Phe Asp Val Val Ala Asn Pro Gly Gln Thr Phe Arg Gly Pro
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Asp Met Thr Ile Phe Tyr Ser Ser Gln Leu Gly Thr Tyr Pro Tyr Tyr
50 55 60
Thr Pro Thr Gly Glu Pro Val Phe Gly Gly Leu Pro Gln Asn Ala Ser
65 70 75 80
Leu Ile Ala His Leu Ala Arg Thr Phe Gln Asp Ile Leu Ala Ala Ile
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Pro Ala Pro Asp Phe Ser Gly Leu Ala Val Ile Asp Trp Glu Ala Trp
100 105 110
Arg Pro Arg Trp Ala Phe Asn Trp Asp Thr Lys Asp Ile Tyr Arg Gln
115 120 125
Arg Ser Arg Ala Leu Val Gln Ala Gln His Pro Asp Trp Pro Ala Pro
130 135 140
Gln Val Glu Ala Val Ala Gln Asp Gln Phe Gln Gly Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Trp Met Ala Gly Thr Leu Gln Leu Gly Arg Ala Leu Arg Pro Arg Gly
165 170 175
Leu Trp Gly Phe Tyr Gly Phe Pro Asp Cys Tyr Asn Tyr Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Pro Asn Tyr Thr Gly Gln Cys Pro Ser Gly Ile Arg Ala Gln Asn
195 200 205
Asp Gln Leu Gly Trp Leu Trp Gly Gln Ser Arg Ala Leu Tyr Pro Ser
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Ile Tyr Met Pro Ala Val Leu Glu Gly Thr Gly Lys Ser Gln Met Tyr
225 230 235 240
Val Gln His Arg Val Ala Glu Ala Phe Arg Val Ala Val Ala Ala Gly
245 250 255
Asp Pro Asn Leu Pro Val Leu Pro Tyr Val Gln Ile Phe Tyr Asp Thr
260 265 270
Thr Asn His Phe Leu Pro Leu Asp Glu Leu Glu His Ser Leu Gly Glu
275 280 285
Ser Ala Ala Gln Gly Ala Ala Gly Val Val Leu Trp Val Ser Trp Glu
290 295 300
Asn Thr Arg Thr Lys Glu Ser Cys Gln Ala Ile Lys Glu Tyr Met Asp
305 310 315 320
Thr Thr Leu Gly Pro Phe Ile Leu Asn Val Thr Ser Gly Ala Leu Leu
325 330 335
Cys Ser Gln Ala Leu Cys Ser Gly His Gly Arg Cys Val Arg Arg Thr
340 345 350
Ser His Pro Lys Ala Leu Leu Leu Leu Asn Pro Ala Ser Phe Ser Ile
355 360 365
Gln Leu Thr Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Leu Arg Gly Ala Leu Ser
370 375 380
Leu Glu Asp Gln Ala Gln Met Ala Val Glu Phe Lys Cys Arg Cys Tyr
385 390 395 400
Pro Gly Trp Gln Ala Pro Trp Cys Glu Arg Lys Ser Met Trp
405 410
<210> 53
<211> 445
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 53
Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gln Tyr Arg Gln Gly
1 5 10 15
Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His
20 25 30
Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gln Leu Ser Thr Thr
35 40 45
Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys
50 55 60
Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe
65 70 75 80
Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gln
85 90 95
Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp
100 105 110
Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gln Gly Ser Pro Ala
115 120 125
Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln Asp Leu Ala Asn Ala
130 135 140
Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu Arg Leu Leu Leu Ser
145 150 155 160
Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp Ala Gly Tyr Glu Val
165 170 175
Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr
195 200 205
Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala
210 215 220
Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu Ile
225 230 235 240
Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser
245 250 255
Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro
260 265 270
Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Ser Trp
275 280 285
Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln Lys Val Pro Tyr Ile
290 295 300
Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys
305 310 315 320
Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val
325 330 335
Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gln Gly
340 345 350
Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu Leu Ser Leu Pro Tyr
355 360 365
Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro Lys Pro Gly Gln Pro
370 375 380
Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gln Asp Thr Phe Cys Gln
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405 410 415
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420 425 430
Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr Trp Asn
435 440 445
<210> 54
<211> 374
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 54
Gln His Ala Pro Pro Trp Thr Glu Asp Cys Arg Lys Ser Thr Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Ser Gly Pro Thr Tyr Arg Gly Ala Val Pro Trp Tyr Thr Ile Asn
20 25 30
Leu Asp Leu Pro Pro Tyr Lys Arg Trp His Glu Leu Met Leu Asp Lys
35 40 45
Ala Pro Val Leu Lys Val Ile Val Asn Ser Leu Lys Asn Met Ile Asn
50 55 60
Thr Phe Val Pro Ser Gly Lys Ile Met Gln Val Val Asp Glu Lys Leu
65 70 75 80
Pro Gly Leu Leu Gly Asn Phe Pro Gly Pro Phe Glu Glu Glu Met Lys
85 90 95
Gly Ile Ala Ala Val Thr Asp Ile Pro Leu Gly Glu Ile Ile Ser Phe
100 105 110
Asn Ile Phe Tyr Glu Leu Phe Thr Ile Cys Thr Ser Ile Val Ala Glu
115 120 125
Asp Lys Lys Gly His Leu Ile His Gly Arg Asn Met Asp Phe Gly Val
130 135 140
Phe Leu Gly Trp Asn Ile Asn Asn Asp Thr Trp Val Ile Thr Glu Gln
145 150 155 160
Leu Lys Pro Leu Thr Val Asn Leu Asp Phe Gln Arg Asn Asn Lys Thr
165 170 175
Val Phe Lys Ala Ser Ser Phe Ala Gly Tyr Val Gly Met Leu Thr Gly
180 185 190
Phe Lys Pro Gly Leu Phe Ser Leu Thr Leu Asn Glu Arg Phe Ser Ile
195 200 205
Asn Gly Gly Tyr Leu Gly Ile Leu Glu Trp Ile Leu Gly Lys Lys Asp
210 215 220
Val Met Trp Ile Gly Phe Leu Thr Arg Thr Val Leu Glu Asn Ser Thr
225 230 235 240
Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Asn Leu Leu Thr Lys Thr Lys Ile Leu Ala
245 250 255
Pro Ala Tyr Phe Ile Leu Gly Gly Asn Gln Ser Gly Glu Gly Cys Val
260 265 270
Ile Thr Arg Asp Arg Lys Glu Ser Leu Asp Val Tyr Glu Leu Asp Ala
275 280 285
Lys Gln Gly Arg Trp Tyr Val Val Gln Thr Asn Tyr Asp Arg Trp Lys
290 295 300
His Pro Phe Phe Leu Asp Asp Arg Arg Thr Pro Ala Lys Met Cys Leu
305 310 315 320
Asn Arg Thr Ser Gln Glu Asn Ile Ser Phe Glu Thr Met Tyr Asp Val
325 330 335
Leu Ser Thr Lys Pro Val Leu Asn Lys Leu Thr Val Tyr Thr Thr Leu
340 345 350
Ile Asp Val Thr Lys Gly Gln Phe Glu Thr Tyr Leu Arg Asp Cys Pro
355 360 365
Asp Pro Cys Ile Gly Trp
370
<210> 55
<211> 515
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 55
Gly Val Tyr Tyr Ala Thr Ala Tyr Trp Met Pro Ala Glu Lys Thr Val
1 5 10 15
Gln Val Lys Asn Val Met Asp Lys Asn Gly Asp Ala Tyr Gly Phe Tyr
20 25 30
Asn Asn Ser Val Lys Thr Thr Gly Trp Gly Ile Leu Glu Ile Arg Ala
35 40 45
Gly Tyr Gly Ser Gln Thr Leu Ser Asn Glu Ile Ile Met Phe Val Ala
50 55 60
Gly Phe Leu Glu Gly Tyr Leu Thr Ala Pro His Met Asn Asp His Tyr
65 70 75 80
Thr Asn Leu Tyr Pro Gln Leu Ile Thr Lys Pro Ser Ile Met Asp Lys
85 90 95
Val Gln Asp Phe Met Glu Lys Gln Asp Lys Trp Thr Arg Lys Asn Ile
100 105 110
Lys Glu Tyr Lys Thr Asp Ser Phe Trp Arg His Thr Gly Tyr Val Met
115 120 125
Ala Gln Ile Asp Gly Leu Tyr Val Gly Ala Lys Lys Arg Ala Ile Leu
130 135 140
Glu Gly Thr Lys Pro Met Thr Leu Phe Gln Ile Gln Phe Leu Asn Ser
145 150 155 160
Val Gly Asp Leu Leu Asp Leu Ile Pro Ser Leu Ser Pro Thr Lys Asn
165 170 175
Gly Ser Leu Lys Val Phe Lys Arg Trp Asp Met Gly His Cys Ser Ala
180 185 190
Leu Ile Lys Val Leu Pro Gly Phe Glu Asn Ile Leu Phe Ala His Ser
195 200 205
Ser Trp Tyr Thr Tyr Ala Ala Met Leu Arg Ile Tyr Lys His Trp Asp
210 215 220
Phe Asn Val Ile Asp Lys Asp Thr Ser Ser Ser Arg Leu Ser Phe Ser
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Gly Phe Leu Glu Ser Leu Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Ser
245 250 255
Ser Gly Leu Ile Leu Leu Gln Thr Thr Asn Ser Val Phe Asn Lys Thr
260 265 270
Leu Leu Lys Gln Val Ile Pro Glu Thr Leu Leu Ser Trp Gln Arg Val
275 280 285
Arg Val Ala Asn Met Met Ala Asp Ser Gly Lys Arg Trp Ala Asp Ile
290 295 300
Phe Ser Lys Tyr Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln Tyr Met Val Leu
305 310 315 320
Asp Leu Lys Lys Val Lys Leu Asn His Ser Leu Asp Lys Gly Thr Leu
325 330 335
Tyr Ile Val Glu Gln Ile Pro Thr Tyr Val Glu Tyr Ser Glu Gln Thr
340 345 350
Asp Val Leu Arg Lys Gly Tyr Trp Pro Ser Tyr Asn Val Pro Phe His
355 360 365
Glu Lys Ile Tyr Asn Trp Ser Gly Tyr Pro Leu Leu Val Gln Lys Leu
370 375 380
Gly Leu Asp Tyr Ser Tyr Asp Leu Ala Pro Arg Ala Lys Ile Phe Arg
385 390 395 400
Arg Asp Gln Gly Lys Val Thr Asp Thr Ala Ser Met Lys Tyr Ile Met
405 410 415
Arg Tyr Asn Asn Tyr Lys Lys Asp Pro Tyr Ser Arg Gly Asp Pro Cys
420 425 430
Asn Thr Ile Cys Cys Arg Glu Asp Leu Asn Ser Pro Asn Pro Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Cys Tyr Asp Thr Lys Val Ala Asp Ile Tyr Leu Ala Ser Gln
450 455 460
Tyr Thr Ser Tyr Ala Ile Ser Gly Pro Thr Val Gln Gly Gly Leu Pro
465 470 475 480
Val Phe Arg Trp Asp Arg Phe Asn Lys Thr Leu His Gln Gly Met Pro
485 490 495
Glu Val Tyr Asn Phe Asp Phe Ile Thr Met Lys Pro Ile Leu Lys Leu
500 505 510
Asp Ile Lys
515
<210> 56
<211> 662
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 56
Gln Glu Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg
1 5 10 15
Ser Glu Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala
20 25 30
Thr Phe His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr
35 40 45
Val Val Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr
50 55 60
Ala Arg Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys
65 70 75 80
Ile Leu His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met
85 90 95
Ser Gly Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr
100 105 110
Ile Glu Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu
115 120 125
Glu Arg Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro
130 135 140
Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln
145 150 155 160
Ser Asp His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu
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Asn Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys
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Cys Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp
195 200 205
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210 215 220
Cys Gln Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe
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Ile Arg Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu
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Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln
260 265 270
Arg Leu Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe
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290 295 300
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305 310 315 320
Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu
325 330 335
Asp Ile Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln
340 345 350
Ser Gly Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met
355 360 365
Met Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg
370 375 380
Leu Ile His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro
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Glu Asp Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro
405 410 415
Ser Thr His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser
420 425 430
Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala
435 440 445
Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys
450 455 460
Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg
465 470 475 480
Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys
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Cys Leu Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala
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Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val
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Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His
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Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly
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Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu
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Ala Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln
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Ala Ser Gln Glu Leu Gln
660
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 57
Ala Gly Arg His Pro Pro Val Val Leu Val Pro Gly Asp Leu Gly Asn
1 5 10 15
Gln Leu Glu Ala Lys Leu Asp Lys Pro Thr Val Val His Tyr Leu Cys
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Ser Lys Lys Thr Glu Ser Tyr Phe Thr Ile Trp Leu Asn Leu Glu Leu
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Leu Leu Pro Val Ile Ile Asp Cys Trp Ile Asp Asn Ile Arg Leu Val
50 55 60
Tyr Asn Lys Thr Ser Arg Ala Thr Gln Phe Pro Asp Gly Val Asp Val
65 70 75 80
Arg Val Pro Gly Phe Gly Lys Thr Phe Ser Leu Glu Phe Leu Asp Pro
85 90 95
Ser Lys Ser Ser Val Gly Ser Tyr Phe His Thr Met Val Glu Ser Leu
100 105 110
Val Gly Trp Gly Tyr Thr Arg Gly Glu Asp Val Arg Gly Ala Pro Tyr
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Val Ala His Ser Met Gly Asn Met Tyr Thr Leu Tyr Phe Leu Gln
165 170 175
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180 185 190
Leu Gly Ala Pro Trp Gly Gly Val Ala Lys Thr Leu Arg Val Leu Ala
195 200 205
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Glu Gln Gln Arg Ser Ala Val Ser Thr Ser Trp Leu Leu Pro Tyr Asn
225 230 235 240
Tyr Thr Trp Ser Pro Glu Lys Val Phe Val Gln Thr Pro Thr Ile Asn
245 250 255
Tyr Thr Leu Arg Asp Tyr Arg Lys Phe Phe Gln Asp Ile Gly Phe Glu
260 265 270
Asp Gly Trp Leu Met Arg Gln Asp Thr Glu Gly Leu Val Glu Ala Thr
275 280 285
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Thr Pro Asp Ser Phe Tyr Tyr Glu Ser Phe Pro Asp Arg Asp Pro Lys
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325 330 335
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Glu Leu Pro Gly Ser Glu His Ile Glu Met Leu Ala Asn Ala Thr Thr
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Leu Ala Tyr Leu Lys Arg Val Leu Leu Gly Pro
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<211> 548
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 58
Ile Pro Ala Pro Gly Gly Arg Trp Ala Arg Asp Gly Gln Val Pro Pro
1 5 10 15
Ala Ser Arg Ser Arg Ser Val Leu Leu Asp Val Ser Ala Gly Gln Leu
20 25 30
Leu Met Val Asp Gly Arg His Pro Asp Ala Val Ala Trp Ala Asn Leu
35 40 45
Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Phe Leu Glu Leu Gly Thr
50 55 60
Ser Gly Gln Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr Ala Ala Gly Val Val
65 70 75 80
Glu Ala Ala Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met His Trp Met Asn Thr
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Val Val Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu Val Gly Tyr Cys Glu
100 105 110
Arg Leu Lys Ser Phe Leu Glu Ala Asn Leu Glu Trp Met Gln Glu Glu
115 120 125
Met Glu Ser Asn Pro Asp Ser Pro Tyr Trp His Gln Val Arg Leu Thr
130 135 140
Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr Glu Gly Arg Val Ser
145 150 155 160
Phe Pro Ala Gly Lys Phe Thr Ile Lys Pro Leu Gly Phe Leu Leu Leu
165 170 175
Gln Leu Ser Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Leu Ala Leu Asn Lys Thr
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Lys Ile Lys Pro Ser Leu Gly Ser Gly Ser Cys Ser Ala Leu Ile Lys
195 200 205
Leu Leu Pro Gly Gln Ser Asp Leu Leu Val Ala His Asn Thr Trp Asn
210 215 220
Asn Tyr Gln His Met Leu Arg Val Ile Lys Lys Tyr Trp Leu Gln Phe
225 230 235 240
Arg Glu Gly Pro Trp Gly Asp Tyr Pro Leu Val Pro Gly Asn Lys Leu
245 250 255
Val Phe Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser Cys Asp Asp Phe Tyr
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Trp Val Arg Asn Ile Val Ala Asn Arg Leu Ala Ser Asp Gly Ala Thr
305 310 315 320
Trp Ala Asp Ile Phe Lys Arg Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Asn Asn Gln
325 330 335
Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Ile Pro Gly Gly Pro Ser Pro
340 345 350
Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val
355 360 365
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370 375 380
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Ala Leu Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser Tyr Asp Gly Ser Pro
405 410 415
Arg Ala Gln Ile Phe Arg Arg Asn Gln Ser Leu Val Gln Asp Met Asp
420 425 430
Ser Met Val Arg Leu Met Arg Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Leu
435 440 445
Ser Leu Cys Lys Ala Cys Asn Pro Gln Pro Asn Gly Glu Asn Ala Ile
450 455 460
Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln
465 470 475 480
Ala Leu Arg Gln Arg Ser His Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Leu Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Lys Phe Ala Pro Val Lys
530 535 540
Val Ser Trp Asp
545
<210> 59
<211> 334
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 59
Ala Thr Ile Ser Cys Arg Asn Glu Glu Gly Lys Ala Val Asp Trp Phe
1 5 10 15
Thr Phe Tyr Lys Leu Pro Lys Arg Gln Asn Lys Glu Ser Gly Glu Thr
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Gly Leu Glu Tyr Leu Tyr Leu Asp Ser Thr Thr Arg Ser Trp Arg Lys
35 40 45
Ser Glu Gln Leu Met Asn Asp Thr Lys Ser Val Leu Gly Arg Thr Leu
50 55 60
Gln Gln Leu Tyr Glu Ala Tyr Ala Ser Lys Ser Asn Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Ile Tyr Asn Asp Gly Val Pro Lys Pro Val Asn Tyr Ser Arg Lys
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Tyr Gly His Thr Lys Gly Leu Leu Leu Trp Asn Arg Val Gln Gly Phe
100 105 110
Trp Leu Ile His Ser Ile Pro Gln Phe Pro Pro Ile Pro Glu Glu Gly
115 120 125
Tyr Asp Tyr Pro Pro Thr Gly Arg Arg Asn Gly Gln Ser Gly Ile Cys
130 135 140
Ile Thr Phe Lys Tyr Asn Gln Tyr Glu Ala Ile Asp Ser Gln Leu Leu
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195 200 205
Lys Phe Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Ser Phe Leu Asp Asp Ile Phe
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Ala Ala Trp Met Ala Gln Arg Leu Lys Thr His Leu Leu Thr Glu Thr
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
Lys Asn Arg Trp Thr Cys Ile Gly Asp Leu Asn Arg Ser Pro His Gln
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Ala Phe Arg Ser Gly Gly Phe Ile Cys Thr Gln Asn Trp Gln Ile Tyr
305 310 315 320
Gln Ala Phe Gln Gly Leu Val Leu Tyr Tyr Glu Ser Cys Lys
325 330
<210> 60
<211> 294
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 60
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1 5 10 15
Gln Lys Cys Arg Asn Lys Val Met Lys Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Ile
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Pro Val Arg Leu Asp Leu Thr Glu Lys Asp Tyr Glu Ile Leu Phe Lys
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Leu Ala Val Glu Pro Leu Thr Ala Asn Phe His Lys Trp Ser Leu Ser
165 170 175
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Ile Tyr Gln Phe Ser Pro Ile Tyr Thr Gly Asn Ile Ser Ser Phe Gln
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290
<210> 61
<211> 509
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 61
Gly Phe Leu Tyr Pro Leu Val Asp Phe Cys Ile Ser Gly Lys Thr Arg
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Gly Gln Lys Pro Asn Phe Val Ile Ile Leu Ala Asp Asp Met Gly Trp
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Gly Asp Leu Gly Ala Asn Trp Ala Glu Thr Lys Asp Thr Ala Asn Leu
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Gly Leu Pro Leu Asn Glu Thr Thr Leu Ala Glu Val Leu Gln Gln Ala
100 105 110
Gly Tyr Val Thr Gly Ile Ile Gly Lys Trp His Leu Gly His His Gly
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130 135 140
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180 185 190
Ile Val Glu Gln Pro Val Asn Leu Ser Ser Leu Ala Gln Lys Tyr Ala
195 200 205
Glu Lys Ala Thr Gln Phe Ile Gln Arg Ala Ser Thr Ser Gly Arg Pro
210 215 220
Phe Leu Leu Tyr Val Ala Leu Ala His Met His Val Pro Leu Pro Val
225 230 235 240
Thr Gln Leu Pro Ala Ala Pro Arg Gly Arg Ser Leu Tyr Gly Ala Gly
245 250 255
Leu Trp Glu Met Asp Ser Leu Val Gly Gln Ile Lys Asp Lys Val Asp
260 265 270
His Thr Val Lys Glu Asn Thr Phe Leu Trp Phe Thr Gly Asp Asn Gly
275 280 285
Pro Trp Ala Gln Lys Cys Glu Leu Ala Gly Ser Val Gly Pro Phe Thr
290 295 300
Gly Phe Trp Gln Thr Arg Gln Gly Gly Ser Pro Ala Lys Gln Thr Thr
305 310 315 320
Trp Glu Gly Gly His Arg Val Pro Ala Leu Ala Tyr Trp Pro Gly Arg
325 330 335
Val Pro Val Asn Val Thr Ser Thr Ala Leu Leu Ser Val Leu Asp Ile
340 345 350
Phe Pro Thr Val Val Ala Leu Ala Gln Ala Ser Leu Pro Gln Gly Arg
355 360 365
Arg Phe Asp Gly Val Asp Val Ser Glu Val Leu Phe Gly Arg Ser Gln
370 375 380
Pro Gly His Arg Val Leu Phe His Pro Asn Ser Gly Ala Ala Gly Glu
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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<211> 546
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 62
Gln Asp Trp Lys Ala Glu Arg Ser Gln Asp Pro Phe Glu Lys Cys Met
1 5 10 15
Gln Asp Pro Asp Tyr Glu Gln Leu Leu Lys Val Val Thr Trp Gly Leu
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35 40 45
Ala Gly Leu Val Ala Ala Lys Val Leu Ser Asp Ala Gly His Lys Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Asp Gln Asn Thr Gly Trp Ile Gly Glu Leu Gly Ala Met Arg Met
85 90 95
Pro Ser Ser His Arg Ile Leu His Lys Leu Cys Gln Gly Leu Gly Leu
100 105 110
Asn Leu Thr Lys Phe Thr Gln Tyr Asp Lys Asn Thr Trp Thr Glu Val
115 120 125
His Glu Val Lys Leu Arg Asn Tyr Val Val Glu Lys Val Pro Glu Lys
130 135 140
Leu Gly Tyr Ala Leu Arg Pro Gln Glu Lys Gly His Ser Pro Glu Asp
145 150 155 160
Ile Tyr Gln Met Ala Leu Asn Gln Ala Leu Lys Asp Leu Lys Ala Leu
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Gly Cys Arg Lys Ala Met Lys Lys Phe Glu Arg His Thr Leu Leu Glu
180 185 190
Tyr Leu Leu Gly Glu Gly Asn Leu Ser Arg Pro Ala Val Gln Leu Leu
195 200 205
Gly Asp Val Met Ser Glu Asp Gly Phe Phe Tyr Leu Ser Phe Ala Glu
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Ala Leu Arg Ala His Ser Cys Leu Ser Asp Arg Leu Gln Tyr Ser Arg
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Ile Val Gly Gly Trp Asp Leu Leu Pro Arg Ala Leu Leu Ser Ser Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Val Leu Leu Asn Ala Pro Val Val Ala Met Thr Gln Gly
260 265 270
Pro His Asp Val His Val Gln Ile Glu Thr Ser Pro Pro Ala Arg Asn
275 280 285
Leu Lys Val Leu Lys Ala Asp Val Val Leu Leu Thr Ala Ser Gly Pro
290 295 300
Ala Val Lys Arg Ile Thr Phe Ser Pro Pro Leu Pro Arg His Met Gln
305 310 315 320
Glu Ala Leu Arg Arg Leu His Tyr Val Pro Ala Thr Lys Val Phe Leu
325 330 335
Ser Phe Arg Arg Pro Phe Trp Arg Glu Glu His Ile Glu Gly Gly His
340 345 350
Ser Asn Thr Asp Arg Pro Ser Arg Met Ile Phe Tyr Pro Pro Pro Arg
355 360 365
Glu Gly Ala Leu Leu Leu Ala Ser Tyr Thr Trp Ser Asp Ala Ala Ala
370 375 380
Ala Phe Ala Gly Leu Ser Arg Glu Glu Ala Leu Arg Leu Ala Leu Asp
385 390 395 400
Asp Val Ala Ala Leu His Gly Pro Val Val Arg Gln Leu Trp Asp Gly
405 410 415
Thr Gly Val Val Lys Arg Trp Ala Glu Asp Gln His Ser Gln Gly Gly
420 425 430
Phe Val Val Gln Pro Pro Ala Leu Trp Gln Thr Glu Lys Asp Asp Trp
435 440 445
Thr Val Pro Tyr Gly Arg Ile Tyr Phe Ala Gly Glu His Thr Ala Tyr
450 455 460
Pro His Gly Trp Val Glu Thr Ala Val Lys Ser Ala Leu Arg Ala Ala
465 470 475 480
Ile Lys Ile Asn Ser Arg Lys Gly Pro Ala Ser Asp Thr Ala Ser Pro
485 490 495
Glu Gly His Ala Ser Asp Met Glu Gly Gln Gly His Val His Gly Val
500 505 510
Ala Ser Ser Pro Ser His Asp Leu Ala Lys Glu Glu Gly Ser His Pro
515 520 525
Pro Val Gln Gly Gln Leu Ser Leu Gln Asn Thr Thr His Thr Arg Thr
530 535 540
Ser His
545
<210> 63
<211> 368
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 63
Glu Asn Asp Phe Gly Leu Val Gln Pro Leu Val Thr Met Glu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Trp Val Ser Gly Arg Gln Ile Gly Ser Val Asp Thr Phe Arg Ile
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Pro Leu Ile Thr Ala Thr Pro Arg Gly Thr Leu Leu Ala Phe Ala Glu
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Ala Arg Lys Met Ser Ser Ser Asp Glu Gly Ala Lys Phe Ile Ala Leu
50 55 60
Arg Arg Ser Met Asp Gln Gly Ser Thr Trp Ser Pro Thr Ala Phe Ile
65 70 75 80
Val Asn Asp Gly Asp Val Pro Asp Gly Leu Asn Leu Gly Ala Val Val
85 90 95
Ser Asp Val Glu Thr Gly Val Val Phe Leu Phe Tyr Ser Leu Cys Ala
100 105 110
His Lys Ala Gly Cys Gln Val Ala Ser Thr Met Leu Val Trp Ser Lys
115 120 125
Asp Asp Gly Val Ser Trp Ser Thr Pro Arg Asn Leu Ser Leu Asp Ile
130 135 140
Gly Thr Glu Val Phe Ala Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ile Gln Lys Gln
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Arg Glu Pro Arg Lys Gly Arg Leu Ile Val Cys Gly His Gly Thr Leu
165 170 175
Glu Arg Asp Gly Val Phe Cys Leu Leu Ser Asp Asp His Gly Ala Ser
180 185 190
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195 200 205
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Asp Gly Ser Val Val Ile Asn Ala Arg Asn Gln Asn Asn Tyr His Cys
225 230 235 240
His Cys Arg Ile Val Leu Arg Ser Tyr Asp Ala Cys Asp Thr Leu Arg
245 250 255
Pro Arg Asp Val Thr Phe Asp Pro Glu Leu Val Asp Pro Val Val Ala
260 265 270
Ala Gly Ala Val Val Thr Ser Ser Gly Ile Val Phe Phe Ser Asn Pro
275 280 285
Ala His Pro Glu Phe Arg Val Asn Leu Thr Leu Arg Trp Ser Phe Ser
290 295 300
Asn Gly Thr Ser Trp Arg Lys Glu Thr Val Gln Leu Trp Pro Gly Pro
305 310 315 320
Ser Gly Tyr Ser Ser Leu Ala Thr Leu Glu Gly Ser Met Asp Gly Glu
325 330 335
Glu Gln Ala Pro Gln Leu Tyr Val Leu Tyr Glu Lys Gly Arg Asn His
340 345 350
Tyr Thr Glu Ser Ile Ser Val Ala Lys Ile Ser Val Tyr Gly Thr Leu
355 360 365
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 64
Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val Ile
1 5 10 15
Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Ala
20 25 30
Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu Gln
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Gln Asp His Val Phe Ile Tyr Phe
115 120 125
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130 135 140
His Val Lys Asp Leu Asn Glu Thr Ile His Tyr Met Tyr Lys His Lys
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Met Tyr Arg Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser
165 170 175
Met Met Asn His Leu Pro Asp Asn Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr Ala
180 185 190
Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys Arg
195 200 205
Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp Ser
210 215 220
Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His Leu
225 230 235 240
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245 250 255
Thr Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys Arg Lys
260 265 270
Ala Ser Ser Pro Val Pro Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu Thr
275 280 285
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305 310 315 320
His Leu Asp Ala Arg His Leu Ile Glu Lys Ser Val Arg Lys Ile Val
325 330 335
Ser Leu Leu Ala Ala Ser Glu Ala Glu Val Glu Gln Leu Leu Ser Glu
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Arg Ala Pro Leu Thr Gly His Ser Cys Tyr Pro Glu Ala Leu Leu His
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Leu Arg His Leu Tyr Val Leu Val Asn Leu Cys Glu Lys Pro Tyr Pro
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Leu His Arg Ile Lys Leu Ser Met Asp His Val Cys Leu Gly His Tyr
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 65
Ile Gly Phe Arg Phe Ala Ser Tyr Ile Asn Asn Asp Met Val Leu Gln
1 5 10 15
Lys Glu Pro Ala Gly Ala Val Ile Trp Gly Phe Gly Thr Pro Gly Ala
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Thr Val Thr Val Thr Leu Arg Gln Gly Gln Glu Thr Ile Met Lys Lys
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Glu Lys Ile Asn Phe Thr Leu Arg Val His Asp Val Leu Phe Gly Asp
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100 105 110
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Val Arg Ile Leu Ser Val Ser Pro Ile Gln Ala Glu Gln Glu Leu Glu
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Ser Ser Trp Gly Gly Thr Pro Ile Glu Ala Trp Ser Ser Gly Arg Ser
195 200 205
Leu Lys Ala Cys Gly Val Pro Lys Gln Gly Ser Ile Pro Tyr Asp Ser
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Val Thr Gly Pro Ser Lys His Ser Val Leu Trp Asn Ala Met Ile His
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Pro Leu Cys Asn Met Thr Leu Lys Gly Val Val Trp Tyr Gln Gly Glu
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Ser Asn Ile Asn Tyr Asn Thr Asp Leu Tyr Asn Cys Thr Phe Pro Ala
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Leu Ile Glu Asp Trp Arg Glu Thr Phe His Arg Gly Ser Gln Gly Gln
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Thr Glu Arg Phe Phe Pro Phe Gly Leu Val Gln Leu Ser Ser Asp Leu
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Ser Lys Lys Ser Ser Asp Asp Gly Phe Pro Gln Ile Arg Trp His Gln
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Thr Ala Asp Phe Gly Tyr Val Pro Asn Pro Lys Met Pro Asn Thr Phe
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Asn Val Ala Lys
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 66
Ser Leu Leu Arg Arg Leu Gly Glu His Ile Gln Gln Phe Gln Glu Ser
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Ser Ala Gln Gly Leu Gly Leu Ser Leu Gly Pro Gly Ala Ala Ala Leu
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Ser Ile Pro Ala Gly Gly Leu Glu Met Ala Gln Leu Arg Phe Leu Ser
115 120 125
Ser Arg Leu Ala Leu Ala Asp Val Val Ser Ala Arg Leu Ala Leu Ser
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Tyr Ala Gly Ser Leu Ala Ala Trp Ala Arg Leu Lys Phe Pro His
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Leu Ile Phe Ala Ser Val Ala Ser Ser Ala Pro Val Arg Ala Val Leu
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Asp Phe Ser Glu Tyr Asn Asp Val Val Ser Arg Ser Leu Met Ser Thr
195 200 205
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225 230 235 240
Leu Arg Thr Glu Leu Ser Ala Cys Gly Pro Leu Gly Arg Ala Glu Asn
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Lys Cys Leu Ser Phe Ser Arg Ala Glu Thr Val Ala Gln Leu Arg Ser
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<213> HOMO SAPIENS
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Asp Gly Leu Ala Pro Leu Gly Arg Ser Thr Tyr Pro Arg Pro His Glu
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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Ser Pro Glu Leu Leu Ala Pro Thr Arg Phe Ala Leu Glu Met Phe Asn
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Ser Ser Val Ile Ser Leu Leu Asn Glu Asp Pro Leu Ser Gln Asp Leu
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Leu Asp Cys Asp Lys Met Asp Lys Ala Cys Met Gly Gly Leu Pro Ser
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Asn Ala Tyr Ser Ala Ile Lys Asn Leu Gly Gly Leu Glu Thr Glu Asp
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Gln Lys Leu Ala Ala Trp Leu Ala Lys Arg Gly Pro Ile Ser Val Ala
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Asp
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<213> HOMO SAPIENS
<400> 69
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Gly Asp Asp Phe Leu Gly Met Leu Asn Arg Thr Leu Leu Glu Thr Leu
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ser Asn Gln Phe Phe Arg Asp Val Thr Ala Asp Phe Glu Gly Gln Ser
180 185 190
Pro Lys Cys Thr Gln Gly Val Arg Glu Ala Phe Arg Gln Ile Lys Asp
195 200 205
Leu Phe Leu Gln Gly Ala Tyr Asp Thr Val Arg Trp Glu Phe Gly Thr
210 215 220
Cys Gln Pro Leu Ser Asp Glu Lys Asp Leu Thr Gln Leu Phe Met Phe
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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355 360 365
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 71
Ala Pro Ala Pro His Arg Ala Ser Tyr Lys Pro Val Ile Val Val His
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50 55 60
Glu Ala Val Val Pro Ile Met Ala Lys Ala Pro Gln Gly Val His Leu
65 70 75 80
Ile Cys Tyr Ser Gln Gly Gly Leu Val Cys Arg Ala Leu Leu Ser Val
85 90 95
Met Asp Asp His Asn Val Asp Ser Phe Ile Ser Leu Ser Ser Pro Gln
100 105 110
Met Gly Gln Tyr Gly Asp Thr Asp Tyr Leu Lys Trp Leu Phe Pro Thr
115 120 125
Ser Met Arg Ser Asn Leu Tyr Arg Ile Cys Tyr Ser Pro Trp Gly Gln
130 135 140
Glu Phe Ser Ile Cys Asn Tyr Trp His Asp Pro His His Asp Asp Leu
145 150 155 160
Tyr Leu Asn Ala Ser Ser Phe Leu Ala Leu Ile Asn Gly Glu Arg Asp
165 170 175
His Pro Asn Ala Thr Val Trp Arg Lys Asn Phe Leu Arg Val Gly His
180 185 190
Leu Val Leu Ile Gly Gly Pro Asp Asp Gly Val Ile Thr Pro Trp Gln
195 200 205
Ser Ser Phe Phe Gly Phe Tyr Asp Ala Asn Glu Thr Val Leu Glu Met
210 215 220
Glu Glu Gln Leu Val Tyr Leu Arg Asp Ser Phe Gly Leu Lys Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Arg Gly Ala Ile Val Arg Cys Pro Met Ala Gly Ile Ser His
245 250 255
Thr Ala Trp His Ser Asn Arg Thr Leu Tyr Glu Thr Cys Ile Glu Pro
260 265 270
Trp Leu Ser
275
<210> 72
<211> 508
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 72
Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr
20 25 30
Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu
35 40 45
Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr
50 55 60
Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg
65 70 75 80
Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser
85 90 95
Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr Gln
100 105 110
Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys Asn Ser
115 120 125
Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe Ala Asn Cys
130 135 140
Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu Arg Thr Ala
145 150 155 160
Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Cys
165 170 175
Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Asn
180 185 190
Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly
195 200 205
Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys
210 215 220
Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr
225 230 235 240
Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp
245 250 255
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260 265 270
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Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val
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325 330 335
Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe Gly
340 345 350
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu
435 440 445
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450 455 460
Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro
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Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe
485 490 495
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500 505
<210> 73
<211> 452
<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
<400> 73
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Lys Glu Glu Ile Ala Ser Cys Gly Asp Val Ala Lys Ala Ile Ile Asn
20 25 30
Leu Ala Val Tyr Gly Lys Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Glu Arg Leu Ala
35 40 45
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<212> PRT
<213> HOMO SAPIENS
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Pro Asp Ser Ser Ala Ser Asn Leu Gly Phe Arg Cys Ala Ala Asp Arg
325 330 335
Leu Pro Thr Met Asp
340
Claims (24)
- a) 글라이코실화된(glycosylated) 라이소좀 단백질(lysosomal protein)과 알칼리 금속 퍼아이오데이트(periodate)를 4시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계; 및
b) 상기 라이소좀 단백질과 알칼리 금속 보로하이드라이드(borohydride)를 2시간 이하의 시간 동안 반응시키는 단계를 포함함으로써,
상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기(glycan moietiy)를 변형시키고, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키며 , 단 상기 단백질은 설파아미다아제(sulfamidase)가 아닌 것인,
변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법. - 제 1항에 있어서, 상기 단계 b)는 예를 들어 적어도 2가지, 예를 들어 적어도 i) 내지 iv) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는 것인, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드(sodium borohydride)인 것;
ii) 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 3배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5배 내지 4배의 농도로 사용되는 것.
iii) 상기 반응은 2시간 이하, 예를 들어 1.5시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 0.75시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
iv) 상기 반응은 0 과 8℃ 사이의 온도에서 수행되는 것. - 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 a) 는 예를 들어 적어도 2가지, 예를 들어 적어도 3가지, 예를 들어 적어도 4가지, 예를 들어 적어도 i) 내지 v) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트(sodium meta-periodate)인 것;
ii) 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하의 농도, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 10mM로 사용되는 것;
iii) 상기 반응은 0 과 22 ℃ 사이, 예를 들어 0-8 ℃, 예를 들어 0-4 ℃, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행되는 것;
iv) 상기 반응은 3시간 이하, 예를 들어 2시간, 예를 들어 1시간, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
v) 상기 반응 단계 a)는 3-7의 pH에서 수행되는 것. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)는 3시간 이하의 시간 동안 수행되고, 단계 b)는 1시간 이하의 시간 동안 수행되고, 상기 보로하이드라이드는 선택적으로 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하로 사용되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a) 및 단계 b)는 어떠한 투석(dialysis), 한외 여과(ultrafiltration), 침전(precitipitation) 또는 완충액 교환(buffer exchange)도 수행하지 않고 순서대로 수행되는 것인, 방법.
- a) 글라이코실화된 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 퍼아이오데이트와 반응시키는 단계, 및
b) 상기 라이소좀 단백질을 알칼리 금속 보로하이드라이드와 반응시키는 단계를 포함함으로써 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 잔기를 변형시키고, 상기 라이소좀 단백질의 글라이칸 인식 수용체에 대한 활성을 감소시키며, 상기 라이소좀 단백질의 상기 활성 부위 또는 기능성 에피토프는 단계 a)및 b) 중 적어도 하나 동안 산화 및/또는 환원 반응에 접근 불가능하도록 만들어지는 것인,
변형된 라이소좀 단백질의 제조 방법. - 제6항에 있어서, 상기 단계 b)는 예를 들어 적어도 2가지, 예를 들어 i) 내지 iv) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는 것인, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 보로하이드라이드는 나트륨 보로하이드라이드인 것;
ii) 상기 보로하이드라이드는 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 3배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 2.5배 이하, 예를 들어 상기 퍼아이오데이트의 농도의 0.5배 내지 4배의 농도로 사용되는 것;
iii) 상기 반응은 2시간 이하, 예를 들어 1.5시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 0.75시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
iv) 상기 반응은 0 내지 8 ℃의 온도에서 수행되는 것. - 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 a) 단계는 예를 들어 적어도 2 가지, 예를 들어 적어도 3 가지, 예를 들어 적어도 4 가지, 예를 들어 적어도 i) 내지 v) 모두 중의 적어도 하나를 추가의 특징으로 하는, 방법:
i) 상기 알칼리 금속 퍼아이오데이트는 나트륨 메타-퍼아이오데이트인 것;
ii) 상기 퍼아이오데이트는 20mM 이하, 예를 들어 15mM 이하, 예를 들어 약 10mM의 농도로 사용되는 것;
iii) 상기 반응은 0과 22 ℃ 사이, 예를 들어 0-8 ℃, 예를 들어 0-4 ℃, 예를 들어 약 8 ℃, 예를 들어 약 0 ℃의 온도에서 수행되는 것;
iv) 상기 반응은 3시간 이하, 예를 들어 2시간 이하, 예를 들어 1시간 이하, 예를 들어 약 0.5시간의 시간 동안 수행되는 것, 및
v) 상기 단계 a)의 반응은 3-7의 pH에서 수행되는 것. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a)는 3시간 이하의 시간 동안 수행되고, 상기 단계 b)는 1시간 이하 동안 수행되고, 상기 보로하이드라이드는 선택적으로 상기 퍼아이오데이트의 농도의 4배 이하로 사용되는 것인, 방법.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 a) 및 단계 b) 는 어떠한 투석, 한외 여과, 침전 또는 완충액 교환도 수행하지 않고 순서대로 수행되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 라이소좀 단백질은 설파타아제(sulfatase); 글라이코시드 하이드로레이즈(glycoside hydrolase), 또는 프로타아제(protease)인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서 상기 라이소좀 단백질은, 데옥시리보뉴클레아제-2-알파(deoxyribonuclease-2-alpha); 베타-만노시다아제(beta-mannosidase); 리보뉴클레아제 T2(ribonuclease T2); 라이소좀 알파-만노시다아제(lysosomal alpha-mannosidase); 알파 L-이두로니다아제(alpha L-iduronidase); 트리펩티딜-펩티다아제 1 (tripeptidyl-peptidase 1); 히알루로니다아제-3(hyaluronidase-3); 카텝신 L2 (cathepsin L2); 세로이드 지질갈색소증 신경원성 단백질(ceroid-lipofuscinosis neuronal protein) 5; 글루코실세라미다아제(glucosylceramidase); 조직 알파-L-푸코시다아제(tissue alpha-L-fucosidase); 미엘로퍼옥시다아제(myeloperoxidase); 알파-갈락토시다아제 A(alpha-galactosidase A); 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파(beta-hexosaminidase subunit alpha); 카텝신 D; 프로사포신(prosaposin); 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 카텝신 L1; 카텝신 B; 베타-글루쿠로니다아제(beta-glucuronidase); 프로-카텝신 H(pro-cathepsin H); 비분비성(non-secretory) 리보뉴클레아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제 (glucosidase); 라이소좀 보호 단백질(lysosomal protective protein); 감마-인터페론-유도성 라이소좀 티올 리덕타아제(gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase); 타르트레이트-내성 산성 포스파타아제 유형 5(tartrate-resistant acid phosphatase type 5); 아릴설파타아제 A(arylsulfatase A); 전립선 산(prostatic acid) 포스파타아제; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제(N-acetylglucosamine-6-sulfatase); 아릴설파타아제 B (arylsulfatase B); 베타-갈락토시다아제; 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제(alpha-N-acetylgalactosaminidase); 스핑고미엘린 포스포디에스테라아제(sphingomyelin phosphodiesterase); 강글리오시드 GM2 (ganglioside GM2) 활성제 (activator); N(4)-(베타-N-아세틸글루코사미닐)-L-아스파라기나아제(N(4)-(beta-N-acetylglucosaminyl)-L-asparaginase); 이두로네이트 2-설파타아제 (iduronate 2-sulfatase); 카텝신 S; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제(N-acetylgalactosamine-6-sulfatase); 라이소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 (lipase/cholesteryl ester) 하이드로레이즈; 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase); 카텝신 O; 카텝신 K; 팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1(palmitoyl-protein thioesterase 1); 아릴설파타아제 D(arylsulfatase D); 디펩티딜(dipeptidyl) 펩티다아제 1; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제(alpha-N-acetylglucosaminidase); 갈락토세레브로시다아제(galactocerebrosidase); 정소상체(epididymal) 분비 단백질 E1; 디-N-아세틸키토비아제(di-N-acetylchitobiase); N-아실에탄올아민-가수분해 산 아미다아제(N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase); 히알루로니다아제-1; 키토트리오시다아제-1(chitotriosidase-1); 산 세라미다아제(acid ceramidase); 포스포리파아제 B-유사체 1(phospholipase B-like 1); 전구단백질 전환효소(proprotein convertase) 섭틸리신/켁신 유형 9 (subtilisin/kexin type 9); 그룹 XV 포스포리파아제 A2; 추정(putative) 포스포리파아제 B-유사체 2; 데옥시리보뉴클레아제-2-베타; 감마-글루타밀 하이드로레이즈(gamma-glutamyl hydrolase); 아릴설파타아제 G; L-아미노산 옥시다아제; 시알리다아제-1(sialidase-1); 레구마인(legumain); 시알레이트 O-아세틸에스테라아제(sialate O-acetylesterase); 흉선-특이적(thymus-specific) 세린(serine) 프로타아제; 카텝신 Z; 카텝신 F; 프레닐시스테인(prenylcysteine) 옥시다아제 1; 디펩티딜 펩티다아제 2; 라이소좀 티오에스라아제 PPT2; 헤파라나아제(heparanase); 카르복시펩티다아제 Q; β-글루쿠로니다아제, 및 설파타아제-변형 인자 1(sulfatase-modifying factor 1)로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 a) 및 b)단계의 적어도 하나는 보호 리간드의 존재 하에 수행되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계 a) 및 b) 는 라이소좀 단백질이 수지(resin) 상에 고정화되어 있는 동안 수행되는 것인, 방법.
- 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여 50% 이하의 글라이칸 잔기가 변형되지 않은 상태로 존재함으로써, 상기 단백질은 글라이칸 인식 수용체에 대한 감소된 활성을 가지며, 단 상기 단백질은 설파아미다아제, β-글루쿠로니다아제, TPP1(tripeptidyl peptidase 1) 또는 알파 L-이두로니다아제가 아닌 것을 특징으로 하는, 감소된 함량의 변형되지 않은 글라이칸 잔기를 갖는 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제 15항에 있어서, 상기 단백질은 데옥시리보뉴클레아제-2-알파; 베타-만노시다아제; 리보뉴클레아제 T2; 라이소좀 알파-만노시다아제; 히알루로니다아제-3; 카텝신 L2; 세로이드 지질갈색소증 신경원성 단백질 5; 글루코실세라미다아제; 조직 알파-L-푸코시다아제; 미엘로퍼옥시다아제; 알파-갈락토시다아제 A; 베타-헥소사미니다아제 소단위 알파; 카텝신 D; 프로사포신; 베타-헥소사미니다아제 소단위 베타; 카텝신 L1; 카텝신 B; 프로-카텝신 H; 비분비성 리보뉴클레아제; 라이소좀 알파-글루코시다아제; 라이소좀 보호 단백질; 감마-인터페론-유도성 라이소좀 티올 리덕타아제; 타르트레이트-내성 산성 포스파타아제 유형 5; 아릴설파타아제 A; 전립선 산 포스파타아제; N-아세틸글루코사민-6-설파타아제; 아릴설파타아제 B; 베타-갈락토시다아제; 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제; 스핑고미엘린 포스포디에스테라아제; 강글리오시드 GM2 활성제; N(4)-(베타-N-아세틸글루코사미닐)-L-아스파라기나아제; 이두로네이트 2-설파타아제; 카텝신 S; N-아세틸갈락토사민-6-설파타아제; 라이소좀 산 리파아제/콜레스테릴 에스테르 하이드로레이즈; 라이소좀 프로-X 카르복시펩티다아제; 카텝신 O; 카텝신 K; 팔미토일-단백질 티오에스테라아제 1; 아릴설파타아제 D; 디펩티딜 펩티다아제 1; 알파-N-아세틸글루코사미니다아제; 갈락토세레브로시다아제; 정소상체 분비 단백질 E1; 디-N-아세틸키토비아제; N-아실에탄올아민-가수분해 산 아미다아제; 히알루로니다아제-1; 키토트리오시다아제-1; 산 세라미다아제; 포스포리파아제 B-유사체 1; 전구단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 유형 9; 그룹 XV 포스포리파아제 A2; 추정 포스포리파아제 B-유사체 2; 데옥시리보뉴클레아제-2-베타; 감마-글루타밀 하이드로레이즈; 아릴설파타아제 G; L-아미노산 옥시다아제; 시알리다아제-1; 레구마인; 시알레이트 O-아세틸에스터라아제; 카텝신 Z; 카텝신 F; 프레닐시스테인 옥시다아제 1; 디펩티딜 펩티다아제 2; 라이소좀 티오에스테라아제 PPT2; 헤파라나아제; 카르복시펩티다아제 Q, 및 설파타아제-변형 인자 1 로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태와 비교하여, 상기 글라이칸 잔기의 45% 이하가 변형되지 않은 상태로 존재하며, 글라이칸 인식 수용체에 대한 에피토프의 예를 들어 40% 이하, 35% 이하, 30%이하, 35% 이하, 30%이하, 25%이하, 20%이하, 15%이하, 10%이하, 5%이하, 1% 이하가 상기 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 형태로부터 잔류하는 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질의 변형되지 않은 글라이칸 잔기는 단일 결합 분해 및 이중 결합 분해에 의해 파괴되고, 단일 결합 분해의 상기 정도가 올리고만노오스(oligomannose) 글라이칸에서 적어도 60%인 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위에 상기 변형되지 않은 글라이칸 잔기의 적어도 1개가 존재하지 않고, 상기 라이소좀 단백질의 N-글라이코실화 부위 중의 예를 들어 적어도 2개, 예를 들어 적어도 3개, 예를 들어 적어도 4개, 예를 들어 적어도 5개, 예를 들어 적어도 6개, 예를 들어 적어도 7개, 예를 들어 적어도 8개, 예를 들어 적어도 9개, 예를 들어 적어도 10개, 예를 들어 적어도 11개, 예를 들어 적어도 12개, 예를 들어 적어도 13개가 존재하지 않으며, 바람직하게는 상기 에피토프는 모든 N-글라이코실화 부위에 존재하지 않는 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라이소좀 단백질은 보유된 촉매 활성, 예를 들어, 상기 상응하는 변형되지 않은 라이소좀 단백질의 촉매 활성의 적어도 50%의 보유된 촉매 활성을 갖는, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따라 수득할 수 있는 변형된 라이소좀 단백질로서, 상기 단백질은 설파아미다아제가 아닌 것인, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법에서 사용하는 변형된 라이소좀 단백질.
- 제22항에 있어서, 라이소좀 저장병(lysosomal storage disease)에 걸린 포유동물을 치료하기 위한, 변형된 라이소좀 단백질.
- 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따르는 변형된 라이소좀 단백질의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 라이소좀 저장병에 걸린 포유동물을 치료하는, 방법.
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